DE68915267T2 - Enzymatisch kontrolliertes freisetzungssystem. - Google Patents

Enzymatisch kontrolliertes freisetzungssystem.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zur gesteuerten Freisetzung einer gewünschten Gruppierung bei Bedarf; insbesondere betrifft sie solche Systeme, die einen Chinon-Methid-Eliminierungsreaktionsmechanismus für die Freisetzung dieser Gruppierungen benutzen.
  • Verbindungen und Systeme für die gesteuerte Freisetzung einer bestimmten Gruppierung waren Gegenstand von umfangreichen Forschungs- und Entwicklungsarbeiten für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen. Enzyme und Enzymkonjugate sind zum Beispiel weitgehend als Reaktionspartner bei Immunassays zur Reaktion mit bestimmten Substraten anerkannt, bei denen eine Vielzahl chromophorer und fluoreszierender Farbstoffe freigesetzt wird. Diese Enzyme und Enzymkonjugate können in mobilen und immobilisierten Formen verwendet werden, bei denen die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion und/oder die Konzentration der Enzymreaktionsprodukte qualitative und quantitative Daten liefern. Beispiele dieser Freisetzungssysteme sind in der PCT-Anmeldung WO 86/046 81 veröffentlicht, die ein Freisetzungssystem beschreibt, bei dem reduzierbare Verbindungen eine nachweisbare Spezies in einer intramolekularen nukleophilen Verdrängungsreaktion freisetzen.
  • Außerdem sind nicht-enzymatische Freisetzungssysteme bekannt z.B. ein solches, bei dem eine Chinon-Methid- Eliminierungsreaktion in einem photographischen Verfahren zur Freisetzung einer photographisch wirksamen Gruppe in Anwesenheit von Alkali angewendet wird. Diesee Chinon-Methid- Freisetzungssysteme sind in der Arbeit von Taylor et al., J. Org. Chem., 43:6 (1978) Seiten 1197 - 1200 wiedergegeben. Der Reaktionsmechanismus der Chinon-Methid-Eliminierung, soweit er photographische Verfahren und Produkte betrifft, ist in den US- Patentschriften 3 674 478, 3 685 991, 3 698 898 und 3 932 480 beschrieben.
  • Ähnliche Freisetzungsverfahren sind in der WO-A-88/05827, einer nach Art. 54(3) EPÜ: als stand der Technik geltenden Veröffentlichung beschrieben. Jedoch entsprechen die allgemeinen Formeln der Verbindungen, die bei diesem Verfahren verwendet werden, nicht den Verbindungen, die im folgenden offenbart werden.
  • Im Hinblick auf das gegenwärtige Interesse an Freisetzungssystemen unter Bereitstellung von gewünschten Molekülen bei Bedarf, gibt es ein fortgesetztes Bedürfnis nach neuen Freisetzungssystemen, die durch die Wirkung von Enymen gesteuert werden.
  • Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein neues enzymgesteuertes Freisetzungssystem bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein Freisetzungssystem bereitzustellen, bei dem eine gewünschte Gruppierung bei Bedarf mittels einer Chinon-Methid-Eliminierungsreaktion freigesetzt wird.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, einen enzymgesteuerten Immunassay bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, ein System für die gesteuerte Freisetzung eines pharmakologisch aktiven Liganden bereitzustellen.
    • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese und andere Aufgaben und Vorteile werden in Übereinstimmung mit der Erfindung durch Bereitstellung eines enzymgesteuerten Freisetzungsverfahrens für die Freisetzung einer austretenden Gruppe erreicht, welches (folgende Sufen) umfaßt:
  • Kontaktieren einer Verbindung, dargestellt durch die Formel Formel A
  • worin bedeuten:
  • R und R&sub1; bedeuten jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, einen Substituenten, der die Mobilität oder Reaktivität der Verbindung beeinflußt, oder einen substituenten, einschließlich einer biologisch aktiven Gruppe, dargestellt durch -L-B, worin L eine verbindende Gruppe und B eine biologisch aktive Gruppe darstellt;
  • R&sub2; und R&sub3; bedeuten jeweils unabhängig voneineander Wasserstoff;
  • X bedeutet eine austretende Gruppe;
  • Z bedeutet eine Enzymsubstratgruppierung;
  • -CH&sub2;R&sub3;X steht entweder in ortho- oder para-Stellung zu der Gruppierung -O-Z-;
  • mit einem aktiven Enzym, das in der Lage ist, die Enzymsubstrat-Gruppierung Z von der Verbindung abzuspalten; wodurch die austretende Gruppe X aus der Verbindung freigesetzt wird.
  • Unter einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Flüssigkeit, welches (folgende Sufen) umfaßt;
  • Kontaktieren einer Flüssigkeitsprobe, enthaltend einen Analyten mit (a) einem Bindungspartner des Analyten, der mit dem Enzym konjugiert ist und (b) einem immobilisierten Analogen des Analyten, um gebundene und freie immunkomplexe zu bilden;
  • Kontaktieren der gebundenen und freien Immunkomplexe mit einer wie oben definierten Verbindung;
  • Abtrennen der gebundenen und freien Immunkomplexe, zur Bildung einer festen Phase und einer flüssigen Phase;
  • und Nachweis der Anwesenheit des Analyten in der festen Phase oder flüssigen Phase als Funktion der austretenden Gruppe.
  • Das Freisetzungssystem kann als eine in Schritten ablaufende Reaktionsequenz angesehen werden, wobei die Schritte selbstverständlich auch im wesentlichen gleichzeitig erfolgen können, um die gewünschte Gruppierung freizusetzen. Der erste Reaktionsschritt umfaßt die Einwirkung eines aktiven Enzyms auf das Enzymsubstrat Z, um die substratgruppierung aus der Verbindung abzuspalten, wobei eine reaktive Zwischenstufe gebildet wird. Die reaktive zwischenstufe macht eine Chinonmethid- Eliminierungsreaktionssequenz durch, um die austretende Gruppe X in anionischer, neutraler oder kationischer Form freizusetzen.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
  • Der Reaktionsmechanismus, durch den die austretende Gruppe bei Bedarf gemäß der vorliegenden Erfindung freigesetzt werden kann, kann durch die folgende Sequenz beschrieben werden:
  • Wie dargestellt, spaltet das aktive Enzym das Substrat Z aus der Verbindung ab, um die Zwischenstufe II zu bilden, die mit der reaktiven Zwischenstufe III im Gleichgewicht steht. Die reaktive Zwischenstufe durchläuft wiederum eine Chinonmethid- Eliminierung in wässrigem Medium, um ein Quinon-Methid (IV) zu bilden, aus dem die austretenden Gruppe X freigesetzt wurde. Je nach der Beschaffenheit von Z und X, kann die Geschwindigkeit der Freisetzung von X in jedem Fall primär von der Geschwindigkeit des enzymatischen Angriffs oder von der Freisetzungsgeschwindigkeit von X&sub1; aus der reaktiven Zwischenstufe III abhängen.
