NO169866B

NO169866B - PREPARATION AND ITS APPLICATION FOR CK-MB ISOENZYM DETERMINATION ANTIBODY PRODUCING CELL LINE AND ITS USE

Info

Publication number: NO169866B
Application number: NO872917A
Authority: NO
Inventors: Jack H Ladenson; Hemant C Vaidya; David N Dietzler; Ann Yvonne Maynard
Original assignee: Univ Washington
Priority date: 1985-11-14
Filing date: 1987-07-13
Publication date: 1992-05-04
Also published as: NO169866C; NO872917D0; NO872917L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et preparat for anvendelse in vitro omfattende monoklonalt antistoff eller immunologisk reaktivt derivat derav. The present invention relates to a preparation for use in vitro comprising monoclonal antibody or immunologically reactive derivative thereof.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av dette preparat for bestemmelse av CK-MB-isoenzym i en prøve. The invention also relates to the use of this preparation for the determination of CK-MB isoenzyme in a sample.

Oppfinnelsen angår videre en antistoffproduserende cellelinje og anvendelsen av et monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB eller et immunologisk reaktivt derivat derav. The invention further relates to an antibody-producing cell line and the use of a monoclonal antibody that is specific for CK-MB or an immunologically reactive derivative thereof.

Enzymet kreatin-kinase (CK; EC 2.7.3.2) katalyserer den reversible fosforyleringen av kreatin hvori adenosin-5'-trifosfat (ATP) tjener som donor: The enzyme creatine kinase (CK; EC 2.7.3.2) catalyzes the reversible phosphorylation of creatine in which adenosine-5'-triphosphate (ATP) serves as the donor:

Reaksjonen i foroverretning hvori ATP omvandles til adenosin-5'-difosfat (ADP) fremmes ved pH ca. 9, mens den reverse reaksjonen fremmes ved pH ca. 7. Den biologiske funksjonen av CK er lagring av høyenergi-kreatin-fosfat i cellen, og store mengder av enzymet er til stede i skjelettmuskler. The forward reaction in which ATP is converted to adenosine-5'-diphosphate (ADP) is promoted at pH approx. 9, while the reverse reaction is promoted at pH approx. 7. The biological function of CK is the storage of high-energy creatine phosphate in the cell, and large amounts of the enzyme are present in skeletal muscle.

Kjemisk er CK en dimer bestående av to molekylære underenheter betegnet som M- og B-underenhetene, som kombineres slik at det oppstår tre isoenzymer: CK-BB, CK-MB og CK-MM. De tre isoenzymene er anbragt i cytoplasma og hver har en molekylvekt på ca. 82.000 dalton. Disse isoenzymene kan separareres ved agarosegel elektroforese, hvorved CK-BB-isoenzymet migrerer lengst mot anoden, mens CK-MM-isoenzymet migrerer mot katoden og CK-MB-isoenzymet migrerer mellom de to. Chemically, CK is a dimer consisting of two molecular subunits designated as the M and B subunits, which combine to form three isoenzymes: CK-BB, CK-MB and CK-MM. The three isoenzymes are located in the cytoplasm and each has a molecular weight of approx. 82,000 daltons. These isoenzymes can be separated by agarose gel electrophoresis, whereby the CK-BB isoenzyme migrates furthest towards the anode, while the CK-MM isoenzyme migrates towards the cathode and the CK-MB isoenzyme migrates between the two.

CK i serum hos et normalt voksent menneske består hovedsaklig av CK-MM-isoenzymet med bare spormengder av CK-MB. CK-BB-isoenzymet er normalt ikke tilstede i serumet innenfor deteksjonsgrensene for de fleste CK-analyser. Deteksjon av betydelige mengder CK-MB i serum er normalt en indikasjon på akutt myokardialt infarkt (AMI). Imidlertid er CK-MB også funnet i serumet hos pasienter med andre sykdomstilstander enn AMI. Derfor må CK-MB-isoenzym-analysen tolkes omhyggelig av medisinere. Ikke desto mindre er de fleste nåværende analysefremgangsmåter rettet mot kvantifisering av CK-MB ved CK in the serum of a normal adult consists mainly of the CK-MM isoenzyme with only trace amounts of CK-MB. The CK-BB isoenzyme is normally not present in the serum within the detection limits of most CK assays. Detection of significant amounts of CK-MB in serum is normally an indication of acute myocardial infarction (AMI). However, CK-MB is also found in the serum of patients with disease states other than AMI. Therefore, the CK-MB isoenzyme assay must be interpreted carefully by physicians. Nevertheless, most current assay methods are aimed at quantification of CK-MB by

AMI. AMI.

