DE69021161T2 - Verfahren zur Bestimmung einer Substanz durch Verwendung von chemilumineszenz. - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung einer Substanz durch Verwendung von chemilumineszenz.

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DE69021161T2
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luminol
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

    Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hochempfindlichkeitsanalyse durch Chemilumineszenzmessung bei der enzymatischen Reaktion, einer Antigen-Antikörper-Reaktion und der Kernsäurehybridisierung in den Bereichen des klinischen Laborversuchs, der Lebesmittelinspektion, der Umweltanalyse, der Untersuchung von Tieren und Pflanzen und einer Kontrollprüfung von Herstellungsverfahren.
    • Hintergrund des Fachgebietes
  • Die Lumineszenzreaktion unter Anwendung der Oxidation von Luminol, Isoluminol oder eines Derivats davon (nachfolgend als chemilumineszierendes DPD (2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion) abgekürzt) durch Peroxidase wird für den Immunoassay, die Analyse von Elastase, die Analyse von Glucose und die Analyse von Oxidantien angewendet.
  • Zur Verbesserung der Lumineszenzintensität der Lumineszenzreaktion ist bekanntlich der Zusatz eines Verstärkers zu diesem Reaktionssystem effektiv, wie er zum Beispiel nachfolgend gezeigt ist.
  • (1) 6-Hydroxybenzothiazol (Patentschrift Nr. JP-A-56-500252)
  • (2) Eine bestimmte Phenolart mit einer Substituentengruppe (Patentschrift Nr. JP-A-59-171839)
  • (3) Eine bestimmte Art eines aromatischen Amins (Patentschrift Nr. JP-A-61-54453)
  • Diese Verstärker weisen jedoch folgende Schwierigkeiten auf.
  • Der Verstärker (1) hat im allgemeinen eine geringere Lumineszenzintensität und ein geringes Signal/Hintergrund-Verhältnis.
  • Der typische Verstärker der Klasse (2) ist p-Jodphenol. Sein Lumineszenzsignal ist hoch, der Hintergrund ist jedoch ebenfalls stark, deshalb ist das Signal/Hintergrund-Verhältnis relativ niedrig.
  • Im Falle eines typischen Verstärkers der Klasse (3) oder N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin ist der Anstieg des Lumineszenzpeaks gering, und für die Messung ist viel Zeit notwendig.
  • Für den Reaktionsmechanismus dieser Verstärkerwirkung gibt es Berichte, die die notwendige wirksame Bildung eines Luminolsemichinon-Radikals (Thorpe, G.H.C. und Kricka, L.J., "Bioluminescence and Chemiluminescence: New Perspectives", Scholmerich, J., Andreesn, R., Kapp, A., Ernst, M. und Woods, W.G. (Hrsg.) John Wiley, Chichester, S. 199-208 (1987)) und die notwendige wirksame Bildung eines Phenoxy- Radikals vorschlagen (Hodgson, M. und Jones, P., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, Bd. 3, S. 21-25 (1989)).
  • Die Phenolderivate umfassen jedoch eine Anzahl von Verbindungen, die keine Verstärkerwirkung zeigen, und die Wahl des wirksamen Verstärkers ist auf der Basis der vorangegangenen Theorien schwierig.
  • Zum Nachweis oder zur mengemäßigen Erfassung eines Gens in einem virulenten Mikroorganismus, von Prostaglandin oder einer anderen physiologisch wirksamen Substanz, des Luteinisierungshormons (LH) und anderer anteriorer hypophysärer Hormone und Cytokine, z.B. Interleukin im Blut, ist es erforderlich, daß eine sehr geringe Menge in der Körperflüssigkeit bestimmt wird. Deshalb wird ein hochempfindliches Nachweissystem gesucht, und zur Verbesserung der Empfindlichkeit beim Nachweis wird ein Verstärker mit größerer Wirksamkeit gefordert.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Hochempfindlichkeits-Lumineszenzanalyse bereitzustellen, das charakteristischerweise in Gegenwart eines neuen Verstärkers erfolgt.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines neuen Oxazol-Derivats, das als Verstärker wirksam ist und die Durchführung der Lumineszenzanalyse mit einem Verstärker ermöglicht, der eine größere Wirksamkeit als die herkömmlich verwendeten Verstärker hat.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Nach der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer Substanz durch Chemilumineszenz, die durch Reaktion von (a) Peroxidase oder eines Derivats davon, (b) eines Oxidans und (c) Luminol oder Isoluminol oder eines Derivats davon erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die die Lumineszenz einleitende Reaktion in Gegenwart von zumindest einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die 2-Hydroxy-9-fluorenon umfaßt, wobei die Verbindung durch die Formel
  • ausgedrückt wird,
  • und Oxazol-Derivaten erfolgt, die durch die Formel
  • ausgedrückt werden,
  • wobei R&sub1; Wasserstoff, CnH2n+1, XCnH2n, CnH2n+1CO&sub2;, eine Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe, CnH2n+1C&sub6;H&sub4;, YC&sub6;H&sub4; oder XYC&sub6;H&sub3; darstellt, wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X F, Cl, Br oder J ist, und Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe ist.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Analyse von CA15-3 mit dem erfindungsgemäßen Verstärker oder 2-Hydroxy-9-fluorenon, die dagegen verwendet wurden, wobei herkömmliche Verstärker eingesetzt werden, wobei Fig. 1 die SN-Verhältnisse der Lumineszenzintensität nach 5 Sekunden und Fig. 2 die nach 10 Sekunden zeigen;
  • Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse von CA15-3 mit und ohne Zusatz des erfindungsgemäßen Verstärkers zum Lumineszenzsystem;
  • Fig. 4 ist ein IR-Spektrum von 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxazol, das in Beispiel 19 erhalten wurde, und Fig. 5 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 6 ist das IR-Spektrum von 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 20 erhalten wurde, und Fig. 7 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 8 ist das IR-Spektrum von 2-(3-Bromphenyl)-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 21 erhalten wurde, und Fig. 9 ist das NNR-Spektrum davon;
  • Fig. 10 ist das IR-Spektrum von 2-(2-Methylphenyl)-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 22 erhalten wurde, und Fig. 11 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 12 ist das IR-Spektrum von 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 35 erhalten wurde, und Fig. 13 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 14 ist das IR-Spektrum von 2-(4-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 36 erhalten wurde, und Fig. 15 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 16 ist das IR-Spektrum von 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 37 erhalten wurde, und Fig. 17 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 18 ist das IR-Spektrum von 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol, das im Beispiel 38 erhalten wurde, und Fig. 19 ist das NMR-Spektrum davon;
  • Fig. 20 zeigt die Werte des SN-Verhältnisses, das im Beispiel 51 und im Bezugsbeispiel 22 erhalten wurde.
    • Beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung
  • Die die Chemilumineszenz verbessernde Wirkung des erfindungsgemäßen Verstärkers oder von 2-Hydroxy-9-fluorenon [4-Hydroxy-3-[3-(4-Hydroxyphenyl)-1-oxo-2-propenyl]-2H- 1-benzopyran-2-on (nachfolgend als HHBP abgekürzt]
  • oder eines Oxazol-Derivats, das durch die Formel [I] ausgedrückt wird, kann bestätigt werden, da das Lumineszenzsignal/Hintergrund-Verhältnis, das beim System aus Peroxidase/Oxidans/chemilumineszierendem DPD erhalten werden kann, stark verbessert wird, wenn dem System der erfindungsgemäße Verstärker zugesetzt wird. Der hier verwendete Begriff "Hintergrund" betrifft die Lumineszenzintensität bei Abwesenheit von Peroxidase oder einem Derivat davon.
  • Die nach der vorliegenden Erfindung verwendete Peroxidase ist nicht besonders begrenzt, ist jedoch vorzugsweise eine Pflanzenperoxidase, z .B. Meerrettichperoxidase. Als Peroxidase-Derivat können zum Beispiel aufgeführt werden: ein Peroxidase-Antikörper-Konjugat, ein Peroxidase-Antigen-Konjugat, ein Peroxidase-Streptoavidin-Konjugat und Biotin-gebundene Peroxidase. Der hier verwendete Antikörper ist nicht besonders begrenzt, Teilstrukturen, wie Fab' und F(ab)&sub2; können jedoch zusätzlich zu intaktem IgG und IgM bevorzugt verwendet werden. Das Antigen ist ebenfalls nicht begrenzt, und Haptene mit geringerem Molekulargewicht, z.B. Fluorescein und Steroidhormon, und hochmolekulare Substanzen, z.B. Polypeptide, Proteine und Polysaccharide lassen sich genauso gut einsetzen.
  • Für die Nucleinsäurehybridisierung können lineare und cyclische DNA und BNA mit 10 oder mehr Basen verwendet werden.
  • Als Oxidans wird bevorzugt Wasserstoffperoxid verwendet, es können jedoch auch Perborate und Hypochlorite verwendet werden.
