WO1998056765A1 - Derives chimioluminescents heterocycliques - Google Patents

Derives chimioluminescents heterocycliques Download PDF

Info

Publication number
WO1998056765A1
WO1998056765A1 PCT/BE1998/000087 BE9800087W WO9856765A1 WO 1998056765 A1 WO1998056765 A1 WO 1998056765A1 BE 9800087 W BE9800087 W BE 9800087W WO 9856765 A1 WO9856765 A1 WO 9856765A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituents
iminomethane
carboxylate
methylacridinium
chemiluminescent
Prior art date
Application number
PCT/BE1998/000087
Other languages
English (en)
Inventor
Gianangelo Ghitti
Michel Kohl
Robert Lejeune
Roger Renotte
Guy Sarlet
Original Assignee
Biocode S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocode S.A. filed Critical Biocode S.A.
Priority to EP98925343A priority Critical patent/EP0988288A1/fr
Publication of WO1998056765A1 publication Critical patent/WO1998056765A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
    • C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to chemiluminescent derivatives of acridinium as well as a conjugate comprising one of these derivatives, linked to a specific biological component.
  • Another aspect of the invention relates to the diagnostic and / or assay kit comprising this conjugate or one of these derivatives, and the use of the conjugate or of one of these chemiluminescent derivatives for the assay and / or detection of a specific biological compound.
  • Chemiluminescence is a formation of light obtained by a chemical reaction.
  • the general mechanism of this reaction has been described in particular by Schuster et al (Advances in Physical organic Chemistry,
  • Compound A by a chemical, physical or biochemical reaction (most often by oxidation with a peroxide) gives a product in an excited state ("B *") which returns to the ground state by the emission of light
  • Patent applications EP-A-273115, EP-A-257541 and EP-A-263657 describe heterocyclic chemiluminescent compounds derived from acridinium, quinolenium phenantridiniumn and isoquinolenium and their isomers, possibly conjugated to antigens, antibodies or nucleic acids for stretch used in chemiluminescence tests.
  • chemiluminescent power of these derivatives is calculated by the emission of light generated in contact with hydrogen peroxide in an alkaline medium.
  • Studies by F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9, 6, p. 201-209) have established a mechanism for chemiluminescence of acridinium compounds. He postulates the formation of an excited reaction intermediate (dioxetane) which breaks down into C0 2 and methylacridone. It also involves the displacement by H 2 0 2 of a leaving group Y. This displacement would, according to generally accepted theory, be possible for derivatives having a group Y having a pKa lower than that of hydrogen peroxide (pKa ⁇ 12 ).
  • Patent application WO95 / 19976 describes heterocyclic derivatives of acridinium, phenanthridinium, quinolinium and isoquinolenium as well as their isomers and any derivatives obtained by substitution, improved, in particular stable derivatives and / or having a high chemiluminescence, in particular when the pKa value of the leaving group is high, preferably when the pKa is greater than 12.
  • the object of the present invention is to obtain acridinium derivatives chemically related to those described in the abovementioned patent application 095/19976, which are easy to synthesize, which also offer numerous possibilities for adaptation, notably including a series of chemical modifications.
  • grafting an arm (spacer) the aim being inter alia to orient the coupling towards functions that are usually difficult to access when labeling proteins such as phenol and thiol groups.
  • the present invention also aims to obtain chemiluminescent derivatives characterized by a dose-response curve allowing their use in the assay and / or diagnosis over a wide concentration range.
  • a final object of the present invention is to obtain a diagnostic kit comprising said active and / or stable chemiluminescent derivative. Characteristic elements of the invention.
  • the present invention relates to chemiluminescent acridinium derivatives of formula:
  • R x to R 13 are substituents which do not prevent the expression of chemiluminescence, it being understood that at least one of the substituents R 12 and R 13 comprises, as a single element or as a binding element to the derivative of acridinium, an atom other than carbon.
  • A is a complementary ion chosen from the halogen, nitrate, sulfate, iodomercurate, trifluoromethanesulfonate, tartrate and phthalate ions, R x to R 13 .
  • R 12 and R 13 are hydrogen or radicals of type R 14 or BR 14 where B represents a group or a connecting atom and R X4 represents a hydrocarbon radical which may contain one or more heteroatoms
  • R 12 and R 13 are identical or different substituents whose function relates to chemiluminescence and to the coupling, one of the substituents R 12 and R 13 comprising as a single element a halogen atom or comprising as connecting element to the acridinium derivative an atom chosen from azotides and chalcogens, while the other of the substituents R 12 and R 13 is similar to the substituents R x to R X1 , with the exception of hydrogen.
  • R x and R lx are hydrogen, one of the substituents R 12 and R 13 is a substituent chosen from halogens and BR 14 groups, the other of the substituents R 12 and R 13 being similar to BR 14 or R 14 , B and R 14 being as defined above.
  • the chemiluminescent derivatives are the compounds
  • Another aspect of the invention relates to the conjugate comprising a chemiluminescent derivative according to the invention linked to a specific biological component.
  • specific biological compound means any biological molecule (lipid, saccharide, protein, peptide, nucleic acid, ...) or set of biological molecules, specific to a species (viral, bacterial, plant, animal or other) , an individual, a pathology (such as cancer or caused by a viral, bacterial or other agent), an activity or a biochemical system (such as an enzyme reaction, ...) .
  • Said biological component is capable of being detected and / or measured, or capable of being used for assaying and / or detecting a specific biological component.
  • this specific biological compound is chosen from the group consisting of antibodies, haptens, antigens, nucleic acids, agonists, cell transporters, fatty acids, lipids and / or a mixture of them.
  • the present invention also relates to the diagnostic and / or assay kit comprising the conjugate or one of the chemiluminescent derivatives according to the invention and the use of the conjugate and / or of a chemiluminescent derivative according to the invention for the assay and / or the detection of a specific biological compound.
  • FIG. 1 represents a general diagram for the preparation of the OX derivatives.
  • FIG. 2 represents the diagram of synthesis of the derivative 0X7.
  • FIG. 3 illustrates the kinetics of the Ab (antibodies) labeled with 0X3, 0X5, 0X6 and 0X7.
  • FIG. 4 to 6 illustrate the stability of the Ac marked with 0X6, 0X7 and 0X5 respectively.
  • FIG. 7 represents the evolution of the concentration of product 0x7 as a function of time in a buffer at pH 8.
  • FIG. 8 represents an example of TSH assay with Ac labeled with 0x7.
  • Figure 9 shows the infrared spectrum of pentafluorobenzaldehyde.
  • Figure 10 shows the infrared spectrum of pentafluorobenzaldoxime.