Forskjellige fremgangsmåter har hittil vært utviklet for analysen av CK, innbefattende spektrofotometriske, kolori-metriske, fluorimetriske og koblede enzymatiske fremgangsmåter . Various methods have so far been developed for the analysis of CK, including spectrophotometric, colorimetric, fluorimetric and coupled enzymatic methods.

I et typisk koblet enzymsystem katalyseres reaksjonen mellom kreatin og ATP innledningsvis ved hjelp av CK, slik at det dannes kreatinfosfat og ADP. Denne reaksjonen kobles deretter til to andre enzymreaksjoner som anvender fosfoenol-pyruvat, redusert nikotinamidadenindinukleotid (NADH) og enzymene pyruvinkinase og laktatdehydrogenase. Disse reaksjonene fører endelig til oksydasjonen av NADH, som følges spektrofotometrisk ved 340 nm. Denne fremgangsmåten er hovedsakelig utviklet av Tanzer og Gilvarg, "J Biol Chem" In a typical linked enzyme system, the reaction between creatine and ATP is initially catalyzed by CK, so that creatine phosphate and ADP are formed. This reaction is then coupled to two other enzyme reactions that use phosphoenol pyruvate, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase. These reactions finally lead to the oxidation of NADH, which is monitored spectrophotometrically at 340 nm. This method was mainly developed by Tanzer and Gilvarg, "J Biol Chem"

(1959) 234:3201-4, og modifikasjoner er beskrevet i US-PS 3,403,077. (1959) 234:3201-4, and modifications are described in US-PS 3,403,077.

En annen koblet enzymfremgangsmåte er basert på den reverse reaksjonen, hvori kreatln-fosfat og ADP-substrater reagerer i nærvær av CK, slik at det dannes kreatin og ATP. ATP som genereres tjener i en hjelpereaksjon til å fosforylere glukose i nærvær av heksokinase (HK). Det resulterende glukose-6-fosfatet (G-6-P) blir deretter et substrat for den endelige indikatorreaksjonen som katalyseres av glukose-6-fosfat-dehydrogenaset (G-6-PDH) i nærvær av nikotinamid-adenindinukleotidfosfat (NADP) slik at det dannes 6-fosfo-glykonat og NADPH. Produksjonen av NADPH følges spektrofotometrisk ved 340 nm. Dette koblede enzymsystemet kan vises ved følgende serieavligninger: Another coupled enzyme method is based on the reverse reaction, in which creatine phosphate and ADP substrates react in the presence of CK to form creatine and ATP. The ATP generated serves in an auxiliary reaction to phosphorylate glucose in the presence of hexokinase (HK). The resulting glucose-6-phosphate (G-6-P) then becomes a substrate for the final indicator reaction catalyzed by the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) such that 6-phosphoglyconate and NADPH are formed. The production of NADPH is monitored spectrophotometrically at 340 nm. This coupled enzyme system can be shown by the following series equations:

Det sistnevnte koblede enzymsystemet, først beskrevet av Nielsen og Ludvigsen og av Oliver, er forbedret av Rosalki, "J.Lab.Clin.Med." (1967) 69:696-705, og ytterligere modifikasjoner er beskrevet i US-PS 3,413,198, 3,485,724, 3,540,984 og 3,994,783. The latter coupled enzyme system, first described by Nielsen and Ludvigsen and by Oliver, has been improved by Rosalki, "J.Lab.Clin.Med." (1967) 69:696-705, and further modifications are described in US-PS 3,413,198, 3,485,724, 3,540,984 and 3,994,783.

Alternativt kan NADP og G-6-PDH i reaksjon 3 ovenfor, erstattes med NAD og et G-6-PDH-enzym som er spesifikt for dette, slik at det dannes NADH som på tilsvarende måte kan måles spektrofotometrisk. Nærværet av NADH kan også detekteres ved hjelp av andre fremgangsmåter. Følgelig kan substratoppløsningen innbefatte et fargestoff som kan reduseres av NADH, derved tillates anvendelsen av kolorimet-riske fremgangsmåter. Alternatively, NADP and G-6-PDH in reaction 3 above can be replaced with NAD and a G-6-PDH enzyme that is specific for this, so that NADH is formed which can be measured spectrophotometrically in a similar way. The presence of NADH can also be detected using other methods. Accordingly, the substrate solution may include a dye that can be reduced by NADH, thereby allowing the use of colorimetric methods.

