NO169866B - Preparat og dets anvendelse for ck-mb-isoenzymbestemmelseantistoffproduserende cellelinje og dets anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et preparat for anvendelse in vitro omfattende monoklonalt antistoff eller immunologisk reaktivt derivat derav.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av dette preparat for bestemmelse av CK-MB-isoenzym i en prøve.

Oppfinnelsen angår videre en antistoffproduserende cellelinje og anvendelsen av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB eller et immunologisk reaktivt derivat derav.

Enzymet kreatin-kinase (CK; EC 2.7.3.2) katalyserer den reversible fosforyleringen av kreatin hvori adenosin-5'-trifosfat (ATP) tjener som donor:

Reaksjonen i foroverretning hvori ATP omvandles til adenosin-5'-difosfat (ADP) fremmes ved pH ca. 9, mens den reverse reaksjonen fremmes ved pH ca. 7. Den biologiske funksjonen av CK er lagring av høyenergi-kreatin-fosfat i cellen, og store mengder av enzymet er til stede i skjelettmuskler.

Kjemisk er CK en dimer bestående av to molekylære underenheter betegnet som M- og B-underenhetene, som kombineres slik at det oppstår tre isoenzymer: CK-BB, CK-MB og CK-MM. De tre isoenzymene er anbragt i cytoplasma og hver har en molekylvekt på ca. 82.000 dalton. Disse isoenzymene kan separareres ved agarosegel elektroforese, hvorved CK-BB-isoenzymet migrerer lengst mot anoden, mens CK-MM-isoenzymet migrerer mot katoden og CK-MB-isoenzymet migrerer mellom de to.

CK i serum hos et normalt voksent menneske består hovedsaklig av CK-MM-isoenzymet med bare spormengder av CK-MB. CK-BB-isoenzymet er normalt ikke tilstede i serumet innenfor deteksjonsgrensene for de fleste CK-analyser. Deteksjon av betydelige mengder CK-MB i serum er normalt en indikasjon på akutt myokardialt infarkt (AMI). Imidlertid er CK-MB også funnet i serumet hos pasienter med andre sykdomstilstander enn AMI. Derfor må CK-MB-isoenzym-analysen tolkes omhyggelig av medisinere. Ikke desto mindre er de fleste nåværende analysefremgangsmåter rettet mot kvantifisering av CK-MB ved

AMI.

Forskjellige fremgangsmåter har hittil vært utviklet for analysen av CK, innbefattende spektrofotometriske, kolori-metriske, fluorimetriske og koblede enzymatiske fremgangsmåter .

I et typisk koblet enzymsystem katalyseres reaksjonen mellom kreatin og ATP innledningsvis ved hjelp av CK, slik at det dannes kreatinfosfat og ADP. Denne reaksjonen kobles deretter til to andre enzymreaksjoner som anvender fosfoenol-pyruvat, redusert nikotinamidadenindinukleotid (NADH) og enzymene pyruvinkinase og laktatdehydrogenase. Disse reaksjonene fører endelig til oksydasjonen av NADH, som følges spektrofotometrisk ved 340 nm. Denne fremgangsmåten er hovedsakelig utviklet av Tanzer og Gilvarg, "J Biol Chem"

(1959) 234:3201-4, og modifikasjoner er beskrevet i US-PS 3,403,077.

En annen koblet enzymfremgangsmåte er basert på den reverse reaksjonen, hvori kreatln-fosfat og ADP-substrater reagerer i nærvær av CK, slik at det dannes kreatin og ATP. ATP som genereres tjener i en hjelpereaksjon til å fosforylere glukose i nærvær av heksokinase (HK). Det resulterende glukose-6-fosfatet (G-6-P) blir deretter et substrat for den endelige indikatorreaksjonen som katalyseres av glukose-6-fosfat-dehydrogenaset (G-6-PDH) i nærvær av nikotinamid-adenindinukleotidfosfat (NADP) slik at det dannes 6-fosfo-glykonat og NADPH. Produksjonen av NADPH følges spektrofotometrisk ved 340 nm. Dette koblede enzymsystemet kan vises ved følgende serieavligninger:

Det sistnevnte koblede enzymsystemet, først beskrevet av Nielsen og Ludvigsen og av Oliver, er forbedret av Rosalki, "J.Lab.Clin.Med." (1967) 69:696-705, og ytterligere modifikasjoner er beskrevet i US-PS 3,413,198, 3,485,724, 3,540,984 og 3,994,783.

Alternativt kan NADP og G-6-PDH i reaksjon 3 ovenfor, erstattes med NAD og et G-6-PDH-enzym som er spesifikt for dette, slik at det dannes NADH som på tilsvarende måte kan måles spektrofotometrisk. Nærværet av NADH kan også detekteres ved hjelp av andre fremgangsmåter. Følgelig kan substratoppløsningen innbefatte et fargestoff som kan reduseres av NADH, derved tillates anvendelsen av kolorimet-riske fremgangsmåter.

I en annen alternativ fremgangsmåte kan omsetningene 2 og 3 ovenfor utelates og kreatinet i reaksjon 1 kan omsettes med cx-naftol og diacetyl slik at det dannes et rosafarget kompleks.