  • Figure 11 shows the infrared spectrum of chlorinated pentafluorobenzaldoxime.
  • Figure 12 shows the infrared spectrum of the coupling product of chlorinated pentafluorobenzaldoxime with 9-acridine carboxylic acid chloride, being 1-chloro-1-perfluorophenyl-1-iminomethane 9-acridine carboxylate.
  • FIGS. 13 to 15 represent the infrared spectra of the markers 0X7, 0X5 and 0X6.
  • Figures 16 to 18 show the mass spectra of the markers 0X5, 0X6 and 0X7.
  • the OX compounds were all prepared by following the general preparation scheme described in FIG. 1. Their syntheses required the synthesis of the starting aldehyde (II) when the latter does not was not directly available.
  • the first step is to form the oxime (III) by reaction between the aldehyde (II) and hydroxylamine. The reaction is carried out in a buffer at pH 4.5-5.
  • Chloroxime (IV) is prepared by bubbling chlorine through an oxime solution.
  • the chloro-derivatives were obtained directly by coupling of chloroxime to the acridine nucleus.
  • the other 3 derivatives were previously treated with an equivalent of sodium alcoholate before the step of coupling to the acridine nucleus.
  • the alcoholate is prepared from sodium and the corresponding alcohol.
  • Compounds IV or IVb are coupled to the carboxylic acid chloride in an organic solvent supplemented with NET 3 .
  • the products V or Vb are methylated by the pair of reagents CH 3 I / HgCl 2 or methyl triflate.
  • EXAMPLE 1 OPERATING MODES COMMON TO CERTAIN DERIVATIVES (FIG. 1). 1. Synthesis of aldehyde II (for OX6 and OX7 derivatives).
  • the aldehydes used in the synthesis of the 0X6 and 0X7 derivatives were produced by reduction of the corresponding acid chlorides (2,4,5-trifluorobenzoic acid chloride or 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoic acid).
  • the protocol used is as follows: one equivalent of acid chloride is placed in the presence of 1.1 equivalents of Bu 3 SnH in THF. After reaction, the THF is evaporated in vacuo and the residue treated with water. The latter is then extracted with petroleum ether (Eb 40 ° C) and then passed over charcoal. The aldehyde is obtained by evaporation under vacuum.
  • the chloroxime is prepared by bubbling chlorine into an oxime solution in a CHCl 3 / dioxane mixture previously cooled to 0 ° C. The reaction is complete and the chloroxime (III) is directly obtained by evaporation of the solvents followed, when the chloroxime is solid at room temperature, recrystallization by adding 40 ° C petrolein (the chloroxime of derivatives 0X6 and 0X7 is liquid).
  • the alcoholate is prepared by reaction between an equivalent of sodium and an equivalent of alcohol (ethanol or phenol). The reaction is carried out in alcohol when possible (ethanol) or in acetone
  • the product formed is either crystallized by adding petroleum ether (Eb 40 ° C) to the solution (0X1, 0X2, 0X3, 0X4 and 0X5) or chromatographed on a silica column using a toluene / ethyl acetate phase / acetic acid in propotions 2/1 / 0.01 (0X6 and 0X7).
  • the fractions corresponding to the first product leaving the column are recovered and concentrated in vacuo.
  • the addition of petroleum ether (Eb 40 ° C) causes the product to crystallize.
  • the products obtained in step 5 are methylated with the pair of reactants CH 3 I / HgCl 2 .
  • the reaction is carried out on an intimate mixture of 50 mg of product with 50 mg of HgCl 2 added with 1 ml of CH 3 I. It takes place in a bomb brought to 110 ° C for 2 h 30 min. After reaction, the bomb is refrigerated at -20 ° C. After cooling and decanting of the contents of the bomb, the supernatant is removed and the crystals of methylated product are washed successively with CH 3 I and then with diethyl ether. The methylated product can optionally be recrystallized from an acetone / diethyl ether mixture.
  • EXAMPLE 2 SYNTHESIS OF THE 0X7 PROBE (FIG. 2) OR
  • the chemiluminescence yield of the OX derivatives cannot be determined when the molecules are in the free state. It is measured after coupling of these products to a protein. For example, for the derivatives 0X5, 0X6 and 0X7, the rate of incorporation on the protein is measured by a fluorescent method.
  • chloroximes appear by far the most stable in the presence of proteins. Measurements carried out by mass spectrometry on 0x7 show no significant variation in the spectrum of the molecule after an incubation of 45 minutes in an acetonitrile / water mixture (proportions 50/50). This chemical stability makes it possible to envisage coupling the probe to the proteins via the halogenated function of the molecule. All the stability measurements carried out show that the oximes 0X5, 0X6 and 0X7 greatly increase their stability in an aqueous medium after coupling to the proteins. The first results of a stability study on antibodies labeled with these probes are given in Figures 4, 5 and 6.
  • the tracer 0X7 appears as being the most stable of the three, and this more particularly at pH 5. This important stability at pH 5 makes it possible to envisage a long conservation of the tracer at 4 ° C. On the other hand, the stability of the latter at pH 7 allows to consider all possible immunoassays at this pH.
  • the stability of the 0X7 probe is very sensitive to pH. In an acid medium (pH 5) the stability of the compound is much higher than in a basic medium (pH 8). When the probe is attached to a protein, its stability greatly increases regardless of the pH tested. 3.1 STABILITY OF THE UNCoupled OX7 PROBE AT PH 8.
  • the stability of the free probe was tested at 25 ° C in a medium identical to that used in the labeling reactions (pH of the medium: 8).
  • the degradation of the product was followed by HPLC analysis using as a chromatographic support a column (4x125 mm) of RP-18 Lichrospheres (5 ⁇ m) and as mobile phase an acetonitrile / water mixture added with decane sulfonic acid, hydroxide tetramethyl ammonium and trifluoroacetic acid (final pH: 2.5).
  • FIG. 7 shows the evolution of the concentration of OX7 product as a function of time in a buffer at pH 8.
  • the stability of the OX7 probe coupled to an antibody was tested at pH 5, 6 and 7. It was evaluated by measuring the chemiluminescent activity of samples of labeled protein aged in phosphate / NaCl buffers supplemented with proteins. Parametric adjustment of the data collected at pH 6 and 7 leads to half-life times of the order of 600 and 375 hours. On the other hand, at pH 5, the half-life time is much longer (the small signal variations recorded over a period of approximately 2 months do not allow a valid parametric adjustment).
  • the medium is chromatographed on a column (50 ⁇ 1 cm) of Sephadex G25.
  • the chromatographic column is balanced and eluted with a 0.1 M phosphate buffer, 0.15 M NaCl. 0.1% NaN 3 containing BSA (lg / 1) and adjusted to p 5.0.
  • the chromatographic fractions are read by measurement of chemiluminescence.
  • the fractions corresponding to the antibody peak are pooled and stored in the purification buffer at a temperature of 4 ° C.
  • a non-optimized TSH assay was carried out following a protocol identical to a commercial IRMA assay with anti-TSH antibodies labeled with the 0X7 probe.
  • the protocol used includes the following steps:
  • the calibration curve obtained shows that antibodies labeled with the 0X7 probe can be perfectly suitable as a chemiluminescent tracer in the context of an assay requiring high sensitivity.