  • Die Acidität der Zwischenstufe II ist bei der Chinon-Methid- Eliminierungsreaktion wichtig; die Acidität wird beeinflußt durch die Struktur des Moleküls; zum Beispiel kann ein Substituent die Zwischenstufe II mehr oder weniger sauer machen. Im allgemeinen kann die Reaktion stattfinden, wenn der pH-Wert des Reaktionsmediums über dem pKa-Wert von II liegt, und die Reaktionsgeschwindigkeit steigt progressiv mit dem pH- Wert an. Vorzugsweise ist der pKa-Wert von II niedriger als der pH-Wert des Reaktionsmediums, bei dem man die Reaktiossequenz durchführen wird. Es sollte auch beachtet werden, daß die Geschwindigkeit des Schrittes, bei dem das aktive Enzym die Substratgruppierung Z aus der Verbindung abspaltet, in gewissem Umfang von der Position der Gruppe -CR&sub2;R&sub3;X im Hinblick auf ein besonderes Enzym abhängig ist. Demgemäß ist die Positionierung der Gruppe-CR&sub2;R&sub3;X, entweder in ortho- oder para-Stellung zur Gruppierung -O-Z teilweise abhängig von dem jeweils verwendeten aktiven Enzym, und die Positionierung de(r)s Substiuenten ist teilweise abhängig von dem Einfluß auf den pKa der Phenolzwischenstufe II. Die Auswahl eines besonderen Substituenten kann auch durch seine Fähigkeit, eine Stelle zur Immobilisierung der Moleküe auf einen festen Träger zu schaffen oder eine verbesserte Löslichkeit für das Molekül zu bewirken, bestimmt werden.
  • R und R&sub1; können jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, ein Substituent, der die Mobilität oder Löslichkeit der Verbindung bewirkt oder ein Substituent, der eine biologisch aktive Gruppe wie unten dargelegt einschließt, bedeuten. Jede kann eine elektronenziehende Gruppe, wie zum Beispiel -NO&sub2;, -CM, Carboxamid usw. oder eine elektronengebende Gruppe, wie Alkyl, Vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine substituierte Alkylgruppe, Arylgruppen wie Phenyl, substiuierte Aryl-, Amino-, Dialkylamino-, Trimethylsilylgruppen bedeuten.
  • Wenn jedes R oder R&sub1; einen Substituenten, der eine biologisch aktive Gruppe einschließt, darstellt, lassen sie sich durch -L-B darstellen, worin L eine verbindende Grupe und B eine biologisch aktive Gruppe, z.B. ein Antigen, ein Antikörper, eine DNA-Probe usw. bedeuten. Die verbindende Gruppe L kann eine beliebige geeignete Gruppe sein, die die biologisch aktive Gruppe mit dem Benzolring verbindet. Für die Reaktionen, zur Bildung der verbindenden Gruppe können verschiedenen funktionelle Gruppen verwendet werden, z.ß. Imidester, Aldehyde, Anhydride, Isothiocyanate, Diazoniumsalze, aktivierte Disulfide (z.B. 2-Pyridyldisulfid), Maleimidgruppen, Bromacetylgruppen usw.
  • Typische geeignete Gruppierungen, die als austretende Gruppe verwendet werden können, umfassen organische Gruppen, wie Farbstoffe und pharmakologisch aktive Gruppen, organometallgruppen, wie Europiumchelat, und anorganische Gruppen, wie TiO&sub2; und SiO&sub2;. Typische geeignete Farbstoffgruppierungen umfassen Hydroxyphenoxazinone, wie Resorufin; Hydroxycumarine, wie Umbelliferon; Fluoresceine und substituierte Fluoresceine, wie Fluorescein, Dibromfluorescein und Dichlorfluorescein; Rhodole (3H-xanthen-3-on), wie 6-Amino- 3H-Xanthen-3-on; und Hydroxyphenylenone, wie 9-Hydroxylphenylenon. Typische geeignete pharmazeutisch aktive Gruppen umfassen therapeutische Arzneimittel, Enzyme, Enzyminhibitoren, Antitumoragentien und dgl.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsfom ist X ein Farbstoff und das gesteuerte Freisetzungssystem wird in einem Immunassayverfahren für einen gewünschten Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, wie Plasma oder Serum, verwendet. Wenn X ein Farbstoff ist, ist dieser vorzugsweise über eine Bindung, die durch ein Meteroatom wie Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff gebildet wird,an ein Kohlenstoffatom gebunden. In diesen Systemen kann die freigesetzte Farbstoffgruppierung eine Spezies mit einer anderen Farbe und/oder Fluoreszenz sein. Wenn zum Beispiel ein Farbstoff, wie Resorufin, über ein Sauerstoffatom an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, ist die Fluoreszenz des Resorufins blockiert. Daher ist die ursprüngliche Verbindung nicht fluoreszierend, und es wird eine fluoreszierende Resorufingruppierung freigesetzt. Außerdem ist die fluoreszierende Resorufingruppierung fuchsinfarben (magenta), während die Ausgangsetherverbindung gelb ist. Wenn die Farbstoffgruppierung Fluoreszein ist, ist der Verbindung fluoreszierend und setzt die fluoreszierende Farbstoffgruppierung frei. Wenn x eine anorganische Gruppierung, wie TiO&sub2; oder SiO&sub2; (die über ein Sauerstoffatom gebunden ist) darstellt, kann eine ursprünglich hydrophobe Spezies durch das Verfahren gemäß der Erfindung in eine hydrophile Spezies umgewandelt werden.
  • Typische geeignete Enzymsubstrate Z umfassen Glycoside, wie Galaktoside, Glucoside und Mannoside und Ester, wie Phosphatester und Aminosäureester, z.ß. Leucin.
  • Im Fall von β-Galaktosidase (E.coli) wurde gefunden, daß die Geschwindigkeit des Enzymangriffs auf das Substrat größer ist, wenn eine Nitrogruppe on ortho-Stellung zur Gruppierung-O-Z vorhanden ist. Optimale Ergebnisse bei der Freisetzung der Farbstoffgruppierung X wurden erhalten, wenn eine Nitrogruppe in ortho-Stellung und die Gruppe -CR&sub2;R&sub3;X in para-Stellung zur Gruppierung -O-Z stand.
  • Die Verbindungen im Rahmen der Formel A können durch Reaktionen hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und diese ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres, insbesondere im Hinblick auf die speziellen Beispiele, die nachstehend angegeben sind. Im allgemeinen werden die Verbindungen dadurch hergestellt, daß zunächst ein Phenol, der nach Wunsch geeignet substituiert sein kann, z.B. o-Nitrophenol in einer Mannichreaktion umgesetzt wird. Das Reaktionsprodukt enthält Isomere, die abgetrennt werden. Das gewünschte produkt reagiert dann mit einer Substratvorstufe, z.B. Tetra-o- Acetylbromgalaktose, worauf die Dimethylaminogrupe durch Umsetzung mit Chlorkohlensäureethylester in eine Chlorgruppe umgewandelt wird. Die Chlorgruppe wird dann durch Umsetzung mit einer geeigneten Verbindung, z.B. durch Reaktion mit dem Natriumsalz eines Farbstoffes,durch den Substituenten X ersetzt. Schließlich wird die Substratgruppe z.B. durch Umsetzung mit Natriummethylat deacetyliert.