I en annen alternativ fremgangsmåte kan omsetningene 2 og 3 ovenfor utelates og kreatinet i reaksjon 1 kan omsettes med cx-naftol og diacetyl slik at det dannes et rosafarget kompleks. In another alternative method, reactions 2 and 3 above can be omitted and the creatine in reaction 1 can be reacted with cx-naphthol and diacetyl so that a pink colored complex is formed.

De fleste vanlige analysefremgangsmåter for CK-MB består av måling av den enzymatiske aktiviteten for CK-MB etter separasjon fra andre CK-isoenzymer på basis av forskjeller i ladning ved anvendelse av elektroforese eller ione-veksling, eller ved immunoinhibering eller en kombinasjon av immunoinhibering og immunoutfelling. Alternativt er massen av CK-MB målt ved hjelp av immunoanalyse, enten ved anvendelse av et antistoff for analysen av B-underenheter (CK-MB pluss CK-BB) eller to-sete-antistoffteknikker. I to-sete-antistoff-teknikkene knyttes et antistoff, for eksempel til B-underenheten til en fast fase for å ekstrahere isoenzymene inneholdende denne underenheten og, etter vasking, tilsettes et merket (enzym eller <*25>j) antistoff til den andre, i dette tilfelle M, underenheten. ;I et nylig utviklet, typisk eksempel på fast-fase to-sete-antistof f teknikken for analyse av CK-MB (som "Enzygnost" immunoanalysen fremstilt av Cal Biochem-Boehring, La Jolla, California), tilsettes serum til rør som er belagt med antistoffer spesifikke for CK-B-underenheten slik at de binder CK-MB, CK-BB, og makro-CK-1 (CK-BB forbundet med immunoglobulin). Etter et vasketrinn som fjerner CK-MM-isoenzymet og alle andre enzymer som ikke inneholder en CK-B-underenhet, tilsettes et andre antistoff (som er spesifikt for CK-M-underenheten og merket med pepperrot-peroksidase-enzym), derved merkes bare det CK-MB som forblir i analyserøret. Subtratet, ureaperoksid, tilsettes deretter. Konsentrasjonen av det genererte fargeproduktet relateres deretter med konsentrasjonen av CK-MB i prøven. ;De senest beskrevne fremgangsmåtene for kvantitativ måling av mengden av CK-MB i sera er følgelig de som er basert på en immunologisk tilnærming. Se for eksempel US-PS 4,260,678, 4,353,982 og 4,387,160. Monoklonale antistoffer (til forskjell fra polyklonale antistoffer) til B- og M-under-hetene av CK er også utviklet for slike analyser, og er beskrevet, for eksempel, av Wurzburg og Strobel, "J. Cl in. Chem. Clin. Biochem." (1981) 19:543-544; Morris og Head, "FEBS Lett." (1982) 145:163-168; Morris og Head, "Biochem. J." (1983), 213:417-425; Jackson et al, Ibid. (1983) 215:505-512. Analyser for CK-MB ved anvendelser av slike antistoffer er videre utviklet og rapportert av Jackson et al, "Clin. Chem." (1984) 30:1157-1162; Sheedan og Haythorn, Ibid (1985) 31:160-161; Chan et al, Ibid (1985) 31:465-469; McBride et al, Ibid (1985) 31;1099-1100. ;De tidligere analysene har varierende grader av følsomhet overfor de andre to isoenzymene av CK, nemlig CK-MM og CK-BB. I tillegg har det også opptrådt interferens av adenylatkinase (når CK-aktivitet måles), av makro-CK-1 (CK forbundet med immunoglobulin) og av makro-CK-2 (mitokondrisk CK). Videre er interferens på grunn av ikke-spesifikk binding et hyppig problem ved to-sete-analyser (Boscato, L.M. et al., "Clin. Chem." (1986) 32:1491-1495). ;Oppfinnelsen tilveiebringer forbedrede fremgangsmåter og materialer for bestemmelsen av CK-MB-isoenzym i serum og andre biologiske fluider. Disse fremgangsmåtene anvender et monoklonalt antistoff, eller derivater derav, som gjenkjenner bare CK-MB og ikke de andre isoenzymene. Anvendelse av dette antistoffet tillater direkte spesifikk måling av isoenzymet i serum og andre biologiske fluider, på grunnlag av dets enzymatiske aktivitet i en analyse i fast fase. Følgelig anvendes denne klassen av antistoff, hvorav ett element betegnes Conan-MB, til å ekstrahere CK-MB-isoenzymer fra serum og andre biologiske fluider. CK-MB i den biologiske prøven kan deretter