KR0132290B1 - 보호된 화학 발광표지 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

보호된 화학 발광표지

본 발명의 실시예는 도면을 참고로 기재될 것이다.

제1도는 시간에 따른 본 발명의 보호 표지의 안정성을 나타내는 그래프이다(실시예 1 참조).

제2도는 보호 부가물 형성제 농도에 대한 보호 부가물 형성제에 의해 표지에 제공되는 보호의 의존도를 나타내는 부분 자외선 스펙트럼이다(실시예 2 참조).

제3도는 보호 부가물 형성제 농도에 대한 본 발명의 부가물의 형성에 관한 의존도를 나타내는 그래프이다

(실시예 3 참조).

제4도는 본 발명의 특정 보호 표지의 형성을 위한 용이한 가역 평형 반응을 나타내는 그래프이다(실시예 4 참조).

제5도는 부가물 형성제를 산화시키는 방법에 의한 본 발명의 보호 표지로부터의 신호의 회복 및 이로 인한 탈보호된 표지의 회복을 나타내는 그래프이다(실시예 6 참조).

제6도는 본 발명의 부가물의 온도 안정성을 나타내는 그래프이다(실시예 8 참조).

발명의 영역

본 발명은 표지 비활성화를 억제하고 이것으로부터 탈보호된 화학 발광 표지를 회복시키기 위해 보호된 화학 발광 표지로 표지시킨 생물학적 프로브와 같은 특이적 결합 파트너에 관한 것이다.

기술적 고찰

임상 연구 및 진단에 있어서, 생물학적 성분의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 공지된 기술은 목적 성분과 특이적으로 결합하는 프로브(그의 특이적 결합 파트너)의 사용을 필요로 한다.

예컨데, 항원 또는 특정 뉴클레오티드 서열의 형태인 목표에 대해서 분석을 행할 경우, 프로브는 각각 항체 또는 올리고뉴클레오티드가 될 수 있을 것이다.

모든 경우에 있어서, 프로브는 통상적으로 표지된다.

즉, 프로브는 이것에 연결되는 원자 또는 기가 제공되었을 때 그것의 존재가 쉽게 확인될 수 있다.

시험 시료에서 표적의 존재를 측정하기 위해, 표지시킨 프로브는 그 프로브를 실험 시료 내의 그의 특이적 결합 파트너와 결합하게 하는 조건하에서 시료에 노출시킨다(예를 들면, 항체 프로브의 경우에 있어서, 항원과 결합시키고, 올리고뉴클레오티드 프로브의 경우에 있어서, 뉴클레오티드 멀티머와 혼성화시킨다.)

이어서, 존재하는 임의의 표지된 프로브/표적 복합체는 통상적으로 비복합 프로브로부터 분리되고 표지의 존재는 복합 또는 비복합 프로브에서 결정된다.

역사적으로, 방사성 표지를 행해왔으나, 조작, 건강상의 위험 및 불안정성에 있어서의 어려움으로 인해, 비동위체 표지가 후에 개발되었다. 이러한 표지는 그의 존재가 직접 또는 간접적으로 결정되는 것들을 포함한다.

직접 표지의 예는 화학 발광, 인광, 형광 또는 분광기로 탐지가능한 표지를 포함한다.

간접 표지의 예는 적절한 탐지가능한 표지에 포합된 특이적 결합 파트너에 의해 탐지될 수 있는 바이오틴 및 여러 가지 항원과 같은 화합물을 포함한다.

상기의 표지 유형 중에서 화학 발광 표지가 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

다수의 화학 발광 화합물이 알려져 있다. 이들 중 몇몇은 맥카프라의 문헌[McCapra, Progress In Organic Chemistry, 8, 78(23), 231-277 페이지, 1973년]에 기재되어 있다.

기타 인용 문헌과 마찬가지로 상기 문헌은 본 명세서에 참고 자료로서 채택되었다.

상기 많은 화합물들은 과산화수소 또는 산소 및 수산화물로 처리시에 화학 발광한다.

이러한 화합물들은 각각 하기의 일반식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)를 갖는 아크리디늄 및 아크리단 뿐만 아니라 하기 일반식 (Ⅲ), (Ⅳ) 및 (Ⅴ)형의 화합물을 포함한다.

캠펠 등(campbell et al.)의 영국 특허 제2 112 779B호(출원 번호 제8235019호, 제1982년 12월 8일 출원)는 화학 발광 생물학적 프로브 표지로서 하기 일반식(Ⅵ)의 아크리디늄 에스테르의 용도를 기재하고 있다.

상기 일반식에서, X-는 임의의 음이온이고, R1은 수소, C1-C10 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아릴 치환체이고, R2 및 R3는 수소, 아미노 치환, 카르복실, 히드록실, 알콕실, 니트로 또는 할로겐 치환체이고 R4는 임의 치환 페녹시 부분이다.

위크스 등 [Weeks, et al. , Clin Chen. 29/8, 1474-1479 페이지(1983년)참조]은 또한 화학 발광 항체 표지로서 상기 일반식의 아크리디늄 에스테르의 용도를 기재하고 있다.

아크리디늄 및 아크리단에 대한 화학 발광 반응 기작은 아주 잘 밝혀져 있다. 아크리디늄의 경우에 있어서, 화학 발광 반응은 과산화수소에 이어 염기의 첨가에 의해 개시된다.

맥카프라의 문헌 [McCapra Chemiluminescent Reactons of Acridiness, Chemistry of Heterocyclic Compounds, 제9권, 16-30페이지(1973년)]에 기재된 바와 같이, 이 기작은 명백히 고리의 9번 탄소 위치로의 과산화물 공격에 이은 과산화물 기의 탈양성자화 및 인접 카르보닐에 대한 친핵 공격을 수반하여 디옥세탄-유사 중간체를 생성한다.

이것은 이탈기, 예를 들면 산화 음이 온의 분열(예, 아크리디늄 페닐 에스테르의 특별한 경우에 있어서, 페녹시드의 분열)과 동시에 일어난다.

과산화수소의 첨가(대표적으로 고리의 9번 위치에 대한 수산화 이온의 첨가)는 아크리디늄이 그의 대응하는 모조 염기와 평형을 이루어 존재하기 때문에 염기의 첨가에 앞서 또는 동시에 행해야 한다는 것은 공지된 사실이다.

모조 염기는 명확하게는 화학 발광체가 아니며 아크리디늄으로부터의 신속한 빛의 방출을 위해, 아크리디늄 및 그의 모조 염기의 평형이 유리 아크리디늄 쪽으로 이동하도록 pH를 과산화수소 첨가 전에 낮게 하여야 한다.

이상의 설명은 위크스 등 (상기함)에 의해 제공되었다.

맥카프라[McCapra, Chemiluminescence of Organic Compounds, Progress in Organic Chemintry, 제8권, 231-277 페이지(1973년)]에 의해 지적된 바와 같이 아크리단의 화학 발광은 처음에 강 염기 중의 아크리단 고리의 9번 위치 수소의 탈양성자화를 수반하여 대응 아크리단 음이온을 형성하고 이것이 고리의 9번 위치에서 산소와 반응하고 이어서 아크리디늄의 기작과 유사한 기작으로 디옥세탄 형성 및 산소 방출이 일어난다.

아크리디늄 또는 아크리단에 대한 화학 발광 기작은 양자의 경우에 있어서, 양호한 이탈기(예, 페녹시드)가 필요함을 제시한다.