Abstract

La présente invention concerne des dérivés d'acridinium chimioluminescents de formule (I) dans laquelle R1 à R13 sont des substituants n'empêchant pas l'expression de la chimioluminescence, étant entendu que l'un au moins des substituants R12 et R13 comporte, comme élément unique ou comme élément de liaison au dérivé d'acridinium, un atome autre que le carbone.

Description

Description
DERIVES CHIMIOLUMINESCENTS HETEROCYCLIOUES. Objet de 1 'invention.
La présente invention concerne des dérivés chimioluminescents d'acridinium ainsi qu'un conjugué comprenant un de ces dérivés, lié à un composant biologique spécifique.
Un autre aspect de l'invention concerne la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant ce conjugué ou un de ces dérivés, et l'utilisation du conjugué ou d'un de ces dérivés chimioluminescents pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique . Arrière-plan technologique à la base de l'invention.
La chimioluminescence est une formation de lumière obtenue par une réation chimique. Le mécanisme général de cette réaction a été notamment décrit par Schuster et al (Advances in Physical organic Chemistry,
187-238 (1984)) par la réaction suivante :
A → B* → B + hv
Le composé A, par une réaction chimique, physique ou biochimique (le plus souvent par une oxydation avec un peroxyde) donne un produit à un état excité ("B*") qui revient à l'état fondamental par l'émission de lumière
(hv).
Ce procédé de chimioluminescence est largement utilisé en chimie analytique et en biologie clinique, notamment pour les immunodosages (chemoluminescence imrauno assay ou "CLIA") .
Les demandes de brevet EP-A-273115, EP-A-257541 et EP-A-263657 décrivent des composés chimioluminescents hétérocycliques dérivés d'acridinium, de phénantridiniumn de quinolénium et d'isoquinolénium et leurs isomères, éventuellement conjugués à des antigènes, des anticorps ou des acides nucléiques pour étire utilisés dans des tests de chimioluminescence.
Le pouvoir chimioluminescent de ces dérivés est calculé par l'émission de lumière engendrée au contact de l'eau oxygénée en milieu alcalin. Des études réalisées par F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9, 6, p. 201-209) ont permis d'établir un mécanisme de chimioluminescence des composés d'acridinium. Il postule la formation d'un intermédiaire réactionnel excité (dioxétane) qui se décompose en C02 et en méthylacridone . Il implique également le déplacement par H202 d'un groupement partant Y. Ce déplacement serait, selon la théorie généralement admise, possible pour des dérivés présentant un groupement Y possédant un pKa inférieur à celui de l'eau oxygénée (pKa < 12).
La demande de brevet W095/19976 décrit des dérivés hétérocycliques d'acridinium, de phénantridinium, de quinoléinium et d'isoquinolénium ainsi que leurs isomères et dérivés quelconques obtenus par substitution, améliorés, en particulier des dérivés stables et/ou présentant une chimioluminescence élevée, notamment lorsque la valeur du pKa du groupement partant est élevée, de préférence lorsque le pKa est supérieur à 12. Buts de 1 invention.
La présente invention a pour but d'obtenir des dérivés d'acridinium apparentés chimiquement à ceux décrits dans la demande de brevet 095/19976 précitée, de synthèse aisée, qui offrent en outre de nombreuses possibilités d'adaptation comportant notamment une série de modifications chimiques telles que le greffage d'un bras (spacer), le but étant entre autres d'orienter le couplage vers des fonctions habituellement peu accessibles lors du marquage de protéines telles que les groupements phénols et thiols.
La présente invention a également pour but d'obtenir des dérivés chimioluminescents caractérisés par une courbe dose - réponse permettant leur utilisation dans le dosage et/ou le diagnostic sur une large plage de concentration.
Un dernier but de la présente invention est d'obtenir une trousse de diagnostic comprenant ledit dérivé chimioluminescent actif et/ou stable. Eléments caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne des dérivés d'acridinium chimioluminescents de formule :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle Rx à R13 sont des substituants n'empêchant pas l'expression de la chimioluminescence, étant entendu que l'un au moins des substituants R12 et R13 comporte, comme élément unique ou comme élément de liaison au dérivé d'acridinium, un atome autre que la carbone.
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, A est un ion complémentaire choisi parmi les ions halogéno, nitrate, sulfate, iodomercurate , trifluorométhanesulfonate, tartrate et phtalate, Rx à R13. sont l'hydrogène ou des radicaux de type R14 ou B-R14 où B représente un groupe ou un atome de liaison et RX4 représente un radical hydrocarboné pouvant contenir un ou plusieurs hétéroatomes , R12 et R13 sont des substituants identiques ou différents dont la fonction porte sur la chimioluminescence et sur le couplage, l'un des substituants R12 et R13 comportant comme élément unique un atome d'halogène ou comportant comme élément de liaison au dérivé d'acridinium un atome choisi parmi les azotides et les chalcogènes, tandis que l'autre des substituants R12 et R13 est semblable aux substituants Rx à RX1, à l'exception de 1 'hydrogène .
De préférence, dans les dérivés chimioluminescents selon l'invention, B représente dans la formule B-R14, un groupe - (CH2)n - où n représente un nombre entier de 1 à 5, B représente également un groupe contenant un azotide ou représente un chalcogène, de préférence un groupe azoté ou l'oxygène deux fois liés, RX4 étant tel que défini précédemment. Et plus particulièrement, R14 est un radical choisi parmi le groupe constitué par al yle, alkényle, alkynyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylkyle éventuellement substitués .
Plus particulièrement encore, dans ces dérivés chimioluminescents, Rx et Rlx sont l'hydrogène, l'un des substituants R12 et R13 est un substituant choisi parmi les halogènes et les groupes B-R14, l'autre des substituants R12 et R13 étant semblable à B-R14 ou à R14, B et R14 étant tels que définis précédemment.
