NL8103615A - Werkwijze voor het bepalen van antigene stoffen door immunometrische en remmingsbepalingen onder toepassing van monoclonale antilichamen. - Google Patents

Description

s _ « S 5830-1 Ned.

P & C

Werkwijze voor het bepalen van antigene stoffen door innnunometrische en remmingsbepalingen onder toepassing van monoclonale antilichamen.

De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen voor het detecteren en/of bepalen van de concentratie van antigene stoffen in vloeistoffen, zoals serum. Volgens een ander aspect heeft de uitvinding betrekking op bepalingsmethoden op basis van immunometrie en van remming. Volgens nog 5 een ander espect heeft de uitvinding betrekking op monoclonale antilichamen.

De bepaling van de aanwezigheid of concentratie van antigene stoffen, bijvoorbeeld die, welke verband houden met een grote verscheidenheid van fysiologische afwijkingen, in serum of andere lichaamsvloeistoffen 10 berust steeds meer op immuniteit-bepalingstechnieken. Deze technieken zijn gebaseerd op de vorming van een complex tussen de te bepalen antigene stof en één of meer antilichamen, waarbij het ene of het andere lid van het complex gemerkt kan worden, bijvoorbeeld met een radio-aktief element, 125 zoals I, wat detectering en/of kwantitatieve bepaling daarvan mogelijk 15 maakt nadat het tot een complex gevormde, gemerkte antigeen of antilichaam gescheiden is van het niet tot een complex gevormde, gemerkte antigeen of antilichaam.

In het geval van een concurrerende immuno-bepalingsmethode concurreert de antigene stof in een vloeistofinonster, dat op zijn aanwezigheid 20 onderzocht moet worden, met een bekende hoeveelheid gemerkt antigeen verbinding aan een beperkte hoeveelheid bindingsplaatsen van antilichaam. Zodoende is de aan het antilichaam gebonden hoeveelheid gemerkt antigeen omgekeerd evenredig aan de hoeveelheid antigeen in het monster. Daarentegen gebruikt men bij immunomefcrische bepalingsmethoden een gemerkt antilichaam.

25 Bij een dergelijke bepaling is de bij het complex aangetroffen hoeveelheid gemerkt antilichaam evenredig aan de hoeveelheid antigene stof in het vloeistofinonster.

Het is gebleken, dat immunometrische bepalingen bijzonder goed geschikt zijn voor het detecteren van polyvalente antigenen, d.w.z. antigene 30 stoffen, die in staat zijn tegelijkertijd complexen te vormen met twee of meer antilichamen. Bij dergelijke bepalingsmethoden past men in representatieve gevallen een hoeveelheid niet-gemerkt antilichaam toe, dat aan een vaste drager gebonden is, die onoplosbaar is in de te onderzoeken vloeistof, benevens een hoeveelheid oplosbaar antilichaam, dat gemerkt is, bijvoor-35 beeld met een radio-aktieve isotoop, die detectering en/of kwantitatieve schatting van de hoeveelheid mogelijk maakt van het ternaire complex, dat gevormd wordt door het antilichaam in de vaste fase, het antigeen en het gemerkte antilichaam.

8103615 [ #* ü - 2 -

Bij bekende innnunometrische bepalingsmethoden past men in representatieve gevallen "voorwaartse" bepalingen toe, waarbij het aan de vaste fase gebonden antilichaam eerst in kontakt wordt gebracht met het te onderzoeken monster, teneinde het antigeen uit het monster te extraheren door vorming 5 van een binair complex van antilichaam in de vaste fase en antigeen. Na een geschikte inkubatietijd wordt de vaste drager gewassen om het residu van het vloeistofmonster, met inbegrip van eventueel niet-omgezet antigeen te verwijderen, en daarna in kontakt gebracht met een oplossing, die een bekende hoeveelheid gemerkt antilichaam bevat.

10 Na een tweede inkubatietijd, teneinde het gemerkte anti-liöhaam \in staat te stellen een complex te vormen met het via het niet-gemerkte antilichaam aan de vaste drager gebonden antigeen, wordt de drager voor de tweede maal gewassen om het niet-omgezette gemerkte antilichaam te verwijderen. Bij een eenvoudige "ja/neen" proef ter bepaling of het antigeen in 15 het onderzochte monster aanwezig is, wordt de gewassen vaste drager onderzocht om de aanwezigheid van gemerkte antilichaam te detecteren, bijvoorbeeld door meting van de geëmitteerde straling als de merkstof een radio-aktief element is. Dë' gedetecteerde hoeveelheid gemerkt antilichaam wordt vergeleken met die voor een negatief controlemonster, waarvan bekend is, 20 dat het vrij is van het antigeen. Een detectering van gemerkt antilichaam in hoeveelheden, die aanzienlijk boven de achtergrondniveaus liggen, die worden aangegeven door de negatieve controle, wordt* geïnterpreteerd een aanwijzing te zijn voor de aanwezigheid van het verdachte antigeen. Kwantitatieve bepalingen kunnen worden uitgevoerd dqor de mate van de aan-25 wezigheid van gemerkt antilichaam te vergelijken, met die, welke verkregen wordt voor geijkte monsters, die bekende hoeveelheden van het antigeen bevatten.

Dit soort bepaling "'wordt, vaak een "tweezijdig" of "sandwich"-be- paling genoemd, aangezien het antigeen twee antilichamen op verschillende 30 plaatsen aan zijn oppervlak gebonden bevat. Deze en verwante methoden zijn beschreven door Wide op blz. 199-206 van."Radioimmunoassay Methods", onder redactie van Kirkham en Hunter, E.& S. livingstone, Edinburgh, 1970.

Een op deze techniek berustende bepalingsmethode voor het detecteren van het met serumhepatitis samenhangende antigeen onder toepassing van een met 125 35 I gemerkt antilichaam is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.867.517.

Ondanks hun grote bruikbaarheid heeft men erkend, dat de bekende immunometrische bepalingsmethoden langzaam verlopen, gedeeltelijk omdat twee wasbehandelingen nodig zijn en omdat langdurige inkubatietijden ver- 8103615 f 4 - 3 - eist zijn ter benadering van het evenwicht, d.w.z. het punt, waarbij de gevormde hoeveelheid complex niet meer verandert met de tijd.

Om tenminste één van de bij deze werkwijze behorende wasbehandelingen uit te schakelen heeft men de zogenaamde "gelijktijdige" en "omgekeerde" 5 bepalingen voorgesteld. Bij een gelijktijdige bepaling wordt één enkele inkubatiestap uitgevoerd, aangezien het aan de vaste drager gebonden anti-lichaam en het gemerkte antilichaam beide tegelijkertijd aan het onderzochte monster worden toegevoegd. Na voltooiing van de inkubatie wordt de vaste drager gewassen om de rest van het vloeibare monster en niet tot 10 een complex gevormd, gemerkt antilichaam te verwijderen. Daarna bepaalt men de aanwezigheid van gemerkt antilichaam, dat gekombineerd is met de vaste drager, evenals het geval is bij een gebruikelijke "voorwaartse" sandwich-bepaling.

Bij een omgekeerde bepaling voegt men stapsgewijs eerst een oplos-15 sing van gemerkt antilichaam aan het vloeistofmonster toe, wat na een geschikte inkubatietijd gevolgd wordt door toevoeging van ongemerkt antilichaam, dat aan een vaste drager gebonden is. Na een twee inkubatie wordt de vaste fase op gebruikelijke wijze gewassen om hem te bevrijden van de rest van het onderzochte monster en van de oplossing van het niet-omgezette 20 gemerkte anti-lichaam. Daarna voert men de bepaling uit van gemerkt antilichaam, dat gekombineerd is met de vaste drager, evenals bij de gelijktijdige en voorwaartse bepalingen.

Zowel de gelijktijdige als de omgekeerde bepalingsmethoden vereisen een voldoende overmaat antilichaam in de vaste fase om het grootste deel 25 van of al het aanwezige antigeen te binden, teneinde een "haakeffekt" bij hoge dosis te vermijden, waarbij de waarneming voor antigeen kunstmatig negatief of zeer laag is bij uiterst hoge concentraties van antigeen.

Om deze reden werd tot dusver de zogenaamde voorwaartse bepalingsmethode als de voorkeur verdienende beschouwd. Dit komt, omdat grote hoeveelheden 30 sterk gezuiverd, aktief antilichaam, dat specifiek is voor het van belang zijnde antigeen, die nodig zijn ter bereiding van een vaste fase met voldoende bindingsvermogen voor antigeen, moeilijk te verkrijgen zijn uit de "polyclonale" antilichamen, die bij de bekende werkwijzen gebruikt werden. Wanneer men een immunogene stof in een levend lichaam brengt, 35 reageert het immuunsysteem van dit lichaam door antilichamen te vormen voor iedere plaats van het immunogene middel, dat het herkent. Een groot immunogeen eiwitmolecuul kan tientallen van dergelijke plaatsen bezitten en een vreemde cel kan er honderden hebben. Terwijl zodoende iedere antilichamen producerende cel een antilichaam vormt, dat specifiek is voor 40 één enkele plaats op het antigeen, heeft het immuunsysteem een soort 8103615 % - 4 - specifiek antilichaam gevormd, waarbij cellen gevormd worden voor iedere herkende immunogene plaats. Bovendien heeft het lichaam betrekkelijk grote hoeveelheden antilichamen gevormd voor andere antigenen dan die, welke van belang zijn, zodat het grootste deel van het antilichaam in het poly-5 clonale mengsel niet specifiek is voor het van belangzijnde antigeen. Derhalve zijn de bij de bekende immunometrische bepalingsmethoden gebruikte antilichamen noodzakelijkerwijs "polyclonaal" van aard, aangezien deze antilichamen verkregen zijn uit antisera,, die op gebruikelijke wijze bij dieren zijn opgewekt, en de zuivering daarvan is moeilijk. Methoden voor 10 het door affiniteit zuiveren van dergelijke antilichamen waren in het algemeen tijdrovend en leiden tot lage opbrengsten en verlies van antilichamen met grote affiniteit.

