WO1990013665A1 - Analyse spectrale d'emissions avec degre de sensibilite eleve - Google Patents

Analyse spectrale d'emissions avec degre de sensibilite eleve Download PDF

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WO1990013665A1
WO1990013665A1 PCT/JP1990/000558 JP9000558W WO9013665A1 WO 1990013665 A1 WO1990013665 A1 WO 1990013665A1 JP 9000558 W JP9000558 W JP 9000558W WO 9013665 A1 WO9013665 A1 WO 9013665A1
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hydroxybenzoxazole
luminol
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PCT/JP1990/000558
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French (fr)
Inventor
Yoshihiro Oyama
Shuntaro Hosaka
Tetsuya Makino
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Definitions

  • the present invention provides high-sensitivity chemiluminescence measurement using enzyme reactions, antigen-antibody reactions, nucleic acid hybrid reactions, etc. in the fields of clinical testing, food testing, environmental analysis, animal and plant testing, and manufacturing process control testing. It relates to a method of performing an analysis.
  • the luminescence reaction using the oxidation of luminol, isorluminol, or a derivative thereof by peroxidase (hereinafter abbreviated as chemiluminescent DPD (2,3-dihydro-1,4-phthaladione dione)) is performed by imnoatase and elastase. It is used for analysis of glucose, glucose, and oxidants.
  • each of the above enhancers has the following problems. In most cases, the amount of light emitted is small and the signal-to-background ratio is small.
  • the typical enhancer in (2) is p-phenol, and its luminescence signal is high, but the background is also high and the signal-to-background ratio is low.
  • An object of the present invention is to perform high-sensitivity luminescence analysis that is performed in the presence of a novel enhancer. Another object of the present invention is to make it possible to carry out emission analysis using an enhancer with higher efficiency than conventionally known enhancers, and to provide a novel oxazole derivative which is effective as an enhancer.
  • the present invention provides a method for detecting or measuring a substance using (a) a peroxidase or a peroxidase derivative, (b) an oxidizing agent, and (c) chemiluminescence generated by a reaction of luminol, isorminol or a derivative thereof.
  • the evoked light response is reduced to 2-hydroxyl-1-fluorenone,
  • R i is hydrogen, C n H 2 n + 1 (where n represents a positive integer of 1 to 4), XC n H 2 n (where X is FC 1, Br or I And n is the same as defined above), C n H 2n + 1 C 0 £ (n is the same as defined above), phenyl group, naphthyl group, C n H 2n + 1 C 6 H 4 (n is the same as defined above), YC 6 H (Y is F represents C 1, B r, I, or off Eniru group), XY C 6 H 3 ( X, Y are each as) defined above]
  • FIG. 1 and FIG. 2 show the results of a CA 15-3 analysis performed using 2-enhoxyl-1-funolelenone, which is the enhancer of the present invention, and a known enhancer.
  • FIG. 1 shows the SN ratio of the luminescence intensity after 5 seconds
  • FIG. 2 shows the SN ratio of the luminescence intensity after 10 seconds.
  • FIG. 3 shows the results of CA 15-3 analysis with and without the case where the enhancer of the present invention was added to the luminescence system, and comparison of the results.
  • FIG. 4 shows the IR spectrum of 2-chloromethyl-6-hydroxybenzoxazole obtained in Example 19, and FIG. 5 shows its NMR spectrum.
  • FIG. 6 shows the IR spectrum of 2-ethoxycarboxy 6-hydroxybenzoxapool obtained in Example 20, and FIG. 7 shows its NMR spectrum.
  • FIG. 8 shows the IR spectrum of 2- (3-bromophenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 21.
  • FIG. 9 shows the NMR spectrum.
  • FIG. 10 shows the IR spectrum of 2- (2-methylphenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 22, and
  • FIG. 11 shows its NMR spectrum. It is.
  • Fig. 12 is the IR spectrum of 2- (3-chlorophenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in the experiment 35, and Fig. 13 is its NMR spectrum. It is a vector.
  • FIG. 14 is the IR spectrum of 2- (4-chlorophenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 36, and FIG. 15 is its NMR spectrum.
  • FIG. 16 shows the IR spectrum of 2- (2-naphthyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 37, and FIG. 17 shows its NMR spectrum. is there.
  • FIG. 18 shows the IR spectrum of 2- (2,4-dichlorophenol) obtained in Example 38
  • FIG. 19 shows the IR spectrum of the compound. It is an NMR spectrum.
  • FIG. 20 shows SN values obtained in Example 51 and Comparative Example 22.
  • the chemiluminescence enhancing effect of the oxazole derivative represented by the formula [I] can be explained by the fact that the ratio of luminescence signal to background obtained in the peroxidase oxidizing chemiluminescent DPD system is the addition of the enhancer of the present invention to the system. This can be confirmed by a remarkable improvement.
  • background refers to the luminescence intensity in the absence of peroxidase or a derivative thereof.
  • the peroxidase used in the present invention is not particularly limited, and is a plant peroxidase such as horseradish peroxidase.
  • the peroxidase derivative include a peroxidase antibody conjugate, a peroxidase antigen conjugate, a peroxidase streptavidin conjugate, and a biotin-bound peroxidase.
  • the antibody used here is not particularly limited, and for example, the partial structure of Fab ', F (ab) n and the like can be preferably used, for example, the strength of the contacts IgG and IgM.
  • the antigen and examples thereof include fluorescein and steroid hormone. Both low molecular weight haptens such as mon and high molecular weight substances such as polypeptides, proteins and polysaccharides can be used.
  • the DNA or RNA having 10 or more bases may be linear or cyclic.
  • hydrogen peroxide is preferably used, but perborate and hypochlorite can also be used.
  • the chemiluminescent DPD used in the practice of the present invention is luminol, isolminol, N- (4-aminobutyl) -N-ethylethyl solminol, or an antigen or antibody bound thereto. , Nucleic acids, etc., but luminol is particularly preferred o
  • HHBP used as an enhancer in the present invention is, for example, 3-acetyl-4-hydroxycoumarin and ha, as described in JP-A-50-46666. It can be produced by condensing lahydroxybenzoaldehyde in the presence of amine.
  • XC n H 2n (where X represents FC l, Br or I, and n is the same as defined above), C n H 2n + 1 C 0 9 (where n is The same as defined above), C n H 2n + 1 C 6 H 4 (n is the same as defined above), phenyl group, naphthyl , YC 6 H 4 (Y represents F, Cl, Br, I or phenyl), XYC 6 H 3 (X and Y have the same definition as above)]
  • the present invention relates to a highly sensitive luminescence analysis method characterized in that the method is carried out in the presence of an oxazole derivative represented by the formula: Specifically, hydrogen is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl (n—, iso—), butyl (n—, iso—, sec. —, Tert —), and a phenyl group.
  • an oxazole derivative represented by the formula: Specifically, hydrogen is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl (n—, iso—), butyl (n—, iso—, sec. —, Tert —), and a phenyl group.
  • halogenated alkyl group examples include a fluoromethyl group, a chloromethyl group, a bromomethyl group, a bromomethyl group, a 1-fluoroethyl group, a 2-fluoroethyl group, a 1-chloroethyl group, and a 2-chloroethyl group.
  • 2-bromopropyl group 3-bromopropyl group, 1-butyl methyl-1-methylethyl group, 2-bromo-1-methylethyl group, 1-iodopropyl group, 2-iodopropyl group,
  • alkoxycarbonyl group examples include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, a 1-methylethoxycanebonyl group, a butoxycarbonyl group, a 1-methylpropoxycarbonyl group, and a 2-methylpropyloxycarbonyl group. And a 1,1 dimethynorethoxyethoxycanolebonyl group.
  • alkyl-substituted phenyl group examples include 2-methylphenyl group, 3-methylinophenyl group, 4-methynolephenyl group, 2-ethynolephenyl group, 3-ethynolephenyl group, 4-ethylphenyl group, and 2-pro-phenyl group.
  • halogen-substituted phenyl group examples include 2-fluorophenyl group, 3-fluorophenyl group, 4-fluorophenyl group, 2-chlorophenyl group, 3-chlorophenyl group, and 4-fluorophenyl group.
  • examples thereof include a chlorophenol group, a 2-bromophenyl group, a 3-bromophenyl group, a 4-bromophenyl group, a 2-phenylphenyl group, a 3-phenylphenyl group, and a 4-phenylphenyl group.
  • Examples of the disubstituted phenyl group include a 2,4-dichlorophenyl group and a 3,5-dichlorophenyl group.
  • substituents are hydrogen, methyl, phenyl, chloromethyl, ethoxycarbonyl, 2-methylphenyl, 3-bromophenyl, 4-chlorophenyl, 2,4-dichlorophenyl. It is.
  • R 2 is XCH 2n (where X is F, C 1,
  • CE A (n is the same as defined above), naphthyl group, YC ha (Y represents F, Cl, Br, I or phenyl group ), XYC 6 H 3 (X and Y are as defined above)]
  • the compound [I] of the present invention can be synthesized by the following reaction formula (1).
  • X represents a positive integer of 4
  • XC n H 2n wherein X represents F, C 1, Br or I, and n is the same as defined above
  • YC 6 H 4 (Y is F, C l, B r, I , or represents the full We two Le group)
  • XY C 6 H 3 ( X, Y represent the same) as defined above
  • R 3 is C n H 2n + 1 (n represents the same) as defined above
  • -Z is Represents F, C1, Br or I].
  • alkyl group for R 3 examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an 11-methylethyl group, a butyl group, and a “1- Examples thereof include a methylpropyl group, a 2-methylpropyl group, and a 1,1-dimethylethyl group.
  • the base used in the present invention includes sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, sodium carbonate, carbonated carbonate and the like, trimethylamine, triethylamine, and the like.
  • t Amines such as monobutylamine and aromatic heterocyclic compounds such as pyridine and quinoline, etc., and sodium bicarbonate is particularly preferred.
  • the reaction does not require a solvent and proceeds at 20 to 150, but preferably 50 to 120 to increase the yield of the desired product.
  • R 3 represents C n H 2n + 1 (n represents a positive integer of 1 to 4), and X and Z represent F, C 1, Br or Represents I)
  • halogenated alkyl group used in the compound [IV] specifically, the same halogenated alkyl group used in the compound [I] is used.
  • R 3 used in compound [IV] specifically, the same R 3 used in compound [m] is used.
  • the reaction solvents used in the present invention include methanol, ethanol, and prono. These include alcohols such as ethanol and butanol, ethers such as ethyl ether and THF, and non-protonic polar solvents such as DMF and DMSO. Ethanol is particularly preferred.
  • the reaction proceeds at 20 to 150, but preferably 60 to 90 ° C to increase the yield of the desired product.
  • Y represents F, Cl, Br, I or a phenyl group
  • Z represents F, Cl, Br or I
  • the substituted phenyl group used in compound [V] are the halogenated phenyl and phenylphenyl groups used in compound [I].
  • the first-stage reaction proceeds at 100 to 280 ° C without requiring a solvent, but is performed at 150 to 250 to increase the yield of compound [VI]. C is preferred.
  • the base used for the hydrolysis reaction of compound [VI] is sodium hydroxide, sodium hydroxide, sodium carbonate, etc., with sodium hydroxide being particularly preferred.
  • the solvent water, alcohols such as methanol and ethanol, and ethers such as THF can be used, and a mixed solvent of water and methanol is particularly preferable.
  • the hydrolysis reaction proceeds at 20 to 50, but preferably 25 to 35 to increase the yield of the desired product.
  • the enhancer of the present invention is a powerful reagent that can be used in a method for measuring a substance using a luminescence reaction system composed of a peroxylase, a chemiluminescent DPD, and an oxidizing agent, and is particularly useful for the enzyme hybridization and DNA hybridization reactions. It is preferably used for measurement.
  • Amino resorcinol hydrochloride and chloroacetonitrile are available from Aldrich Co., Ltd., et al., Ethanol, DMS 0, getyl oxalate, 3-bromobenzoyl chloride, 2- Methyl benzoylc mouth ride, 41 Black Benzoynolechloride, 2,4-Dibenzo Benzoyloride, Noreminol (5-Amino 2,3-Dihydro 1,4,1-phthalazine dione), and I Solminol (6-amino 2,3-dihydro 1,4-phthalazine dione) is from Tokyo Chemical Co., Ltd., and phosphorus pentachloride and sodium hydrogen carbonate are from Kanto Chemical Co., Ltd.