De fleste vanlige analysefremgangsmåter for CK-MB består av måling av den enzymatiske aktiviteten for CK-MB etter separasjon fra andre CK-isoenzymer på basis av forskjeller i ladning ved anvendelse av elektroforese eller ione-veksling, eller ved immunoinhibering eller en kombinasjon av immunoinhibering og immunoutfelling. Alternativt er massen av CK-MB målt ved hjelp av immunoanalyse, enten ved anvendelse av et antistoff for analysen av B-underenheter (CK-MB pluss CK-BB) eller to-sete-antistoffteknikker. I to-sete-antistoff-teknikkene knyttes et antistoff, for eksempel til B-underenheten til en fast fase for å ekstrahere isoenzymene inneholdende denne underenheten og, etter vasking, tilsettes et merket (enzym eller <*25>j) antistoff til den andre, i dette tilfelle M, underenheten. ;I et nylig utviklet, typisk eksempel på fast-fase to-sete-antistof f teknikken for analyse av CK-MB (som "Enzygnost" immunoanalysen fremstilt av Cal Biochem-Boehring, La Jolla, California), tilsettes serum til rør som er belagt med antistoffer spesifikke for CK-B-underenheten slik at de binder CK-MB, CK-BB, og makro-CK-1 (CK-BB forbundet med immunoglobulin). Etter et vasketrinn som fjerner CK-MM-isoenzymet og alle andre enzymer som ikke inneholder en CK-B-underenhet, tilsettes et andre antistoff (som er spesifikt for CK-M-underenheten og merket med pepperrot-peroksidase-enzym), derved merkes bare det CK-MB som forblir i analyserøret. Subtratet, ureaperoksid, tilsettes deretter. Konsentrasjonen av det genererte fargeproduktet relateres deretter med konsentrasjonen av CK-MB i prøven. ;De senest beskrevne fremgangsmåtene for kvantitativ måling av mengden av CK-MB i sera er følgelig de som er basert på en immunologisk tilnærming. Se for eksempel US-PS 4,260,678, 4,353,982 og 4,387,160. Monoklonale antistoffer (til forskjell fra polyklonale antistoffer) til B- og M-under-hetene av CK er også utviklet for slike analyser, og er beskrevet, for eksempel, av Wurzburg og Strobel, "J. Cl in. Chem. Clin. Biochem." (1981) 19:543-544; Morris og Head, "FEBS Lett." (1982) 145:163-168; Morris og Head, "Biochem. J." (1983), 213:417-425; Jackson et al, Ibid. (1983) 215:505-512. Analyser for CK-MB ved anvendelser av slike antistoffer er videre utviklet og rapportert av Jackson et al, "Clin. Chem." (1984) 30:1157-1162; Sheedan og Haythorn, Ibid (1985) 31:160-161; Chan et al, Ibid (1985) 31:465-469; McBride et al, Ibid (1985) 31;1099-1100. ;De tidligere analysene har varierende grader av følsomhet overfor de andre to isoenzymene av CK, nemlig CK-MM og CK-BB. I tillegg har det også opptrådt interferens av adenylatkinase (når CK-aktivitet måles), av makro-CK-1 (CK forbundet med immunoglobulin) og av makro-CK-2 (mitokondrisk CK). Videre er interferens på grunn av ikke-spesifikk binding et hyppig problem ved to-sete-analyser (Boscato, L.M. et al., "Clin. Chem." (1986) 32:1491-1495). ;Oppfinnelsen tilveiebringer forbedrede fremgangsmåter og materialer for bestemmelsen av CK-MB-isoenzym i serum og andre biologiske fluider. Disse fremgangsmåtene anvender et monoklonalt antistoff, eller derivater derav, som gjenkjenner bare CK-MB og ikke de andre isoenzymene. Anvendelse av dette antistoffet tillater direkte spesifikk måling av isoenzymet i serum og andre biologiske fluider, på grunnlag av dets enzymatiske aktivitet i en analyse i fast fase. Følgelig anvendes denne klassen av antistoff, hvorav ett element betegnes Conan-MB, til å ekstrahere CK-MB-isoenzymer fra serum og andre biologiske fluider. CK-MB i den biologiske prøven kan deretter bestemmes ved å eksponere det adsorberte CK-MB-isoenzymet mot et CK-reagenssystem og måle den kataly-tiske aktiviteten, eller kan detekteres ved andre fremgangsmåter. For eksempel kan enzymaktiviteten ved katalysering av ATP/ADP-omvandl ingen bestemmes ved å overvåke absorbans-endringen ved 340 nm forårsaket av NADH eller NADPH, eller reaksjonen kan være forbundet med en annen kjent reaksjon som kan følges spektrofotometrisk. I representative eksempler anvendes denne fremgangsmåten ved anvendelse av det Conan-MB-monoklonale antistoffet belagt på latekspartikler. Denne fremgangsmåteutgaven viste ingen interferens og ga utmerket overensstemmelse med en kommersielt tilgjengelig, fast fase, to-sete enzym-immunoanalyse. Andre fremgangsmåtevarianter hvori det MB-spesifikke antistoffet er nyttig kan naturligvis også anvendes. ;Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen et preparat for anvendelse in vitro innbefattende et monoklonalt antistoff eller et immunologisk reaktivt derivat derav, og dette preparat karakteriseres ved at antistoffet eller derivatet er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM-eller CK-BB-isoenzymer. ;Oppfinnelsen angår som innledningsvis nevnt også anvendelsen av preparatet som beskrevet idet foregående avsnitt for bestemmelse av CK-MB-isoenzym i en prøve, hvor prøven bringes i kontakt med preparatet for å bevirke en immunoreaksjon mellom CK-MB i prøven og antistoffet eller derivatet derav i preparatet, og separering av de immunoomsatte komponentene fra resten av prøven. ;Oppfinnelsen angår videre en cellelinje som karakteriseres ved at den produserer et antistoff som er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM- eller CK-BB-isoenzymer, og som utgjøres av ATCC HB 8939. ;Til slutt angår oppfinnelsen som antydet innledningsvis, et monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB eller et immunologisk reaktivt derivat derav for å rense CK-MB fra en blanding, hvorved blandingen bringes i kontakt med antistoffet eller derivatet. ;En spesiell utførelse av de MB-spesifikke monoklonale antistoffpreparatene er betegnet Conan-MB, og hybridom-cellelinjen som produserer det Conan-MB-monoklonale antistoffet er deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under aksesjonsnummer ATCC HB 8939 den 6. november 1985. ;Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser spesifisiteten av Conan-MB-monoklonalt antistoff som bestemt ved kompetitiv RIA. Immobilisert monoklonalt antistoff Conan-MB ble eksponert mot forskjellige konsentrasjoner av CK-MM (X), CK- ;BB (0), nativt CK-MB (.), og hybrid CK-MB (A) sammen med 100.000 cpm av 125I CK-MB. Tellingene for 125I CK-MB bundet til Conan-MB som en prosent av tellingene bundet uten kompetitor til stede er avsatt mot logaritmen av tilsatt kompetitor (jjg/1). Figur 2 er en grafisk fremstilling som viser beleggingen av lateksperler med monoklonalt antistoff Conan-MB ifølge en utførelse av oppfinnelsen. Conan-MB Immobilisert på 0,8 pm lateksperler (5g/liter) etter inkubering over natten ved 4°C er avsatt mot økende konsentrasjoner av antistoff. Figur 3 er en grafisk fremstilling som viser innvirkningen av CK-MM, CK-BB, mitokondrisk CK og hemolyse på den direkte analysen av CK-MB ifølge en utførelse av oppfinnelsen. Kontroll CK-MB-verdien var 62 U/l av renset humant CK-MB. Eemolysatet ble fremstilt ved å nedfryse vaskede humane røde celler lagret mindre enn 24 timer. Renset CK-MM, CK-BB og mitokondrisk CK ble benyttet. Verdiene i nærvær av de høyere mengdene av isoenzymer er korrigert for en liten gjenværende aktivitet tilstede etter to vaskinger av lateksperlene. Denne rest-aktiviteten ble bestemt ved å anvende kontrollperler for analysen og var 35,9 U/l for 200.000 U/l av CK-MM og 25.0 U/l for 250.000 U/l av CK-BB. Figur 4 er en grafisk fremstilling som viser sammenligningen av CK-MB-aktivitet (U/l) bestemt ved direkte analyse i en utførelse av oppfinnelsen og CK-MB-konsentrasjonen bestemt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig to-sete-immunoanalyse (jig/l). Femti prøver ble målt ved begge analyser. Den lineære regresjonen var Y = 0,915 X +0.35 med en korrela-sjonskoeffisient på 0.997. ;A. Definisjoner ;Slik betegnelsen her benyttes viser "immunologisk reaktiv med" til typiske antistoff-antigen-reaksjoner som bevirkes ved spesifisiteten av det variable området av immunoglobuli-ner til spesifikke epitoper. ;"Immunologisk reaktivt derivat" av et antistoff refererer til deler av antistoffet som bevarer evnen til å gjenkjenne epitopene som ordinært gjenkjennes av antistoffer hvorav de er avledet. Slike derivater innbefatter vanligvis, for eksempel, Fab, Fab' og F(ab')2 fragmenter av immunoglobulin-er. Fremstilling av slike immunologisk reaktive derivater er velkjent innen teknikken, og gir ofte fordeler når antistoffene skal