CN104049090A - 一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，公开了一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法操作简单，无需预稀释试剂及样本，工作试剂无需配制可直接在各种自动生化分析仪上使用，定量测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液测定基本不受尿液氨基酸及氨的影响。实验表明，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。

Description

一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。
背景技术
丙氨酰氨基肽酶，简称APP，是亮氨酸氨基肽酶(LAP)的同工酶。血清、尿中丙氨酰氨基肽酶活性变化与机体某些病理状态密切相关。一些研究表明血清AAP测定可用于肝胆疾病、肝肿瘤和脂肪肝的诊断。肝内胆汁郁积、重症肝炎、梗阻性黄疸、原发和继发性肝癌均会造成血清AAP明显增高，其较其他指标敏感。另外一些研究表明尿AAP的测定可应用于肾小球肾炎、肾小管早期损伤的诊断。在肾移植排异反应、长期服用肾毒性药物治疗对肾小管的损伤、糖尿病肾病等疾病中，尿AAP均会呈不同程度增高，尤其是在对肾移植排异反应时尿AAP的检测较N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)敏感。因此丙氨酰氨基肽酶的测定对疾病的鉴别诊断具有重要意义。
目前，丙氨酰氨基肽酶的测定方法主要是酶联免疫吸附测定法。酶联免疫吸附测定法的测定丙氨酰氨基肽酶原理的为双抗体夹心ELISA法，该方法在测定时需要事先对标准品进行预稀释(倍比稀释)，工作试剂在使用前也需要预稀释并按比例配制，操作过程十分复杂，测定结果极易受人为因素影响，从而影响测定结果的准确性。且该方法的不同检测试剂需要在不同条件下保存，并且检测试剂的有效期短，故不能被广泛应用。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现检测丙氨酰氨基肽酶的方法准确性差等问题，提供了一种准确度高的检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7.5～8.0的缓冲液中，待测样品与L-丙氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
作为优选，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
为优选，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
本发明还提供了一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括L-丙氨酰对硝基苯胺、pH7.5～8.0的缓冲液和激活剂。
作为优选，所述L-丙氨酰对硝基苯胺浓度为8～12mmol/L。
作为优选，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
作为优选，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒还包括稳定剂。
作为优选，所述稳定剂为叠氮钠。
作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒包括80mmol/L～120mmol/L pH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、8mmol/L～12mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.1mmol/L～0.3mmol/L叠氮钠、0.5mmol/L～0.8mmol/LMgCl2和0.2mmol/L～0.6mmol/L硫酸锌。
与现有技术相比，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法操作简单，无需预稀释试剂及样本，工作试剂无需配制可直接在各种自动分析仪上使用，定量测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的活性，尿液测定基本不受尿液氨基酸及氨的影响。实验表明，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定人血清或尿液中丙氨酰氨基肽酶的含量。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7.5～8.0的缓冲液中，待测样品与L-丙氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法，在pH7.5～8.0缓冲液中，底物L-丙氨酰对硝基苯胺在待检样品中的丙氨酰氨基肽酶作用下分解出对硝基苯胺，然后通过在405nm波长下检测每分钟对硝基苯胺吸光度的变化率(△A/分钟)，计算AAP的活性。
待测样品中丙氨酰氨基肽酶的活性按如下公式计算：
丙氨酰氨基肽酶含量(U/L)＝△A/分钟×理论因数K，
其中，上式中△A/分钟通过仪器测定的，为待测样品每分钟吸光度的变化率；理论因数K为已知的，计算公式为：理论因数(K)＝103×VT//(9.9×VS×b)＝2525(103：mmol转化umol的因数；VT：反应液总体积；9.9：对硝基苯胺在405nm处的毫摩尔消光系数；VS：样品体积；b：比色杯光径(cm))。
其中，本发明所述检测方法中，所述待测样品可以为人血清或尿液。且所述尿液无需预处理。
根据酶催化反应最适条件的要求，在酶测定体系中还需要加入一定量的激活剂。激活剂可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。其中，所述激活剂可以为二价金属离子，如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。
作为优选，本发明所述检测方法中所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌，以提供Mg2+、Zn2+。在一些实施例中，所述氯化镁为MgCl2·6H2O，所述硫酸锌为ZnSO4·7H2O。
为了酶与底物很好的结合，酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性，离子强度过高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法中所述缓冲液为pH7.5～8.0的Tris-HCL液。
进一步的，为了保证待测样品中丙氨酰氨基肽酶充分反应，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的方法中所述L-丙氨酰对硝基苯胺、激活剂均过量。
本发明还提供了一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，包括L-丙氨酰对硝基苯胺溶液、pH7.5～8.0的缓冲液和激活剂。
其中，作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述L-丙氨酰对硝基苯胺浓度为8～12mmol/L。更优选为10mmol/L。
作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
进一步的，作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述缓冲液的浓度为80mmol/L～120mmol/L。
作为优选，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
在一些实施例中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒中，所述激活剂为氯化镁和硫酸锌，其中所述氯化镁的浓度优选为0.5～0.8mmol/L，更优选为0.65mmol/L；所述硫酸锌的浓度优选为0.2～0.6mmol/L，更优选为0.5mmol/L。
进一步的，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒还包括稳定剂。
作为优选，所述稳定剂为叠氮钠。进一步的，所述叠氮钠工作浓度为0.1mmol/L～0.3mmol/L，更优选为0.2mmol/L。