  • Das nach der vorliegenden Erfindung verwendete chemilumineszierdende DPD umfaßt Luminol, Isoluminol und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol und daran gebundene Antigene, Antikörper und Nucleinsäuren. Davon ist Luminol besonders bevorzugt.
  • Das nach der vorliegenden Erfindung als Verstärker verwendete HHBP kann durch Kondensation von 3-Acetyl-4-hydroxycumarin und p-Hydroxybenbenzoaldehyd in Gegenwart eines Amins nach dem Verfahren hergestellt werden, das in der Patentschrift Nr. JP-A-50-46666 beschrieben wird.
  • Wie bereits beschrieben betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hochempfindlichkeits-Lumineszenzanalyse, das charakteristischerweise in Gegenwart eines Oxazol-Derivats erfolgt, das durch die Formel
  • dargestellt wird (in der Formel stellt R&sub1; Wasserstoff, CnH2n+1 (hier ist n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4), XCnH2n (hier ist X F, Cl, Br oder J und n wie bereits definiert), CnH2n+1CO&sub2; (wobei n wie bereits definiert ist), CnH2n+1C&sub6;H&sub4; (wobei n wie bereits definiert ist), eine Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe, YC&sub6;H&sub4; (wobei Y F, Cl, Br oder eine Phenylgruppe ist) oder XYC&sub6;H&sub3; (wobei x und Y wie bereits definiert sind) dar).
  • Insbesondere können für R&sub1; in der erfindungsgemäßen Verbindung [I] Wasserstoff und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufgeführt werden, z.B. eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- (n- und Iso-), eine Butyl- (n-, Iso-, sek.- und tert.-) und eine Phenylgruppe.
  • Für die halogenierte Alkylgruppe können die Gruppen aufgeführt werden: Fluormethyl, 1-Chlormethyl, Brommethyl, Jodmethyl, 1-Fluorethyl, 2-Fluorethyl, 1-Chlorethyl, 2-Chlorethyl, 1-Bromethyl, 2-Bromethyl, 1-Jodethyl, 2-Jodethyl, 1- Fluorpropyl, 2-Fluorpropyl, 3-Fluorpropyl, 1-Fluor-1-methylethyl, 2-Fluor-1-methylethyl, 1-Chlorpropyl, 2-Chlorpropyl, 3-Chlorpropyl,1-Chlor-1-methylethyl, 2-Chlor-1-methylethyl, 1-Brompropyl, 2-Brompropyl, 3-Brompropyl, 1-Brom-1-methylethyl, 2-Brom-1-methylethyl, 1-Jodpropyl, 2-Jodpropyl, 3- Jodpropyl, 1-Jod-1-methylethyl, 2-Jod-1-methylethyl, 1- Fluorpropyl, 2-Fluorbutyl, 3-Fluorbutyl, 4-Fluorbutyl, 1- Fluor-1-methylpropyl, 2-Fluor-1-methylpropyl, 3-Fluor-1-methylpropyl, 1-Fluormethylpropyl, 1-Fluor-2-methylpropyl, 2- Fluor-2-methylpropyl, 3-Fluor-2-methylpropyl, 1-Fluormethyl- 1,1-dimethylmethyl, 1-Chlorbutyl, 2-Chlorbutyl, 3-Chlorbutyl, 4-Chlorbutyl, 1-Chlor-1-methylpropyl, 2-Chlor-1-methylpropyl, 3-Chlor-1-methylpropyl, 1-Chlormethylpropyl, 1- Chlor-2-methylpropyl, 2-Chlor-2-methylpropyl, 3-Chlor-2-methylpropyl, 1-Chlormethyl-1,1-dimethylmethyl, 1-Brombutyl, 2-Brombutyl, 3-Brombutyl, 4-Brombutyl, 1-Brom-1-methylpropyl, 2-Brom-1-methylpropyl, 3-Brom-1-methylpropyl, 1-Brommethylpropyl, 1-Brom-2-methylpropyl, 2-Brom-2-methylpropyl, 3 - Brom-2-methylpropyl, 1-Brommethylmethyl-1,1-dimethylmethyl, 1-Jodbutyl, 2-Jodbutyl, 3-Jodbutyl, 4-Jodbutyl, 1-Jod-1-methylpropyl, 2-Jod-1-methylpropyl, 3-Jod-1-methylpropyl, 1- Jod-2-methylpropyl, 2-Jod-2-methylpropyl, 3-Jod-2-methylpropyl und 1-Jodmethyl-1,1-dimethylmethyl.
  • Als Alkoxycarbonylgruppe können die Gruppen aufgeführt werden: Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, 1-Methylethoxycarbonyl, Butoxycarbonyl, 1-Methylpropoxycarbonyl, 2-Methylpropoxycarbonyl und 1,1-Dimethylethoxycarbonyl.
  • Als alkylsubstituierte Phenylgruppe können die Gruppen aufgeführt werden: 2-Methylphenyl, 3-Methylphenyl, 4-Methylphenyl, 2-Ethylphenyl, 3-Ethylphenyl, 4-Ethylphenyl, 2-Propylphenyl, 3-Propylphenyl, 4-Propylphenyl, 2-(1-Methylethyl), 3-(1-Methylethyl), 4-(1-Methylethyl), 2-Butylphenyl, 3-Butylphenyl, 4-Butylphenyl, 2-(1-Methylpropyl)phenyl, 3-(1-Methylpropyl)phenyl, 4-(1-Methylpropyl)phenyl, 2-(2-Methylpropyl)phenyl, 3-(2-Methylpropyl)phenyl, 4-(2-Methylpropyl)phenyl, 2-(1,1-Dimethylethyl)phenyl, 3-(1,1-Dimethylethyl)phenyl und 4-(1,1-Dimethylethyl)phenyl.
  • Als halogensubstituierte Phenylgruppe können die Gruppen aufgeführt werden: 2-Fluorphenyl, 3-Fluorphenyl, 4-Fluorphenyl, 2-Chlorphenyl, 3-Chlorphenyl, 4-chlorphenyl, 2-Bromphenyl, 3-Bromphenyl, 4-Bromphenyl, 2-Jodphenyl, 3-Jodphenyl und 4-Jodphenyl.
  • Als disubstituierte Phenylgruppe können die Gruppen 2,4-Dichlorphenyl und 3,5-Dichlorphenyl aufgeführt werden.
  • Bevorzugte substituierende Gruppen davon sind Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Chlormethylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe, eine 2-Methylphenylgruppe, eine 3-Bromphenylgruppe, eine 4-Chlorphenylgruppe und eine 2,4-Dichlorphenylgruppe.
  • Von den durch die Formel [I] dargestellten Verbindungen ist jedes Oxazolderivat, das durch die Formel
  • ausgedrückt wird, eine neue Substanz (in der Formel ist R&sub2; XCnH2n (wobei X hier F, Cl, Br oder J ist und n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist), CnH2n+1CO&sub2; (wobei n wie oben definiert ist), Cnh2n+1C&sub6;H&sub4; (wobei n wie oben definiert ist), eine Naphthylgruppe, YC&sub6;H&sub4; (wobei Y F, Cl, Br oder J oder eine Phenylgruppe ist), XYC&sub6;H&sub3; (wobei X und Y wie oben definiert sind).
  • Die erfindungsgemäße Verbindung [I] kann durch Synthese nach der Reaktionsgleichung hergestellt werden: Base
  • (in dieser Formel ist RI Wasserstoff, CnH2n+1 (wobei n hier eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist), XCnH2n (wobei X hier F, Cl, Br oder J ist und n wie oben definiert ist), CnH2n+1CO&sub2; (wobei n wie oben definiert ist), eine Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe, CnH2n+1C&sub6;H&sub4; (wobei n wie oben definiert ist), YC&sub6;H&sub4; (wobei Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe ist) oder XYC&sub6;H&sub3; (wobei x und Y wie oben definiert sind); R&sub3; CnH2n+1 ist (wobei n wie oben definiert ist); und Z F, Cl, Br oder J ist).
  • Insbesondere ist hier R&sub1;, das in der Verbindung [III] verwendet wird, das gleiche wie R&sub1;, das in der Verbindung [I] verwendet wird.
  • Als Alkylgruppe R&sub3; können zum Beispiel die Gruppen aufgeführt werden: Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl und 1,1-Dimethylethyl.
  • Die nach der vorliegenden Erfindung verwendete Base umfaßt Carbonate, wie Natriumhydrogencarbonat, Kaliumhydrogencarbonat, Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat, Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin und t-Butylamin, und aromatische heterocyclische Verbindungen, wie Pyridin und Chinolin; Natriumhydrogencarbonat ist jedoch besonders bevorzugt.
  • Die Reaktion erfordert kein Lösungsmittel und verläuft bei einer Tempertur von 20 bis 150ºC; zur Verbesserung der Ausbeute der gewünschten Verbindung ist jedoch eine Temperatur von 50 bis 120ºC bevorzugt.
