DE68926259T2

DE68926259T2 - Geschützte chemilumineszierende Markierungen

Info

Publication number: DE68926259T2
Application number: DE68926259T
Authority: DE
Inventors: Lyle John Arnold; Philip W Hammond; Iii Alexander Atkinson Waldrop
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: ES2012323A4; NO894218L; EP0330433B1; DK530489D0; FI895062A0; PT89834B; CA1333396C; AU626319B2; EP0330433A2; US4950613A; NO894218D0; EP0330433A3; PT89834A; AU4072389A; ATE137021T1; WO1989008256A1; GR900300054T1; ES2012323T3; KR900700885A; JPH02503268A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische Bindungspartner, wie biologische Sonden, die mit einem geschützten chemilumineszenten Marker markiert sind, um die Inaktivierung des Markers zu verhindern und von denen der ungeschützte, chemilunineszente Marker wiedergewonnen werden kann.

Technologischer Hintergrund

In der klinischen Forschung und Diagnostik beinhaltet eine bekannte Technik zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Anwesenheit einer biologischen Gruppierung die Verwendung einer Sonde, die spezifisch an die interessierende Gruppierung bindet (deren spezifischer Bindungspartner). In Situationen beispielsweise, in denen ein Assay auf eine zielverbindung in Form eines Antigens oder einer bestimmten Nucleotidsequenz durchgeführt werden soll, könnte die Sonde ein Antikörper bzw. ein Oligonucleotid sein. In jedem Fall wird die Sonde gewöhnlich markiert, d.h. sie wird mit einem Atom oder einer Gruppe versehen, die damit vebunden wird und deren Anwesenheit leicht nachgewiesen werden kann. Um die Anwesenheit der Zielverbindung in einer Testprobe nachzuweisen wird die markierte Sonde der Probe unter Bedingungen ausgesetzt, die ein Verbinden der markierten Sonde in der Testprobe mit deren spezifischem Bindungspartner in der Testprobe ermöglicht (beispielsweise im Fall einer Antikörper-Sonde, ein Verbinden mit dem Antigen, im Fall der Oligonucleotid-Sonde, Hybridisieren mit dem Nucleotid- Multimer). Anschließend wird gewöhnlich jeder vorhandene markierte Sonden/Zielverbindungs-Komplex von der nicht-komplexierten Sonde getrennt und die Anwesenheit der Sonde in der komplexierten oder nicht-komplexierten Sonde bestimmt.
Historisch wurden radioaktive Marker eingesetzt. Wegen Schwierigkeiten bei der Handhabung, Gesundheitsgefährdung und Instabilität wurden später jedoch nicht-isotopische Marker entwickelt. Derartige Marker beinhalten solche, deren Anwesenheit entweder direkt oder indirekt bestimmt wird. Beispiele für direkte Marker beinhalten chemilumineszente, phosphoreszente, fluoreszente oder spektroskopisch nachweisbare Marker. Beispiele für indirekte Marker beinhalten Verbindungen wie Biotin und verschiedene Antigene, die mittels spezifischer Bindungspartner nachgewiesen werden können, die mit einem geeigneten nachweisbaren Marker konjugiert sind. Von den vorstehenden Marker-Typen wurden chemilumineszente Marker als besonders nützlich befunden.
Eine Reihe chemilumineszenter Verbindungen sind bekannt. Einige davon werden von McCapra in Progress in Organic Chemistry 8 78(23) (1973), 231-277 diskutiert.
Viele der vorstehenden Verbindungen zeigen bei Behandlung mit Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff und Hydroxid Chemilumineszenz. Derartige Verbindungen umfassen Acridinium- Verbindungen und Acridane, welche die nachstehenden Strukturen I bzw. II aufweisen, sowie Verbindungen des Typs der nachstehenden Struktur III, IV und V:
Das GB-P-2 112 7798 (Campell et al., Anmelde-Nr. 8235019, eingereicht am 8. Dezember 1982) offenbart die Verwendung von Acridiniumestern der nachstehenden Struktur VI als chemilumineszenten Marker für biologische Sonden:
In der vorstehenden Formel ist X ein Anion, R&sub1; bedeutet H, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl- oder -Aryl-Substituenten, R&sub2; und R&sub3; sind Wasserstoff, Amino-substituierte Amino-, Carboxy-, Hydroxy-, Alkoxy-, Nitro- oder Halogen-Substituenten und R&sub4; ist eine gegebenenfalls substituierte Phenoxy-Gruppierung. Weeks et al., Clin Chen. 29/8 (1983), 1474-1479 offenbart zudem die Verwendung von Acridiniumestern der vorstehenden Formel als chemilumineszente Antikörper-Marker.
Der chenilumineszente Reaktionsmechanisnus für Acridinium- Verbindungen und Acridane wurde ziemlich gut ausgearbeitet. Im Fall von Acridinium-Verbindungen wird die chemilumineszente Reaktion durch Zugabe von Wasserstoffperoxid initiiert, gefolgt von Base. Wie in McCapra, "Chemiluminescent Reactions of Acridines", Chemistry of heterocyclic Compounds, Bd.9 (1973), 16-30 offenbart beinhaltet der Mechanismus offensichtlich den Angriff von Peroxid auf den Ring am Kohlenstoff in Position 9 mit nachfolgender Deprotonierung der Peroxidgruppe und nukleophilem Angriff auf das benachbarte Carbonyl, wobei ein Dioxetanähnliches Zwischenprodukt erhalten wird. Dies kann gleichzeitig mit Abspaltung einer austretenden Gruppe erfolgen, die beispielsweise ein Oxidanion sein kann (beispielsweise im besonderen Fall eines Acridiniumphenylesters, Abspaltung von Phenoxid). Die Addition von Wasserstoffperoxid sollte bekanntermaßen vor oder gleichzeitig mit Zugabe der Base erfolgen, da das Acridinium im Gleichgewicht mit seiner entsprechenden "Pseudobase" vorliegt (dargestellt durch Zugabe eines Hydroxidions an Position 9 des Rings). Die Pseudobase zeigt offensichtlich keine Chemilumineszenz und, um eine schnelle Licht-Emission von dem Acridinium zu erhalten, sollte der pH-Wert vor Zugabe von Wasserstoffperoxid niedrig sein, so daß das Gleichgewicht von Acridinium und seiner Pseudobase zugunsten des freien Acridiniums verschoben ist. Eine Erläuterung des Vorstehenden wird von Weeks et al., vorstehend geliefert.
Wie von McCapra in "Chemiluminescence of Organic Compounds", Progress in Organic Chemistry, Bd.8 (1973), 231-277 dargelegt, würde die Chemilumineszenz von Acridanen anscheinend beinhalten zuerst den Wasserstoff in Position 9 des Acridan- Ringes in Anwesenheit einer starken Base abzuspalten, um das entsprechende Acridananion zu bilden, das mit Sauerstoff in Position 9 des Rings reagiert, gefolgt von nachfolgender Dioxetanbildung und Abspaltung eines Oxids in ähnlicher Art und Weise wie bei Acridiniumverbindungen.
Der chemilumineszente Mechanismus für Acridiniumverbindungen oder Acridane würde in jedem Fall eine gute austretende Gruppe (beispielsweise Phenoxid) erfordern. Diese Notwendigkeit wurde von McCapra, Accounts of Chemical Research, Bd.9 Nr.6 (6/1976), 201-208, entdeckt, wo offenbart wird, daß die Quantenausbeute (bezogen auf die chemische Ausbeute des angeregten Produkts) mit abnehmendem pKa-Wert von ROH (wobei RO&supmin; das austretende Oxid-Anion ist) ansteigt. Das heißt, die Quantenausbeute steigt, wenn RO&supmin; eine bessere Austrittsgruppe ist.
Markierte Sonden werden häufig als eine Komponente eines Assay-Test-Kits auf eine biologische Zielverbindung hergestellt. Im allgemeinen enthalten die Kits eine markierte Sonde in Form einer wäßrigen Lösung. Die Schwierigkeit bei dieser Situation ist, daß chemilumineszente Verbindungen des vorstehenden Typs an der Gruppierung in Position 9 des Rings (der aktiven Gruppierung), die für Chemilumineszenz erforderlich ist hydrolysierbar sind. Im Fall von Acridiniumphenylestern beispielsweise ist der Carbonyl-Kohlenstoff der aktiven Estergruppierung sogar bei leicht sauren Bedingungen (beispielsweise pH- Wert 6) hydrolysierbar, wobei die entsprechende nicht-chemilumineszente Acridinsäure und die austretende Gruppe (die in diesem Fall das Phenoxid-Anion ist) erhalten wird. Eine derartige Hydrolyse kann vonstatten gehen, wenn eine Sonde, die den Marker trägt in einem Assay für eine Zielverbindung verwendet wird. Dies ist insbesondere der Fall, wenn die Sonde ein Oligonucleotid ist, das gemäß dem Assay-Protokoll bei erhöhten Temperaturen (beispielsweise 60ºC) und über längere Zeiträume (beispielsweise 2 Stunden) mit einer Zielverbindungssequenz hybridisieren soll.
Hinsichtlich der Pyridin- und Acridinanalogen wurden bezüglich der nukleophilen Addition an den Positionen C4 bzw. C9 allgemeine Arbeiten durchgeführt. Derartige Arbeiten sind beispielsweise beschrieben in Colowick et al., J. Biol. Chem., Bd.191 (1951), 447, Ludowieg et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Bd.14 (1964), 431 und im Text von Acheson "Acridines", veröffentlicht von John Wiley and Sons Inc., London, U.K. (1973).
Ein markierter spezifischer Bindungspartner aus einem an Progesteron gebundenen β-D-Thioglucose-Addukt von [2,6-Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium-9-carbonsäurefluorsulphonat ist in EP-A-0 322 926 offenbart, welche nur gemäß Art.54(3) Stand der Technik darstellt.

