CN102253041A

CN102253041A - 一种检测肌酐的试剂盒

Info

Publication number: CN102253041A
Application number: CN2011101661366A
Authority: CN
Inventors: 董理
Original assignee: Individual
Current assignee: Changchun Hui Li Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: CN102253041B

Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，公开了一种检测肌酐的试剂盒。本发明提供的检测肌酐的试剂盒包括2，4，6-三硝基苯酚、pH12.5～13.5的缓冲溶液和曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物。曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物可包围2，4，6-三硝基苯酚分子，在pH12.5～13.5的缓冲体系中，减缓2，4，6-三硝基苯酚与NaOH的迅速接触，提高试剂的稳定性，保证肌酐检测结果的准确性。试验表明本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，应用本发明所述试剂盒检测肌酐准确性高、精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中肌酐含量。

Description

一种检测肌酐的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测肌酐的试剂盒。

背景技术

肌酐(creatinine，Cr)是肌肉在人体内代谢的产物，每20g肌肉代谢可产生1mg肌酐。血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。

在肌肉中，肌酸主要通过不可逆的非酶脱水反应缓缓地形成肌酐，再释放到血液中，随尿排泄。因此血肌酐与体内肌肉总量关系密切，不易受饮食影响。肌酐是小分子物质，通过肾小球滤过排出体外。在肾小管内很少吸收，每日体内产生的肌酐，几乎全部随尿排出，一般不受尿量影响。肾功能不全时，肾小球过滤降低，造成血清肌酐水平增加在体内蓄积成为对人体有害的毒素。血浆肌酐的正常上限值为100μmol/L左右。

肾单位时间内，把若干毫升血浆中的内生肌酐全部清除出去，称为内生肌酐清除率(Ccr)。临床上检测血肌酐，计算内生肌酐清除率，可反映肾小球滤过功能和粗略估计有效肾单位的数量，因其操作方法简便，干扰因素较少，敏感性较高，为目前临床常用的较好的肾功能试验之一。

血清肌酐含量的测定方法有很多，现有技术中主要有酶比色法和Jaffe氏苦味酸测定法。

酶比色法的反应原理是以肌酐作为底物，经肌酐脱氨酶催化脱氨生成甲基乙内酰脲，氨与α-酮戊二酸和NADH在谷氨酸脱氢酶的作用生成谷氨酸，NAD和水，在340nm波长下测定NADH的吸光度变化率，计算其含量。虽然酶比色法广泛应用于肌酐测定，但是酶比色法试剂稳定性不好，检测结果重复性差，且价格昂贵。

Jaffe氏苦味酸法的反应原理是样品中的肌酐在碱性环境与苦味酸(2，4，6-三硝基苯酚)反应生成橙红色的复合物，将反应液置于紫外/可见光分析仪下或半、全自动生化分析仪下，检测在主波长510nm处吸光度上升的速度，通过吸光度变化值，测算样品中肌酐的活性。然而现有的Jaffe氏苦味酸法试剂稳定性不好，2，4，6-三硝基苯酚与碱性缓冲溶液混合后24h内就明显变红，致使检测结果偏高，检测准确性降低。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是针对现有检测肌酐的试剂盒中2，4，6-三硝基苯酚与碱性缓冲溶液混合稳定性差的问题，提供了一种稳定性好的检测肌酐的试剂盒。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测肌酐的试剂盒，包括2，4，6-三硝基苯酚、pH12.5～13.5的缓冲溶液和曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物。

2，4，6-三硝基苯酚，又名苦味酸，英文名为2，4，6-Trinitrophenol、Picricacid，为淡黄色结晶固体，具有苦杏仁味，分子式为C₆H₃N₃O₇，分子量为229.11。现有的Jaffe氏苦味酸法试剂稳定性差，2，4，6-三硝基苯酚与碱性缓冲溶液混合后24h内就明显变红。本发明人发现曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物可包围2，4，6-三硝基苯酚的分子，在pH12.5～13.5的缓冲体系中，可以减缓2，4，6-三硝基苯酚与NaOH的迅速接触，提高试剂的稳定性，保证肌酐检测结果的准确性。