benyttes in vivo, eller når de funksjonelle virkningene av det samlede immunoglobulin-molekylet ikke er ønskede. ;"Kryss-reaktiv med" ved beskrivelse av egenskapene for et immunoglobulin eller dets derivat refererer til evnen til å gjenkjenne den samme epitopen som finnes hos det angitte antistoffet eller derivatet. Denne evnen kan gjenkjennes ved å vurdere evnen av det kryssreagerende materialet til å blokkere den immunologiske reaksjonen av det angitte immunoglobulinet. ;Slik størrelsen her benyttes er en aktivitet-enhet (U) definert som et mikromol ATP dannet pr. minutt ved 37°C. ;"Cellelinje" refererer til en udødeliggjort celle, cellekul-tur, et større antall identiske celler, og deres etterkom-mere. Det er kjent at avkommet, og noen av medlemmene av den "identiske" samlingen ikke nødvendigvis er absolutt identiske med den opprinnelige cellen hvorfra linjen er avledet, men kan adskille seg fra hverandre i genetisk oppbygning på grunn av tilfeldige mutasjoner. Dette muterte avkommet er imidlertid innbefattet innenfor definisjonen så lenge som de vesentlige egenskapene for cellelinjen bevares. ;"Spesifikk for CK-MB-isoenzymet" refererer til evnen av et ;antistoff eller derivat til å reagere immunologisk med CK-MB, med utelukkelse av CK-BB eller CK-MM. ;Betegnelsen "Conan-MB" refererer spesifikt til antistoffet utskilt av ATCC HB-8939 og denne spesielle cellelinjen. Følgelig benyttes "Conan-MB" til å betegne både cellelinjen og dens produkt. Betegnelsen "Conan-type MB" refererer til antistoffer som konkurrerer med Conan-MB i reaksjon med CK-MB og cellelinjene som utskiller disse. Betegnelsen "MB-spesifikke antistoffer" refererer til et hvilket som helst monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB, enten det gjenkjenner den samme epitopen som Conan-MB eller ikke. ;Følgelig er det tre nivåer av likhet med antistoffene som utskilles av den deponerte cellelinjen. Antistoffene som utskilles av cellelinjen per se, Conan-MB, kryssreagerer med "Conan-type MB"-monoklonale antistoffer siden begge konkurrerer om den samme eller en tilsvarende epitop. Den generelle klassen av MB-spesifikke monoklonale antistoffpreparater reagerer med CK-MB under utelukkelse av CK-BB eller CK-MM, og disse sistnevnte isoenzymene konkurrerer ikke med CK-MB om immunoreaksjoner med MB-spesifikke monoklonale antistoffer; imidlertid konkurrerer eller kryss-reagerer ikke alle medlemmer av den generelle klassen av MB-spesifikke monoklonale antistoffer med Conan-MB. Noen kan gjenkjenne forskjellige epitoper på CK-MB-isoenzymet som Conan-MB selv, selv om epitopene er unike for CK-MB I motsetning til CK-BB eller CK-MM. ;"CK-reagens" betyr, slik betegnelsen her benyttes, en samling av komponenter som kan anvendes for å måle den enzymatiske aktiviteten av kreatin-kinasen. Kreatin-kinase er enzymatisk aktiv i alle dens tre isoenzymformer og katalyserer den gjensidige omvandlingen av kreatinfosfat-og-ADP med kreatin-og-ATP, som angitt ovenfor. Reagensen vil følgelig inneholde de egnede reaktantene for gjennomføringen ;av denne reaksjonen, pluss reagenser for å produsere et detekterbart resultat fra produktene. ;I eksempel 2 er, for eksempel, "CK-reagensen" en kommersielt tilgjengelig reagensblanding inneholdende AMP, ADP, kreatin-fosfat, NAD, gjær HK, og G-6-PDH og forskjellige bufrende og stabiliserende komponenter. Denne blandingen markedsføres av Electro-Nucleonics, Inc. under betegnelsen "Gemini C^LTS"-reagens. ;I eksempel 3 er "CK-reagensen" en 30:1 blanding av en "substrat" oppløsning inneholdende 20.92 g/liter Bis-Tris, 1.010 g/liter ADP, 2.14 g/liter Mg(oAc)2, 3.60 g/liter D-glukose, 2.00 g/liter NAD, 1.85 g/liter AMP, 0.95 g/liter EGTA, 2500 U/liter HK og 1650 U/liter G-6-PDH, og en "kicker" oppløsning inneholdende 2.092 g/liter Bis-Tris og 332.8 g/liter kreatin-fosfat. ;B. Produksjon av MB- spesifikke antistoffer. ;Generelt kan de MB-spesifikke antistoffene fremstilles ved en spesifikk fremgangsmåte som innbefatter immunisering av et egnet pattedyr med renset CK-MB, slik at det oppnås anti-MB-utskillende celler fra de perifere blodlymfocyttene eller milten av det immuniserte dyret ved et tidspunkt når antistoff titerne i serumet er høye, immortalisering av disse antistoffutskillende cellene, og deretter undersøkelse av de immortaliserte cellene vedrørende produksjonen av de ønskede antistoffene. Undersøkelsesfremgangsmåten er av den aller største betydning, og innbefatter immunoreaksjoner med renset CK-MB og verifisering av en mangel på kryss-reaktivitet for antistoffene med renset CK-BB og CK-MM. ;Det er viktig for vellykket fremstilling av MB-spesifikt antistoffutskillende cellelinjer å anvende et renset CK-MB-isoenzym som immunogenet i den innledende immuniseringen. Enzymet kan være renset for human skjelett- og hjertemuskel som beskrevet av Leykam, Dietzler, og Ladenson, "Clin. Chem." (1983) 29:1219 (Abstract 413-A), og av Vaidya, Dietzler, Leykam og Ladenson, "Biochlm. Biophys. Acta" (1984) 790:230237. Denne rensefremgangsmåten anvender vevshomogeni-sering, ammoniumsulfat fraksjonering, ioneveksling kromatografi som med DEAE-"Sepharose", etterfulgt av affinitetskromatografi og kromatofokusering. Variasjoner av denne omtalte fremgangsmåten kan også anvendes. ;I affinitetskromatografi er for eksempel et stoff spesifikt og reversibelt adsorbert av et komplementært bindende stoff (ligand) immobilisert på en uoppløselig bærer (matriks). En rekke matrikser og ligander kan benyttes. Foretrukne affinitetskromatografi materiale er "Affi-Gel Blue", som er en agarose med reaktivt blått fargestoff, kommersielt tilgjengelig fra Bio-Rad, Richmond, California, og 5'-AMP-"Sepharose" som fremstilles ved å koble N^(6-aminohexyl-) 5'-AMP til "Sepharose" (agarose), kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige. ;En spesielt foretrukket fremgangsmåte for rensing av CK-MB er muliggjort ved tilgjengeligheten av Conan-MB utskilt av hybridomen ATCC EB-8939 eller andre MB-spesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fordi disse antistoffene er så sterkt spesifikke for det ønskede isoenzymet, danner de egnede ligander for affinitetskromatografi i fremgangsmåter for å rense dette materialet. Antistoffet kan konjugeres til en hvilken som helst egnet matriks, innbefattende "Sepharose", lateks, agarose, eller polyakrylamid. Fremgangsmåte for Immobilisering av antistoffer til faste bærere er naturligvis tallrike og velkjente Innen teknikken. ;Ved kromatofokuseringsfremgangsmåten elueres proteiner som skarpt fokuserte, vel separerte soner i en lineær pH-gradient avhengig av deres isoelektrlske punkt. Proteinene migrerer, etter innledende binding ved toppen av kolonnen til en polybuffer-utvekslingsharpiks, nedover etterhvert som pH-gradienten utvikler seg. Hastigheten for bevegelse til et spesielt nivå i pH-gradienten ned kolonnen er lavere enn hastigheten for strømning av polybufferen. Etterfølgende proteiner føres nedover og når området hvor de bindes til kolonnen og derved opprettholder en trangsonebredde. Ytterligere informasjon vedrørende kromatofokusering kan finnes under henvisning til fabrikantens skriv "Cromato-focusing with "Polybuffer" and "PBE"", Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige, 1982; Richey og Beadling, "Amer. Lab." 13, Oktober 1981, side 100-102; og Sluyterman, "Trends in Biochem. Sei." (1982) 7:168-170. ;Det rensede CK-MB-isoenzymet benyttes deretter som et immunogen for å fremstille celler som er i stand til å utskille MB-spesifikke antistoffer. Mus (eller andre egnede pattedyr) immuniseres ved injeksjon med det rensede CK-MB-isoenzymet inntil en høy titer av antistoffet er detekterbar i serumet. Et vel-immunisert objekt som derved er identifi-sert injiseres fortrinnsvis med ytterligere CK-MB. Etter et egnet tidsrom høstes miltcellene eller perifere blodlymfo-cytter, fortrinnsvis miltceller, og immortaliseres. ;En foretrukken musestamme for anvendelse ved immuniseringen er A/J-stammen som er tilgjengelig fra Jackson Laboratories, Bar Earbor, Maine. Dette er en velkjent musestamme som har genetiske egenskaper som definert i "Biological Handbooks III: Inbred and Genetically Defined Strains of Laboratory Animals", Del 1, Mus og Rotter, samlet og redigert av Altman og Katz, FASEB, Bethesda, Maryland, 1979, side 21. For ytterligere informasjon vedrørende A/J-stammen, se også Bangham, "Mouse News Lett." (1965) 