Definitionen

rlu - relative Lichteinheit. Wenn ein Photon den Photoelektronenmultiplier eines Luminometers trifft, setzt es eine elektronische Kaskade in Gang, die zu einem vorrichtungsspezifischen numerischen Wert führt. Die Wirksamkeit dieses Prozesses hängt von der Vorrichtung ab und die Einheiten werden daher relative Lichteinheiten genannt.
Addukt - betrifft ein einzelnes molekulares Produkt, das aus der Reaktion von zwei strukturell unterschiedlichen Reaktanten hervorgeht.
Spezifischer Bindungspartner - ein biologisches Molekül, das mit hoher Spezifität an ein anderes biologisches Molekül bindet. Beispielsweise ist jeder Antikörper und ein Analyt, an den der Antikörper spezifisch bindet, ein spezifischer Bindungspartner des anderen (manchmal als "Komplement" bezeichnet).
Aktive Gruppierung - eine Gruppierung eines chemilumineszenten Markers, der sich in einem Zustand befindet, wie er für die nachfolgende Anregung in die lumineszente Form erforderlich ist.
Anregung der Emission (light-off) - die spezifische Reaktion, mit der aus einem chemilumineszenten Marker auf Wunsch Chemilumineszenz erfolgt.
Reagenzien zur Anregung der Emission - Reagenzien, die dazu verwendet werden, die Emission (light off) eines chemilumineszenten Marker zu bewirken.
Inaktivierung - jede Reaktion, die dem chemilumineszenten Marker die Fähigkeit zur Chemilumineszenz zum Zeitpunkt der Anregung der Emission (light off) nimmt.
Addukt-Bildner - jede chemische Verbindung, die ausreichend reaktiv ist, um mit einer anderen Verbindung ein Addukt zu bilden.
Schutz-Addukt-Bildner - jeder Addukt-Bildner, der einen chemilumineszenten Marker vor Inaktivierung schützt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung gründet auf der Erkenntnis, daß die aktive Gruppierung eine gute austretende Gruppe besitzen sollte, um die maximale Quantenausbeute aus chemilumineszenten Markern des vorstehend beschriebenen Typs zu erhalten. Dies beinhaltet jedoch, daß die aktive Gruppierung gegenüber Inaktivierung empfindlicher wird, da der Kohlenstoff, an den die austretende Gruppierung gebunden ist, gegenüber unerwünschten Reaktionen, wie Hydrolyse oder vorzeitiger Chemilumineszenz empfindlicher wird. Diese Marker des vorstehend beschriebenen Typs, die die größte Quantenausbeute liefern würden, und daher verwendet werden könnten, um markierte Sonden mit hoher Sensitivität zu liefern, sind folglich auch diejenigen, die gegenüber Inaktivierung äußerst empfindlich sind. Hydrolyse von Markern ist eine besonders problematische Form der Marker- Inaktivierung. Die Inaktivierung von Markern führt zu einem Verlust der Sensitivität und Genauigkeit der Marker, insbesondere während der Lagerung von Kits, die markierte Sonden enthalten oder während des Assay-Verfahrens, das die Inaktivierung des Markers beschleunigt (beispielsweise Hybridisierung einer markierten Nucleotid-Sonde mit seinem spezifischen Bindungspartner, der in diesem Fall eine Zielverbindung-Nucleotidsequenz ist). Die vorliegende Erfindung liefert ein Mittel, durch das die Sensitivität des Markers gegenüber Inaktvierung verringert werden kann, was zu einer verbesserten Lagerbeständigkeit des Markers und einer erhöhten Sensitivität und Genauigkeit des Assays führt. Dies wird allgemein dadurch erreicht, daß Addukte der Marker mit geeigneten Schutz-Addukt-Bildnern hergestellt werden, die die aktive Gruppierung vor Inaktivierung schützen während die leichte Wiedergewinnung einer chemilumineszenten Form des Markers aus dem Addukt ermöglicht wird, was gewöhnlich nach Komplexbildung mit der biologischen Zielverbindung erfolgt.
Ein erster Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines markierten spezifischen Bindungspartners, welches umfaßt:
(a) einen chemilumineszenten Marker mit einer labilen, aktiven Gruppierung zur Verfügung zu stellen, die inaktiviert werden kann um eine nicht-chemilumineszente Form des Markers zu ergeben,
(b) ein Addukt aus einem Schutz-Addukt-Bildner mit dem Marker zu bilden, um die aktive Gruppierung vor Inaktivierung zu schützen, wobei aus dem Addukt eine chemilumineszente Form des Markers wiedergewonnen werden kann, und
(c) vor oder nach (b) einen spezifischen Bindungspartner mit dem Marker zu verknüpfen,
mit der Maßgabe, daß der markierte spezifische Bindungspartner kein an Progesteron gebundenes β-D-Thioglucose-Addukt von [2, 6-Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium-9-carbonsäurefluorsulphonat ist.
Es wird daher ein Verfahren zur Herstellung eines markierten spezifischen Bindungspartners zur Verfügung gestellt, welches eine Peptid- oder Nucleotid-Gruppierung oder einen anderen spezifischen Bindungspartner und einen chemilumineszenten Marker verwendet. Der Marker besitzt eine aktive Gruppierung, die für Chemilumineszenz erforderlich ist, die jedoch inaktivierbar ist und dabei eine nicht-chemilumineszente Form des Markers ergibt. Bei der Herstellung eines Addukts des Markers mit einem Schutz-Addukt-Bildner wird eine Schutzgruppierung für die aktive Gruppierung geliefert wobei die aktive Gruppierung vor Inaktivierung geschützt wird. Das Addukt kann entweder vor oder nach Verknüpfen des Markers mit der Sonde hergestellt werden. Bei Herstellung nach Verbinden des Markers mit der Sonde ist klar, daß es wünschenswerter ist, Bedingungen zu wählen, die der Sonde nicht schaden (d.h. die nicht dazu führen, daß ein erheblicher Teil der Sonde zum Nachweis des spezifischen Bindungspartners, für den sie gedacht war, nicht mehr effektiv ist). Im Fall chemilumineszenter Verbindungen, die nach Behandlung mit Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff und Base Chemilumineszenz zeigen bedeutet dies, daß die Schutzgruppierung nicht OH oder Peroxid (OOH) ist. Hydroxid wird nicht als Schutzgruppe betrachtet, da die Herstellung und Lagerung eines Addukts davon Lösungen erfordert, die ausreichend alkalisch sind, um eine schnelle Hydrolyse der aktiven Gruppe zu beschleunigen. H kann als Schutzgruppierung verwendet werden, was jedoch nicht bevorzugt ist, da die Bildung von Verbindungen wie Acridanen eine Reduktion mit Hydrid, eine Reaktion, die nicht ohne weiteres reversibel ist, erfordert. Peroxid ist auf der anderen Seite als Schutzgruppierung für die meisten chemilumineszenten Marker ungeeignet, da deren Anwesenheit vorzeitige Chemilumineszenz fördert. Die Schutzgruppierung wird zudem so gewählt, daß dem Addukt der Schutz entzogen werden kann, wobei eine chemilumineszente Form des Markers erhalten wird. Geschützte Formen derartiger Marker selbst sind ebenso wie mit spezifischen Bindungspartnern verbundene Marker erfindungsgemäß Der Schutz-Addukt-Bildner liefert. vorzugsweise durch eine leicht reversible Reaktion (am meisten bevorzugt eine leicht reversible Gleichgewichtsreaktion) eine Schutzgruppierung, so daß die Schutzgruppierung bei der Entfernung des Schutzes einfach abgespalten wird, wobei der chemilumineszente Marker wiedergewonnen wird.
Marker, die in dem vorstehenden Verfahren eingesetzt werden könnten, besitzen die folgende Formel:
worin:
der Phenyl- und der Pyridiniumring gegebenenfalls weiter substituiert ist,
Y für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine NH- Gruppe steht,
R&sub1; einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff oder ein Wasserstoffatom bedeutet,
R&sub4; eine austretende Gruppe ist,
-(C=Y)-R&sub4; eine aktive Gruppierung ist, die in den Marker und die (gespaltene) austretende Gruppe hydrolysierbar ist und in der ortho- oder para-Position mit dem Pyridiniumring verknüpft ist.
Die Schutzgruppe ist vorzugsweise ein Addukt eines Nucleophils an dem a-Atom der aktiven Gruppierung, d.h. im Fall der vorstehenden Struktur VI ein Kohlenstoff des Pyridinium-Rings.
Der Marker ist vorzugsweise eine Acridinium-Verbindung der Formel:
worin R&sub1; vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte Alkyl- Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe ist. R&sub2; und R&sub3; sind fakultative Substituenten und vorzugsweise ausgewählt unter H, einer Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe, einem Halogen-, einer Amido-, Acetyl-, Alkyl-, Alkenyl-, einer aryl-substituierten Acetyl-, einer substituierten Alkyl-, einer substituierten Alkenyl-, einer substituierten Aryl-, einer Alkyoxy- oder einer Aryloxygruppe. R&sub4; kann ein Halogen-, ein substituiertes Phosphor-, ein substituiertes Stickstoff-, ein substituiertes Bor- oder ein substituiertes Arsenatom sein. R&sub4; kann zusätzlich die Struktur -Z(R&sub5;) (R&sub6;) bedeuten, worin Z ein O, S, N ist und R&sub5; ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff ist. In dem vorstehenden ist R&sub6; H oder ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff wenn und nur wenn Z ein Stickstoffatom ist.
Am meisten bevorzugt ist der Marker ein Acridiniumester der Formel.
Natürlich können verschiedene mögliche Schutz-Addukt- Bildner gewählt werden, es ist jedoch bevorzugt, daß der Schutz-Addukt-Bildner ein Nudeophil ist, das ausgewählt ist unter einem primären Thiol, am meisten bevorzugt einem primären Alkyl oder Arylthiol.
Die vorliegende Erfindung liefert zudem geschützte chemilumineszente Marker, die als biologische Sonden wie nachstehend beschrieben nützlich sind. In den folgenden Formeln ist -(C=Y)-R&sub4; eine aktive Gruppierung des in Verbindung mit dem vorstehenden Verfahren beschriebenen Typs, während M eine Schutzgruppierung außer H oder OH oder OOH (Peroxid) ist. Die Schutzgruppierung ist abspaltbar, wobei der ungeschützte chemilumineszente Marker erhalten wird, und ist so gewählt, daß der C--Y- Kohlenstoff in dem geschützten Marker weniger hydrolyseempfindlich ist als in dem ungeschützten Marker. R&sub4; (die austretende Gruppe) enthält vorzugsweise eine funktionelle Gruppe, die leicht mit einer biologischen Sonde verknüpft werden kann, oder die bereits mit der Sonde verknüpft sein kann.
Die geschützten Marker besitzen vorzugsweise entweder die nachstehende Formel IXb oder IXc.
Die vorstehenden geschützten chemilumineszenten Marker des Typs IXb oder IXc können als Addukt eines Schutz-Addukt- Bildners, der M enthält, mit Markern der vorstehenden Struktur VI betrachtet werden, wobei M- an das Kohlenstoffatom in α- Position zur aktiven Gruppe gebunden ist. Die am meisten bevorzugten geschützten Marker sind Acridiniumester der folgenden Formel:
worin M vorzugsweise ein primäres Thiol ist.
Bevorzugte Addukt-Bildner, die Schutzgruppierungen (M) bilden, umfassen Natriumbisulfit, Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Hydroxylamin, 2,5-Dimercapto-1,3,4-thiadiazol, 4-Hydroxythiophenol, 4-Aminothiophenol und 3-Mercaptopropionsäure. Primäre Thiole sind bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiter biologische Sonden, die mit geschützten Markern des vorstehend beschriebenen Typs verknüpft sind.