  • Wie vorstehend diskutiert, erfordert das Freisetzungssystem die verwendung eines aktiven Enzyms, das mit dem Enzymsubstrat Z reagiert, welches ein Teil der ursprünglichen Reagensverbindung ist, und das die Reaktionssequenz initiiert, wobei die austretende Gruppe X aus dem Reagens freigesetzt wird. Enzyme mit der spezifischen Aktivität, die kovalente Bindung, die das Substrat Z mit dem Sauerstoffatom verbindet, abzuspalten, sind bekannt und als Hydrolasen, Transferasen und dgl. beschrieben. Dem Fachmann sind Enzymreaktionen, Enzymkinetik und Enzymspezifität geläufig, so daß die Auswahl des Substrates Z, des aktiven Enzyms und der Reaktionsbedingungen in jedem besonderen Fall durch das gewünschte Ergebnis bestimmt wird. Besondere Details und Beschreibungen von Enzymen und Enzymreaktionen finden sich bei Dixon und Webb, Enzymes, Academic Press, 1979 und Davison, Elliott und Jones, Data for Biochemical Research, 3. Aufl., Clarendon Press, 1986, auf deren Ausführungen hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Es folgt eine repräsentative, aber nicht vollständige Liste von einzelnen Enzymen, die für die Verwendung mit spezifischen Enzymsubstraten Z geeignet sind und die als brauchbar für das Freisetzungssystem gemäß der Erfindung angesehen werden. Enzym Substrat(Z) Alkalische Phosphatase saure Phophatase β-D-Galaktosidase α-D-Mannosidase β-D-Glycosidase Thioglycosidase Rindertrypsin Leucinaminopeptidase Schlangengiftphosphodiesterase Bauchspeicheldrüsenribonuclease β-D-Galaktose α-D-Mannose β-D-Glycose Glycosylrest CBZ-Glycin-Argnin Leucin Adenosin-5'-phosphat Cytidin-5'-phosphat
  • Die Enzyme, die für das gesteuerte Freisetzungssystem verwendet werden, können in verschiedenen Formen vorliegen, u.a.: als diskreteg Enzym; als Enzym, das mit einem Liganden bekannter Zusammensetzung oder Aktivität konjugiert ist; als mobiles Molekül in diskreter oder konjugierter Form und als immobilisiertes Molekül entweder in diskreter oder konjugierter Form.
  • Als diskrete Einheit soll das Enzym lediglich einen meßbaren und reproduzierbaren Grad an spezifischer Aktivität zeigen, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, die kovalente Bindung, über die das Substrat Z an das Sauerstoffatom gebunden ist, zu spalten. Bei einer konjugierten Enzymform ist das Enzym in üblicher Weise an den Liganden mit spezifischen Eigenschaften gebunden. Übliche Beispiele dieser Liganden sind: ein Partner eines spezifischen Bindungspaares von immunologischen Reaktionspartnern, z.B. Antigene und ihre spezifischen Antikörper; spezifische Bindungproteine, wie Biotin und Avidin; und Hormone und ihre Zielorgane. Verfahren zum Konjugieren von Liganden an Enzyme ohne wesentlichen Verlust oder Modifizierung der spezifischen Aktivität der Enzyme, sind im stand der Technik bekannt und in den us-Patentschriften 4 423 143 und 4 501 692 erläutert. Andere brauchbare Techniken (in Zusammenhang mit einem homogenen Enzymimmunassay) sind jeweils in den US- Patentschriften 3852 157, 4 067 774, 4 190 496, 4 203 802, 4 282 352 und 4 376 825 beschrieben.
  • Was die Immobilisierung der diskreten oder der konjugierten Enzyme, die spezifische Art und Weise und die chemischen Reaktionen, durch die das Enzym an eine Festphasenoberfläche oder einen Träger gebunden wird, betrifft, so können diese aus dem bekannten Stand der Technik ausgewählt werden. Diese Immobilisierungstechniken und -verfahren, durch die das Enzym direkt oder durch verbindende Gruppen an Festkörper, wie polymere Materialien, Teströhrchen, Scheiben, Agarose- und Plastikkügelchen, poröses Glas und Polyacrylamidgele gebunden wird, sind in Methods in Enzymology, Academic Press, 1980, Updike, Antibotics and Chemotherapeutics 26:67 (1979) und in den US-patentschriften 3 739 445, 3 970 429 und 4 138 474 beschrieben.
  • Wie vorstehend beschrieben, führt die Einwirkung des aktiven Enzyms auf die Substratgruppe Z zur Abspaltung der Substratgruppe und zur Bildung einer Zwischenstufe, die eine Chinon-Methid-Eliminierungsreaktionssequenz in einem wäßrigen Medium durchläuft, um die Freisetzung der austretenden Gruppe X zu bewirken. Diese Gruppierung ist über ein Kohlenstoffatom an den Benzolring gebunden, der seinerseits durch verschiedene Substituenten, wie vorstehend beschrieben, substituiert sein kann.
  • Die Ausgangsverbindung, dargestellt durch die Formel A, kann ihrerseits eine mobile Spezies sein, oder sie kann dadurch immobilisiert sein, daß sie über eine der Gruppen R oder R&sub1; an eine Festphasenoberfläche oder einen Träger gebunden ist. Techniken und Reaktionen, nach denen die Immobilisierung dieser Moleküle durchgeführt werden kann, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Wo das Molekül an einem Träger immobilisiert ist, kann das Freisetzungssystem verwendet werden, um eine mobile Spezies aus dem ursprünglich immobilen Molekül zu liefern. Es sind viele verschiedene Alkyl- und Arylgruppen für die Bindung des Moleküls an einen immobilien Träger bekannt. Eine besonders bevorzugte Gruppe für diesen Zweck ist die Piperazinylsulfonyl-Reihe, dargestellt durch
  • worin R&sub4; Wasserstoff oder einen
  • niederen Alkylrest, der direkt an eine Festkörperoberfläche oder einen Träger gebunden ist, bedeutet.
  • Die Auswahl der austretenden Gruppe X hängt von der beabsichtigten Verwendung ab. Die freisetzbare Gruppierung kann in Form eines Chromophors, von fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Farbstoffen; einer Farbstoff-Vorstufe; einer spezifischen Aminosäure,wie Serin, Cystein, Tryrosin, Lysin, Glutaminsäure und dgl. eingesetzt werden. Sie kann auch eine biologisch aktive Spezies (z.B. therapeutische Arzneimittel, Steroide oder Polypeptide) sein, die an die Kohlenstoffbindung gebunden sein kann, ohne daß die biologischen Eigenschaften des Moleküls als ganzes beinflußt werden. Diese letzte Kategorie umfaßt insbesondere Polypeptide mit bekannten spezifischen Aktivitäten, wie Enzyme und Polypeptide, die fähig sind, spezifisch an ein anderes Molekül, wie Hormone zu binden; und Polypeptide mit definierten pharmazeutischen Eigenschaften, z.B. den Gewebeplasminogenaktivator (tPA).
