JP2596574B2 - クレアチンキナーゼｍｂ定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は，血清中および他の生物領域にて，クレアチ
ンキナーゼMBアイソエンザイムを定量するための改良方
法に関し，これらの方法に有用な抗体に関し，そしてこ
れら抗体を生成する細胞系に関する。

背景技術 この酵素クレアチンキナーゼ（CK;EC2.7.3.2）は，ク
レアチンの可逆リン酸化反応を触媒する。この反応で
は，アデノシン−５′−トリリン酸塩（ATP）がドナー
として働く： 上の反応では,ATPはアデノシン−５′−２リン酸（AD
P）に転化される。この反応は，約pH9において好適に行
われる。これに対して，この逆反応は，約pH7において
好適に行われる。CKの生物学的機能は，細胞中の高エネ
ルギークレアチンリン酸の貯蔵にあり，多量の該酸素
が，骨格筋中に存在する。

化学的には,CKは,MサブユニットおよびＢサブユニッ
トと称される２分子サブユニットからなるダイマーであ
る。このＭサブユニットおよびＢサブユニットは,3つの
アイソエンザイムCK−BB,CK−MBおよびCK−MMを与える
べく結合している。この３つのアイソエンザイムは，細
胞質中に位置しており，各々は約82000ダルトンの分子
量を有する。これらアイソエンザイムは，アガロースゲ
ル電気泳動により分離され得る。この電気泳動では,CK
−BBアイソエンザイムはアノード側に向かって最も遠く
に移動するのに対し,CK−MMはカソード側に移動し，そ
してCK−MBは両者の間に移動する。

正常な成人の血清中でのCKは，主としてCK−MMからな
り，痕跡量のCK−MBを伴う。このCK−BBアイソエンザイ
ムは，通常，ほとんどのCK分析の検出限界では，血清中
に存在しない。血清中に著しい量のCK−MBが検出される
ということは，ふつうは，急性の心筋梗塞（AMI）を表
す。しかしながら,CK−MBもまた,AMI以外の疾患をもつ
患者の血清中に見出されている。従って，このCK−MBア
イソザイム分析の結果は，医者により注意深く解釈され
る必要がある。それにもかかわらず,AMIにおけるCK−MB
の定量には，もっぱら電流分析方法が行われている。

CKの分析に関し，これまで種々の方法が開発されてい
る。これらの方法には，分光分析学的方法，比色法，螢
光光度法および酵素連結（coupled enzymatic）法が包
含される。

ある典型的な酵素連結系では，クレアチンおよびATP
の反応が，まず,CKにより触媒され，クレアチンリン酸
およびADPが形成される。この反応は，次いで，他の２
つの酵素反応と連結される。この酵素反応では，ホスホ
エノールピルビン酸，還元されたニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NADH），およびピルビン酸キナーゼ
や乳酸デヒドロゲナーゼといった酵素が使用される。こ
れらの反応は，最終的には,NADHの酸化（分光光学的に
は340nmで追跡される）を生じる。この方法は,Tanzerお
よびGivarg,J Biol Chem（1959）234:3201−４により本
質的に開発され，その改良法は，米国特許第3,403,077
号に記述されている。

他の酵素連結法は，逆反応に基づく。この反応では，
クレアチンリン酸およびADP基質がCKの存在下にて反応
して，クレアチンおよびATPを形成する。生成するATP
は，ヘキソキナーゼ（HK）の存在にて，ホスホリラート
グルコースへの副反応に役立つ。得られたグルコース−
６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）は，次いで，最終的な指示反
応の基質となる。この指示反応は，ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸（NADP）の存在下にて，グル
コース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）により触媒され,6−
ホスホグルコン酸および（NADPH）が形成される。NADPH
の生成は,340nmにて分光学的に追跡される。この酵素連
結系は，以下の一連の等式により示され得る： 後者の酵素連結系（これは,NielsenおよびLudvigsen
およびOliverにより，最初に述べられた）は,Rosalki,J
Lab Clin Med（1967）69:696−705により展開されてい
る。さらにこの改良法は，米国特許第3,413,198, 3,48
5,724, 3,540,984および3,994,783号に開示されてい
る。

他方，上記反応（３）では，このNADPおよびＧ−６−
PDHは，それぞれ，それらに対して酵素特異的であるNAD
およびＧ−６−PDHに置き換えられ得,NADHを生成する。
NADHは分光光度法で同様に測定され得る。NADHの存在
は，また，他の方法によって検出される。それゆえ，こ
の基質溶液は,NADHにより還元されうる染料を含み得
る。それにより，比色方法の使用が可能となる。

もう１つの代替方法では，上の反応２および３は省略
され得る。反応１でのクレアチンは，α−ナフトールお
よびジアセチルと反応して，ピンク色の複合体を形成し
得る。

CK−MBの最も普通の分析方法は,CK−MBの酵素活性を
測定すること，続いて，電気泳動またはイオン交換を利
用して電荷の違いに基づいて，他のCKアイソエンザイム
から分離することからなる。または，免疫阻害または免
疫阻害と免疫精製との組み合わせにより，他のCKアイソ
エンザイムから分離される。他方，多量のCK−MBは,Bサ
ブユニットの分析（CK−MB＋CK−BB）に対しある抗体を
用いるイムノアッセイ，または,2部位抗体方法のいずれ
かにより，測定される。２部位抗体方法では，ある抗体
（例えばこのＢサブユニットに対する抗体）が，そのサ
ブユニットを含むアイソエンザイムを抽出するべく，固
相に結合される。そして，洗浄後，他（この場合Ｍ）に
対する標識化（酵素または¹²⁵I）されたサブユニットが
加えられる。

CK−MBの分析に関する固相の２部位抗体方法の，最近
開発された典型例（例えば,Cal Biochem−Boehring,La
Jolla,Californiaにより作られたEnzygnost免疫分析）
では,CK−MB,CK−BBおよびマクロ−CK−１（イムノグロ
ブリンと結合したCK−BB）を結合させるために,CK−Ｂ
に対し抗体特異的に被覆されたチューブに血清が加えら
れる。CK−MMアイソエンザイムおよび他のすべての酵素
（CK−Ｂサブユニットを含まない）を除去するための洗
浄工程の後，第２の抗体（CK−Ｍサブユニットに特異的
であり西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている）
が加えられる。このことにより，分析チューブに残って
いるCK−MBのみが標識される。次いで，その基質（尿素
過酸化物）が加えられる。その際，生じた有色生成物の
濃度は，サンプル中のCK−MBの濃度に関連する。

それゆえ，血清中のCK−MBの量を定量的に測定するた
めに，ごく最近に記述された方法は，免疫的手法に基づ
く方法である。例えば，米国特許第4,260,678, 4,353,9
82および4,387,160号を参照せよ。CKのＢサブユニット
およびＭサブユニットに対するモノクローナル抗体（ポ
リクローナル抗体から区別されるような）もまた，この
ような分析に対し開発されている。この抗体は,Wurzbur
gおよびStrobel,J Clin Chem Clin Biochem（1981）19:
543−544;MorrisおよびHead,FEBS Lett（1982）145:163
−168;MorrisおよびHead,Biochem J（1983）213:417−4
25;Jacksonら，Ibid（1983）215:505−512により，記述
されている。このような抗体を用いるCK−MBの分析は,J
acksonら，Clin Chem（1984）30:1157−1162;Sheehanお
よびHaythorn,Ibid（1985）31:160−161;Chanら，Ibid
（1985）31:465−469;McBrideら，Ibid（1985）31:1099
−1100により，さらに評価され，そして報告されてい
る。

以前の分析では,CKの他の２つのアイソエンザイム
（すなわちCK−MMおよびCK−BB）に対する感受性の程度
が異なる。さらに，アデニル酸キナーゼ（CK活性が測定
される場合），マクロ−CK−１（これはイムノグロブリ
ンが結合したCKである）およびマクロ−CK−２（ミトコ
ンドリアCK）による阻害も起こる。また，非特異的結合
による阻害は,2部位分析にてしばしば問題となる（Bosc
ato,L.M.ら，Clin.Chem.（1986）32:1491−1495）。