Zeichnungen

Erfindungsgemäße Ausführungen werden nun unter Bezug zu den Zeichnungen beschrieben, worin:
Fig.1: ein Graph ist, der die Stabilität von erfindungsgemäßen geschützten Markern in Abhängigkeit von der Zeit zeigt (siehe Beispiel 1);
Fig.2: ein partielles ultraviolettes Spektrum ist, das die Abhängigkeit von den Markern durch Schutz-Addukt-Bildner angebotenem Schutz in Abhängigkeit von der Konzentration des Schutz-Addukt-Bildners zeigt;
Fig.3: ein Graph ist, der die Abhängigkeit der Bildung von erfindungsgemäßen Addukten von der Konzentration des Schutz- Addukt-Bildners zeigt (siehe Beispiel 3);
Fig.4: eine einfach reversible Gleichgewichtsreaktion für die Bildung eines spezifischen geschützten erfindungsgemäßen Markers zeigt (siehe Beispiel 4);
Fig.5: ein Graph ist, der die Wiedergewinnung des Signals und daher die Wiedergewinnung des vom Schutz befreiten Markers von dem geschützten erfindungsgemäßen Marker mittels Oxidation des Addukt-Bildners zeigt (siehe Beispiel 6);
Fig.6: die Temperaturstabilität von erfindungsgemäßen Addukten zeigt (siehe Beispiel 8);

Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung

Ein Verfahren zur Auswahl geeigneter Schutz-Addukt-Bildner zur Bildung erfindungsgemäß geschützter Marker wird zuerst beschrieben. Zudem wird ein Verfahren zur Verknüpfung spezifischer Bindungspartner mit den Markern beschrieben. Weiterhin wird die Abhängigkeit des Schutzes erfindungsgemäß geschützter Marker vor Inaktivierung durch Peroxid in Abhängigkeit von der Konzentration von Addukt-Bildnern erläutert. Die weiteren Beispiele zeigen neue Wege erfindungsgemäß geschützte Marker in ungeschützte Marker durch 1) Verdünnung, 2) generelle Oxidation, 3) spezifische Oxidation umzuwandeln. Anschließend wird die Nützlichkeit von Schutz-Addukt-Bildnern bei der Manipulation von Acridiniumestern gezeigt.
Im Fall von Acridiniumester-Markern der vorstehenden Formel VII kann ein Schutz der aktiven Gruppierung, insbesondere des C=Y-Kohlenstoffs (beispielsweise Carbonyl) vor Hydrolyse dadurch erreicht werden, daß ein Addukt zwischen einem geeigneten Nudeophil und dem Marker hergestellt wird, wobei das Addukt an dem zur aktiven Gruppe α-ständigen Kohlenstoff gebildet wird (d.h. dies wird insbesondere ein Pyridinium-Ring- Kohlenstoffatom sein). Potentiell geeignete Schutz-Addukt- Bildner können in diesem Fall gesichert werden, indem deren Fähigkeit zur Verringerung der Hydrolyse der aktiven Gruppierung experimentell bestimmt wird. Eine derartige Technik ist nachstehend in Beispiel 1 gezeigt.