이 필요성은 맥카프라[Accounts of Chemical Research, 제9권 제6호, 201-208페이지(1976년 6월) 참조]에 의해 입증되었고 그의 문헌에는 여기 원자의 화학적 수율에 기초한 양자 수율이 ROH (RO-는 이탈 산화 음이온임)의 pKa가 감소함에 따라 증가한다고 기재되어 있다.

즉 양자 수율은 RO-가 더 나은 이탈기인 경우 증가한다.

표지된 프로브는 주로 생물학적 표적에 대한 검정 시험 키트의 성분으로서 제조된다.

전형적으로, 이 키트는 표지된 프로브를 수용액의 형태로 함유한다. 이러한 조건에 따른 난점은 상기 형의 화학 발광 화합물이 화학 발광에 필요한 고리의 9번 부분(그이 활성 성분)에서 가수분해되는 것이다. 예를 들면, 아크리디늄 페닐 에스테르의 경우에 있어서, 에스테르 활성 부분의 카르보닐 탄소는 약산성(예, pH 6)의 조건하에서 조차도 가수분해되어 아크리디늄산에 대응하는 비-화학 발광체 및 이탈기(이 경우에 있어서는 페녹시드 음이온)를 생성한다.

이러한 가수분해는 표지 함유 프로브가 표적의 검정에 사용될 때 일어난다.

이것은 특히 검정 프로토콜에 의해 프로브가 승온(예, 60℃)에서 장기간(예, 2시간)에 걸쳐 표적 서열과 혼성화하도록 요구되는 올리고 뉴클레오티드인 경우이다.

피리딘 유사체 및 아크리딘 유도체에 관하여, C4 및 C9 위치에서의 친핵성 첨가에 관한 일반적인 방법으로 연구가 행해졌다.

예를 들면, 이러한 연구는 콜로위크 등(Colowick et al)의 문헌[J. Biol.Chem. 191권, 447 페이지(1951년)], 루도비에그 등 (Ludowieg et al)의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Commun. ,제14권, 431페이지(1964년)] 및 아케슨(Acheson)의 교재 [Acridines, John Wiley and Sons Inc. (London, U.K. 출판(1973년)]에 기재되어 있다.

정의

rlu - 상대적 빛의 단위. 양성자가 광도계의 광전증배관을 치면 이는 전자 캐스케이드가 시작되어 기계에 지정 수치를 나타낸다.

이 과정의 효율은 기계 의존성이고 따라서 단위는 상대적 빛의 단위(rlu)라 한다.

부가물 - 구조적으로 상이한 2개의 반응체의 반응으로 생성된 단일 분자 생성물. 특이적 결합 파트너-고도의 특이성을 갖고 다른 생물학적 분자와 결합하는 생물학적 분자.

예를 들면, 이것이 특이적으로 결합하는 각각의 항체 및 분석물은 다른 것의 특이적 결합 파트너(때때로 보체로서 언급된다)이다.

활성 부분 - 발광 형으로의 연속적인 여기를 필요로 하는 상태에 있는 화학 발광 표지 부분.

라이트 오프(ligh off) - 필요시 화학 발광 표지로부터 화학 발광을 일으키는 특이적 반응.

라이트 오프 시약 - 화학 발광 표지의 라이트-오프를 일으키는데 사용되는 시약. 비활성화 - 라이트-오프시 화학 발광을 할 수 없는 화학 발광 표지를 제공하는 임의의 반응.

부가물 형성제 - 다른 화합물과의 부가물을 형성하기에 충분한 반응성을 가진 임의의 화합물.

보호 부가물 형성제 - 화학 발광 표지의 비활성화를 방지하는 부가물 형성제.

발명의 요약

본 발명은 상기 형의 화학 발광 표지로부터 최대의 양자 수율을 얻기 위해, 활성 부분이 양호한 이탈기를 가져야 한다는 인식에 기초하고 있다.

그러나, 이것은 이탈기가 부착되는 곳의 탄소 원자가 가수분해 또는 조급한 화학 발광과 같은 바람직하지 않은 반응에 대해 더 민감하기 때문에 활성 부분이 비활성에 대해 더 민감할 것임을 의미한다.

따라서, 가장 높은 양자 수율을 나타냄으로써 고감도를 갖는 표지된 프로브를 제공하는데 사용될 수 있는 상기 형태의 표지들은 또한 비활성화에 가장 민감한 것들이다.

표지 가수분해는 표지 비활성화의 특히 문제가 되는 점이다. 표지 비활성화를 촉진할 수도 있는 검정 절차 동안에 검정 감도 및 정확도의 손실을 초래한다.(예, 표지된 뉴클레오티드 프로브의 표적 뉴클레오티드 서열인 그의 특이적 결합 파트너와의 혼성화).

본 발명은 표지의 비활성화에 대한 감도가 줄어들고, 따라서 표지 저장 수명의 연장 및 검정 감도 및 정확도의 증가를 초래하는 방법을 제공한다.

넓게는, 이 방법은 활성 부분의 비활성화를 억제하는 반면 통상적으로 생물학적 표적과의 복합체 형성에 이어 표지의 화학 발광 형태가 부가물로부터 쉽게 회복되도록 하는 적합한 보호 부가물 형성제와 표지의 부가물을 제조함으로써 수행된다.

본 발명에 따라 표지된 특이적 결합 파트너를 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 펩티드 또는 뉴클레오티드 부분, 또는 기타 특이적 결합 파트너 및 화학 발광 표지를 사용한다.

표지는 화학 발광에 필요한 활성 부분을 가지나 비활성화 되어 표지의 비-화학 발광 형을 나타내기 쉽다.

본 방법은 특이적 결합 파트너를 표지에 결합시키고, 활성 부분에 보호 부분을 제공함으로써 활성 부분의 비활성화를 억제하기 위한 보호 부가물 형성제와 표지의 부가물을 제조하는 것으로 이루어진다.

부가물은 표지가 프로브에 결합되기 전 또는 후에 제조될 수 있다.

그러나, 표지가 프로브에 결합된 후에 제도될 경우, 프로브에 대해 비가역조건(즉, 프로브의 실질적인 비율을 의도한 대로 특이적 결합 파트너를 검출하기에 비효율적인 것으로 만들지 않는 조건)을 선택하는 것이 바람직한 것으로 사료된다.

과산화수소 또는 산소 및 염기에 의한 처리후에 화학 발광하는 화학 발광 화합물의 경우에 있어서, 보호 부분은 OH 또는 과산화물(OOH) 이외의 것임을 의미한다.

부가물의 제조 및 저장은 활성 기의 신속한 가수분해를 촉진하기에 충분히 알칼리성인 용액을 필요로 하기 때문에 수산화물은 보호 부분으로 고려될 수 없다.

H는 보호 부분으로 사용될 수 있으나 아크리단과 같은 화합물의 형성은 비가역적 반응인 수소화물로의 환원을 필요로 하므로 바람직하지 않다.

한편으로, 과산화물은 그의 존재가 조급한 화학 발광을 촉진하므로 대부분의 화학 발광 표지에 대한 보호 부분으로서 부적절하다. 보호 성분은 또한 부가물이 탈보호되어 표지의 화학 발광 형을 나타내도록 선택된다.

바람직하게는, 보호 부가물 형성제는 용이한 가역 반응(가장 바람직하게는, 용이한 가역 평형 반응)에 의해 보호 부분을 제공하여 보호 부분이 탈보호되는 동안 간단하게 분열되어 화학 발광 표지를 회복하게 된다.

상기 방법에 있어서 사용될 수 있는 표지는 하기 일반식(VIa)를 갖는 것이다.