33:68; Dickie, Ibid (1966) 34:30; og "Handbook of Genetically Standardized JAX Mice", Eeiniger og Dorey, redaktører, The Jackson Laboratory, Bar Earbor, Maine, 3. utgave, 1980, spesielt Del 2, side 1-32. ;Immortalisering kan bevirkes ved fusjon med et myelom som opprinnelig beskrevet av Kohler og Milstein, "Nature" (1975) 256:495-497; "Eur. J. Immunol" (1976) 6:511-519. Ifølge denne fremgangsmåten smeltes vevskulturtilpassede musemyelom-celler til miltceller fra immuniserte mus slik at man oppnår hybridcellene som produserer store mengder av enkelt anti-stoffmolekyl. Naturligvis kan andre immortaliseringsfrem-gangsmåter som er kjente innen teknikken, for eksempel infeksjon med Epstein-Barr virus, eller transfeksjon med viralt DNA, også benyttes. ;For fremgangsmåten ifølge Kohler og Milstein er en foretrukket musemyelom-cellelinje Sp2/0-Agl4-cellelinjen. Dette er en velkjent cellelinje av BALB/c-opphav, definert av Schulman, Wilde og Kohler, "Nature" (1978) 276:269-270. Disse cellene, som ikke syntetiserer immunoglobulin(lg)-kjeder, er tilgjengelige fra Basel Institute for Immunology, Basel, Sveits, og American Type Culture Collection, Rockville, Maryland under aksesjonsnr. ATCC CRL-1581. ;En foretrukket fremgangsmåte for utførelse av fusjonen av myelomcellene og miltcellene er ved den generelle fremgangsmåten beskrevet av Galfre et al, "Nature" (1977) 266:550-552. hvori polyetylen-glykol (PEG), for eksempel PEG 1500, benyttes som sammensmeltingsmiddelet for cellene som vokser i monolag. Immortaliserte celler kan selekteres ved kultiver-ing i HAT (hypoxanthine, aminopterin og thymidine) seleksjonsmedium som beskrevet for eksempel av Littlefield, "Science" (1964) 145:709. Valget av seleksjonsmedium avhenger naturligvis av naturen av immortaliseringsprosessen. Dersom immortalisering skjer ved fusjon, gir fusjonspartner-en, for eksempel myelomet, immortalitet på den antistoff-utskiIlende linjen og må ha mangelegenskaper som komple-menteres av den antistoff-utskillende partneren i forbindelse med seleksjonsmediet. ;De immortaliserte cellene må deretter undersøkes med henblikk på de som utskiller antistoff av den korrekte spesifisiteten. En kritisk viktig del av prosessen for fremstilling av de MB-spesif ikke antistoffene ifølge oppfinnelsen, er valget av en egnet undersøkelsesfremgangsmåte som vil resultere i identi-fikasjon av immortaliserte celler som utskiller antistoff av den korrekte spesifisiteten. ;Supernatantene fra de immortaliserte cellene undersøkes først for sekresjon av antistoffer som binder CK-MB. Dette kan utføres ved å anvende konvensjonelle immunoanalysefremgangs-måter som immunoanalyse. ;Konvensjonelle generelle RIA-fremgangsmåter ble opprinnelig beskrevet, for eksempel, av Yalow et al, "J. Clin. Invest.", 39: 1157 (1960); og fast-fase RIA ble først utviklet av Catt og Tregear, "Science" 158, 1570-1572 (1967). Siden poly-vinyl-overflater generelt sterkt vil adsorbere nanogram-mengder av de fleste proteiner, benyttes et immobilisert andre antistoff (antiserum) for å oppfange primært antistoff som i sin tur kan binde radiomerket antigen i en kompetitiv-type analyse. Som et eksempel kan RIA utføres ved å påføre supernatantene på flerbrønns mikrotiterplater som er belagt med, for eksempel, anti-mus antistoff, og deretter å detektere bundet antistoff ved anvendelse av merket, renset ;CK-MB. ;Gruppen av hybridomer eller andre celler som derved identi-fiseres som utskillende antistoffer som er i stand til binding av CK-MB, undersøkes deretter med henblikk på de som ikke bindes til CK-MM eller CK-BB. Dette kan gjøres ved en rekke fremgangsmåter, men den enkleste og foretrukne fremgangsmåten er en kompet!tiv analyse ved anvendelse av rensede monoklonale antistoffer fra supernatantene. De rensede preparatene påføres på mikrotiterbrønner belagt med anti-mus IgG og brønnene behandles med merket CK-MB i nærvær av varierende mengder konkurrerende CK-BB eller CK-MM. De cellelinjene som produserer antistoffer som fortsetter å binde CK-MB og derved motstår konkurransen av enten CK-MM eller CK-BB, selekteres deretter. ;Den foregående fremgangsmåten kan anvendes enten på de opprinnelige kultursupernatantene, eller kan anvende delvis renset kulturmedium eller ascites-fluid etter forsterkning av de kulturene som er vist å utskille antistoff reaktivt med CK-MB. Basert på erfaringen som her er beskrevet er hoveddelen av de CK-MB-reaktive antistoffene fremstilt ved den angitte fremgangsmåten spesifikke for dette isoenzymet og reagerer ikke med CK-MM og CK-BB; følgelig forekommer det lite spill ved forsterkningsfremgangsmåten, hvilket kan være tilfellet dersom hoveddelen av de immortaliserte cellelinjene ikke produserer antistoffer av den ønskede spesifisiteten. Et nyttig bekreftelsesforsøk for spesifisiteten til det ønskede isoenzymet utføres mer hensiktsmessig på delvis rensede antistoffer fra slike forsterkede supernatanter eller ascites-fluider. I denne fremgangsmåten merkes antistoffene som produseres ved anvendelse av, for eksempel, <125>j eller et annet merke og bringes i kontakt med elektroforese-geler inneholdende bånd svarende til de separerte Isoenzymene. Preparater hvori immunoglobulinene bindes utelukkende til det separerte isoenzymet CK-MB, men ikke til bånd tilsvarende CK-BB eller CK-MM, selekteres deretter. ;I fremgangsmåten som er illustrert nedenfor viste det seg at av 13 hybridomer som ble oppnådd som utskilte antistoffer mot CK-MB, produserte åtte antistoffer som var spesifikke for dette isoenzymet. ;For å øke antistoffproduksjonen kultiveres de immortaliserte cellene in vitro i kulturmedium eller, alternativt, injiseres i mus hvori de produserer ascites-tumorer som tillater vekst av cellene og generering av store mengder monoklonalt antistoff. ;Etter fremstilling kan det monoklonale antistoffet isoleres og renses fra vevskulturmediet eller ascites-fluidet ved forskjellige kjente fremgangsmåter som ammoniumsulfat-utfelling, dialyse, affinitetskromatografi, ionevekslings-kromatografi, ultrafiltrering, adsorpsjon med polyelektrolytt copolymeres og lignende fremgangsmåter for proteinseparasjon. Foretrukne fremgangsmåter anvender affinitetskromatografi på protein A-agarose kolonner, for eksempel protein A-"Sepharose", etterfulgt av dialyse eller ultrafiltrering. Protein A er et polypeptid (molekylvekt 42.000) isolert fra Staphylo-coccus aureus som binder lg molekylet uten Interaksjon med det antigen-bindende sete. Protein A-"Sepharose" er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige. ;Disse og andre egnede fremgangsmåter for isolering og rensing av monoklonale antistoffer er generelt beskrevet av Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, London og New York, 1983, og US-PS 4,533,496. ;C. Affinitetskromatografi ;De CK-MB-spesifikke monoklonale antistoffene fremstilt som beskrevet ovenfor er nyttige for affinitetsrensing av CK-MB fra biologiske fluider eller kulturmedia. Ved anvendelse av slike antistoffer i disse rensefremgangsmåtene benyttes affinitetskromatografI-teknikker som generelt er velkjente. I en typisk fremgangsmåte konjugeres de monoklonale antistoffene eller deres immunologisk reaktive fragmenter til en fast bærer som agarose, polyakrylamid, eller lateks ved standard sammenbindingsteknologi, som for eksempel anvendelse av bifunksjonelle forbindingsmidler eller ved direkte binding. Blandingen fra hvilken CK-MB-rensingen er ønsket føres deretter gjennom en kolonne eller et filter inneholdende det understøttede antistoffpreparatet ved anvendelse av betingelser hvorunder en immunologisk reaksjon finner sted mellom antistoffet og CK-MB. CK-MB elueres deretter ved å pålegge betingelser som dissosierer antigen-antistoffkomplekset selektivt. Slike betingelser innbefatter endring av pH, endring av temperatur, og kontroll av ionestyrken. ;D. Analyse med henblikk på CK- MB ;De CK-MB-spesifikke antistoffene i følge oppfinnelsen er spesielt nyttige som komponenter av en analyse for nærværet, fraværet eller mengden av CK-MB i biologiske eller andre prøver, innbefattende for eksempel analyse i serum som en indikasjon på myokardialt infarkt. Fremgangsmåter for analyser ved anvendelse av dette antistoffet varierer innenfor vide grenser, og kan anvende direkte måling av gjenvunnet CK-MB ved anvendelse av dette antistoffet, eller kan anvende kompetitive eller sandwich-analyseteknikker. ;Eksempler