Beispiel 1

Verfahren zur Auswahl von Schutz-Addukt-Bildnern

Verschiedene Nudeophile wurden als potentielle Schutzgruppen für Acridiniumphenylester der folgenden Formel gewählt:
Die Fähigkeit eines jeden Nucleophils als Schutzgruppe zu fungieren wurde experimentell gesichert, indem das Nudeophil (in Form eines potentiellen Addukt-Bildners, der als "Agenz" in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt ist) mit der folgenden wäßrigen Testlösung vermischt wurde:
0,5 M Phosphatpuffer ("PB") - pH 6,
0,1 % Natriumdodecylsulfat ("SDS")
0,5 µm des Agenz
10&sup6; rlu einer biologischen Sonde in Form eines 26 Basen- Oligonucleotids, das mit einem substituierten Acridiniumphenylester markiert war.
Das Markieren der Oligonucleotid-Sonde kann mittels des in der anhängigen US-Patentanmeldung mit dem Titel "Acridiniumester-Markierung und Reinigung von Nucleotid-Sonden", die am S. Oktober 1987 mit der Serien Nr. 105,080 eingereicht wurde und der entsprechenden EP-A-0 312 248, die am 19.4.1989 veröffentlicht wurde, beschriebenen Verfahrens erreicht werden.
Das vorstehende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 min inkubiert und anschließend bei 60ºC inkubiert und ein Teil zu den in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigten Zeitpunkten entnommen. Der Teil wurde dann in 100 µl 0,5N HNO&sub3; gegeben, um Sicherzustellen, daß jegliche vorhandene Pseudobasen-Form des Acridiniumesters in den freien Ester umgewandelt wurde. Die Anregung der Emission erfolgte dann durch Zugabe von 100 µl 0,2 % H&sub2;O&sub2; zu der Salpetersäure-Lösung gefolgt von 200 µl alkalischem Phosphatpuffer (pH 12,75). Die Licht-Emissions-Messungen wurden zudem bei einer Reihe von Kontrollen durchgeführt, welche aus dem vorstehenden Gemisch ohne die zu untersuchende potentielle Addukt-bildende Verbindung (d.h. das "Agenz") bestand. Die Lichtemission wurde über eine Zeitpanne von jeweils etwa 10 Sek. gemessen und der so zu den jeweiligen Zeitpunkten erhaltene Wert (in Tausend rlu) ist in Tabelle 1 nachstehend aufgeführt. Die nukleophile Komponente der untersuchten Agenzien wurde dann als potentiell geeigneter Schutz-Addukt-Bildner betrachtet, wenn die Lichtemission zu jedem Zeitpunkt, später als 0 Min. erheblich größer war als in der Kontrolle. Aufgrund des vorstehenden Kriteriums werden Anzeichen jener Addukt-Bildner, von denen man annimmmt, daß sie geschützte erfindungsgemäße Marker ergeben könnten und die für das erfindungsgemäße Verfahren potentiell geeignet sind, mit einem "Y" in der Spalte, die in nachstehender Tabelle 1 mit "Potentiell geeignet" überschrieben ist, angegeben. Tabelle 1 Agenz Zeit (min) Raumtemperatur Potentiell geeignet Kontrolle Natriumbisulfit Natriumisothiocyanat Thioharnstoff Mercaptoethanol Dithiothreitol Hydroxylamin N,N-Dimethylhydroxylamin N--Bromsuccinimid N-Iodsuccinimld N-Hydroxysuccinimid Periodat Wasserstoffperoxid Imidazol Hypochlorit Analin Azid Ethylendiamin Hydrazin 2,5-Dimercapto-1,3,4-thiadiazol Cysteamin 4-Hydroxythiophenol Natriumcyanid Thioessigsäure Natriumthiosulfat 4-Aminothiophenol 3-Mercaptopropionsäure Thiosalicylsäure Mercaptoetansulfonsäure Natriumhydrosulfit Mercaptosuccinsäure Cystein 2-Aminoethanthiol * Diese Werte wurden bei 45 min statt bei 60 min abgelesen. (Werte sind in 1000 rlus angegeben)
Die Ergebnisse einiger in Tabelle 1 aufgeführter potentieller Addukt-Bildner sind in Fig.1, aufgetragen als Graph von:
log[100 x (rlu zum Zeitpunkt)/rlu zum Zeitpunkt 0)] gegen die Zeit gezeigt. Wie sowohl aus Tabelle 1 als auch aus Fig.1 ersichtlich lieferten viele der untersuchten Agenzien Schutz-Gruppierungen, die die Inaktivierung des Markers verringerten. Diese Addukt-Bildner werden in vorstehender Tabelle 1 in der Spalte "potentiell geeignet mit einem "Y" gekennzeichnet.
Der durch die Schutz-Gruppierungen der Agenzien, die potentiell geeignete Schutz-Addukt-Bildner sind, verliehene Schutz, liefert insbesondere zwei mögliche Vorteile. Erstens ist die Lagerbeständigkeit der spezifischen Bindungspartner, die mit geschützten Markern markiert sind, größer als die von Sonden mit den entsprechenden ungeschützten Markern. Zweitens ist ein derartiger Schutz während der Komplex-Bildung des markierten spezifischen Bindungspartners mit seinem Komplement unter erschwerten Bedingungen, die eine Hydrolyse des Markers fördern könnten, besonders vorteilhaft. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn der spezifische Bindungspartner eine Oligonucleotid-Sonde ist, die während des Assays mit einer komplementären Zielverbindung bei erhöhten Temperäturen und über einen längeren Zeitraum hybridisiert werden soll. Wie in Tabelle 1 und Fig.1 gezeigt, steigert eine erhöhte Temperatur von 60ºC die Frequenz, mit der der ungeschützte Narker inaktiviert wird beträchtlich, wobei dieser offensichtlich in eine nicht- chemilumineszente Form hydrolysiert wird. Aus Tabelle 1 und Fig.1 ist zudem ersichtlich, daß die anfängliche Licht-Emission des ungeschützten Markers in vielen Fällen erheblich geringer ist, als die von dem entsprechenden ungeschützten Marker. Dies ist offensichtlich das Ergebnis davon, daß das Addukt während der Anregung der Emission (light-off) im Wettbewerb mit Wasserstoffperoxid mit dem Marker eine starke Verbindung bildet. Wie nachstehend ersichtlich wird, können diese verlorenen rlus" der Licht-Emission mittels Techniken, die beschrieben werden, wiedergewonnen werden.
Es sollte daran gedacht werden, daß die Tatsache, ob ein potentiell geeigneter Schutz-Addukt-Bildner in einer gegebenen Situation wirklich geeignet ist, von den spezifischen Bindungspartner abhängt, mit dem der Marker verwendet wird. Es wurde beispielsweise gefunden, daß, wenn der spezifische Bindungspartner ein Oligonucleotid ist, die Verwendung von Bisulfit die Hybridisierung stark vermindert. Dies beruht wahrscheinlich auf der einhergehenden Zersetzung von Cytosin zu Uridin, wobei die Homologie zwischen der Sonde und deren Zielverbindung (d.h. deren Komplement) verringert wird. In einem speziellen Fall sollte man daher ungünstige Auswirkungen eines potentiell geeigneten Schutz-Addukt-Bildners auf den spezifischen Bindungspartner, mit dem er verwendet werden soll, untersuchen.

Beispiel 2

Konzentrations-Abhängigkeit des Schutzes vor Peroxid

Dieses Beispiel erläutert die Abhängigkeit der Bildung von geschützten erfindungsgemäßen Markern von der Konzentration des Addukt-Bildners. 5 Lösungen mit jeweils dem folgenden Inhalt wurden hergestellt:
0,5 M Phosphatpuffer (pH 6,0)
0,1 % SDS
80 nM Acridiniumphenylester-Marker; steigende Mengen des Addukt-Bildners 3-Mercaptopropionsäure ("MPA") wurden zugesetzt, um Konzentrationen von 0 bis 10 mM zu erreichen. Ultraviolett-("UV")-Abtastungen der so erhaltenen Gemische wurden dann in dem Bereich von 300 - 240 nm erhalten. Diese Abtastungen sind in Fig.2 erläutert.
Die Absorption bei 260 nm entspricht der nicht als Addukt vorliegenden Form der Acridinium-Ringstruktur. Wie daher aus Fig.1 ersichtlich, bewirken erhöhte Konzentrationen der Addukt- Bildner eine entsprechende Abnahme in der Absorption bei 260 nm aufgrund der Umwandlung der Acridinium-Ringstruktur in ein Addukt. Zudem wurde beobachtet, daß sich die Addukt-Menge bei einer gegebenen Konzentration an MPA mit der Zeit nicht erheblich änderte. Dies zeigt, daß sich das Addukt mit der freien Acridiniumstruktur in einem dynamischen Gleichgewicht befindet.

Beispiel 3

Durch Chemilumineszenz ersichtliche Konzentrations-Abhängigkeit des Schutzes vor Peroxid

Dieses Beispiel zeigt auch, daß, wie in Beispiel 2, das Ausmaß der Bildung von geschütztem Marker von der Konzentration des Addukt-Bildners abhängig ist.
In diesem Beispiel wurden verschiedene Lösungen der folgenden Zusammensetzung hergestellt, indem 1 µl einer Lösung, die die mit Acridiniumester markierte Sonde enthielt, zu 100 µl 0,5 N HNO&sub3; gegeben wurden und anschließend die erforderliche Menge Addukt-Bildner (3-Mercaptopropionsäure) zugesetzt wurde, um die in Fig.3 gezeigten Konzentrationen an Addukt-Bildner zu erhalten. Die Anregung der Emission (light-off) wurde dann durch Zugabe von 100 µl 0,2 % H&sub2;O&sub2; (Gew./Vol.) und anschließender Zugabe von 200 µl alkalischem Phosphatpuffer mit einem pH- Wert von 12,75 erreicht. Die so erhaltenen Licht-Emission gegen den Logarithmus der Konzentration des Addukt-Bildners (in mM) ist in Fig. 3 dargestellt.
Fig.3 zeigt darüber hinaus die Abhängigkeit der Bildung eines Teils der erfindungsgemäß geschützten Marker von der Konzentration des Addukt-Bildners. D.h. je höher die Konzentration des Addukt-Bildners ist, desto höher wird der Anteil des Markers sein, der in der geschützten Form vorliegt. Dieses Ergebnis weist auch darauf hin, daß, zumindest mit den Addukt-Bildnern des voliegenden Beispiels der chemilumineszente Marker aus seiner nicht-chemilumineszenten Form wiedergewonnen werden kann, indem die Addukt-Bildner-Konzentration verringert wird.