  • Die Oxazol-Verbindung [I] kann auch, wenn R&sub1; XCnH2n (wobei X F, Cl, Br oder J ist und n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 darstellt) nach der Gleichung (2) hergestellt werden, oder wenn R&sub1; YC&sub6;H&sub4; ist (wobei Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe ist) nach der folgenden Gleichung (3) hergestellt werden:
  • (in dieser Gleichung ist R&sub3; CnM2n+1 (wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist), und X und Z sind F, Cl, Br bzw. J).
  • Als halogenierte Alkylgruppe, die in der Verbindung [IV] verwendet wird, kann die gleiche halogenierte Alkylgruppe verwendet werden, wie sie bei der Verbindung [I] verwendet wird. Als R&sub3;, das bei der Verbindung [IV] verwendet wird, kann das gleiche R&sub3; verwendet werden, das bei der Verbindung [III] verwendet wird.
  • Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Reaktionslösungsmittel umfaßt Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, Ether, wie Ethylether und THF, und aprotische polare Lösungsmittel, wie DMF und DMSO. Davon ist Ethanol besonders bevorzugt.
  • Die Reaktion verläuft bei einer Temperatur von 20 bis 150ºC, zur Verbesserung der Ausbeute des gewünschten Produktes ist jedoch eine Temperatur von 60 bis 90ºC bevorzugt. Base Lösungsmittel
  • (in dieser Gleichung ist Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe und Z F, Cl, Br oder J).
  • Als substituierte Phenylgruppe, die bei der Verbindung [V] verwendet wird, kann die halogenierte Phenylgruppe oder Phenylphenylgruppe verwendet werden, die bei der Verbindung [I] verwendet wird.
  • Die erste Stufe der Reaktion erfordert kein Lösungsmittel und verläuft bei einer Temperatur von 100 bis 280ºC, damit jedoch die Ausbeute der Verbindung [VI] verbessert wird, ist eine Temperatur von 150 bis 250ºC bevorzugt.
  • Die für die hydrolytische Reaktion der Verbindung [VI] verwendete Base umfaßt Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Natriumcarbonat, Natriumhydroxid ist jedoch besonders bevorzugt. Als Lösungsmittel sind Wasser, Alkohole, wie Methanol und Ethanol, und Ether, wie THF, verwendbar, eine Mischung aus Wasser/Ethanol ist jedoch besonders bevorzugt.
  • Die hydrolytische Reaktion verläuft bei einer Temperatur von 20 bis 50ºC, damit jedoch die Ausbeute der gewünschten Verbindung verbessert wird, ist eine Temperatur von 25 bis 35ºC bevorzugt.
  • Der erfindungsgemäße Verstärker ist zur Bestimmung einer Substanz bei der Verwendung eines Lumineszenzsystems verwendbar, das Peroxidase, chemilumineszierendes DPD und ein Oxidans umfaßt, er ist jedoch besonders für die Bestimmung durch enzymatischen Immunoasssay und DNA-Hybridisierung verwendbar.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezug auf die Beispiele detailliert beschrieben.
  • Die in den Beispiele verwendeten Reagenzien und die Vorrichtung werden nachfolgen beschrieben.
    • Reagenzien
  • 4-Aminoresorcinolhydrochlorid und Chloracetonitril wurden von Aldrich Co. geliefert; Ethanol, DMSO, Diethyloxalat, 3- Brombenzoylchlorid, 2-Methylbenzoylchlorid, 4-Chlorbenzoylchlorid, 2,4-Dichlorbenzoylchlorid, Luminol (5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion und Isoluminol (6-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazindion) wurden von Tokyo Kasei Co. geliefert; Phosphorpentachlorid und Natriumhydrogencarbonat wurden von Kanto Kagaku Co. geliefert; der Hydrogenchloridzylinder wurde von Tsurumi Soda Co. geliefert; N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (ABEI) und Tris(hydroxymethyl)aminomethan wurden von Sigma Chemical Co. geliefert; Meerrettichperoxidase (HRP) wurde von Boehringer Mannheim GmbH geliefert, PBS-Pulver wurde von Nissui Seiyaku Co. geliefert; Sinderserumalbumin (BSA) wurde Seikagaku Kogyo Co. geliefert; und 2-Hydroxy-9-flurenon wurde von Aldrich Chemical Co. geliefert.
  • HHBP wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in der Patentschrift Nr. JP-A-50-46666 beschrieben ist.
  • Das mit Brustdrüsenkrebs verwandte Antigen (CA15-3) und der CA15-3-Antikörper (monoklonaler Anitkörper der Maus) wurden von Centocor (Malvern, USA) bereitgestellt. Der mit Meerrettichperoxidase markierte CA15-3-Antikörper wurde nach dem Maleimid-hinge-Verfahren hergestellt (Yoshitake, S. et al., J. Biochem. 92, 1413-1424 (1982)) und mit einer Hydroxylapatit-Säule (Mitsui-Toatsu, HCA-Säule, 7,6 mm x L 100 mm) mit Pharmacia's FPLC abgetrennt und gereinigt.
  • Mit dem CA15-3-Antikörper überzogene Polystyrolkügelchen wurden hergestellt, indem Polystyrolkügelschen mit einem Durchmesser von 6 mm (Meiwa Fusso Shokai, Oberflächenrauheit #80) über Nacht in eine PBS-Lösung des CA15-3-Antikörpers mit 10 ug/ml getaucht wurden.
    • Analysevorrichtung
  • Die Chemilumineszenzreaktion erfolgte in einem 3 ml Einwegplastikrohr mit 12 mm x 47 mm. Das erzeugte Licht wurde mit einem Lumineszenzmeßgerät (Biolumat LB9500T) nachgewiesen, das von Berthold Co. hergestellt wird.
  • Das Infrarotspektrum (nachfolgend als IR abgekürzt) wurde mit FT/IR-5000 gemessen, ein Produkt von Nippon Bunko Kogyo Co.
  • Das magnetische Kernresonanzspektrum (nachfolgend als NMR abgekürzt) wurde mit EX90FTNMR gemessen, einem Produkt von Nippon Denshi Co.
  • Das Massenspektrum (nachfolgend als MS abgekürzt) wurde durch das Direkteinführungsverfahren gemessen, wobei der Spektrograph JMS D300 verwendet wurde. Die Hochauflösung MS wurde unter Verwendung des Spektrographen JMS DX-303 bestimmt.
    • Beispiel 1 Lumineszenzanalyse von Peroxidase unter Verwendung von Luminol und 2-Hydroxy-9-fluorenon
  • 200 ul Luminol (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, ph = 7,5), 200 ul 2-Hydroxy-9- fluorenon (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, ph = 7,5), 10 ul HRP (100.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung, die 1 g/l BSA enthält (pH = 7,4)) und 10 ul Wasserstoffperoxid (1.000fache Verdünnung einer 9,1 m wässigen Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette eingeführt, und die Mischung wurde 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt, und nach 10 Sekunden wurde die Lumineszenzintensität gemessen. Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung, die keine HRP enthielt (ph = 7,4) und die oben genannten Mengen von Luminol, 2-Hydroxy-9-fluorenon und Wasserstoffperoxid gemischt und gerührt, und nach 10 Sekunden wurde die Lumineszenzintensität gemessen. Das Verhältnis der ersteren zur letzteren ist in Tabelle 1 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei Isoluminol anstelle von Luminol verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
    • Beispiel 3
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei N-(4- Aminobutyl)-N-ethylisoluminol anstelle von Luminol verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
    • Bezugsbeispiele 1 bis 3
  • Den Verfahren der Beispiele 1, 2 und 3 wurde gefolgt, außer daß kein 2-Hydroxy-9-fluorenon verwendet wurde. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) mit 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) Lumineszenzintensität nach 10 s (relativer Wert) SN-Verhältnis Beispiel Bezugsbeispiel Luminol Isoluminol N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol
    • Beispiel 4 Lumineszenzanalvse des Ca15-3-Antigens mit 2-Hydroxy-9- fluorenon und verschiedenen Verstärkern
  • Es wurde eine CA15-3-Antigenlösung (615 E/ml) mit einer Phosphatpufferlösung (PBS), die Rinderserumalbumin enthielt, zu Lösungen mit den Konzentrationen 300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml, 25 E/ml und 0 E/ml verdünnt (PBS, das Rinderserumalbumin enthielt), diese wurden als CA15-3-Standardlösungen verwendet.
  • Zwei Proben jeder CA15-3-Standardlösungen mit den oben genannten Konzentrationen wurden in Vertiefungen einer Schale (25 Vertiefungen) mit jeweils 20 ul gegossen. Danach wurden den entsprechenden Vertiefungen 300 ul des mit Peroxidase markierten CA15-3-Antikörpers (Maus) zugegeben. Jeder Vertiefung wurde ein mit Antikörper beschichtetes Kügelchen mit einer Pinzette zugegeben, bei dem die anhaftende Flüssigkeit mit Filterpapier aufgesaugt worden war.