Bij toepassing van gebruikelijke polyclonale antilichamenmengsels bij de omgekeerde en gelijktijdige bepalingsmethoden is de vorming moge-15 lijk van een "sandwich", die het antigeen bevat, dat tot een complex gevormd is met twee of meer gemerkte antilichamen, die op verschillende plaatsen met het antigeen complexen vormen. Deze complexen kunnen oplosbaar blijven in het onderzochte mengsel en dus bij daarop volgende wasbehandelingen verwijderd worden en niet meegeteld worden, wanneer de vaste 20 fase geanalyseerd wordt op gemerkt antilichaam, dat aan de vaste fase gebonden is. Als dit in aanmerkelijke mate optreedt, gaat de gevoeligheid van de methode achteruit en kunnen foutieve resultaten optreden. Wanneer het ongemerkte gebonden antilichaam echter eerst aan het monster wordt toegevoegd, zoals bij de voorwaardse "sandwich" bepaling, verhinderen sterische 25 overwegingen de vorming van een sandwich, die het antigeen bevat, dat een complex gevormd heeft met twee of meer ongemerkte antilichamen, waarbij gemerkt antilichaam wordt uitgesloten om ook een binding aan te gaan met het antigeen. Derhalve is het antigeen hier wel vrij om met een gemerkt antilichaammolecuul te reageren. Desondanks heeft men voorgesteld een 30 "gelijktijdige" bepalingsmethode toe te passen voor menselijk schildklier stimulerend hormoon (HTSH) door toepassing van een grote overmaat van het aan een vaste fase gebonden,, ongemerkte antilichaam, teneinde de vorming van een oplosbaar complex door oplosbare gemerkte antilichamen zoveel mogelijk terug te dringen. Men zie hiervoor Jeong c.s. "Comparison of 35 Radioimmunoassay (RIA) Unique, Single-incubation Two-Side Immunoradio-metric Assay (IRMA) as Applied to the Determination of Human Thyroid Stimulating Hormone (HTSH)," Bio-Rad Laboratories, 1979.

Een variatie van een "gelijktijdige (simultaan)" bepaling wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.174.384. Bij die bepaling 40 worden afzonderlijke delen van anti-IgG (menselijke) respektievelijk ge- 8103615 i i - 5 - merkt met een fluorescerende chromofore verbinding (fluoresceien) en een chromofoor (rodamine), dat licht absorbeert, dat door het fluoresceien geemitteerd wordt. De beide antilichamen worden in oplosbare vorm in kontakt gebracht met een monster, dat menselijk · IgG bevat. Een reaktie 5 van het anti-IgG met het IgG kan de beide chromoforen voldoende dicht bij elkaar brengen, d.w.z. binnen 10 nm of minder, zodat de emissie van licht door het fluorescerende chromofoor geabsorbeerd (afgezwakt) wordt door het andere. Het percentage maximale fluorescentie voor het monster wordt bepaald en als maat gébruikt voor de hoeveelheid IgG in het monster.

10 Ook heeft men voorgesteld een omgekeerde bepaling toe te passen voor HTSH, met hepatitis verband houdend antigeen (HAA) en carcino-embryonisch antigeen (CEA) door toepassing van een hoeveelheid gemerkt antilichaam, die voldoende is om een complex van gemerkt antilichaam en antigeen te verzekeren, maar onvoldoende om een "sandwich" van al het in een monster aan-15 wezige antigeen te vormen; zie Amerikaans octrooischrift 4.098.876.

Aangezien bij alle drie bekende werkwijzen een polyclonaal mengsel van antilichamen wordt toegepast, wordt de mogelijkheid voor een kruis-reaktie met andere materialen in het serum of andere vloeistof dan het antigeen waarvoor de proef bedoeld is, verhoogd. Het optreden van kruis-reakti-20 viteit met andere antigenen vermindert ook de gevoeligheid van de proef voor het verdachte antigeen en verhoogt de mogelijkheid van een valse positieve uitkomst van de bepaling. Voorts vereist de toepassing van polyclonale antilichamen bij een simultane of omgekeerde bepalingsmethode een zorgvuldige afweging van de gebruikte hoeveelheid gemerkte antilichaam ten opzichte 25 van de aanwezige hoeveelheid antilichaam in de vaste fase en/of antigeen.

In het geval van de toepassing van uitdoving van fluorescentie wordt de gevoeligheid verminderd, omdat de minimum afstand tussen het fluorescerende chromofoor en het uitdovende chromofoor niet verzekerd is, wanneer men polyclonale antilichamen toepast.

30 In verband met deze bezwaren zijn de beperkingen van de bekende immu- nometrische methoden duidelijk. De gebruikelijke "voorwaartse" bepalingen worden met minder stappen uitgevoerd, maar vereisen grotere hoeveelheden specifiek antilichaam in de vaste fase en zijn niet goed geschikt voor de bepaling van kleine concentraties antigeen, aangezien de vorming van een 35 sandwich van het antigeen met een aantal gemerkte antilichaammoleculen concurreert met de vorming van de sandwich, die gebonden antilichaam: antigeen: gebonden antilichaam bevat of·in het geval van de toepassing van uitdoving van fluorescentie is de vorming mogelijk van een sandwich zonder dat een fluorescerend chromofoor gepaard gaat. met een uitdovend chromofoor; 8103615

* . V

l - 6 - en al deze methoden zijn onderhevig aan foute interpretaties of valse positieven wegens de polyclonale aard van hët antilichaam.

De uitvinding beoogt derhalve een verbeterde werkwijze te verschaffen voor de immunometrische bepaling van antigene stoffen.

5 Meer in het bijzonder beoogt de uitvinding snellere immunometrische bepalingsmethoden te verschaffen.

Voorts beoogt de uitvinding gevoeliger immunometrische bepalingsmethoden te verschaffen.

Verder beoogt de uitvinding verbeterde "simultane" en "omgekeerde" 10 immunometrische bepalingen te verschaffen.

Ook beoogt de uitvinding verbeterde remmingsproeven te verschaffen.

Eén en ander wordt hieronder nader beschreven.

Volgens de uitvinding worden de polyclonale antilichamen, die bij een immunometrische bepalingsmethode gebruikt worden (bijvoorbeeld als het 15 ongemerkte antilichaam, dat aan een vaste drager gebonden is en het als oplosbaar gemerkte antilichaam gebruikte antilichaam of wel in een geval van bepalingsmethoden,· die gebaseerd zijn op uitdoving van fluorescentie, de antilichamen, die een fluorescerend of uitdovend chromofoor dragen) vervangen door tenminste één en gewoonlijk twee of meer verschillende mono-20 clonale antilichamen, d.w.z. antilichamen, die elk specifiek zijn voor één enkele antigene plaats en afzonderlijk geproduceerd worden door clonen afgeleid van bijzondere cellenlijnen.

De uitvinding verschaft een'immunometrische bepalingsmethode voor het onderzoeken van een vloeistofmonster, waarbij men een ternair complex 25 vormt van de antigene stof, een eerste antilichaam en een tweede antilichaam, dat op een andere plaats waar het eerste antilichaam aan het antigeen gebonden is, door het monster met het eerste en tweede antilichaam in kontakt te brengen, welke werkwijze tot kenmerk, dat men als eerste en tweede antilichaam een monoclonaal antilichaam toepast.

30 Volgens eën voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is het mono- clonale antilichaam, dat als het aan een vaste drager gebruikte antilichaam wordt toegepast, het produkt van een andere cellenlijn dan het monoclonale antilichaam, dat als gemerkt antilichaam gebruikt wordt, terwijl de beide monoclonale antilichamen zodanig gekozen worden, dat zij aan de antigene 35 stof gebonden worden op plaatsen, die op een afstand van elkaar liggen, teneinde de bindingen van elkaar aan het antigeen niet te storen. In het geval van uitdoven van fluorescentie zijn de beide antilichamen ook gewoonlijk produkten van verschillende cellenlijnen en worden zij zodanig gekozen, dat zij de binding van de andere niet storen, terwijl toch de beide chromo-40 foren dicht genoeg bij elkaar worden gdstacht om uitdoving van fluorescentie 8103615 < * » - 7 - mogelijk te maken, d.w.z. gewoonlijk binnen ca. 10 nm. De voordelen van de uitvinding, in het bijzonder bij simultane en omgekeerde bepalingen, ten opzichte van de bekende methoden worden hieronder nader toegelicht, mede aan de hand van de bijgevoegde tekening.

5 Ook gebruikt men volgens de uitvinding monoclonale antilichamen bij remmingsbepalingen. Bij dergelijke bepalingen brengt men een bekende hoeveelheid van een-antigeen en monoclonaal antilichaam in kontakt met een monster, dat verdacht wordt een antigeen te bevatten, dat overeenkomt met het bekende antigeen, dat met het monoclonale antilichaam wordt toegevoegd. De 10 mate, waarin remming optreedt van het complex tussen het antilichaam en antigeen, doordat een complex van het monoclonale antilichaam en antigeen uit het monster gevormd wordt, is een maat voor de aanwezigheid en/of hoeveelheid antigeen in het onderzochte monster.

Verder omvat volgens de uitvinding een werkwijze ter bepaling van 15 de aanwezigheid of concentratie van een antigene stof in een vloeistof de volgende stappen: (a) men brengt een monster van de vloeistof in kontakt met een bekende hoeveelheid toegevoegde antigene stof en een monoclonaal antilichaam voor de antigene stof en 20 (b) men meet de remming van de vorming van een complex tussen het antilichaam en de toegevoegde antigene stof door kombinatie van het monoclonale antilichaam en de antigene stof in de vloeistof onder vorming van een tweede complex.

Volgens een voorkeuruitvoeringsvorm worden het antilichaam en het 25 antigeen respectievelijk gebonden aan één van de leden van een stel fluorescerende en uitdovende chromoforen. Remming van de vorming van een complex tussen het gemerkte antigeen en het antilichaam door in het onderzochte monster aanwezige antigenen leidt tot een vermindering van de uitdoving en een toename van de fluorescentie. De mate van de remming van de uitdoving 30 is een maat voor de antigeenconcentratie in het monster. Volgens een andere voorkeursuitvoeringsvorm van een remmingsproef wordt men uit bekende antigeen en antilichaam voor het oorpronkelijke complex gebonden aan deeltjes, bijvoorbeeld latexdeeltjes, waarvan de grootte het mogelijk maakt, dat zich agglomeraten vormen. Wanneer een monster, dat verdacht wordt antigeen te 35 bevatten, in kontakt wordt gebracht met het antilichaam en het gebonden antigeen, treedt remming van de agglomeraatvorming op tengevolge van complexvorming tussen het gebonden antilichaam en antigeen uit het monster, waardoor geen agglomeraten gevormd kunnen worden. De vermindering in agglomeratie kan gemeten worden met behulp van turbidimetrische methoden.