  • Wie vorstehend erwähnt, können das enzymgesteuerte Freisetzungssystem und die darin verwendeten Verbindungen in Kombination mit einem aktiven Enzym bei einer Vielzahl von verschiedenen Anwendungen verwendet werden. Verschiedene Eigenschaften und Kennzeichen der Erfindung werden vorteilhaft bei diesen Anwendungsarten benutzt. Eine bevorzugte Art der Verwendung ist das Gebiet der Immunassays für chemische und diagnostische Analysen. Bei dieser Verfahrensweise ist das aktive Enzym kovalent an einen Liganden mit bekannten spezifischen Bindungseigenschaften für einen gewünschten Analyten gebunden. Typischerweise wird ein immobilisiertes Analytenanaloges verwendet, um eine Konkurrenz zwischen dem interessierenden Analyten und dem Analytenanalogen um die Bindungsstellen des Liganden (dem spezifischen Bindungspartner), der an das Enzym gebunden ist, zu schaffen. Der spezifische Bindungspartner oder Ligand,der an das Enzym gebunden ist, ist ein Protein oder ein Polypeptid und kann funktionell als ein Antikörper (monoklonal oder polyklonal), ein Antikörperfragment (z.B. ein Fab-Fragment oder Fab'- Fragment) oder ein spezifisches Bindungsmolekül, wie Avidin oder Biotin klassifiziert werden. Der interessierende Analyt zeigt eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden, der mit dem Enzym verbunden ist und wird gewöhnlich ein Antigen oder Hapten, als spezifisches Bindungsprotein oder als ein Molekül mit einer spezifischen Rezeptorstelle für den Liganden bezeichnet. Das Analytenanaloge ist gewöhnlich eine chemische Spezies, die mit dem interessierenden Analyten identisch oder ähnlich ist; es ist ebenfalls auf grund seiner nachgewiesenen Fähigkeit selektiv an den Liganden, der zuvor mit dem Enzym verbunden, zu binden, ausgewählt. Nach der Wechselwirkung zwischen den immunologischen Komponenten und dem nachfolgendem Waschen, zur Entfernung aller ungebundenen Spezies wird der Ligand-Enzym-Komplex mit dem Molekül, das das Substrat Z enthält und der austretenden Gruppe X in reaktiven Kontakt gebracht, so daß die letztere Gruppierung freigesetzt wird. Auf diese Weise kann die Anwesenheit und Konzentration eines oder mehrerer intressierender Analyten mit Präzision und Genauigkeit bestimmt werden.
  • Eine andere Anwendungsw betrifft durch Enzyme ausgelöste Fluoreszenzassays. Obwohl diese Art der Anwendung allgemein ist, ist sie insbesondere für den oben beschriebenen Immunassay anwendbar. Die Verbindung (Formel A) wird einem geeigneten aktiven Enzym oder mit dem oben beschriebenen immunologischen Ligand-Enzymkomplex, der eine Gruppierung X umfaßt, die ein Fluoreszenzfarbstoff ist, in reaktiven Kontakt gebracht. Während der Bindung an das Molekül zeigt die Farbstoffgruppierung keine nennenswerte Fluoreszenz oder Änderung in ihren Anregungsmaximum. Durch den Angriff des Enzyms oder des Enzym-Liganden-Komplex wird das Substrat abgespalten, worauf die Fluoreszenzfarbstoffgruppierung als mobile Einheit ins Reaktionsmedium freigestetzt wird. Nach der Freisetzung und der Einführung von Licht mit einer geeigneten Wellenlänge fluoresziert der mobile Farbstoff und kann nachgewiesen werden. Nach dieser Anwendungsweise kann entweder ein qualitativer oder ein quantitativer Test bereitgestellt werden. Ferner kann bei dieser Anwendungsweise das Molekül, das den Fluoresenz- (oder den Chromphoren- oder Chemilumineszenz-) Farbstoff enthält, entweder als mobiler Reaktionspartner oder als immobilisierter Reaktionspartner, der mit einen Festkörperträger verbunden ist, verwendet werden. Die Fähigkeit, das Reaktionspartnermolekül,das eine Farbstoff- Vorstufe enthält,zu immobilisieren und dann aus ihm einen mobilen Farbstoff freizusetzen, ist ein wichtiges Merkmal der Erfindung.
  • Analytische Systeme, die eine Enzymverstärkung benötigen, stellen eine weitere Anwendungsweise dar. In vielen Fällen, in denen der Nachweis eines Enzyms das Ziel des Assays ist, liegt ein großer Nachteil von bekannten Nachweissystemen in ihrer relativen Unempfindlichkeit und/oder in ihrer Unfähigkeit, ausreichende Mengen einer identifizierenden Markierung im Hinblick auf die Menge an Enzym in der Testprobe zu liefern. Genauer gesagt, obgleich konventionelle Reaktanten mit dem Enzym in der Probe wechselwirken, ist die Menge an identifizierbarer Markierung, die durch das Testsystem freigesetzt wird, als Nachweis des reaktiven Kontaktes oft unzureichend, so daß mit dem existierenden Instrumentarium keine Messung mit der für die Analyse erforderlichen Genauigkeit möglich ist. Dies gilt besonders für Assays zum Nachweis von Analyten oder Metaboliten, wie spezifischen Enzymen,die in Nanogramm- oder Pikogrammengen vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verstärkung dieser Nachweissysteme, indem das Freisetzungssystem in Serie oder in mehreren Stufen angewendet wird. Wenn zum Beispiel der Nachweis von beta-Galaktosidase das Ziel des Assays ist, kann ein Reaktant der ersten Stufe ein immobilisiertes Molekül sein, das ein für beta-Galaktosidase spezifisches Substrat Z und eine freisetzbare Gruppierung X, die ein anderes aktives Enzym mit eines breiteren Substratbereich, wie Amylase, darstellt enthalten. Die Amylase-Enzym-Gruppierung ist mit dem immobilisierten Molekül durch einen ihrer Bestandteile Lysin, Tyrosin, Serin oder Thiolreste über abstehende Seitengruppen verbunden. In der zweiten Stufen wird ein Molekül als ein zweiter immobilisierter Reaktionspartner bereitgstellt, in dem ein weiteres Substrat Z' zum Angriff durch die verdrängte Amylase-Enzym-Gruppierung nach deren Freisetzung geöffnet wird. Die freisetzbare Gruppierung X' des Reaktionspartners der zweiten Stufe ist ein meßbarer Farbstoff, der entweder chromophor, fluoreszierend oder chemilumineszierend ist.