bestemmes ved å eksponere det adsorberte CK-MB-isoenzymet mot et CK-reagenssystem og måle den kataly-tiske aktiviteten, eller kan detekteres ved andre fremgangsmåter. For eksempel kan enzymaktiviteten ved katalysering av ATP/ADP-omvandl ingen bestemmes ved å overvåke absorbans-endringen ved 340 nm forårsaket av NADH eller NADPH, eller reaksjonen kan være forbundet med en annen kjent reaksjon som kan følges spektrofotometrisk. I representative eksempler anvendes denne fremgangsmåten ved anvendelse av det Conan-MB-monoklonale antistoffet belagt på latekspartikler. Denne fremgangsmåteutgaven viste ingen interferens og ga utmerket overensstemmelse med en kommersielt tilgjengelig, fast fase, to-sete enzym-immunoanalyse. Andre fremgangsmåtevarianter hvori det MB-spesifikke antistoffet er nyttig kan naturligvis også anvendes. ;Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen et preparat for anvendelse in vitro innbefattende et monoklonalt antistoff eller et immunologisk reaktivt derivat derav, og dette preparat karakteriseres ved at antistoffet eller derivatet er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM-eller CK-BB-isoenzymer. ;Oppfinnelsen angår som innledningsvis nevnt også anvendelsen av preparatet som beskrevet idet foregående avsnitt for bestemmelse av CK-MB-isoenzym i en prøve, hvor prøven bringes i kontakt med preparatet for å bevirke en immunoreaksjon mellom CK-MB i prøven og antistoffet eller derivatet derav i preparatet, og separering av de immunoomsatte komponentene fra resten av prøven. ;Oppfinnelsen angår videre en cellelinje som karakteriseres ved at den produserer et antistoff som er immunologisk reaktivt med CK-MB-isoenzym, men ikke med CK-MM- eller CK-BB-isoenzymer, og som utgjøres av ATCC HB 8939. ;Til slutt angår oppfinnelsen som antydet innledningsvis, et monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB eller et immunologisk reaktivt derivat derav for å rense CK-MB fra en blanding, hvorved blandingen bringes i kontakt med antistoffet eller derivatet. ;En spesiell utførelse av de MB-spesifikke monoklonale antistoffpreparatene er betegnet Conan-MB, og hybridom-cellelinjen som produserer det Conan-MB-monoklonale antistoffet er deponert ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under aksesjonsnummer ATCC HB 8939 den 6. november 1985. ;Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser spesifisiteten av Conan-MB-monoklonalt antistoff som bestemt ved kompetitiv RIA. Immobilisert monoklonalt antistoff Conan-MB ble eksponert mot forskjellige konsentrasjoner av CK-MM (X), CK- ;BB (0), nativt CK-MB (.), og hybrid CK-MB (A) sammen med 100.000 cpm av 125I CK-MB. Tellingene for 125I CK-MB bundet til Conan-MB som en prosent av tellingene bundet uten kompetitor til stede er avsatt mot logaritmen av tilsatt kompetitor (jjg/1). Figur 2 er en grafisk fremstilling som viser beleggingen av lateksperler med monoklonalt antistoff Conan-MB ifølge en utførelse av oppfinnelsen. Conan-MB Immobilisert på 0,8 pm lateksperler (5g/liter) etter inkubering over natten ved 4°C er avsatt mot økende konsentrasjoner av antistoff. Figur 3 er en grafisk fremstilling som viser innvirkningen av CK-MM, CK-BB, mitokondrisk CK og hemolyse på den direkte analysen av CK-MB ifølge en utførelse av oppfinnelsen. Kontroll CK-MB-verdien var 62 U/l av renset humant CK-MB. Eemolysatet ble fremstilt ved å nedfryse vaskede humane røde celler lagret mindre enn 24 timer. Renset CK-MM, CK-BB og mitokondrisk CK ble benyttet. Verdiene i nærvær av de høyere mengdene av isoenzymer er korrigert for en liten gjenværende aktivitet tilstede etter to vaskinger av lateksperlene. Denne rest-aktiviteten ble bestemt ved å anvende kontrollperler for analysen og var 35,9 U/l for 200.000 U/l av CK-MM og 25.0 U/l for 250.000 U/l av CK-BB. Figur 4 er en grafisk fremstilling som viser sammenligningen av CK-MB-aktivitet (U/l) bestemt ved direkte analyse i en utførelse av