상기 식에서, 피리디늄 고리는 임의로 추가 치환되고,

Y는 O, S또는 NH이고,

R1은 임의 치환 탄화수소 또는 H이고, R4는 이탈기이고,

는 피리디늄의 오르토 또는 파라 위치에 결합된 활성 부분이고, 가수분해되어 표지 및 이탈기의 비-화학 발광 형을 생성한다.

이러한 경우에 있어서, 보호기는 상기 일반식(Ⅵ)의 경우에 피리디늄 고리의 알파 탄소 원자에서 활성 부분에 형성되는 친핵체의 부가물이다.

바람직하게는, 표지는 하기 일반식(Ⅶ)의 아크리디늄 화합물이다.

상기 식에서, R1은 바람직하게는 임의 치환 알킬, 알케닐 또는 알키닐이다. R2 및 R3는 바람직하게는 H, 아미노, 히드록시, 티올, 할로겐, 아미도, 아세틸, 알킬, 알케닐, 아릴 치환 아세틸, 치환 알킬, 치환 할케닐, 치환 아릴, 알콕시 또는 아릴옥시로부터 선택된 임의의 치환체이다.

R4는 할로겐, 치환 인, 치환 질소, 치환 붕소, 치환 비소일 수 있다.

R4는 또한 Z가 O, S, N이고 R5가 임의 치환 탄화 수소인 -Z(R5)(R6)의 구조일 수 있다.

상기에 있어서, R6는 H이거나 또는 Z=N일 경우에만 임의 치환 탄화 수소이다. 가장 바람직하게는, 표지는 하기 일반식(Ⅷ)의 아크리디늄 에스테르이다.

물론 여러 가지 가능한 보호 부가물 형성제를 선택할 수 있으나, 보호 부가물 형성제는 1급 티올, 가장 바람직하게는 1급 알킬 또는 아릴 티올로부터 선택된 친핵체인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 하기한 바와 같은 생물학적 프로브 표지로서 유용한 보호 화학 발광 표지를 제공한다.

다음의 일반식에 있어서

는 M이 H 또는 OH, 또는 OOH(과산화물)이외의 보호성분인, 상기한 형태의 활성 부분이다.

보호 부분은 탈보호된 화학 발광 표지를 생성하도록 분열가능하고 보호 표지의 C=Y 탄소가 탈보호 표지에서 보다 가수분해에 덜 민감하도록 선택된다. R4 (이탈기)는 바람직하게는 생물학적 프로브에 쉽게 결합될 수 있거나 또는 이미 프로브에 결합된 관능기를 함유할 수 있다.

바람직하게는, 보호 표지는 하기 일반식 (IXb) 또는 (IXc)로 표시된다.

상기(IXb) 또는 (IXc)형의 보호 화학 발광 표지는 M-가 활성기의 알파 탄소에 첨가된 M을 함유한 보호 부가물 형성제와 상기 일반식(VI)의 표지의 부가물로 간주될 수도 있다.

가장 바람직한 보호 표지는 하기 일반식(X)의 아크리디늄에스테르이다.

상기 식에서, M은 바람직하게는 1급 티올이다.

본 발명은 또한 상기 형태의 보호 표지에 결합된 생물학적 프로브를 제공한다.

본 발명의 실시예에 대한 구체적인 설명

본 발명의 보호 표지를 생성하기 위한 적합한 보호 부가물 형성제를 선택하는 방법을 우선 기재하였다.

또한, 특이적 결합 파트너를 표지와 결합시키는 방법도 기재하였다.

다음에 부가물 형성제 농도에 대한, 과산화물 비활성화로부터의 본 발명의 보호 표지의 보호 의존도를 설명하였다.

다음의 실시예들은 본 발명의 보호 표지를 1)희석, 2)일반 산화 및 3)특수 산화를 통해 비보호 표지로 전환시키는 신규 방법을 설명하였다.

이 다음에, 아크리디늄 에스테르의 제조에 있어서 보호 부가물 형성제의 이용성을 나타냈다.

상기 일반식(Ⅶ)의 아크리디늄 에스테르 표지의 경우에 있어서, 그의 특정 C=Y(예, 카르보닐) 탄소에서 가수분해로부터의 활성 부분의 보호는 적합한 친핵체 및 표지 사이의 부가물(이것은 알파 탄소에서 활성기에 형성되고 구체적으로 이것은 피리디늄 고리 탄소에 존재할 것임)을 제조함으로써 행해진다.

잠재적으로 적합한 보호 부가물 형성제는 이 경우에 있어서 활성 부분의 가수분해를 감소시키는 그들의 능력을 실험적으로 측정함으로써 확인될 수 있다.

그러한 기술은 하기 실시예 1에 설명하였다.

실시예1 보호 부가물 형성제를 선택하는 방법

여러 가지 친핵체를 하기 일반식(?)을 갖는 아크리디늄 페닐 에스테르에 대한 잠재적 보호기로서 선택하였다.

각각의 친핵체가 보호 부분으로서 작용하는 능력은(하기 표 4의 시약으로서 나열한 잠재적 부가물 형성제 형태의) 친핵체를 다음을 시험 수용액 중에서 혼합시킴으로써 실험적으로 확인되었다.

0.5 M 인산염 완충액(PB). . .pH 6.0,

0.1%황산 도데실 나트륨(SDS),

5 mM시약

치환 아크리디늄 페닐 에스테르로 표지시킨 26 염기쌍(bp)올리고뉴클레오티드 형태의 106 rlu의 생물학적 프로브올리고뉴클레오티드 프로브의 표지화는 1987년 10월 5일자로 Acridinium Ester Labelling and Purification of Nucleotide Probes의 발명의 명칭으로 계류 중인 미합중국 특허 출원 제105, 080호에 기재된 방법에 의해 진행되었다.

상기 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양시키고 이어서 60℃에서 배양시켜 시간에 따라 추출한 부분 표본을 하기 표 1에 나타냈다.

이어서, 부분 표본을 0.5 N HNO3 100 μ1에 첨가하여 존재하는 아크리디늄 에스테르의 어떤 모조 염기가 유기 에스테르로 전환되는 가를 확인하였다.

이어서, 질산 용액, 0.2% H2O2 100μ1에 이어 알칼리성 인산염 완충액(pH 12. 75) 200μ1를 첨가함으로써 라이트 오프를 행하였다.

빛 방출의 측정은 또한 시험할 잠재적인 부가물 형성 화합물(즉, 시약)이 없는 상기 혼합물로 이루어진 다수의 대조군에 대해서도 행하였다.

빛의 방출은 각각의 경우에 있어서 약 10초간 측정하였으며 각 시간에 있어서 결과치(rul 1000)는 하기 표 1에 나타냈다.

시험한 시약의 친핵 성분은 빛의 방출이 0분 후 각각의 시점에서 대조군에서 보다 아주 클 경우, 보호 부가물 형성제로서 잠재적으로 적합한 것으로 구분되었다. 상기의 기준에 기초하여, 본 발명의 보호 표지를 생성하고 본 발명의 방법에 있어서 잠재적으로 적합한 것으로 생각되는 상기 부가물 형성제는 표 1의 잠재적으로 적합함의 란에서 Y로 표시하였다.

* 이것은 60분이 아니라 45분에 행하였다.

(숫자는 rlu 1000이다) ,

R.T. = 실온(room temperature)

표 1에 기재된 몇가지 잠재적 부가물 형성제에 대한 결과는 log[100×일정 시간에 있어서 rlu)/(시간0에 있어

서 rlu) 대 시간의 함수로서 도면 제1도에 나타내었다.

표 1 및 제1도에 나타낸 바와 같이, 시험한 여러 시약은 표지 비활성화를 감소시키는 보호 부분을 제공하였다.