Beispiel 4

Nachweis der Reversibilität durch Verdünnung

Ein Mittel die Addukt-Bildner-Konzentration zu verringern, um den chemilumineszenten Marker wiederzugewinnen, besteht einfach darin, eine Lösung, die den Marker und den Addukt-Bildner enthält,zu verdünnen. Diese Technik wird natürlich nur dann wirksam sein, wenn eine Lösung gewählt wird, bei der die allgemeine chemische Lösung so ist, daß bei Verdünnung eine Verschibung der Gleichgewichtsreaktion zwischen dem Addukt-Bildner und dem Marker zugunsten der Bildung des geschützten Markers erfolgt. Bei Verwendung eines primären Thiols als Addukt-Bildner würde die Gleichgewichtsreaktion folgendermaßen aussehen:
RSH + Acr&spplus; == H&spplus; + RSAcr
In dem Vorstehenden ist RSH der Addukt-Bildner in Form eines primären Thiols, Acr&spplus; stellt den ungeschützten Acridiniumester- Marker dar und RSAcr ist das Acridinium-Addukt (d.h. der geschützte Marker). In einem derartigen System bleibt in Anwesenheit eines Puffers die H&spplus;-Konzentration konstant, so daß Verdünnung der Lösung zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zur linken Seite führt, mit der folgerichtigen Entfernung des Schutzes von dem geschützten Acridiniumester-Marker, wobei der chemilumineszente Acridiniumester-Marker wiedergewonnen wird.
Um dies zu erläutern wurde eine Versuchslösung hergestellt, indem zu einer Lösung von Acridiniumphenylester in Phosphatpufferlösung (pH 6,0) eine Lösung des Addukt-Bildners 3-Mercaptopropionsäure zugesetzt wurde, wobei die Endkonzentration des Addukt-Bildners auf 10 nim eingestellt wurde. Diese Lösung wurde dann verdünnt, um die so erhaltenen Versuchsproben, die unterschiedliche Konzentrationen des Addukt-Bildners enthielten, wie in Fig.4 gezeigt, herzustellen. Die Anregung der Emission (light-off) dieser Versuchsproben wurde dann dadurch erreicht, daß den verdünnten Proben 100 µl 0,5 N HNO&sub3; gefolgt von 100 µl 0,2 % H&sub2;O&sub2; und anschließend 200 µl alkalischer Phosphatpuffer pH 12,75 zugesetzt wurden. In Fig.4 ist die auf die Verdünnung berichtigte Lichtemission gegen die Konzentration sowohl für die Versuchsproben, als auch für die Kontrollproben, die entsprechend der gleichen Technik, allerdings ohne Schutz- Addukt-Bildner hergestellt wurden, gezeigt.
Aus Fig.4 wird deutlich, daß für den Schutz-Addukt-Bildner 3-Mercaptopropionsäure die Gleichgewichtsreaktion der vorstehenden Gleichung (1) eine leicht reversible Gleichgewichtsreaktion ist. Insbesondere läßt sich mit diesem Addukt-Bildner der chemilumineszente Marker mit Verfahren leicht wiedergewinnen, die das Gleichgewicht zugunsten der Entfernung des Schutzes des geschützten Markers verschieben, beispielsweise durch Verdünnung bei im wesentlichen konstantem pH-Wert.

Beispiel 5

Reversion durch Waschen nach Binden an einen festen Träger

In dem Fall, in dem der spezifische Bindungspartner eine Oligonucleotid-Sonde ist, die mit einem erfindungsgemäß geschützten Marker markiert ist und die so erhaltenen Sonden/Zielverbindungs-Hybride an einen festen Träger gebunden sind, kann die in vorstehenden Beispiel 4 beschriebene Verdünnung einfach durch Waschen des Trägers nach Hybridisierung erreicht werden. Dies wird durch das vorliegende Beispiel erläutert. "Markierte Sonden-Hybride" wurden unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt und behandelt:
i) ein Hybrid zwischen einem 26 Basen langen Oligonucleotid, das mit einem Acridiniumphenylester markiert war und einer Ziel-Nucleotid-Sequenz wurde in Phosphatpuffer ("PB"), pH 6,0, vorgebildet;
ii) eine - hybridisierte, markierte Sonde wurde von der nicht-hybridisierten Sonde an einem festen Träger abgetrennt und der feste Träger wurde dann mit PB, pH 6,0, gewaschen;
iii) 50 µl der Aufschlämmung aus Schritt (ii) wurde mit Salpetersäure behandelt und Emission erfolgte in der gleichen Art und Weise, wie in Verbindung mit Beispiel 4 beschrieben; die Lichtemission ist in Tabelle 2 unter "Prä-Addukt" aufgeführt (alle Lichtemissionen in Tabelle 2 sind in rlus);
iv) dem Rest der Aufschlämmung aus Schritt (ii) wurde ausreichend 3-Mercaptopropionsäure (Schutz-Addukt-Bildner) zugesetzt, um dessen Konzentration auf 10 mM einzustellen;
v) eine weitere 50 µl Teilmenge der Aufschlämmung aus Schritt (iv) wurde dann in der gleichen Art und Weise wie in Schritt (iii) zur Emission gebracht und die Emission in nachstehender Tabelle 2 unter "nach der Bildung" aufgeführt;
vi) der Rest der so erhaltenen Aufschlämmung aus Schritt (iv) wurde einmal mit PB gewaschen und eine 50 µl Teilmenge wurde unter Verwendung des Verfahren des vorstehenden Schritts (iii) zur Emission gebracht; die so erhaltene Emission ist in Tabelle 2 unter "Nach 1. Waschschritt" aufgeführt.
vii) Der Rest der Aufschlämmung aus Schritt vi) wurde erneut mit PB gewaschen und eine weitere Teilmenge wurde dann unter Verwendung des Verfahrens des vorstehenden Schritts (ii) zur Emission gebracht; die Emission ist in nachstehender Tabelle 2 unter "Nach 2. Waschschritt" aufgeführt.
Das vorstehende Verfahren wurde auch mit einer Kontrolle und einer Blindprobe wiederholt, wobei bei der Kontrolle kein Schutz-Addukt-Bildner (d.h. keine 3-Mercaptoprpionsäure) zugesetzt wurde und im Fall der Blindprobe kein Oligonucleotid vorhanden war. Die Lichtemission von der Kontrolle und der Blindprobe ist nachstehend in Tabelle 2 in den Zeilen mit der Beschriftung "kontrolle" bzw. "blindprobe" aufgeführt. Tabelle 2 Prä-Addukt Nach der Bildung Nach 1. Waschschritt Markierte sonden-Hybride Kontrolle Blindprobe
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wandelte MPA fast den gesamten Marker wirksam in einen geschützten, nicht-chemilumineszenten Marker um, was durch die Lichtemission in der Spalte "nach der Bildung" gezeigt ist. Weiterhin wurde die Entfernung des Schutzes durch Waschen mit PB einfach erreicht, wobei der ungeschützte, chemilumineszente Marker erhalten wurde und wobei ein Waschschritt ebenso wirksam war wie zwei Waschschritte. Für den Zweck eines klinischen Assays natürlich würde gewöhnlich vor dem Assay ein Test-Kit vorbereitet werden&sub1; der die nichthybridisierte Sonde, die mit einem erfindungsgemäß geschützten Marker markiert ist, enthält, um die Inaktivierung des Markers sowohl während der Lagerung der markierten Sonde, als auch während der Inkubation in dem Assay-Verfahren auf ein Minimum zu beschränken. Die gleichen qualitativen Ergebnisse aus Tabelle 2 würden in dieser Situation jedoch ebenfalls erwartet werden.

Beispiel 6

Reversion durch Oxidation mit Fe(CN)&sub6;³&supmin;

Wie in den vorstehenden Beispielen erläutert wurde ist die Gleichgewichtsreaktion zwischen diesen Schutz-Addukt-Bildnern und einem Marker, wie einem Acridiniumester-Marker, leicht reversibel, wobei der chemilumineszente nicht-geschützte Marker wiedergewonnen werden kann. Es wurde gezeigt, daß Verdünnung einen Weg darstellt, das Gleichgewicht zugunsten des ungeschützten Markers zu verschieben, wobei jedoch andere Verfahren zum Verschieben des Gleichgewichts bekannt sind. Das vorliegende Beispiel zeigt ein derartiges anderes Verfahren, genauer, die Oxidation des Schutz-Addukt-Bildners. In diesem Beispiel wurde das folgende Verfahren angewendet.
i) eine Oligonucleotid-Sonde mit 26 Basen, die mit einem Acridiniumphenylester markiert war, wurde in PB (pH 4,9) gemischt;
ii) eine ausreichende Menge des Schutz-Addukt-Bildners, 4- Hydroxythiophenol wurde zugesetzt, um dessen Konzentration auf 7,5 mM einzustellen;
iii) 5 µl Teilmengen der Lösung aus dem vorhergehenden (ii) wurden zu jeweils 5 4 Teilmengen einer Kaliumferricyanid-Lösung [K&sub3;Fe(CN)&sub6;] der in Fig.5 gezeigten Konzentrationen gegeben, was eine Reihe von Versuchsproben ergab;
iv) jede der Versuchsproben aus dem vorhergehenden Schritt (iii) wurde dann nach dem in Verbindung mit Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Emission gebracht, d.h. durch Zugabe von Salpetersäure gefolgt von Behandlung mit Wasserstoffperoxid und anschließend mit alkalischem Phosphatpuffer, pH 12,75.
Das gleiche Verfahren wurde unter Verwendung einer Kontrolle, in der kein Addukt-Bildner (4-Hydroxythiophenol) enthalten war, wiederholt. Die Ergebnisse der Lichtemission der Versuchsproben sind in Fig.5 als Lichtemission in Form der prozentualen Emission aus der Probe im Vergleich mit der entsprechenden Kontrollprobe, gegen die Ferricyanid-Konzentration in der Lösung, zu der die markierte Probe zugesetzt wurde (die Ferricyanid-Konzentration in den so erhaltenen Proben sind dann ½ der in Fig.5 aufgeführten Konzentration), aufgeführt.
Wie aus Fig.5 ersichtlich ist, ist die Oxidation des Addukt-Bildners 4-Hydroxythiophenol ebenfalls ein sehr effektiver Weg, mit dem das Gleichgewicht verschoben werden kann, um den Schutz von dem geschützten Marker zu entfernen und den ungeschützten chemilumineszenten Marker wiederzugewinnen. In einem klinischen Assay würde ein derartiger Schritt der Entfernung des Schutzes gewöhnlich nach der Bildung des Komplexes zwischen der markierten Sonde und der Zielverbindung, vor der Anregung der Emission (light-off), erfolgen.