oppfinnelsen og CK-MB-konsentrasjonen bestemt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig to-sete-immunoanalyse (jig/l). Femti prøver ble målt ved begge analyser. Den lineære regresjonen var Y = 0,915 X +0.35 med en korrela-sjonskoeffisient på 0.997. ;A. Definisjoner ;Slik betegnelsen her benyttes viser "immunologisk reaktiv med" til typiske antistoff-antigen-reaksjoner som bevirkes ved spesifisiteten av det variable området av immunoglobuli-ner til spesifikke epitoper. ;"Immunologisk reaktivt derivat" av et antistoff refererer til deler av antistoffet som bevarer evnen til å gjenkjenne epitopene som ordinært gjenkjennes av antistoffer hvorav de er avledet. Slike derivater innbefatter vanligvis, for eksempel, Fab, Fab' og F(ab')2 fragmenter av immunoglobulin-er. Fremstilling av slike immunologisk reaktive derivater er velkjent innen teknikken, og gir ofte fordeler når antistoffene skal benyttes in vivo, eller når de funksjonelle virkningene av det samlede immunoglobulin-molekylet ikke er ønskede. ;"Kryss-reaktiv med" ved beskrivelse av egenskapene for et immunoglobulin eller dets derivat refererer til evnen til å gjenkjenne den samme epitopen som finnes hos det angitte antistoffet eller derivatet. Denne evnen kan gjenkjennes ved å vurdere evnen av det kryssreagerende materialet til å blokkere den immunologiske reaksjonen av det angitte immunoglobulinet. ;Slik størrelsen her benyttes er en aktivitet-enhet (U) definert som et mikromol ATP dannet pr. minutt ved 37°C. ;"Cellelinje" refererer til en udødeliggjort celle, cellekul-tur, et større antall identiske celler, og deres etterkom-mere. Det er kjent at avkommet, og noen av medlemmene av den "identiske" samlingen ikke nødvendigvis er absolutt identiske med den opprinnelige cellen hvorfra linjen er avledet, men kan adskille seg fra hverandre i genetisk oppbygning på grunn av tilfeldige mutasjoner. Dette muterte avkommet er imidlertid innbefattet innenfor definisjonen så lenge som de vesentlige egenskapene for cellelinjen bevares. ;"Spesifikk for CK-MB-isoenzymet" refererer til evnen av et ;antistoff eller derivat til å reagere immunologisk med CK-MB, med utelukkelse av CK-BB eller CK-MM. ;Betegnelsen "Conan-MB" refererer spesifikt til antistoffet utskilt av ATCC HB-8939 og denne spesielle cellelinjen. Følgelig benyttes "Conan-MB" til å betegne både cellelinjen og dens produkt. Betegnelsen "Conan-type MB" refererer til antistoffer som konkurrerer med Conan-MB i reaksjon med CK-MB og cellelinjene som utskiller disse. Betegnelsen "MB-spesifikke antistoffer" refererer til et hvilket som helst monoklonalt antistoff som er spesifikt for CK-MB, enten det gjenkjenner den samme epitopen som Conan-MB eller ikke. ;Følgelig er det tre nivåer av likhet med antistoffene som utskilles av den deponerte cellelinjen. Antistoffene som utskilles av cellelinjen per se, Conan-MB, kryssreagerer med "Conan-type MB"-monoklonale antistoffer siden begge konkurrerer om den samme eller en tilsvarende epitop. Den generelle klassen av MB-spesifikke monoklonale antistoffpreparater reagerer med CK-MB under utelukkelse av CK-BB eller CK-MM, og disse sistnevnte isoenzymene konkurrerer ikke med CK-MB om immunoreaksjoner med MB-spesifikke monoklonale antistoffer; imidlertid konkurrerer eller kryss-reagerer ikke alle medlemmer av den generelle klassen av MB-spesifikke monoklonale antistoffer med Conan-MB. Noen kan gjenkjenne forskjellige epitoper på CK-MB-isoenzymet som Conan-MB selv, selv om epitopene er unike for CK-MB I motsetning til CK-BB eller CK-MM. ;"CK-reagens" betyr, slik betegnelsen her benyttes, en samling av komponenter som kan anvendes for å måle den enzymatiske aktiviteten av kreatin-kinasen. Kreatin-kinase er enzymatisk aktiv i alle dens tre isoenzymformer og katalyserer den gjensidige omvandlingen av kreatinfosfat-og-ADP med kreatin-og-ATP, som angitt ovenfor. Reagensen vil følgelig inneholde de egnede reaktantene