発明の開示 本発明は，血清および他の生体液中にて,CK−MBアイ
ソエンザイムを定量するための改良法および材料を提供
する。これらの方法は,CK−MBだけを認識し，そして他
のアイソエンザイムを認識しないモノクローナル抗体ま
たはその誘導体を使用する。この抗体を使用すると，固
相分析での酵素活性によって，血清および他の生体液中
で，直接かつ特異的にアイソエンザイムを測定すること
が可能となる。それゆえ，このクラスの抗体（Conan−M
Bと命名されたあるメンバー）は，血清および他の生体
液から,CK−MBアイソエンザイムを抽出するために利用
される。生物学的試料中のCK−MBは，次いで，吸収され
たCK−MBアイソエンザイムをCK試薬系にさらし，触媒活
性を測定することにより，定量され得る。または，この
CK−MBは，他の手段により検出され得る。例えば,ATP/A
DP転化を触媒する際の酵素活性は,NADHまたはNADPHによ
る340nmの吸収変化を追跡することにより，測定され得
る。または，この反応は，分光光度的に行われ得る他の
公知の反応と連結され得る。代表的な例では，ラテック
ス粒子上に被覆されたConan−MBモノクローナル抗体を
用いる分析が，この方法を使用する。このプロトコル
は，阻害を示さず，商業的に利用される固相の２部位酵
素イムノアッセイと，非常によく一致していた。MB特異
的抗体が有用な他のプロトコルもまた，もちろん使用さ
れ得る。

それゆえ，ある局面では，本発明は，適当なサンプル
中でのCK−MBを決定する際に有用なMB特異的マノクロー
ナル抗体の調製物を示す。他の局面では，本発明は，細
胞系，特にハイブリドーマを示す。この細胞系は,MB特
異的モノクローナル抗体の調製物を生成し得る。さらに
他の局面では，本発明は，このような細胞系およびモノ
クローナル抗体を調製する方法，および本発明のモノク
ローナル抗体調製物を用いて，生物学的試料および他の
試料中のCK−MBを分析する方法を示す。

MB特異的モノクローナル抗体の調製物の特定の実施態
様は,Conan−MBと名付けられている。そして,Conan−MB
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系
は，アメリカン タイプ カルチャー コレクション
（Rockville,Maryland,ATCC受託番号HB 8939）に寄託さ
れている。

図面の簡単な説明 第１図は，拮抗RIAにより決定された特定のConan−MB
モノクローナル抗体を示す図式的説明である。固定化さ
れたモノクローナル抗体Conan−MBは，種々の濃度のCK
−MM（Ｘ）,CK−BB（Ｏ），天然CK−MB（・），および
ハイブリッドCK−MB（▲）に,100,000cpmの¹²⁵I CK−MB
とともにさらされた。Conan−MBに結合した¹²⁵I CK−MB
のカウント数は，拮抗物が存在しない状態で結合したと
きのカウントに対する割合として，加えられた拮抗物
（μg/l）の対数に対し，プロットされた。

第２図は，本発明の一実施態様において，モノクロー
ナル抗体Conan−MBを付けたラテックスビーズの被覆物
を示す図式的説明である。４℃で一昼夜インキュベート
後,0.8ミクロンのラテックスビーズ（5g/l）に固定化さ
れたConan−MBは，抗体濃度の増加に対しプロットされ
た。

第３図は，本発明の一実施態様において,CK−MBの直
接分析におけるCK−MM,CK−BB,ミトコンドリアCKおよび
溶血の影響を示す図式的説明である。対照CK−MB値は,6
2U/lの精製ヒトCK−MBであった。この溶血物は,24時間
を越えない時間で貯蔵された洗浄ヒト赤血球細胞を凍結
することにより，調製された。精製CK−MM,CK−BBおよ
びミトコンドリアCKが利用された。アイソエンザイムが
高い値で存在する場合の値は,2回のラテックスビーズ洗
浄後，少量の残存ラテックス活性に対して補正される。
この残存ラテックス活性は，分析に対照ビーズを用いる
ことにより，決定された。この活性は,200000U/lのCK−
MMに対し35.9U/lであり,250000U/lのCK−BBに対し25.0U
/lであった。

第４図は，本発明の一実施態様において，直接分析に
より決定されたCK−MB活性（U/l）と，市販の２部位イ
ムノアッセイ（μg/l）により決定されたCK−MB濃度と
の比較を示す図式的説明である。両方法により50の試料
が測定された。線形の回帰式は,Y＝0.915 X＋0.35（相
関係数0.997）であった。

本発明の実施様式 A.定義 ここで言う“〜と免疫学的に反応性の”とは，特定の
エピトープに対するイムノグロブリンの変化領域の特異
性により媒介された，典型的な抗原−抗体反応をいう。

抗体の“免疫学的に反応性である誘導体”とは，エピ
トープ（通常，それらが由来する抗体により認識されて
いる）を認識する能力を保持している抗体の部分をい
う。このような誘導体には，通常，例えば，イムノグロ
ブリンのFab断片,Fab'断片，およびＦ（ab'）₂断片が包
含される。このような免疫学的に反応性の誘導体の調製
は，当該技術分野でよく理解されており，抗体がイン
ビボで使用されるとき，または全イムノグロブリン分子
の機能的な効果が望まれないとき，しばしば有利とな
る。

イムノグロブリンまたはその誘導体の特性を記述する
際における，“〜と交差反応性の”とは，参照された抗
体または誘導体と同じエピトープを認識する能力をい
う。この能力は，参照イムノグロブリンの免疫学的反応
を妨げるために，交差反応性物質の能力を評価すること
により，認識され得る。

ここで用いられる,1ユニット（Ｕ）の活性とは,37℃
にて毎分形成されるATP 1マイクロモルに等しく定義さ
れる。

“細胞系”とは，固定化細胞，細胞培養物，同一の細
胞の増殖物，およびそれらの子孫をいう。この子孫およ
び“同一の”集団のある構成物は，この系が由来するも
との細胞と完全に同一でなくてもよく，偶然の変異によ
り遺伝的な構成が異なっていてもよい。しかしながら，
これらの変異された子孫は，細胞の本質的な性質が維持
される限り，この定義に含まれる。本発明によると，細
胞またはその子孫は，必要な特性（すなわち,CK−MBア
イソエンザイムに対する特異性）の抗体を分泌する能力
が維持される限り，この定義にはいる。

“CK−MBアイソエンザイムに特異的”とは,CK−BBお
よびCK−MMを除外して,CK−MBと免疫学的に反応する抗
体または誘導体の能力をいう。

用語“Conan−MB"とは,ATCC HB−8939およびこの特定
の細胞系により分泌される抗体，を特に示す。それゆ
え，“Conan−MB"は，この細胞系およびその生成物の両
方を示すべく用いられる。用語“Conan型MB"は,CK−MB
との反応においてConan−MBと拮抗する抗体，およびそ
れらを分泌する細胞系をいう。用語“MB特異的抗体”
は,CK−MBに特異的な全てのモノクローナル抗体（それ
が,Conan−MBと同じエピトープを認識するか否かにかか
わらず）をいう。

それゆえ，寄託された細胞系により分泌される抗体と
の類似性には,3つのレベルがある。細胞系Conan−MB自
身により分泌された抗体は，“Conan型MB"モノクローナ
ル抗体と交差反応する。なぜなら両者は，同一または類
似のエピトープと拮抗するからである。MB特異的モノク
ローナル抗体の調製物の一般的なクラスは,CK−BBおよ
びCK−MMを除外して,CK−MBと反応する。CK−BBおよびC
K−MMアイソエンザイムは,MB特異的モノクローナル抗体
との免疫反応性に関し,CK−MBと拮抗しない。しかしな
がら，一般的なクラスのMB特異的モノクローナル抗体の
全構成物は,Conan−MBと拮抗しないか，または交差反応
しない。あるものは,Conan−MBそれ自体よりも,CK−MB
アイソエンザイム上の異なるエピトープを認識する。し
かし，このエピトープは,CK−BBまたはCK−MMとは反対
にCK−MBに特有である。

ここで用いられる“CK試薬”とは，クレアチンキナー
ゼの酵素活性を測定するのに用いられ得る成分の集合を
いう。クレアチンキナーゼは,3つのそのイソ酵素型のす
べてに酵素活性があり，上で述べたように，クレアチン
リン酸およびADPと，クレアチンおよびATPとの相互変換
を触媒する。それゆえ，この試薬は，この反応を遂行す
るための適当な反応成分に加えて，生成物から検出可能
な結果を得るための試薬を含有する。

例えば、実施例２では，“CK試薬”は,AMP,ADP,クレ
アチンリン酸,NAD,酵母HK,およびＧ−６−PPHおよび種
々の緩衝成分および安定化成分を含有する市販の試薬混
合物である。この混合物は,Gemini CK_LTS試薬の名で，
エレクトローヌクレオニクス社から市場に出されてい
る。

実施例３では，この“CK試薬”は，“基質”溶液（こ
れは,20.92g/lビス−トリス,1.010g/l ADP,2.14g/l,Mg
(oAc)₂,3.60g/l D−グルコース,2.00g/l NAD,1.85g/l A
MP,0.95g/l EGTA,2500U/l HKおよび1650U/l G−６−PDH
を含有する）と，“キッカー”溶液（これは,2.092g/l
ビス−トリス，および332.8g/lクレアチンリン酸を含有
する）との30:1の混合物である。