Selon une forme d'exécution préférée, de l'invention, les dérivés chimioluminescents sont les composés;
[ 1-éthoxy-l-( 4-carboxyphényl )-1-iminométhane]-10- méthylacridinium-9-carboxylate ou { l-éthoxy-l-[ 4-(2-bromoéthoxy)-phényl]-l- iminométhane}-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou (l-chloro-l-phényl-ι-iminométhane)-lθ- méthylacridinium-9-carboxylate ou
[ 1-benzyloxy-l- ( 4-carboxyphényl ) -l-iminométhane ] - 10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
[ 1-chloro-l-( 3-cyanophényl ) -l-iminométhane ]-10- méthylacridinium-9-carboxylate ou [l-chloro-l-(2,4,5,-trifluorophényl)-l- iminométhane]-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
( 1-chloro-l-perfluorophényl-l-iminométhane ) -10- méthylacridinium-9-carboxylate . Ces dérivés sont désignés par les références 0X_, à 0X7 respectivement et leurs formules de structure sont reprises au tableau 1 qui suit.
Figure imgf000008_0001
Un autre aspect de l'invention concerne le conjugué comprenant un dérivé chimioluminescent selon l'invention lié à un composant biologique spécifique.
On entend par "composé biologique spécifique", toute molécule biologique (lipide, saccharide, protéine, peptide, acide nucléique,...) ou ensemble de molécules biologiques, spécifiques d'une espèce (virale, bactérienne, végétale, animale ou autre), d'un individu, d'une pathologie (telle que le cancer ou causée par un agent viral, bactérien ou autre), d'une activité ou d'un système biochimique (telle qu'une réaction enzy atique, ... ) .
Ledit composant biologique est susceptible d'être détecté et/ou dosé, ou susceptible de servir au dosage et/ou à la détection d'un composant biologique spécifique. De préférence, ce composé biologique spécifique est choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux. La présente invention concerne également la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué ou un des dérivés chimioluminescents selon l'invention et l'utilisation du conjugué et/ou d'un dérivé chimioluminescent selon l'invention pour le dosage et/ou la détection d'un composé biologique spécifique.
Brève description des Figures.
La figure 1 représente un schéma général de préparation des dérivés OX.
La figure 2 représente le schéma de synthèse du dérivé 0X7.
La figure 3 illustre la cinétique des Ac (anticorps) marqués par 0X3, 0X5, 0X6 et 0X7.
Les figures 4 à 6 illustrent la stabilité des Ac marqués par 0X6, 0X7 et 0X5 respectivement. Dans les figures 3 à 6, le signal est exprimé par le rapport entre l'intensité (en RLU) mesurée au temps t et l'intensité (en RLU) mesurée au temps t=0. La figure 7 représente l'évolution de la concentration en produit 0X7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
La figure 8 représente un exemple de dosage de TSH avec Ac marqué par 0X7.
La figure 9 représente le spectre infrarouge du pentafluorobenzaldéhyde .
La figure 10 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime. La figure 11 représente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime chlorée.
La figure 12 représente le spectre infrarouge du produit de couplage de la pentafluorobenzaldoxime chlorée avec le chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique, étant le 9-acridine carboxylate de 1-chloro-l-perfluorophényl-l- iminométhane.
Les figures 13 à 15 représentent les spectres infrarouge des marqueurs 0X7 , 0X5 et 0X6.
Les figures 16 à 18 représentent les spectres de masse des marqueurs 0X5, 0X6 et 0X7.
Les composés OX dont les formules sont reprise au tableau 1 , ont tous été préparés en suivant le schéma général de préparation décrit dans la figure 1. Leurs synthèses ont nécessité la synthèse de l'aldéhyde de départ (II) lorsque celui-ci n'était pas directement disponible. La première étape consiste à former l'oxime (III) par réaction entre l'aldéhyde (II) et de l'hydroxylamine. La réaction est réalisée dans un tampon à pH 4,5-5.
La chloroxime (IV) est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime.
Les chloro-dérivés ont été obtenus directement par couplage de la chloroxime au noyau acridine. Les 3 autres dérivés ont été préalablement traités par un équivalent d'alcoolate sodique avant l'étape de couplage au noyau acridine. L'alcoolate est préparé à partir de sodium et de l'alcool correspondant. Les composés IV ou IVb sont couplés au chlorure d'acide carboxylique dans un solvant organique additionné de NET3.
Les produits V ou Vb sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCl2 ou le triflate de méthyle.
EXEMPLES EXEMPLE 1: MODES OPERATOIRES COMMUNS A CERTAINS DERIVES (FIG. 1). 1. Synthèse de l'aldéhyde II (pour les dérivés OX6 et OX7).
Les aldéhydes employés dans la synthèse des dérivés 0X6 et 0X7 ont été réalisés par réduction des chlorures d'acides correspondants (chlorure d'acide 2,4,5- trifluorobenzoïque ou 2,3 , 4 ,5 ,6-pentafluorobenzoïque) . Le protocole utilisé est le suivant: un équivalent de chlorure d'acide est mis en présence d'1,1 équivalents de Bu3SnH dans du THF. Après réaction, le THF est évaporé sous vide et le résidu traité par de l'eau. Ce dernier est ensuite extrait par de l'éther de pétrole (Eb 40° C) puis passé sur charbon. L'aldéhyde est obtenu par évaporation sous vide.
2. Formation de l'oxime III (pour tous les dérivés).
Un équivalent d'aldéhyde dissous dans le l'éthanol est additionné d'eau et de cinq équivalents de chlorhydrate d'hydroxylamine. Le pH est ajusté à une valeur de 5 par ajout de NaOH à 5 %. Le solvant organique est évaporé et l'oxime formée est extraite au toluène. La solution organique est séchée sur Na2S04 et passée sur charbon. ELle est ensuite concentrée sous vide et additionnée de pétroléine 40° C Le refroidissement de la solution à -20° C provoque la cristallisation de l'oxime.
3. Transformation en chloroxime IV (pour tous les dérivés) .
La chloroxime est préparée par barbotage de chlore dans une solution d'oxime dans un mélange CHCI3/dioxane préalablement refroidi à 0° C La réaction est complète et la chloroxime (III) est directement obtenue par évaporation des solvants suivie, lorsque la chloroxime est solide à température ambiante, d'une recristallisation par ajout de pétroléine 40° C. (la chloroxime des dérivés 0X6 et 0X7 est liquide).