for gjennomføringen ;av denne reaksjonen, pluss reagenser for å produsere et detekterbart resultat fra produktene. ;I eksempel 2 er, for eksempel, "CK-reagensen" en kommersielt tilgjengelig reagensblanding inneholdende AMP, ADP, kreatin-fosfat, NAD, gjær HK, og G-6-PDH og forskjellige bufrende og stabiliserende komponenter. Denne blandingen markedsføres av Electro-Nucleonics, Inc. under betegnelsen "Gemini C^LTS"-reagens. ;I eksempel 3 er "CK-reagensen" en 30:1 blanding av en "substrat" oppløsning inneholdende 20.92 g/liter Bis-Tris, 1.010 g/liter ADP, 2.14 g/liter Mg(oAc)2, 3.60 g/liter D-glukose, 2.00 g/liter NAD, 1.85 g/liter AMP, 0.95 g/liter EGTA, 2500 U/liter HK og 1650 U/liter G-6-PDH, og en "kicker" oppløsning inneholdende 2.092 g/liter Bis-Tris og 332.8 g/liter kreatin-fosfat. ;B. Produksjon av MB- spesifikke antistoffer. ;Generelt kan de MB-spesifikke antistoffene fremstilles ved en spesifikk fremgangsmåte som innbefatter immunisering av et egnet pattedyr med renset CK-MB, slik at det oppnås anti-MB-utskillende celler fra de perifere blodlymfocyttene eller milten av det immuniserte dyret ved et tidspunkt når antistoff titerne i serumet er høye, immortalisering av disse antistoffutskillende cellene, og deretter undersøkelse av de immortaliserte cellene vedrørende produksjonen av de ønskede antistoffene. Undersøkelsesfremgangsmåten er av den aller største betydning, og innbefatter immunoreaksjoner med renset CK-MB og verifisering av en mangel på kryss-reaktivitet for antistoffene med renset CK-BB og CK-MM. ;Det er viktig for vellykket fremstilling av MB-spesifikt antistoffutskillende cellelinjer å anvende et renset CK-MB-isoenzym som immunogenet i den innledende immuniseringen. Enzymet kan være renset for human skjelett- og hjertemuskel som beskrevet av Leykam, Dietzler, og Ladenson, "Clin. Chem." (1983) 29:1219 (Abstract 413-A), og av Vaidya, Dietzler, Leykam og Ladenson, "Biochlm. Biophys. Acta" (1984) 790:230237. Denne rensefremgangsmåten anvender vevshomogeni-sering, ammoniumsulfat fraksjonering, ioneveksling kromatografi som med DEAE-"Sepharose", etterfulgt av affinitetskromatografi og kromatofokusering. Variasjoner av denne omtalte fremgangsmåten kan også anvendes. ;I affinitetskromatografi er for eksempel et stoff spesifikt og reversibelt adsorbert av et komplementært bindende stoff (ligand) immobilisert på en uoppløselig bærer (matriks). En rekke matrikser og ligander kan benyttes. Foretrukne affinitetskromatografi materiale er "Affi-Gel Blue", som er en agarose med reaktivt blått fargestoff, kommersielt tilgjengelig fra Bio-Rad, Richmond, California, og 5'-AMP-"Sepharose" som fremstilles ved å koble N^(6-aminohexyl-) 5'-AMP til "Sepharose" (agarose), kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige. ;En spesielt foretrukket fremgangsmåte for rensing av CK-MB er muliggjort ved tilgjengeligheten av Conan-MB utskilt av hybridomen ATCC EB-8939 eller andre MB-spesifikke antistoffer ifølge oppfinnelsen. Fordi disse antistoffene er så sterkt spesifikke for det ønskede isoenzymet, danner de egnede ligander for affinitetskromatografi i fremgangsmåter for å rense dette materialet. Antistoffet kan konjugeres til en hvilken som helst egnet matriks, innbefattende "Sepharose", lateks, agarose, eller polyakrylamid. Fremgangsmåte for Immobilisering av antistoffer til faste bærere er naturligvis tallrike og velkjente Innen teknikken. ;Ved kromatofokuseringsfremgangsmåten elueres proteiner som skarpt fokuserte, vel separerte soner i en lineær pH-gradient avhengig av deres isoelektrlske punkt. Proteinene migrerer, etter innledende binding ved toppen av kolonnen til en polybuffer-utvekslingsharpiks, nedover etterhvert som pH-gradienten utvikler seg. Hastigheten for bevegelse til et spesielt nivå i pH-gradienten ned kolonnen er lavere enn hastigheten for strømning av polybufferen. Etterfølgende proteiner føres nedover og når området hvor de bindes