B.MB特異的抗体の生産 一般に,MB特異的抗体は，適当な哺乳類検体と精製CK
−MBとの免疫化を含む特異的プロトコルにより調製され
得る。この精製CK−MBは，血清中の抗体力価が高いと
き，免疫した動物の末梢血液リンパ球または脾臓に由来
する抗−MB分泌細胞を含み，これら抗体分泌細胞を永久
分裂化しており，次いで，所望の抗体を生産するため
に，これら永久分裂化した細胞を選抜している。この選
抜手順は，極めて重要であり，精製CK−MBとの免疫反応
を含んでいる。この手順によれば，抗体と，精製CK−BB
およびCK−MMとの交差反応性のないことが証明される。

最初の免疫中の免疫原として，精製CK−MBアイソエン
ザイムを用いることは,MB特異的抗体を分泌する細胞系
の調製を成功させるのに重要である。この酵素は，ヒト
骨格筋および心筋から,Leykam,Dietzler,およびLadenso
n,Clin Chem（1983）29:1219（要約413−Ａ），およびV
aidya,Dietzler,Leykam,およびLadenson,Biochim Bioph
ys Acta（1984）790:230−237に記述のように精製され
得，その内容はここに示されている。この精製手順は，
組織均質化，硫酸アンモニウム分画，イオン交換クロマ
トグラフィー（例えばDEAEセファロースを用いる）を使
用し，続いて，アフィニティークロマトグラフィーまた
はクロマトフォーカシング（chromato−focusing）によ
り行われる。この開示方法の変更もまた，実行可能であ
る。

例えば，アフィニティークロマトグラフィーでは，基
質は，不溶性の支持体（マトリックス）上に固定化され
た相補的な結合基質（リガンド）により，特異的かつ可
逆的に吸収される。種々のマトリックスおよびリガンド
が用いられ得る。より好ましいアフィニティークロマト
グラフィー材料は,Affi−Gel Blueおよび5'−AMP−Sep
harose である。Affi−Gel Blueは，反応性の青色染
料を付けたアガロースであり,Bio−Rad,Richmond,Cali
f.から市販されている。5'−AMP−Sepharose は，N
⁶（６−アミノヘキシル）5'−AMPとセファロース（アガ
ロース）とのカップリングにより形成され,Pharmacia F
ine Chemicals AB,Uppsala,Swedenから市販されてい
る。

CK−MBを精製するための特に好ましい方法は，ハイブ
リドーマATCC HB−8939,から分泌されたConan−MBまた
は本発明の他のMB特異的抗体を利用することにより，可
能となる。これらの抗体は，所望のアイソザイムに対
し，極めて完全に特異的であるため，これら抗体は，こ
の材料を精製する手順において，アフィニティークロマ
トグラフィーに対し適当なリガンドをつくる。この抗体
は，セファロース，ラテックス，アガロースまたはポリ
アクリルアミドを含むあらゆる適当なマトリックスと結
合され得る。抗体を固体支持体に固定化する手段は，も
ちろん，非常に多くあり，当該技術分野にてよく知られ
ている。

クロマトフォーカシング方法では，タンパクが明確に
集中するように溶出され，それらの等電点に従って，線
形のpH勾配中の領域に分離される。このタンパクは，カ
ラムの先端にて，ポリバッファー交換樹脂（Polybuffer
Exchange resin）と最初に結合した後,pH勾配の展開と
して下方に移動する。pH勾配において，特定のレベルに
までカラム下部へ移動する速度は，ポリバッファーの流
速より遅い。テーリングタンパクは，下方に運ばれ，カ
ラムに結合する領域にまで行きつき，それにより，狭い
帯状の広さを維持する。クロマトフォーカシングに関す
るさらに背景となる情報は，製造者の公表を参照して得
られる：ヒ゜スChromatofocusing with Polybuffer and
PBE ,Pharmacia FineChemicals,Uppsala,Sweden,1982;
RicheyおよびBeadling,Amer Lab 13,October 1981,pp.1
00−102;そしてSluyterman,Trends in Biochem Sci（19
82）7:168−170。

精製CK−MBアイソエンザイムは，次いで,MB特異的抗
体を分泌し得る細胞を生成するための，免疫原として用
いられる。マウス（または他の適当な哺乳類検体）は，
血清中に高力価の抗体が検出し得るまで，精製CK−MBア
イソエンザイムを注射することにより，免疫化される。
このように確認され，うまく免疫化された検体には，好
ましくは，追加のCK−MBが注射される。適当な時間後，
この脾臓細胞または末梢血液リンパ球（好ましくは脾臓
細胞）は，採取され永久分裂化される。

免疫化の際の使用により好ましいマウス品種は,Jacks
on Laboratories,Bar Harbor,Maineにより入手可能なA/
J種である。これは，遺伝的特性を有する公知のマウス
品種である。この品種は，Biological HandbooksIII:In
bred and Genetically Defined Strains of Laboratory
Animals, 1巻，マウスおよびラット,AltmanおよびKatz
により組み合わされ編集されている,FASEB,Bethesda,Ma
ryland,1979,page21により定義され，その内容はここに
示されている。A/J品種に関するさらなる情報は,Bangha
m,Mouse News Lett（1965）33:68;Dickie,Ibid（1966）
34:30;およびHandbook of Genetically Standardized J
AX Mice,HeinigerおよびDorey,eds,The Jackson Labora
tory,Bar Harbor,Maine,3d Ed.,1980,特に２章,pp.1−3
2を参照せよ。

永久分裂化はミエローマとの融合により行われ得,Mil
stein,Nature（1975）256:495−497;Eur J Immunol（19
76）6:511−519に最初に記述されている。こ方法によれ
ば，マウスミエローマ細胞に適用される組織培養物は，
免疫化したマウス由来の脾臓細胞に融合され，ハイブリ
ッド細胞が得られる。このハイブリッド細胞は，多量の
単一抗体分子を生成する。もちろん，当該技術分野で公
知の他の永久分裂化方法（例えば,Epstein−Barrウイル
スとの感染，またはウイルスDNAとのトランスフェクシ
ョン）もまた，用いられ得る。

KohlerおよびMilsteinの方法に関し，より好ましいマ
ウスミエローマ細胞系は,Sp2/0−Ag14細胞系である。こ
れは,BALB/c起源の公知の細胞系であり,Schulman,Wilde
およびKohler,Nature（1978）276:269−270により定義
されている。これらの細胞（これはイムノグロブリン
（Ig）鎖を合成しない）は,the Basel Institute for I
mmunology,Basel,Switzerland,およびアメリカン タイ
プ カルチャー コレクション,Rockville,Maryland（A
TCC受け入れ番号CRL−1581）から入手可能である。

ミエローマ細胞および脾臓細胞の融合を行うより好ま
しい方法は,Galfreら，Nature（1977）266:550−552に
記述の一般的方法による。この方法では，ポリエチレン
グリコール（PEG），例えばPEG1500は，単一層中で成長
する細胞に対する融合剤として用いられる。永久分裂細
胞は,HAT（ヒポキサンチン，アミノプテリンおよびチミ
ジン）選択培地中で培養することにより，選択され得
る。このことは，例えば;Littlefield,Science（1964）
145:709に記述されている。選択培地の選定は，もちろ
ん，永久分裂化過程の性質に依存する。永久分裂化が融
合を介してなされるなら，この融合パートナー（例えば
ミエローマ）は，抗体分泌系にて永久分裂性を与え，欠
陥のある特性を有するに違いない。この特性は，選択培
地の関係から，抗体を分泌するパートナーにより補足さ
れる。

この永久分裂化された細胞は，次いで，正確な特異性
を有する抗体を分泌する細胞について，選抜されなけれ
ばならない。ここでのMB特異的抗体の調製過程におい
て，決定的に重要な部分は，実際には，適当な選抜方法
の選択である。この方法によれば，正確な特異性を有す
る抗体を分泌する永久分裂化細胞が確認される。

永久分裂化細胞の上澄みは，まず,CK−MBに結合する
抗体の分泌のために，選抜される。これは，免疫分析の
ような従来の免疫分析方法を用いてなされ得る。

従来の一般的なRIA方法は，通常，例えばYallowら，J
Clin Invest 39,1157（1960）に記述されていた。固
相RIAは，まず,CattおよびTregear,Science 158,1570
−1572（1967）により開発された。一般に，ポリビニル
表面は，大抵のタンパクをナノグラム量で堅く吸着する
ので，固定化された第２の抗体（抗血清）は，最初の抗
体（これは，拮抗型分析において，放射線標識された抗
原と順に結合し得る）を捕らえるために，用いられる。
ある例示では，このRIAは，この上澄みをマルチウェル
マイクロタイタープレート（これは，例えば，抗マウス
抗体で被覆されている）に適用し，次いで，標識され精
製されたCK−MBを用いて，結合した検体を検出すること
により，達成され得る。