优选的，本发明所述试剂盒中，所述曲拉通X-100与二甲基亚砜体积比为1∶50～1∶100。

优选的，本发明所述试剂盒中，所述二甲基亚砜的加入量为1～20v/v％。试验表明，随着二甲基亚砜加入量的增多，空白吸光度的变化越小，当二甲基亚砜加入量超过10v/v％后，即加入量为10～20v/v％时空白吸光度基本不再变化。因此，本发明所述试剂盒中，所述二甲基亚砜的加入量优选为9.5～10.5v/v％，以降低成本，更优选为10v/v％。

由于肌酐与2，4，6-三硝基苯酚在碱性环境下反应才能生成橙红色的复合物，因此为了保证待测样品中的肌酐能与2，4，6-三硝基苯酚反应，本发明所述试剂盒还包括pH12.5～13.5的缓冲溶液。作为优选，本发明所述pH12.5～13.5的缓冲溶液为Tris、碳酸钠、碳酸氢钠和氢氧化钠的混合溶液。Tris、碳酸钠和碳酸氢钠可以形成缓冲体系，氢氧化钠可以保证缓冲体系为碱性。

优选的，所述试剂盒包括体积分数为0.1～0.2％曲拉通X-100、体积分数为9.5～10.5％二甲基亚砜、3～10mmol/L 2，4，6-三硝基苯酚、50～100mmol/LTris、25～30mmol/L碳酸钠、2.5～3.0mmol/L碳酸氢钠和80～120mmol/L氢氧化钠。

在一个具体实施方案中，所述是试剂盒包括体积分数为0.1％曲拉通X-100、体积分数为10％二甲基亚砜、6mmol/L2，4，6-三硝基苯酚、50mmol/LTris、28mmol/L碳酸钠、2.8mmol/L碳酸氢钠和100mmol/L氢氧化钠。

优选的，本发明所述试剂盒还包括硅酸钠。硅酸钠为无色正交双锥结晶或白色至灰白色块状物或粉末，分子式为Na₂SiO₃·9H₂O，分子量为284.20，易溶于水，溶于稀氢氧化钠溶液，主要用于作为防火剂和黏合剂。本发明所述试剂盒中硅酸钠可以清除2，4，6-三硝基苯酚和反应产物的残留，避免肌酐与2，4，6-三硝基苯酚反应生成的复合物对检测仪器的影响，保证了仪器检测结果的准确性。优选的，所述硅酸钠浓度为80～120mmol/L，更优选为100mmol/L。

优选的，本发明所述试剂盒还包括标准溶液。所述标准溶液优选为150～250μmol/L的肌酐溶液，更优选为200μmol/L的肌酐溶液。

本发明提供的检测肌酐的试剂盒可以为单一试剂，也可以为双试剂。例如，将2，4，6-三硝基苯酚和复合表面活性剂与缓冲液制成稳定的单一试剂；或者，将2，4，6-三硝基苯酚与复合表面活性剂制成第一试剂，将缓冲液制成第二试剂，在利用该试剂盒检测肌酐时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待测样品中的肌酐。

从上述的技术方案可以看出，本发明所述检测肌酐的试剂盒包括2，4，6-三硝基苯酚、pH12.5～13.5的缓冲溶液和曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物。曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物可包围2，4，6-三硝基苯酚的分子，在pH12.5～13.5的缓冲体系中，可以减缓2，4，6-三硝基苯酚与NaOH的迅速接触，提高试剂的稳定性，保证肌酐检测结果的准确性。本发明所述试剂盒还包括硅酸钠。硅酸钠可以清除2，4，6-三硝基苯酚和反应产物的残留，避免肌酐与2，4，6-三硝基苯酚反应生成的复合物对检测仪器的影响，保证了仪器检测结果的准确性。试验表明，本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，应用本发明所述试剂盒检测肌酐结果准确性高，精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中肌酐含量。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种检测肌酐的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种检测肌酐的试剂盒进行详细说明。