  • Die Schale wurde mit einem Deckel abgedeckt und leicht mit dem Finger angetippt, damit sich die Komponenten in den entsprechenden Vertiefungen mischen, und jede Mischung konnte 2 Stunden bei 25ºC reagieren. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Kügelchen dreimal gewaschen, jedesmal mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung, wobei eine Waschvorrichtung für Kügelchen angewendet wurde. Nach dem Waschen wurde jedes Kügelchen in der Schale zur Messung mit dem Lumineszenzmeßgerät in ein Versuchsrohr und dann in eine Kunststoffküvette gegeben.
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 7,5), 200 ul einer 2-Hydroxy-9-fluorenonlösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 7,5) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1,000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden jeder Kunststoffküvette zugegeben, und nach 5 und 10 Sekunden wurden die Lumineszenzintensitäten gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2-1 und 2-2 gezeigt.
  • Es wurden die Verhältnisse der Lumineszenzintensitäten nach 5 und 10 Sekunden der CA15-3-Antigen-Standardlösungen (300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml und 25 E/ml) zu den Intensitäten nach 5 und 10 Sekunden von 0 E/ml (SN-Verhältnisse) erhalten, wie es in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiele 4 bis 8
  • Dem Verfahren von Beispiel 4 wurde gefolgt, wobei p-Jodphenol, p-Hydroxycinnamonsäure, p-Phenylphenol, 6-Hydroxybenzothiazol und N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin anstelle von 2-Hydroxy-9-fluorenon verwendet wurde. Die Lumineszenzintensitäten sind in den Tabellen 2-1 und 2-2 gezeigt, und die SN- Verhältnisse in den Fig. 1 und 2. Tabelle 2-1 Lumineszenzintensitäten nach 5 Sekunden mit verschiedenen zugesetzten Verstärkern (relativ Werte) Verstärker Bezugsbeispiel Beispiel p-Jodphenol p-Hydroxycinnamonsäure p-Phenylphenol 6-Hydroxybenzothiazol N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin 2-Hydroxy-9-flourenon Tabelle 2-2 Lumineszenzintensitäten nach 10 Sekunden mit verschiedenen zugesetzten Verstärkern (relativ Werte) Verstärker Bezugsbeispiel Beispiel p-Jodphenol p-Hydroxycinnamonsäure p-Phenylphenol 6-Hydroxybenzothiazol N,N,N',N'-Tetramethylbenzidin 2-Hydroxy-9-flourenon
    • Beispiel 5 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und HHBP
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul einer HHBP-Lösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, ph = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (100.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthält) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in ein Kunststoffrohr eingeführt und 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt, danach wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul der Pufferlösung (pH = 7,0), die kein HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol, HHBP und der Wasserstoffperoxidlösung gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. Das Verhältnis der ersten zur letzteren ist in Tabelle 3 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 6 und 7
  • Als Beispiele 6 und 7 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnliche dem Beispiel 5 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 5 Isoluminol (Beispiel 6) und ABEI (Beispiel 7) verwendet wurden, wie es in Tabelle 3 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiele 9 bis 11
  • Die Lumineszenzintensitäten wurden ähnlich den Beispielen 5 bis 7 gemessen, außer daß HHBP nicht verwendet wurde, wie es in Tabelle 3 gezeigt ist.
  • Aus den Beispielen 5 bis 7 und den Bezugsbeispielen 9 bis 11 wird deutlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein deutlich anderes Verfahren der Lumineszenzanalyse ist. Tabelle 3 Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) mit 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verhältnis Beispiel Bezugsbeispiel Luminol Isoluminol
    • Beispiel 8 Synthese von 6-Hydroxybenzoxazol
  • 2,0 g 4-Aminoresorcinolhydrochlorid (12,4 mmol), 8,5 ml Methylorthoformiat (51,4 mmol) und 1,07 g Natriumhydrogencarbonat (12,8 mmol) wurden in einen 2-Hals-Kolben gegeben, der mit einem Kühlkondensator ausgestattet war, und die Mischung wurde einen ganzen Tag und eine ganze Nacht lang bei 100ºC in einer Argonatmosphäre gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionslösung abgekühlt. Danach wurde Hexan zugesetzt und das Reaktionsprodukt wurde filtriert. Der Kristall wurde mit Wasser gewaschen, wodurch das anorganische Salz entfernt wurde, danach wurde erneut filtriert.
  • Der erhaltene Kristall wurde in Aceton gelöst, und es wurde Aktivkohle zugegeben, die Lösung wurde 1,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Aktivkohle wurde entfernt, das Aceton wurde verdampft, und der erhaltene Kristall wurde mit Aceton-Wasser rekristallisiert. Es wurden 0,28 g eines weißen Pulvers erhalten. Die Ausbeute der Reaktion betrug 16,7%.
  • Schmelzpunkt: 183,5 bis 185,2ºC
  • IR (KBr, cm&supmin;¹)
  • 3150, 1630, 1528, 1489, 1276, 1236, 1195, 1104, 1085, 816
  • NMR (δ, DMSO-d&sub6;)
  • 6,81 (dd, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 8,46 (s, 1H), 9,75 (s, 1H)
  • MS (EI): 135 (M&spplus;), 52,31
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub7;H&sub5;O&sub2;N
  • Berechnet: 135,0344
  • Beobachtet: 135,0332
    • Lumineszenzanaylse von Peroxidase mit Luminol und 6-Hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul einer 6-Hydroxybenzoxallösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthält) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette eingeführt und 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gemischt, danach wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul der Pufferlösung, die keine HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol, 6-Hydroxybenzoxazol und die Wasserstoffperoxidlösung gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. Das Verhältnis der ersten zur letzteren ist in Tabelle 4 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN- Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 9 und 10
  • Als Beispiele 9 und 10 wurden ähnlich dem Beispiel 8 die Lumineszenzintensitäten gemessen, außer daß bei der Lumineszenzanalyse anstelle von Luminol vom Beispiel 8 Isoluminol (Beispiel 9) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (nachfolgend als ABEL abgekürzt) (Beispiel 10) verwendet wurden, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist.
    • Beispiel 11
  • Ähnlich dem Beispiel 8 wurde die Lumineszenzintensität gemessen, außer daß anstelle von 6-Hydroxybenzoxazol vom Beispiel 8 2-Methyl-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist.
    • Beispiele 12 und 13
  • Als Beispiele 12 und 13 wurden ähnlich dem Beispiel 11 die Lumineszenzintensitäten gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 11 Isoluminol (Beispiel 12) und ABEI (Beispiel 13) verwendet wurden, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist.
    • Beispiel 14
  • Ähnlich dem Beispiel 8 wurde die Lumineszenzintensität gemessen, wobei anstelle von 6-Hydroxybenzoxazol vom Beispiel 8 2-Phenyl-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist.
    • Beispiele 15 und 16
  • Ähnlich dem Beispiel 14 wurden die Lumineszenzintensitäten gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 14 Isoluminol (Beispiel 15) und ABEI (Beispiel 16) verwendet wurden, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiele 12 bis 14
  • Als Bezugsbeispiele 12 bis 14 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich wie in den Beispielen 8 bis 10 gemessen, außer daß 6-Hydroxybenzoxazol nicht verwendet wurde, wie es in Tabelle 4 gezeigt ist. Tabelle 4 Signal/Hintergrund-Verhältnisse durch eine Kombination von Verstärken und 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verstärker SN-Verhältnis Beispiel Bezugsbeispiel 6-Hydroxybenzoxal 2-Methyl-6-Hydroxybenzoxal keiner Luminol Isoluminol * Wert, mit HRP, 10fache Verdünnung, gemessen, und Lumineszenzintensität nach 1 min, multipliziert mit 10
    • Beispiel 17 Lumineszenzanalyse des CA15-3-Antigens mit HHBP
  • Eine CA15-3-Antigenlösung (615 E/ml) wurde mit einer Phosphatpufferlösung (PBS), die Rinderserumalbumin enthielt, zu Lösungen mit den Konzentrationen verdünnt: 300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml, 25 E/ml und 0 E/ml (Rinderserumalbumin enthaltende PBS), und diese wurden als CA15-3- Standardlösungen genommen.
  • Zwei Proben jeder Standardlösung mit den oben genannten Konzentrationen wurden in die Vertiefungen einer Schale (15 Vertiefungen) mit jeweils 20 ul eingeführt. Jeder Vertiefung wurden 300 ul eines mit Peroxidase markierten Marker-CA15-3- Antikörpers (Maus) zugegeben. Danach wurde jeder Vertiefung ein mit Antikörper beschichtetes Kügelchen zugesetzt, bei dem die anhaftende Flüssigkeit mit Filterpapier aufgesaugt worden war.