ハイブリドーマ，またはCK−MBを結合し得る分泌抗体
としてこのように同定された他の細胞の一群は，次い
で,CK−MMおよびCK−BBのいずれにも結合しない細胞が
選抜される。これは，種々のプロトコル中でなされ得
る。しかし，最も直接的かつより好ましい大部分の方法
は，この上澄みに由来の精製モノクローナル抗体を用い
る拮抗分析である。この精製された調製物は，抗マウス
IgGで被覆されたマイクロタイターウェルに適用され
る。このウェルは，拮抗するCK−BBまたはCK−MMの変化
量の存在下にて，標識CK−MBで処理される。CK−MBと結
合し続け，それゆえCK−MMまたはCK−BBのいずれについ
ても拮抗に耐える抗体を生成する細胞系が，次いで，選
択される。

先のプロトコルは，もとの培養物の上澄み上で使用さ
れるか，部分的に精製された培地または腹水を利用し得
る。これら培地または腹水は，培養物の増幅後,CK−MB
と反応性の抗体を分泌することが，示される。ここで開
示の実験に基づいて，例示方法により調製された抗体と
反応性のCK−MBの多数は，このアイソエンザイムに対し
特異的であり,CK−MMおよびCK−BBと反応しない。それ
ゆえ，もし永久分裂化した細胞の多数が，所望の特異性
を有する抗体を生成しない場合には，この増幅操作で
は，ほとんど何も消費されない。所望のアイソエンザイ
ムに対する特異性についての有用な確認試験は，このよ
うな増幅された上澄みまたは腹水に由来の部分的に精製
された抗体について，より好都合に行われる。この手順
では，生成される抗体は，例えば，¹²⁵Iまたは他の適当
な標識を用いて標識化される。この抗体は，分離された
アイソエンザイムに対応するバンドを含む電気泳動ゲル
と接触される。イムノグロブリンが，分離されたアイソ
エンザイムCK−MBとは排他的に結合するが,CK−BBおよ
びCK−MMに対応するバンドとは結合しないような調製物
が，次いで，選択される。

以下に例示の手順では,CK−MBに対する抗体を分泌す
る13のハイブリドーマのうち,8つのハイブリドーマは，
このアイソエンザイムに特異的な抗体を生成した。

抗体生成物を増幅するために，この永久分裂化細胞
は，インビトロにて培地中で培養されるか，または，そ
れに代えて，細胞の成長や多数のモノクローナル抗体の
生成を可能にするような，腹水腫傷を生成するマウスに
注射される。

生成するにつれて，このモノクローナル抗体は，種々
の公知方法により，組織培地または腹水から単離され精
製され得る。この公知方法には，例えば，硫酸アンモニ
ウム沈澱法，透析，アンフィニティークロマトグラフィ
ー，イオン交換クロマトグラフィー，限外濾過，高分子
電解質共重合体による吸着，および類似のタンパク分離
方法がある。より好ましい方法では，タンパクＡ−アガ
ロースカラム（例えばプロテインＡ−セファロース ）
上でアフィニティークロマトグラフィーが使用され，続
いて透析または限外濾過にかけられる。プロテインＡ
は，Staphylococcus aureus（これは，抗原結合部位に
て相互作用なしでIg分子と結合している）から単離され
たポリペプチド（mol.wt.42000）である。プロテインＡ
−セファロース は,Pharmacia Fine Chemicals AB,Upp
sala,Swedenから市販されている。

モノクローナル抗体の単離および精製に関するこれら
の方法および他の適当な方法は,Goding,Monoclonal Ant
ibodies：Principles and Practice,Academic Press,Lo
ndonおよびNew York,1983,および米国特許第4,533,496
号に一般に記述されている。

C.アフィニティークロマトグラフィー 上に記述のように調製されるCK−MB特異的モノクロー
ナル抗体は，生物学的流体または培地からのCK−MBのア
フィニティー精製に有用である。これら精製方法におい
て，このような抗体の使用には，一般によく知られてい
るアフィニティークロマトグラフィー方法が使用され
る。典型的な方法では，モノクローナルまたはそれらの
免疫学的に反応性の断片は，標準的な連結方法（例え
ば,2官能性の連結試薬を用いる方法，または直接連結方
法）により，固体支持体（例えば，アガロース，ポリア
クリルアミドまたはラテックス）に結合される。CK−MB
精製が望まれる混合物は，次いで，支持された抗体調製
物を含むカラムまたはフィルターに通される。この調製
物は，抗体とCK−MBとの間で免疫反応が起こるような条
件下で用いられる。このCK−MBは，抗原−抗体複合体を
選択的に解離させる確実な条件で溶出される。このよう
な条件には,pHの変化，温度の変化，およびイオン強度
の制御が含まれる。

D.CK−MBの分析 本発明のCK−MB特異的抗体は，生物学的試料または他
の試料中におけるCK−MBの存在，不存在またはその量を
分析する成分として，特に有用である。この分析には，
例えば，心筋梗塞の指標としての血清中の分析も含まれ
る。この抗体を利用する分析のプロトコルは，広く変え
られ，そして，この抗体を用いて回収されるCK−MBの直
接測定，または拮抗分析法またはサンドイッチ分析法が
使用され得る。

アッセイは以下のプロトコルに使用される試薬を含む
キットを用いて行い得る。

適当な例示的プロトコルには，以下が包含される。

特に有用なプロトコルの設定には，標識CK−MBが，固
定化されたCK−MB特異的抗体に対し，サンプル中に含ま
れるCK−MBと拮抗するような拮抗免疫分析が用いられ得
る。この分析タイプでは，このCK−MB特異的抗体は，マ
イクロタイターウェル，ビーズなどの固体支持体，また
はカラムに結合されている。この抗体は，異なる量の標
識CK−MBが加えられた試料と接触して位置している。サ
ンプル中のCK−MB濃度が高くなるほど，固体支持体に結
合される標識CK−MBが少なくなる。試料CK−MBに対する
標識診断薬の量は，支持体で処理された後の状態の溶液
中で測定され得るか，または支持体それ自体か支持体か
ら溶出されて測定され得る。この標識が，溶液中に残留
しているものとして測定されるなら，測定される標識の
量は，試料のCK−MB含量と直接比例する。支持体に結合
した標識が基準として用いられるなら，逆も正しい。こ
の標識には，このような分析に通常公知かつ使用される
あらゆる標識がある。この標識には，制限なしで，放射
活性アイソトープ，螢光化合物，色素形成化合物，また
は酵素（検出可能な結果を生じる反応を触媒する酵素）
が含まれる。

別のタイプのプロトコルには，サンドイッチ分析が用
いられ得る。この分析では，本発明のMB特異的モノクロ
ーナル抗体は，試料中のCK−MBを抽出するために用いら
れる。このCK−MBは，次いで，標識された抗−CK−Ｍま
たは抗−CK−Ｂの使用により，検出される。この標識さ
れた抗−CK−Ｍまたは抗−CK−Ｂは，例えば，サブユニ
ット（または，実際には,CK−MBと反応性のあるポリク
ローナル抗血清または他のモノクローナル）のいずれか
と特異的である。この分析は，固相支持体上で行われ得
る。または免疫沈澱が最初に形成され，次いで，分離さ
れ標識され得る。このプロトコルは，もちろん可逆的で
あり，そして，抗−CK−Ｍまたは抗−CK−Ｂは，免疫沈
澱または吸着物の検出に用いられる捕捉イムノグロブリ
ンまたは標識化されたMB特異的抗体として，使用され得
る。

CKのＭサブユニットまたはＢサブユニットに特異的な
抗体は，ポリクローナル調製物またはモノクローナル調
製物のいずれかとして，用いられ得る。これらの抗体
は，市販されているか，または上記の方法と類似の標準
方法を用いて，調製され得る。この方法は，これら特別
な特異性のあるIgについて，当該技術分野で記述されて
いる。

上記に加えて，試験されるべき試料を，本発明のMB特
異的抗体でインキュベートすることにより，直接的な免
疫分析が達成され得る。ここで，この抗体またはそれら
の断片は，固体粒子（例えば，担体ビーズ）または固体
表面上に固定化されている。このビーズまたは他の不活
性固体は，次いで，洗浄される。抗体に結合したCK−MB
活性は，特異的なCK試薬（例えば，連結された酵素反応
系の成分）でインキュベートされた後，測定される。こ
のようなプロトコルでは，最初のインキュベーションは
室温で行われ得る。これに対して,CK試薬とのインキュ
ベーションは，しばしば，約37℃で実行される。