8103615 4· v . .......

- 8 -

Figuur 1 is een grafiek, die de resultaten weergeeft, die bij vier soorten immunometrische bepalingen van menselijke IgE verkregen worden onder toepassing van polyclonale antilichamen.

Figuur 2 is een overeenkomstige grafiek, die het verschil in resul-5 taten toont, dat onder toepassing van monoclonale antilichamen verkregen wordt met dezelfde vier soorten immunometrische bepalingen van menselijke IgE.

Zoals reeds vermeld, wordt volgens de uitvinding het polyclonale antilichaam, dat bij een immunometrische bepaling van antigene stoffen 10 wordt gébruikt, vervangen door een monoclonale antilichaam. Evenzo past men monoclonale antilichamen toe bij remmingsbepalingen. De uitvinding is geschikt voor het bepalen van de aanwezigheid uit de concentratie van een grote verscheidenheid van antigene stoffen, waaronder polyvalente antigene stoffen. Onder antigeen of antigene stof worden hier algemeen 15 stoffen verstaan, waartegen antilichamen gevormd kunnen worden. Als dergelijke stoffen zijn te noemen haptenen, hormonen, zoals insuline en menselijk schildklier stimulierend hormoon (HTSH), gamma globulinen, allergenen, virussen, virüsonderdelen (subunits), bacteriën, toxinen, zoals die, welke verband houden met tetanus en met dierlijke vergiften, en zelfs sommige 20 geneesmiddelen. Als specifieke antigenen, die met de werkwijzen van de uitvinding bepaald kunnen worden, zijn te noemen carcino-embryonisch antigeen (GEA), hepatitis A en B, hepatitis Non A - Non B, IgE en a-feto-protelne.

De bij de werkwijze volgens de uitvinding geschikte monoclonale anti-25 lichamen worden verkregen met de werkwijze, die door Milstein en Kohier beschreven is in Nature 256, 495-497 (1975). De details van deze werkwijze zijn bekend en worden hier niet herhaald. In principe komt het echter hierop neer dat men een muis of ander geschikt zoogdier injecteert met een immunogeen. De muis wordt vervolgens opgeofferd en uit de milfc daarvan ge-30 nomen cellen worden gefuseerd met myeloomcellen. Het resultaat is een hybridische cel, die een "hybridoom" genoemd wordt en die in vitro reproduceert.

De populatie van hybridomen wordt onderzocht en verder behandeld om individuele clonen te isoleren, waarvan elk één enkele soort antilichaam 35 voor het antigeen afscheidt. Iedere afzonderlijke soort antilichaam, die op deze wijze verkregen wordt, is het produkt van een enkele B cel van het immune dier, die gevormd is als responsie op een bepaalde antigeenplaats, die op de immunogene stof herkend is.

Wanneer een immunogene stof wordt ingevoerd in een levende gastheer, 40 reageert het immuunsysteem van de gastheer door antilichamen de produceren 81 0 3 6 1 5 4 * c - 9 - tegen alle herkenbare plaatsen op de stof. Deze "geweer" benadering door antilichamen te vormen om de indringer te bestrijden leidt tot de pro-duktie van antilichamen met verschillende affiniteiten en specifiteiten voor de immunogene stof. Nadat derhalve de verschillende hybridoom-cellen-5 lijnen onderzocht zijn om die te identificeren, welke antilichaam produceren voor het gewenste antigeen, worden de door de afzonderlijke hybri-doont-cellenlijnen geproduceerde antilichamen bij voorkeur verder uitgezocht om die te identificeren, welke de grootste affiniteit bezitten voor de immunogene stof, wat hun oorspronkelijke produktie vóór de selectie voor 10 toepassing volgens de uitvinding stimuleert. Aangenomen wordt, dat een op dit kriterium gebaseerde selectie het' verschaffen van de grotere gevoeligheid bevordert bij de immunometrische en remmingsproeven van de uitvinding onder toepassing van monoclonale antilichamen in vergelijking met de polyclonale antilichamen, die bij de bekende werkwijzen gebruikt worden, 15 welke antilichamen op zijn gunstigst een affiniteit voor het antigeen bezitten, die ruwweg het gemiddelde is van de affiniteiten van alle antilichamen, die door het immuunsysteem geproduceerd worden. Bij voorkeur bezit het geselecteerde monoclonale antilichaam een affiniteit, die verenigbaar is met de gewenste gevoeligheid en het gewenste traject voor 20 het betrokken proef systeem. Bij voorkeur bezit het antilichaam een affi- g niteit vein tenminste 10 liter/mol en nog meer bij voorkeur een affini- g teit van tenminste 10 liter/mol.

Tevens kunnen de monoclonale antilichamen met de grootste affiniteiten verder onderzocht worden door een gesimuleerde bepaling uit te 25 voeren met monsters, waarvan bekend is, dat zij valse positieve resultaten geven met methoden, waarbij gebruikelijke polyclonale antilichamen gebruikt worden, teneinde zo die monoclonale antilichamen te identificeren, die geen kruisreaktie aangaan en geen valse positieve resultaten geven.

Omdat de op twee plaatsen optredende immunometrische bepalingsmethode 30 berust op de vorming van een sandwich van antilichaam: antigeen: antilichaam, kiest men gewoonlijk twee verschillende monoclonale antilichamen, die de binding van elkaar aan het antigeen niet storen, als gebonden antilichaam en oplosbaar gemerkt antilichaam ofwel als stel antilichamen, wanneer uitdoving vein fluorescentie wordt toegepast. Aangezien beide noodzakelijk zijn 35 om de sandwich te voltooien, kunnen omgekeerde en simultane bepalingen ook worden uitgevoerd zonder dat men angst hoeft te hebben, dat bijvoorbeeld een complex van gemerkt antilichaam : antigeen : gemerkt antilichaam gevormd wordt, dat de vorming van een complex tussen het antigeen en het aan de vaste fase gebonden antilichaam zou uitsluiten, en dit betekent een bij-40 zonder voordeel van de onderhavige uitvinding. Verder kan een voorwaartse 8103615 - 10 - .* * t proef uitgevoerd worden zonder de tussenstap van het' wassen, aangezien de beide antilichamen zich aan twee verschillende plaatsen binden. Een dergelijke werkwijze wordt een "snel voorwaartse" bepaling genoemd.

In het bijzonder echter in het geval van een voorwaartse bepaling 5 kan hetzelfde monoclonale antilichaam gebruikt worden voor zowel het gemerkte antilichaam als het aan de vaste drager gebonden antilichaam, wanneer de antigene stof identieke bindingsplaatsen voor antilichaam bezit, die voldoende ver van elkaar verwijderd zijn om. het mogelijk te maken, dat tegelijkertijd meer dan één antilichaammolecuul gebonden wordt. In een dergelijk 10 systeem wordt door eerst toevoegen van het gebonden antilichaam en het monster de vorming van een sandwich wegens sterisChe overwegingen uitgesloten. Wanneer vervolgens.het gemerkte monoclonale antilichaam wordt toegevoegd, is dit'eveneens in staat een complex te vormen met het antigeen, dat reeds aan het ongemerkte antilichaam op de vaste fase gebonden is.

15 Het ongemerkte monoclonale antilichaam, dat bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt wordt om de antigene stof uit het te onderzoeken monster te extraheren, kan geïmmobiliseerd worden op elk van de gebruikelijke dragers, die toegepast worden bij immunometrische bepalingen. Als zodanig zijn te noemen filtreerpapier, kunststof kralen of reageerbuisjes, 20 die vervaardigd zijn van polyetheen, polystyreen, polypropeen of ander geschikt materiaal. Ook geschikt zijn deeltjesvormige materialen, zoals agarose, verknoopt dextran en andere polysacchariden. De methoden voor het hechten van antilichamen en dergelijke materialen zijn op zichzelf bekend.

Zo kunnen bijvoorbeeld antilichamen aan polysaccharidepolymeren gebonden 25 worden volgens de in het Amerikaanse octrooischrift 3.645.852 beschreven werkwij ze.

Het bij de uitvinding gebruikte, gemerkte monoclonale antilichaam kan van dezelfde merking voorzien worden als bij de bekende immunometrische bepalingen. Als zodanig zijn te noemen fluorogene merken voor het detecteren 30 door fluorimetrie, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.940.475 en enzymatische markeringen, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.654.090. Het verdient thans de voorkeur het antilichaam 125 te merken met een radioisotoop, bijvoorbeeld I, waarbij men bijvoorbeeld de werkwijze van Hunter en Greenwood, Nature, 144 (1962), blz.945 of die 35 van David c.s., Biochemistry, Vol. 13, blz. 1014-1021 (1974) kan toepassen.

Bij een representatieve bepaling wordt de hoeveelheid gemerkt antilichaam, die gekombineerd is met het onoplosbare sandwich-complex bepaald door onderzoek van het onoplosbare drager materiaal met geschikte middelen. Het is echter ook mogelijk de aanwezigheid of afwezigheid van antigeen in 40 het te onderzoeken vloeistofmonster in verband te brengen met de hoeveelheid 8103615 - 11 - gemerkt antilichaam, die tijdens de bepaling niet reageert en in oplosbare vorm aanwezig blijft.

De voordelen van de uitvinding/ waarbij monoclonale antilichamen gebruikt worden bij de immunometrische bepalingen, ten opzichte van de 5 polyclonale antilichamen blijken uit het onderstaande voorbeeld. In dit - voorbeeld werden vier vergelijkende proeven uitgevoerd, een simultane bepaling, een omgekeerde bepaling, een voorwaartse bepaling en een snel-voorwaartse bepaling, waarbij zowel monoclonale antilichamen als polyclonale antilichamen gebruikt werden en een standaardserum werd toegepast, 10 dat 100 IE/ml menselijk IgE als'positief monster bevatba.Als negatieve controle werd normaal paardeserum gebruikt, dat geen IgE bevatte.