  • HRP horseradish peroxidase
  • BSA serum albumin
  • HHBP was adjusted by the method described in JP-A-50-46666.
  • CA15-3 and anti-CA15-3 antibody were obtained from Centcore (Malvern. USA). Horseradish peroxidase-labeled anti-CA15-3 antibody was detected by the mouse
  • the chemiluminescence reaction was carried out in a 3 ml disposable plastic tube of 12 faces x 47 mm.
  • the generated light was detected with a Berthold luminometer (Biolumat LB9500T).
  • IR infrared absorption spectrum
  • NMR Nuclear magnetic resonance spectrum
  • MS The mass spectrum
  • the high resolution MS was measured using a JMSDX-303 mass spectrometer.
  • Example 1 The procedure of Example 1 was repeated, using isoluminol instead of norminol. The results are shown in Table 1.
  • Example 3- The procedure of Example 1 was repeated, except that ⁇ -(4-aminobutyl) - ⁇ ethylethyl solminol was used instead of luminol. The results are shown in Table 1.
  • CD CJ1 CJ1 Table 1 Based on 2,3-dihydro 1,4-monophthalazinedione (DPD)
  • the CA15-3 antigen solution (615 UZml) was diluted with phosphate buffer (PBS) containing serum albumin to give 300 U / mK 200 U / mK 100 U / m 50 U / mK 25 U / mK 0 U Zml (PBS containing serum albumin) was prepared, and each was used as a standard CA 15-3 solution.
  • PBS phosphate buffer
  • the mixture was reacted at 25 ° C for 2 hours. After completion of the reaction, the beads were washed three times with 5 ml of physiological saline using a bead sash. After washing, the beads in the tray were transferred to a test tube, and further to a plastic cubette for luminometer-one measurement.
  • the emission intensity after 5 seconds and 10 seconds after the standard CA 15-3 antigen solution 300 U Zml, 200 U Zml, 100 U / mK 50 U / m 25 U Zml
  • the emission intensity ratios (SN ratios) at 5 seconds and 10 seconds after 0 U Zml were determined and are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • Example 4 The procedure of Example 4 was repeated, except that 2-hydroxy 9 -fluorenone was replaced with P-phenophenol, P-hydroxygaymic acid, P-phenylphenol, 6-hydroxybenzothiazole, N- , N, N ', —' — Tetrametylbenzidine was used.
  • the emission intensities are shown in Tables 2-1 and 2-2, and the S ⁇ ratio is shown in Figures 1 and 2, respectively.
  • HBS-free PBS buffer ( ⁇ 7.0) 10 &, luminol, and hydrogen peroxide were mixed and stirred in the above amounts, and the luminescence intensity after 1 minute was measured.
  • Table 3 shows the ratio of the former and the latter as the signal-to-background ratio (SN ratio).
  • Example 6 the luminescence intensity was measured in the same manner as in Example 5, except that isoluminol (Example 6) or ⁇ I (Example 7) was used instead of luminol of Example 5. The results are shown in Table 3. Comparative Examples 9 to 11
  • the luminescence intensity was measured in exactly the same manner as in Examples 5 to 7 except that HHBP was not used.
  • the obtained crystals were dissolved in acetone, activated carbon was added, and the mixture was heated under reflux for 1.5 hours. Except for the activated carbon, the acetate was concentrated with an evaporator, and the obtained crystals were recrystallized with acetonitrile. 0.28 g (2. 07 ⁇ 1) of a white powder was obtained, and the conversion was 16.7%.
  • Example 9 in the light-emitting assembly of Example 8, isoluminol (Example 9), ⁇ - (4-aminobutyl) -1-ethylisoluminol (hereinafter abbreviated as ABEI) instead of luminol in the light-emitting assembly of Example 8
  • ABEI ⁇ - (4-aminobutyl) -1-ethylisoluminol
  • the emission intensity was measured in the same manner as in Example 8 except that 2-methyl-6-hydroxybenzoxazole was used instead of 6-hydroxybenzoxazole in Example 8, and Table 4 shows the results. Indicated.
  • Examples 12 and 13 are the same as Example 11 except that isoluminol (Example 12) and ABEI (Example 13) are used in place of luminol of Example 11.
  • the emission intensity was measured by the method shown in Table 4.
  • the luminescence intensity was measured in the same manner as in Example 8 except that 2-phenyl 6-hydroxybenzoxazole was used instead of 6-hydroxybenzoxazole in Example 8. 4
  • Examples 15 and 16 are the same as Example 14 except that isoluminol (Example 15) and ABEI (Example 16) are used instead of luminol of Example 14
  • the emission intensity was measured as shown in Table 5.
  • the CA15-3 antigen solution (615 UZml) was diluted with phosphate buffer (PBS) containing serum albumin to give a concentration of 300 U / mK 200 U / mK 100 U / mK 50 U / ml and 25 U / mK 0 U / ml (PBS containing bovine serum albumin) were prepared, and each was used as a standard CA 15-3 solution.
  • PBS phosphate buffer
  • the mixture was reacted at 25 eC for 2 hours. After the completion of the reaction, the beads were washed three times with 5 ml of physiological saline using a bead crusher. After washing, the beads in the tray were transferred to a test tube, and further to a plastic tube for luminometer single measurement.
  • Ratio of the average emission intensity after 10 seconds of the standard CA 15-3 antigen solution 300 UZml, 200 U Zml, 100 U / m 50 U / mU 25 U / ml) to the average emission intensity after 10 seconds of 0 UZml (SN ratio) was calculated and shown in Fig. 3.
  • Example 17 except that 2-methyl-6-hydroxybenzoxazole was used in place of HHBP in Example 17.
  • the luminescence intensity was measured in the same manner as in Example 17, and the average luminescence intensity was shown in Table 5, and the SN ratio was shown in FIG.
  • Comparative Example 15 The measurement was carried out in exactly the same way as in Example 17 except that HHBP and 2-methyl-16-hydroxybenzoxazole were not used.
  • Table 5 shows the average luminescence intensity
  • FIG. 3 shows the SN ratio.
  • the reaction was cooled to produce a precipitate, spent 14.
  • the precipitate was dissolved in acetone, activated carbon was added, and the mixture was refluxed for 1.5 hours.
  • Activated carbon was removed by 14 over 14 solution passed through a silica gel column, and concentrated.
  • the resulting crystals were dried under reduced pressure to obtain 1.07 g (5.17 niDiol) of 2-ethoxycanoleponyl 6-hydroxyloxybenzoxazole.
  • the reaction yield was 83.5%.
  • a hydrogen peroxide solution (a 9.1 M aqueous solution diluted 1000 times) was placed in a plastic cuvette, stirred with a vortex mixer for 3 seconds, and the luminescence intensity after 1 minute was measured.
  • the ratio of the former to the latter is shown in Table 6 as the signal-to-background ratio (S ⁇ ratio). Examples 24 and 25
  • Example 24 isoluminol (Example 24), ⁇ - (4-aminobutyl) monophenylisoluminol (hereinafter abbreviated as ABEI) in place of luminol of Example 23 (Example 24)
  • ABEI ⁇ - (4-aminobutyl) monophenylisoluminol
  • Example 23 The procedure was repeated except that 2- (3-bromophenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 21 was used instead of 2-ethoxycarbonyl 6-hydroxybenzoxazole in Example 3. The emission intensity was measured in the same manner as in Example 23 and shown in Table 6.
  • Example 27 instead of luminol of Example 26, isoluminol (Example 27) and ABEI (actual The emission intensity was measured in the same manner as in Example 26 except that Example 28) was used.
  • Example 23 instead of using 2-ethoxyquinone benzoxazole in Example 23 in place of 2-hydroxyquinobenzoxazole, the 2-clomethineolate 6-hydroxybenzoxazole obtained in Example 19 was used. The emission intensity was measured in the same manner as in Example 23, and the results are shown in Table 6.
  • Example 30 the light emission intensity was the same as in Example 29 except that isoluminol (Example 30) and ABEI (Example 31) were used instead of luminol of Example 29. was measured and the results are shown in Table 6.
  • Example 22 Except that 2- (2-methylphenyl) -16-hydroxybenzoxazole obtained in Example 22 was used in place of 2-ethoxyquin-carboxy 6-hydroxybenzoxazole of Example 20, The emission intensity was measured in the same manner as in Example 23, and shown in Table 6.
  • Example 33 the emission intensity was increased in the same manner as in Example 32 except that isoluminol (Example 33) and ABEI (Example 34) were used instead of luminol of Example 32. It was measured and shown in Table 6. Comparative Example 16-: L 8
  • reaction solution was extracted with ethyl acetate, washed with saturated saline, and excess ethyl acetate was distilled off. After the residue was recrystallized from water Z methanol ZT HF, the crystals were dried to obtain 1.24 g (5.05 ramol) of 2-((4-cyclohexanol) -16-hydroxybenzoxoxazole. Was. The reaction yield was 27. 2%.
  • the reaction solution was extracted with ethyl acetate, washed with a saturated saline solution, and the residue obtained by distilling off excess ethyl acetate was reconstituted with water ZHN ZT HF, and the crystals were dried. , 4-Dichroic phenyl) 1-6-hydroxybenzoxazole 915 nig (3.27 ⁇ ) was obtained.
  • the reaction yield was 26.3%.
  • Example 40 luminol in Example 39 was replaced with isoluminol (Example 40), ⁇ — (4-aminobutyl) monoethylisoluminol ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ )
  • the emission intensity was measured in the same manner as in Example 39 except that (Example 41) was used.
  • HR ⁇ horseradish peroxidase
  • Examples 43 and 44 are as follows. Instead of luminol of Example 42, isolminol (Example 43), ⁇ - (4-aminobutyl) monoethylisoluminol ( ⁇ ⁇ ⁇ ) ⁇ ⁇ ) The emission intensity was measured in the same manner as in Example 42 except that (Example 44) was used.
  • Example 46 the luminol of Example 45 was replaced with isoluminol (Example 46), ⁇ - (4-aminobutyl) monoethylisoluminol ( ⁇ ⁇ ⁇ ) (Example 4).
  • the emission intensity was measured in the same manner as in Example 45 except that 7) was used, and the results are shown in Table 7.
  • the emission intensity was measured in the same manner as in Example 48 except that (Example 50) was used.
  • CA 15-3 antigen solution (615 UZini) was diluted with phosphate buffer (PBS) containing 0.25% serum albumin, and SOO UZm 200 U / mK 100 U / mK 50 U / ml, 25 U / mKO UZml (PBS containing 0.25% serum albumin) were prepared, and each was used as a standard CA 15-3 solution.
  • PBS phosphate buffer
  • the mixture was reacted at 25 ° C for 2 hours. After the completion of the reaction, the beads were washed three times with 5 ml of physiological saline using a beadwasher. After washing, the beads in the tray were transferred to a test tube, and further to a plastic cubette for luminometer-one measurement.
  • Example 35 According to the procedure of Example 35, except that 2-ethoxycarbonyl 6-hydroxybenzoxoxasol was not used, the operation was carried out in exactly the same manner.
  • the emission intensity and SN ratio are shown in Table 8 and FIG. 20. .
  • the luminescence analysis method according to the present invention enables high-sensitivity rapid measurement of a substance.