이러한 부가물 형성물 형성제는 상기 표 1의 잠재적으로 적합함의 란에 Y로 나타냈다.

잠재적으로 적합한 부가물 형성제인 시약의 보호 부분에 의해 이루어지는 보호는 특히 두가지의 잠재적인 잇점을 가지고 있다.

첫째, 보호 표지로 표지된 특이적 결합 파트너의 저장 수명이 대응하는 비보호 표지로 표지된 프로브의 것보다 크다.

둘째, 이러한 보호는 표지의 가수분해를 촉진시킬지도 모르는 까다로운 조건하에서 표지된 특이적 결합 파트너와 그의 보체의 복합체 형성 동안, 예를 들면, 특이적 결합 파트너가 검정하는 동안 승온에서 장기간 동안 보체 표적과 혼성화될 올리고뉴클레오티드 프로브일 때 특히 유리하다.

표 1 및 제1도에 나타낸 바와 같이, 60℃의 승온은 비보호 표지가 비활성화되는, 명확하게는 가수분해되어 비-화학 발광 형이 되는 비율을 상당히 증가시킨다.

또한 표 1 및 제1도에서 보호 표지로부터 초기의 빛의 방출은 많은 경우에 있어서 대응하는 비보호 표지로 부터의 방출 보다 상당히 낮은 것으로 나타났다.

이는 부가물이 라이트 오프 동안에 과산화수소와 경쟁하여 표지와 강한 결합을 형성한 결과이다.

하기와 마찬가지로, 빛 방출의 손실 rlu(lost rlu's)는 다음에 논의 할 기술에 의해 회복될 수 있다.

잠재적으로 적합한 보호 부가물 형성제 중 어느 것이 실제로 주어진 조건에 있어서 적합한가는 표지를 사용한 특이적 결합 파트너에 달려 있음을 명심해야 한다. 예컨데, 특이적 결합 파트너가 올리고 뉴클레오티드 프로브일 때, 산성 아황산염을 사용하면 혼성화가 현저하게 줄어드는 것으로 밝려졌다. 이것은 시토신이 우리딘으로 분해됨으로써 프로브 및 그의 표적(즉, 그의 보체) 사이의 상동성이 줄어든 결과에 기인하는 것으로 보인다.

따라서, 특별한 경우에 있어서, 사용 할 특이적 결합 파트너에 대한 잠재적으로 적합한 보호 부가물 형성제의 부작용을 점검해야 한다.

과산화물로부터 보호의 농도 의존성

이 실시예는 부가물 형성제 농도에 대한 본 발명의 보호 표지 형성의 의존성을 설명한다.

각각 다음 성분을 함유한 다섯 가지 용액을 제조하였다.

0.5M 인산염 완충액(pH 6.0)

0.1% SDS

아크리디늄 페닐 에스테르 표지 80 nM; 부가물 형성제인 3-메르캅토프로피온산(MPA)를 항상 0 내지 10mM의 농도로 유지하기 위해 증가량으로 첨가하였다.

생성혼합물의 자외선(UV)주사는 300-240 nm의 영역에서 행하여 제2도에 나타내었다.

260 nm에서의 흡수는 비-부가물 아크리디늄 고리 구조에 대응한다. 따라서, 제1도에 나타낸 바와 같이, 부가물 형성제의 농도의 증가는 아크리디늄 고리 구조가 부가물로 전환된 결과로 260nm에서의 흡광도의 대응하는 감소를 유발한다.

또한 부가물의 양이 일정 농도의 MPA에서 시간에 따라 현저히 변하지 않는 것도 관찰되었다.

이것은 부가물이 유리 아크리디늄 구조와 동적인 평형 상태에 있음을 나타낸다.

화학 발광에 의해 나타난 바와 같은 과산화물로부터의 보호의 농도 의존성

이것은 또한 실시예 2에서와 마찬가지로, 보호 표지 형성의 정도는 부가물 형성제 농도에 의존함을 설명하는 것이다.

이 실시예에서, 다음의 조성물을 갖는 여러 가지 용액은 아크리디늄 에스테르 표지 프로브를 함유한 용액 1μ1를 0.5 N HNO3 100μ1에 첨가하고 이어서 필요량의 부가물 형성제(3-메르캅토프로피온산)를 첨가하여 제3도에 나타낸 부가물 형성제 농도를 얻었다. 이어서, 각각의 생성 혼합물에 (중량-용적에 의한) 0.2% H2O2 100 μ1를 첨가하고 알칼리성 인산염 완충액(pH 12. 75) 200 μ1를 첨가함으로써 라이트 오프를 행하였다.

결과적인 빛의 방출 대 부가물 형성제 농도(mM)의 로그 함수를 제3도에 나타냈다.

제3도는 또한 본 발명의 보호 표지 형성의 부가물 형성제의 농도에 대한 의존성을 나타낸다.

즉, 부가물 형성제의 농도가 높아질수록, 보호 표지 형으로 전환되는 표지의 비율이 높아진다.

이 결과는 또한 적어도 본 실시예의 부가물 형성제를 사용할 때, 화학 발광 표지가 부가물 형성제의 농도를 줄임으로써 그이 비-화학 발광 보호형으로부터 회복될 수 있음을 나타낸다.

실시예4

희석을 통한 가역성의 입증

화학 발광 표지를 회복하기 위해 부가물 형성제 농도를 저하시키는 한 방법은 표지 및 부가물 형성제를 함유한 용액을 간단히 희석하는 것이다.

이 기술은 물론 희석시켰을때 부가물 형성제 및 표지 사이의 평형 반응의 이동을 유발하여 보호 표지가 생성되도록 하는 전체으로 화학적 용액을 선택했을 때만 유효하다. 1급 티올 부가물 형성제를 고려해 볼 때, 예측되는 평형 반응은 다음과 같다.

상기 반응식에서, RSH는 1급 티올 형의 부가물 형성제이고, Acr+는 비보호 아크리니듐 에스테르 표지이고 RSAcr은 아크리디늄 부가물(즉, 보호 표지)이다.

이와 같은 시스템에 있어서, 완충액이 존재할 때 H+농도는 일정하게 유지되고 용액의 희석은 평형을 왼쪽으로 이동시켜 보호 아크리니듐 에스테르 표지가 탈보호된 결과로 화학 발광 아크리니듐 에스테르 표지가 회복된다.

이것을 설명하기 위해, 인산염 완충액(pH 6.0) 중의 아크리디늄 페닐 에스테르에 부가물 형성제인 3-메르캅토프로피온산의 용액을 최종 부가물 형성 농도가 10mM이 되도록 첨가하여 시험 시약을 제조하였다.

이어서, 이 용액을 희석시켜 표 4에 나타낸 여러 가지 농도의 부가물 형성제를 함유한 결과적인 시험 시약을 제조하였다.

이어서 이들 시험 시료의 라이트 오프는 희석 시료에 0.5N HNO3 100μ1에 이어 0.2% H2O2 100μ1, 알칼리성 완충액(pH 12.75) 200μ1를 첨가함으로써 행하였다. 희석 비율에 대해 보정한 빛의 방출 대 농도를 시험 시료에 대해서 뿐만 아니라 어떤 보호 부가물 형성제 없이 동일한 기술에 의해 제조한 대조군 시료에 대해서도 제4도에 나타냈다.

제4도로 부터 알 수 있듯이, 보호 부가물 형성제인 3-메르캅토프로피온산에 대한 상기 반응식 (1)의 평형 반응은 용이한 가역 평형 반응임이 명백하다.