Het polyclonale antilichaam voor IgE, dat als gemerkt antilichaam bij dit voorbeeld werd gebruikt, werd verkregen van Pharmacia Diagnostics, Piscataway, New Jersey. Het aan de vaste drager gebonden polyclonale anti-15 lichaam werd verkregen van Tago, Inc. Burlingame, Californie.

Monoclonaal antilichaam voor IgE werd verkregen onder toepassing van de bovengenoemde methode van Milstein en Kohier. De beide gekozen anti- 9 lichamen vertoonden ieder een affiniteit voor IgE van meer dan 10 liter/mol en stoorden de binding van het andere aan IgE niet.

20 De proeven werden uitgevoerd onder toepassing van ongemerkt anti lichaam, dat aan agarose gebonden was volgens de werkwijze van het Amerikaanse octrooischrift 3.645.852. Het merken van het antilichaam geschiedde 125 met I volgens de bovengenoemde werkwijze van David c.s. Men gebruikte met fosfaat gebufferde zoutoplossing met pH 7,4 om alle monsters te wassen. 25 Voorbeeld ’> 1) Simultane bepalingsmethode.

Men onderzocht monsters in duplo. Men mengde 100 pl van een suspensie van op agarosedeeltjes geïmmobiliseerd antilichaam met 100 pi monster 125 (serum) en 100 pl oplosbaar, met I gemerkt antilichaam. Dit mengsel werd 30 gedurende de in tabel A voor polyclonale antilichamen en in tabel B voor > monoclonale antilichamen opgegeven tijden plus 30 minuten geincubeerd.

De extra 30 minuten inkubatietijd werd toegepast om deze bepalingsmethode gelijk te maken met de andere bepalingsmethoden, die een verdere 30 minuten inkubatietijd vereisten voor een tweede toegevoegd reagens. Na de inkubatie-35 tijd werden de agarosedeeltjes door toevoeging van buffer gewassen en gecentrifugeerd. Na verwijdering van de wasvloeistof door af zuigen werd het verkregen tablet van agarosedeeltjes vervolgens door tellen onderzocht op 125 gebonden, met I gemerkt antilichaam. De voor elk van de complexen na.de genoemde inkubatietijd verkregen tellingen zijn weergegeven in tabel A en B.

8103615 tf t, k - 12 - « 2) Omgekeerde bepalingsmethode.

Men onderzocht monsters in duplo. Men mengde 100 ul monster (serum) 125 met 100 jil met I gemerkt oplosbaar antilichaam en inkubeerde gedurende de in tabel A en B opgegeven tijden. Daarna voegde men 100 jil van een 5 suspensie van op agarosedeeltjes geïmmobiliseerd antilichaam toe en inkubeerde het mengsel nog 30 minuten. Daarna werden de agarosedeeltjes gewassen en geteld als bij de simultane bepalingsmethode. De uitkomsten van de tellingen zijn weergegeven in tabel A en B.

3) Voorwaartse bepalingsmethode.

10 Men onderzocht monsters in duplo..Men mengde 100 pl monster (serum) met 100 pl van een suspensie van op agarosedeeltjes geïmmobiliseerd antilichaam en inkubeerde gedurende de in tabel A en B opgegeven tijden.

Daarna werden de agarosedeeltjes eenmaal gewassen door toevoeging van 2,5 - 3,0 ml buffer, die na het mengen afgecentrifugeerd werd; de vloei- 125 15 stof werd door afzuiging verwijderd. Daarna voegde men 100 yal met I gemerkt oplosbaar antilichaam toe en inkubeerde het mengsel nog 30 minuten. Daarna werden de agarosedeeltjes gewassen en geteld evenals bij de simultane bepalingsmethode. De uitkomsten van de tellingen zijn weergegeven in tabel A en B, 20 4) Snelle voorwaartse bepalingsmethode.

De bepaling werd weer in duplo uitgevoerd en op overeenkomstige wijze als de voorwaartse bepalingsmethode, echter met dit verschil, dat de wasbehandeling tussen de eerste inkubatie van het monster met op agarosedeeltjes geïmmobiliseerd antilichaam en de toevoeging van oplosbaar, met 125 25 I gemerkt antilichaam werd weggelaten.

De tellingen per minuut voor de beide controleproeven en voor de in duplo uitgevoerde bepalingen van de IgE bevattende monsters onder toepassing van polyclonaal antilichaam en monoclonaal antilichaam zijn weergegeven in tabel A, respectievelijk tabel B. Deze gegevens werden op de 30 volgende wijze gebruikt om figuur 1 en 2 te vervaardigen. Het gemiddelde van de tellingen/minuut voor een controlemonster voor een bepaalde inku-batietijd werd afgetrokken van het gemiddelde van de verkregen tellingen voor de overeenkomstige IgE-bepaling. Het verschil werd berekend als een percentage van het totaal van de tellingen per minuut voor het gemerkte 35 antilichaam, dat aan het monster werd toegevoegd, en dit is op de Y-as uitgezet als percentage van totale tellingen/minuut van aan de vaste fase gebonden antilichaam. De inkubatietijd is op de X-as uitgezet.

Bij vergelijking van de grafieken van figuur 2 die de resultaten tonen met behulp van monoclonaal antilichaam, met die van figuur 1, die 40bepalingen tonen onder toepassing van polyclonaal antilichaam, ziet men, 8103615 k - 13 - dat bij iedere soort bepaling, d.w.z. simultane, omgekeerde voorwaartse en snelle voorwaartse, de bepaling onder toepassing van monoclonaal anti-lichaam gevoeliger was, wat blijkt uit het hogere percentage van de totale tellingen, dat aan de vaste fase gebonden was bij een monster met 100 IE 5 IgE/ml. Verrassenderwijs werd in het geval van de simultane en omgekeerde bepalingen gevonden, dat bij de proef met monoclonaal antilichaam het evenwicht sneller bereikt wordt dan bij de overeenkomstig proef met behulp van polyclonaal antilichaam. Door derhalve monoclonaal antilichaam bij deze proefmethoden toe te passen kan de voor de bepaling benodigde tijd 10 aanmerkelijk verminderd worden, nog afgezien van de tijdsbesparing, die bereikt wordt door eenvoudig een wasbehandeling uit te schakelen. Wat dat betreft, werd bij de omgekeerde bepaling met monoclonaal antilichaam het evenwicht in minder dan een uur bereikt. Wanneer men dezelfde bepaling uitvoerde met polyclonaal antilichaam werd het evenwicht slechts na 4 uren 15 bereikt. Evenzo werd in het geval van simultane bepalingen bij de bepaling onder toepassing van monoclonaal antilichaam het evenwicht binnen 8 uren bereikt, waar tegenover dit bij de proef met polyclonaal antilichaam in 24 uur nog niet het geval was. Derhalve verschaft de uitvinding aanzienlijk snellere en gevoeliger simultane en omgekeerde bepalingen dan de bekende 20 werkwijzen en schakelt het risico uit, dat de vorming van een oplosbaar "sandwich" complex concurreert met de vorming van het gewenste onlosbare complex.

8103615 » < * - 14 - oo va o ro o cn ro o co co cn r··· <1) ^ cn p» co co ^

CQ d) CN | Ή «H *-t *H *-C

J 1 .fj ******* * u cn ·<-ι ι σι co o ro o 3 h g r- co cn cn oo in (0 u o m ο- r- r-- cn ·3<

5 H S CN

M

O &>

O G

> Ή «H

H (0 I

d) ft 0) cn S G d) Η μ ro ^ N iM (i 3 w m O <u cn co h m ui in co μ +j cn | cn ro cn cn cn H 4Jcn^’ι···fc*,·,i ü G G co I "3* CO ro »-< ro •H OOCn O 00 CO O t" Η u E (*i ‘ ro cn cn ro cn

•H

P

§ P p ui ® N N <i ωΓ'-^ΐΡΐΉσϊΐοο h μοοοοΝΟοο'ϊΌ

(ö dJMrlPIMNHH

4J ^ ***.·*** *|> ·* G cncginr'UOffion o HGcnoiO’S'^-iinin h <u tnoocn-ncrior-in om hScn*hcn»hcn»h»-i >i +J _ η μ & O (ö G ft m -η i 5 h d) m G ΜίβΗμνΟΓΟ-^’ϋ'ΐη^Γ' 3 oftoocNcocgT-iinvor^ > o d) ^+JmcN<irocgcgog > pq m **·***·*«

ft GGP'OOin rg'i'^HO

(—I oomcounor'^rg G USrocNrorocNCNro Λ i - d) o ·<-ι cn co cn *h ro co MCDOIHHUI^fl 4J GincncNCNOcoin <U d) cn cn ro ro ro ro ro g 4J *%>**«·«>*

fiC IKltOCOifPOINH

G ΜβνΟίΛΙΠΓ'ΉνΟϋΙ jd) o>Ouioi'-i(n ,!llpdi H ö> h S cs cs ro ro co cn co a-5 s

Eh η μ &>

iö d) G

ft Φ -H

<D X H

0) (8 I

öi ft cu m

GidJH^cncgp'^i'O^.cn «om οφ^όγ-'Ρ-οοοοό > iggJcgcMCMcgcgcgcg 4j cn *******

G GGC'd'tf^OCOUOfO

d) oooooocricgcrim

+J CJ Ë ΓΟ CN CO CN CN CM

« μ

I—I

3 cn ['•vocor^co^oo

<D cnvovoora^ocN

K μνο<οΓ'-οοΓ'·*-<Ό (INNMMnO1^1 4J ^ S V ^ ·» K ·>

ninHnc'OtO'J

WGocn<ncn<yiCN<o

Dior-for"cocoouo HËCNCNCNCNCO'Cl1,Cl1 d) § £

•μ ·η I

η η d) m

GcdHM'^firip'COinvop' SftO lllOlOplIICOOP

•μ aj a+JoocgcNoooo'd'Ln com+Jm ******* CGMiOUlWrthli) OOr^'dl'<-<'i,cN'^i'CN υβ ΟΟΟΟΓΟΟΟ'Φ'Ο'ΙΓ) I '—'

φ G •rl <D

μίμιοοοοοοο (Ö G CN UVO O o 0 0 Q ******* G’doo^HCN'st'co'd’