  • Bei der Durchführung der Analyse wird durch die Anwesenheit der β-Galaktosidase in der Testprobe ein Angriff auf den ersten immobilen Reaktionsparner initiiert, wodurch das Amylaseenzym als erste verdrängte Gruppierung X freigeswetzt wird; die freigesetzte Amylase kann dann mit dem zweiten immobilen Reaktionspartner reagieren, dessen eigenes Substrat Z' zum Angriff durch die freigesetzte Amylase geöffnet ist, die wiederum die Freisetzung eines identifizierbaren Farbstoffs als zweite verdrängte Gruppierung X' bewirkt. Die Konzentration des zweiten immobilen Reaktionspartners ist typischerweise größer als die Konzentration des ersten immobilen Reaktionspartners, um den Verstärkungseffekt zu erreichen. Demgemäß bewirkt ein einziges β-Galaktosidase- Molekül (durch das zweistufige enzymgesteuerte Freisetzungssystem) die Freisetzung von vielen Molekülen des identifizierbaren Farbstoffs in Mengen, die für eine reproduzierbare und genaue Messung mit herkömmlichen photometrischen Vorrichtungen ausreichend sind. Auf diese Weise kann die Anwesenheit von sehr kleinen Mengen an β-Galaktosidase in der Testprobe durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung verstärkt werden, um einen positiven Nachweis und quantitative Messungen auszuführen.
  • Die Freisetzung von spezifischen Agentien bei Bedarf ist eine weitere Anwendungsweise, die benutzt wird, wenn eine Freisetzung als Antwort auf ein spezifisches Auslöseereignis bei Bedarf nötig oder erwünscht ist. Diese Situationen betreffen die Freisetzung von therapeutischen Arzneimitteln, Proteinen oder pharmazeutischen Wirkstoffen oder die Freisetzung von Molekülen mit spezifischen Eigenschaften und Charakteristiken. In diesen Fällen enthält die Ausgangsverbindung das freizusetzende Agens als Gruppierung X. Durch Zugabe des aktiven Enzyms, das in der Lage ist, das Substrat Z abzuspalten, erfolgt die Freisetzung des gewünschten Agens unmittelbar bei Bedarf. Auf diese Weise liegt das gewünschte Agens im gebundenen Zustand vor und kann nach der Einführung eines geeigneten aktiven Enzyms sofort freigestzt werden.
  • Die Erfindung ist nachstehend im Hinblick auf die besonders bevorzugte Ausführungsform durch Beispiele erläutert.
    • Beispiel 1
  • Eine Mischung aus o-Nitrophenol (1,0 g; 7,19 mMol), 37 %iger wäßriger Formalinlösung (0,81 ml; 10,78 mMol) und 25 %iger wäßriger Dimethylaminlösung (1,9 ml; 10,78 mMol) wurden in 25 ml absoluten Alkohol über Nacht unter Rückfluß gehalten, worauf die flüchtigen Bestandteile mit einem Rotationverdampfer entfernt wurden. Der resultierende Rückstand wurde auf einem Silikagel (Silica Woelin 32-62 u von Universal Scientific Inc.) unter Verwendung von 5 %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Die erste gelbe Hauptbande, die eluiert wurde, enthielt 0,3 g (23 % Ausbeute) an 4- Dimethylaminomethyl-2-nitrophenol. Die nächste gelbe Bande, die eluiert wurde, enthielt 0,3 g (23 % Ausbeute) eines isomeren Produktes 2-Dimethylaminomethyl-5-nitrophenol. Das Bis-Mannich- Produkt blieb auf der Säule. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten bei Verwendung von N,N,N',N'-Tetramethyldiaminomethan anstelle von Dimethylamin und Formalin.
  • Eine Mischung aus 4-Dimethylaminomethyl-2-nitrophenol (270 mg; 112 mMol), 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-Galaktopyranosylbromid (1,0 g; 2,4 mMol), Benzyltriethylammoniumchlorid (274 mg; 1,2 mMol) und 0,3 M Natriumhydroxid (6 ml; 1,8 mMol) wurden mit 10 ml Methylenchlorid vereinigt und 7 Stunden kräftig bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Die Schichten wurden getrennt, die wässrige Phase wurde mit zusätzlichem Methylenchlorid gewaschen, und die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockene eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde in Ether aufgenommen und mehrmals mit 1 N Natriumhydoxid gewaschen, bis die Waschflüssigkeit farblos war. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand auf Silikagel mit 5 %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel (Rf auf TLC 0,5) chromatographiert, um 0,6 g (90 % Ausbeute) an (4-Dimethylaminomethyl-2-nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β- D-galaktopyranosid als farblosen Feststoff zu erhalten.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,0 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,2 (s, 3H), 2,22 (s, 6H), 3,4 (S, 2H), 4,05 (m, 1H), 4,1-4,3 (m, 2H), 5,0-5,1 (m, 2H), 5,4-5,6 (m, 2H), 7,3 (d, J=7Hz, 1H), 7,45 (d, J=7Hz, 1H), 7,75 (bs, 1H).
  • Eine Lösung dieser Galaktopyranosidverbindung (360 mg, 0,68 mMol) in 10 ml Ethylenchlorid wurde mit Ethylchlorformiat (98 ul, 1,03 mMol) behandelt, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Weitere 100 ul Ethylchlorformiat und 50 mg wasserfreies Natriumcarbonat wurden zugegeben, und die Mischung wurde erneut über Nacht gerührt. Die Lösung wurde filtriert und bis zur Trockene eingedampft, wobei 350 mg (100 % Ausbeute) an (4-Chlormethyl-2-nitrophenyl)- 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galaktopyranosid als ein Öl, das langsam kristalliesierte, erhalten wurden.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,0 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,1 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 3,9-4,3 (m, 3H), 4,55 (s, 2H), 4,9-5,15 (m, 2H), 5,4- 5,6 (m, 2H), 7,3 (d, J=7Hz, 1H), 7,5 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,75 (d, J=2Hz, 1H).
    • Beispiel II
  • Eine Lösung von 2-Brommethyl-4-nitrophenol (0,5 g, 2,15 mMol), das nach dem Verfahren von Kirkland et al., JACS 86 (1964) 1448 und ORG. SYN. 20 (1940) 59 snythestisiert wurde, in 7 ml Acetonitril wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Dimethylamin (0,56 ml, 5,39 mMol) in 10 ml Acetonitril bei 0-5 ºC gegeben. Nach 1 1/2 Stunden wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt, 45 Minuten gerührt, worauf die flüchtigen Komponenten mit einem Rotationsverdampfer entfernt wurden. Der Rückstand wurde in Essigsäureethylester aufgenommen, zweimal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumchlorid getrocknet und bis zur Trockne eingedampft. Das resultierende Rohprodukt wurde durch Chromatographie auf Silikagel unter Verwendung von 5 %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel gereinigt, wobei 0,22 g (46 % Ausbeute) reines 2-Diethylaminomethyl-4-nitrophenol als gelbes Öl erhalten wurden.