på egnede fremgangsmåter innbefatter følgende. ;I en spesielt nyttig serie av fremgangsmåter kan det benyttes kompetitive immunoanalyser hvori merket CK-MB konkurrerer med CK-MB som finnes i prøven om immobiliserte CK-MB-spesifikke antistoffer. Ved denne analysetypen plasseres de CK-MB-spesif ikke antistoffene, bundet til fast bærer som mikro-titerbrønner, perler eller til en kolonne, i kontakt med prøven hvortil det er tilsatt varierende mengder av merket CK-MB. Jo høyere konsentrasjonen av CK-MB er i prøven, jo mindre merket CK-MB får anledning til å bindes til den faste bæreren. Mengden av merker som gir en indikasjon på prøve CK-MB kan måles enten i oppløsningen som er igjen etter behandling med bæreren, eller kan måles på bæreren selv eller elueres fra bæreren. Dersom merket måles som det som er igjen i oppløsning vil mengden av merke som måles være direkte proporsjonalt med CK-MB-innholdet i prøven; det omvendte gjelder dersom merket bundet til bæreren benyttes som et mål. Merket kan være et hvilket som helst av de som er vanlig kjente og anvendte innen slike analyser, innbefattende, uten begrensning, radioaktive isotoper, fluorescente forbindelser, kromogene forbindelser, eller enzymer som katalyserer reaksjoner som gir detekterbare resultater. ;I en alternativ type fremgangsmåte kan en sandwich-analyse benyttes hvori det MB-spesifikke monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen benyttes til å ekstrahere CK-MB i prøven, som deretter detekteres ved anvendelse av merkede anti-CK-M eller anti-CK-B - for eksempel antistoffer som er spesifikke til hver underenhet (eller, polyklonale antisera eller andre monoklonale stoffer reaktive med CK-MB). Denne analysen kan gjennomføres på en bærer i fast fase eller en Immunoutfelling kan innledningsvis dannes og deretter separeres og merkes. Fremgangsmåten kan naturligvis reverseres og anti-CK-M eller anti-CK-B kan benyttes som oppfangingsimmunoglobulin og merkede MB-spesifikke antistoffer benyttes til å detektere immunoutfellingen eller adsorbatet. ;Antistoffer som er spesifikke for M- eller B-underenhetene av CK kan benyttes som enten polyklonale eller monoklonale preparater. De er tilgjengelige kommersielt, eller kan fremstilles ved anvendelse av standard fremgangsmåter svarende til de som er beskrevet ovenfor, som er beskrevet innen teknikken for lg av disse spesielle spesfisitetene. ;I tillegg til ovennevnte kan en direkte immunoanalyse utføres ved inkubering av prøven som skal undersøkes med de MB-spesifikke antistoffene ifølge oppfinnelsen hvori antistoffene eller deres fragmenter er immobilisert på faste partik-ler som for eksempel bærerkuler, eller på faste overflater. Perlene eller andre inerte faste stoffer vaskes deretter og CK-MB-aktiviteten bundet til antistoffet måles etter inkubering med en spesifikk CK-reagens som komponentene av et koblet enzymreaksjonssystem. Ved slike fremgangsmåter kan den innledende inkuberingen utføres ved romtemperatur, mens inkuberingen med CK-reagensen ofte utføres ved ca. 37°C. ;Ved disse fremgangsmåtene, som bygger på CK-aktivitet, er det ønskelig å ta forholdsregler for å forhindre denaturering. ;Siden CK-enzymer er kjent for å være relativt ustabile i blodserumprøver, kan tilsats av en liten, men aktiverende mengde av en sulfhydryl (thiol) forbindelse som for eksempel P-merkaptoetanol, cystein, glutation eller ditiotreltol tilsettes til analysereaksjonsmediet. Se for eksempel US-PS 3,403,077 og 3,540,984 vedrørende anvendelse av slike additiver. ;De inerte baerepartiklene kan for eksempel være glass, silisiumdioksyd, agarose, dekstran, polystyren, polyvinyl-klorid, styren/divinylbenzenkopolymer og andre slike organiske eller uorganiske materialer som kan være fremstilt i form av sfæriske kuler, selv om ikke-sfæriske overflater også kan benyttes. I tillegg kan magnetiserte perler benyttes for å lette separasjonen. Perlene kan være av partlkkelstørrelse under en pm eller større, for eksempel opptil ca. en centimeter i diameter. Den ikke-sfæriske overflaten kan være en glass- eller plastrøroverflate, eller en mikrotiterbrønn. ;I en illustrasjon nedenfor benyttes latekskuler, og disse kan være polystyren-latekskuler av en partikkelstørrelse mindre enn ca. en pm i diameter. Slike kuler er vanlig anvendt som bærerpartikler i antigen/antistoff-reaksjoner såsom beskrevet, for eksempel av Singer og Plotz, "Amer. J. Med." (1956) 21:888-892 og TJS-PS 3,088,875. ;Det finnes et antall alternative kjemiske teknikker tilgjengelig. I en illustrert utførelse er CK-reagens en bufret vandig oppløsning inneholdende effektive mengder av kreatin-fosfat, ADP, glukose, HK, G-6-PDH og NAD, pH ca. 7. ;CK-reagenskomponentene for denne utførelsen og lateksperlene eller andre inerte bærepartikler er velkjente materialer og er også tilgjengelige kommersielt. Følgelig kan ADP og NAD<+ >forbindelsene oppnås fra pattedyr-muskelvev, og er generelt tilgjengelig kommersielt som vannoppløselige salter, vanligvis som natriumsaltene. Kreatin-fosfat er også tilgjengelig fra pattedyr-muskelvev, mens glukose generelt oppnås kommersielt ved hydrolyse av maisstivelse. HK- og G-6-PDH-enzymene kan oppnås fra gjær og andre mikroorganismer som det fremgår fra for eksempel US-PS 3,794,562. HK-enzymet har et absolutt kofaktorbehov for Mg<+2->ion for aktivitet, og dette kan tilføres ved tilsetning av en liten, men effektiv mengde av et vannoppløselig magnesiumsalt, for eksempel magnesiumsulfat eller magnesiumacetat, til reaksjonsmediet. Dannelsen av NADH i dette systemet kan detekteres spektrofotometrisk ved 340 nanometer eller ved fluorescens. I tillegg kan dannet NADH benyttes til å redusere fargestoffer, såsom jodonitrotetrazolium-fiolett (INT) via en elektronbærer som diaforase, slik at det dannes fargede forbindelser som kan detekteres spektrofotometrisk i det synlige området. ;Andre enzymsystemer som genererer NADH eller NADPH kan også benyttes. ;I tillegg kan koblede enzymsystemer eller andre innretninger for å detektere spesifikt ett eller flere av produktene fra den CK-katalyserte reaksjonen i den valgte retningen, anvendes istedenfor den angitte CK-reagensen. For eksempel kan det også benyttes materialer som danner spesifikke fargede komplekser med kreatin eller kreatin-fosfat, eller som videre reagerer med ATP på en hvilken som helst måte. ;I ett spesielt alternativ kan ATP som genereres i kreatin-kinase reaksjonen detekteres ved anvendelse av et luciferase-system. Dette enzymet, ekstrahert fra ildfluer og kommersielt tilgjengelig, katalyserer omvandlingen av luciferin i nærvær av oksygen til produkter som er av tilstrekkelig lavere energi til at lys emitteres under forløpet av reaksjonen. Denne bioluminescensen kan anvendes som en direkte fremgangsmåte for deteksjon av CK-MB kvantitativt eller kvalitativt. ;De følgende detaljerte eksemplene illustrerer oppfinnelsen ytterligere, selv om det skal understrekes at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse. Deler er vektdeler med mindre annet er angitt. ;Eksempel 1 ;Fremstilling og karakterisering av monoklonale antistoffer. Innledende forsøk viste at immuniserte A/J-mus hadde mye høyere antistofftitere for CK-MB i deres serum enn konvensjo-nelt benyttede BALB/c-mus. ;Fremgangsmåtene ble gjennomført som følger: ;A. Immunlseringsfremgangsmåte: Åtte uker gamle A/J hunmus, H-2a haplotype, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA 04609), ble injisert intraperitonealt med 25 pg av humant kreatin-kinase-MB emulgert i et like stort volum av fullstendig Freund's adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178). Fire uker og åtte uker senere ble den samme mengden antigen i ufullstendig Freund's adjuvans (Sigma Chemical Co.) og fosfat-bufret saltvannsoppløsning (PBS, 60 mmol/liter natriumfosfat, pH 7.2, inneholdende 150 mmol/liter NaCl) administrert på tilsvarende måte. En endelig porsjon på 25 jjg antigen i PBS ble tilført fire dager før fusjon, minst tre uker etter den tredje injeksjonen. ;CK-MB-isoenzymet som ble benyttet ved denne immuniseringen var isolert fra human hjertemuskel og renset ved en kombinasjon av ionevekslingkromatografi og affinitetskromatografi. Følgelig ble hjertevevet ekstrahert med en buffer innbefattende 50 mmol Tris, pH 7.3, inneholdende 100 mmol/liter EDTA, 10 mmol/liter 2-merkaptoetanol (Buffer A). En 40-70$ ;(NH4)2S04 utskjæring av vevekstraktet ble