实施例1：本发明所述检测肌酐的试剂盒。

本发明所述检测肌酐的试剂盒为液体单一试剂，包括：0.1％曲拉通X-100、体积分数为10％二甲基亚砜、6mmol/L2，4，6-三硝基苯酚、100mmol/L硅酸钠、50mmol/L Tris、28mmol/L碳酸钠、2.8mmol/L碳酸氢钠和100mmol/L氢氧化钠。

标准液：200μmol/L肌酐。

实施例2：本发明所述检测肌酐的试剂盒。

本发明所述检测肌酐的试剂盒为液体单一试剂，包括：0.15％曲拉通X-100、体积分数为10.5％二甲基亚砜、10mmol/L2，4，6-三硝基苯酚、100mmol/L Tris、30mmol/L碳酸钠、3.0mmol/L碳酸氢钠和120mmol/L氢氧化钠。

标准液：150μmol/L肌酐。

实施例3：本发明所述检测肌酐的试剂盒。

本发明所述检测肌酐的试剂盒为液体单一试剂，包括：0.2％曲拉通X-100、体积分数为9.5％二甲基亚砜、3mmol/L2，4，6-三硝基苯酚、120mmol/L硅酸钠、50mmol/L Tris、25mmol/L碳酸钠、2.5mmol/L碳酸氢钠和80mmol/L氢氧化钠。

标准液：250μmol/L肌酐。

实施例4：检测肌酐的方法。

设定全自动生化分析仪反应温度37℃，反应方法为两点速率法，测定主波长510nm，反应方向为正反应，延迟时间30s，测量时间为60s，标准液浓度为200μmol/L。然后取待测样品与试剂盒中的试剂混合均匀后，置于全自动生化分析仪，检测并记录510nm波长下的吸光度变化值。200μmol/L肌酐标准溶液与上述处理相同。根据计算公式C_样＝(ΔA_样/min)/(ΔA_标/min)×C_标，计算待测样品中肌酐的浓度，其中，C_样为待测样本浓度；C_标为标准液浓度；ΔA_样/min为样品每分钟吸光度变化率；ΔA_标/min为标准液每分钟吸光度变化率。

实施例5：二甲基亚砜加入量的比较试验

取6mmol/L2，4，6-三硝基苯酚、50mmol/L Tris、28mmol/L碳酸钠、2.8mmol/L碳酸氢钠和100mmol/L氢氧化钠，分别与不同体积的二甲基亚砜与曲拉通X-100组成的混合物混合，其中曲拉通X-100的加入量为0.1v/v％，在室温条件下进行试验考察，考察7天，检测加入不同体积的二甲基亚砜与曲拉通X-100组成的混合物后空白吸光度的变化，结果见表1。

表1二甲基亚砜加入量比较试验

由表1的结果可见，在室温下考察7天，加入不同体积的二甲基亚砜与曲拉通X-100组成的混合物后空白吸光度的变化减小，随着二甲基亚砜加入量的增多，空白吸光度的变化越小，当二甲基亚砜加入量超过10v/v％后，即加入量为10～20v/v％时空白吸光度基本不再变化，表明二甲基亚砜与曲拉通X-100组成的混合物的加入，可以减缓2，4，6-三硝基苯酚与NaOH的迅速接触，提高试剂的稳定性。

实施例6：本发明所述试剂盒稳定性试验

利用日立7080全自动生化分析仪，检测在2～8℃环境下保存不同时间的实施例1所述试剂盒的空白吸光度，结果见表2。

表2稳定性试验

由表2的结果可见，与市售肌酐双试剂(YZB 0014-2009)按比例混合成的工作试剂相比，本发明所述试剂盒半年内的空白吸光度的变化明显小于现有的肌酐双试剂的空白吸光度，表明本发明所述试剂盒稳定性优于现有的肌酐双试剂。