4. Etape de réaction avec un alcoolate (pour dérivés OX1 , OX2 et 0X4) .
Obtention du produit IVb.
L'alcoolate est préparé par réaction entre un équivalent de sodium et d'un équivalent d'alcool (éthanol ou phénol). La réaction est effectuée dans l'alcool lorsque c'est possible (éthanol) ou dans l'acétone
(phénol) .
Un équivalent de chloroxime dissous dans l'acétone est directement mis en réaction avec un équivalent d'alcoolate. Le pH du milieu est ajusté à 4,5 par ajout de HCI concentré et le précipité formé (NaCI) est éliminé par filtration ou par centrifugation. La solution est additionnée d'eau. L' évaporation des solvants organiques provoque la cristallisation du produit.
5. Couplage à l'acridine (pour tous les dérivés). Obtention du produit VTb.
L'acide acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide dans du chlorure de thionyle porté à reflux. Après transformation complète de l'acide, le chlorure de thionyle est évaporé sous vide. Un équivalent des composés préparés aux étapes 3
(0X3, 0X5, 0X6 et 0X7) ou 4 (0X1, 0X2 et 0X4) sont couplés avec un équivalent de chlorure d'acide acridine carboxylique dans du THF additionné d'un excès de pyridine. Le THF est évaporé sous vide et le résidu repris dans du toluène. On lave la phase toluénique à l'eau puis on la sèche sur du sulfate sodique anhydre. Le produit formé est soit cristallisé par ajout d'éther de pétrole (Eb 40° C) à la solution (0X1, 0X2, 0X3, 0X4 et 0X5) ou chromatographié sur une colonne de silice en utilisant une phase toluène /acétate d'ethyle/ acide acétique en propotions 2/1/0,01 (0X6 et 0X7). Les fractions correspondant au premier produit qui sort de la colonne sont récupérées et concentrées sous vide. L'addition d'éther de pétrole (Eb 40° C) provoque la cristallisation du produit.
6. Méthylation des composés (pour tous les dérivés).
Les produits obtenus à l'étape 5 sont méthylés par le couple de réactifs CH3I/HgCl2. La réaction est réalisée sur un mélange intime de 50 mg de produit avec 50 mg de HgCl2 additionné de 1 ml de CH3I. Elle se déroule dans une bombe portée à 110° C durant 2h30. Après réaction, la bombe est réfrigérée à -20° C. Après refroidissement et décantation du contenu de la bombe, le surnageant est éliminé et les cristaux de produit méthylé sont lavés successivement par du CH3I puis par de l'éther diéthylique. Le produit méthylé peut éventuellement être recristallisé dans un mélange acétone/éther diéthylique. EXEMPLE 2: SYNTHESE DE LA SONDE 0X7 (FIG. 2) OU
( 1-C2ÏLORCH1-PERFLUOROPHENΥL-1-IMINOMETHANE ) -10- METHYLACRIDINIUM-9-CARBOXYLATE .
1. Préparation de la pentafluorobenzaldoxime (I).
20 g de pentafluorobenzaldéhyde sont rais en solution dans 400 ml d'éthanol. D'autre part, 25 g de chlorhydrate d'hydroxylamine sont solubilisés dans 200 ml d'eau. La solution aqueuse est ajoutée à la solution alcoolique et le pH de la solution résultante est amené à 5 par addition de NaOH 2N. Après transformation complète (CCM) , on cristallise l'oxime par évaporation de l'éthanol de la solution. Le produit est isolé par filtration et lavé abondamment à l'eau. 17,8 g de pentafluorobenzaldoxime sont récupérés après séchage du précipité (rendement 82 %).
2. Préparation de la chloropentafluorobenzaldoxime (II).
1 g de pentafluorobenzaldoxime est mis en solution dans 15 ml d'un mélange dioxanne-chloroforme (1:1). Cette solution est refroidie à 0° C et saturée par du chlore. Après 90 minutes de réaction, la transformation est complète (CCM). Les solvants et l'excès de chlore sont éliminés sous pression réduite et le résidu est utilisé tel quel dans l'étape suivante. 3. Couplage de la chloropentafluorobenzaldoxime (II) au chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique
(III)-
1,05 g d'acide 9-acridine carboxylique est transformé en chlorure d'acide par traitement au chlorure de thionyle (10 ml) contenant une trace de N, N- diméthylformamide pendant 90 minutes à 85° C. L'excès de chlorure de thionyle est éliminé sous dépression. Le chlorure d'acide (III) obtenu sous forme de chlorhydrate est mis en suspension dans 20 ml de tetrahydrofurane et neutralisé par 5 équivalents (2400 μl) de triéthylamine. Le produit obtenu à l'étape précédente est dilué dans 10 ml de tetrahydrofurane et additionné à la solution de chlorure d'acide. Après 30 minutes de réaction, le solvant est éliminé sous dépression et le résidu est solubilisé dans un minimum de chloroforme. La phase organique est lavée trois fois par 40 ml d'eau, décantée et séchée sur sulfate sodique anydre. Le solvant est éliminé au rotavapor et le résidu est dilué par un minimum de toluène et abandonné à la cristallisation à 0° C pendant une nuit. Le produit est filtré, lavé par du toluène froid puis par de l'éther de pétrole. Il est ensuite séché sous vide en présence d'un desséchant. 1,8 g de produit (IV) sont récupérés après séchage (rendement 85 %). 4. N-méthylation du produit (IV) et obtention du traceur chimioluminescent OX7 (V) .
50 mg du produit (IV) sont mis en solution dans 2 ml de dichlorométhane anhydre et traités par 800 μl d'une solution à 10% de trifluorométhanesulfonate de méthylé dans le dichlorométhane. Après 4h de réaction, le produit désiré est précipité par addition modérée d'éther dans le milieu réactionnel. Le traceur est isolé par filtration et lavé successivement par de l'éther diéthylique puis par de l'éther de pétrole. 50 mg de produit (V) sont récupérés (rendement 73%). Points de Fusion et données chromatographiques .
Composé N° Point de fusion (°C) Rf CCM Rf CCM SIL SIL G UVjgj RP18W/Uy2S ι
I 13 1 0,87 0,70 IV 206-207 0,77 0,31 V 210-213 0,00 0,27
Phases Mobiles CCM SIL G/UV2S4: toluène/acétate d'éthyle/acide acétique (2: 1: 0,04).
CCM DIL RP18W/UV25_,: acétonitrile/tampon phosphate 0,1 M pH=3 (60: 40 heptanesulfonate sodique: 0,1 %). EXEMPLE 3: ESSAIS EXPERIMENTTAUX SUR LES SONDES OX. 1. Rendement de chimioluminescence
Le rendement de chimioluminescence des dérivés OX ne peut pas être déterminé lorsque les molécules sont à l'état libre. Il est mesuré après couplage de ces produits à une protéine. A titre d'exemple, pour les dérivés 0X5, 0X6 et 0X7, le taux d'incorporation sur la protéine est mesuré par une méthode fluorescente.