dialysert, og deretter underkastet DEAE-"Sepharose" ionevekslingskolonne-kromatografi ved anvendelse an en 0-325 mmol/liter NaCl lineær gradient i Buffer A. CK-MB-toppen ble detektert ved hjelp av agarosegel-elektroforese. CK-MB-fraksjonene ble deretter underkastet "Affi-Gel Blue"-affinitetskolonne-kromatografi for å fjerne albumin ved anvendelse av en 0-250 ;mmol/liter NaCl-gradient i Buffer A for å eluere CK-MB. Forurensende LDH ble fjernet ved å underkaste CK-MB til 5'-AMP-"Sepharose" affinitetskolonne-kromatografi som binder NAD<+->avhengige dehydrogenaser og ATP-avhengige kinaser. Det rensede CK-MB ble samlet i gjennomstrømningen, konsentrert, dialysert og lagret ved -70°C i 50$ glyserol. ;B. FusJonsteknlkk: Milter ble fjernet aseptisk fra de immuniserte musene. Splenocytter (10<8>) ble sammensmeltet med Sp2/0-Agl4-celler (IO<7>), en BALB/c-myelomcellelinje, i nærvær av polyetylenglykol (PEG 1500) i det vesentlige ved den publiserte fremgangsmåten ifølge Kohler og Milstein, "Nature" 25b., 495-497 (1975 ). C. Undersøkelse: Undersøkelse av hybridomene som fremstil-ler antistoffer mot CK-MB ble utført ved å anvende fast-fase-radioimmunoanalyse. Geit-anti-mus-IgG (H + L) antistoffer ("Pel-Freeze" Biologicals, Rogers, AR 72756) (2 mg/liter i 100 mmol/liter natriumborat, pH 8.5, inneholdende 150 mmol/liter NaCl) ble belagt på 96 godt rundbundede mikrotiterplater (Dynatech, Alexandria, VA 22314) ved inkubering av 100 pl geit-anti-mus-IgG over natten ved 4°C og i 2 timer ved 37°C. Platene ble vasket med "Tween"-saltvannsoppløsning (0,5 ml "Tween-20", 8.77 g NaCl, 0.02 g NaN3 pr. liter). Dette ble etterfulgt av tilsetning av 100 pl hybridomsupernatant etterfulgt av inkubering og vasking som ovenfor. Antistoffene som var til stede i supernatantene mot humant CK-MB ble detektert ved å tilsette 100.000 cpm radiomerket antigen (CK-MB, renset som ovenfor) per brønn og inkuberer over natten ved 4°C. Det radiomerkede CK-MB ble fortynnet i PBS inneholdende 10 g/liter bovinserumalbumin og 1 mmol/liter 2-merkaptoetanol. Platene ble vasket, tørket og det bundne, radiomerkede CK-MB ble tellet på en "Packard" -y-teller. Resultatene ble betraktet som positive dersom tellingene bundet til brønnen var minst dobbelt så store som for de negative kontrollbrønnene inneholdende urelaterte hybridom-supernatanter. Som positive kontroller ble brønner utviklet ved anvendelse av egnet fortynnede anti-CK-M underenhet og anti-CK-B underenhet spesifikke monoklonale antistoffer oppnådd fra Hybritech (San Diego, CA 92121). Hybridomer produserende antistoffer til CK-MB ble klonet i myk agar og lagret under flytende nitrogen i "Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM) med 10$ dimetylsulfoksyd og 30$ hesteserum. D. Rensing av monoklonalt antistoff fra ascltes: Pristan-primer behandlede CAF^/J-mus (Jackson Laboratories) ble injisert intraperitonealt med 10^ hybridceller, og ascites-fluid ble samlet 1-2 uker senere. Ascitesfluid fremstilt av hver cellelinje ble samlet og lagret ved -20"C etter fjerning av celleavfallet ved sentrifugering. Monoklonalt antistoff fra ascites-fluidet ble renset ved anvendelse av et protein A-affinitetskolonnesystem ("MAPS", Bio-Rad, Richmond, CA 94804). Antistofftoppen eluert fra kolonnen ble konsentrert ved anvendelse av en "Amicon YM-50" ultrafiltreringscelle som hadde en molekylvekt-sperregrense på 50.000 Dalton, og deretter dialysert mot PBS og lagret ved -70°C. Renheten av de monoklonale antistoffene ble undersøkt ved elektroforese på agarosegel. ;E. Agarosegel- elektroforese: ;Elektroforese av ascites-fluid ble utført ved anvendelse av agarosegel ("Corning agarose film No. 470100", American Scientific Products, Palo Alto, CA 94306) og barbitol-buffer ("PEAB, Corning No. 470180"). Elektroforese ble utført i 40 minutter ved 90V. Elektroforetisk separasjon av CK-isoenzymer ble utført på tilsvarende måte i 30 minutter ved anvendelse av Corning Agarose film (Nr. 470104) og "Mopso" buffer: 3-(N-Morfolino)-2-hydroksypropan-sulfonsyre (Corning No. 470046). For farging av proteinene ble geler fiksert og farget i en blanding av metanol, eddiksyre og vann (40:10:50) inneholdende 0.125$ "Coomassie blue". Bakgrunnen ble avfarget i den samme blandingen uten "Coomassie blue"-sjølufttørking. ;F. Bestemmelse av isotype: Isotypebestemmelse av det monoklonale antistoffet ble utført ved Ouchterlony radial-immunodiffusjonsteknikken. (Se Ouchterlony, "Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis", Ann Arbor Sc. Publ., 1968). Doble immunodiffusjonsskiver og muse-isotype spesifikke antisera ble oppnådd fra Miles Scientific, Naperville, IL 60566. ;G. Bestemmelse av spesifisitet: Spesifisiteten av de monoklonale antistoffene ble bestemt ved kompetitiv radio-immunoanalyse. Denne analysen var tilsvarende den RIA som ble benyttet for undersøkelse av hybridomsupernatant, bortsett fra at bindingen av radiomerket CK-MB til de monoklonale antistoffene foregikk i konkurranse med forskjellige konsentrasjoner av rensede CK-isoenzymer. 100 pl av affinitetsrenset monoklonalt antistoff (2 mg/liter i PBS inneholdende 10 g/liter bovinserum albumin) ble bundet til geit-anti-mus-IgG immobilisert på mikrotiterplaten. En 100 pl blanding av merket CK-MB (100.000 cpm) og 0-1000 ng av konkurrerende isoenzym av CK, (CK-BB eller CK-MM) ble deretter tilsatt og inkubert over natten ved 4°C. Platene ble deretter vasket og tørket, og bundet radiomerket CK-MB ble tellet på en "Packard" •y-teller. ;Spesifisiteten av Conan-MB ble bekreftet ved å la radiomerket antistoff bindes til CK-isoenzymer separert på agarosegel ved elektroforese. Etter elektroforese ble geler fiksert i en blanding av isopropanol, eddlksyre og vann (25:10:65) i 30 minutter, vasket to ganger med deionisert vann i samme tidsrom og inkubert i 50 ml PBS inneholdende 10 g/liter bovinserumalbumin (BSA) og 500.000 cpm av ^<25>I-merket antistoff i 4 timer ved romtemperatur. Ubundet radioaktivi-tet ble vasket av med PBS. Geler ble deretter tørket, eksponert mot "XAR-5" røntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, NY 14650) i 24 timer ved -70°C med en intensiver-ende, skjerm og utviklet i en automatisk filmbearbeidelses-enhet. ;Resultater ;Fremgangsmåtene ovenfor ga følgende resultater: ;Karakterisering av monoklonalt antistoff ;Fusjon av miltcellene fra fire immuniserte A/J-mus med BALB/c-myelomcellelinje Sp2/0-Agl4 genererte opp 13 hybridomer som utskilte antistoffer mot humant CK-MB. Ved kompet!tiv RIA, ble det funnet at åtte av de 13 hybridomene produserte antistoffer spesifikke for human-CK-MB som ikke gjenkjente humant CK-MM eller CK-BB. I tillegg ble det funnet fire hybridomer som produserte antistoffer spesifikke for B-underheten og et antistoff spesifikt for M-underenheten. ;Ascites-fluid fremstilt ved injeksjon av en av de klonede hybridomene som ga antistoff spesifikt for CK-MB (Conan-MB) ble karakterisert ved Immunodiffusjon til å være av IgG-2b-underklassen med kappa-lette kjeder. ;Kompetitiv RIA som demonstrerer spesifisiteten av Conan-MB er vist i figur 1. Conan-MB gjenkjente ikke CK-MM eller CK-BB, selv i konsentrasjoner opp til 10 mg/liter. Spesifisiteten av Conan-MB blir bekreftet ved anvendelse av hybrid CK-MB, som ga et identisk inhiberingsmønster som det native CK-MB, renset fra menneskehjerte. Videre, separert radiomerket Conan-MB bundet til CK-MB, men ikke til CK-MM eller CK-BB ved agarosegelelektroforese. ;Videre karakterisering avslørte at binding av Conan-MB til CK-MB ikke syntes å påvirke enzymaktiviteten. Dette var også tilfellet når CK-MB ble ekstrahert fra oppløsningen ved hjelp av Conan-MB, immobilisert på lateksperler. På grunn av spesifisiteten og evnen til å ekstrahere enzymatisk aktivt CK-MB, ble Conan-MB benyttet i en klinisk analyse for direkte måling av CK-MB-aktivitet. ;Eksempel 2 ;Bestemmelse av CK- MB ;Kliniske prøver og standarder ;Serumprøver innsendt til kjemilaboratoriet ved Barnes Hospital eller Coronary Care enhet laboratorie for CK-MB-analyse ble lagret ved 4<*>C etter stabilisering til en endelig konsentrasjon på 10 mmol/liter 2-merkaptoetanol og analysert i løpet av 5 dager. Prøver ble analysert ved den direkte CK-MB-fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og også, for sammenligning, til hjelp av en kommersielt tilgjengelig to-sete enzymimmunoanalyse ("Enzygnost CK-MB", Behring Diagnostics, La Jolla, CA 92037).