-- X .n CN

G -H H +J

if) - O

8103615 -, 3 - 15 - (O N rl ^ Η ΓΟ Π ΜΟΙΠΟ'ΪΓ'*-!^ ffl

m u^ifl^^inciN

1} _|J *.*.****· sj κσΐ'^'Γ'Γ^^Μΐη· nj rgctncMCOncjn'i (Ö (jiOCOOfflfflfflOCi M _ O &

O C

>H

Η ld I

(D ft (U Dl S ΰαίι-ΐΜΓοι^ΐΜΟΓ^Ώ00 S tocQ OQ) oo σι σι r-t co ^ en dj _C +)[(}***··»·»» u ΰΰ^οοιησοοοιηνο •η οοσσ-τ-ισι—'Ο'Φ h 'USW,H w- *-i cm <n •H ij c ·ςρηωοοο*-ινο S mcnr-ovocNnco UCOCMOOOJ'J^Jin Η Φ'ίΐΛ^'ί'ίίΊΝ (rt +J * - ' ni οιοοΓ'-οο'τσινοιη c O) HG'-icoinmiOOvo

O 0] OiOlflOI^COMO'J

H +> O Μ D> - O 5 (5 C Λ Ή

O & 1-1 I

g H Rj 0) Dl vo ΟΟιΗμίΟΟΟΓ^Γ^-Η·^^ c o ai οωοοιωσιοιιοο (3 >fflk+)«N<N»-'·^ - ΓΟΜ E> ΟβοηοιΟ Ή'Λ'ί Ο, oo-'-immcgmiNOi ,_) UiolCMCNCN101CN«-l aj ω^ρ^Ίίοοωσι

Mrommior'-mm +j αιωοοωΡ'Γ^Γ'·^ ai +)-*»»*·*** S αίΓ^ωο'ΌΓ'ΟΓ' m fl) HGOm—ιΐστ-ιΐ'-ΐ’")

C Ό O'O'SfO'lOOOOOOO

ui Μ&ΐΗ0ωοοωΓ»ωι>Γ^ η σ ai c

m C 0) *H

3 -H

B H dl ld id & ft ft IS.

O O « I

o 0) Dl HH^^mintnOin ö - οωσίΓπωοοιηΓΜ (ö S-i+JincNCNinfocom > 4j m ******** * GGcoointncncor·' c οοοο'^ΐΝίΛ'ίσισι 0 ugfncNicncNimm'a'

-P

id +> n BI ΟΙ ί lil ·ί Ί 01 l|Ortf|(Dlfl(Jl^ φ ^ΙΟΟήΙΟΓ^^’ιΙ’Ο PS JllilhlOIOfflOlOl jj V S W ·> «k ^ ηοΓοσίΓ-ο^ΐ'σ» HG<i-ir^ooooincovo O'OvO’d'CMC^^aiw) HBint^vovocococo ai

G Dl Id G I

+1 Ή 0) 01 „ riH ·η u οι σι - m in οι r- ο did ooimmuor^r^mm gftÜlJrl^OlCNNlS'} •HG) 4J 01 ·.·»·*··*«*·* m ffl GC^lCODOmCOCIlO OOminioooo'S'CM OË—imcMcvininTr 01 G *H O) jjtotfioooooin <d g m moooom n ^ ^ * *»*»* >* ΰΌΟΟ'-ιηι-^ΓΦΐη Μ -n in G -H H +) in o T—i 8103615 4 '*> - 16 -

In de bovenstaande bespreking is de nadruk gelegd op tweezijdige of sandwich-bepalingen, waarbij één van de antilichamen onoplosbaar gemaakt wordt, terwijl het andere oplosbaar is in het te analyseren medium. Er zijn ook andere variaties mogelijk. Bij een de voorkeur verdienende variatie 5 gebruikt men antilichamen, die op zodanige wijze aan deeltjes, bijvoorbeeld latexdeeltjes,gebonden zijn, dat ieder deeltje een aantal antilichamen draagt. Wanneer een hoeveelheid deeltjes, waaraan een eerste monoclonale antilichaam gebonden is, gemengd wordt met bijvoorbeeld een hoeveelheid deeltjes, waaraan een tweede monoclonaal antilichaam gebonden is, ontstaat 10 een melkachtige suspensie. Wanneer echter een monster, dat polyvalent antigeen, waarvoor de antilichamen specifiek zijn, in de suspensie wordt gebracht, treedt agglomeratie of agglutinatie van de deeltjes op, waardoor gemakkelijk detecteerbare klonten van deeltjes gevormd worden.

De visuele detectering van agglomeraatvorming kan toegepast worden 15 bij een voorlopige bepaling van de aanwezigheid van antigeen. Deze detectering kan bevorderd worden door de deeltjes, die het ene monoclonale antilichaam dragen, anders te kleuren dan het deeltje, dat het andere antilichaam draagt. De mate van agglomeratie kan echter ook bepaald worden als een maat voor de in het monster aanwezige hoeveelheid antigeen. Zo kan bij-20 voorbeeld de verandering in turbiditeit gemeten worden met behulp van standaardmethoden, zoals nefelometrie.

Het verdient thans de voorkeur latexdeeltjes te gebruiken, waaraan het antilichaam covalent gebonden wordt onder toepassing van op zichzelf bekende methoden. Men kan echter ook andere deeltjesvormige dragers toe-25 passen. Als zodanig zijn te noemen siliciumdioxide, glas, cellen, poly-aerylamiden, polymethylmethacrylaat en agarose. Bij voorkeur bezitten de deeltjes een grootte van ca. 0,2 - 10 um. Voor visueel onderzoek zijn echter deeltjes vereist met een grootte van tenminste ca. 1,0 um.

Volgens nog een andere variatie wordt één van de antilichamen on-30 oplosbaar gemaakt op een parelvormig materiaal, de wand van een reageerbuis of een andere macroscopische vaste drager, terwijl het andere gebonden wordt aan kleine deeltjes van latex of een ander geschikt materiaal.

Bij aanwezigheid van antigeen vormt zich een sandwich van het antigeen tussen het macroscopisch gebonden antilichaam en het aan het deeltjes ge-35 bonden antilichaam. Door nu bijvoorbeeld de deeltjes te kleuren kan de vorming van de sandwich visueel bepaald worden. Men kan merking van het aan het deeltje gebonden antilichaam met een fluorescerend, enzymatisch, radio-aktief of ander markeringsmateriaal toepassen voor kwantitatieve bepalingen, evenals in het bovenbeschreven geval, waarbij een oplosbaar 40 antilichaam wordt toegepast.

8103615 * ί - 17 -

Volgens een andere de voorkeur verdienende variatie van de tweezijdige bepalingsmethode wordt tenminste één van twee verschillende mono-clonale antilichamen gebonden aan een enzym, dat een reaktie katalyseert, waarbij een aan het andere monoclonale antilichaam gebonden stof bij be-5 trokken is, zodat een detecteerbare stof gevormd wordt of op één of andere andere wijze een inwerking verkregen wordt op de stof van het tweede antilichaam, teneinde detectering aan het antilichaam : antigeen : antilichaam complex mogelijk te maken. De detectering kan bijvoorbeeld geschieden met colorimetrie, fluorimetrie, luminescentie, spectrofotometrie e.d.

10 Het is duidelijk, dat bij toepassing van dergelijke methoden geen van beide antilichamen onoplosbaar gemaakt behoeven te worden, wat de bepaling sterk vergemakkelijkt.

Volgens een thans de voorkeur verdienende uitvoeringsvorm is de stof op het tweede antilichaam eveneens een enzym en past men bij de bepa-15 ling het stel met enzym gemerkte antilichamen toe om opeenvolgende reakties te katalyseren, waarvan de ene een produkt geeft, dat nodig is voor de andere. Bij deze reakties worden de beide antilichamen zodanig gekozen, dat wanneer zij aan het antigeen gebonden worden, zij een zodanige steri-sche positie innemen, dat het produkt van de eerste enzymatische reaktie 20 in zo dichte nabijheid van het tweede met enzym gemerkte antilichaam ontstaat, dat de tweede reaktie plaatsheeft alvorens aanzienlijke diffusie van het produkt van de eerste reaktie in het omringende medium kan optreden.

Deze werkwijze kan toegelicht worden aan de hand van de toepassing 25 van een stel monoclonale antilichamen, waarvan er één gemerkt is met hexokinase (HK) en het andere met glucose-6-fosfaat-dehydrogenase (G-6-PDH) en wel met de volgende reeks reakties.

HK

(1) adenosinetrifosfaat + glucose _ (ATP) 30 adenosinedifosfaat + glucose-6-fosfaat (ADP) (2) glucose-6-fosfaat + nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)

35 G-6-PDH

_^ gluconolacton-6-fosfaat + dihydronicotinamide adenine dinucleotide (NADH) 8103615 , * - 18 -

De bepaling wordt uitgevoerd door aan het monster, dat mogelijk anti-geen bevat, de gemerkte antilichamen voor het antigeen, ATP, glucose en het co-enzym NAD+ toe te voegen. Als het antigeen aanwezig is, vormt zich een complex als hieronder aangegeven 5 Ab (HK)

Ag

__Ab(G-6-PDH

Het met HK gemerkte antilichaam katalyseert de vorming van glucose- 6-fosfaat dichtbij het met G-6-PDH gemerkte antilichaam, waar dit wordt 10 omgezet in gluconolacton-6-fosfaat. Het bij deze reaktie door reductie van NAD+ gevormde NADH kan spectrofotometrisch gedetecteerd worden wegens zijn sterke absorptie bij 340 nm, die karakteristiek is voor een dihydro-nicotinamide.

Dezelfde omzetting van glucose in gluconolacton-6-fosfaat onder 15 vorming van NADH kan ook optreden in het medium zelf, waar hij gekatalyseerd wordt door de niet tot een complex omgezet, gemerkte antilichamen, maar dan met een veel geringere snelheid dan wanneer de beide antilichamen zich dicht bij elkaar bevinden in het complex antilichaam: antigeen: antilichaam. Derhalve bevestigt een toename van de absorptie bij 340 nm 20 vergeleken met een controlemonster de aanwezigheid van antigeen in het monster. De toename van de absorptie kan ook gecorreleerd worden met de hoeveelheid antigeen in het complex.