  • Die Schale wurde mit einem Deckel abgedeckt und leicht mit dem Finger geklopft, damit sich der Inhalt mischt, die Reaktion erfolgte 2 Stunden bei 25ºC. Nach Abschluß der Reaktion wurde dreimal mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wobei eine Waschvorrichtung für Kügelchen verwendet wurde. Nach dem Waschen wurde jedes Kügelchen in der Schale für die Messung mit dem Lumineszenzmeßgerät in ein Versuchsrohr und dann in ein Kunststoffrohr gegeben.
  • Es wurden 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 7,5), 200 ul einer HHBP-Lösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 7,5) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) in die entsprechenden Kunststoffrohre gegeben, es wurden die Lumineszenzintensitäten nach 10 Sekunden gemessen. Die durchschnittlichen Lumineszenzintensitäten von zwei Proben sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • Die Verhältnisse der durchschnittlichen Lumineszenzintensitäten nach 10 Sekunden der CA15-3-Antigen-Standardlösungen (300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml und 25 E/ml) zur durchschnittlichen Lumineszenzintensität nach 10 Sekunden bei 0 E/ml (SN-Verhältnisse) wurden wie in Fig. 3 gezeigt erhalten.
    • Beispiel 18 Lumineszenzanalyse des CA15-3-Antigens mit 2-Methyl-6-hydroxybenzoxazol
  • Nach dem Verfahren von Beispiel 17 wurden die Lumineszenzintensitäten gemessen, außer daß anstelle von HHBP vom Beispiel 17 2-Methyl-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde. Die durchschnittlichen Lumineszenzintensitäten sind in Tabelle 5 gezeigt, und die SN-Verhältnisse in Fig. 3.
    • Bezugsbeispiel 15
  • Nach dem Verfahren von Beispiel 17 erfolgte die Messung auf ähnliche Weise, außer daß HHBP und 2-Methyl-6-hydroxybenzoxazol nicht verwendet wurden. Die durchschnittlichen Lumineszenzintensitäten sind in Tabelle 5 gezeigt, und die SN-Verhältnisse in Fig. 3. Tabelle 5 Analyse von CA15-3: Durchschnittliche Lumineszenzintensitäten nach 10 Sekunden (relative Werte) Verstärker Beispiel Bezugsbeispiel 2-Methyl-6-hydroxybenzoxazol keiner
    • Beispiel 19 Synthese von 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxazol
  • 26,1 g (345,7 mmol) Chloracetonitril, 20 ml absolutes Ethanol und 70 ml Ether wurden in einen 300 ml 3-Hals-Kolben eingeführt, der mit Rührschaufeln versehen war, und bei langsamem Rühren wurde etwa 40 Minuten lang Chlorwasserstoff bei Raumtemperatur in den Kolben geblasen. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der danach filtriert und mit Ether gewaschen wurde. Es wurden 37,5 g (237,3 mmol) Ethylchlormethylimidathydrochlorid erhalten. Die Ausbeute der Reaktion betrug 68,7%.
  • 1,78 g (11,3 mmol) des Ethylchlormethylimidathydrochlorids, 1,22 g (7,55 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid und 20 ml Ethanol wurden in einen 2-Hals-Kolben eingeführt, der mit einem Dimroth-Kondensator versehen war, und die Mischung wurde einen ganzen Tag und eine ganze Nacht lang in einer Argonatmosphäre unter Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion und nach dem Abkühlen wurde der Kristall filtriert und mit Hexan gewaschen, danach wurde das Produkt vakuumgetrocknet. Es wurden 0,40 g (2,33 mmol) 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxazol erhalten, und die Ausbeute der Reaktion betrug 30,9%.
  • Schmelzpunkt: 148,5 bis 153,7ºC
  • IR (Fig. 4, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3076, 1615, 1572, 1491, 1334, 1238, 1141, 837
  • NMR (Fig. 5, DMSO-d&sub6;)
  • 4,97 (s, 2H), 6,84 (dd, 2H), 7,08 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 9,89 (s, 1H)
  • MS (EI): 183 (M&spplus;), 148
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub8;H&sub6;O&sub2;NCl
  • Berechnet: 183, 0015
  • Beobachtet: 183, 0051
    • Beispiel 20 Synthese von 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol
  • 61,3 g (420 mmol) Diethyloxalat und 90,2 g (433 mmol) Phosphorpentachlorid wurden in einen 500 ml 3-Hals-Kolben eingeführt, der mit Rührschaufeln und einem Kühlkondensator versehen war, und es wurde 17 Stunden bei Erwärmung auf 105ºC gerührt.
  • Die restliche Flüssigkeit wurde bei 11 mm Hg im Vakuum destilliert, und 53,2 g (265 mmol) der bei 77 bis 85ºC destillierenden Fraktion wurden aufgefangen. Die Ausbeute an Dichlorethoxyethylacetat betrug 63, 0%.
  • 85 ml dehydratisierter Ether, 35,5 ml absolutes Ethanol und 53,2 g (265 mmol) Dichlorethoxyethylacetat wurde unter einer Argonatmosphäre in einen 500 ml 3-Hals-Kolben eingeführt, der mit Rührschaufeln, einem Kühlkondensator und einem Tropftrichter versehen war, und unter Rühren wurden innerhalb von 1 Stunde tropfenweise aus dem Tropftrichter 49,5 ml dehydratisiertes Pyridin zugesetzt.
  • Nach 2 Stunden langem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Pyridinhydrochlorid durch Filtrieren entfernt und mit 50 ml dehydratisiertem Ether gewaschen. Der Ether wurde vom Filtrat abdestilliert, die restliche Lösung wurde 1,5 Stunden bei 90ºC gerührt. Die Reaktionslösung wurde abgekühlt, Ether wurde zugesetzt, und es wurde mit 3 n Schwefelsäure und danach mit einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die Etherschicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und der Ether wurde abdestilliert, die verbleibende Lösung wurde bei 7 mm Hg im Vakuum destilliert, und es wurden 40,1 g (182 mmol) der Fraktion aufgefangen, die bei 83 bis 89ºC siedet. Die Ausbeute des erzeugten Triethoxyethylacetats betrug 68,7%.
  • Es wurden 4 ml des Triethoxyethylacetats, 1,00 g (6,19 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid und 5,05 mg Natriumhydrogencarbonat genommen und unter einer Argonatmosphäre in einen 2-Hals-Kolben eingeführt, der mit einem Kühlkondensator versehen war, und die Mischung wurde einen ganzen Tag und eine ganze Nacht lang unter Erwärmung auf 100ºC gerührt.
  • Die Reaktionslösung wurde abgekühlt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde, der anschließend filtriert wurde. Der Niederschlag wurde in Aceton aufgelöst, und es wurde Aktivkohle zugesetzt, die Lösung wurde 1,5 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert, das Filtrat wurde zur Konzentration durch eine Kieselgelsäule geleitet. Das erzeugte Kristall wurde vakuumgetrocknet, und es wurden 1,07 g (5,17 mmol) 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute des Produktes betrug 83,5%.
  • Schmelzpunkt: 199,5 bis 200,2ºC
  • IR (Fig. 6, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3278, 1736, 1630, 1539, 1489, 1261, 1241, 1145, 116, 849
  • NMR (Fig. 7, DMSO-d&sub6;)
  • 1,35 (t, 3H), 4,41 (q, 2H), 6,97 (dd, 1H), 7,14 (d 1H), 7,72 (d, 1H), 10,25 (bs, 1H)
  • MS (EI): 207 (M&spplus;), 135
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub0;H&sub9;O&sub4;N
  • Berechnet: 207,0591
  • Beobachtet: 207,0561
    • Beispiel 21 Synthese von 2-(3-Bromphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 14,1 ml (107 mmol) 3-Brombenzochlorid und 1,7 g (10,5 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals-Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühlkondensator versehen war, und die Mischung wurde 30 Minuten auf 90 bis 145ºC erwärmt. Dem Rückstand wurde eine wäßrige Lösung von Natriumhydroxid und Methanol zu einer homogenen Lösung zugegeben, diese wurde dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde zweimal mit Ethylacetat extrahiert und mit 1 n Salzsäure und danach mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Das überschüssige Ethylacetat wurde abdestilliert, der erhaltene Niederschlag wurde mit THF/Wasser rekristallisiert. Es wurden 0,68 g (2,35 mmol) 2-(3-Bromphenyl)-6-hydroxybenzoxazol erhalten, und die Ausbeute betrug 16,6%.
  • Schmelzpunkt: 248,0 bis 248,5ºC
  • IR (Fig. 8, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3190, 1630, 1549, 1475, 1325, 1143, 1062, 835
  • NMR (Fig. 9, DMSO-d&sub6;)
  • 6,90 (dd 1H), 7,12 (d, 1H), 7,66 (m, 2H), 7,71 (d, 1H), 8,15 (m, 2H), 9,94 (s, 1H)
  • MS (EI): 289 (M&spplus;), 291 (M&spplus;+2), 210, 182
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub3;H&sub8;O&sub2;NBr
  • Berechnet: 288,9738
  • Beobachtet: 288,9711
    • Beispiel 22 Synthese von 2-(2-Methylphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 14 ml (107,3 mmol) 2-Methylbenzoylchlorid und 1,7 g (10,5 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals- Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühl kondensator versehen war, und die Mischung wurde 1 Stunde auf 144 bis 215ºC erwärmt. Das überschüssige Säurechlorid wurde durch Destillation entfernt, das System wurde auf ein Vakuum von 1 bis 1,5 mm Hg gebracht, und die bei 88 bis 230ºC destillierende Fraktion wurde aufgefangen. Sie betrug 6,2 g.