En varme-inaktivert serumsamling (56°C i 30 minutter) ble fremstilt fra overskudd av sera oppnådd fra kjemilaboratoriet og lagret ved -70°C. Varmebehandlingen var tilstrekkelig til å inaktivere kreatin-kinase-aktiviteten og tillot at serumsamlingen kunne benyttes som en matriks for CK-MB-standarder og fortynning av prøver med høy CK-MB-aktivitet. CK-MB benyttet som standard ble renset som beskrevet ovenfor. Enzymaktiviteten for standarden med høyt innhold ble bestemt med en "Flexigem" sentrifugeanalysator ved 37°C ved anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten i følge Rosalki, "J. Lab. Clin. Med." b9, 696-705 (1967), hvori kreatin-fosfat tjente som substrat og heksokinase og glukose-6-fosfat dehydrogenase var de koblende enzymene (Electronucleonics Inc., Fairfield, NJ 07006). "Calibrator 4" (matriks for BSA) fra "Enzygnost CK-MB"-analysen (Behring Diagnostics) og serumsamlinger av lav og høy CK-MB-aktivitet ble benyttet som kontrollprøver. Alle andre reagenser var innkjøpt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178.

Immobilisering av antistoff på lateksperler

Monoklonalt antistoff ble immobilisert ved passiv adsorpsjon på polystyren lateksperler av diameter 0.8 pm ("LB-8", Sigma Chemical Co.). Perlene ble fortynnet 20 ganger til en 5 g/liter suspensjon i belegglngsbuffer (0.1 mol/liter natrlumfosfat, pH 6.0) og pelletisert i en "Eppendorf mlcrofuge" (15.000 x g, 5 min.). Perlene ble resuspendert til 5 g/liter i belegglngsbuffer inneholdende 0.1 g/liter monoklonalt antistoff og inkubert over natten ved 4°C under forsiktig rotasjon. De belagte perlene ble pelletisert, vasket to ganger med Tris-bufret saltvann (TBS) (20 mmol/liter Tris, pH 7.2, 150 mmol/liter NaCl) og resuspendert til 5 g/liter i TBS. Mengden av muse-immunoglobulin som var tilbake i supernatanten ble bestemt ved en sandwich-enzym-immunoanalyse. Mengden av monoklonalt antistoff bundet til lateksperlene ble bestemt ved å subtrahere konsentrasjonen av monoklonalt antistoff som var tilbake i supernatanten fra konsentrasjonen i beleggingsoppløsningen. Mer enn 90$ av antistoffet var bundet til perlene under disse betingelsene, slik at 10 pl av belagt perlesuspensjon inneholdt ca. 1.0 pg monoklonalt antistoff.

Direkte analvsefremgangsmåte for CK- MB

Analysen for CK-MB bestod av to inkuberinger separert av et vasketrinn. Under den innledende ekstraksjonen eller immunoadsorpsjonsfasen var serum-CK-MB bundet til monoklonalt antistoff immobilisert på lateksperler. Det adsorberte enzymet ble deretter eksponert mot CK-reagens i den enzymatiske fasen. Den resulterende absorbansen ble målt ved 340 nm og var proporsjonal med enzymaktiviteten.

Analysen ble utført som følger:

(1) Pipetter 100 pl serumprøver, standardoppløsninger eller kontrollprøver i 1.5 ml polypropylenrør fra "Eppendorf mlcrofuge". Standarder ble fremstilt ved fortynnet, renset CK-MB til en aktivitet på ~125 U/liter. Fortynninger av denne oppløsningen ble utført for å tilveiebringe standarder varierende fra 4 til 128 U/liter. Den enzymatiske aktiviteten for standarden med høyt innhold ble målt kinetisk, og aktiviteten for de andre standardene ble beregnet ved anvendelse av den aktuelle fortynningsfaktoren. Tilsett 100 pl varme-inaktivert serumsamling til rør inneholdende standard og ikke-serum-holdig kontrollprøve. Bring volumet til 1 ml med analysebuffer (TBS + 1 mmol/1 2-merkaptoetanol). (2) Tilsett 25 pl monoklonalt antistoff-belagte latekspartikler som inneholder ca. 2.5 pg monoklonalt antistoff. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. (3) Nedkjøl rør i vannbad av 4°C og pelletiser perler i "Eppendorf mlcrofuge" (15.000 x g, 5 min.). Vask perlene to ganger med 1 ml analysebuffer. (4) Resuspender perler i 0.25 ml analysebuffer. Tilsett 0.50 ml CK-reagens. Overfør rørene til et vannbad på 37°C 1 30 minutter. (5) Pelletiser perler, fjern 0.5 ml supernatant og avles A34Q. Beregn U/liter av CK-MB ved sammenligning med stigningen med minstekvadratets regresjon A34Q og aktivitet for standardene.

Absorbansavlesninger ble foretatt med "Flexigem"-sentrifuge-analysatoren. Prøver med verdier >100 U/liter ble gjenanaly-sert etter 2- og 4-gangers fortynning i varme-inaktivert serum.

Analvsefremgangsmåte

Analysen ble utført i to trinn, og hvert ble optimalisert med hensyn på serumkonsentrasjon, tid og temperatur. Latekspartikler (0.8 pm) ble valgt som den faste fasen på grunn av høyoppnåelig beleggingstetthet og deres lette tilgjengelig-het. Ved konsentrasjonen som ble benyttet for belegging (0.1 g/liter) adsorberes mer enn 95$ Conan-MB til perlene i en suspensjon på 5 g/liter. Ved lavere konsentrasjoner adsorberer tilnærmet 100$ Conan-MB, men den endelig belagte konsentrasjonen er lavere. Ved høyere beleggingskonsentra-sjoner er en større andel av antistoff ikke bundet, hvilket tyder på metning av proteinMndings-setene på perlene. Se figur 2.

Den optimale mengden av immobilisert Conan-MB ble bestemt ved å tilsette økende mengder av en 5 g/liter suspensjon av belagte perler til fire doser av CK-MB i PBS inneholdende 10 g/liter BSA som representerer enzymaktivitet fra 32 til 256 U/liter. Etter en inkubering over natten ved 4°C ble de Conan-MB-belagte perlene pelletisert og vasket. Enzymaktiviteten som ble adsorbert på perlene ble målt som A34Q etter 30 minutters inkubering med CK-reagens ved 37° C, og enzymaktiviteten tilbake i supernatantene ble målt ved kinetisk CK-analyse, også ved 37°C. Omfanget av enzymaktiviteten på perlene øket med økende mengde immobilisert Conan-MB inntil et platå nåes ved 2 pg Conan-MB. Mer enn 90$ CK-MB kunne være bundet ved hver aktivitet av enzymet som ble undersøkt. Tilsvarende konklusjoner kunne trekkes ved undersøkelse av enzymaktiviteten som var igjen i supernatanten. Det er foretrukket å anvende 2.5 pg Conan-MB i analysen.

Når CK-MB ble tilsatt til normalt serum, blir en mindre prosentandel av enzymaktivitet adsorbert av immobilisert Conan-MB etter inkubering over natten ved 4°C. Denne effekten fant sted selv ved høye doser antistoff (opp til 16 pg), men syntes å bli minimalisert ved økende fortynning av serum. Det er derfor foretrukket å fortynne 100 pl serum til et volum på 1000 pl med analysebuf fer. Standarder og kont-rollprøver ble blandet med 100 pl varme-inaktivert serum og deretter fortynnet til 1000 pl med analysebuffer. Disse betingelsene tillot ca. 70$ CK-MB i standardene å binde alle dosene undersøkt. Utvinningen av CK-MB ble vurdert ved å tilsette 10.2 U/liter eller 77.9 U/liter til en serumprøve som innledningsvis ble analysert til å være 21.7 U/liter. Utvinningen var henholdsvis 106.9$ og 94.1$.