实施例7：

分别取本发明实施例1所述试剂盒和不含硅酸钠的现有的肌酐双试剂(苦味酸法)2mL，倒入2个比色杯中，放置1min后将比色杯中试剂全部倒出，向比色杯中加2mL蒸馏水混合均匀，测定405nm下的吸光度，记录结果1；再将比色杯中试剂全部倒出，向比色杯中再加2mL蒸馏水混合均匀，测定405nm下的吸光度，记录结果2。试验设一次重复，统计结果见表3。

表3残余量对比试验

由表3的结果可见，与现有的肌酐双试剂(苦味酸法)相比，本发明所述试剂盒残余量少，表明硅酸钠存在可以清除2，4，6-三硝基苯酚和反应产物的残留，避免肌酐与2，4，6-三硝基苯酚反应生成的复合物对检测仪器的影响，保证了仪器检测结果的准确性。

实施例8：本发明所述试剂盒准确性分析

以朗道质控中值和朗道质控高值血清作为待测样品，按照实施例4所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的肌酐含量，设三个重复，与市售肌酐双试剂(苦味酸法)比较，结果见表4。

表4朗道质控样品肌酐含量检测结果

注：朗道质控中值样品靶值靶值：129μmol/L，

朗道质控高值样品靶值337μmol/L，

由表4结果可见，本发明所述试剂盒在质控品的

范围内，符合《体外诊断试剂通用要求》。与现有肌酐双试剂相比，本发明所述试剂盒，朗道质控血清测定平均值与靶值更接近，表明本发明所述试剂盒准确性好。

实施例9：本发明所述试剂盒重复性检测

以常规血清样本作为待测样品，按照实施例4所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的肌酐含量，与市售肌酐双试剂(苦味酸法)比较，结果见表5。

表5样品重复性检测结果

本发明所述试剂盒	市售肌酐试剂
		82.6	83.6
81.2	79.2
		78.0	77.6
79.4	78.0
		81.6	80.6
82.6	83.4
		81.9	82.3
80.3	79.6
		81.4	83.9
82.7	81.9
		CV％＝1.88％	CV％＝2.89％

由表5结果可见，采用本发明所述试剂盒检测肌酐的变异系数CV＝1.88％，小于5％，符合《体外诊断试剂通用要求》，并且小于现有的肌酐试剂的变异系数，表明本发明所述试剂盒重复性好。

实施例10：本发明所述试剂盒线性的检测

取肌酐浓度接近1000μmol/L的高值血清，稀释成5个不同的浓度梯度，理论浓度值依次为100、200、400、800、1000μmol/L，按照实施例4所述方法，利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的肌酐，每个浓度测定2次，取平均值，根据公式计算相关系数r值，结果见表6。

表6样品线性检测结果

由表6的结果可见，本发明所述试剂盒线性范围可达1000μmol/L，表明本发明所述试剂盒线性范围宽、适用范围广。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种检测肌酐的试剂盒，其特征在于，包括2，4，6-三硝基苯酚、pH12.5～13.5的缓冲溶液和曲拉通X-100与二甲基亚砜的混合物。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述曲拉通X-100与二甲基亚砜体积比为1∶50～1∶100。

3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述二甲基亚砜的加入量为1～20v/v％。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述二甲基亚砜的加入量为10v/v％。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述pH12.5～13.5的缓冲溶液为Tris、碳酸钠、碳酸氢钠和氢氧化钠的混合溶液。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，包括体积分数为0.1～0.2％曲拉通X-100、体积分数为9.5～10.5％二甲基亚砜、3～10mmol/L 2，4，6-三硝基苯酚、50～100mmol/L Tris、25～30mmol/L碳酸钠、2.5～3.0mmol/L碳酸氢钠和80～120mmol/L氢氧化钠。

7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括硅酸钠。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述硅酸钠浓度为80～120mmol/L。

9.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括标准溶液。

10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述标准溶液为150～250μmol/L的肌酐溶液。