  • Das Produkt wurde nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren galaktosidiert, wobei (2-Diethylaminomethyl-4- nitrophenol)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-galaktopyranosid in 58 %iger Ausbeute erhalten wurde.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,05 (t, J=7Hz, 6H), 2,0-2,2 (3 singlets, 12H), 2,52 (q, 7Hz, 4H), 3,45 (AB quartet, J=15 Hz, 2H), 4,15 (m, 3H), 5,0-5,2 (m, 2H), 5,4-5,6 (m, 2H), 6,95 (d, J=9H2, 1H), 8,0 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=3Hz, 1H), 8,4 (d, J=3Hz, 1H); MS (FB&spplus; 555).
  • Die entsprechende Chlormethylverbindung wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthestisiert, wobei (2-Chlormethyl-4-nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acety-β-D- galaktopyranosid in quantitativer Ausbeute erhalten wurde.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,0-2,2 (3 singlets, 12H), 4,1-4,4 (m, 3H), 4,55 (AB quartet, J=12Hz, 2H), 5,0-5,3 (m, 2H), 5,4-5,7 (m, 2H), 7,16 (d, J=9Hz, 1H), 8,16 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=3Hz, 1H), 8,3 (d, J=3Hz, 1H).
    • Beispiel III
  • Eine Lösung von 5-Carboxy-2-nitrophenol (1,0 g, 5,5 mMol), Thionylchlorid (1,5 ml, 20,75 mMol) und Dimethylformamid (3 Tropfen) in 10 ml Toluol wurden auf 70 ºC erhitzt und 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde dann gekühlt und von einer kleinen Menge an dunklem Öl, das sich an den Wänden des Kolbens abgeschieden hatte, dekantiert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde erneut aus frischem Toluol eingedampft. Die resultierende Mischung wurde in 10 ml Methylenchlorid aufgenommen und tropfenweise zu einer kalten, gerührten Lösung von Morpholin (4,8 ml, 55,0 mMol) in 20 ml Methylenchlorid gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, mit 1 N HCl gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf die flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt wurden. Die Rekristallisation des Rohprodukts aus einer Methylenchlorid- Hexan-Lösung ergab 700 mg (50 % Ausbeute) an 5-Morpholinamid- 2-nitrophenol als blaßgelbliche Kristalle.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 3,2-4,0 (m, 8H), 6,9 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,05 (d, J=2Hz, 1H), 8,05 (d, J=9Hz, 1H), 10,05 (bs, 1H).
  • Nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren wurde eine Dimethylaminomethylgruppe in 4-Stellung angefügt, wobei 4-Dimethylaminomethyl-5-morpholinamid-2-nitrophenol in einer Ausbeute von 24 % erhalten wurde.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 2,2 (s, 6H), 2,8-3,3 (m, 3H), 3,4-3,9 (m, 7H), 6,94 (s, 1H), 8,0 (s, 1H), MS (FB&spplus; 310).
  • Das vorstehend angegebene Produkt wurde galaktosidiert, indem zunächst eine Lösung dieser Verbindung (56 mg, 0,18 mMol) mit 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-galaktopyranosylbromid (74 mg, 0,18 mmol) und Silbercarbonat (55 mg, 0,2 mmol) in 5 ml trockenem Acetonitril hergestellt wurde, die bei Raumtemperatur unter Stickstoff über Nacht gerührt wurde. Die Mischung wurde abgenutscht, zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde auf Silikagel unter Verwendung von 5 %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert, wobei 84 mg (73 % Ausbeute) an (4-Dimethylaminomethyl-5-morpholinamid-2- nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galaktopyranasid in Form eines farblosen festen Schaumes erhalten wurden.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) 6 2,0 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 2,2 (s, 6H), 2,9-3,3 (m, 3H), 3,4-4,3 (m, 10H), 4,9- 5,6 (m, 4H), 7,15 (s, 1H), 7,7 (s, 1H), MB (FB&spplus; 649).
  • Die entsprechende Chlormethylverbindung wurde nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren synthetisiert, wobei (4- Chlormethyl-5-morpholinamid-2-nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O- acetyl-β-D-galaktopyranosid erhalten wurde.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,94 (s, 3H), 2,0 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 3,1-3,3 (m, 3H), 3,5-4,5 (m, 10H), 4,8-5,1 (m, 2H), 5,3-5,5 (m, 2H), 7,15 (bs, 1H), 7,8 (s, 1H), MS (FB&spplus; 631).
    • Beispiel IV
  • 3-Morpholinamido-2-nitrophenol wurde nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei das Produkt nach dem Umkristallisieren aus Methylenchlorid-Hexan in einer 79 %igen Ausbeute erhalten wurde.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 3,14-3,35 (m, 2H), 3,6-4,1 (m, 6H), 6,75 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,1 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,5 (t, J=2Hz, 1H), 10,5 (s, 1H).
  • Die beiden lsomere nämlich (3- und 5-Morpholinamid-2- nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-Galaktopyranosid wurden aus 3-Morpholinamid-2-nitrophenol bzw. aus 5-Morpholinamid-2- nitrophenol nach dem in Beispiel III beschriebenen Silbercarbonatverfahren synthetisiert. Die ¹H MMR-Daten waren in Übereinstimmung mit der Struktur der Verbindungen.
    • Beispiel V
  • Eine Verbindung (A), nämlich (4-Resorufinylmethyl-2- nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galaktopyranosid (Formel A -
  • R bedeutet O-Nitro; R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind H; -CR&sub2;R&sub3;X ist para;
  • X ist
  • wurden hergestellt, indem zunächst eine Lösung von (4- Chlormethyl-2-nitrophenyl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D- galaktopyanosid (220 mg, 0,425 mMol), Natrium-Resorufin (190 mg, 0,425 mMol) und einer katalytischen Menge an Natriumiodid in 4 ml trockenem DMF bei 70 ºC 4 Stunden erhitzt wurden. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, im Hochvakuum zur Trockne eingedampft,und der resultierende Rückstand wurde auf Silikagel mit 5 %igem Methanol in Methylenchlorid als Elutionsmittel chromatographiert. Die Isolierung der orangegelben Bande mlt dem hohen Rf-Wert ergab 277 mg (94% Ausbeute) des gewünschten Produkts in Form eines orangefarbenen festen Schaums.
  • ¹H NMR (CDCl&sub3;) 6 2,0 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,1 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 4,0-4,3 (m, 3H), 5,0-5,2 (m, 2H), 5,35-5,7 (m, 2H), 6,2 (d, 2Hz, 1H), 6,65-7,1 (m, 3H), 7,3-8,0 (m, 5H), MS (FB&spplus; 694).
  • Die Galaktosylacetatschutzgruppe wurde in der folgenden Weise entfernt: Die Verbindung (277 mg, 0,4 mMol) in 30 ml Methanol wurde mit 0,2 N Natriummethoxid (140 ul, 0,028 mMol) behandelt, worauf die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt wurde. Das Produkt wurde abgenutscht, mit einem Überschuß an Methanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 167 mg (79 % Ausbeute) an (4- Resorufinylmethyl-2-nitrophenyl)-β-D-galaktopyranosid in Form eines orangefarbenen Pulvers erhalten wurden.