Beispiel 7

Reversion von Addukten durch Reaktion mit einem Thiol-spezifischen Reagenz

Die vorstehend in Beispiel 6 gezeigte Reversion verwendet ein unspezifisches Oxidationsmittel. Hier wird die Verwendung eines spezifischen Reagenz gezeigt. In diesem Fall ist Aldrithiol (2,2'-Dithiodipyridin) ein nützliches Reagenz, um die Addukt-Bildung umzukehren, da der Schutz-Addukt-Bildner ein reaktives primäres Thiol ist. Dieser Reaktant schöpft nicht alle Möglichkeiten aus und andere Thiol-spezifische Reagenzien oder Reagenzien, die für andere Schutz-Addukt bildende Nudeophile spezifisch sind, können verwendet werden. Das folgende Verfahren wurde verwendet:
i) Eine mit einem Acridiniumester markierte Oligonucleotid-Sonden-Lösung wurde durch Zugabe der Sonde zu einer Lösung von 50 % Formamid (Vol.), 0,2 M PB pH 6,0, hergestellt;
ii) Lösungen des Addukt-Bildners 2-Mercaptoethansulfonsäure ("2MESA") und Lösungen von Aldrithiol wurden jeweils in einer Konzentration von 0, 0,1, 1 und 10 mM in dem vorstehenden Puffer bzw. 100 % Formamid hergestellt;
iii) 100 µl der Addukt-Lösung und 100 µl Aldrithiol-Lösung wie in nachstehender Tabelle 3 gezeigt, wurden zu 100 µl der Sonden-Lösung gegeben;
iv) die so hergestellten Proben wurden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Anregung der Emission (light-off) wurde dann durch Zugabe von 200 µl 0,4 N HNO&sub3; mit 0,1 % H&sub2;O&sub2; und anschließend 200 µl 1N NaOH erreicht.
Die Ergebnisse in nachstehender Tabelle 3 zeigen, daß eine stöchiometrische Umkehrung durch wirksames Reduzieren der Konzentration des Addukt-Bildners in Lösung erfolgt. Tabelle 3 Konz. von 2MESA (nM) Aldrithiol

Beispiel 8

Verminderte Temperaturempfindlichkeit bei Verwendung von Addukten

Um die Temperatur-Stabilität von erfindungsgemäß geschützten Markern zu zeigen, wurden 2 wäßrige Proben der folgenden Lösungen hergestellt:
"DIBSS-Mix" (d.h. 45 Gew.-% Diisobutylsulfonsäuresuccinat < "DIBBS"> , plus Phosphatpuffer, Ethylendiamintetraacetat < "EDTA"> und EGTA < Ethylenglycol-bis-(B-aminoethylether)- N,N,N',N'-tetraessigsäure> Mix pH 6,0);
10&sup6; rlu mit Acridiniumphenylester markiertes Oligonucleotid mit 26 Basen.
Zwei DIBBS-Lösungen wurden mit 0 oder 5 mM 4-Hydroxythiophenol hergestellt. 2 µl der Sonde in 3 % LDS (Lithiumdodecylsulfat) wurden zu 20 µl des jeweiligen DIBSS-Mix gegeben. Jeder Temperaturpunkt wurde mit einer einzelnen Probe, die wie vorstehend hergestellt wurde, durchgeführt. Die Proben wurden für 5 min Inkubation bei steigenden Temperaturen in ein Wasserbad überführt. Die Anregung der Emission (light-off) wurde dann für jede Teilmenge unter Verwendung von Wasserstoffperoxid gefolgt von Salpetersäure und dann Base erreicht. In Fig.6 ist die Lichtemission gegen die Temperatur für die Teilmengen der zwei Proben aufgetragen.
Wie aus Fig.6 ersichtlich ist, produzierte das 4-Hydroxythiophenol offensichtlich ein Addukt des Acridiniumesters, das bei erhöhten Temperaturen erheblich stabiler war, als der Acridiniumester selbst. Geschützte erfindungsgemäße Marker sind daher besonders vorteilhaft, wenn die Sonde, an die sie gebunden sind, ein Oligonucleotid ist und es ist erwünscht erhöhte Hybridisierungstemperaturen zu verwenden.

Beispiel 9

Verbesserung der Wiedergewinnung des Signals nach langer Hybridisierungsdauer

Die Auswirkungen des Schützens eines Markers, der mit einer Oligonucleotidsonde verknüpft ist, während langer Hybridisierungszeiträume werden nun erläutert. In diesem Beispiel wurden 3 Versuchslösungen unter Verwendung des gleichen Gemisches wie in Beispiel 8 hergestellt, wobei in einer Probe kein Schutz-Addukt-Bildner verwendet wurde, in einer zweiten Probe 3-Mercaptopropionsäure verwendet wurde, und in einer dritten Probe 4-Hydroxythiophenol verwendet wurde. Jeder der Schutz- Addukt-Bildner und der Acridiniumester würde dann den entsprechenden geschützten Marker bilden. Eine Teilmenge aus jeder der vorstehenden Lösungen wurde dann mit der gleichen Ziel- Nucleotidsequenz rRNA bei 60ºC für 2,5 Std. hybridisiert. Jede Probe war an Hydroxyapatit gebunden und der Überstand wurde als "Nichtgebundenes" entfernt, wobei der Träger einmal mit Phosphatpuffer gewaschen wurde und die Waschlösung als "Waschlösung" aufbewahrt wurde. Die Lichtemission von dem Träger, von dem "Nichtgebundenen" und der "Waschlösung" wurde unter Verwendung des Verfahrens zur Anregung der Emission (light- off) aus Beispiel 5 gemessen. Die Lichtemission ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Wiedergewinnung des Signals nach 2,5 Std. Hybridisierung Schutz-Addukt-Bildner Träger rlus Nicht-Gebundenes Waschlösung Keiner 4-Hydroxythiophenol 3-Mercaptopropionsäure
Es ist anzumerken, daß das Signal in den mit Addukten geschützten Proben fast 3 Mal größer ist als in der Kontrollprobe. Alle Versuche enthielten eine Marker-Menge, die die gleichen rlus ergeben konnten.
Die Ergebnisse aus Tabelle 4 zeigen somit, welche Auswirkung eine zur Verfügung gestellte Schutzgruppe für einen mit einem Oligonucleotid verknüpften Acridiniumester-Marker bei Oligonucleotid/Ziel-Hybridisierung über lange Zeiträume aufweist. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ermöglichen die erfindungsgemäßen geschützten Marker eine verbesserte Wiedergewinnung des Signals (d.h. sie zeigen eine langsamere Marker- Inaktivierung) im Vergleich mit ungeschützten Markern und ermöglichen daher einen Zielverbindung-Assay mit erhöhter Sensitivität. Dies gilt insbesondere bei langen Inkubationszeiträumen (beispielsweise länger als etwa 2 Std.)

Beispiel 10

Verbesserte Lagerungsstabilität durch Verwendung von Addukten

Wie in den vorstehenden Beispielen gezeigt, weist die erhöhte Stabilität zahlreiche Vorteile auf. Von besonderem Interesse ist die verbesserte Lagerung einer mit Acridiniumester markierten Sonde. Um diese verbesserte Lagerungsstabilität zu erläutern wurden die folgenden Bedingungen verwendet. Eine Lösung wurde wie nachstehend hergestellt:
0,1 M Lithiumsuccinat, pH 5,2
0,1 % Lithiumlaurylsulfat
mit Acridiniumester markierte DNA-Sonde
10 mM 3-Mercaptopropionsäure (in vorliegender Kontrollprobe nicht vorhanden).
Diese Lösung wurde auf chemilumineszente Aktivität des Markers untersucht, indem 5 µl einer 100-fachen Verdünnung der Lösung zu 300 µl 50 % Formamid, 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0 gegeben wurden wobei die Anregung der Emission (light-off) wie in Beispiel 7 vorstehend erreicht wurde. 1 ml Teilmengen der Lösung wurden dann lyophilisiert und die so erhaltenen Pellets wurden bei 45ºC für 1 bis 3 Tage inkubiert. Diese wurden dann wieder auf das ursprüngliche Volumen gebracht und auf Retention chemilumineszenter Aktivität untersucht, die nachstehend als Prozentsatz aufgeführt ist. % verbleibende anfängliche Aktivität Tag Kein Addukt Mit Addukt
Es ist offensichtlich, daß ein erhebliches Ausmaß an verbesserter Stabilität erhalten wird, wenn die Lagerung als Addukt erfolgt. Die verwendete erhöhte Temperaturbedingung ist ein üblicher Weg um abzuschätzen, wie gut die Stabilität für längere Zeiträume bei niedrigeren Temperaturen sein wird.