  • Mit einem Ethanolzusatz wurde die oben genannte Fraktion rekristallisiert, und es wurden 2,32 g (6,76 mmol) des Kristalls erhalten. Zu 500 mg (1,46 mmol) des Kristalls wurden 772 mg (13,6 mmol) KOH, 30 ml THF, 5 ml Wasser und 10 ml Methanol gegeben, und die Mischung wurde einen ganzen Tag und eine ganze Nacht lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, und Ethylacetat wurde abdestilliert. Beim Trocknen des Rückstands bei reduziertem Druck wurden 320 g (1,42 mmol) 2-(2- Methylphenyl)-6-hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute betrug 62,7%.
  • Schmelzpunkt: 133,5 bis 137,5ºC
  • IR (Fig. 10, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3064, 1613, 1489, 1224, 1151, 729
  • NMR (Fig. 11, DMSO-d&sub6;)
  • 2,73 (s, 3H), 6,87 (dd, 1H), 7,11 (d, 1H), 7,42 (m, 3H), 7,64 (d, 1H), 8,06 (m, 1H), 9,86 (s, 1H)
  • MS (EI): 225 (M&spplus;), 196, 168, 156, 116, 91, 79, 51, 39
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub1;O&sub2;N
  • Berechnet: 225,0790
  • Beobachtet: 225, 0764
    • Beispiel 23 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul des im Beispiel 3 erhaltenen 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazols (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, ph = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthält) und 10 ul einer wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette eingeführt und die Mischung wurde 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt, anschließend wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0) die kein HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol und 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol gemischt und gerührt, und die Lumineszenzintensität wurde nach 1 Minute gemessen. Das Verhältnis der ersten zur letzteren ist in Tabelle 6 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 24 und 25
  • Als Beispiele 24 und 25 wurde dem Verfahren von Beispiel 23 gefolgt, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 23 Isoluminol (Beispiel 24) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (nachfolgend als ABEI abgekürzt) (Beispiel 25) verwendet wurden, und es wurden die Lumineszenzintensitäten gemessen, wie es in Tabelle 6 gezeigt ist.
    • Beispiel 26
  • Dem Verfahren von Beispiel 23 wurde gefolgt außer daß anstelle von 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol vom Beispiel 23 das im Beispiel 21 erhaltene 2-(3-Bromphenyl)-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde, und die Lumineszenzintensität wurde wie in Tabelle 6 gezeigt gemessen.
    • Beispiele 27 und 28
  • Als Beispiele 27 und 28 wurde dem Verfahren von Beispiel 26 gefolgt außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 26 Isoluminol (Beispiel 27) und ABEI (Beispiel 28) verwendet wurden, und die Lumineszenzintensitäten wurden wie in Tabelle 6 gezeigt gemessen.
    • Beispiel 29
  • Ähnlich dem Beispiel 23 wurde die Lumineszenzintensität wie in Tabelle 6 gezeigt gemessen, außer daß anstelle von 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol vom Beispiel 23 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde, das im Beispiel 19 erhalten worden war.
    • Beispiele 30 und 31
  • Als Beispiele 30 und 31 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 29 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 29 Isoluminol (Beispiel 30) und ABEI (Beispiel 31) verwendet wurden, wie es in Tabelle 6 gezeigt ist.
    • Beispiel 32
  • Ähnlich dem Beispiel 23 wurde die Lumineszenzintensität wie in Tabelle 6 gezeigt gemessen, außer daß anstelle von 2- Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol vom Beispiel 20 2-(2-Methylphenyl)-6-hydroxybenzoxazol verwendet wurde, das im Beispiel 22 erhalten worden war.
    • Beispiele 33 und 34
  • Als Beispiele 33 und 34 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 32 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 32 Isoluminol (Beispiel 33) und ABEI (Beispiel 34) verwendet wurden, wie es in Tabelle 6 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiele 16 bis 18
  • Als Bezugsbeispiele 16 bis 18 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich den Beispielen 23 bis 25 gemessen, außer daß 2 -Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol nicht verwendet wurde, dies ist in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Signal/Hintergrund-Verhältnisse (SN-Verhältnisse) durch Kombination von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) mit Verstärkern Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verstärker SN-Verhältnis Beispiel 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxal 2-(3-Bromphenyl)-6-hydroxybenzoxal 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxal Luminol Isoluminol * 10facher Wert der Lumineszenzintensität, der durch 10fache Verdünnung von HRP erhalten wurde. Tabelle 6 (Fortsetzung) Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verstärker SN-Verhältnis Beispiel Bezugsbeispiel 2-Chlormethyl-6-hydroxybenzoxal 2-(2-Methylphenyl)-6-hydroxybenzoxal keiner Isoluminol Luminol * 10facher Wert der Lumineszenzintensität, der durch 10fache Verdünnung von HRP erhalten wurde.
    • Beispiel 35 Synthese von 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 4,5 ml (35,2 mmol) 3-Chlorbenzoylchlorid und 1,0 g (6,19 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals- Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühlkondensator versehen war, und die Mischung wurde 1 Stunde auf 170 bis 235ºC erwärmt, danach wurde das überschüssige Säurechlorid durch Destillation entfernt. Dem Rückstand wurden 1,5 g (38,5 mmol) NaOH, 20 ml THF, 20 ml Wasser und 10 ml Ethanol zugegeben, und die Mischung wurde etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde mit Wasser/Methanol/THF rekristallisiert, und der Kristall wurde getrocknet, es wurden 250 mg (1,02 mmol) 2-(3-Chlorphenyl)- 6-hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute betrug 16,5%.
  • Schmelzpunkt: 246,0 bis 247,5ºC
  • IR (Fig. 12, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3146, 1630, 1599, 1551, 1477, 1328, 1232, 1145, 1062, 835
  • NMR (Fig. 13, DMSO-d&sub6;)
  • 6,90 (dd, 1H), 7,12 (d, 1H), 7,61 (m, 3H), 8,06 (m, 2H), 9,94 (s, 1H)
  • MS (EI) 245 (M&spplus;), 247 (M&spplus;+2), 138, 122, 80, 52
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub3;H&sub8;O&sub2;NCl
  • Berechnet: 245, 0193
  • Beobachtet: 245,0218
    • Beispiel 36 Synthese von 2-(4-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 25 g (142,8 mmol) 4-Chlorbenzoylchlorid und 3,0 g (18,6 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals- Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühl kondensator versehen war, und die Mischung wurde 1 Stunde auf 170 bis 235ºC erwärmt, danach wurde das überschüssige Säurechlorid durch Destillation entfernt. Dem Rückstand wurden 8,4 g (210 mmol) NaOH, 60 ml THF, 60 ml Wasser und 30 ml Methanol zugesetzt, und die Mischung wurde etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Wasser/Methanol/THF rekristallisiert, und der Kristall wurde getrocknet, es wurden 1,24 g (5,05 mmol) 2-(4-Chlorphenyl)- 6-hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute betrug 27,2%.
  • Schmelzpunkt: 272,8 bis 273,5ºC
  • IR (Fig. 14, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3138, 1632, 1618, 1485, 1236, 1143, 832
  • NMR (Fig. 15, DMSO-d&sub6;)
  • 6,87 (dd, 1H), 7,11 (d, 1H), 7,62 (m, 3H), 8,13 (d, 2H), 9,90 (s, 1H)
  • MS (EI): 245 (M&spplus;), 247 (M&spplus;+2), 138, 122
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub3;H&sub8;O&sub2;NCl
  • Berechnet: 245, 0178
  • Beobachtet: 245,0211
    • Beispiel 37 Synthese von 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 20 g (104,9 mmol) 2-Naphthylchlorid und 2,5 g (15,5 mmol) 4- Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals-Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühlkondensator versehen war, und die Mischung wurde 1 Stunde auf 135 bis 205ºC erwärmt, danach wurde das überschüssige Säurechlorid durch Destillation entfernt. Dem Rückstand wurden 8,3 g (207,5 mmol) NaOH, 60 ml THF, 60 ml Wasser und 30 ml Methanol zugegeben, und die Mischung wurde etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, und das Ethylacetat wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Wasser/Methanol/THF rekristallisiert, und der Kristall wurde getrocknet, es wurden 1,92 mg (7,36 mmol) 2-(2-Naphthyl)-6- hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute betrug 47,5%.