Ieder ander stel geschikte, achtereenvolgend verlopende en enzymatisch gekatalyseerde reakties kunnen toegepast worden bij een op twee na-25 bije plaatsen uitgevoerde bepaling met geschikt gemerkte antilichaam op een verdacht antigeen. Als zodanig zijn te noemen de door glucose-oxidase gekatalyseerde reaktie van glucose onder vorming van gluconolacton en waterstofperoxide, gevolgd door de reaktie van het waterstofperoxide met ·' o.fenyleendiamine, die gekatalyseerd wordt door peroxidase en waar-30 bij een gekleurde groep wordt gevormd. Bij deze bepaling wordt één van de monoclonale antilichamen gemerkt met glucose-oxidase en het andere met peroxidase. De intensiteit van de kleur in vergelijking met een controle kan gecorreleerd worden aan de aanwezigheid en/of hoeveelheid antigeen in het onderzochte monster. Het is duidelijk, dat andere stoffen, die bij 35 aanwezigheid van een enzym tot een gekleurd produkt geoxideerd kunnen worden in plaats van o.<fenyleendiamine gebruikt kunnen worden.

Nog een ander geschikt stel achtereenvolgend optredende reakties onder toepassing van een stel antilichamen voor een gewenst antigeen, die respectievelijk gemerkt zijn met NAD-oxidireductase en luciferase is als 40 volgt: 8103615 « - 19 - NAD oxido-reductase ,(1) NADH + ribof lavine-5' -fosfaat -> (FMN) FMNH2 + NAD+ 5 luciferase (2) FMNH2 + RCHO + 02 -> FMN* + RCOOH + H20 RCHO is een representatief geval een aldehyde met rechte keten en met 10 of meer koolstof atomen.

De vorming van FMN , een geëxciteerde toestand van FMN, wordt ge-*0 volgd door de emissie van een foton, dat fotometrisch gedetecteerd kan worden en met een controlemonster gecorreleerd kan worden, zodat hiermee de aanwezigheid en/of hoeveelheid antigeen in een onderzocht monster aangegeven kan worden.

Volgens een andere uitvoeringsvorm, waarbij een stel met enzymen 15 gemerkt antilichamen wordt gebruikt, kan het produkt van de eerste, enzymatisch gekatalyseerde reaktie een allosterische activator of inhibitor van de daarop volgende, door enzym gekatalyseerde reaktie zijn. Een allosterische activator werkt, in plaats van bij de tweede reaktie verbruikt te worden, op het enzym in en verhoogt zijn affiniteit voor een 20 substraat of verhoogt de omzettingssnelheid van het substraat tot het produkt nadat het complex vai-eizym en substraat gevormd is. Anderzijds hebben allosterische inhibitors het tegengestelde effekt, d.w.z. dat zij de affiniteit van het enzym voor een substraat verminderen of de omzettingssnelheid van substraat in produkt verlagen. Allosterische remming 25 kan van het competitieve of niet-competitieve type zijn.

Een voorbeeld van bepaling, waarbij allosterische aktivering betrokken is onder toepassing van een stel antilichamen, die respectievelijk gemerkt zijn met fosfofructokinase en fosfoenolpyruvaat, benut het volgende reaktieschema: 20 fosfofructokinase (1) fructose-6-fosfaat + ATP -^

fructose-1 6-difosfaat + ADP

(2) HCO^ + fosfoenolpyruvaat (PEP) 25 fosfoenolpyruvaat- carboxylase -* oxaloacetaat (OAA) 81 0 3 6 1 5 malaat- 40 dehydrogenase t * - 20 -

Het bij'teaktie (1) gevormde fructose-l*6-difos£aat werkt allosterisch in op het fosfoenolpyruvaat-carboxylase en aktiveert zijn katalyse van reaktie (2), d.w.z. de vorming van oxaloacetaat uit PEP. Reaktie (3) treedt op in het omgevende medium, d.w.z. dat het niet nodig is het malaat-dehydro-5 genase te binden aan een derde monoclonaal antilichaam. De aanwezigheid en/of hoeveelheid verdacht antigeen wordt bepaald door correlatie van de reductie van de absorptie bij 340 nm van NADH, dat bij reaktie (3) geoxideerd wordt tot NAD+.

Bij een voorbeeld van een bepaling, waarbij allosterische remming 10 betrokken is, gebruikt men een stel antilichamen, die respectievelijk gemerkt zijn met aspartaataminotransferase (AST) en fosfoenolpyruvaat-carboxylase en waarbij men gebruik kan maken van het volgende reaktie-schema:

AST

15 (1) oxaloacetaat + glutaminaat - aspartaat + a-ketoglutoraat fosfoenolpyruvaat- carboxylase (2) PEP + NADH - OAA + NAD+ 20 Het bij reaktie (1) gevormde aspartaat remt de tweede reaktie, door- ν’ dat het allosterisch inwerkt op het fosfoenolpyruvaat-caboxylase. Dit vermindert de snelheid, waarmee NADH geoxideerd wordt tot NAD+. Derhalve kan de afname in de absorptie bij 340 nm, die door NADH vertoond wordt, gecorreleerd worden aan de aanwezigheid en/of hoeveelheid antigeen in het 25 onderzochte monster, waarbij een kleinere afname dan met een controle-monster optreedt er op wijst dat antigeen aanwezig is.

Het is duidelijk, dat men in plaats van de bovengegeven voorbeelden voor toepassing bij een bepaling, waarbij twee plaatsen betrokken zijn, talrijke andere reaktieparen kan gebruiken, waarbij aktivering of remming 30 optreedt van de tweede, enzymatisch gekatalyseerde reaktie.

Volgens een andere uitvoeringsvorm wordt slechts één van het stel antilichamen met een enzym gemerkt, terwijl het tweede bijvoorbeeld gemerkt wordt een stof, die een reaktie ondergaat, welke gekatalyseerd wordt door het enzym; zodoende wordt een tweede produkt gevormd, dat gedetecteerd 35 en/of kwantitatief bepaald kan worden met colorimetrie, fluorimetrie, luminescentie, spectrofotometrie of een andere methode. Bij een voorbeeld van een dergelijke uitvoeringsvorm gebruikt men een stel monoclonale antilichamen, waarvan het ene gemerkt is met peroxidase en het andere met luminol, waarbij men de volgende reaktie benut: 8103615

« J

- 21 - nh9 o NH5 o Tl! j II peroxi- _ dase γ jp 0 I I TH+ 2H2°2 * N2 + 2H2° + ^ - L JL n-

^VH

o 5 luminol . Het foton (hV) dat bij deze reaktie wordt geëmitteerd, kan gedetecteerd worden met behulp van fotometrische methoden en in relatie worden gebracht tot de aanwezigheid en/of hoeveelheid van een antigeen in een onderzocht monster.

10 Volgens nog een andere de voorkeur verdienende variatie van de op twee plaatsen aangrijpende bepaling worden de beide monoclonale antilichamen gekombineerd met respectievelijk een fluorescerend chromofoor en een uitdovend chromofoor, dat licht absorbeert bij de golflengte, waarbij het fluorescerende materiaal emitteert. De beide antilichamen worden zodanig 15 gekozen, dat wanneer zij zich verenigen met het antigeen, waarvoor zij specifiek zijn, de beide chromoforen dicht genoeg bij elkaar komen te liggen om het door de fluorescerende stof geëmitteerde licht te laten absorberen door het andere chromofoor. Gewoonlijk heeft dit plaats, wanneer zij binnen ca. 10 nm van elkaar gelegen zijn en bij voorkeur binnen ca. 5 nm van 20 elkaar. De keuze van geschikte antilichamen kan worden uitgevoerd door een proefbepaling, waarbij men een mengsel van met fluorescerend materiaal en met uitdovend materiaal gemerkte monoclonale antilichamen in kontakt brengt met een monster, dat een bekende hoeveelheid antigeen bevat. Vermindering van de fluorescentie wijst erop, dat de beide chromoforen dicht genoeg bij 25 elkaar liggen.

Bij toepassing van uitdoving van fluorescentie is het niet nodig één van de beide antilichamen onoplosbaar te maken. Kwantitatieve bepalingen kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door meting van de afname van de maximale fluorescentie, d.w.z. de hoeveelheid fluorescentie, die door een controle-30 monster vrij van antigeen wordt vertoond, ofwel door vergelijking van de fluorescentie van het monster met die van controlemonsters, die een bekende hoeveelheid antigeen bevatten. Fluorescentie uitdovende chromoforenparen kunnen echter ook gebruikt worden in kombinatie met de methode van deeltjes agglomeratie en bij de methode, waarbij één van de antilichamen onoplos-35 baar gemaakt wordt doordat hij aan een vaste drager, bijvoorbeeld de wand van een reageerbuis of een pareltje, gebonden wordt, aangezien paarvorming van de fluorescentie uitdovende chromoforen zal optreden. Een afname van 8103615 * * - 22 - de fluorescentie wijst dan weer op de aanwezigheid of op de hoeveelheid antigeen in het monster.

Geschikte fluorescerende en uitdovende chromoforen en methoden om ze te kombineren met antilichamen zijn beschreven in het Amerikaanse 5 octrooischrift 4.174.384. Het verdient thans de voorkeur fluoresceien en rodamine toe te passen als respectievelijk fluorescerend chromofoor en uitdovend chromofoor.

In de bovenstaande bespreking van de uitvinding zijn methoden beschreven voor het uitdoven van fluorescentie, waarbij men stellen anti-10 lichamen, die de benodigde chromoforen dragen, zich aan een eventueel in het te analyseren monster aanwezige antigeen laat binden in een sterische rangschikking, die het mogelijk maakt,, dat het uitdovende chromofoor licht absorbeert, dat geëmitteerd wordt door het fluorescerende chromofoor. Kwantitatieve bepalingen van de aanwezige hoeveelheid antigeen worden uit-15 gevoerd door de afname van de maximale fluorescentie te maten.

Deze methoden zijn goed geschikt voor het. bepalen van de aanwezigheid van antigeen in een monster over een ruim trajekt van concentraties. De kleine afnamen in fluorescentie, die gepaard gaan met lage antigeenconcen-tratie zijn echter moeilijk te detecteren en nauwkeurig te meten. Daaren-20 tegen zijn kleine toenamen van de fluorescentie betrekkelijk gemakkelijk te detecteren en nauwkeurig te meten. Derhalve verdient het volgens een andere aspect van de uitvinding de voorkeur gebruik te maken van remming van de uitdoving en toenamen in fluorescentie te meten.