Zusammenfassung der Beispiele

Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich, daß ein chemilumineszenter Marker geschützt werden kann durch Verwendung verschiedener Addukt-Bildner zur Bildung eines geschützten Markers, der aufgrund der Anwesenheit der Schutzgruppierung aus dem Addukt-Bildner gegenüber Inaktivierung, wie durch Hydrolyse, weniger empfindlich sein kann als der ungeschützte Marker. Vorstehend wurde zudem gezeigt, daß in vielen Fällen die Reaktion des Schutz-Addukt-Bildners mit dem Marker eine Gleichgewichtsreaktion ist, die häufig durch Verfahren wie Verdünnung oder Oxidation des Addukt-Bildners einfach umgekehrt werden kann. Es ist jedoch im Fall von einfach umkehrbaren Gleichgewichtsreaktionen vom vorstehenden Typ klar, daß viele andere Mittel zur Verschiebung des Gleichgewichts zugunsten des ungeschützten Markers vorstellbar sind. Im Fall der Bildung eines geschützten Phenylacridinium-Markers unter Verwendung des Addukt-Bildners 3-Mercaptopropionsäure beispielsweise wurde das Gleichgewicht zugunsten des ungeschützten Markers verschoben, indem N-Ethylmaleimid oder 2,2'-Dithiodipyridin zugesetzt wurde. Es ist auch klar, daß verschiedene andere Addukt-Bildner zur Verknüpfung von Schutzgruppen mit dem Marker und Mittel zur Wiedergewinnung des ungeschützten Markers, die je nach Art des bestimmten Addukt-Bildners formuliert werden, gewählt werden können. Darüber hinaus ist klar, daß die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden kann, Marker zu schützen, die mit spezifischen Bindungspartnern außer Oligonucleotid-Sonden verknüpft sind. Das Grundkonzept der vorliegenden Erfindung ist es Marker zur Verfügung zu stellen, die entweder bereits mit spezifischen Bindungspartnern verknüpft sind, oder die mit diesen verknüpft werden können, wobei die Marker eine für Lumineszenz notwendige aktive Gruppierung besitzen, und inaktivierbar sind, wobei die aktive Gruppierung durch eine Schutzgruppierung geschützt ist, so daß die aktive Gruppierung gegenüber Inaktivierung weniger anfällig ist als in dem ungeschützten Marker und wobei der vom Schutz befreite chemilumineszente Marker gewöhnlich nach einem Assay wiedergewonnen werden kann.
Die vorstehende Erfindung findet zudem in einem Assay Anwendung, bei dem der Schutz-Addukt-Bildner verknüpft mit einem spezifischen Bindungspartner in dem Assay-System zur Verfügung gestellt wird, statt wie in den vorstehenden Beispielen in im wesentlichen freier Form zur Verfügung gestellt zu werden. Diese Technik weist den Vorteil auf, daß bei Komplexbildung eines markierten spezifischen Bindungspartners mit einem Komplement, das entweder selbst den Schutz-Addukt-Bildner aufweisen kann oder das mit einem anderen Komplement, das den Schutz-Addukt- Bildner aufweist, weiter komplexieren kann, der Marker geschützt werden kann. Dies resultiert schlußendlich daraus, daß die Konzentration des Schutz-Addukt-Bildners in der Nähe des Markers hoch ist. Ein nicht-komplexierter Marker wird jedoch nicht im gleichen Ausmaß geschützt werden und kann daher selektiv inaktiviert werden.
Die vorstehende Technik kann beispielsweise in einem Assay mit zwei aktiven Stellen, der insgesamt 3 spezifische Bindungspartner beinhaltet, angewendet werden. Ein Partner würde dann den Schutz-Addukt-Bildner tragen, während ein zweiter Partner den ungeschützten Marker tragen würde. Derartige Assays könnten Assays vom Sandwich-Typ und vom Typ der sequentiellen Sättigung umfassen. Die Technik besitzt jedoch auch bei einem Assay mit einer aktiven Stelle Anwendung (nur 2 spezifischen Bindungspartner sind betroffen).
Darüber hinaus kann der Assay bei dieser Technik entweder homogen oder heterogen sein. Ungeachtet des Assay-Typs besteht das zugrundeliegende Prinzip darin, daß die lokale Konzentration des Addukt bildenden Mittels in der Nachbarschaft eines chemilumineszenten Markers im Verhältnis zur Anwesenheit der nachzuweisenden Zielverbindung verändert werden kann. Als besonderes Beispiel könnte der Assay-Typ ein DNA-Sonden-Assay mit 2 aktiven Stellen sein, wobei die zwei DNA-Sonden an zwei benachbarten aktiven Stellen eines gemeinsamen Ziel-Polynucleotids binden könnten. In einem derartigen Assay könnte der chemilumineszente Marker am Ende der ersten Sonde angebracht werden und das Addukt bildende Mittel könnten am Ende der zweiten Sonde angebracht werden, so daß, wenn beide Sonden an eine Ziel-Nucleotidsequenz binden, der Schutz-Addukt-Bildner proxlmal zum chemilumineszenten Marker an der ersten Sonde steht. Das gleichzeitige Binden der zwei Sonden an dasselbe Ziel- Polynucleotid würde dazu führen, daß die Konzentration des Addukt bildenden Mittels in der Nachbarschaft des chemilumineszenten Markers deutlich ansteigt. Eine derartig erhöhte Konzentration sollte wiederum die Stabilität des komplexierten chemilumineszenten Markers erhöhen, was eine Unterscheidung der komplexierten und der nicht-komplexierten Form der Sonden aufgrund ihrer relativen Stabilität ermöglicht. Nach geeigneter Inaktivierung des Markers an der nicht-komplexierten chemilumineszenten Sonde mit Mitteln, die die geschützte Sonde im wesentlichen nicht beeinträchtigen, und Umwandlung des mit der komplexierten Sonde assoziierten Addukts, würde die Menge an intaktem chemilumineszenten Marker als Maß für die Menge dieses Komplexes und daher als Maß für die Menge der vorhandenen Zielverbindung dienen. Die grundlegenden Schritte in einem derartigen Assay sind die folgenden:
1. Spezifische Bindungspartner, die an dem Assay beteiligt sind miteinander zu komplexieren, so daß die lokale Konzentration am Schutz-Addukt-Bildner in der Nachbarschaft des Markers in dem komplexierten Bindungspartner hoch ist;
2. Anschließend Inaktivierung des ungeschützten Markers, wie durch Abbau (beispielsweise Hydrolyse von Acridiniumverbindungen);
3. Anschließend Entfernung des Schutzes vom geschützten Marker;
4. Anschließend Nachweis der Menge an intaktem Marker als Maß für die vorhandene Zielverbindung.
Wie vorstehend erläutert kann diese Erfindung zum Entwurf homogener Assay-Typen einfach verwendet werden. Sie kann jedoch auch als ein Zusatz zu heterogenen und homogenen Assays eingesetzt werden, bei denen es wünschenswert ist zwischen komplexierten und nicht-komplexierten spezifischen Bindungspartnern weiter zu unterscheiden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines markierten spezifischen Bindungspartners, welches umfaßt:

(a) einen chemilumineszenten Marker mit einer labilen, inaktivierbaren aktiven Gruppierung zur Verfügung zu stellen, um eine nicht-chemilumineszente Form des Markers zu ergeben,

(b) ein Addukt aus einem Schutzadduktbildner mit dem Marker zu bilden, um die aktive Gruppierung vor Inaktivierung zu schützen, wobei aus dem Addukt eine chemilumineszente Form des Markers wiedergewonnen werden kann, und

(c) vor oder nach (b) einen spezifischen Bindungspartner mit dem Marker zu verknüpfen,

mit der Maßgabe, daß der markierte spezifische Bindungspartner kein an Progesteron gebundenes β-D-Thioglucose-Addukt von [2,6-Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium- 9-carbonsäurefluorsulphonat ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Adduktbildner dem Marker eine Schutzgruppierung außer H und vorzugsweise auch außer OH oder OOH (Peroxid) überträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schutzadduktbildner ein Nudeophil ist, das über einen Pyridinium-Kohlenstoff des Markers, der in α-Position zur aktiven Gruppe steht, verknüpft ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Marker die Formel

besitzt,

worin:

der Phenyl- und der Pyridiniumring gegebenenfalls weiter substituiert ist,

Y für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine NH- Gruppe steht,

R&sub1; einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff oder ein Wasserstoffatom bedeutet,

R&sub4; eine austretende Gruppe ist,

-(C=Y)-R&sub4; eine aktive Gruppierung ist, die in den Marker und die (gespaltene) austretende Gruppe hydrolisierbar ist und mit den ortho- oder para-Positionen des Pyridiniumrings verknüpft ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Marker eine Acridinium-Verbindung der Formel

ist, worin

jeder Phenylring gegebenenfalls weiter substituiert ist, so daß R&sub2; und R&sub3; jeweils fakultative Substituenten sind, und, wenn vorhanden, jeweils ein Halogenatom oder eine Amino-, Hydroxy-, Thiol-, Amido, Acetyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, eine substituierte Acetyl-, eine substituierte Alkyl-, eine substituierte Alkenyl-, eine substituierte Aryl-, eine Alkyoxy- oder eine Aryloxygruppe bedeuten,

R&sub1; ein Wasserstoffatom oder ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff ist,

R&sub4; ein Halogen-, ein substituiertes Phosphor-, ein substituiertes Stickstoff-, ein substituiertes Bor- oder ein substituiertes Arsenatom ist, und

R&sub4; zusätzlich -Z(R&sub5;)(R&sub6;) bedeuten kann, worin Z ein Sauerstoff- Schwefel- oder Stickstoffatom bedeutet, R&sub5; ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff oder eine Arylgruppierung ist und, wenn Z ein Stickstoffatom ist, R&sub6; ein Wasserstoffatom oder ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 oder 6, wobei der Marker eine Verbindung der Formel

ist, worin:

jeder der Phenylringe gegebenenfalls substituiert ist,

R&sub1; ein gegebenenfalls substituierter Kohlenwasserstoff oder ein Wasserstoffatom ist,

Y für ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom oder eine NH- Gruppe steht,

Z ein Sauerstoff-, Stickstoff- oder ein Halogenatom, ein gegebenenfalls substituiertes Schwefelatom, ein substituiertes Phosphoratom, ein substituiertes Boratom oder ein substituiertes Arsenatom bedeutet,

-Z-R&sub5; eine austretende Gruppe ist,

-(C=Y)-Z-R&sub5; eine aktive Gruppierung ist, die an dem C=Y- Kohlenstoff in einen nicht-chemilumineszenten hydrolisierten Marker und die austretende Gruppe hydrolisierbar ist,

R&sub5; einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff oder eine Arylgruppe bedeutet oder abwesend ist, wenn Z für Halogen steht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Marker die Formel

besitzt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Marker mit dem spezifischen Bindungspartner über R&sub4; oder R&sub5; verknüpft ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Schutzadduktbildner ein Nukleophil ist, der sich an Position 9 des Rings addiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schutzadduktbildner ein primäres Thiol ist, wie ein primäres Alkyl- oder Arylthiol.