  • Schmelzpunkt: 226,0 bis 226,2ºC
  • IR (Fig. 16, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3050, 1620, 1485, 1450, 1303, 1141, 1116, 816, 752
  • NMR (Fig. 17, DMSO-d&sub6;)
  • 6,92 (dd, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,64 (m, 3H), 8,08 (m, 4H), 8,74 (s, 1H), 9,92 (s, 1H)
  • MS (EI): 261 (M&spplus;), 130
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub1;O&sub2;N
  • Berechnet: 261,0825
  • Beobachtet: 261,0807
    • Beispiel 38 Synthese von 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 9,9 ml (70,5 mmol) 2,4-Dichlorbenzoylchlorid und 2,0 g (12,4 mmol) 4-Aminoresorcinolhydrochlorid wurden in einen 3-Hals- Kolben eingeführt, der mit einem Thermometer und einem Kühlkondensator versehen war, und die Mischung wurde 1 Stunde auf 172 bis 247ºC erwärmt, danach wurde das überschüssige Säurechlorid durch Destillation entfernt. Dem Rückstand wurden 6,47 g (161,8 mmol) NaOH, 60 ml THF, 60 ml Wasser und 30 ml Methanol zugesetzt, und die Mischung wurde etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, und Ethylacetat wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Wasser/Methanol/THF rekristallisiert, und der Kristall wurde getrocknet, es wurden 915 mg (3,27 mmol) 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol erhalten. Die Ausbeute betrug 26,3%.
  • Schmelzpunkt: 212,5 bis 212,8ºC
  • IR (Fig. 18, KBr, cm&supmin;¹)
  • 3150, 1638, 1611, 1564, 1489, 1464, 1325, 1232, 1094, 822, 808
  • NMR (Fig. 19, DMSO-d&sub6;)
  • 6,92 (dd, 1H), 7,11 (d, 1H), 7,66 (m, 2H), 7,85 (dd, 1H), 8,12 (d, 1H), 9,97 (s, 1H)
  • MS (EI): 279 (M&spplus;), 281 (M&spplus;+2), 283 (M&spplus;+4), 172, 139, 108, 80, 52
  • Hochauflösungs-MS (EI): C&sub1;&sub3;H&sub7;O&sub2;NCl
  • Berechnet: 278,9898
  • Beobachtet: 278,9876
    • Beispiel 39 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und 2-(3- Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul der im Beispiel 35 erhaltenen 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol-Lösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthielt) und 10 ul einer wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette gegeben, und nachdem 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt worden war, wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die kein HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol und 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. Das Verhältnis der ersten zur letzteren ist in Tabelle 7 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 40 und 41
  • Als Beispiele 40 und 41 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 39 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 39 Isoluminol (Beispiel 40) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (Beispiel 41) verwendet wurden, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist.
    • Beispiel 42 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und 2-(4- Chlorohenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul der im Beispiel 36 erhaltenen 2-(4-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol-Lösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/g mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthielt) und 10 Nil einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette gegeben, und nachdem 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt worden war, wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die kein HRP enthielt, und die oben genannte Menge von Luminol und 2-(4-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. In Tabelle 7 ist das Verhältnis der ersten zur letzteren als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 43 und 44
  • Als Beispiele 43 und 44 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 42 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 42 Isoluminol (Beispiel 43) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (ABEI) (Beispiel 44) verwendet wurden, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist.
    • Beispiel 45 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul der im Beispiel 37 erhaltenen 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxazol-Lösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, ph = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/mg mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthielt) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette gegeben, und nachdem 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt worden war, wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die kein HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol und 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxazol gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. In Tabelle 7 ist das Verhältnis der ersten zur letzteren als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 46 und 47
  • Als Beispiele 46 und 47 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 45 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 45 Isoluminol (Beispiel 46) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (Beispiel 47) verwendet wurden, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist.
    • Beispiel 48 Lumineszenzanalyse von Peroxidase mit Luminol und 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol
  • 200 ul einer Luminollösung (100 mM DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 200 ul der im Beispiel 38 erhaltenen 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol-Lösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung, pH = 8,5), 10 ul einer Meerrettichperoxidase-Lösung (HRP-Lösung) (10.000fache Verdünnung von 1111 Einheiten/g mit einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die 1 g/l BSA enthielt) und 10 ul einer Wasserstoffperoxidlösung (1.000fache Verdünnung einer wäßrigen 9,1 m Lösung) wurden in eine Kunststoffküvette eingeführt, und nachdem 3 Sekunden mit einem Wirbelmischer gerührt worden war, wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen.
  • Danach wurden 10 ul einer PBS-Pufferlösung (pH = 7,0), die keine HRP enthielt, und die oben genannten Mengen von Luminol und 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol gemischt und gerührt, und es wurde die Lumineszenzintensität nach 1 Minute gemessen. Das Verhältnis der ersten zur letzteren ist in Tabelle 7 als Signal/Hintergrund-Verhältnis (SN-Verhältnis) gezeigt.
    • Beispiele 49 und 50
  • Als Beispiele 49 und 50 wurden die Lumineszenzintensitäten ähnlich dem Beispiel 48 gemessen, außer daß anstelle von Luminol vom Beispiel 48 Isoluminol (Beispiel 49) und N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol (ABEI) (Beispiel 50) verwendet wurden, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiele 19 bis 21
  • Als Bezugsbeispiele 19 bis 21 wurden die Lumineszenzintensitäten den Beispielen 39 bis 41 recht ähnlich gemessen, außer daß 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxazol nicht verwendet wurde, wie es in Tabelle 7 gezeigt ist. Tabelle 7 Signal/Hintergrund-Verhältnisse (SN-Verhältnisse) durch Kombination von 2,3-Dihydro-1,4-phthalazindion (DPD) mit Verstärkern Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verstärker SN-Verhältnis Beispiel 2-(3-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxal 2-(4-Chlorphenyl)-6-hydroxybenzoxal 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxal Luminol Isoluminol * 10facher Wert der Lumineszenzintensität, der durch 10fache Verdünnung von HRP erhalten wurde. ** 20facher Wert der Lumineszenzintensität, der durch 20fache Verdünnung von HRP erhalten wurde. Tabelle 7 (Fortsetzung) Lumineszenzintensität nach 1 min (relativer Wert) Verstärker SN-Verhältnis Beispiel Bezugsbeispiel 2-(2-Naphthyl)-6-hydroxybenzoxal 2-(2,4-Dichlorphenyl)-6-hydroxybenzoxal keiner Isoluminol Luminol ** 20facher Wert der Lumineszenzintensität, der durch 20fache Verdünnung von HRP erhalten wurde.
    • Beispiel 51 Lumineszenzanalyse des CA15-3-Antigens mit 2-Ethoxycarbonyl- 6-hydroxybenzoxazol
  • Eine CA15-3-Ahtigenlösung (615 E/ml) wurden mit einer Phosphatpufferlösung (PBS), die 0,25% Rinderserumalbumin enthielt, zu Lösungen mit den Konzentrationen 300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml, 25 E/ml und 0 E/ml verdünnt (0,25 Rinderserumalbumin enthaltende PBS), diese wurden als CA15- 3-Standardlösungen verwendet.
  • Die CA15-3-Stanardlösungen mit den oben genannten Konzentrationen wurden in die Vertiefungen einer Schale (25 Vertiefungen), jeweils in 200 ul gegeben. Danach wurden 300 ul des mit Peroxidase markierten CA15-3-Antikörpers (Maus) zu den entsprechenden Vertiefungen gegeben. Jeder Vertiefung wurde ein mit dem Antikörper überzogenes Kügelchen mit einer Pinzette zugegeben, bei dem die anhaftende Flüssigkeit mit Filterpapier aufgesaugt worden war.
  • Die Schale wurde mit einem Deckel bedeckt, sie wurde leicht mit dem Finger geklopft, damit sich die Komponenten in den entsprechenden Vertiefungen mischen, und jede Mischung konnte 2 Stunden bei 25ºC reagieren. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Kügelchen dreimal gewaschen, jedesmal mit 5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung, wobei eine Waschvorrichtung für Kügelchen verwendet wurde. Nach dem Waschen wurde jedes Kügelchen in der Schale für die Messung mit dem Lumineszenzmeßgerät in ein Versuchsrohr und dann in eine Kunststoffküvette gegeben.
  • 100 ul einer Luminol-Na-salz-Lösung (lBfache Verdünnung einer Lösung von 12,6 mM, Luminol-Na-salz/0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung ph = 8,5 mit der gleichen Pufferlösung), 100 ul einer 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazollösung (100 mm DMSO-Lösung 10 ul/10 ml, 0,1 m Trishydrochlorid-Pufferlösung ph 8,5) und 100 ul einer Wassestoffperoxidlösung (18fache Verdünnung von 16,2 uM Wasserstoffperoxid/0,01 m Dinatriumhydrogenphosphat-Zitronensäure-Pufferlösung ph = 5,2 mit der gleichen Pufferlösung) wurden in eine Kunststoffampulle gegeben, und nach 10minütigem Erwärmen auf 37ºC wurde 60 Sekunden lang die Lumineszenz gemessen. Die 1/6-Werte der kumulativen Werte der Lumineszenzintensitäten von 50 bis 60 Sekunden sind in Tabelle 8 gezeigt.