특히, 이 부가물 형성제를 갖는 화학 발광 표지는, 예를 들면, 실질적으로 일정한 pH 하에서 희석에 의해 보호 표지의 탈보호에 유리하게 평형을 이동시키는 방법에 의해 용이하게 재회복된다.

실시예 5

고상 지지체에 결합시킨 후 세척에 의한 가역 반응

특이적 결합 파트너가 본 발명의 보호 표지로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브이고 결과적인 프로브/표적 혼성체가 고상 지지체에 결합된 경우에 있어서, 상기 실시예 4에 기재된 희석 과정은 혼성화 후 지지체를 세척하는 동안 쉽게 진행될 수 있다.

이것은 본 실시예에 의해 설명된다.

표지 프로브 혼성체는 다음의 방법을 이

용하여 제조하고 처리하였다.

(ⅰ) 혼성화는 인산염 완충액(PB , pH 6.0) 중에서 아크리니듐 페닐 에스테르로 표지시킨 26 bp 올리고뉴클레오티드 및 표적 뉴클레오티드 서열 사이에서 행하였다.

(ii) 혼성화되고 표지된 프로브를 고상 지지체상의 비혼성화 프로브로부터 분리하고 이어서 고상 지지체상의 비혼성화 프로브로부터 분리하고 이어서 고상 지지체를 PB(pH 6.0)로 세척하였다.

(iii) 단계 (ii)에서 얻은 슬러리 50μ1 를 질산으로 처리하고 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 라이트 오프시켰다.

빛의 방출량은 표 2의 부가물 형성전 란에 기재하였다(표 2의 모든 빛 방출량은 rlu 단위로 나타냈다).

(iv)단계 (ii)로부터 얻은 잔여 슬러리에 충분한 3-메트캅토프로피온산(보호 부가물 형성제)를 첨가하여 그의 농도가 10mM이 되게 하였다.

(v) 이어서 단계 (iv)로부터의 얻은 또다른 슬러리 부분 표본 50μ1를 단계(iii)에서와 동일한 방법으로 라이트 오프시키고 빛의 방출량을 하기 표2에 있어서 형성 후란에 기록하였다.

(vi) 단계 (iv)로부터 얻은 결과적인 잔여 슬러리를 PB로 1회 세척하고 부분 표본 50μ1를 상기 단계(iii)의 방법을 사용하여 라이트 오프시키고 그 결과의 빛의 방출량을 표2의 1회 세척 후란에 기록하였다.

(vii) 단계 (vi)으로부터 생성된 잔여 슬러리를 PB로 1회 세척하고 이어서 또다른 부분 표본을 상기 단계 (ii)의 방법을 사용하여 라이트 오프시키고 방출을 하기 표 2에서 2회 세척 후란에 기록하였다.

상기의 방법을 또한 대조군 및 블랭크에도 반복하고, 대조군의 경우에는 보호 부가물 형성제를 첨가하지 않고(즉, 3-메르캅토프로피온산이 없음), 블랭크의 경우에는 올리고뉴클레오티드를 첨가하지 않았다.

각각의 대조군 및 블랭크로부터의 빛의 방출은 하기 표2의 각각 대조군 및 블랭크로 표시된 선을 따라 기재하였다.

표2로 부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, MPA는 형성 후란 아래의 빛의 방출에 의해 설명된 바와 같이 대부분의 표지를 보호된 비-화학 발광 표지로 전환 시켰다. 더욱이, 탈보호는 PB로 세척함으로써 용이하게 진행되어 2회 세척과 같이 효과적인 1회 세척으로 비보호된 화학 발광 표지를 형성하였다.

물론, 임상검정의 목적을 위해, 시험 키트는 통상적으로 검정에 앞서 준비되며 이것은 표지 프로브의 저장 동안 및 검정 절차에 있어서 인큐베이션 동안에 표지 비활성화를 최소화하기 위해 본 발명의 보호 표지로 표지시킨 비혼성화된 프로브를 함유한다.

그러나, 표 2에 나타낸 것과 동일한 정성적인 결과는 이 상황에서도 역시 예견될 수 있다.

실시예 6

Fe(CN)63-에 의한 산화에 의한 가역반응

상기 실시예에서 설명한 바와 같이, 상기 보호 부가물 형성제 및 아크리디늄 에스테르 표지와 같은 표지 사이의 평형 반응은 비보호된 화학 발광 표지를 회복하도록 하는 용이한 가역 반응이다.

희석은 비보호 표지에 유리하게 평행을 이동시키는 한 방법인 것으로 밝혀졌다.

그러나, 평형을 이동시키는 다른 방법도 유력할 것이다.

본 실시예는 이러한 다른 방법, 즉 보호 부가물 형성제의 산화를 설명한다.

본 실시예에서, 다음의 방법을 사용하였다.

i) 아크리디늄 페닐 에스테르로 표지시킨 26-량체 올리고뉴클레오티드 프로브를 PB(pH 4.9) 중에서 혼합하였다.

ii) 보호 부가물 형성제인 4-히드록시티오페놀을 충분량 첨가하여 그의 농도가 7.5mM이 되게 하였다.

iii) 상기 단계 (ii)에서 얻은 용액의 부분 표본 5μ1를 제5도에 나타낸 농도의 포타슘 페리시아나이드 K3Fe(CN)6 용액의 각각의 부분 표본 5μ1에 첨가하여 다수의 시험 시료를 형성하였다.

iv) 이어서 상기 단계 (iii)으로부터 얻은 시험 시료 각각을 질산에 첨가하고 이어서 과산화수소 및 알칼리성 인산염 완충액(pH 12.75) 처리에 의해 실시예 1에 기재한 방법에 따라 라이트 오프시켰다.

동일한 방법을 부가물 형성제(4-히드록시티오페놀)를 첨가하지 않은 대조군을 사용하여 반복하였다.

시험 시료로부터의 빛의 방출 결과는 대응하는 대조군 시료의 빛의 방출과 비교한 시료로부터의 방출율에 대한 표지 프로브를 첨가한 용액에 있어서 페리시아나이드 농도의 비율의 형태로 빛이 방출을 제5도에 나타냈다(따라서, 결과적인 시료에 있어서 페리시아나이드 농도는 제5도에 나타낸 절반이 된다).

제5도에 나타낸 바와 같이, 부가물 형성제인 4-히드록시티오페놀의 산화 역시 평형을 이동시켜 보호 표지를 탈보호시키고 비보호 화학 발광 표지를 회복시키는 매우 효과적인 방법이다.

임상 분석에 있어서, 상기 탈보호 과정은 라이트 오프에 앞서 표지 프로브 및 표적 사이의 복합체 형성이 이루어질 것이다.

실시예 7

티올-특이성 시약과의 반응에 의한 부가물의 가역 반응

상기 실시예 6에서 가역 반응에서는 불특정 산화제를 사용하였다.

이 경우에 있어서, 알드리티올(2,2’-디티오디피리딘)은 보호 부가물 형성제가 반응성 1급 타올이기 때문에 부가물 형성을 가역시키는 시약으로서 유용하다. 이 반응제는 모든 경우에 있어서 유용하지는 않으며, 다른 티올 특이성 시약 또는 다른 부호 부가물 형성 친핵체에 대해 특이적인 시약이 사용될 수 있다. 다음의 방법을 사용하였다.

i) 아크리디늄 에스테르로 표지시킨 올리고뉴클레오티드 프로브 용액은 프로브를 50%포름아미드(용적비), 0.2M PB(pH 6.0)에 첨가하여 제조하였다.

ii) 부가물 형성제인 2-메르갑토에탄술폰산(2MESA)의 용액 및 알드리티올의 용액을 각각 상기 완충액 및 100%포름아미드 중에 0, 0.1, 및 10mM로 제조하였다.

iii) 프로브 용액 100μ1에 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 부가물 용액 100μ1 및 알드리티올 용액 100μ1를 첨가하였다.

iv) 이와 같이 제조한 시료를 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고 0.1% H2O2와 혼합된 0.4N HNO3 200μ1에 이어 1N NaOH 200μ1를 첨가함으로써 라이트 오프를 행하였다.