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Description

明 細 書
高感度発光分析方法
技 術 分 野
本発明は、 臨床検査、 食品検査、 環境分析、 動植物検 查、 製造工程管理検査などの領域で、 酵素反応、 抗原抗 体反応、 核酸ハイブリ ッ ド反応などを利用して化学発光 測定による高感度分析を行なう方法に関する。
背 景 技 術
ペルォキシターゼによるルミ ノール、 イ ソルミ ノール またはそれらの誘導体 〔以下、 化学発光性 D P D (2, 3—ジヒ ドロー 1 , 4一フタラジンジオン） と略記〕 の 酸化を用いた発光反応は、 ィムノアツセィ、 エラスター ゼの分析、 グルコースの分析、 酸化剤の分析などに利用 されている。
上述の発光反応の発光強度を向上させるために、 次の ようなェンハンサーを反応系に添加すれば効果があるこ とが知られている。
① 6— ヒ ドロキンべンゾチアゾ一ル
(特開昭 5 9 - 5002 52号公報）
② ある種の置換基を有するフ ヱノール
(特開昭 5 9— 1 7 1 § 3 9号公報）
③ ある種の芳香族ァミ ン
(特開昭 6 1 — 544 53号公報） '
しかしながら、 上記の各ェンハンサ一には次のような 問題がある。 ①は多く の場合、 発光量が少なく、 シグナル対バック グラゥン ド比が小さい。
②の代表的ェンハンサ一は p—ョ一 ドフヱノールであ り、 その発光シグナルは高いが、 バックグラウン ドも高 く、 シグナル対バックグラウン ド比は低い。
③の代表的ェンハンサー N, N, Ν' , Ν' ーテトラ メチルべンジジンの場合は、 発光ピークの立 上がりが 遲く 、 測定に時間がかかる。
また、 ェンハンサー効果の反応機構に関しては、 ノレミ ノールセミキノ ンラジカルの効率的生成の必要性
[Thorpe, G. H. G and ricka.L. J . ： "Bioluminescence and Chemi luminescence ： New perspectives" , Scholme rich, J., Andreesn.R.. Kapp. A.. Ernst, M. and Woods, V.G. (Eds) . John Wiley, Chichester, pp.199-208. (19 87) 〕 、 およびフヱノキシラジカルの効率的生成の必要 性 Hodgson.M. and Jones. P : Journal of Biol uminesc ence and Chenii luminescence Vol .3. pp.21-25. (1989)〕 が提唱されている。
しかしながら、 フエノール誘導体の中にもェンハンサ 一効果を示さない化合物が多数あり、 上記の理論だけか ら有効なェンハンサーを選別することは困難である。
また、 病原性微生物中の遺伝子の検出、 プロスダグラ ンジンなどの生理活性物質の定量、 黄体化ホルモン （L H) などの脳下垂体前葉から放出されるホルモン、 イ ン ターロイキンなどの血中のサイ トカイ ンなどは、 いずれ も体液中の僅かな量を測定する必要があり、 高感度検出 系が求められ、 検出感度向上のためにさらに効率の高い ェンハンサ一が望まれていた。
本発明は、 新規ェンハンサ一の存在下に行なう ことを 特徵とする高感度発光分析を行なう ことを目的とする。 また、 本発明により従来公知のェンハンサ一より高効率 のェンハンサーを用いた発光分析を可能と し、 さらにェ ンハンサ一と して有効な新規ォキサゾール誘導体をも提 供することを目的とする。
発 明 の 開 示
本発明は、 （a) ペルォキシダーゼまたはペルォキシダ ーゼ誘導体、 （b〉 酸化剤および （c)ルミ ノール、 ィ ソル ミ ノールまたはそれらの誘導体の反応により生ずる化学 発光を利用して、 物質を検出または測定する方法におい て、 誘発光反応を 2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ン、
Figure imgf000005_0001
および一般式
Figure imgf000005_0002
〔式中、 R i は水素、 C n H 2 n+ 1 (こ で、 n は 1〜 4の正の整数を表わす） 、 X C n H 2 n ( こで、 Xは F C 1 、 B r または I を表わし、 nは前記定義に同じ） 、 C n H2n+1C 0 £ ( n は前記定義に同じ） 、 フヱニル 基、 ナフチル基、 Cn H2n+1C6 H4 (nは前記定義に 同じ） 、 Y C 6 H （ Yは F、 C 1、 B r、 I またはフ ェニル基を表わす） 、 XY C6 H3 (X、 Yは前記定義 に同じ） を表わす〕
で示される新規なォキサゾール誘導体からなる群から選 ばれる少なく とも 1つの化合物の存在下に行なうことを 特徵とする高感度発光分析方法に関するものである。
図面の簡単な説明
第 1図および第 2図は本発明のェンハンサーである 2 ーヒ ドロキシー 9一フノレオレノ ンと公知のェンハンサー を用いて、 C A 1 5— 3の分析を行なった結果を比較し たものであり、 第 1図は 5秒後の発光強度の S N比を、 第 2図は 1 0秒後の発光強度め S N比を各々示す。
第 3図は本発明のェンハンサーを発光系に添加した場 合としなかった場合で、 C A 1 5— 3の分析を行ない、 結果を比較したものである。
第 4図は実施例 1 9で得られた 2—クロロメチルー 6 ーヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺク トルであ り、 第 5図はその NMRスぺク トルである。
第 6図は実施例 20で得られた 2—ェトキシカルボ二 ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサプールの I Rスぺク ト ルであり、 第 7図はその NMRスぺク トルである。
第 8図は実施例 2 1で得られた 2— （3—ブロモフエ ニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺ ク トルであり、 第 9図はその NMRスぺク トルである。 第 1 0図は実施例 22で得られた 2— （ 2—メチルフ ェニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 1図はその NMRスぺク トルであ る。
第 1 2図は実施冽 3 5で得られた 2— （3—クロロフ ェニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 3図はその N MRスぺク トルであ る。
第 14図は実施例 36で得られた 2— （4ークロロフ ェニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rス ぺク トルであり、 第 1 5図はその NMRスぺク トルであ る o
第 1 6図は実施例 37で得られた 2— （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの I Rスぺク トル であり、 第 1 7図はその NMRスぺク トルである。
第 18図は実施例 38で得られた 2— （ 2, 4—ジク ロ ロ フ エ二ノレ） 一 6— ヒ ドロキ シベ ンゾォキサゾ一ノレの I Rスぺク トルであり、 第 1 9図はその NMRスぺク ト ルで,ある。
第 20図は実施例 5 1および比較例 22で得られた S N値を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明のェンハンサーである 2— ヒ ドロキシー 9ーフ ノレオレノ ン、
Figure imgf000008_0001
[ 4ーヒ ドロキシ一 3— 〔3— （4ーヒ ドロキシフヱ ニル） 一 1 一ォキソ一 2—プロぺニル〕 一 2 Η—
1 一べンゾピラン一 2—オン （以下、 Η Η Β Ρと略 す） ]
または、 [ I ] 式に示すォキサゾール誘導体による化学 発光増強効果は、 ペルォキシダーゼ 酸化剤ノ化学発光 性 D P D系で得られる発光シグナル対バックグラゥ ン ド 比が、 本発明のェンハンサーをその系に添加することに より著しく向上することで確認できる。 ここで用いたバ ックグラウン ドなる用語は、 ペルォキシダーゼまたはそ の誘導体が存在しない場合の発光強度をいう。
本発明で用いるペルォキシターゼは特に限定されるも のではない力《、 好ま しく は西洋わさびペルォキシターゼ などの植物ペルォキシタ一ゼである。 ペルォキシターゼ 誘導体と しては、 例えばペルォキシターゼ抗体コンジゲ ー ト、 ペルォキシターゼ抗原コンジュゲー ト、 ペルォキ シターゼス ト レプトアビジンコンジュゲー トおよびピオ チン結合ペルォキシターゼを挙げることができる。 ここ で用いる抗体は特に制限はないが、 例えばィ ンタク ト I g G、 I g Mのほ力、にも F a b ' 、 F ( a b ) n などの 部分構造も好ま しく使用できる。 また、 抗原と しては特 に制限はなく 、 例えばフルォレ ツセン、 ステロイ ドホル モンのような低分子量ハプテンもポ リペプチ ド、 タ ンパ ク質、 多糖類のような高分子量物質も使用できる。
核酸ハイプリ ッ ド反応の場合には、 塩基数 1 0以上の D N Aおよび R N Aで直鎖でも環状でもよい。
酸化剤と しては、 好ま しく は過酸化水素が用いられる が、 過ホウ酸塩、 次亜塩素酸塩も使用できる。
本発明の実施に使用される化学発光性 D P Dは、 ルミ ノール、 イ ソルミ ノール、 N— （4一ア ミ ノ ブチル） 一 N—ェチルイ ソルミ ノ ールない し、 これらと結合した抗 原、 抗体、 核酸などであるが、 特にルミ ノールが好ま し い o
本発明でェンハンサ一と して用いる H H B Pは、 例え ば特開昭 5 0 — 4 6 6 6 6号に記載のとおり、 3—ァセ チルー 4 ー ヒ ドロキシクマ リ ンとハ。ラ ヒ ドロキシベンゾ アルデヒ ドを、 ア ミ ンの存在下に縮合させることにより 製造するこ とができる。
一般式
〔式中、 η は 1
Figure imgf000009_0001
〜
4の正の整数を表わす） 、 X C n H2n (こ こで、 Xは F C l 、 B r または Iを表わし、 nは前記定義に同じ） 、 C n H 2n+1C 09 ( nは前記定義に同じ） 、 C n H 2n+1 C 6 H4 ( nは前記定義に同じ） 、 フヱニル基、 ナフチ ル基、 Y C6 H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエ 二ル基を表わす） 、 XY C 6 H3 (X、 Yは前記定義に 同じ） を表わす〕
で示されるォキサゾール誘導体の存在下に行なうことを 特徵とする高感度発光分析方法に関するものであり、 本 発明化合物 [ I ] の！ ェ は、 具体的には、 水素、 炭素数 1〜4のアルキル基と して、 メ チル基、 ェチル基、 プロ ピル基 （n—、 i s o—） 、 ブチル基 （n—、 i s o—、 s e c—、 t e r t —） 、 フヱニル基などが挙げられる。 ハロゲン化アルキル基と しては、 フルォロメ チル基、 ク ロロメチル基、 ブロモメ チル基、 ョー ドメ チル基、 1 一フルォロェチル基、 2—フルォロェチル基、 1一ク ロ 口ェチル基、 2—ク ロ口ェチル基、 1一ブロモェチル基、 2—ブロモェチル基、 1ーョー ドエチル基、 2—ョー ド ェチル基、 1一フルォロプロ ピル基、 2—フルォロプロ ピル基、 3—フルォロプロ ピル基、 1一フルオロー 1一 メ チルェチル基、 2—フルオロー 1—メチルェチル基、 1一ク ロ口プロ ピノレ基、 2—ク ロ口プロ ピル基、 3—ク ロロプロ ピル基、 1一ク ロロー 1一メ チルェチル基、 2 一ク ロロー 1一メ チルェチル基、 1—ブロモプロ ピル基、
2—ブロモプロ ピル基、 3—ブロ乇プロ ピル基、 1—ブ 口モー 1一メ チルェチル基、 2—ブロモー 1ーメ チルェ チル基、 1一ョー ドプロ ピル基、 2—ョー ドプロ ピル基、