CK活性に依存するこれらプロトコルでは，変性を避け
るべく，予防措置を施すのが望ましい。

CK酵素が，血清サンプル中では，相対的に不安定なこ
とは公知なので，スルフヒドリル（チオール）化合物
（例えば，β−メルカプトエタノール，システイン，グ
ルタチオンまたはジチオスレイトールなど）の少量では
あるが活性化量が，分析反応媒質に加えられ得る。この
ような添加剤の使用に関し，例えば，米国特許第3,403,
077号および第3,540,984号を参照せよ。

不活性担体粒子は，例えば，ガラス，シリカ，アガロ
ース，デキストラン，ポリスチレン，ポリ塩化ビニル，
スチレン／ジビニルベンゼン共重合体および他のこのよ
うな有機材料または無機材料（これらは，球形ビーズの
形に作り上げられ得る）とされうる。しかし，非球形表
面も使用され得る。さらに，分離を助けるために，磁性
ビーズが用いられてもよい。このビーズは，サブミクロ
ン粒子サイズまたはそれ以上（例えば，直径約1cmま
で）とされ得る。この非球形表面は，ガラスまたはプラ
スチックのチューブ表面，またはマイクロタイターウェ
ルとされ得る。

以下のある例示では，ラテックスビーズが用いられ，
直径約１ミクロンより小さい粒子サイズのポリスチレン
ラテックスビーズとされ得る。このようなビーズは，通
常，抗原／抗体反応における担体粒子として用いられて
いる。このビーズは，例えば,SingerおよびPlotz,Amer
J Med（1956）21:888−892および米国特許第3,088,875
号に記述されている。

入手可能な別の化学物質が多くある。ある例示の実施
態様では,CK試薬は，クレアチンリン酸,ADP,グルコー
ス,HK,G−６−PDHおよびNADの効果量を含有する緩衝化
された水系溶液（pH約７）である。

この実施態様に対するCK試薬成分，およびラテックス
ビーズまたは他の不活性担体粒子は，公知物質であり，
また市販されている。それゆえ，このADP化合物およびN
AD⁺化合物は，哺乳類の筋組織から得られる。これは，
一般に，水溶性の塩，通常ナトリウム塩，として市販さ
れている。クレアチリン酸もまた，哺乳類の筋組織から
入手される。これに対して，グルコースは，一般に，コ
ーンスターチの加水分解により，商業的に得られる。こ
のHK酵素およびＧ−６−PDH酵素は，酵母または他の微
生物から得られる。これらは，例えば，米国特許第3,79
4,562号に認められる。このHK酵素は，活性に関するMg
²⁺イオンに対し完全に共同因子となる必要条件を有す
る。これは，水溶性マグネシウム塩（例えば，硫酸マグ
ネシウムまたは酢酸マグネシウム）の少量ではあるが効
果量を，この反応媒体に添加することにより，供給され
得る。この系でのNADHの形成は,340nmにて分光光学的に
検出されるか，または螢光により検出され得る。さら
に，形成されるNADHは，電子伝達体（例えば，ジアホラ
ーゼ）によって，インドニトロテトラゾリウムバイオレ
ット（INT）のような染料を還元するために，用いられ
得る。それにより，可視領域において，分光光学的に検
出され得る有色化合物が生成する。

NADHまたはNADPHを生成する他の酵素系もまた，代用
され得る。

さらに，組み合わされた酵素系または他の手段は，選
択された方向で反応を触媒するCKの１つまたはそれ以上
の生成物を特異的に検出するために，例示のCK試薬に対
し代用され得る。例えば，クレアチンまたはクレアチン
リン酸と，特異的な有色複合体を形成する物質，また
は，どんな場合にもATPとさらに反応する物質もまた，
用いられ得る。

ある特定の選択では，クレアチンキナーゼ反応で生成
するATPは，ルシフェラーゼ系を用いて検出され得る。
この酵素は，螢から抽出され，そして市販されている。
この酵素は，酵素存在下にて，ルシェリンが転化して，
反応中に光が放射されるのに充分な低エネルギー生成物
となる反応を触媒する。このバイオルミネッセンスは,C
K−MBの定量的または定性的な検出の直接的方法とし
て，用いられ得る。

以下の詳細な実施例は，本発明をさらに例示する。し
かし，本発明はこれらに限定されないことが理解される
だろう。部は，他に特定されていなければ，重量部であ
る。

実施例１ モノクローナル抗体の産生および特徴付け 予備検査によれば，免疫化されたA/Jマウスは，従
来，使用されてきたBALB/cマウスに比べると，その血清
中のCK−MBに対する非常に高い抗体価を有した。

その例証となる手順は以下のように実施された： A.免疫化プロトコル：生後８週間の雌A/Jマウス,H−2
^aハプロタイプ（ジャクソン ラボラトリーズ，バーハ
ーバー,MA04609）に,25μｇのヒトクレアチンキナーゼ
−MBを等量のフロイントの完全アジュバント（シグマ
ケミカルCo.,セントルイス,M063178）に乳化して，腹腔
内に注射した。４週間後および８週間後に，フロイント
の不完全アジュバント（シグマ ケミカルCo.）および
リン酸緩衝食塩水（PBS;150mmol/l NaClを含む50mmol/l
リン酸ナトリウム,pH7.2）中の等量の抗原を同様に投与
した。３回目の注射の少なくとも３週間後，融合の４日
前に，最後の追加免疫としてPBS中の25μｇの抗原を与
えた。

この免疫化に用いたCK−MBイソ酵素は，ヒトの心筋か
ら単離し，イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィ
ニティークロマトグラフィーを組み合わせて精製した。
100mmol/l EDTA,10mmol/l 2−メルカプトエタノールを
含む50mmolトリス,pH7.3からなる緩衝液（緩衝液Ａ）を
用いて，心臓組織を抽出した。組織抽出物の40〜70％(N
H₄)₂SO₄分画を透析し，次いで緩衝液Ａ中の０〜325mmol
/l NaCl直線勾配を用いて,DEAE−セファロース イオン
交換カラムクロマトグラフィーに供した。CK−MBピーク
をアガロースゲル電気泳動によって検出した。次いで,C
K−MB分画をAffi−Gel Blueアフィニティーカラムクロ
マトグラフィーに供し，緩衝液Ａ中の０〜250mmol/l Na
Cl勾配を用いてアルブミンを除去し,CK−MBを溶離し
た。このCK−MBを，NAD⁺−依存 デヒドロゲナーゼおよ
びATP−依存 キナーゼを結合した5'−AMP−セファロー
ス アフィニティーカラムクロマトグラフィーに供する
ことによって汚染物質LDHを除去した。精製されたCK−M
Bをフロースルー（flow through）中に採取し，濃縮
し，透析し，そして50％グリセリン中で−70℃にて保存
した。

B.融合技術：免疫化したマウスから脾臓を無菌状態で
摘出した。ポリエチレングリコール（PEG1500）の存在
下で，脾臓細胞（10⁸）をSp2/0−Ag14細胞（10⁷）,BALB
/c骨髄腫細胞系列と融合した。これは本質的にはKohler
およびMilstein,Nature 256,495−497（1975）によっ
て公表された方法に従った。

C.スクリーニング:CK−MBに対する抗体を産生するハ
イブリドーマのスクリーニング（選抜）は，固相ラジオ
イムノアッセイを用いることによって実施した。ヤギ抗
−マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体（ペル−フリーズ バイオ
ロジカルズ，ロジャーズ,AR72756）（150mmol/l NaClを
含む100mmol/lホウ酸ナトリウム,pH8.5中2mg/l）を96穴
丸底マイクロタイタープレート（ダイナテック，アレキ
サンドリア,VA22314）上に被覆した。これは100μｌの
ヤギ抗−マウスIgGを４℃にて一晩,37℃にて２時間イン
キュベートすることによって行った。このプレートをツ
イーン −食塩水（１あたり0.5ml ツイーン−20,8.
77g NaCl,0.02g NaN₃）で洗浄した。次いで,100μｌの
ハイブリドーマの上清を添加し，続いて上述のようにイ
ンキュベーションと洗浄を行った。放射標識抗原（CK−
MB,上述のように精製）を各ウェルあたり100,000cpm添
加し,4℃にて１晩インキュベートすることによって，上
清中に存在する，ヒトCK−MBに対する抗体を検出した。
放射標識CK−MBは,10g/lウシ血清アルブミンおよび1mmo
l/l 2−メルカプトエタノールを含むPBSに希釈した。こ
のプレートを洗浄し，乾燥し，そして結合した放射標識
CK−MBをパッカードのγ線カウンターで計数した。ウェ
ルに関するカウントが，無関係なハイブリドーマの上清
を含む陰性の対照ウェルの少なくとも２倍以上であれ
ば，結果は陽性であるとみなした。陽性の対照として
は，ハイブリテック（サンディエゴ,CA92121）から入手
した，抗CK−Ｍサブユニットおよび抗CK−Ｂサブユニッ
トに特異的な，適当に希釈したモノクローナル抗体を用
いて，ウェルを展開した。CK−MBに対する抗体を産生す
るハイブリドーマを軟寒天培地中でクローン化し,10％
ジメチルスルホキシドおよび30％ウマ血清を含むダルベ
ッコの修正イーグル培地（DMEM）中，液体窒素下で保存
した。