하기 표 3의 결과는 입체 이성질체의 가역 반응이 용액 중의 부가물 형성제의 농도를 줄임으로써 효과적으로 일어남을 나타낸다.

실시예 8

부가물을 사용함으로써 감소되는 온도 감성

본 발명의 보호 표지의 온도 안정성을 설명하기 위해 다음 용액의 두 수성 시료를 제조하였다.

BSS 믹스(즉, 디이소부틸 술포숙시네이트DIBBS 45 중량%, + 인산염 완충액인 에틸렌디아민테트라아세테이트“EDTA”및EGTA에틸렌글리콜-비스-(B-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산의 혼합물, pH 6.8), 106 rlu의 아크리디늄 페닐 에스테르 표지시킨 26 염기쌍(bp) 올리고뉴클레오티드.

두 DIBSS 용액을 0 또는 5mM 4-히드록시티오페놀로 제조하였다.

3%LDS(리륨도데실 술페이트)중의 프로브 2μ1를 하나의 DIBSS 혼합물 20μ1에 첨가하였다. 각 온도 점을 상기와 같이 제조한 개개의 시료로 행하였다.

시료들을 수조에 위치시켜 점차 가온시킨 온도에서 5분 동안 인쿠베이션시켰다. 각각의 부분 표본에 대한 라이트 오프는 과산화수소를 사용하고 이어 질산과 염기 처리에 의해 행하였다.

두 시료로부터 얻은 부분 표본에 대한 빛의 방출 대 온도 관계를 제6도에 나타냈다.

제6도에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 4-히드록시티오페놀은 아크리디늄 에스테르 그 자체 보다 승온에서 상당히 안정된 아크리디늄 에스테르의 부가물을 생성하였다.

따라서, 본 발명의 보호 표지는 이들이 결합된 프로브가 올리고뉴클레오티드일 때 특히 유리하고 상승 혼성화 온도를 이용하는 것이 바람직하다.

실시예 9

장시간 혼성화 후 신호 회복의 개선 방법

장기간 혼성화시키는 동안 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합된 표지를 보호 시킨 효과가 지금부터 예시될 것이다.

본 실시예에 있어서, 실시예 8에서와 동일한 혼합물을 사용하여 3개의 시험 용액을 제조하였는데, 제1의 시료 중에는 보호 부가물 형성제가 없고, 제2의 시료 중에는 3-메르캅토프로피온산이 제공되고, 제3이 시료중에는 4-히드록시티오페놀이 제공되었다.

따라서 보호 부가물 형성제 및 아크리디늄 에스테르는 각각 대응하는 보호 표지를 형성한다.

상기 각각의 용액으로부터의 부분 표본을 60℃에서 2.5시간 동안 동일한 표적 뉴클레오티드 서열 rRNA로 혼성화시켰다.

각각의 시료를 수산화인회석에 결합시키고, 상층액을 비결합물로서 제거하고, 지지체는 인산염 완충액으로 1회 세척하고, 세척액은 세척물으로서 저장하였다. 지지체, 비결합물, 및 세척물로부터의 빛 방출은 실시예 5의 라이트 오프 방법을 사용하여 측정하였다. 표 4에 빛의 방출을 나타냈다.

부가물로 보호시킨 시료에서의신호가 대조군 시료의 것의 거의 3배이었음을 주목해야 할 것이다.

모든 시료는 동일한 rlu값을 생성할 수 있는 양의 표지를 가졌다.

따라서 표 4의 결과는 올리고뉴클레오티드-결합 아크리디늄 에스테르 표지에 대한 보호기가 장시간 동안 올리고뉴클레오티드/표적 혼성화에 미치는 효과를 설명한다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 보호 비보호 표지보다 큰 신호 회복율(예를 들면, 이것은 좀 더 낮은 표지 비활성화율을 나타냄)을 나타내며, 따라서 증가돈 감성을 갖는 표적 검정이 가능하다.

이와 같은 사실은 특히 장시간의 인큐베이션 기간 동안(예, 약 2시간 이상)에도 적용된다.

실시예 10

부가물의 사용을 통한 개선된 저장 안정성

상기 실시예에서 입증된 바와 같이 개선된 안정성은 많은 잇점이 있다.

구체적인 잇점은 아크리디늄 에스테르가 표지된 프로브의 저장성을 개선시키는 것이다.

이러한 개선된 저장 안정성을 예시하기 위해 다음의 조건들을 사용하였다.

용액은 다음과 같이 제조하였다.

0.1M 숙신산리튬 (pH 5.2),

0.1% 라우릴 황산리튬,

아크리디늄 에스테르 표지된 DNA 프로브,

10mM 3-메르캅토프로피온산(대조용 시료 중에는 없음)

상기 용액의 100배 희석액 5μ1를 50% 포름아미드, 0.2M 인산염 완충 용액 (pH 6.0) 300μ1에 첨가하여 표지의 화학 발광 활성을 분석하였으며, 라이트 오프는 상기 실시예 7에서와 같이 행하였다.

이 용액의 부분 표본 1ml를 동결건조 시키고, 생성된 펠릿을 45℃에서 1 또는 3일 동안 인큐베이션시켰다.

이어서, 이것을 원래의 부피로 재구성하고 화학 발광 활성의 보유 여부를 분석하고 하기에 백분율로 나타냈다.

초기 잔류 활성%

조건 1일 3일

불가물 없음 61% 23%

불가물 없음 101% 105%

부가물로서 저장했을 때 실제적인 정도로 개선된 안정도가 얻어졌음은 명백하다. 사용한 승온 조건은 저온에서 양호한 안정성이 얼마나 장기간 동안 유지될것인가를 측정하는 통상적인 방법이다.

실험 실시예의 요약

상기의 예로부터 화학 발광 표지는 여러 가지 부가물 형성제를 사용하여 보호 시킴으로써 보호된 표지를 생성할 수 있으며, 이 보호된 표지는 부가물 형성제로 부터 유래된 보호 부분의 존재로 인해 비보호된 표지 보다는 가수분해와 같은 비활성화에 덜 민감함을 알 수 있다.

많은 경우에 있어서, 표지와 보호 부가물 형성제의 반응이 부가물 형성제의 희석 또는 산화와 같은 방법에 의해 용이하게 가역될 수 있는 평형 반응임을 알 수 있다.

그러나, 상기 형태의 용이하게 가역되는 평형 반응의 경우에 있어서, 비보호된 표지에 유리하게 평행을 이동시키는 여러 가지 다른 방법을 상상할 수 있음을 알아야 한다.

예를 들면, 부가물 형성제인 3-메르캅토프로피온산을 사용한 보호 페닐 아크리디늄 표지 형성의 경우에 있어서, 평형은 N-에틸말레이미드 또는 2,2’-디티오디피리딘를 첨가함으로써 비보호된 표지에 유리한 방향으로 이동되었다.

그러나, 보호기를 표지에 첨가시키는데 여러 가지 다른 부가물 형성제를 선택할 수 있으며, 특정 부가물 형성제에 따라 제조한 비보한 표지를 회복하는 방법을 사용할 수 있다.