  • ¹H NMR (D&sub6;DMSO + 1 Tropfen D&sub2;O) δ 3,4-3,8 (m, 6H), 5,08 (d, J=9Hz, 1H), 5,28 (s, 2H), 6,25 (d, J=2Hz, 1H), 6,78 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,1 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,19 (d, J=2Hz, 1H), 7,45 (d, J=9Hz, 1H), 7,5 (d, J=9Hz, 1H), 7,7-7,8 (m, 2H), 8,0 (d, J=2Hz, 1H), MS (FB&spplus; 527).
  • Das oben beschriebene Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zur Entfernung von Schutzgruppen. In Fällen, in denen das Produkt nicht in geeigneter Weise ausfällt, kann ein abgeändertes Verfahren durchgeführt werden, bei dem die Lösung mit einem Ionenaustauscherharz,wie Amberlite 410 (aktiviert mit 1 N Natriumacetatlösung über 1 Stunde und anschließendem Waschen mit destilliertem Wasser und schließlich mit absolutem Methanol) einige Minuten behandelt wird, worauf das Harz in eine kleine Säule unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel eingeführt wird. Das eluierte Produkt wird dann durch Abdampfen des Lösungsmittels isoliert. Durch diese Behandlung werden das restliche Natriummethoxid und Farbstoff quantitativ entfernt.
  • Ein weiteres Verfahren zur Entfernung der Acetatgruppen umfaßt die Behandlung mit 50 Äquivalenten Triethylamin in Methanol bei Raumtemperatur.
    • Beispiel VI
  • Es wurde eine Verbindung (B) gemäß der Erfindung hergestellt-Formel A, Z ist ein β-D-Galaktopyranosidrest, R ist o-Nitro, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind Wasserstoff, CH&sub2;R&sub3;X steht in para-Stellung und X ist
  • pH 7
  • max 460 nm (epsilon=21500)
  • ¹H NMR (CD&sub3;OD) 6 2,5 (s, 3H), 2,75 (s, 3H), 3,4-4,0 (m, 22H), 5,1 (d, J=9Hz, 1H), 5,35 (AB quartet, J=12Hz, 2H), 6,94 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 7,54 (d, J=9Hz, 1H), 7,7 (d, J=9Hz, 1H), 7,94 (s, 1H).
    • Beispiel VII
  • Es wurde eine Verbindung (C) gemäß der Erfindung hergestellt - Formel A, Z ist ein β-D-Galaktopyranosidrest, R ist p-Nitro, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind Wasserstoff, CR&sub2;R&sub3;X steht in ortho-Stellung und X ist
  • ¹H NMR (DMSO-d6) δ 3,2-3,8 (m, 6H), 5,05 (d, J=7Hz, 1H), 5,4 (s, 2H), 6,3 (s, 1H), 6,8 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,21 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,3 (d, J=2Hz, 1H), 7,4 (d, J=9Hz, 1H), 7,57 (d, J=9Hz, 1H), 7,84 (d, J=9Hz, 1H), 8,3 (dd, J&sub1;=9Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 8,35 (d, J=2Hz, 1H), MS (FB&spplus; 527).
    • Beispiel VIII
  • Es wurde eine Verbindung (D) gemäß der Erfindung hergestellt - Formel A, Z ist ein β-D-Galaktopyranosidrest, R ist o-Nitro, R&sub1; ist 5-Morpholinamid, CR&sub2;R&sub3;X steht in para-Stellung und X ist Resorufinyl.
  • ¹H NNR (d&sub7;DMF) δ 3,3-4,0 (m, 14H), 5,3 (d, J=8Hz, 1H), 7,2 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=2Hz, 1H), 7,3 (d, J=2Hz, 1H), 7,55 (d, J=7Hz, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,84 (d, J=7Hz, 1H), 8,25 (s, 1H), MS (FB&spplus; 640).
    • Beispiel IX
  • Es wurde eine Verbindung (E) gemäß der Erfindung hergestellt - Formel A, R ist o-Nitro, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; sind Wasserstoff, CR&sub2;R&sub3;X steht in para-Stellung und X ist ein Farbstoffrest, dargestellt durch die Formel
  • ¹H NMR (d&sub6;DMSO + 1 Tropfen D&sub2;O) δ 3,3-3,7 (m, 14H), 5,08 (d, J=8Hz, 1H), 7,1 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=3Hz, 1H), 7,15 (d, J=3Hz, 1H), 7,5 (dd, J&sub1;=7Hz, J&sub2;=3Hz, 1H), 7,7-7,8 (m, 2H), 8,0 (s, 1 H), 8,15 (s, 1H), MS (FB&spplus; 589).
    • Beispiel X
  • Die angenäherten relativen Freisetzungsgeschwindigkeiten der austretendenden Gruppen von Verbindungen gemäß der Erfindung verglichen mit denen von o-Nitrophenolgalaktosid (ONPG) wurden nach dem folgenden Verfahren gemessen: Es wurde eine 5 x 10&supmin;&sup5; M Lösung der Verbindung in Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer, pH 7, die 0,01 M an Natriumchlorid und 0,01 M an Magnesiumchlorid bei 25 ºC war, hergestelt. Die Lösung wurde in eine 3 ml-Küvette überführt in die 1,5 Internationale Einheiten β-Galaktosidase aus E.coli eingeführt wurden. Die Reaktionsmischung wurde in einem Spektralphotometer bei der geeigneten Wellenlänge überwacht. Die Ergenisse sind nachstehend angegeben. Verbindung angenäherte relative Geschwindigkeit
  • Man erkennt, daß die Verbindungen A und C, die Isomere sind, deutlich verschiedene Freisetzungsgeschwindigkeiten haben. Diese Daten veranschaulichen die bevorzugten Stellungen der Nitrogruppe und des Substituenten, einschließlich der Farbstoffgruppierung im Hinblick auf das speziell verwendete Enzym. Außerdem zeigt die Verbindung C, die identisch mit der Verbindung A ist, außer daß erstere eine Morpholinamidgruppe in der 5-Stellung enthält, eine viel langsamere Freisetzungsgeschwindigkeit, woraus sich die Wirkung des Substituenten auf die Freisetzungsgeschwindigkeit bei Verwendung dieses speziellen Enzmys zur Initiierung des Freisetzungsmechanismus ergibt.
    • Beispiel XI
  • Eine 0,3 mmolare Mischung der Verbindung B in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 (0,1 N NaH&sub2;PO, 0,15 M NaCl, 1 % Zwittergent 3-14) wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt und dann durch ein 22u-Filterelement filtriert. Die Konzentration der Verbindung wurde berechnet durch Verdünnen der Lösung (1:10), wobei eine optische Dichte zwischen 0,39 und 0,41 bei 470 nm erhalten wurde.
  • Die Lösung (100 ul) wurde in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben, und die optische Dichte wurde bei 570 nm mit einem EIA Auto Reader, Modell EL 310 von Bio Tek Instruments gemessen. Die Fluoreszenz des gleichen 100 ul- Volumens der Lösung wurde mit einem Titertek Fluoroskan von Flow Laboratories durch Anregung bei 550 nm und Ablesen bei 580 nm gemessen.