D.腹水からのモノクローナル抗体の精製：プリスタン
（Pristan）で感作されたCAF₁/Jマウス（ジャクソン
ラボラトリーズ）に10⁶のハイブリッド細胞を腹腔内に
注射し，腹水を１〜２週間後に採取した。各細胞系列に
よって産生された腹水をプールし，そして遠心分離によ
って細胞片を除去した後，−20℃にて保存した。腹水か
らのモノクローナル抗体は，プロテインＡアフィニティ
カラム系（MAPS^TM，バイオ−ラッド，リッチモンド,CA9
4804）を用いて精製した。カラムから溶出した抗体のピ
ークは，アミコンYM−50限界濾過セル（遮断分子量50,0
00ダルトン）を用いて濃縮し，次いでPBSに透析，そし
て−70℃にて保存した。モノクローナル抗体の純度はア
ガロースゲル上の電気泳動によって確認した。

E.アガロースゲル電気泳動：腹水の電気泳動は，アガ
ロースゲル（コーニング アガロースフィルムNo.47010
0,アメリカン サイエンティフィック プロダクツ，パ
ロアルト,CA94306）およびバルビトール緩衝液（PHAB,
コーニングNo.470180）を用いて行った。電気泳動は,90
Vで40分間実施した。CKイソ酵素の電気泳動による分離
は，同様にしてコーニングアガロースフィルム（No.470
104）およびモプソ緩衝液:3−（Ｎ−モルホリノ）−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸（コーニングNo.47004
6）を用いて30分間行った。タンパクを染色するには，
ゲルを固定し,0.125％クーマシーブルーを含むメタノー
ル，酢酸および水の混合物（40:10:50）中で染色した。
クーマシーブルーを含まない同様の混合物で背景を脱色
し，風乾した。

F.イソタイプの決定：モノクローナル抗体のイソタイ
プの決定は，アウクターロニィーの放射状免疫拡散法に
よって行った（アウクターロニィー，免疫拡散および免
疫電気泳動ハンドブック，アンアーバーSc.Publ.,1968,
を参照されたい）。二重免疫拡散ディスクおよびマウス
のイソタイプに特異的な抗血清は，マイルス サイエン
ティフィック，ネイパービル,IL 60566から入手した。

G.特異性の決定：モノクローナル抗体の特異性は競合
ラジオイムノアッセイによって決定した。このアッセイ
は，放射標識CK−MBのモノクローナル抗体への結合が各
種濃度の精製されたCKイソ酵素と競合すること以外は，
ハイブリドーマの上清のスクリーニングに用いたRIAと
同様であった。アフィニティー精製モノクローナル抗体
（10g/lウシ血清アルブミンを含むPBS中に2mg/l）の100
μｌをマイクロタイタープレート上に固定化されたヤギ
抗マウスIgGに結合させた。次いで，標識CK−MB（100,0
00cpm）および０〜1000ngのCK競合イソ酵素（CK−BBま
たはCK−MM）の混合物を100μｌ添加し，そして４℃に
て一晩インキュベートした。次いで，このプレートを洗
浄して乾燥し，そして結合した放射標識CK−MBをパッカ
ードのγ線カウンターで計数した。

Conan−MBの特異性は，放射標識抗体を，電気泳動に
よりアガロースゲル上で分離されたCKイソ酵素に結合さ
せることによって確認した。電気泳動の後，ゲルをイソ
プロパノール，酢酸および水の混合物（25:10:65）中で
30分間固定し，脱イオン水で同じ時間かけて,2度洗浄
し，そして10g/lウシ血清アルブミン（BSA）および500,
000cpmの¹²⁵I−標識抗体を含む,50mlのPBS中で室温にて
４時間インキュベートした。結合しない放射活性をPBS
で洗い流した。次いで，ゲルを乾燥し，増感スクリーン
を用いて−70℃にて24時間,XAR−5 X線フィルム（イー
ストマン コダック カンパニィー，ロチェスター,NY1
4650）に感光させ，そして自動フィルム処理装置で現象
した。

結果 上述の方法により，以下の結果が得られた。

モノクローナル抗体の特徴付け 免疫化された４匹のA/Jマウスの脾臓細胞をBALB/c骨
髄腫細胞系列SP2/0−Ag14に融合させることによって，
ヒトCK−MBに対する抗体を分泌する13のハイブリドーマ
を得た。競合RIAにより,13のハイブリドーマのうち８つ
がヒトCK−MBに特異的であって，ヒトCK−MMおよびCK−
BBを認識しない抗体を産生することがわかった。さら
に,Bサブユニットに特異的な抗体を産生する４つのハイ
ブリドーマ，およびＭサブユニットに特異的な抗体を産
生する１つのハイブリドーマが見出された。

CK−MBに特異的な抗体を産生するクローン化ハイブリ
ドーマ（Conan−MB）の１つを注射することによって産
生された腹水は，免疫拡散によりκＬ鎖を有するIgG−2
bサブクラスに属すると特徴付けられた。

Conan−MBの特異性を示す競合RIAを第１図に示す。Co
nan−MBは,10mg/lまでの濃度でさえCK−MMおよびCK−BB
を認識しなかった。Conan−MBの特異性は，ヒトの心臓
から精製した天然のCK−MBと同一の抑制パターンを与え
るハイブリッドCK−MBを用いることによって確認した。
また,CK−MBには結合するが,CK−MMまたはCK−BBには結
合しない放射標識Conan−MBをアガロースゲル電気泳動
によって分離した。

さらに,Conan−MBのCK−MBへの結合が，酵素活性には
影響を及ぼさないらしいことによって特徴付けられた。
ラテックスビーズ上に固定されたConan−MBによってCK
−MBを溶液から抽出する場合もこのようなものだった。
Conan−MBは，その特異性，および活性CK−MBを酵素的
に抽出する能力を有するのでCK−MBの活性を直接測定す
る臨床検査に用いた。

実施例２ CK−MBの測定 臨床試料および標準 CK−MB分析のためにバーンズ病院化学実験室または冠
疾患集中治療検査室に提出された血清試料は,10mmol/l
2−メルカプトエタノールの最終濃度に安定化させた後,
4℃にて保存し，そして５日以内に分析した。試料は，
本発明の直接CK−MB法によって分析した。また，比較す
るために市販の二部位酵素免疫測定法（two−site enzy
me immunoassay;エンザイグノストCK−MB,ベーリング
ダイアグノスティックス，ラジョラァ,CA92037）によっ
ても分析した。

熱不活性化血清プール（56℃にて30分間）を化学実験
室よ得た余分の血清から調製し，そして−70℃にて保存
した。加熱処理はクレアチンキナーゼ活性を不活性化す
るのに十分であり，この血清プールはCK−MB標準のマト
リックスとして，また高いCK−MB活性を有する試料を希
釈するために用いた。標準として用いたCK−MBは上述の
ように精製した。高標準の酵素活性は，フレキシジェム
^TM遠心分析器により37℃にてRosalki,J Lab Clin Med
69,696−705（1967）の方法の変法を用いて測定した。
この方法では，クレアチンホスフェートが基質として働
き，ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−ホスフェー
ト デヒドロゲナーゼが結合酵素であった（エレクトロ
ヌクレオニクスInc.,フェアフィールド,NJ 07006）。エ
ンザイグノストCK−MB分析（ベーリング ダイアグノス
ティックス）のキャリブレーター４（BSAのマトリック
ス）および低いCK−MB活性および高いCK−MB活性を有す
る血清プールを対照として用いた。他のすべての試薬は
シグマ ケミカルCo.,セントルイス,MO63178から購入し
た。