더욱이, 본 발명이 올리고뉴클레오티드 프로브 보다는 특이적 결합 파트너에 결합된 표지를 보호시키는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 기본 개념은 이미 특이적 결합 파트너에 결합되거나 또는 이들에 결합될 수 있는 표지를 제공하며, 어느 표지가 발광에 필요한 활성 부분을 가지며, 어느 것이 비활성화되고, 어느 활성 부분이 보호부분에 의해 보호되어 활성 부분이 탈보호된 표지 보다는 비활성에 대해 덜 민감하고 어떠한 탈보호된 화학 발광 표지가 전형적으로 분석에 이어 회복될 수 있는 가를 제공하는 것이다.

상기 발명은 또한 보호 부가물 형성제가 상기 실시예에서와 같이 반드시 유리 형태로 제공되기 보다는 검정 시스템 중에서 특이적 결합 파트너에 결합을 하도록 제공되는 검정에 응용성을 가진다.

이 기술은 표지된 특정/결합 파트너가 보체와 복합체를 형성하는 경우, 표지는 보호될 수 있다는 잇점을 가지며, 상기 특이적 결합 파트너는 스스로 보호 부가물 형성제를 운반할 수 있거나 또는 보호 부가물 형성제를 운반하는 또다른 보체와 추가로 복합체를 형성할 수 있다.

이것은 효과적으로 표지 근처의 보호 부가물 형성제의 부분 농도가 매우 높은 결과로 생기나, 비복합 표지는 동일한 정도로 보호될 수 없으며, 따라서 선택적으로 비활성화시킬 수 있다.

상기 기술은 3개의 특이적 결합 파트너 전체를 수반하는 2 위치 검정에 적용 시킬 수 있다.

제1의 파트너는 보호 부가물 형성제를 운반하는 반면, 제 2의 파트너는 비보호된 표지를 운반한다.

이와 같은 검정법으로는 샌드위치 및 순차적포화형 검정법(sequential saturation type assay)을 들 수 있다.

그러나, 이 기술은 또한 단일 위치 검정(2개의 특이적 결합 파트너만을 수반함)에도 적용된다.

또한, 이 기술에 있어서, 검정법은 동형 또는 이형일 수 있다. 검정 형태에 무관하게 기초가 되는 원리는 화학 발광 표지의 근처의 부가물 형성제의 부분 농도가 탐지할 표적의 존재와 관련하여 변화가능하다는 데에 있다.

구체적인 실시예로서, 검정 형태는 2 위치 DNA 프로브 검정일 수 있으며, 이것에 의해 2개의 DNA프로브가 통상의 폴리뉴클레오티드 표적상의 인접한 위치에 결합한다.

상기와 같은 분석에 있어서, 화학 발광 표지는 제1의 프로브의 말단에 위치할 수 있으며, 부가물 형성제는 제2의 프로브 말단에 위치할 수 있으며, 두 개의 프로브가 표적 뉴클레오티드 서열에 결합될 경우, 보호 부가물 형성제는 첫 번째 프로브상의 화학 발광 표지에 가깝게 존재하게 된다.

동일한 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 2개의 프로브의 동시 결합은 화학 발광 표지의 근처에 있어서 부가물 형성제의 농도를 현저하게 증가시킨다.

이와 같은 증가된 농도는 다시 복합 화학 발광 표지의 안정도를 증가시키며, 이들의 상대적 안정성에 기초하여 프로브의 복합형 및 비복합형의 구별이 가능하게 된다.

실제적으로 보호된 프로브에 영향을 미치지 않는 방법에 의해 비복합 화학 발광 프로브 상에서 표지를 적절하게 비활성화시키고, 복합 프로브에 관련된 부가물을 가역시킨 후, 원래의 화학 발광 표지의 양은 상기 복합체의 양의 척도로서 작용하며, 따라서 존재하는 표적의 양의 척도로서 작용한다.

상기 검정에 있어서 기본 단계는 다음과 같다.

1. 복합된 결합 파트너 중의 표지 근처에 있어서 보호 부가물 형성제의 부분 농도가 높아지도록 검정에 포함된 특이적 결합 파트너들을 서로 복합시키고,

2. 분해(예, 아크리디늄의 가수분해)와 같은 방법으로써 비보호된 표지를 비활성화시키고,

3. 보호된 표지를 탈보호시키고, 이어서

4. 존재하는 표적의 척도로서 원래의 표지 양을 탐지한다.

상기에 예시한 바와 같이, 본 발명은 동형의 검정 형태의 설계에 용이하게 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명은 복합 및 비복합된 특정 결합 파트너를 더욱 구별할 필요가 있을 경우 이형 및 동형 분석 방식에 대해 부수적으로 적용할 수 있다.

본 발명의 상기한 실시태양의 다양한 변형 및 별법은 당업계의 숙련자에 의해 예측될 수 있다.

따라서, 본 발명이 상기한 실시태양 및 변형에만 제한되는 것은 아니다.

Claims (33)

1. (a) 특이적 결합 파트너를 표지에 결합시키고, 이어서 (b) 활성 부분이 비활성화되는 것을 방지하기 위하여 보호 부가물 형성제와 표지의 부가물을 제조하고 이 부가물로부터 표지의 화학 발광 형을 회복시키는 것으로 이루어지는, (i) 특이적 결합 파트너 및 , (ii) 비활성화되어 표지의 비-화학 발광 형을 생성하기 쉬운 불안정한 활성부분을 갖는 화학 발광 표지로부터 표지된 특이적 결합 파트너를 제조하는 방법.
2. (a) 특이적 결합 파트너를 표지에 결합시키고, 이어서 (b) 활성 부분이 비활성화되는 것을 방지하기 위하여 표지에 수소 원자 이외의 보호 성분을 제공하는 보호 부가물 형성제와 표지의 부가물을 제조하고, 이 부가물로부터 표지의 화학 발광 형을 회복시키는 것으로 이루어지는, (i) 특이적 결합 파트너 및 (ii) 비활성화되어 표지의 비-화학 발광 형을 생성하기 쉬운 불안정한 활성 부분을 갖는 화학 발광 표지로부터 표지된 특이적 결합 파트너를 제조하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 표지가 하기 일반식의 것이고 보호 부가물 형성제가 피리디늄 알파 탄소에서 활성 부분에 부가되는 친핵체인 방법.

   

   상기식에서, 피리디늄 고리는 임의로 추가 치환되고, Y는 0, S 또는 NH이고, R1은 임의 치환 탄화 수소이거나 또는 H이고, R4는 이탈기이고,

   

   는 피리디늄 고리의 오르토 또는 파라 위치에 결합된 활성 부분이고, 가수분해되어 표지 및 이탈기를 생성한다.
4. 제1항에 있어서, 상기 표지 하나의 페닐 고리가 임의로 추가 치환된 하기 일반식의 아크리디늄 화합물인 방법.

   

   상기식에서, Y, R1 및 R4는 제 3항에 정의한 바와 같다.
5. 제4항에있어서, 상기 R1이 임의 치환 알킬, 알케닐 또는 알키닐인 방법.
6. (a) 특이적 결합 파트너를 표지에 결합시키고, 이어서 (b) 활성 부분이 비활성화되는 것을 방지하기 위해 보호 부가물 형성제와 표지의 부가물을 제조하여, 이 부가물로부터 표지의 화학 발광 형을 회복시키는 것으로 이루어지는, (i) 특이적 결합 파트너 및, (ii) 하기 일반식의 화학 발광 표지로부터 화학 발광 특이적 결합 파트너를 제조하는 방법.