3—ョー ドプロ ピル基、 1ーョ一 ドー 1一メ チルェチル 基、 2—ョ一 ドー 1一メチルェチル基、 1一フルォロブ チル基、 2—フルォロブチル基、 3—フルォロブチル基、 4一フルォロブチル基、 1一フルオロー 1 一メチルプロ ビル基、 2—フルオロー 1一メチルプロ ピル基、 3—フ ルオロー 1 一メチルプロピル基、 1 一フルォロメチルプ 口ビル基、 1 一フルオロー 2—メチルプロ ピル基、 2— フルオロー 2—メチルプロピル基、 3—フルオロー 2— メチルプロピル基、 1一フルォロメチルー 1 , 1 ージメ チルメチル基、 1 一クロロブチル基、 2—ク ロロブチル -、 基、 3—クロロブチル基、 4—クロロブチル基、 1 ーク ロロ一 1一メチルプロピル基、 2—ク ロロー 1 一メチル プロビル基、 3—クロロー 1一メチルプロ ビル基、 1一 クロロメチノレプロピル基、 1一クロロー. 2—メチルプロ ビル基、 2—クロロー 2—メチルプロ ビル基、 3—クロ 口— 2—メチルプロビル基、 1 一クロロメチルー 1 , 1 ージメチルメチル基、 1一ブロモブチル基、 2—ブロモ ブチル基、 3—プロモブチル基、 4一ブロモブチル基、 1 ーブロモー 1 一メチルプロピル基、 2—プロモー 1一 メチルプロピル基、 3—ブロモー 1一メチルプロ ピル基、 1一ブロモメチルプロピル基、 1 ーブロモー 2—メチル プロビル基、 2—プロモー 2—メチルプロ ピル基、 3— ブロモー 2—メチルプロピル基、 1 ーブロモメチルー 1 , 1一ジメチノレメチル基、 1 一ョー ドブチル基、 2—ョー ドブチル基、 3—ョー ドブチル基、 4一ョー ドブチル基、 1 ーョー ドー 1 一メチルプロ ビル基、 2—ョ一 ドー 1 — メチルプロ ピル基、 3—ョー ドー 1 一メチルプロ ピル基、 1ーョー ドメ チルプロ ピル基、 1 ーョー ドー 2—メ チノレ プロ ピル基、 2 —ョー ドー 2 —メ チルプロ ピル基、 3— ョ一 ドー 2 —メ チルプロ ピル基、 1 ー ョー ドメ チルー 1 , 1 ージメ チルメ チル基などが挙げられる。
アルコキシカルボニル基と しては、 メ トキシカルボ二 ル基、 エ トキシカルボニル基、 プロポキシカルボニル基、 1 ーメ チルェ トキシカネボニル基、 ブ トキシカルポニル 基、 1 一メ チルプロポキシカルボニル基、. 2 —メ チルプ 口ポキシカノレポ'ニル基、 1 , 1 ージメ チノレエ トキシカノレ ボニル基などを挙げることができる。
アルキル置換フヱニル基と しては、 2 —メ チルフエ二 ノレ基、 3 —メ チノレフエ二ノレ基、 4ーメ チノレフェニル基、 2—ェチノレフェニル基、 3—ェチノレフェニル基、 4ーェ チルフエニル基、 2 —プロ ピルフヱニル基、 3—プロ ピ ルフ ヱニル基、 4 一プロ ピルフ エニル基、 2 - ( 1 一 メ チルェチル） 基、 3— （ 1 ーメ チルェチル） 基、 4 一 ( 1 ーメ チルェチル） 基、 2 —ブチルフエニル基、 3— ブチルフ エニル基、 4 一ブチルフ エニル基、 2 - ( 1 - メ チルプロ ピル） フ エニル基、 3— （ 1 一メ チルプロ ピ ル） フヱニル基、 4一 （ 1 一メ チルプロ ピル） フエニル 基、 2— （ 2 —メチルプロ ピル） フ エニル基、 3— （ 2 一メチルプロ ピル） フエニル基、 4一 （2 —メ チルプロ ピル） フエニル基、 2— （ 1 , 1 ー ジメ チルェチル） フ ェニル基、 3— （ 1 , 1 ージメ チルェチル） フ エニル基、 4 一 （ 1 , 1 ージメ チルェチル） フエニル基などを挙げ ることができる。
ハロゲン置換フエニル基と しては、 2—フルオロフェ ニル基、 3 —フルオロフェニル基、 4一フルオロフェニ ル基、 2—ク ロ口フエ二ル基、 3—ク ロ口フエ二ル基、 4一ク ロ口フエ二ノレ基、 2—ブロモフエニゾレ基、 3—ブ ロモフエニル基、 4一ブロモフエニル基、 2—ョー ドフ ェニル基、 3—ョー ドフエニル基、 4—ョー ドフエニル 基などを挙げることができる。
二置換フエニル基と しては、 2 , 4 —ジクロ口フエ二 ル基、 3 , 5—ジクロロフェニル基などを挙げることが できる。
この中でも好ま しい置換基は、 水素、 メチル基、 フニ ニル基、 クロロメチル基、 エ トキシカルボニル基、 2 — メチルフヱニル基、 3—ブロモフエニル基、 4 一クロ口 フヱニル基、 2 , 4—ジク ロロフェニル基である。
なお、 上記一般式 [ 1〕 の化合物のうち、
一般式
Figure imgf000013_0001
〔式中、 R 2 は X C H 2n (こ こで、 Xは F、 C 1 、
B rまたは Iを表わし n .〜4の正の整数を表わす） n -2n+lC °2 (nは前記定義に同じ） 、 Cn H 2η, ,
C EA ( nは前記定義に同じ） 、 ナフチル基、 Y Cハ (Yは F、 C l 、 B r、 I またはフエ二ル基を表わ す） 、 XYC6 H3 (X、 Yは前記定義に同じ） を表わ す〕
で示されるォキサゾール誘導体は新規物質である。
本発明の化合物 [ I ] は、 下記の反応式 （ 1 ) により 合成できる。
すなわち、
RLC (OR3)3
Figure imgf000014_0001
[i] [i]
〔式中、 は水素、 Cn H2n+: で、 nは 1〜
4の正の整数を表わす） 、 X Cn H2n こで、 Xは F、 C 1、 B rまたは Iを表わし、 nは前記定義に同じ） 、 Cn H2n+1C 02 ( n は前記定義に同 じ：） 、 フヱニル 基、 ナフチル基、 Cn H2n+1C6 H4 (nは前記定義に 同じ） 、 Y C6 H4 (Yは F、 C l 、 B r、 I またはフ ヱ二ル基を表わす） 、 XY C6 H3 (X、 Yは前記定義 に同じ） を表わし、 R3 は Cn H2n+1 (nは前記定義に 同じ） を表わし、 -Zは F、 C 1、 B rまたは Iを表わす〕 である。
こ こで、 化合物 [m] で用いられる は、 具体的に は化合物 [ I ] で用いられる と同じものである。
また、 R3 のアルキル基と しては、 メチル基、 ェチル 基、 プロ ピル基、 1一メ チルェチル基、 ブチル基、 "1 - メチルプロ ピル基、 2—メチルプロ ピル基、 1 , 1 —ジ メチルェチル基などを挙げることができる。
本発明で使用する塩基は、 炭酸水素ナ ト リ ゥム、 炭酸 水素カ リ ウム、 炭酸ナ ト リ ウム、 炭酸力 リ ゥムなどの炭 酸塩、 ト リ メチルァ ミ ン、 ト リェチルァ ミ ン、 t 一プチ ルァミ ンなどのア ミ ン類、 ピリ ジン、 キノ リ ンなどの芳 香族複素環化合物などであるが、 特に炭酸水素ナ ト リ ゥ ムが好ま しい。
反応は溶媒を必要とせず、 20〜 1 5 0てで進行する が、 目的物の収率を上げるためには 5 0〜 1 2 0てが好 ま しい。
また、 ォキサゾール化合物 [ I ] のうち、 R , が X (：[1 11211 ( は？、 C l 、 B r または I を表わし、 n は 1〜 4の正の整数を表わす） の場合は、 下記の反応 式 （ 2 ) によっても、 また が Y C 6 H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエ二ル基を表わす） の場合は、 下記の反応式 （3) によっても製造できる。
NH^Z" 、
Figure imgf000015_0001
ίΝΤ ']
〔式中、 R3 は C n H2n+1 (nは 1〜4の正の整数を 表わす） を表わし、 Xおよび Zは F、 C 1 、 B r または Iを表わす〕
この化合物 [IV] で用いられるハロゲン化アルキル基 は、 具体的には化合物 [ I ] で用いられるハロゲン化ァ ルキル基と同じものが用いられる。 また、 化合物 [IV] で用いられる R3 は、 具体的には化合物 [m] で用いら れる R3 と同じものが用いられる。
本発明で使用する反応溶媒は、 メ タノール、 エタノー ル、 プロノ、。ノール、 ブタノールなどのアルコール類、 ェ チルエーテル、 T H Fなどのエーテル類、 DMF、 DM S 0などの非プロ トン性極性溶媒などであるが、 特にェ 夕ノールが好ま しい。
反応は、 20〜 1 50でで進行するが、 目的物の収率 を上げるためには 60〜90°Cが好ま しい。
Figure imgf000016_0001
溶 媒
[!"]
〔式中、 Yは F、 C l、 B r、 I またはフ エ二ル基を 表わし、 Zは F、 C l、 B rまたは Iを表わす〕
化合物 [V] で用いられる置換フニニル基は、 具体的 には化合物 [ I ] で用いられるハロゲン化フヱニル基、 フエニルフェニル基が用いられる。
第 1段の反応は、 溶媒を必要とせず 1 0 0〜 2 8 0 °C で進行するが、 化合物 [ VI ] の収率を上げるためには 1 5 0〜 2 5 0。Cが好ま しい。
化合物 [ VI ] の加水分解反応に使用する塩基は、 水酸 化ナ ト リ ウム、 水酸化力 リ ウム、 炭酸ナ ト リ ウムなどで あるが、 水酸化ナ ト リ ゥムが特に好ま しい。 溶媒と して は、 水、 メ タノール、 エタノールなどのアルコール類、 T H Fなどのエーテル類が使用できるが、 水ノメ タノー ルの混合溶媒が特に好ま しい。
加水分解反応は 2 0〜 5 0てで進行するが、 目的物の 収率を上げるためには 2 5〜 3 5でが好ま しい。
本発明のェンハンサ一は、 ペルォキシ夕ーゼ、 化学発 光性 D P D、 酸化剤からなる発光反応系を利用した物質 の測定法に用いることができる力く、 特にェンザィムィム ノアッセィ、 D N Aハイブリ ツ ド反応による測定に好ま しく用いられる。
以下、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 実施例中の試薬および装置は次に示すものを用いた。 試 薬
4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸およびクロロアセ トニ ト リルはアル ドリ ツチ社 （A l dri ch Co . )力、ら、 エタノー ル、 D M S 0、 シユウ酸ジェチル、 3—ブロ ムべンゾィ ノレクロライ ド、 2—メチルベンゾイルク 口ライ ド、 4一 ク ロ口べンゾィノレク ロライ ド、 2 , 4—ジク ロ口べンゾ イルク 口ライ ド、 ノレミ ノール （5—ア ミ ノ ー 2, 3—ジ ヒ ドロー 1 , 4一フタラジンジオン） 、 およびイ ソルミ ノール （6—ア ミ ノ ー 2, 3—ジヒ ドロー 1 , 4一フタ ラジンジオン） は東京化成㈱から、 五塩化リ ンおよび炭 酸水素ナト リゥムは関東化学㈱から、 塩化水素ボンべは 鹤見曹達㈱から、 N— （4一アミノブチル） 一 N—ェチ ルイ ソルミ ノール （ A B E I ) およびト リ ス 〔ヒ ドロキ シメ チル〕 ァ ミ ノ メ タ ンはシグマ社 （Sigma Chemical Co.)から、 西洋わさびペルォキシターゼ （H R P) はべ 一リ ンガーマンノヽィム社 (Boehringer Mannheim Gnibh) から、 粉末 P B Sは日水製薬㈱から、 ゥシ血清アルブミ ン （B S A) は生化学工業㈱から、 2—ヒ ドロキシー 9 一フルォ レノ ンはァノレ ド リ ツ チケ ミ カル社 （Aldrich Chemical Co.) から、 それぞれ購入した。
HH B Pは特開昭 50— 46666号公報に記載され た方法により調整した。
乳癌関連抗原 （ C A 1 5 — 3 ) 、 抗 C A 1 5— 3 抗体 （マウ スモノ ク ロ ーナル抗体） はセ ン ト コア社 (Malvern. USA) から入手した。 西洋わさびペルォキシ タ一ゼ標識抗 C A 1 5— 3抗体はマ レイ ミ ドヒ ンジ法
[Yoshitake.S. et al ： J.Biochem. , 92, 1413-1424 (1982) 〕 により作成し、 ヒ ドロキシァハ。タイ トガラム (三井東圧、 H C A—力ラム、 07. 6議 X L l O Omni) を用いたフアルマシア社 F P L Cで分離精製した。 抗 C A 1 5— 3抗体固定化ポリスチレンビーズは、 直 径 6議のポリスチレンビーズ （明和フッ素商会、 面粗度 # 80) を l O yW g Zmlの抗 C A 1 5— 3抗体、 P B S 溶液中に一晩浸して作成した。
分折装置
化学発光反応は、 1 2顏 ø X 4 7 mmの 3 ml容の使い捨 てプラスチッ クチューブで行なった。 発生した光は、 Berthold社製、 ルミ ノメーター （Biolumat LB9500T) で 検出した。
赤外吸収スペク トル （以下、 I Rと略記） は、 日本分 光工業㈱製、 F TZ I R - 5000で測定した。
核磁気共鳴スぺク トル （以下、 NMRと略記） は、 日 本電子㈱製、 E X 9 0 F T NMRで測定した。
質量スぺク トル （以下、 M Sと略記） は、 直接導入法 により行ない、 日本電子㈱製、 J M S D 3 0 0質量分 析計で測定した。 また、 高分解能 M Sは、 J M S D X - 303質量分析計を用いて測定した。
実 施 例 1
ルミ ノールと 2— ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ンとを使 用するペルォキシダーゼの発光アツセィ