Om dit uit te voeren bij een proef op een bepaald antigeen worden 25 hoeveelheden van het antigeen en monoclonaal antilichaam voor het antigeen afzonderlijk gemerkt met een individu van het stel fluorescerende en uitdovende chromoforen. Het met chromofoor gemerkte antigeen en antilichaam worden dan gecombineerd onder vorming van een complex, waarin het fluorescerende chromofoor zodanig gelegen is, dat het daardoor geëmitteerde licht 30 geabsorbeerd wordt door het uitdovende chromofoor. Om dit te bereiken kan het antigeen met het fluorescerende chromofoor en het antilichaam met het uitdovende chromofoor gemerkt worden of omgekeerd.

Een te onderzoeken monster, dat verdacht wordt het antigeen te bevatten, wordt daarna in kontakt gebracht met het met chromofoor gemerkte 35 antigeen en antilichaam. Na een geschikte inkubatietijd wordt de fluorescentie gemeten. Als antigeen aanwezig is in het onderzochte monster, remt dit tenminste voor een deel de vorming van een complex tussen het met chromofoor gemerkte antigeen en het antilichaam doordat het zelf een complex vormt met het monoclonale antilichaam. In de mate dat dit optreedt 40 bevindt het fluorescerende chromofoor zich niet langer op een zodanige 8103615 * « - 23 - plaats, dat het daardoor geëmitteerde licht geabsorbeerd wordt door het uitdovende chromofoor. Dit leidt tot een toename in fluorescentie. De toename in fluorescentie kan gemeten worden en in relatie worden gebracht tot de antigeenconcentratie in het geanalyseerde monster door vergelijking 5 met de fluorescentie, die vertoond wordt door controlemonsters,die vrij zijn van antigeen of die bekende hoeveelheden antigeen bevatten. .

Uit het bovenstaande is duidelijk, dat· het met chromofoor gemerkte antigeen-antilichaamcomplex een oplosbaar complex kan zijn. Het verdient echter thans de voorkeur met chromofoor gemerkt antigeen en monoclonaal 10 antilichaam te gebruiken, die gebonden zijn aan latexdeeltjes of andere geschikte deeltjes, bijvoorbeeld de bovengenoemde, en wel van een zodanige vorm, dat zij agglomeraten vormen, als het complex gevormd wordt. Deeltjes met grootten uiteenlopende van ca. 0,2 tot ca. 10 ^im zijn gewoonlijk voor dit doel geschikt. Wanneer een onbekend monster, dat het verdachte antigeen 15 bevat, in kontakt wordt gebracht met de agglomeraat vormende deeltjes van antilichaam en antigeen, treedt remming van de agglomeratie op, omdat antigeen uit het monster zich combineert met aan een deeltje gebonden antilichaam. Hierdoor ontstaat een toename van de fluorescentie, aangezien er niet langer uitdoving kan optreden en deze toename kan gedetecteerd en 20 gemeten worden om gecorreleerd te worden met de hoeveelheid antigeen in het monster door vergelijking met de fluorescentie die wordt waargenomen voor een monster, dat een bekende hoeveelheid antigeen bevat.

Ook is het volgens de uitvinding mogelijk gebonden antigeen en aan een deeltje gebonden monoclonaal antilichaam toe te passen bij een bepaling, 25 waarbij direkt de remming van de agglomeratie gemeten wordt. Bij deze methode wordt noch het antigeen, noch het antilichaam gemerkt. Wanneer een antigeen bevattend monster in kontakt wordt gebracht met de deeltjes, treedt tijdens de inkubatietijd remming van de agglomeratie op. Dit leidt tot tenminste een gedeeltelijke vermindering van de agglomeraatvorming.

30 Deze remming wordt gedetecteerd met behulp van nefelometrie of andere methoden voor het meten van turbiditeit. De afname in turbiditeit kan in verband worden gébracht met de hoeveelheid antigeen in het monster.

De bovenstaande beschrijving van de uitvinding en voorbeelden geven de toepassing van de uitvinding voor bepalingen van IgE, maar dit zijn 35 slechts voorbeelden van de verschillende methoden, waarop de uitvinding kan worden benut. Uiteraard zijn binnen het raam van de uitvinding talrijke wijzigingen mogelijk.

8103615

Claims (47)

1. Werkwijze voor het uitvoeren van een immunometrische bepaling van de aanwezigheid of concentratie van een antigêne stof in een vloeistof-monster, waarbij men een ternair complex vormt van de antigene stof, een 5 eerste antilichaam en een tweede antilichaam, dat op een andere plaats dan het eerste antilichaam aan het antigeen gebonden wordt, door het monster in kontakt te brengen met het eerste en het tweede antilichaam, met het kenmerk, dat men als eerste en tweede antilichaam een monoclonaal antilichaam gebruikt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een fluores cerend chromofoor gebonden is aan het eerste lichaam én een chromofoor, dat in staat is licht te absorberen bij de door het fluorescerende chromofoor geëmitteerde golflengte gebonden is aan het tweede antilichaam en men het monster in kontakt brengt met een oplossing, die het eerste en 15 tweede antilichaam bevat onder vorming van het ternaire complex en de intensiteit van de fluorescentie bepaalt en vergelijkt met de fluorescentie van een standaardmonster, dat vrij is van het antigeen of het antigeen in een bekende hoeveelheid bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat één van de 20 beide antilichamen gebonden is aan een vaste drager, die onoplosbaar is in het vloeistofmonster, terwijl het andere antilichaam oplosbaar is in het vloeistofmonster.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men het vlöeistofmonster gelijktijdig in kontakt brengt met het eerste en tweede 25 antilichaam onder vorming van een onoplosbaar ternair complex en de intensiteit van de fluorescentie van het ternaire complex bepaalt en vergelijkt met die van een standaardmonster, dat vrij is van het antigeen of een antigeen in een bekende hoeveelheid bevat.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men het 30 monster eerst in kontakt brengt met één van de antilichamen om de vorming van een binair complex van antilichaam en antigeen en daarna met het andere antilichaam in kontakt brengt onder vorming van het ternaire complex en de intensiteit van de fluorescentie van het complex of de vloeistof bepaalt en vergelijkt met een standaardmonster, dat vrij is van het antigeen of 35 het antigeen in een bekende hoeveelheid bevat.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het eerste antilichaam en eventueel ook het tweede antilichaam gebonden is aan deeltjes, die onoplosbaar zijn in het vloeistofmonster en men het monster gedurende voldoende tijd in kontakt brengt met een suspensie van de deeltjes om vor- 40 ming van het ternaire complex te veroorzaken, waardoor agglomeratie op- 8103615 t e- * - 25 - treedt van de aan het eerste en tweede antilichaam gebonden deeltjes.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk/ dat de deeltjes een grootte hébben van ca. 0,2 - 10 ^im.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men de deel-5 tjes kiest uit deeltjes van latex, siliciumdioxide, glas, cellen, polyacrylamide, polymethylmethacrylaat en agarose.

9. Werkwijze volgens conclusies6 - 8, met het kenmerk, dat de deeltjes, die het eerste antilichaam binden, een andere kleur hebben dan de deeltjes die het tweede antilichaam binden.

10. Werkwijze volgens conclusies6 - 9, met het kenmerk, dat de deel tjes een grootte hebben van ca. 1,0 - 10 pm.

11. Werkwijze volgens conclusies 6 - 8 of 10, met het kenmerk, dat men de turbiditeit van het monster na de vorming van het ternaire complex bepaalt en deze in verband brengt met de turbiditeit van een controle- 15 monster, waarvan bekend is dat het vrij is van antigeen of een bekende hoeveelheid van het antigeen bevat.

12. Werkwijze volgens conclusies 6 - 8 of 10, met het kenmerk, dat een fluorescerend chromofoor aan het eerste antilichaam en een chromofoor, dat in staat is licht te absorberen bij de door het fluorescerende chromofoor 20 geëmitteerde golflengte, aan het tweede antilichaam gebonden is en men na het in kontakt brengen met het monster de intensiteit van de fluorescentie bepaalt en vergelijkt met de fluorescentie van een standaardmonster, dat vrij is van het antigeen of het antigeen in een bekende hoeveelheid bevat.

13. Werkwijze volgens conclusies 2 - 5 of 12, met het kenmerk, dat men als fluorescerend chromofoor fluoresceren en als chromofoor, dat in staat is het daardoor geëmitteerde licht te absorberen, rodamine kiest.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een enzym gebonden is aan het eerste antilichaam en aan het tweede antilichaam een 30 stof gebonden is, waarop het enzym inwerkt, teneinde detectering mogelijk te maken van het antilichaam:antigeen:antilichaam complex.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de aan het tweede antilichaam gebonden stof een enzym is.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het aan het 35 eerste antilichaam gebonden enzym een reaktie katalyseert die een produkt geeft, dat nodig is voor een reaktie, die door het aan het tweede antilichaam gebonden enzym gekatalyseerd wordt.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat het produkt van de reaktie, die door het eerste gebonden enzym gekatalyseerd wordt, 8103615 9 ** L - 26 - verbruikt wordt bij de reaktie, die door het tweede gebonden enzym gekatalyseerd wordt.

18. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat het produkt van de reaktie, die door het eerste gebonden enzym gekatalyseerd wordt, 5 op allosterische wijze inwerkt op het tweede gebonden enzym.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat het produkt van de reaktie, die door het eerste gebonden enzym gekatalyseerd wordt,' het tweede gebonden enzym allosterisch aktiveert of remt.

20. Werkwijze volgens conclusies 16 - 19, met het kenmerk, dat de 10 door het aan het tweede antilichaam gebonden enzym gekatalyseerde reaktie een detecteerbaar produkt oplevert.

21. Werkwijze volgens conclusies 16 - 19, met het kenmerk, dat de door het aan het tweede antilichaam gebonden enzym gekatalyseerde reaktie een detecteerbare stof verbruikt.

22. Werkwijze volgens conclusie 20 of 21, mêt het kenmerk, dat men de vorming of het verbruik van de detecteerbare stof detecteert door colorimetrie, fluorimetrie, luminescentie of spectrofotometrie.

23. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de stof op het tweede antilichaam een reaktie ondergaat, die gekatalyseerd wordt 20 door het aan het eerste antilichaam gebonden enzym.

24. Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat de reaktie een stof vormt, die detecteerbaar is door colorimetrie, fluoremetrie, luminescentie of· spectrofotometrie.

25. Werkwijze voor het bepalen van de aanwezigheid of concentratie 25 van een antigene stof in een vloeistof / met het kenmerk, dat men: Ca) een monster van de vloeistof in kontakt brengt met een bekende hoeveelheid toegevoegde antigene stof en een monoclonaal antilichaam voor de antigene stof en (b) de remming meet van de.complexvorming tussen het antilichaam -,en de:·. 30 toegevoegde antigene stof tengevolge van de kombinatie van het monoclonale antilichaam en de in de vloeistof aanwezige antigene stof tot een tweede complex.

26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat een fluorescerend chromofoor gebonden is aan. de toegevoegde antigene stof en een 35 chromofoor, dat in staat is licht te absorberen bij de door het fluorescerende chromofoor geëmitteerde golflengte, gebonden is aan het monoclonale antilichaam en waarbij men na het in kontakt brengen de intensiteit van de fluorescentie bepaalt en vergelijkt met die van een standaardmonster, dat vrij is van de antigene stof of de antigene stof in een bekende hoe- 40 veelheid bevat. 8103615 «· at * - 27 -

27. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat een fluorescerend chromofoor aan het monoclonale antilichaam gebonden is en een chromofoor, dat in staat is licht te absorberen bij de door het fluorescerende chromofoor uitgezonden golflengte, aan de toegevoegde antigene stof gebon- 5 den is en waarbij men na het in kontakt brengen de intensiteit van de fluorescentie bepaalt en vergelijkt met die van een standaardmonster, dat vrij is van de antigene stof of de antigene stof in een bekende hoeveelheid bevat.

28. Werkwijze volgens conclusie 26 of 27, met het kenmerk, dat men 10 als fluorescerend chromofoor fluoresceien en als chromofoor, dat in staat is geëmitteerd licht te absorberen, rodamine kiest.

29. Werkwijze volgens conclusie 26 of 27, met het kenmerk, dat het monoclonale antilichaam en de toegevoegde antigene stof gebonden zijn aan deeltjes en het eerste complex een agglomeraat is van de deeltjes, waar- 15 aan het monoclonale antilichaam gebonden is en de deeltjes, waaraan de antigene stof gebonden is.

30. Werkwijze volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat men de deeltjes kiest uit latex, siliciumdioxide, glas, cellen, polyacrylamide, polymethylmethacrylaat en agerose.

31. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het mono clonale antilichaam en de toegevoegde antigene stof gebonden zijn aan deeltjes en het eerste complex een agglomeraat is van de deeltjes, waaraan de toegevoegde antigene stof gebonden 'is en waarbij men na het in kontakt-brengen de turbiditeit van het monster bepaalt en vergelijkt met die van 25 het standaardmonster, dat vrij is van de antigene stof of een bekende hoeveelheid van de antigene stof bevat.

32. Werkwijze volgens conclusie 31, met het kenmerk, dat men de deeltjes kiest uit latex, siliciumdioxide, glas, cellen, polyacrylamide, polymethylmethacrylaat en agerose.

33. Werkwijze volgens conclusies 29 - 32, met het kenmerk, dat de deeltjes een grootte hebben van ca. 0,2 - 10 yim.

34. Werkwijze volgens conclusie 1 ter bepaling van de aanwezigheid of concentratie van een antigene stof in een vloeistof, met het kenmerk, dat men: 35 (a) een monster van de vloeistof in kontakt brengt met een oplosbaar, eerste monoclonaal antilichaam voor de antigene stof teneinde een oplosbaar complex van het antilichaam en de in het monster aanwezige antigene stof te vormen, waarbij dit eerste monoclonale antilichaam gemerkt is; k (b) het oplosbare complex in kontakt brengt met een tweede monoclonaal 40 antilichaam, dat gebonden is aan een vaste drager, die onoplosbaar in de 8103615 ά >> fc - 28 - vloeistof is, teneinde een onoplosbaar complex te vormen van het eerste monoclonale antilichaam, de antigene stof en het aan de vaste drager gebonden tweede monoclonale antilichaam; (c) de vaste drager van het vloeistofmonster en niet-omgezet gemerkt 5 antilichaam scheidt; (d) de hoeveelheid met de vaste drager gekombineerd, gemerkt antilichaam ofwel de hoeveelheid niet-omgezet gemerkt antilichaam meet; en (e) de gemeten hoeveelheid gemerkt antilichaam in verband brengt met de hoeveelheid gemerkt antilichaam, die gemeten wordt voor een controlemonster, 10 dat bereid is volgens de stappen (a) - (d), en waarvan bekend is dat het vrij is van de antigene stof, teneinde aldus de aanwezigheid van antigene stof in het vloeistofmonster te bepalen of de gemeten hoeveelheid gemerkt antilichaam in verband te brengen met de hoeveelheid gemerkt antilichaam, die gemeten wordt voor monsters, die bekende hoeveelheden antigene stof 15 bevatten en bereid zijn volgens de stappen (a) - (d), teneinde de concentratie van antigene stof in het vloeistofmonster te bepalen.

35. Werkwijze volgens conclusie 1 ter bepaling van de aanwezigheid van een antigene stof in een vloeistof, met het kenmerk, dat men: (a) een monster van de vloeistof gelijktijdig in kontakt brengt met een 20 eerste en een tweede monoclonaal antilichaam voor de antigene stof, waarbij het eerste monoclonale antilichaam gemerkt is en het tweede monoclonale antilichaam gebonden is aan een tweede drager, die onoplosbaar is in de vloeistof, teneinde een onoplosbaar complex te vormen van het eerste monoclonale antilichaam, de antigene stof en het tweede monoclonale anti-25 lichaam; (b) de vaste drager van het vloeistofmonster en niet-omgezet gemerkt antilichaam scheidt; (c) de met de vaste drager gekombineerde hoeveelheid gemerkt antilichaam ofwel de niet-omgezette hoeveelheid gemerkt antilichaam meet; en 30. (d) de gemeten hoeveelheid gemerkt antilichaam in verband brengt met de hoeveelheid gemerkt antilichaam, die gemeten wordt voor een controlemonster, dat bereid is volgens de stappen (a) - (c) en waarvan bekend is dat het vrij is van de antigene stof, teneinde de aanwezigheid van antigene stof in een vloeistofmonster te bepalen, ofwel de gemeten hoeveelheid gemerkt 35 antilichaam in verband brengt met de hoeveelheid gemerkt antilichaam, die gemeten wordt voor monsters, die bekende hoeveelheden antigene stof bevatten en bereid zijn volgens de stappen (a) - (c), teneinde de concentratie van antigene stof in het vloeistofmonster te bapelen.

36. Werkwijze voor het uitvoeren van een immunometrische bepaling 40 volgens conclusie 1 ter bepaling van de aanwezigheid of concentratie van 8103615 «· 5 - 29 - een antigene stof in een vloeistofmonster, waarbij men een ternair complex vormt van een eerste gemerkt antilichaam, de antigene stof en een tweede antilichaam, waarbij het tweede antilichaam gebonden is aan een in de vloeistof onoplosbare, vaste drager, met het kenmerk, dat men een monoclo-naal antilichaam gebruikt voor zowel het gemerkte antilichaam als het aan een vaste drager gebonden lichaam.

37. Werkwijze volgens conclusie 36, met het kenmerk, dat men het vloeistofmonster eerst in kontakt brengt met het tweede antilichaam onder vorming van een binair complex van de antigene stof en het in de vloeistof onoplosbare tweede antilichaam en het daarna in kontakt brengt met het eerste gemerkte antilichaam onder vorming van het ternaire complex.

38. Werkwijze volgens conclusie 36, met het kenmerk, dat men het vloeistofmonster eerst in kontakt brengt met het tweede antilichaam onder vorming van een in de vloeistof onoplosbaar binair complex van de antigene stof en het tweede antilichaam, het monster scheidt van de vaste drager en de vaste drager in kontakt brengt met een oplossing van het eerste gemerkte antilichaam onder vorming van het ternaire complex.

39. Werkwijze volgens conclusies 34 - 38, met het kenmerk, dat het eerste monoclonale antilichaam het produkt is van een andere cellenlijn dan het tweede monoclonale antilichaam.

40. Werkwijze volgens conclusies 34 - 38, met het kenmerk, dat het antigeen tenminste twee identieke bindingsplaatsen bezit en dat het eerste en tweede monoclonale antilichaam het produkt zijn van dezelfde cellenlijn.

41. Werkwijze volgens conclusies 34 - 40, met het kenmerk, dat men het eerste en tweede antilichaam zodanig kiest, dat zij een affiniteit g voor het antigeen bezitten van tenminste ca. 10 liter/mol.

42. Werkwijze volgens conclusies 41, met het kenmerk, dat de affini- g teit tenminste ca. 10 liter/mol bedraagt.

43. Werkwijze volgens conclusies 34 - 40, met het kenmerk, dat men de vaste drager wast can het vloeistofmonster van de drager te scheiden.

44. Werkwijze volgens conclusie 43, met het kenmerk, dat men de vaste drager wast met zoutoplossing, die met fosfaat gebufferd is.

45. Werkwijze volgens conclusies 34 - 40, met het kenmerk, dat men het antigeen kiest uit IgE, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis Non A, hepatitis Non B, α-fetoproteine, carcinoembrynonisch antigeen, insuline en menselijk schildklier stimulerend hormoon.

46. Werkwijze volgens conclusies 34 - 40, met het kenmerk, dat het gemerkte antilichaam gemerkt is met een radio-aktief isotoop, een enzym of een fluorogeen materiaal, waarbij het onderzoek geschiedt met respectievelijk radiometrische middelen, enzymatische middelen of fluoremetrische middelen. 8 1 0 3 6 1 5 3 * • \ ·- -30-.

47. Werkwijze volgens conclusie 46, met het kenmerk, dat het anti- 125 lichaam gemerkt is met het radio-aktieve isotoop I 8103615