  • Zu jedem 100 ul Volumen der Lösung wurden 10 ul eines Anti- α- TSH-β-Galaktosidasekonjugats (1,3 x 10&supmin;¹¹ molar in β- Galaktosidase) gegeben, und die Mischungen wurden 15 Minuten bei 37 ºC inkubiert, worauf die optische Dichte und die Fluoreszenz, wie oben beschrieben, gemessen wurden. Die Daten zeigten eine Änderung der optischen Dichte von 0,0584 und eine Änderung der Fluoreszenz von 7266 mV. Diese Daten veranschaulichen, daß ein mit dem Freisetzungssystem gemäß der Erfindung ein nachweisbares Ergebnis bei einer molaren Enzymkonzentration von 1,3 x 10&supmin;¹² erhalten wurde.
    • Beispiel XII
  • Eine 0,614 mmolare Lösung der Verbindung B wurde in einem Puffer von pH 7,6, zusammengesetzt aus 0,01 N NaH&sub2;PO&sub4;, 0,1 N NaCl, 0,1 N NaN&sub3;, 2 mM MgCl&sub2;, 0,1 % Tween 20 , einem Tensid und 0,1 % Rinderserumalbumin hergestellt. Dann wurden β- Galaktosidaselösungen (E.coli) in verschiedenen Konzentrationen in einem pH 7-Puffer, wie oben beschrieben, hergestellt, außer daß sie kein BSA enthielten.
  • Die Lösung der Komponente B (45 ul) wurde zu jeder Enzymlösung (5ul) in einer Reaktionskammer gegeben, welche in ein Laborinstrument eingebracht wurden. Die Fluoreszenz jeder Reaktionsmischung wurde zu Beginn und nach 2 Minuten durch Anregung bei 550 nm und Messung der Emission bei 580 nm abgelesen. Die Tabelle zeigt die Änderung in Volt/Minute (Durchschnittswerte aus 2 getrennten Messungen) als Funktion der Enzymkonzentration. Enzymkonzentration V/min
  • Diese Daten zeigen, daß eine befriedigende Standardkurve für einen enzymgesteuerten Assay gemäß der Erfindung erhalten wurde.

Claims (11)

1. Enzymgesteuertes Verfahren zur Freisetzung einer austretenden Gruppe, welches (folgende Stufen) umfaßt: Kontaktieren einer Verbindung der Formel
worin bedeuten:
R und R&sub1; bedeuten jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, einen Substituenten, der die Mobilität oder Reaktivität der Verbindung beeinflußt oder einen Substituenten, einschließlich einer biologisch aktiven Gruppe, dargestellt durch -L-B, worin L eine verbindende Gruppe und B eine biologisch aktive Gruppe darstellt;
R&sub2; und R&sub3; bedeuten jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff;
X bedeutet eine austretende Gruppe;
Z bedeutet eine Enzymsubstrat-Gruppierung;
-CR&sub2;R&sub3;X steht entweder in ortho- oder para-Stellung zu der Gruppierung -O-Z;
mit einem aktiven Enzym, das in der Lage ist, die Enzymsubstrat-Gruppierung Z von der Verbindung abzuspalten; wodurch die austretende Gruppe X aus der Verbindung freigesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die austretende Gruppe aus der Gruppe, bestehend aus einer organischen Gruppierung, einer organometallischen Gruppierung und einer anorganischen Gruppierung ausgewählt ist und vorzugsweise eine organische Farbstoffgruppierung, die gegebenenfalls fluoreszierend ist, oder eine pharmakologisch aktive Gruppe darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das aktive Enzym kovalent an einen Analyten gebunden ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Enzymsubstrat-Gruppierung Z ein Glycosid, einen Phosphatester oder einen Aminosäureester darstellt.
5. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Flüssigkeit, welches (folgende Stufen) umfaßt:
Kontaktieren einer Flüssigkeitsprobe, enthaltend einen Analyten, mit (a) einem Bindungspartner des Analyten, der mit einem Enzym konjugiert ist, und (b) einem immobilisierten Analogen des Analyten, um gebundene und freie Immunkomplexe zu bilden;
Kontaktieren der gebundenen und freien Immunkomplexe mit einer Verbindung der Formel
worin bedeuten:
R und R&sub1; bedeuten jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, einen Substituenten, der die Mobilität oder Reaktivität der Verbindung beeinflußt oder einen Substituenten, einschließlich einer biologisch aktiven Gruppe, dargestellt durch -L-B, worin L eine verbindende Gruppe und B eine biologisch aktive Gruppe darstellt;
R&sub2; und R&sub3; bedeuten jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff;
X bedeutet eine austretende Gruppe;
Z bedeutet eine Enzymsubstrat-Gruppierung;
-CR&sub2;R&sub3;X steht entweder in ortho- oder para-Stellung zu der Gruppierung -O-Z;
worin das aktive Enzym in der Lage ist, die Enzymsubstrat-Gruppierung Z von der Verbindung abzuspalten, wodurch die austretende Gruppe X aus der Verbindung freigesetzt wird;
Abtrennung der gebundenen und freien Immunkomplexe zur Bildung einer festen Phase und einer flüssigen Phase;
und Nachweis der Anwesenheit des Analyten in der festen Phase oder in der flüssigen Phase als Funktion der austretenden Gruppe.
6. Verfahren nach Anspruch 2, worin die austretende Gruppe X eine organische Farbstoffgruppierung darstellt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin die organische Farbstoffgruppierung fluoreszierend ist und vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyphenoxazinonen, Hydroxykumarinen, Fluoresceinen, Rhodolen und Hydroxyphenalenonen, insbesondere Resorufin, Umbelliferon oder Fluorescein, ausgewählt ist, und der Analyt in der festen Phase nachgewiesen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin die Enzymsubstrat-Gruppierung Z ein Glycosid, einen Phosphatester oder einen Aminosäureester darstellt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Enzym β-Galactosidase, Z eine Glactosidase, R eine Nitrogruppe in ortho-Stellung zu der Gruppierung -O-Z bedeuten und -CR&sub2;R&sub3;X in para-Stellung zu der Gruppierun -O-Z steht.
10. Verbindung, dargestellt durch die Formel
worin bedeuten:
R, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; bedeuten jeweils unabhängig voneinander ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Nitro, Cyano, Alkyl, Phenyl, Carboxamido und Amino;
X bedeutet eine organische Farbstoffgruppierung oder eine pharmakologisch aktive Gruppierung;
Z bedeutet eine Gruppierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycosiden, Phosphatestern und Aminosäureestern; und -CR&sub2;R&sub3;X steht in ortho- oder para-Stellung zu der Gruppe -O-Z.
11. Verbindung nach Anspruch, worin X wie in den Ansprüchen 2 oder 7 definiert ist und, wenn es sich um eine pharmakologisch aktive Gruppierung handelt, vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus therapeutischen Drogen, Steroiden und Polypeptiden ausgewählt ist.
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