ラテックスビーズ上への抗体の固定化 モノクローナル抗体は，直径0.8ミクロンのポリスチ
レンラテックスビーズ（LB−8,シグマ ケミカルCo.）
上への受動的吸着によって固定化した。このビーズは,2
0倍に希釈し，被覆緩衝液（0.1mol/lリン酸ナトリウム,
pH6.0）の5g/l懸濁液とし，エッペンドルフの微小遠心
器（15,000×g,5分間）でペレット化した。このビーズ
は,0.1g/lのモノクローナル抗体を含む被覆緩衝液中に
再懸濁して5g/lとし，穏やかに回転させながら４℃にて
一晩インキュベートした。被覆したビーズをペレット化
し，トリス緩衝食塩水（TBS）（20mmol/lトリス,pH7.2,
150mmol.l NaCl）で２度洗浄し，そしてTBS中に再懸濁
して5g/lとした。上清中に残留するマウスの免疫グロブ
リンの量は，サンドウィッチ酵素免疫測定法によって測
定した。ラテックスビーズに結合したモノクローナル抗
体の量は，被覆溶液中のモノクローナル抗体の濃度から
上清中に残留するモノクローナル抗体の濃度を差し引く
ことによって決定した。10μｌの被覆ビーズ懸濁液が約
1.0μｇのモノクローナル抗体を含む，このような条件
下で,90％以上の抗体がビーズに結合した。

CK−MBに対する直接分析法 ２度のインキュベーションから構成されるCK−MBの分
析は，洗浄段階によって分離された。最初の抽出または
免疫吸着段階の間に，血清のCK−MBはラテックスビーズ
上に固定化されたモノクローナル抗体に結合した。次い
で，吸着された酵素は酵素段階でCK試薬にさらした。34
0nmで測定された吸光度は酵素活性に比例した。

分析は以下のように実施した： （１）100μｌの血清試料，標準溶液または対照を1.5
mlのポリプロピレン製エッペンドルフ微小遠心管にピペ
ットで採取する。標準は，精製したCK−MBを〜125U/lの
活性まで希釈することによって調製した。この溶液を希
釈することによって４〜128U/lの範囲の標準を準備し
た。高標準の酵素活性は速度論的に測定し，他の標準の
活性は適当な希釈因子を用いて計算した。熱不活性化血
清プール100μｌを標準，および血清を含まない対照の
試料管に添加する。分析緩衝液（TBS＋1mmol/l 2−メル
カプトエタノール）を用いて容量を1mlにする。

（２）モノクローナル抗体を被覆したラテックス粒子
を25μｌ（約2.5μｇのモノクローナル抗体を含む）を
添加する。30分間室温にてインキュベートする。

（３）試料管を４℃の水浴中で冷却し，ビーズをエッ
ペンドルフの微小遠心器（15,000×g,5分間）でペレッ
ト化する。ビーズを1mlの分析緩衝液で２度洗浄する。

（４）ビーズを0.25mlの分析緩衝液に再懸濁する。CK
−試薬0.50mlを添加する。試料管を37℃の水浴に30分間
移す。

（５）ビーズをペレット化し，上清0.5mlを採取し，
そして吸光度A₃₄₀を読み取る。最小二乗法による回帰曲
線の勾配A₃₄₀と標準の活性を比較することによってCK−
MBのU/lを計算する。

吸光度の読み取りは，フレキシジェム^TMの遠心分析器
を用いて行った。100U/lより大きな値を有する試料は，
熱不活化血清で２倍および４倍に希釈した後，再分析し
た。

分析方法 分析は２段階で実施するが，その各々は血清濃度，時
間および温度に関して最適化した。ラテックス粒子（0.
8ミクロン）を固相として選択したが，それは高い被覆
密度を達成することができ，また容易に入手し得るから
である。被覆に用いた濃度（0.1g/l）では,95％を越え
るConan−MBが,5g/lの懸濁液中のビーズに吸着する。よ
り低濃度では，実質的に100％のConan−MBが吸着する
が，最終的な被覆濃度は，それより低い。より高い被覆
濃度では，結合する抗体の割合はそれほど大きくない
が，これはビーズ上のタンパク結合部位が飽和している
ことを示唆している。第２図を参照されたい。

固定化されたConan−MBの最適量は，被覆されたビー
ズの5g/l懸濁液を,32〜256U/lの酵素活性を示す,10g/lB
SAを含むPBS中の４つの用量のCK−MBに，順次増加する
量だけ添加することによって決定した。４℃にて一晩イ
ンキュベートした後,Conan−MBを被覆したビーズをペレ
ット化し，そして洗浄した。ビーズ上に吸着された酵素
活性を,37℃にてCK試薬とインキュベートした30分後のA
₃₄₀として測定した。上清中に残留する酵素活性は，や
はり37℃にて速度論的CK分析によって測定した。ビーズ
上の酵素活性の量は,2μg Conan−MBで頭打ちになり始
めるまで，固定化されたConan−MBの量が増加するとと
もに上昇する。90％を越えるCK−MBが検査した各活性度
の酵素に結合し得た。上清中に残留している酵素活性を
調べることによっても同様の結果が得られた。分析には
2.5μｇのConan−MBを用いるのが好ましい。

CK−MBを正常な血清に添加した場合には,4℃にて一晩
インキュベートした後，固定化されたConan−MBによっ
て吸着された酵素活性の割合は，より少なかった。抗体
量が高い（16μｇまで）場合でさえ，このような効果が
生じたが，血清の希釈率を上昇させることによって最小
になるようであった。従って,100μｌの血清を分析緩衝
液で1000μｌの容量に希釈するのが好ましい。標準およ
び対照は，熱不活性化血清100μｌと混合し，次いで分
析緩衝液で1000μｌに希釈した。これらの条件により，
標準中の約70％のCK−MBが検査したすべての用量におい
て結合した。CK−MBの回収率は,10.2U/lまたは77.9U/l
を最初に21.7U/lであると分析された血清試料に添加す
ることによって評価した。回収率は，それぞれ106.9％
および94.1％であった。

温度および時間が免疫吸着段階に及ぼす効果も評価し
た。CK−MBの活性は対照ビーズ（マウスのIgGで被覆さ
れたもの）とインキュベーションして得られた上清で測
定されたように，室温または４℃のいずれかで24時間一
定であった。37℃では，この活性は対照ビーズとインキ
ュベーションした30分後に累進的に減少した。CK−MB活
性は，室温では30分後または４℃では２時間後にConan
−MBを被覆したビーズに最大限結合した。これらの時間
の後,4℃では結合したCK−MBの減少は少なかったが，室
温では累進的に減少した。これらの変化は上清中にCK−
MBが比例して増加することと関連し,CK−MBがモノクロ
ーナル抗体から解離すること，またはCK−MB−抗体複合
体がラテックスビーズから解離することを示唆した。試
料はConan−MBを被覆したビーズと室温にて30分間イン
キュベートした後，直ちに氷水浴中で冷却し，次の洗浄
段階の間にCK−MBの放出を最小限にするのが好ましい。

洗浄し,4℃にてビーズを再懸濁した後，分析の第２段
階を,CK−試薬の添加および試料管を37℃の水浴へ移す
ことによって開始する。インキュベーションの容量と時
間は，高標準（〜125U/l）に対してはA₃₄₀が1.3になる
ように,15U/l CK−MBを含む標準に対してはA₃₄₀が0.16
になるように設定した（これは正常な被験体に対して期
待される参照上限である）。30分間のインキュベーショ
ンにわたって検査した標準のA₃₄₀は，その濃度に対して
直線的に増加した。第２段階の条件を変更して分析感度
を上昇させるかまたは低下させることができる。

少量（1mmol/l）の２−メルカプトエタノールを分析
混合物に添加して酵素活性を増大させ，安定性を維持さ
せた。10mmol/lを添加しても活性は増大するが，捕捉さ
れた酵素の固定化されたConan−MBからの解離が増大す
るようである。

潜在的な阻害物質の影響を評価した。好ましい分析条
件では，たとえ血清が最初の分析容量の80％まで存在し
ていても結果に影響を与えなかった。室温にて30分間の
インキュベーションを行った，これらの結果は４℃にて
一晩インキュベートして得られた結果と相違した（上記
参照）。熱不活性化血清を希釈用および標準用マトリッ
クスとして用いたが，それは緩衝液のみが存在する場合
よりも血清が存在する場合の方が明らかにCK−MBがラテ
ックスビーズからよく解離したからである。アデニレー
トキナーゼの源として溶解した赤血球を添加すること
は，ヘモグロビン（溶血の評価として）が246g/l程度で
ある場合でさえ，結果に影響を与えない。第３図を参照
されたい。CK−MMを200,000U/lまで，またはCK−BBを25
0,000U/lまで添加するだけで非特異的な効果が得られ
た。このように多量の酵素を添加すると，ラテックスビ
ーズを２度洗浄しても除去されない酵素活性が残留し
た。対照ビーズを用いて分析を行い，残留する少量の酵
素活性（例えば,200,000U/lのCK−MMに対して36U/l）を
差し引いても,CK−BBまたはCK−MMの影響は見られなか
った。第３図を参照されたい。これらの結果はラテック
スビーズの洗浄を４度用いて阻害実験を繰り返すことに
よって確認した。ミトコンドリアCKによる影響は見られ
なかった。