til kolonnen og derved opprettholder en trangsonebredde. Ytterligere informasjon vedrørende kromatofokusering kan finnes under henvisning til fabrikantens skriv "Cromato-focusing with "Polybuffer" and "PBE"", Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige, 1982; Richey og Beadling, "Amer. Lab." 13, Oktober 1981, side 100-102; og Sluyterman, "Trends in Biochem. Sei." (1982) 7:168-170. ;Det rensede CK-MB-isoenzymet benyttes deretter som et immunogen for å fremstille celler som er i stand til å utskille MB-spesifikke antistoffer. Mus (eller andre egnede pattedyr) immuniseres ved injeksjon med det rensede CK-MB-isoenzymet inntil en høy titer av antistoffet er detekterbar i serumet. Et vel-immunisert objekt som derved er identifi-sert injiseres fortrinnsvis med ytterligere CK-MB. Etter et egnet tidsrom høstes miltcellene eller perifere blodlymfo-cytter, fortrinnsvis miltceller, og immortaliseres. ;En foretrukken musestamme for anvendelse ved immuniseringen er A/J-stammen som er tilgjengelig fra Jackson Laboratories, Bar Earbor, Maine. Dette er en velkjent musestamme som har genetiske egenskaper som definert i "Biological Handbooks III: Inbred and Genetically Defined Strains of Laboratory Animals", Del 1, Mus og Rotter, samlet og redigert av Altman og Katz, FASEB, Bethesda, Maryland, 1979, side 21. For ytterligere informasjon vedrørende A/J-stammen, se også Bangham, "Mouse News Lett." (1965) 33:68; Dickie, Ibid (1966) 34:30; og "Handbook of Genetically Standardized JAX Mice", Eeiniger og Dorey, redaktører, The Jackson Laboratory, Bar Earbor, Maine, 3. utgave, 1980, spesielt Del 2, side 1-32. ;Immortalisering kan bevirkes ved fusjon med et myelom som opprinnelig beskrevet av Kohler og Milstein, "Nature" (1975) 256:495-497; "Eur. J. Immunol" (1976) 6:511-519. Ifølge denne fremgangsmåten smeltes vevskulturtilpassede musemyelom-celler til miltceller fra immuniserte mus slik at man oppnår hybridcellene som produserer store mengder av enkelt anti-stoffmolekyl. Naturligvis kan andre immortaliseringsfrem-gangsmåter som er kjente innen teknikken, for eksempel infeksjon med Epstein-Barr virus, eller transfeksjon med viralt DNA, også benyttes. ;For fremgangsmåten ifølge Kohler og Milstein er en foretrukket musemyelom-cellelinje Sp2/0-Agl4-cellelinjen. Dette er en velkjent cellelinje av BALB/c-opphav, definert av Schulman, Wilde og Kohler, "Nature" (1978) 276:269-270. Disse cellene, som ikke syntetiserer immunoglobulin(lg)-kjeder, er tilgjengelige fra Basel Institute for Immunology, Basel, Sveits, og American Type Culture Collection, Rockville, Maryland under aksesjonsnr. ATCC CRL-1581. ;En foretrukket fremgangsmåte for utførelse av fusjonen av myelomcellene og miltcellene er ved den generelle fremgangsmåten beskrevet av Galfre et al, "Nature" (1977) 266:550-552. hvori polyetylen-glykol (PEG), for eksempel PEG 1500, benyttes som sammensmeltingsmiddelet for cellene som vokser i monolag. Immortaliserte celler kan selekteres ved kultiver-ing i HAT (hypoxanthine, aminopterin og thymidine) seleksjonsmedium som beskrevet for eksempel av Littlefield, "Science" (1964) 145:709. Valget av seleksjonsmedium avhenger naturligvis av naturen av immortaliseringsprosessen. Dersom immortalisering skjer ved fusjon, gir fusjonspartner-en, for eksempel myelomet, immortalitet på den antistoff-utskiIlende linjen og må ha mangelegenskaper som komple-menteres av den antistoff-utskillende partneren i forbindelse med seleksjonsmediet. ;De immortaliserte cellene må deretter undersøkes med henblikk på de som utskiller antistoff av den korrekte spesifisiteten. En kritisk viktig del av prosessen for fremstilling av de MB-spesif ikke antistoffene ifølge oppfinnelsen, er valget av en egnet undersøkelsesfremgangsmåte som vil resultere i identi-fikasjon av immortaliserte celler som utskiller antistoff av den korrekte spesifisiteten. ;Supernatantene fra de immortaliserte cellene undersøkes først for