200〃i? のルミ ノール （ l O O mM DM S O溶液 l O ^i X l O ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と の 2— ヒ ドロキシ一 9 一フルォ レノ ン （ l O O mM D M S O溶液 1 0 〃 J? ノ 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と の H R P 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 gr Zj? の B S Aを含有す る P B S緩衝液 （p H 7. 4 ) で 1 0万倍に希釈〕 と 1 0 の過酸化水素 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に 希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボル テックスミキサーで撹拌した後、 1 0秒後の発光強度を 測定した。 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 4 ) 1 0 ίί とルミ ノール、 2 —ヒ ドロキシー 9一 フルォレノ ン、 過酸化水素を上記の量混合撹拌し、 1 0 秒後の発光強度を測定した。 前者と後者の比をシグナル Ζバックグラウン ド比 （ S Ν比） と して表 1に示す。 実 施 例 2
実施例 1の手順を反復し、 ノレ ミ ノ ールの代わりにイ ソ ルミノールを使用した。 結果は表 1に示す。
実施 例 3 - 実施例 1の手順を反復し、 ルミ ノールの代わりに Ν— (4 —ア ミ ノブチル） — Ν—ェチルイ ソルミ ノールを使 用した。 結果は表 1に示す。
比較例 1〜 3
実施例 1、 実施例 2、 実施例 3の手順に従い、 2 -ヒ ドロキシー 9 一フルォレノ ンを使用しなかった以外は全 く同様に操作した。 結果は表 1に示す。 t t |_4
CD CJ1 CJ1 表 1 2, 3—ジヒ ドロー 1, 4一フタラジンジオン （DPD) による
シグナル対バックグラウン ド比 （SN比）
10秒後の発光強度 （相対値）
D P D S N 比
+ HR P -HR P 宾施冽 1 ル ミ ノ ー ノレ 449863 103 4368
" 2 イ ソ ノレ ミ ノ ー ル 9885 99 99. 8
N- (4一ア ミ ノブチル） 一 N—
" 3 17370 96 180. 9 ェチノレイソノレミ ノーノレ 比蛟例 1 ル ミ ノ ー ル 149 133 1. 12
" 2 イ ソ ノレ ミ ノ ー ル 167 1 54 1. 08
N- (4ーァミ ノプチル） 一 N—
" 3 1 57 137 1. 1 5 ェチルイソルミ ノール
実 施 例 4
2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ンおよび各種ェンハン サ一を用いた C A 1 5— 3抗原の発光ァッセィ
C A 1 5 — 3抗原溶液 （ 6 1 5 UZml) をゥ シ血清 アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で希釈し、 3 0 0 U/mK 2 0 0 U/mK 1 0 0 U/m 5 0 U/ mK 25 U/mK 0 U Zml (ゥシ血清アルブミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各々を標準 C A 1 5— 3溶液とした。
各濃度の標準 C A 1 5 - 3溶液を ずつ 2サン プルを ト レイ （2 5穴） に分注した。 ペルォキシダーゼ 標識抗 C A 1 5— 3抗体 （マウス） を 3 0 0 ずつゥ エルに加えた。 各ゥエルに抗体不溶化ビーズを w紙で付 着液を吸い取った後、 ピンセッ トで 1個ずつ加えた。
ト レイカバーシールをし、 軽く たたいて混合した後、 2 5 °Cで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥッ シ ヤーを用い、 生理食塩水 5mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノ メータ 一測定用プラスチッ クキュべッ トに移動させた。
2 0 0 ί のルミ ノ ール （ l O O mM DM S O溶液 1 0 βίί / l O nil 0. 1 Μ— ト リ ス塩酸緩衝液 ρ Η 7. 5) と の 2 — ヒ ドロキシー 9 一フルォ レノ ン （ l O O mM D M S O溶液 Ι θ / l O ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 1 0 ;ζΰ の 過酸化水素 （ 9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍希釈） とを各 々のプラスチッ クキュベッ トに加え、 5秒後および 1 0 秒後の発光強度を測定した。 結果を表 2 — 1、 表 2 — 2 に示した o
標準 C A 1 5 - 3抗原溶液 （3 0 0 U Zml、 2 0 0 U Zml、 1 0 0 U/mK 5 0 U/m 2 5 U Zml) の 5秒 後および 1 0秒後の発光強度と 0 U Zmlの 5秒後および 1 0秒後の発光強度の比 （S N比） をそれぞれ求め、 第 1図、 第 2図に示した。
比較例 4〜 8
実施例 4の手順を反復し、 2 — ヒ ドロキシー 9 一フル ォレノ ンの代わりに、 P —ョー ドフエノール、 P — ヒ ド ロキシゲイ皮酸、 P —フエニルフエノール、 6— ヒ ドロ キシベンゾチアゾール、 N , N , N ' , Ν' —テ トラメ チルべンジジンを使用した。 発光強度を表 2 — 1および 表 2— 2に、 S Ν比を第 1図および第 2図にそれぞれ示 す。
t
CD CJ1 C3 cn
表 2— 1 各種ェンハンサーを添加した場合の 5秒後の発光強度 （相対値）
C A 15-3 (U/ml)
ェ ン ハ ン サ ー
U ou 1 1 nUn nn
U UU oUU mm 4 P—ョー ドフエノール 1686 10314 28463 67438 142810 238017
" 5 P—ヒ ドロキシケィ皮酸 1745 4661 7736 10314 17851 28246
" 6 P—フヱニルフエノール 590 7023 10525 21541 31672 49180
" 7 6—ヒ ドロキシベンゾチアゾール 912 3471 6843 9719 15868 22810
N, N, Ν' , Ν' ーテトラメチル
" 8 203 99 174 298 1785 3968
ベンジジン
¾施例 4 2—ヒ ドロキシ一 9一フルォレノ ン 472 13554 24492 41803 64033 116066
t t
3 表 2 - 2 各種ェンハンサーを添加した場合の 10秒後の発光強度 （相対値）
CA 15-3 (U/ml)
ェ ン ノヽ ン サ 一
0 25 50 100 200 300 比較例 4 P—ョードフエノール 1796 12664 38123 85089 153034 242580
" 5 P—ヒ ドロキンゲイ皮酸 1630 4670 7663 10363 15525 27940
t
CO
" 6 P—プヱニルフヱノール 675 7003 10487 21288 35650 52421
" 7 6—ヒ ドロキシベンゾチアゾール 811 3438 6819 9696 18092 22644
N, N, Ν' , N' —テトラメチル
" 8 423 84 354 290 3127 6900
ベンジジン 突施冽 4 2—ヒ ドロキン一 9一フルォレノン 643 13652 24248 40907 63885 116905
実施 例 5
ルミ ノールと HH B Pとを使 するペルォキシダーゼの 発光ァッセィ
2 0 0 ^5 のルミ ノール （ l O O mM DM S O溶液
0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 8. 5) と 20 0 J? の H H B P ( 1 0 0 mM DM S 0溶液 1 O /t i Z l OmlO O. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 £ の西洋わさびペルォキシダーゼ (H R P ) 〔 1 1 1
Figure imgf000026_0001
を 1 £ の83八を含 有する P B S緩衝液 （p H 7. 0) で 1 0万倍に希釈〕 と 1 0 の過酸化水素 （9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍 に希釈） とをプラスチックチューブに入れ、 3秒間ボル テックスミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測 定した。
次に、 HR Pを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) 1 0 & とルミ ノール、 ΗΗ Β Ρ過酸化水素を上記の量 混合撹拌し、 1分後の発光強度を測定した。 前者と後者 の比をシグナル Ζバックグラウンド比 （S N比） として 表 3に示した。
実施例 6、 7
実施例 6、 7として、 実施例 5のルミ ノールの代わり にイソルミノール （実施例 6) 、 または Α Β Ε I (実施 例 7) を用いる以外は実施例 5と同様にして発光強度を 測定し、 表 3に示した。 比較例 9〜 1 1
実施例 5〜 7の H H B Pを使用しなかった以外は全く 同様にして発光強度を測定し、 表 3に示した。
実施例 5〜 7および比較例 9〜 1 1から、 本発明が優 れた発光分析方法であることが明らかとなつた。
t 卜
CD JI 表: 3 2 , 3—ジヒ ドロ一 1 , 4一フタラジンジ才ン （D P D)
による シグナル対バックグラウ ン ド比 （S N比）
1分後の発光強度 （相対値）
D P D
+ H R P - H R P S N 比
5 ル ミ ノ ー ル 453039 88 5148
" 6 イ ソルミ ノ ール 7524 24 313. 5
t
" 7 A B E I 21073 31 679. 8 比蛟冽 ル ミ ノ ー ル 550 507 1. 08
〃 1 0 イ ソル ミ ノ ール 1 60 1 37 1. 1 7 1 1 A B E I 188 180 1. 04
実 施 例 8
6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの合成
4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 0 g- ( 1 2. 4 minol) 、 オルトギ酸メチル 8. 5 ml ( 5 1. 4 ιπιποΐ) 、 炭酸水素ナ ト リ ウム 1. 0 7 g ( 1 2. διπιποΐ) を冷却 用コンデンサーを付けたニッロフラスコに入れ、 ァルゴ ン雰囲気下 1 00てで一昼夜撹拌した。 反応終了後、 反 応液で冷却してへキサンを加え生成物を14過した。 結晶 を水洗して無機塩を除き、 再度14過した。
得られた結晶をァセ ト ンに溶解し、 活性炭を加え、 1. 5時間加熱還流した。 活性炭を除き、 アセ ト ンをェ バポレーターにて濃縮し、 得られた結晶でアセ ト ン一水 で再結晶した。 白色粉末 0. 28 g (2. 07ιπιπο1) を 得、 反応率は 1 6. 7 %であった。
m. ρ . ： 183. 5〜： L 85 · 2で
I R ( K B r、 cm 17 ) ：
3150、 1630、 1528、 1489、 1276、 1236、 1195、 1104、 1085、 816
NMR ( 5、 DM S 0 - ） ：
. 6.81 (dd, 1H) 、 7.03 ( d , 1H) 、 7.53 ( d , 1H) 、
8.46 ( s , 1H) 、 9.75 ( s , 1H)
M S (E I ) : 1 35 (M + ) 、 52、 3 1
高分解能 M S (E I ) ： C? H 5 02 N
計算値 1 3 5. 0344
実測値 1 3 5. 033 2 ルミ ノールと 6ーヒ ドロキシベンゾォキサゾールと使 ¾ するペルォキシターゼの発光ァッセィ
200 ^5 のルミ ノール溶液 （l O O mM DMS O 溶液 1 0 / 1 Oml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 200 £ の 6—ヒ ドロキシベンゾォキ サゾール溶液 （ l O O mM DM S 0溶液 1 0
1 0ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 10 ίϋ の西洋わさびペルォキシターゼ （HR Ρ) 溶液 〔1 1 1 1 unitZmgを 1 g /j? の B S Aを含有する P B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 £ の 過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 000倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 とルミ ノール、 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾ ール、 過酸化水素を上記量混合撹拌し、 1分後の発光強 度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζ.バックグ ラウン ド比 （S Ν比） として表 4に示した。
実施例 9、 1 0