Pour 0X7, on peut aussi quantifier la fluorescence émise par un dérivé de dégradation: l'acridone. Le rendement quantique de la molécule de 0X7 conjuguée à un anticorps anti-hCG a été évalué à 1,10i9 RLU/mole. 2. Cinétique d'émission
Toutes les cinétiques d'émission enregistrées avec des dérivés OX sont très rapides. Plus de 95 % du signal est émis dans la seconde suivant l'injection du réactif déclenchant la réaction chimioluminescente. Même couplés, les dérivés de chloroximes conservent cette cinétique particulièrement rapide. A titre d'exemple, la figure 3 reprend les cinétiques observées sur des anticorps (Ac) marqués par les chloro-dérivés . 3. Etude de stabilité
De tous les oximes synthétisés, les chloroximes apparaissent de loin les plus stables en présence de protéines. Des mesures réalisées par spectrométrie de masse sur 0X7 ne montrent aucune variation significative du spectre de la molécule après une incubation de 45 minutes dans un mélange acétonitrile/eau (proportions 50/50). Cette stabilité chimique permet d'envisager le couplage de la sonde aux protéines via la fonction halogénée de la molécule. Toutes les mesures de stabilité effectuées montrent que les oximes 0X5 , 0X6 et 0X7 augmentent fortement leur stabilité en milieu aqueux après couplage aux protéines. Les premiers résultats d'une étude de stabilité sur des anticorps marqués par ces sondes sont donnés dans les figures 4 , 5 et 6. Cette étude est réalisée à 25° C dans des tampons (0,1 M phosphate, 0,15 M NaCI, 0,1 % NaN3, 0,1 % BSA) à pH 5 , 6 et 7. Dans les conditions expérimentales décrites ci- après, les premiers résultats montrent que la stabilité des traceurs diminue avec la basicité du milieu, ce qui est lié à la nature des sondes. Ils montrent également que le traceur 0X5 est nettement moins stable que les traceurs 0X6 et 0X7. Les cassures observées entre t=470 et t=560 heures sur les courbes des figures 4 et 5 à pH 5 et 6 permettent difficilement de conclure sur la stabilité exacte des traceurs 0X6 et 0X7 à pH 5 et 6. Toutefois , le traceur 0X7 apparaît comme étant le plus stable des trois, et ce plus particulièrement à pH 5. Cette importante stabilité à pH 5 permet d'envisager une longue conservation du traceur à 4° C D'un autre côté, la stabilité de celui-ci à pH 7 permet d'envisager tous les immunodosages possible à ce pH. La stabilité de la sonde 0X7 est très sensible au pH. En milieu acide (pH 5) la stabilité du composé est nettement plus élevée qu'en milieu basique (pH 8). Lorsque la sonde est fixée à une protéine, sa stabilité augmente fortement et ce quelque soit le pH testé. 3.1 STABILITE DE LA SONDE OX7 NON COUPLEE A PH 8.
La stabilité de la sonde libre a été testée à 25° C dans un milieu identique à celui employé dans les réactions de marquage (pH du milieu: 8). La dégradation du produit a été suivie par analyse HPLC en utilisant comme support chromatographique une colonne (4x125 mm) des Lichrosphères RP-18 (5 μm) et comme phase mobile un mélange acétonitrile/eau additionné d'acide décane sulfonique, d'hydroxyde de tétraméthyle ammonium et d'acide trifluoroacétique (pH final: 2,5).
La figure 7 présente l'évolution de la concentration en produit 0X7 en fonction du temps dans un tampon à pH 8.
L'ajustement paramétrique des données présentées par une fonction de type: Y = A* exp (-B*X) + C a conduit aux résultats suivants:
Figure imgf000017_0001
- = 0,992,- y.x= ,
Le temps de demi-vie de la sonde libre obtenu en utilisant l'ajustement paramétrique est de 17 minutes. 3.2 STABILITE DE LA SONDE OX7 COUPLEE A UN ANTICORPS.
La stabilité de la sonde OX7 couplée à un anticorps a été testée à pH 5 , 6 et 7. Elle a été évaluée par mesure de l'activité chimioluminescente d'échantillons de protéine marquée vieillis dans des tampons phosphate/NaCl additionnés de protéines. L'ajustement paramétrique des données recueillies à pH 6 et 7 conduit à des temps de demi-vie de l'ordre de 600 et 375 heures. Par contre à pH 5, le temps de demi-vie est nettement plus important (les faibles variations de signal enregistrées sur une période d'environ 2 mois ne permettent pas un ajustement paramétrique valable).
4.1 MARQUAGE D'ANTICORPS ANTI-TSH PAR LA SONDE OX7 25 μg d'anticorps en solution dans 100 μl de tampon de marquage (solution 0,1 M phosphate de sodium, 0,15 M NaCI ajustée à pH 8,0) sont additionnés de 10 μl d'une solution de 0X7-méthyltriflate dans l'acétonitrile (solution 0,5 mg/ml). Après homogénéisation, le mélange réactionnel est incubé durant 15 minutes à température ambiante. L'excès de sonde 0X7 est neutralisé par ajout de 100 μl d'une solution de lysine dans le tampon de marquage (solution 1,5 mg/ml). Après une nouvelle incubation de 5 minutes à température ambiante, le milieu est chromatographié sur une colonne (50x1 cm) de séphadex G25. La colonne chromatographique est équilibrée et éluée avec un tampon 0,1 M phosphate, 0,15 M NaCI . 0,1 % NaN3 contenant de la BSA ( lg/1 ) et ajusté à p 5,0. Les fractions chromatographiques sont lues par mesure de chimioluminescence. Les fractions correspondant au pic d'anticorps sont rassemblées et conservés dans le tampon de purification à une température de 4° C
4.2 DOSAGE DE TSH AVEC LES ANTICORPS MARQUES PAR OX7.
Un dosage non optimisé de la TSH a été réalisé en suivant un protocole identique à un dosage IRMA commercial avec des anticorps anti-TSH marqués par la sonde 0X7. Le protocole utilisé comporte les étapes suivantes:
• préparation du traceur par dilution du pic d'anticorps marqués dans un tampon traceur à pH 7,0 (dilution 50x);
• remplissage des différents tubes coatés avec 200 μl de standards (0, 0,15, 0,5, 1.5, 4, 15, 50 et 85 μl/ml ) ; • agitation durant 2h à température ambiante;
• aspiration du contenu de chaque tube;
• rinçage des tubes avec un tampon de lavage (opération réalisée 2 fois) et élimination de la phase liquide par aspiration; • lecture de la chimioluminescence des différents tubes.
La courbe de calibration obtenue (Fig. 8) montre que des anticorps marqués par la sonde 0X7 peuvent parfaitement convenir comme traceur chimioluminescent dans le cadre d'un dosage nécessitant une grande sensibilité.