  • Dann wurden die Verhältnisse der 1/6-Werte der kumulativen Werte der Lumineszenzintensitäten von 50 Sekunden bis 60 Sekunden der CA15-3-Standardlösungen (300 E/ml, 200 E/ml, 100 E/ml, 50 E/ml, 25 E/ml) zu den 1/6-Werten des kumulativen Wertes der Lumineszenzintensität von 50 Sekunden bis 60 Sekunden von 0 E/ml (SN-Verhältnisse) erhalten, wie es in Tabelle 8 und Fig. 20 gezeigt ist.
    • Bezugsbeispiel 22
  • Nach dem Verfahren von Beispiel 35 wurden die Lumineszenzintensitäten und SN-Verhältnisse erhalten, außer daß 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxybenzoxazol nicht verwendet wurde, dies ist in Tabelle 8 und Fig. 20 gezeigt. Tabelle 8 Analyse von CA15-3; 1/6-Werte der kumulativen Werte der Lumineszenzintensitäten von 50 Sekunden bis 60 Sekunden Verstärker Beispiel Bezugsbeispiel 2-Ethoxycarbonyl-6-hydroxyoxazol keiner Lumineszenzintesität (relativer Wert) SN-Verhältnis
    • Industrielle Anwendbarkeit
  • Wie es vorstehend beschrieben wurde, ermöglicht das erfindungsgemäße Lumineszenzanalyseverfahren eine hohe Empfindlichkeit und eine sofortige Bestimmung der Substanzen.

Claims (4)

1. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer Substanz durch Chemilumineszenz, die durch Reaktion von (a) Peroxidase oder eines Derivats davon, (b) eines Oxidans und (c) Luminol oder Isoluminol oder eines Derivats davon erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, daß die die Lumineszenz einleitende Reaktion in Gegenwart von zumindest einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die 2-Hydroxy-9-fluorenon umfaßt, wobei die Verbindung durch die Formel
dargestellt wird, und Oxazol-Derivaten erfolgt, die durch die Formel
dargestellt werden,
worin R&sub1; Wasserstoff, CnH2n+1, XCnH2n, CnH2n+1CO&sub2;, eine Phenylgruppe, eine Naphthylgruppe, CnH2n+1C&sub6;H&sub4;, YC&sub6;H&sub4; oder XYC&sub6;H&sub3; darstellt, wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X F, Cl, Br oder J ist, und Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei R&sub1; Wasserstoff, eine Methylgruppe, eine Chlormethylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Bromphenylgruppe, eine Methylphenylgruppe, eine Chlorphenylgruppe, eine Naphthylgruppe oder eine Dichlorphenylgruppe ist.
3. Oxazol-Derivat mit der Formel
worin R&sub2; XCnH2n, CnH2n+1CO&sub2;, eine Naphthylgruppe, CnH2n+1C&sub6;H&sub4;, YC&sub6;H&sub4; oder XYC&sub6;H&sub3; darstellt, wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 4 ist, X F, Cl, Br oder J ist und Y F, Cl, Br, J oder eine Phenylgruppe ist.
4. Oxazol-Derivat nach Anspruch 3, wobei R&sub2; eine Chlormethylgruppe, eine Ethoxycarbonylgruppe, eine Bromphenylgruppe, eine Chlorphenylgruppe, eine Naphthylgruppe, eine Dichlorphenylgruppe oder eine Methylphenylgruppe ist.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670644A (en) * 1993-05-17 1997-09-23 Lumigen, Inc. Acridan compounds
US5723295A (en) * 1993-05-17 1998-03-03 Lumigen, Inc. Methods, acridan compounds and kits for producing light
US5523212A (en) * 1993-05-17 1996-06-04 Lumigen, Inc. Aryl N-alkylacridanthiocarboxylate derivatives useful for chemiluminescent detection
US5593845A (en) * 1993-05-17 1997-01-14 Lumigen, Inc. Aryl N-alkylacridancarboxylate derivatives useful for chemiluminescent detection
US5686258A (en) * 1993-05-17 1997-11-11 Lumigen, Inc. Chemiluminescent detection of hydrolytic enzymes using an acridan
US5843666A (en) * 1994-09-02 1998-12-01 Lumigen, Inc. Chemiluminescent detection methods using dual enzyer-labeled binding partners
ES2113294B1 (es) * 1995-08-01 1999-05-16 Univ Malaga Metodo para aumentar la sensibilidad de un ensayo quimioluminiscente utilizando compuestos aromaticos con grupos amino e hidroxi como intensificadores
FR2740219B1 (fr) * 1995-10-20 1998-01-16 Covalab Systeme d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances, de preference biologiques, par chimiluminescence, amplifiee, procede et necessaire d'analyse en faisant application
US5922558A (en) * 1997-09-12 1999-07-13 Lumigen, Inc. Methods and compositions for generating chemiluminescence with a peroxidase
WO1999014220A1 (en) * 1997-09-12 1999-03-25 Lumigen, Inc. Novel compounds for generating chemiluminescence with a peroxidase
WO2001055446A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 Brij Pal Giri Novel stabilized formulations for chemiluminescent assays
US6872828B2 (en) 2001-12-20 2005-03-29 Lumigen, Inc. Compounds for generating chemiluminescence with a peroxidase
AU2002352881B2 (en) 2001-12-20 2008-11-06 Lumigen, Inc. Improved compounds for generating chemiluminescence with a peroxidase
US6897036B2 (en) * 2002-06-06 2005-05-24 Lumigen, Inc. Fluorescent detection of peroxidase enzymes
JP3881667B2 (ja) 2003-12-24 2007-02-14 信一郎 礒部 生体分子の検出方法及びそれに用いる標識色素並びに標識キット
US7875426B2 (en) * 2005-02-04 2011-01-25 University Of South Florida DNA biochip and methods of use
US7732153B2 (en) 2006-05-09 2010-06-08 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation assay methods
US7799534B2 (en) * 2006-05-09 2010-09-21 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation assay methods
ITBO20070112A1 (it) * 2007-02-23 2008-08-24 Cyanagen Srl Metodo per incrementare l'emissione di luce da una reazione chemiluminescente
US20100240070A1 (en) * 2007-11-07 2010-09-23 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation Assay Methods Using Peroxide Generating Enzymes
US20100273189A1 (en) * 2009-02-27 2010-10-28 Beckman Coulter, Inc. Non separation assays with selective signal inhibitors
EP2401392B1 (de) 2009-02-27 2017-01-25 Beckman Coulter, Inc. Homogene lösungsphasentestverfahren
US20210270838A1 (en) 2018-07-13 2021-09-02 3M Innovative Properties Company Assay
WO2020012390A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 3M Innovative Properties Company Specific binding chemiluminescent assay
WO2020028619A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Beckman Coulter, Inc. Sparc based microorganism detection method

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3928227A (en) * 1967-02-01 1975-12-23 Sentol Associates Liquid scintillation, counting and compositions
GB1428367A (en) * 1972-04-10 1976-03-17 Becker Delft Nv Apparaten En I Composition for use in scintillator systems
US4193983A (en) * 1978-05-16 1980-03-18 Syva Company Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith
US4256834A (en) * 1979-04-09 1981-03-17 Syva Company Fluorescent scavenger particle immunoassay
JPS59500252A (ja) * 1982-03-03 1984-02-23 ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド 増強ルミネツセンスおよび発光分析
EP0116454B1 (de) * 1983-02-11 1987-04-29 National Research Development Corporation Erhöhte lumineszierende oder luminometrische Prüfung
NL8303213A (nl) * 1983-09-16 1985-04-16 Packard Becker Bv Mengsel voor toepassing bij de lsc-(liquid scintillation counting) analysetechniek.
GB8420053D0 (en) * 1984-08-07 1984-09-12 Secr Social Service Brit Enhanced luminescent/luminometric assay
JO1410B1 (en) * 1984-11-03 1986-11-30 سميث كلاين اند فرينش لابوراتوريز ليمتد Vehicles
US4950588A (en) * 1985-07-10 1990-08-21 Molecular Diagnostics, Inc. Prolonged enhanced chemiluminescence
US4853327A (en) * 1985-07-10 1989-08-01 Molecular Diagnostics, Inc. Enhanced phthalazinedione chemiluminescence
US4835101A (en) * 1986-02-10 1989-05-30 Kallestad Diagnostics, Inc. Luminescent analyses with enhanced storage stability

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Publication number Publication date
EP0422252A4 (en) 1992-04-08
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DE69021161D1 (de) 1995-08-31

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