実施例 9、 1 0として、 実施例 8の発光ァッセィにお いてルミ ノールの代わりにイソルミ ノール （実施例 9 ) 、 Ν - (4ーァ ミノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール (以下、 A B E I と略す） （実施例 1 0) を用いる以外 は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定し、 表 4に示 した。 実施例 1 1
実施例 8の 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの代わ りに 2 —メチルー 6 — ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを 用いる以外は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定し、 表 4に示した。
実施例 1 2、 1 3
実施例 1 2、 1 3と して、 実施例 1 1のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 1 2 ) 、 A B E I (実 施例 1 3 ) を用いる以外は、 実施例 1 1 と同様にして発 光強度を測定し、 表 4に示した。
実施例 1 4
実施例 8の 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールの代わ りに 2 —フエ二ルー 6 —ヒ ドロキシベンゾォキサゾール を用いる以外は、 実施例 8と同様にして発光強度を測定 し、 表 4に示した。
実施例 1 5、 1 6
実施例 1 5、 1 6と して、 実施例 1 4のルミ ノールの 代わりにイ ソルミ ノール （実施例 1 5 ) 、 A B E I (実 施例 1 6 ) を用いる以外は、 実施例 1 4と同様にして発 光強度を測定し、 表 5に示した。
比較例 1 2〜： L 4
比較例 1 2 〜 1 4 と して、 実施例 8〜 1 0の 6 — ヒ ド ロキシベンゾォキサゾールを使用しない以外は、 全く 同 様にして発光強度を測定し、 表 4に示した。 t t
CJ1 en CZ5 CJ1 表 4 ェンハンサ一と 2, 3—ジ ΐ:ドロ一 1 , 4一フタラジンジオン
の組合せによるシグナノレ対バックグラウンド比
CO
3
Figure imgf000032_0001
実施例 1 7
H H B Pを用いた C A 1 5 - 3抗原の発光ァッセィ
C A 1 5 — 3抗原溶液 （ 6 1 5 U Zml ) をゥ シ血清 アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で希釈し、 3 0 0 U /mK 2 0 0 U /mK 1 0 0 U /mK 5 0 U / ml、 2 5 U /mK 0 U /ml (ゥシ血清アルブミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各々を標準 C A 1 5 - 3溶液と した。
各濃度の標準 C A 1 5 — 3溶液 2 0 ΰ ずつ 2サンプ ルを ト レイ （ 2 5穴） に分注した。 ペル才キシダーゼ標 識抗 C A 1 5 — 3抗体 （マウス） を 3 0 0 ^ ί ずつゥェ ルに加えた。 各ゥエルに抗体不溶化ビーズを14紙で付着 液を吸い取った後、 ピンセッ トで各ゥヱルに 1個ずつ加 えた。
ト レイカバーシールを貼り、 軽く たたいて混合した後、 2 5 eCで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥ ッ シ ヤ ーを用い、 生理食塩水 5 mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノメータ 一測定用プラスチックチューブに移動させた。
のル ミ ノーノレ （ l O O m M D M S 0溶液
1 0 i £ / 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 2 0 0 j? の H H B P ( l O O m M D M S 0溶液 1 0 1 0 ml 0. 1 M— ト リ ス塩酸緩衝液 p H 7. 5 ) と 1 0 ζ ί の過酸化水素 （ 9. 1 M水溶液 を 1 0 0 0倍に希釈） とを各々のプラスチッ クチューブ に加え、 1 0秒後の発光強度を測定した。 2サンプルの 平均発光強度を表 5に示した。
標準 C A 15 - 3抗原溶液 （300 UZml、 200 U Zml、 100 U/m 50 U/mU 25 U/ml) の 10 秒後の平均発光強度と 0 UZmlの 10秒後の平均発光強 度の比 （S N比） を求め、 第 3図に示した。
実施例 18
2—メチルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを用い た C A 1 5 - 3抗原の発光ァッセィ
実施例 17の H H B Pの代わり に 2—メ チルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを使用した以外は、 実施例
17と同様に操作し発光強度を測定し、 平均発光強度を 表 5に、 S N比を第 3図に示した。
比較例 1 5 - 実施例 17の手順に従い、 HH B Pおよび 2—メチル 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを使用しなかつた 以外は、 全く同様に測定を行なった。 平均発光強度を表 5に、 S N比を第 3図に示した。
t t
CD CJ
表 5 CA 15— 3の分析 10秒後の平均発光強度 （相対値）
CA 15-3 (U/ml)
ェ ン ノヽ ンサ一
0 25 50 100 200 300
実施例 17 H H B P 602 8031 17045 30454 65824 91745
2—メチルー 6—ヒドロ
実施例 18 401 3370 6929 17223 27926 46613
キンべンゾォキサゾール
比較冽 15 な し 154 148 165 165 152 182
実施例 1 9
2—ク口ロメチル一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール の合成
撹拌羽根を付けた 3 0 0 ml三ッロフラスコに、 クロ口 ァセ トニ ト リル 2 6. 1 g ( 34 5. 7 πιιποΐ) 、 無水ェ 夕ノール 2 0 ml、 エーテル 7 0 mlを入れ、 ゆっ く りと撹 拌しながら、 室温で約 4 0分間塩化水素ガスを吹き込ん だ。 生成した白色沈殿を14過し、 エーテルで洗浄した。
3 7. 5 g ( 2 3 7. 3 mol)のクロロメチルイ ミ ド酸ェ チル塩酸塩が得られ、 反応収率は 6 8. 7 %であった。
上述のクロロメチルイ ミ ド酸ェチル塩酸塩 1. 7 8 g ( 1 1. 3 Dnol) 、 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 2 2 g (7. 5 5ιπιηο1) 、 エタノール 2 O mlをジム ロー トコンデンサーを付けたニッロフラスコに入れ、 ァ ルゴン雰囲気下、 一昼夜加熱還流した。 反応終了後、 冷 却して結晶を14過し、 へキサンで洗浄した後、 目的物を 減圧乾燥した。 0. 4 0 gr ( 2. 3 3 ιππιο1) の 2—クロ ロメチルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールが得られ、 反応収率は 3 0. 9 %であった。
m. p . : 14 8. 5〜 1 5 3. 7。C
I R (第 4図、 K B r、 cm ） ：
3076、 1615、 1572s 1491、 1334、 1238、 1141、 837 NMR (第 5図、 D M S 0— d ） ：
4.97 ( s , 2Η) 、 6.84 (dd, 2Η) 、 7.08 ( d , 1H) . 7.55 ( d , 1H) 、 9.89 ( s , 1H) MS (E I ) : 1 83 (M + ) 、 148
高分解能 M S (E I ) ： C g H6 02 N C 1
計算値 1 83. 00 1 5
実測値 1 83. 00 5 1
実施例 20
2—エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾールの合成
撹拌羽根、 冷却用コンデンサーを付けた 50 0ml三ッ 口フラスコに、 6 1. 3 g (420 niinol) のシユウ酸ジ ェチルと 90. 2 g (433ιηιπο1) の五塩化リ ンを入れ、 1 05°Cで 1 7時間加熱撹拌した。
残った液体を 1 1 mmHgの減圧化、 蒸留し、 7 7〜85 。Cの留分 53. 2 g (26 5 nnnol) を集めた。 ジクロロ エ トキシ酢酸ェチルの生成収率は、 63. 0 %であった。
撹拌羽根、 冷却用コンデンサ一、 滴下 b— トを付けた 500 ml三ッロフラスコに、 無水エーテル 85 ml、 無水 エタノ ーノレ 3 5. 5 ml、 ジク ロ ロエ トキ シ酢酸ェチル 53. 2 g (26 5πιπιο1) をアルゴン雰囲気下入れ、 撹 拌しながら滴下ロー トから無水ピリ ジン 4 9. 5 mlを 1 時間で滴下した。
2時間室温で撹拌した後、 ビリ ジン塩酸塩を14過で除 き、 50 mlの無水エーテルで洗浄した。 14液からエーテ ルを留去し、 残った液体を 9 CTCで 1時間半撹拌した。 反応液を冷却し、 エーテルを加え、 3 N—硫酸、 炭酸 水素ナ ト リ ゥム水溶液で順次洗浄した。 エーテル層を 硫酸マグネ シウムで乾燥した後、 エーテルを留去し、 残液を 7 mmHgの減圧下、 蒸留した.。 83〜89 °Cの留分 40. 1 g ( 182πιπιο1) を集めた。 生成したト リエト キシ酢酸ェチルの収率は、 68. 7 %であった。
上述の ト リエトキシ酢酸ェチル 4 ml、 4ーァミ ノ レン ゾルシノ ール塩酸塩 1. 00 g (6. 1 9 O1) 、 炭酸 水素ナト リ ウム 5. 0 5 mgを冷却用コ ンデセンサーを付 けたニッロフラスコにアルゴン雰囲気下入れ、 1 0 CTC で一昼夜加熱撹拌した。
反応液を冷却して沈殿を生成させ、 14過した。 沈殿は アセ ト ンに溶解し、 活性炭を加え、 1. 5時間加熱還流 した。 活性炭を14過で除き、 14液はシリカゲルカラムを 通し、 濃縮した。 生成した結晶を減圧乾燥して、 2— ェ トキシカノレポ二ルー 6— ビ ドロキシベンゾォキシサ ゾール 1. 07 g (5. 1 7 niDiol) を得た。 反応収率は 83. 5 %であった。
m. p. : 1 9. 5〜200. 2。C
I R (第 6図、 K B r、 cm 17) ：
3278s 1736、 1630、 1539、 1489、 1261、 12"、 1145、 116、 849、
NMR (第 7図、 DMS 0— d。 ） ：
1.35 ( t , 3H) . 4.41 ( q , 2H) 、 6.97 (dd, 1Η·) 、 7.14 ( d , 1H) 、 7.72 ( d , III) 、 10.25(bs, iH)
MS (E I ) : 207 (M + ) 3 5 高分解能 M S (E I ) ： C 10H 9 04 N
計算値 20 7. 0 5 9 1
実測値 2 0 7. 0 5 6 1
実施例 2 1
2 - (3—ブロモフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッロフラ ス コ に、 3 —ブロ モ安息香酸ク ロラ イ ド 1 4. 1 ml ( 1 0 7 ιπιποΐ) と 4 一ア ミ ノ レゾルシノ ール塩酸塩 1. 7 g ( 1 0. 5 nimol) を入れ、 9 0〜 1 4 5でに 3 0分加熱した。 残渣に水酸化ナ ト リ ゥム水溶液とメ タノールを加え、 均一溶液と して 2時間室温で撹拌し た。 反応液を酢酸ェチルで 2回抽出し、 I N *塩酸、 飽 和食塩水の順で洗浄した。 過剰の酢酸ェチルを留去し、 得られた沈殿を T H F Z水で再結晶した。 0. 6 8 g ( 2. 3 5 Diinol) の 2— （3—プロモフヱニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールが得られ、 反応収率は 1 6. 6 %であった。
m. p . : 248. 0〜 24 8. 5 V
I R (第8図、 8 1"、 cm 17 ) ：
3190、 1630、 1549、 1475、 1325、 1234、 1143、 1062、 835、
NMR (第 9図、 DM S 0— d 6 ) ：
6.90 (dd, 1H) 、 7.12 ( d , 丄 H) 、 7.66 ( m , 2Η) 、 7.71 ( d , 1Η) 、 8.15 ( in , 2H) 、 9.94 ( s , 1H) MS (E I ) : 289 (M + ) 、 29 1 (M+ + 2) 、
2 1 0、 182.