分析内（ｎ＝10）のCVは，低い血清プール（13.0U/
l）について２度測定され,5.3％および9.5％であること
が見出された；また，高い血清プール（105.1U/l）につ
いても２度測定され,3.2％および1.2％であることが見
出された。分析間のCVは，キャリブレーター４（12.8U/
l）（異なる11日）については13.2％；低い血清プール
（11回の分析）については18.7％，および高い血清プー
ル（11回の分析）については4.5％であった。

本発明によるCK−MBの直接分析法による結果は，バー
ンズ病院臨床検査室によって用いられた二部位免疫測定
法と比較した。第４図を参照されたい。相関係数は0.99
7であり，勾配は0.915であった。これにより両者の結果
は匹敵し得るものであることを示している。

実施例３ マクロビーズによる直接分析法 上述の実施例２と同様の直接分析法は，直径が約0.25
インチのマクロビーズを用いても行い得る。この分析は
以下のように行われる： アボットラボラトリーズから入手し得るようなマルチ
ウェル反応トレーを分析に用い,0.2M β−メルカプトエ
タノール10/μｌを各ウェルにピペットで分注する。標
準試料または検査材料100μｌを，必要に応じて，熱不
活性化血清プール（HISP）で希釈して用いる。HISPは余
分の血清を56℃にて30分間加熱することにより調製し，
次いで−70℃にてインキュベートされた血清を50mlの既
知量ずつ保存する。標準は最も高濃度の標準（S4）から
順次，希釈することによって調製する。この高濃度標準
は,5ml HISP中の保存CK−MB 10μｌ（約62,000U/l）で
あって，その活性は実施例２で述べたようにフレキシジ
ェム^TMで速度論的に確認されている。標準曲線は，この
標準（S4）の希釈物を用いて作製する。ここで,S4の測
定値は108U/lであって,S3には36U/l,S2には12U/l,そし
てS1に4U/lが含まれている。S0はブランクである。標準
溶液は４℃で保存する場合は１週間，あるいは−70℃で
保存する場合は少なくとも３ヵ月間安定である。

次いで,1つのConan−MBビーズを各ウェルに添加す
る。このビーズは，ラテックス ミクロビーズの代わり
に鏡面仕上げをした1/4インチのポリスチレン製ビーズ
を用いること以外は実施例２で述べたように調製する。
このビーズはウェルに添加する前に50mMトリス,pH7.5中
ですすぐ。

次いで，ウェルを室温にて１時間，プラットホームシ
ェーカー（platform shaker）上にて約150rpmでインキ
ュベートし，そしてプロクァンタム （アボットラボラ
トリーズ）のような自動洗浄器で各ウェルあたり10mlの
水を用いて洗浄する。次いで，各ビーズを別々の試料管
に移す。この試料管には実施例２と同様のCK試薬300μ
ｌを添加するが,2−メルカプトエタノールのようなスル
フヒドリル活性化剤は添加しない。

個々のビーズを含む試料管を37℃にて45分間インキュ
ベートし,100mMトリス,pH7.5,5mM 1,2−ジアミノシクロ
ヘキサン−N,N,N',N'−四酢酸（DCTA）,0.1mg/ml R−ヨ
ードニトロテトラアゾリウムバイオレット（INT），お
よび1U/mlジアホラーゼを含む色停止試薬1mlを添加する
ことによって反応を停止する。これらの試薬は市販され
ており，シグマケミカルCo.より購入した。

反応を停止させた後，試料管を水浴から取り出し,5分
後に492nmで吸光度を読み取る。

この結果は，バーンズ病院臨床検査室で用いられた二
部位免疫測定法によって測定されたようにCK−MB濃度と
よい相関を示した。693の試料を比較した場合，相関関
数は0.978であり，勾配は0.800であった。これは両者の
結果が匹敵し得るものであることを示している。

他の各種実施例は，本発明の開示を読んだ後に，本発
明の精神と権利範囲から逸脱することなく当業者に明ら
かとなる。これは，このような他のすべての実施例が，
添付された請求の範囲に包含されることを意図してい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴァイディア，ヘマント シー アメリカ合衆国 ミズーリ 63116 セ ント ルイス，ガスティン テラス 4617ビー (72)発明者 ディエツラー，デビッド エヌ アメリカ合衆国 ミズ−リ 63116 セ ント ルイス，ハートフォード 4025 (72)発明者 メイナード，アン イヴォンヌ アメリカ合衆国 ミズ−リ 63110 セ ント ルイス，ショー プレイス 10 (56)参考文献 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．30，Ｎｏ．７（1984）, Ｐ．1157−1162 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．31，Ｎｏ．３（1985）, Ｐ．465−469 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．31，Ｎｏ．１（1985）, Ｐ．160−161

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】CK−MBとのみ免疫学的に反応し、CK−MMお
   よびCK−BBとは免疫学的に反応しないモノクローナル抗
   体または該抗体の免疫学的反応性を有する該抗体の誘導
   体。
2. 【請求項２】CK−MBとのみ免疫学的に反応し、CK−MMお
   よびCK−BBとは免疫学的に反応しないモノクローナル抗
   体または該抗体の免疫学的反応性を有する該抗体の誘導
   体と該CK−MBを検出または測定する試薬とを含む、キッ
   ト。
3. 【請求項３】前記抗体またはその誘導体がConan−MBと
   の交差反応性を有する、請求の範囲第２項に記載のキッ
   ト。
4. 【請求項４】前記抗体またはその誘導体がConan−MBま
   たはその誘導体である、請求の範囲第２項に記載のキッ
   ト。
5. 【請求項５】試料中のCK−MBを直接かつ特異的に測定す
   る方法であって、以下の工程： （ａ）該試料を、CK−MBとのみ免疫学的に反応し、CK−
   MMおよびCK−BBとは免疫学的に反応しないモノクローナ
   ル抗体または該抗体の免疫学的反応性を有する該抗体の
   誘導体と接触させて、該試料中のCK−MBと該モノクロー
   ナル抗体またはその誘導体との間で免疫反応を起こさせ
   る工程；および （ｂ）クレアチンキナーゼとしてのCK−MBのみを含む、
   該免疫反応を起こした成分を該試料の残りの部分から分
   離する工程、を包含する方法。
6. 【請求項６】前記抗体またはその誘導体が、固相支持体
   に結合されており、 前記試料と該支持体とをインキュベートする工程； 該支持体を除去して該試料との接触をなくす工程；およ
   び 該支持体に結合したCK−MBの量を測定する工程、を含
   む、請求の範囲第５項に記載の方法。
7. 【請求項７】CK−MM、CK−MBおよびCK−BBの混合物から
   CK−MBをアフィニティ生成する方法であって、該混合物
   をCK−MBとのみ免疫学的に反応し、CK−MMおよびCK−BB
   とは免疫学的に反応しないモノクローナル抗体、または
   該抗体の免疫学的反応性を有する該抗体の誘導体と接触
   させる工程、を包含する方法。
8. 【請求項８】CK−MBに特異的なモノクローナル抗体およ
   び該抗体の免疫学的反応性を有する該抗体の誘導体を製
   造する方法であって、以下の工程； （ａ）CK−MBとのみ免疫学的に反応し、CK−MMおよびCK
   −BBとは免疫学的に反応しないモノクローナル抗体を産
   生する細胞系を培養する工程；および （ｂ）産生された、該CK−MB特異的抗体を回収する工
   程、を包含する方法。
9. 【請求項９】CK−MB特異的モノクローナル抗体を作成す
   る方法であって、以下の工程： （ａ）哺乳動物に精製されたCK−MBを注射する工程； （ｂ）該哺乳動物から脾臓または末梢血リンパ球を回収
   する工程； （ｃ）該リンパ球または脾臓細胞に永久分裂能を付与す
   る工程； （ｄ）工程（ｃ）により永久分裂能を付与された細胞
   を、CK−MBとの免疫反応性を有する免疫グロブリンの産
   生について選抜する工程；および （ｅ）工程（ｄ）において選抜されたCK−MBと反応する
   抗体を分泌する細胞系を、該抗体とCK−MBとの免疫学的
   反応がCK−MMおよびCK−BBのいずれの存在によっても低
   減化されない抗体の産生について選抜する工程； を包含する、方法。