Claims

REVENDICATIONS
Dérivés d'acridinium chimioluminescents de formule:
Figure imgf000019_0001
dans laquelle Rx à R13 sont des substituants n'empêchant pas l'expression de la chimioluminescence, étant entendu que l'un au moins des substituants RX2 et R13 comporte, comme élément unique ou comme élément de liaison au dérivé d'acridinium, un atome autre que le carbone.
2. Dérivés chimioluminescents suivant la revendication 1, caractérisés en ce que:
A est un ion complémentaire choisi parmi les ions halogéno, nitrate, sulfate, sulfonate, iodomercurate, trifluorométhane sulfonate, tartrate et phtalate,
Rx à Rxx sont l'hydrogène ou des radicaux de type R14 ou B-R14 où B représente un groupe ou un atome de liaison et RX4 représente un radical hydrocarboné pouvant contenir un ou plusieurs hétéroatomes ,
R12 et Ri3 sont des substituants identiques ou différents dont la fonction porte sur la chimioluminescence et sur le couplage, l'un des substituants R12 et R13 comportant comme élément unique un atome d'halogène ou comportant comme élément de liaison au dérivé d'acridinium un atome choisi parmi les azotides et les chalcogènes, tandis que l'autre des substituants R12 et R13 est semblable aux substituants Rx à Ru, à l'exception de l'hydrogène.
3. Dérivés chimioluminescents suivant la revendication 2, caractérisés en ce que, dans la formule B-
B représente un groupe -(CH2)n-, où n représente un nombre entier de 1 à 5, B représente également un groupe contenant un azotide ou représente un chalcogène de préférence un groupe azoté ou l'oxygène deux fois liés, R14 étant tel que défini précédemment.
4. Dérivés chimioluminescents suivant la revendication 3, caractérisés en ce que:
R1 est un radical choisi parmi le groupe constitué par alkyle, alkényle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle et hétéroarylkyle éventuellement substitués .
5. Dérivés chimioluminescents suivant les revendications 3 et 4, caractérisés en ce que: Rxà Rxx sont l'hydrogène, l'un des substituants RX2 et Rx3 est un substituant choisi parmi les halogènes et les groupes B-R4, l'autre des substituants RX2 et RX3 étant semblable à B-RX4 ou à RX4, B et RX4 étant tels que définis précédemment .
6. Dérivés chimioluminescents suivant la revendication 5, de formule: [ 1-éthoxy-l-(4-carboxyphényl )-l-iminométhane]-10- méthylacridinium-9-carboxylate ou
{l-éthoxy-l-[4-(2-bromoéthoxy)-phényl]-l- iminométhane}-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
(l-chloro-l-phényl-l-iminométhane)-lθ- méthylacridinium-9-carboxylate ou
[ 1-benzyloxy-l-( 4-carboxyphényl )-l-iminométhane]- 10-méthylacridinium-9-carboxylate ou [ 1-chloro-l- ( 3-cyanophényl ) -l-iminométhane]-10- méthylacridinium-9-carboxylate ou
[l-chloro-l-(2,4,5-trifluorophényl)-l- iminométhane]-10-méthylacridinium-9-carboxylate ou
( 1-chloro-l-perfluorophényl-l-iminométhane)-10- méthylacridinium-9-carboxylate .
7. Conjugué comprenant un dérivé chimioluminescent selon l'une quelconque des revendications
1 à 6 lié éventuellement par l'intermédiaire d'un bras à un composant biologique spécifique choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides nucléiques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
8. Trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugué selon le revendication 7 ou un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
9. Utilisation du conjugué selon la revendication
7 ou d'un dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour le marquage de protéines, le dosage et/ou la détection d'un composant biologique spécifique choisi parmi le groupe constitué par les anticorps, les haptènes, les antigènes, les acides gras, les lipides et/ou un mélange d'entre eux.
PCT/BE1998/000087 1997-06-11 1998-06-10 Derives chimioluminescents heterocycliques WO1998056765A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98925343A EP0988288A1 (fr) 1997-06-11 1998-06-10 Derives chimioluminescents heterocycliques