高分解能 MS (E I ) ： C 13H 8 02 N B r
計算値 288. 9738
実測値 288. 97 1 1
実施例 22
2 — ( 2—メチルフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
温度計および冷却用 コ ンデンサーを付けた三ッ ロ フ ラ ス コ に、 2 —メ チル安息香酸ク ロライ ド 1 4 ml ( 1 07. 3πιπιο1) と 4 -ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 7 g (10. 5 ιππιοΐ) を入れ、 144〜 2 1 5でで 1時間加熱した。 過剰の酸ク ロライ ドを蒸留で除き、 系を 1〜 1. 5 mroHgの減圧にして 88〜 230での留分 6. 2 gを集めた。
上述の留分にェタールを加え再結晶し、 結晶 2. 32 g ( 6. 7 6 ιπιποΐ) を得た。 結晶 5 0 0 mg ( 1. 46 Diniol) に、 K 0 H 7 7 2 mg; ( 1 3. 6 nimol) 、 T H F
30 mK 水 5ml、 メ タノール 1 0 mlを加え、 室温で一昼 夜撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水 で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を真 空ポンプで乾燥し、 2— （2—メ チルフエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾール 320 mg ( 1. 4 2 πιιποΐ) を得た。 反応収率は 62. 7 %であった。
m. p. : 1 33. 5〜： L 37. 5 °C I R (第 1 0図、 K B r、 cm 17) ：
3064、 1613、 1489、 1224、 1151、 729
N M R (第 1 1図、 D M S O d β )) ：
2.73 ( s , 3H) 、 6.87 (dd, 1Η) 、 7.11 ( d 1H) 7.42 ( m , 3H) 、 7.64 ( d , 1H) 、 8.06 ( oi 1H) 9.86 ( s , 1H)
M S ( E I ) : 2 2 5 (M + ) 1 9 6、 1 6 8、
1 5 6 6 9 1、 7 9、 5 1 3 9
高分解能 M S ( E I )
C 14H11° 2 N
計算値 2 2 5 0 7 9 0
実測値 2 2 5 0 7 64
実施例 2 3
ルミ ノールと 2—エ トキシカルボ ノレ一 6— ヒ ドロキシ ベンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの発光 ッセっ
2 0 0 z ϋ のルミ ノール溶液 （ l O O m M D S O 溶液 1 0 〃 i Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝 液 p H 8. 5 ) と実施例 3で得られた 2 0 0 の 2 一エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S 0溶液 1 0 ノ 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 β & の西洋わさびペルォキシターゼ H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 1111111 1^を 1 g Zj? の B S Aを含有する P B S緩衝液 （ p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 i? の 過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した, 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 βί とノレミ ノール、 2—エ トキシカルボ二ルー 6— ヒ ドロキンべンゾォキサゾールを上記量混合撹拌し、 1 分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナ ル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） と して表 6に示した, 実施例 24、 2 5
実施例 24、 2 5と して、 実施例 2 3のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 24 ) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール （以下、 A B E I と略す） （実施例 2 5 ) を用いる以外は、 実施例 23と同様にして発光強度を測定し、 表 6に示した。
実施例 2 6
2— （3—ブロモフエニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾ一ルを用いたペルォナシ _ーゼの発光ァッセィ
実施例 2 3の 2—ェトキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施例 2 1で得られ た 2— （3—ブロモフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾールを用いる以外は、 実施例 2 3と同様にして 発光強度を測定し、 表 6に示した。
実施例 2 7. 28
実施例 2 7、 28と して、 実施例 2 6のルミ ノールの 代わり にイ ソルミ ノ ール （実施例 2 7 ) 、 A B E I (実 施例 28) を用いる以外は、 実施例 26と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。
実施例 2 9
実施例 23の 2—エトキン力ルボニル一 6— ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施^ 1 9で得られ た 2—ク口ロメチノレー 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾー ルを用いる以外は、 実施例 2 3と同様にして発光強度を 測定し、 表 6に示した。
実施^ 30、 3 1
実施例 30、 3 1と して、 実施例 29のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 30 ) 、 A B E I (実 施例 3 1 ) を用いる以外は、 実施例 29と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。
実施例 32
実施例 20の 2—エ トキン—カルボ二ルー 6— ヒ ドロキ シベンゾォキサゾールの代わりに、 実施例 22で得られ た 2— （2—メチルフエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾールを用いる以外は、 実施例, 23と同様にして 発光強度を測定し、 表 6に示した。
実施例 33. 34
実施例 33、 34と して、 実施例 3 2のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 33) 、 A B E I (実 施例 34 ) を用いる以外は、 実施例 32と同様にして発 光強度を測定し、 表 6に示した。 比較例 16〜： L 8
比較例 16〜 18として、 実施例 23〜 25の 2—ェ トキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール を使用しない以外は、 全く同様にして発光強度を測定し、 表 6に示した。
ISD t
n
en CD 表 6 ェンハンサ一と 2, 3—ジヒ ドロ一 1, 4—フタラジンジオン （DPD)
の組合せによるシグナル対バックグラウンド比 （S N比）
CO
Figure imgf000045_0001
* HRPを 10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
n 表 6 (続き）
Figure imgf000046_0001
* 111 ?を10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
実施例 35
2 - (3—クロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキンべンゾォ キサゾ一ルの
温度計および冷却用コ ンデ ンサーを付けた三 ッ 口 フ ラ ス コ に、 3 — ク ロ 口安息香酸ク ロラ イ ド 4. 5 ml (35. 2 iDfflOl) と 4一アミ ノ レゾルシノール塩酸塩 1. 0 g (6. 1 ηιιο1) を入れ、 1 7 0〜 23 5。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残澄に、 N a 0 H 1. 5 s ( 3 7. 5 mniol) 、 T H F 20 mU 水 20 ml、 メタノール 1 0 mlを加え、 室温で約 2時間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食 塩水で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣 を水 メ タノール ZTH Fで再結晶した後、 結晶を乾燥 し、 2— （3—ク ロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベン ゾォキサゾール 2 50 mg ( 1： 02 mmol) を得た。 反応 収率は 1 6. 5%であった。
m. p. : 246. 0〜 247. 5 °C
I R (第 1 2図、 K B r、 cm 17) ：
3146、 1630、 1599、 1551、 1477、 1328、 1232、 1145、 1062、 835
NMR (第 1 3図、 DM S O— d 6 ) ：
6.90 (dd, 1H) 、 7,12 ( d , 1H) 、 7.61 m , 3H) 、 8.06 "， 2H) 、 9.94 ( s , 1H)
M S (E I ) : 24 5 (M + ) 、 24 7 (M+ + 2) 、
1 38、 1 22、 80、 5 2 高分解能 M S ( E I ) ： C i3H 8 02 N C 1
計算値 24 5. 0 1 9 3
実測値 24 5. 0 2 1 8
実施例 3 6
2 — （4一クロ口フ エニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾールの合成
温度計および冷却用コ ンデンサーを付けた三ッ ロ フ ラ ス コ に、 4 — ク ロ 口安息香酸ク ロ ラ イ ド 2 5 g ( 1 4 2 , 8fflDiol) と 4一アミノ レゾルシノール塩酸塩 3. 0 g ( 1 8. 6 nifflol) を入れ、 1 7 0〜2 0 0。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残渣に、 N a O H 8. 4 g ( 2 1 O mnol) 、 T H F 6 0 ml、 水 6 0 ml、 メタノール 3 0 mlを加え、 室温で約 2時 間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水 で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を水 Zメ タノール ZT H Fで再結晶した後、 結晶を乾燥し、 2 — （ 4一ク ロ口フエ二ノレ） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォ キサゾール 1. 24 g ( 5. 0 5 ramol) を得た。 反応収 率は 2 7. 2 %であつた。
m. p . : 2 7 2. 8〜2 7 3. 5 °C
I R (第 1 4図、 K B r、 cm 17 ) ：
3138、 1632、 1618、 1485. 1236、 1143、 832
N MR (第 1 5図、 D M S O - d 6 ) ：
6.87 (dd， 1H) 、 7.11 ( d , 1H) 、 7.62 ( m , 3H) 、 8.13 ( d , 2H) 、 9.90 ( s， 1H) M S (E I ) : 24 5 (M + ) 、 24 7 (M + + 2) 、
1 38、 1 22
高分解能 M S (E I ) ： C13Hg 02 N C 1
計算値 24 5. 0 1 78
実測値 24 5. 02 1 1
実施例 37
2— （2—ナフチル） 一ら一ヒ ドロキシべンゾォキサゾ ールの合成
温度計および冷却用コ ンデンサーを付けた三ッ ロフ ラスコに、 2—ナフ トェ酸クロライ ド 2 0 g ( 1 04. 9議 1) と 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 5 g: ( 1 5. 5 iniol) を入れ、 1 3 5〜 2 0 5てで 1時間加 熱した後、 過剰の酸クロライ ドを蒸留で除いた。 残渣に、 N a 0 H 8. 3 s (207. 5πιιπο1) 、 T H F 6 0 mK 水 60ml、 メ タノール 30mlを加え、 室温で約 2時間撹 拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗 浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した。 残渣を水 Zメ タノール ZTH Fで再結晶した後、 結晶を乾燥し、 2—
( 2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾール 1. 2 rag ( 7. 36 oiniol) を得た。 反応収率は 4 7. 5 %であった。
m. p. ： 226. 0〜 226. 2 °C
I R (第 1 6図、 K B r、 cm 17) ：
3050s 1620、 1485、 1450、 1303、 1141、 1116、 816、 752 NMR (第 1 7図、 DM S O— d 6 ) ：
6.92 (dd, 1H) 、 7.17 ( d , 1H) 、 7.64 ( m , 3H) 、 8.08 ( in , 4H) 、 8.74 ( s , 1H) 、 9.92 ( s , 1H) MS (E I ) : 26 1 (M + ) 、 1 30
高分解能 MS (E I ) ： 17Hn02 N
計算値 26 1. 082 5
実測値 26 1. 0807
実施例 38
2— （2, 4—ジクロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシべ ンゾォキサゾールの合成
温度計および冷却用コンデンサーを付けた三ッロフラ スコに、 2, 4—ジクロ口安息香酸クロライ ド 9. 9 ml ( 7 0. 5 ππιοΐ) と 4一ア ミ ノ レゾルシノール塩酸塩 2. 0 g ( 1 2. 4ιπιηο1) を入れ、 1 7 2〜 247。Cで 1時間加熱した後、 過剰の酸ク ロライ ドを蒸留で除い た。 残渣に、 N a O H 6. 47 g- ( 1 6 1. διηιποΐ) 、 T H F 60 ml 水 60 ml、 メタノール 3 0 mlを加え、 室 温で約 2時間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 飽和食塩水で洗浄した後、 過剰の酢酸ェチルを留去した 残渣を水 Zメ 夕ノール ZT H Fで再結畢した後、 結晶を 乾燥し、 2— (2, 4—ジクロ口フエニル） 一 6—ヒ ド ロキシベンゾォキサゾ一ル 9 1 5 nig ( 3. 27 ιππιοϊ) を 得た。 反応収率は 26. 3 %であった。
m. p. 21 2. 5〜2 1 2. 8。C I R (第 1 8図、 K B r、 cm 17 ) ：
3150、 1638、 1611、 1564、 1489、 1464、 1325、 1232.