   

   상기 식에서, 페닐 고리는 임의 치환되고, R1은 임의 치환 탄화수소이거나 또는 H이고, Y는 0, S 또는 NH이고, Z는 0, NH 또는 치환 N, 할로겐 , 임의 치환 S, 치환 P, 치환 B 또는 치환 As 이고, -Z-R5는 이탈기이고,

   

   는 C=Y탄소에서 가수분해되어 비-화확 발광형의 가수분해된 표지 및 이탈기를 생성하는 활성 부분이고, R5는 임의 치환 탄화수소이거나 Z가 할로겐일 경우 존재하지 않는다.
7. 제5항에 있어서, 상기 표지가 하기 일반식의 것인 방법.

   
8. 제6항에 또는 7항에 있어서, 상기 표지가 R5를 통하여 특이적 결합 파트너에 결합된 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 보호 부가물 형성제가 고리의 9번 위치에서 부가되는 친핵성 부가물 형성제인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 보호 부가물 형성제가 1급 티올로부터 선택된것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 보호 부가물 형성제가 1급 알킬 또는 알킬 또는 아릴 티올로부터 선택된 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 보호 부가물 형성제가 1급 알킬 티올로부터 선택된것인 방법.
13. 제9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5-Z-가 임의 치환 알콕시, 알케녹시, 알키녹시 및 알릴옥시로부터 선택된 것인 방법.
14. 제9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R5-Z-가 임의 치환 아릴옥시이고, 상기 R1이 임의 치환 C1 내지 C5 알킬인 방법.
15. 하기의 일반식을 가지며, 특이적 결합 파트너에 대한 표지로서 유용한 보호된 화학 발광 표지.

    

    상기 식에서, 페닐 및 피리닌 고리는 임의로 추가 치환되고, Y는 0, NH 또는 S이고, R1은 H또는 임의 치환 탄화수소이고, R4는 특이적 결합 파트너에 임의로 결합된 이탈기이고,

    

    는 가수분해시 표지의 비-화학 발광 형 및 이탈기를 생성하는 활성 부분이고, M은 분열되어 탈보호된 화학 발광 표지를 생성하고 보호 표지의 활성 부분이 탈보호된 표지에서 보다 가수분해에 대해 덜 민감하도록 선택된,H, OH 또는 OOH 이외의 보호 부분이다.
16. 제15항에 있어서, 상기 R4가 임의 치환 페녹시인 보호 표지.
17. 하기 일반식을 가지며, 특이적 결합 파트너에 대한 표지로서 유용한 보호 표지.

    

    상기 식에서, 페닐 고리는 임의 치환되고, R1 은 H 또는 임의 치환 탄화수소이고, R5는 특이적 결합 파트너에 임의로 결합된 이탈기이고,

    

    카르보닐 탄소에서 가수분해시 표지의 비-화학 발광 형 및 이탈기를 생성하는 활성 부분이고, M은 분열되어 탈보호된 화학 발광 표지를 생성하고 보호 표지의 카르보닐 탄소가 탈보호 표지에서 보다 가수분해에 대해 덜 민감하도록 선택된, H, OH 또는 과산화물 이외의 보호 부분이다.
18. 제17항에 있어서, 상기 탈보호 표지가 과산화수소 또는 산소 및 수산화물과의 반응 후 수용액 중에서 발광하는 보호 표지.
19. 제18항에 있어서, 상기 R5가 임의 치환 아릴 부분이고, R1이 임의 치환 알킬, 알케닐 또는 알키닐 부분인 보호 표지.
20. 제18항에 있어서, 상기 M이 1급 티올인 보호 표지.
21. 제18항에 있어서, 상기 두 페닐기의 임의 치환제가 아미노, 치환 아미노, 카르보닐, 히드록실, 알콕실, 니트로 또는 할라이드 치환체로부터 선택된 것인 보호 표지.
22. 제17항, 18항에 또는 19항에 있어서, 상기 R1이 C1 내지 C10 알킬이고, 두 페닐기가 비치환된 것인 보호 표지.
23. (a) 특이적 결합 파트너, (b) 하기의 일반식을 가지며 특이적 결합 파트너에 결합된 보호 표지로 이루어지는 표지된 특이적 결합 파트너.

    

    상기 식에서, 페닐 및 피리딘 고리는 임의로 추가 치환되고, Y는 0, NH 또는 S이고, R1은 H 또는 임의 치환 탄화수소이고, R4는 특이적 결합 파트너에 임의로 결합된 이탈기이고,

    

    는 C=Y 탄소에서 가수분해시 표지의 비-화학 발광 형 및 이탈기를 생성하는 활성 부분이고, M은 분열되어 탈보호된 화학 발광 표지를 생성하고 보호 표지의 C=Y 탄소가 탈보호시킨 표지에서 보다 가수분해에 대해 덜 민감하도록 선택된, H, OH 또는 과산화물 이외의 보호 부분이다.
24. (a) 특이적 결합 파트너, (b) 하기 일반식을 가지며 특이적 결합 파트너에 결합된 보고 표지로 이루어지는 표지된 특이적 결합 파트너.

    

    상기 식에서, 페닐 고리는 임의 치환되고, R1은 H또는 임의 치환 탄화수소이고,

    

    는 R5가 특이적 결합 파트너에 임의로 결합된 이탈기이고, -C-O-R5는 카르보닐 탄소에서 가수분해시 표지의 비-화학 발광 형 및 이탈기를 생성하는 활성 부분이고, M은 분열되어 탈보호된 화학 발광 표지를 생성하고 보호 표지의 카르보닐 탄소가 탈보호 표지에서 보다 가수분해에 대해 덜 민감하도록 선택된, H, OH 또는 과산화물 이외의 보호 부분이다.
25. 제23항에 있어서, 상기 탈보호 표지가 과산화수소 또는 산소 및 수산화물과의 반응 후 수용액 중에서 발광하는 것인 표지된 특이적 결합 파티너.
26. 제24항에 있어서, 상기 R5가 임의 치환 아릴 부분이고, R1이 임의 치환 알킬, 알케닐 또는 알키닐 부분인 것인 표지된 특이적 결합 파트너.
27. 제26항에 있어서, 상기 M이 1급 티올인 것인 표지된 특이적 결합 파트너.
28. 제26항에 있어서, 상기 두 페닐기의 임의 치환체가 아미노, 치환 아미노, 카르보닐, 히드록실, 알콕실, 니트로 또는 할라이드 치환체로부터 선택된것인 표지된 특이적 결합 파트너.
29. 제25항, 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 R1이 C1 내지 C10 알킬이고 두 페닐기가 비치환된 것인 표지된 특이적 결합 파트너.
30. (a) 검정을 행하고, (b) 비보호된 화학 발광 표지를 회복시키기 위해 그의 보호 부분을 분열시킴으로써 보호 표지를 탈보호시키는 것을 특징으로 하는, (i) 비활성화되어 표지의 비-발광 형을 형성하기 쉬운 불안정한 활성 부분 및 (ii) 활성 부분이 비활성화되는 것을 방지하고, 분열되어 비보호된 화학 발광 표지를 생성하는 보호 부분을 갖는, 화학 발광 표지의 비-화학 발광 보호 형으로 표지된 특이적 결합 파트너를 사용하여 시험 시료 중의 표적에 대한 검정을 행하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 보호 부분이 산화에 의해 분열가능한 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 보호 부분이 페리시아나이트에 의한 산화에 의해 분열가능한 것인 방법.
33. 제24항에 있어서, 상기 탈보호 표지가 과산화수소 또는 산소 및 수산화물과의 반응 후 수용액 중에서 발광하는 것인 표지된 특이적 결합 파트너.

Images