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9700503 1997-06-11
BE9700503A BE1011206A4 (fr) 1997-06-11 1997-06-11 Derives chimioluminescents heterocycliques.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998056765A1 true WO1998056765A1 (fr) 1998-12-17

Family

ID=3890565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BE1998/000087 WO1998056765A1 (fr) 1997-06-11 1998-06-10 Derives chimioluminescents heterocycliques

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0988288A1 (fr)
BE (1) BE1011206A4 (fr)
WO (1) WO1998056765A1 (fr)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6783948B1 (en) 1999-07-30 2004-08-31 Bayer Corporation Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes
WO2005015215A1 (fr) * 2003-07-30 2005-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes chimioluminescents et leur utilisation
US7262306B2 (en) 2003-07-08 2007-08-28 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
US7332354B2 (en) 2001-06-01 2008-02-19 Roche Diagnostics Operations, Inc. Compounds for chemiluminescense procedures
EP3674381A4 (fr) * 2017-08-25 2021-08-18 Japan Science and Technology Agency Matériau optique organique

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257541A2 (fr) * 1986-08-22 1988-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés de l'acridine chimioluminescents et leur utilisation pour dosage immunologique par chimioluminescence
EP0263657A2 (fr) * 1986-10-06 1988-04-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Esters aryl-polysubstitués d'acridinium
WO1995019976A1 (fr) * 1994-01-25 1995-07-27 Biocode S.A. Derives chemoluminescents heterocycliques

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257541A2 (fr) * 1986-08-22 1988-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Dérivés de l'acridine chimioluminescents et leur utilisation pour dosage immunologique par chimioluminescence
EP0263657A2 (fr) * 1986-10-06 1988-04-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Esters aryl-polysubstitués d'acridinium
WO1995019976A1 (fr) * 1994-01-25 1995-07-27 Biocode S.A. Derives chemoluminescents heterocycliques

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6783948B1 (en) 1999-07-30 2004-08-31 Bayer Corporation Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes
US7097995B2 (en) 1999-07-30 2006-08-29 Bayer Corp. Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes
US7459284B2 (en) 1999-07-30 2008-12-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Chemiluminescent acridinium compounds and analogues thereof as substrates of hydrolytic enzymes
US7332354B2 (en) 2001-06-01 2008-02-19 Roche Diagnostics Operations, Inc. Compounds for chemiluminescense procedures
US7262306B2 (en) 2003-07-08 2007-08-28 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
WO2005015215A1 (fr) * 2003-07-30 2005-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Nouveaux composes chimioluminescents et leur utilisation
US7563902B2 (en) 2003-07-30 2009-07-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Chemiluminescent compounds and their use
EP3674381A4 (fr) * 2017-08-25 2021-08-18 Japan Science and Technology Agency Matériau optique organique

Also Published As

Publication number Publication date
EP0988288A1 (fr) 2000-03-29
BE1011206A4 (fr) 1999-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0321353B1 (fr) Cryptates de terres rares, procédés d&#39;obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
JP4842914B2 (ja) 捕獲化合物、その収集物ならびにプロテオームおよび複合組成物を分析するための方法
FR2500165A1 (fr) Procede et reactifs d&#39;immunodetermination par polarisation de fluorescence utilisant des carboxyfluoresceines
EP0916658B1 (fr) Tests utilisant des esters, thioesters ou amides chimioluminescents
EP0574313A1 (fr) Pipérazines 1,4-disubstituées pour le traitement des maladies du système nerveux central et des maladies neuro endocriniennes
FR2810406A1 (fr) Nouveaux cryptates de terre rare peu sensibles a l&#39;extinction de fluorescence
JPH0699401B2 (ja) 化学発光性アクリジン誘導体
WO1990013665A1 (fr) Analyse spectrale d&#39;emissions avec degre de sensibilite eleve
FR2748027A1 (fr) Derives de la fluoresceine 4&#39;-methyl-substituee
JPH06206871A (ja) 新規カルバマゼピンハプテン類似体
EP1105730B1 (fr) Immunoessai base sur l&#39;inhibition enzymatique
CN111848526A (zh) 多取代1,4-二氢哒嗪和哒嗪类衍生物及其合成方法
DE4302241A1 (de) Neues Biotinylierungsreagenz
EP0624575A1 (fr) Indoles substitués et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
BE1011206A4 (fr) Derives chimioluminescents heterocycliques.
WO1989008115A1 (fr) NOUVEAUX DERIVES DE LA DEOXY-2&#39;-URIDINE SUBSTITUEE EN POSITION 5, 3&#39; ou 5&#39; PAR DES GROUPEMENTS alpha-AMINO ACYLES, PROCEDE POUR LEUR OBTENTION ET MEDICAMENTS LES CONTENANT
GB2038838A (en) Immunogen conjugates of diphenyldantoin
CN111170994A (zh) 一种吖啶内盐的制备方法
BE1008216A4 (fr) Derives chemoluminescents heterocycliques.
EP0432017B1 (fr) Dérivés de tétrahydro-2,3,6,7,1H,5H,11H-(1)benzopyrano(6,7,8,ij)quinolizinone-11 utilisables comme marqueurs de composés organiques en vue de la détection de ces composés par chimiluminescence ou fluorescence
EP0419542B1 (fr) NOUVEAUX DERIVES DE TETRAHYDRO-2,3,6,7,1H,5H,11H-(1)BENZOPYRANO(6,7,8,ij)QUINOLIZINONE-11 UTILISABLES COMME MARQUEURS DE COMPOSES ORGANIQUES EN VUE DE LA DETECTION DE CES COMPOSES PAR CHIMILUMINESCENCE OU FLUORESCENCE
JP4265324B2 (ja) 新規なニコチン酸誘導体及びその合成方法
KR20070070200A (ko) 페닐 2-피리미디닐 케톤의 제조 방법 및 이의 신규 중간체
EP0162877B1 (fr) Méthode de dosage d&#39;enzymes
EP0069018B1 (fr) Dérivés de stilbène radioactifs marqués à l&#39;iode, procédé et intermédiaires de préparation, et leur application aux dosages radioimmunologiques

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998925343

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1999501161

Format of ref document f/p: F

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998925343

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998925343

Country of ref document: EP