12. Verfahren nach Anspruch 7, wobei R&sub5;-Z- eine gegebenenfalls substituierte Alkoxy-, Alkenoxy-, Alkinoxy- oder Aryloxygruppe bedeutet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei R&sub5;-Z- eine gegebenenfalls substituierte Aryloxygruppe bedeutet und R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe bedeutet.

14. Verbindung, geeignet als geschützter, chemilumineszenter Marker für einen spezifischen Bindungspartner der Formel

worin,

die Phenyl- und Pyridinringe gegebenenfalls noch weiter substituiert sind, und

Y für ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine NH- Gruppe steht,

R&sub1; ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff bedeutet,

R&sub4; eine austretende Gruppe ist, die gegebenenfalls mit einem spezifischen Bindungspartner verknüpft werden kann,

-(C=Y)-R&sub4; eine aktive Gruppierung bedeutet, die in eine nicht-chemilumineszente Form (des Markers) und die (gespaltene) austretende Gruppe hydrolysierbar ist,

M eine Schutzgruppierung außer H, OH oder OOH (Peroxid) bedeutet, die in eine ungeschützte chemilumineszente Form spaltbar ist und die aktive Gruppierung des geschützten Markers weniger hydrolyseempfindlich macht als im ungeschützten Marker.

15. Verbindung nach Anspruch 14, worin R&sub4; eine gegebenenfalls substituierte Phenoxygruppe bedeutet.

16. Verbindung, geeignet als geschützter chemilumineszenter Marker für einen spezifischen Bindungspartner der Formel

worin:

R&sub2; und R&sub3; jeweils fakultative Substituenten sind und, wenn vorhanden, jeweils ein Halogenatom oder eine Amino-, Hydroxy-, Thiol-, Amido, Acetyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, eine substituierte Acetyl-, eine substituierte Alkyl, eine substituierte Alkenyl-, eine substituierte Aryl-, eine Alkoxy-, oder eine Aryloxygruppe bedeuten,

R&sub4; ein Halogen-, ein substituiertes Phosphor-, ein substituiteres Stickstoff-, ein substituiertes Bor- oder ein substituiertes Arsenatom bedeutet, und

R&sub4; zusätzlich -Z(R&sub5;)(R&sub6;) bedeuten kann, worin Z ein Sauerstoff-, Schwefel- oder ein Stickstoffatom bedeutet, R&sub5; einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff oder eine Arylgruppierung bedeutet und, wenn Z ein Stickstoffatom ist, R&sub6; ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff bedeutet,

R&sub4; eine austretende Guppe ist, die gegebenenfalls mit einem spezifischen Bindungspartner verknüft sein kann,

-(C=Y)-R&sub4; eine aktive Gruppierung ist, die nach Hydrolyse eine nicht-chemilumineszente Form (des Markers) und die austretende Gruppe ergibt, und

M eine Schutzgruppierung außer H, OH oder OOH (Peroxid) bedeutet, die in einen ungeschützten chemilumineszenten Marker spaltbar ist und die aktive Gruppierung in dem geschützten Marker weniger hydrolyseempfindlich macht als im ungeschützten Marker,

worin die Verbindung kein β-D-Thioglucoseaddukt von [2,6- Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium-9-carbonsäurefluorsulphonat ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, geeignet als geschützter Marker für einen spezifischen Bindungspartner mit der Formel

worin jeder der Phenylringe gegebenenfalls substituiert ist, und

-O-R&sub5; eine austretende Gruppe bedeutet, die gegebenenfalls, mit einem spezifischen Bindungspartner verbunden sein kann,

-(C=O)-O-R&sub5; eine aktive Gruppierung bedeutet, die nach ilydrolyse an dem Carbonylkohlenstoff eine nicht-chemilumineszente Form (des Markers) und die (gespaltene) austretende Gruppe ergibt,

M eine Schutzgruppe außer H, OH oder OOH (Peroxid) bedeutet, welche in eine ungeschützte chemilumineszente Form spaltbar ist und den Carbonylkohlenstoff in dem geschützten Marker weniger hydrolyseempfindlich macht als in dem ungeschützten Marker.

18. Verbindung nach Anspruch 16 oder 17, worin der ungeschützte Marker (d.h. ohne M) in wäßriger Lösung nach Reaktion mit Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff und Hydroxid Lumineszenz zeigt.

19. Verbindung nach Anspruch 17 oder 18, worin:

R&sub5; einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoff oder eine Arylgruppierung bedeutet, und R&sub1; eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl oder Alkinylgruppe bedeutet.

20. Verbindung nach Anspruch 14 bis 19, worin M aus einem primären Thiol gebildet wird.

21. Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, worin die fakultativen Substituenten der zwei Phenylgruppen Amino-, Carbonyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Nitro oder Halogen-Substituenten sind.

22. Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 21, worin R&sub1; eine C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppe bedeutet und die zwei Phenylgruppen nicht substituiert sind.

23. Markierter spezifischer Bindungspartner, umfassend:

(a) einen spezifischen Bindungspartner,

(b) einen geschützten Marker, der mit dem spezifischen Bindungspartner verknüpft ist, wobei der Marker eine Verbindung nach einem der Ansprüche 14, 15 oder 20 bis 22 ist.

24. Markierter spezifischer Bindungspartner, umfassend:

(a) einen spezifischen Bindungspartner,

(b) einen geschützten Marker, der mit dem spezifischen Bindungspartner verknüpft ist, wobei der Marker eine Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 22 ist,

mit der Maßgabe, daß der markierte spezifische Bindungspartner kein an Progesteron gebundenes β-D-Thioglucoseaddukt von [2, 6-Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium- 9-carbonsäurefluorsulphonat ist.

25. Markierter spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 23 oder 24, worin der ungeschützte Marker in wäßriger Lösung nach Reaktion mit Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff und Hydroxid Lumineszenz zeigt.

26. Markierter spezifischer Bindungspartner nach einem der Ansprüche 23 bis 25, worin der Bindungspartner ein Protein (beispielsweise ein Antikörper oder ein Antigen) oder ein Nucleotid (wie eine Oligonucleotid-Sonde) ist.

27. Verfahren zur Durchführung eines Assays auf eine Zielverbindung in einer Testprobe mittels eines spezifischen Bindungspartners, der mit einer nicht-chemilumineszenten geschützten Form eines chemilumineszenten Markers markiert ist, wobei die geschützte Form

(i) eine labile, aktive Gruppierung, die in eine nichtlumineszente Form des Markers inaktivierbar ist, und

(ii) eine Schutzgruppierung besitzt, die die aktive Gruppierung vor Inaktivierung schützt, wobei die Schutzgruppierung abspaltbar ist, um eine ungeschützte, chemilumineszente Form des Markers zu ergeben,

wobei das Verfahren umfaßt

(a) den Assay durchzuführen,

(b) den Schutz von dem geschützten Marker zu entfernen, indem die Schutzgruppierung davon abgespalten wird, so daß ein ungeschützter Marker hergestellt wird, der Chemilumineszenz zeigen kann, und

(c) den ungeschützten Marker zur Chemilumineszenz anzuregen,

mit der Maßgabe, daß der markierte spezifische Bindungspartner kein an Progesteron gebundenes β-D-Thioglucoseaddukt von [2,6-Dimethoxy-3-chlorsulphonyl]phenyl-N-methyl-acridinium- 9-carbonsäurefluorsulphonat ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Schutzgruppierung durch Oxidation, wie durch Oxidation mit Eisen-III-cyanid, abspaltbar ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der geschützte Marker eine Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 22 ist und/oder der markierte spezifische Bindungspartner wie in einem der Ansprüche 23 bis 26 definiert ist.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, welches weiter umfaßt den Marker zur Chemilumineszenz anzuregen, indem der Marker in einer wäßrigen Lösung mit entweder Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid und einer Base umgesetzt wird.

31. Ein Assay-Testkit für ein biologisches Ziel, welcher als eine Komponente einen markierten spezifischen Bindungspartner nach einem der Ansprüche 23 bis 26 enthält.