在一些具体实施方案中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒包括80mmol/L～120mmol/L pH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、8mmol/L～12mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.1mmol/L～0.3mmol/L叠氮钠、0.5mmol/L～0.8mmol/LMgCl2和0.2mmol/L～0.6mmol/L硫酸锌。
进一步的，在一些实施例中，本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒由100mmol/LpH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、10mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.2mmol/L叠氮钠、0.65mmol/L MgCl2和0.5mmol/L硫酸锌组成。
本发明提供的检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒可以为单一试剂，例如，将L-丙氨酰对硝基苯胺与缓冲液、稳定剂、激活剂制成单一试剂。本发明提供的检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒也可以为双试剂。如，将缓冲液和金属离子激活剂制成第一试剂，将L-丙氨酰对硝基苯胺和稳定剂制成第二试剂，在利用该试剂盒检测丙氨酰氨基肽酶时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待测样品中的丙氨酰氨基肽酶。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒。
本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒为液体单一试剂，包括：100mmol/L pH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、10mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.2mmol/L叠氮钠、0.65mmol/L MgCl2和0.5mmol/L硫酸锌。
实施例2：本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒。
本发明所述检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒为双试剂，第一试剂包括100mmol/L PH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、0.65mmol/L MgCl2和0.5mmol/L硫酸锌，第二试剂包括10mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.2mmol/L叠氮钠。
实施例3：检测丙氨酰氨基肽酶的方法。
设定全自动生化分析仪反应温度37℃，反应方法为速率法，测定主波长405nm，反应方向为正反应，延迟时间90s，测量时间为120s，理论因数为2525。然后取待测样品与试剂盒中的试剂置于全自动生化分析仪，仪器自动加样混合，检测并记录405nm波长下的吸光度变化值。根据计算公式C样＝△A样/min×K，计算待测样品中丙氨酰氨基肽酶的浓度，其中，C样为待测样本浓度；△A样/min为样品每分钟吸光度变化率；K为理论因数，已设定为2525。
实施例4：本发明所述试剂盒稳定性试验
利用日立7080全自动生化分析仪，检测在2～8℃环境下保存不同时间的实施例1所述试剂盒的空白吸光度，结果见表1。
表1 稳定性试验
时间(d) 实施例1试剂盒
0 0.1122
7 0.1179
14 0.1252
30 0.1546
60 0.1924
180 0.2253
由表1的结果可见，本发明实施例1所述试剂盒，在2～8℃环境下保存18d空白吸光度变化较小。
按照上述方法，检测在2～8℃环境下保存不同时间的实施例2所述试剂盒的空白吸光度，结果与实施例1所述试剂盒相似。
表明本发明所述试剂盒，稳定性好，保存期长。
实施例5：本发明所述试剂盒的重复性检测
以常规血清样本作为待测样品，分成10份，分别与本发明实施例1所述试剂盒的试剂混合，按照实施例3所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中丙氨酰氨基肽酶的含量，结果见表2。
表2 样品重复性检测结果
实施例1试剂盒
44.73
44.61
44.02
44.74
44.19
43.92
43.92
43.55
44.66
44.87
CV％＝1.03％
由表2的结果可见，采用本发明实施例1所述试剂盒检测丙氨酰氨基肽酶的变异系数CV为1.02％，小于5.0％，符合《体外诊断试剂通用要求》。
按照上述方法，采用本发明实施例2所述试剂盒检测丙氨酰氨基肽酶的变异系数CV，结果与实施例1所述试剂盒相似，小于5.0％，符合《体外诊断试剂通用要求》。
表明本发明所述试剂盒重复性好。
实施例6：本发明所述检测方法的准确性检测
以不同浓度的丙氨酰氨基肽酶溶液作为待测样品，与本发明实施例1所述试剂盒的试剂混合，按照实施例3所述方法(本发明所述检测方法)，对试剂盒进行测试，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的丙氨酰氨基肽酶含量，每个浓度样本重复测定3次，计算样本测定结果的平均值按下式计算相对偏差(B％)，结果见表3。
表3 不同浓度样品丙氨酰氨基肽酶检测结果
由表3结果可见，本发明所述检测方法B％＜2.0％，符合《体外诊断试剂通用要求》，表明本发明所述检测方法准确性好。
实施例7：本发明所述检测方法线性的检测
取丙氨酰氨基肽酶浓度接近400U/L的高值样本，稀释成5个不同的浓度梯度，理论浓度值依次为25、50、100、200、400U/L，与实施例1所述试剂盒混合，按照实施例3所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样本中的丙氨酰氨基肽酶，每个浓度测定2次，取平均值，根据公式计算相关系数r值，结果见表4。
表4 样品线性检测结果
由表4的结果可见，本发明所述检测方法线性范围可达400U/L，表明本发明所述检测方法线性范围宽、适用范围广。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测丙氨酰氨基肽酶的方法，其特征在于，在pH7.5～8.0的缓冲液中，待测样品与L-丙氨酰对硝基苯胺和激活剂混合，在405nm波长处检测吸光度变化，通过每分钟吸光度的变化率计算待测样本中丙氨酰氨基肽酶的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
4.一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒，其特征在于，包括L-丙氨酰对硝基苯胺、pH7.5～8.0的缓冲液和激活剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述L-丙氨酰对硝基苯胺浓度为8～12mmol/L。
6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCL缓冲液。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述激活剂为氯化镁和/或硫酸锌。
8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括稳定剂。
9.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为叠氮钠。
10.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，包括80mmol/L～120mmol/L pH7.5～8.0Tris-HCL缓冲液、8mmol/L～12mmol/L L-丙氨酰对硝基苯胺、0.1mmol/L～0.3mmol/L叠氮钠、0.5mmol/L～0.8mmol/LMgCl2和0.2mmol/L～0.6mmol/L硫酸锌。
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