Virkningene av temperatur og tid på immunoadsorpsjonstrinnet ble også vurdert. Aktiviteten for CK-MB var konstant i 24 timer ved både romtemperatur og 4°C, som bestemt i supernatantene fra inkubering med kontrollperler (belagt med muse-IgG). Ved 37°C avtok aktiviteten gradvis etter 30 minutters inkubering med kontrollperlene. CK-MB-aktivitet var maksi-malt bundet til de Conan-MB-belagte perlene etter 30 minutter ved romtemperatur eller 2 timer ved 4°C. Etter disse tidene var det en liten reduksjon i bundet CK-MB ved 4°C, men en gradvis økning ved romtemperatur. Disse endringene var forbundet med proporsjonale økninger i CK-MB i supernatantene, dette tyder på dissosiering av CK-MB fra det monoklonale antistoffet eller dissosiering av CK-MB-antistoffkomplekset fra lateksperlene. Det er foretrukket å inkubere prøver med Conan-MB-belagte perler i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av øyeblikkelig nedkjøling i et isvannbad for å minimalisere frigivelsen av CK-MB under de etterfølgende vasketrinnene.

Etter vasking og resuspensjon av perlene ved 4°C, initieres det andre trinnet av analysen ved tilsetning av CK-reagensen og overføring av rørene til et vannbad ved 37°C. Volumet og tiden for inkubering ble innstilt slik at man fikk Å340 på 1.3 for standarder med høyt innhold (~125 U/liter) og A340 på 0.16 for en standard inneholdende 15 U/liter CK-MB, hvilket er den ventede øvre referansegrensen for normale forsøksob-jekter. Økningen i A340 var lineær for konsentrasjoner av standarder undersøkt i løpet av inkuberingen på 30 minutter. Betingelsene for det andre trinnet kan endres ved å øke eller redusere sensitiviteten for analysen.

En liten mengde (1 mmol/liter) av 2-merkaptoetanol ble tilsatt til analyseblandingen for å øke den enzymatiske aktiviteten og opprettholde stabiliteten. Tilsetningen av 10 mmol/liter fremmer også aktiviteten, men synes å øke dissosieringen av oppfanget enzym fra immobilisert Conan-MB.

Innvirkningen av potensielt interfererende stoffer ble vurdert. Under de foretrukne analysebetingelsene ble det funnet at serum ikke påvirket resultatene, selv ved tilstede-værelse ved opp til 80$ av det innledende analysevolumet. Disse resultatene, utført med en inkubering i 30 minutter ved romtemperatur, var forskjellige fra de funnet med inkubering over natten ved 4"C (se ovenfor). Varme-inaktivert serum ble benyttet som en matriks for fortynninger og standarder, idet den tilsynelatende dissosieringen av CK-MB fra lateksperlene var større når serum var tilstede enn når bare buffer var tilstede. Tilsetningen av lyserte røde blodceller som en kilde for adenylatkinase påvirket ikke resultatene selv når hemoglobinet (som en fastsetning av hemolyse) var så høyt som 246 g/liter. Se figur 3. Tilsetningen av opp til 200.000 U/liter av CK-MM eller 250.000 U/liter CK-BB forårsaket bare en ikke-spesifikk effekt. Med slike høye mengder av tilsatt enzym var det bare en gjenværende enzymatisk aktivitet som ikke ble fjernet ved to vaskinger av lateksperlene. Når analysen ble utført med kontrollperler og den lave gjenværende enzymaktiviteten, for eksempel 36 U/liter for 200.000 U/liter CK-MM, var trukket fra, ble det ikke funnet noen innvirkning av CK-BB eller CK-MM. Se figur 3. Disse resultatene ble bekreftet ved gjentatte interferens-undersøkelser ved anvendelse av fire vaskinger av lateksperlene. Ingen innvirkning på grunn av mitokondrisk CK ble funnet.

CV innen analysen (n = 10) ble bestemt to ganger og funnet å være 5.3$ og 9.5$ for en serumsamling med lavt innhold (13.0 U/llter); ble bestemt to ganger og funnet å være 3.2$ og 1.2$ for en serumsamling med høyt innhold (105.1 U/liter). CV-mellomanalysen var 13.2$ for kalibrator 4 (12.8 U/liter) (11 forskjellige dager); 18.7$ for serumsamlingen med lavt innhold (11 analyser) og 4.5$ for serumsaml ingen med høyt Innhold (11 analyser).

Resultatene med den direkte analysen for CK-MB ifølge foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet med to-sete-immunoanalysen anvendt ved Barnes Hospital Clinical Laboratories. Se figur 4. Korrelasjonen var 0.997 og stigningen 0.915, dette indikerer sammenlignbarhet mellom resultatene.

Eksempel 3

Direkte analyse på makroperler

En direkte analyse svarende til den angitt i eksempel 2 ovenfor kan også gjennomføres på makroperler av diameter ca. 0.635 cm. Analysen utføres som følger: Flerbrønns reaksjonsbrett, som for eksempel de som er tilgjengelige fra Abbott Laboratories, benyttes for analysen, og 10/pl av 0.2 M p<->merkaptoetanol pipetteres inn i hver brønn. 100 pl prøver av standarder eller forsøksmaterialer benyttes, fortynninger utføres, om nødvendig, i varme-inaktivert serumsamling (EISP). EISP fremstilles ved å oppvarme overskuddet av serum i 30 minutter ved 56°C, og deretter lagre det inkuberte serumet ved -70°C i porsjoner på 50 ml. Standarder fremstilles ved å anvende serie-fortynninger fra den høyeste konsentrasjonsstandarden (S4), som er 10 pl forråds-CK-MB (ca. 62.000 U/liter) i 5 ml EISP og undersøke aktiviteten kinetisk på "Flexigem", som beskrevet I eksempel 2. En standardkurve fremstilles ved å anvende fortynninger av denne standarden (S4), hvorved for en bestemt verdi av S4 på 108 U/liter, S3 inneholder 36 U/liter, S2 inneholder 12 U/liter, og Sl inneholder 4 U/liter. SO er blindprøve. Standardoppløsnlngene er.stabile i 1 uke når de lagres ved 4°C eller i minst 3 måneder når de lagres ved -70°C.

En Conan-MB-perle tilsettes deretter til hver brønn. Perlene fremstilles som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at det i stedet for lateks-mikroperler anvendes polystyren-perler på 0,635 cm med speilblank sluttbehandling. Perlene renses før tilsats til brønnene i 50 mM tris, pE 7.5.

Brønnene inkuberes deretter i 1 time ved romtemperatur på en plattf ormrister ved ca. 150 opm og vaskes deretter på en automatisert vaskeinnretning som "Proquantum" (Abbott Laboratories) ved anvendelse av 10 ml vann per brønn. Hver perle overføres deretter til et separat rør, hvortil det tilsettes 300 pl CK-reagens, som tilsvarer den i eksempel 2, men uten tilsetning av sulfhydrylaktivator som 2-merkaptoetanol.

Rørene inneholdende de individuelle perlene inkuberes ved 37°C i 45 minutter før reaksjonen stoppes ved tilsetning av 1 ml farge-stoppereagens som inneholder 100 mM tris, pH 7.5, 5 mM 1,2-diaminocykloheksan-N,N,N',N'-tetraedikksyre (DCTA), 0.1 mg/ml R-jodonitrotetrazolium-fiolett (INT), og 1 U/ml diaforase. Disse reagensene er kommersielt tilgjengelige og ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co.

Etter at reaksjonen er stoppet fjernes rørene fra vannbadet, og absorbansen avledes ved 492 nm etter 5 minutter.

Resultatene viste god korrelasjon med CK-MB-konsentrasjon bestemt ved to-sete-immunoanalysen anvendt ved Barnes Hospital Clinical Laboratories. Korrelasjonen var 0.978 og stigningen 0.800 funnet ved sammenligning av 639 prøver, hvilket indikerer sammenlignbarhet av resultatene.

Claims (7)

1. Preparat for anvendelse in vitro innbefattende monoklonalt antistoff eller immunologisk reaktivt derivat derav, karakterisert ved at antistoffet eller derivatet er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM- eller CK-BB-isoenzymer.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller derivatet er kryss-reaktivt med Conan-MB.

3. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller derivatet er Conan-MB eller et derivat derav.

4. Cellelinje, karakterisert ved at den produserer et antistoff som er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM- eller CK-BB-isoenzymer, og som utgjøres av ATCC HB 8939.

5. Anvendelse av preparatet ifølge krav 1 for bestemmelse av CK-MB-isoenzym i en prøve, hvor prøven bringes i kontakt med preparatet for å bevirke en immunoreaksjon mellom CK-MB i prøven og antistoffet eller derivatet derav i preparatet, og separering av de immunoomsatte komponentene fra resten av prøven.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor det utføres inkubering av prøven med en bærer i fast fase hvortil det nevnte antistoff eller derivat derav er bundet; bæreren fjernes fra kontakt med prøven; og mengden av CK-MB bundet til bæreren, måles med en CK-reagens.

7. Anvendelse av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB eller et immunologisk reaktivt derivat derav for å rense CK-MB fra en blanding, hvorved blandingen bringes i kontakt med antistoffet eller derivatet.