1094、 822、 808
N M R (第 1 9図、 D M S O— d 6 ) ：
6.92 (ddf IH) 、 7.11 ( d , 1H) 、 7.66 ( in , 2H) ,
7.85 (dd, 1H) 、 8.12 ( d , 1H) 、 9.97 ( s , 1H)
M S ( E I ) : 2 7 9 (M + ) 2 8 (M + + 2 )
2 8 3 (M + + 4 ) 、 1 7 2、 1 3 9 1 0 8、 8 0、 5 2
高分解能 M S ( E I ) ： C i3H7 ° 2 N C 1 2
計算値 2 7 8. 9 8 9 8
実測値 2 7 8. 9 8 7 6
実施例 3 9
ルミ ノールと 2— （3—クロ-口フエニル） 一 6— ヒ ドロ キシベンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの 発光ァッセィー
2 0 0 のルミ ノール溶液 （ l O O mM D M S O 溶液 1 0 ノ 1 O ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 P H 8. 5 ) と実施例 3 5で得られた 2 0 0 ]? の 2 一 （ 3 —ク ロ口フエニル） 一 6 — ヒ ドロキシベンゾォ キサゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S O溶液 1 0 j? Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 ί の西洋わさびペルォキシターゼ （H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 ：！ ^^ を丄 £：ノ£ の B S Aを含有する Ρ Β S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 z j? の 過酸化水素溶液 （ 9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュべッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した, 次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 μύ. とノレミ ノール、 2— （3—ク ロ口フエニル） 一 6 — ヒ ドロキンべンゾォキサゾールを上記量混合撹拌 し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） として表 7に 示した。
実施例 4 0. 4 1
実施例 4 0、 4 1 と して、 実施例 3 9のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 40) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミノール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 1 ) を用いる以外は、 実施例 3 9と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
実施例 42
ルミ ノールと 2— （4一ク ロ口フエニル） 一 6— ヒ ドロ キシベンゾォキサゾ ルと使用するペルォキシターゼの 発光ァッセィ
20 0 βίί のルミ ノ ール溶液 （ l O O mM DM S O 溶液1 0 ^£ 1 01111、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と実施例 3 6で得られた 2 0 0 ίί の 2— (4一 ク ロ 口フ エ二ノレ） 一 6 — ヒ ドロキシベンゾォキ サゾール溶液 （ l O O mM D M S O溶液 1 0 〃 £ 1 0ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と 1 0 μ& の西洋わさびペルォキシターゼ （ H R Ρ ) 溶液 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 g Zi? の B S Aを含有する P B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 の 過酸化水素溶液 （ 9. 1 Μ水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック スミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
次に、 H R Ρを含まない P B S緩衝液 （ρ Η 7. 0 ) 1 0 μ & とノレミ ノール、 2 — （4一ク ロ口フエニル） 一 6— ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合撹拌 し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル/バックグラウン ド比 （ S Ν比） と して表 7に 示した。
実施例 4 3、 44
実施例 4 3、 44と して、 実施例 4 2のルミ ノールの 代わり にイ ソルミ ノール （実施例 4 3 ) 、 Ν— （4 —ァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノ ール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 4 ) を用いる以外は、 実施例 4 2と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
実施例 4 5
ルミ ノールと 2 一 ( 2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシべ ンゾォキサゾールと使用するペルォキシターゼの発光ァ ッセィ
2 0 0 のルミ ノール溶液 （ l O O mM D M S O 溶液 1 0 〃^ // 1 01111、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 P H S . 5 ) と実施例 3 7で得られた 2 0 0 j? の 2 一 （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾ一 ル溶液 （ l O O mM D M S 0溶液 1 0 z i? Z 1 0 ml、 0. 1 M— ト リス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 の西洋わさびペルォキシターゼ （HR P ) 溶液 〔 1 1 1 1 unitZmgを 1 g の B S Αを含有する P B S緩衝液 (p H 7. 0) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 ^ i? の過酸化水 素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをブラ スチックキュべッ トに入れ、 3秒間ボルテックスミキサ 一で撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
次に、 HR Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0) 1 0 & とルミ ノール、 2— （2—ナフチル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合撹拌し、 1分 後の発光強度で測定した。 前者と後者の比を、 シグナル Ζバックグラウン ド比 （S Ν比） と して表 7に示した。 実施例 46、 4 7
実施例 4 6、 47として、 実施例 4 5のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 46 ) 、 Ν— （4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイソルミ ノール （Α Β Ε Ι ) (実施例 4 7 ) を用いる以外は、 実施例 4 5と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
実施例 48
ノレミノー と 2一 （2， 4ニジクロ口フエニル） 一 6— _t ド αキシベンゾォキサプールと使用するペルォキシタ ーゼの発光アツセィ
2 0 0 £ のルミ ノール溶液 （ 1 0 0 m M DM S O 溶液 1 0 ^ j? ノ 1 0 ml、 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と実施例 3 8で得られた 2 0 0 £ の 2 — ( 2 , 4—ジクロロフヱニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾ ォキサゾール溶液 （ l O O mM D M S 0溶液 1 0 β / \ 0 m 0. 1 M - ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5 ) と Ι Ο ^ ΰ の西洋わさびペルォキシターゼ （H R P ) 溶 液 〔 1 1 1 1111111 1^を 1 gr /J? の B S Aを含有する P
B S緩衝液 （p H 7. 0 ) で 1万倍に希釈〕 と 1 0 z j? の過酸化水素溶液 （9. 1 M水溶液を 1 0 0 0倍に希釈） とをプラスチックキュベッ トに入れ、 3秒間ボルテック ス ミキサーで撹拌した後、 1分後の発光強度を測定した。
次に、 H R Pを含まない P B S緩衝液 （p H 7. 0 )
1 0 β とノレミ ノール、 2 — （2 , 4—ジクロ口フ エ二 ル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサゾールを上記量混合 撹拌し、 1分後の発光強度で測定した。 前者と後者の比 を、 シグナル Ζバックグラゥン ド比 （ S Ν比） と して表
7に示した。
実施例 4 9、 5 0
実施例 4 9、 5 0と して、 実施例 4 8のルミ ノールの 代わりにイソルミ ノール （実施例 4 9 ) 、 Ν - (4ーァ ミ ノブチル） 一 Ν—ェチルイ ソルミ ノール （Α Β Ε Ι )
(実施例 5 0 ) を用いる以外は、 実施例 4 8と同様にし て発光強度を測定し、 表 7に示した。
比較例 1 9〜2 1
比較例 1 9〜 2 1 と して、 実施例 3 9〜 4 1 の 2 — ( 3—クロ口フ エニル） 一 6—ヒ ドロキシベンゾォキサ ゾールを使用しない以外は、 全ぐ同様にして発光強度を 測定し、 表 7に示した。
t t
J1 n 表 7 ェンハンサ一と 2, 3—ジヒ ドロ一 1, 4一フタラジンジオン （DPD)
の組合せによるシグナル対バックダラゥンド比 （S N比）
e e
Figure imgf000057_0001
木 111 ?を10倍希釈して得られた発光強度を 10倍した値
U H R Pを 20倍希釈して得られた発光強度を 20倍した値
C
CJ1 表 7 (続き）
0
Figure imgf000058_0001
U HRPを 20倍希釈して得られた発光強度を 20倍した値
実施例 51
2—ェ トキシカルボ二ルー 6 ドロキシベンゾォキサ ゾールを用いた C A 1 5— 3抗原の発光ァッセィ
C A 1 5— 3抗原溶液 （61 5 UZini) を 0. 25% ゥシ血清アルブミ ンを含むリ ン酸塩緩衝液 （P B S ) で 希釈し、 S O O UZm 200 U/mK 1 00 U/mK 50 U/ml, 25 U/mK O UZml (0. 25%ゥシ血 清アルブ ミ ンを含む P B S ) の濃度の溶液に調製し、 各 々を標準 C A 1 5 - 3溶液と した。
各濃度の標準 C A 1 5— 3溶液を 20 iii? ずつ、 ト レ (25穴） に分注した。 ペルォキシダ一ゼ標識抗 C A 1 5— 3抗体 （マウス） を 300 ί ずつゥエルに加え た。 各ゥェルに抗体不溶化ビーズを14紙で付着液を吸い 取った後、 ピンセ ン トで 1個ずつ加えた。
ト レイカバーシールを貼り、 軽く たたいて混合した後、 25 °Cで 2時間反応させた。 反応終了後、 ビーズゥォ ッ シヤーを用い、 生理食塩水 5mlで 3回洗浄した。 洗浄後、 ト レイ中のビーズを試験管に移し、 さ らにルミ ノ メータ 一測定用プラスチッ クキュべッ トに移動させた。
1 00 ί のノレ ミ ノ ーノレ N a塩溶液 （ 1 2. 6 mM、 ル ミ ノ ール N a塩/ 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5の溶液を同緩衝液で 18倍に希釈） と 1 00 /ζ£ の 2—ェ トキシカノレポ'ニノレー 6—ヒ ドロ千シベンゾォキ サゾール溶液 （ 1 0 0 m M D M S 0溶液： 1 0〃 i? Z 1 0 m 0. 1 M— ト リ ス塩酸塩緩衝液 p H 8. 5) と 1 0 0 の過酸化水素溶液 （16. 2 β Μ過酸化水素 Ζ 0. 01 Μリ ン酸水素 2ナト リ ウム · クェン酸緩衝液 ρ Η 5. 2を同緩衝液で 18倍に希釈） をプラスチック バイアルに加え、 37てで 10分間加温した後、 60秒 間発光を測定した。 50秒から 60秒の間の発光強度の 積算値の 1 /6の値を、 表 8に示した。
標準 C A 15 - 3抗原溶液 （300 X1,1111、 200 U Zml、 100 U/mK 50 U/mK 25 U/ml) の 50 秒から 60秒の間の発光強度の積算値の 1 Z 6の値と、 0 U mlの 50秒から 60秒の間の発光強度の積算値の 1 Z6の値の比 （S N比） を求め、 表 8、 第 20図に示 した。
比較例 22
実施例 35の手順に従い、 2—ェトキシカルボ二ルー 6—ヒ ドロキシベンゾォキサソールを使用しなかった以 外は全く同様に操作し、 発光強度および S N比を表 8、 第 20図に示した。
t
cn CD 表 8 CA15— 3の分析 50秒から 60秒の問の発光 の 積算値の · ~の値および SN比
D
CA15-3 (U/ml)
ェ ン ノヽ ン サ一
0 25 50 100 200 300 発光強度
2—ェ卜キシ^;ノレポ' 151 763 2729 18333 54503 94172
麵値）
実施例 51 ニル一 6—ヒドロキン
ベンゾォキサゾール S N 比 1 4.86 17.4 117 347 600 発光強度
250 329 397 968 1422 8625 (相対値）
比較例 22 な し
S N 比 1 1.32 1.59 3.87 5.69 34.5
産業上の利用可能性
以上のように本発明にかかる発光分析方法により、 物 質の高感度迅速測定が可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
. (a) ペルォキシダーゼまたはペルォキシダーゼ誘導 体、 （b) 酸化剤および （c)ルミ ノール、 イソルミ ノー ルまたはそれらの誘導体の反応により生ずる化学発光 を利用して、 物質を検出または測定する方法において, 誘発光反応を 2—ヒ ドロキシー 9一フルォレノ ン、
0H および
Figure imgf000063_0001
一般式
Figure imgf000063_0002
〔式中、 は水素、 Cn H2n+1 (こ こで、 nは 1〜 4の正の整数を表わす） 、 X C n H2n (こ こで、 Xは F C l、 B rまたは Iを表わし、 n = l〜4の正の整数を 表わす） 、 Cn H2n+1C 02 (nは前記定義に同じ） 、 フエニル基、 ナフチル基、 Cn H ofl+1C 6 H4 (nは前 記定義に同じ） 、 Y C P H^ (¥は？、 じ 1 、 8 1"、 I またはフエ二ル基を表わす） 、 X Y C 6 H 3 (X、 Yは 前記定義に同じ） を表わす〕
で示されるォキサゾール誘導体からなる群から選ばれる 少なく とも 1つの化合物の存在下に行なう ことを特徴と する高感度発光分析方法。
2. —般式 [ I ] に示される化合物の 1 ェ が水素、 メチ ノレ基、 クロロメチル基、 エ トキシカルボニル基、 フ エ ^ル基、 ブロモフエニル基、 メチルフエニル基、 クロ 口フエニル基、 ナフチル基またはジクロロフエニル基 である請求項 1記載の高感度発光分析方法。
3. — 般 式 な • R [Π]
HOへ、 " x
〔式中、 R0 は X Cn H2n (ここで、 Xは F、 C 1、 B r または Iを表わし、 n = 1〜 4の正の整数を表わ す） 、 Cn H2n+1C 02 (nは前記定義に同じ） 、 ナフ チル基、 Cn H n+1 C β Η4 (ηは前記定義に同じ） 、 Y C g H4 (Yは F、 C l、 B r、 I またはフエニル基 を表わす） 、 XY C6 H8 (X、 Yは前記定義に同じ） を表わす〕
で示される新規なォキサゾール誘導体。
4. 一般式 [H] に示される化合物の R2 がクロロメチ ノレ基、 エトキシカルボニル基、 ブロモフエニル基、 ク ロロフェニル基、 ナフチノレ基、 ジクロロフエ二ル基ま たはメチルフヱニル基である請求項 3記載の新規なォ キサゾール誘導体。
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