sekresjon av antistoffer som binder CK-MB. Dette kan utføres ved å anvende konvensjonelle immunoanalysefremgangs-måter som immunoanalyse. ;Konvensjonelle generelle RIA-fremgangsmåter ble opprinnelig beskrevet, for eksempel, av Yalow et al, "J. Clin. Invest.", 39: 1157 (1960); og fast-fase RIA ble først utviklet av Catt og Tregear, "Science" 158, 1570-1572 (1967). Siden poly-vinyl-overflater generelt sterkt vil adsorbere nanogram-mengder av de fleste proteiner, benyttes et immobilisert andre antistoff (antiserum) for å oppfange primært antistoff som i sin tur kan binde radiomerket antigen i en kompetitiv-type analyse. Som et eksempel kan RIA utføres ved å påføre supernatantene på flerbrønns mikrotiterplater som er belagt med, for eksempel, anti-mus antistoff, og deretter å detektere bundet antistoff ved anvendelse av merket, renset ;CK-MB. ;Gruppen av hybridomer eller andre celler som derved identi-fiseres som utskillende antistoffer som er i stand til binding av CK-MB, undersøkes deretter med henblikk på de som ikke bindes til CK-MM eller CK-BB. Dette kan gjøres ved en rekke fremgangsmåter, men den enkleste og foretrukne fremgangsmåten er en kompet!tiv analyse ved anvendelse av rensede monoklonale antistoffer fra supernatantene. De rensede preparatene påføres på mikrotiterbrønner belagt med anti-mus IgG og brønnene behandles med merket CK-MB i nærvær av varierende mengder konkurrerende CK-BB eller CK-MM. De cellelinjene som produserer antistoffer som fortsetter å binde CK-MB og derved motstår konkurransen av enten CK-MM eller CK-BB, selekteres deretter. ;Den foregående fremgangsmåten kan anvendes enten på de opprinnelige kultursupernatantene, eller kan anvende delvis renset kulturmedium eller ascites-fluid etter forsterkning av de kulturene som er vist å utskille antistoff reaktivt med CK-MB. Basert på erfaringen som her er beskrevet er hoveddelen av de CK-MB-reaktive antistoffene fremstilt ved den angitte fremgangsmåten spesifikke for dette isoenzymet og reagerer ikke med CK-MM og CK-BB; følgelig forekommer det lite spill ved forsterkningsfremgangsmåten, hvilket kan være tilfellet dersom hoveddelen av de immortaliserte cellelinjene ikke produserer antistoffer av den ønskede spesifisiteten. Et nyttig bekreftelsesforsøk for spesifisiteten til det ønskede isoenzymet utføres mer hensiktsmessig på delvis rensede antistoffer fra slike forsterkede supernatanter eller ascites-fluider. I denne fremgangsmåten merkes antistoffene som produseres ved anvendelse av, for eksempel, <125>j eller et annet merke og bringes i kontakt med elektroforese-geler inneholdende bånd svarende til de separerte Isoenzymene. Preparater hvori immunoglobulinene bindes utelukkende til det separerte isoenzymet CK-MB, men ikke til bånd tilsvarende CK-BB eller CK-MM, selekteres deretter. ;I fremgangsmåten som er illustrert nedenfor viste det seg at av 13 hybridomer som ble oppnådd som utskilte antistoffer mot CK-MB, produserte åtte antistoffer som var spesifikke for dette isoenzymet. ;For å øke antistoffproduksjonen kultiveres de immortaliserte cellene in vitro i kulturmedium eller, alternativt, injiseres i mus hvori de produserer ascites-tumorer som tillater vekst av cellene og generering av store mengder monoklonalt antistoff. ;Etter fremstilling kan det monoklonale antistoffet isoleres og renses fra vevskulturmediet eller ascites-fluidet ved forskjellige kjente fremgangsmåter som ammoniumsulfat-utfelling, dialyse, affinitetskromatografi, ionevekslings-kromatografi, ultrafiltrering, adsorpsjon med polyelektrolytt copolymeres og lignende fremgangsmåter for proteinseparasjon. Foretrukne fremgangsmåter anvender affinitetskromatografi på protein A-agarose kolonner, for eksempel protein A-"Sepharose", etterfulgt av dialyse eller ultrafiltrering. Protein A er et polypeptid (molekylvekt 42.000) isolert fra Staphylo-coccus aureus som binder lg molekylet uten Interaksjon med det antigen-bindende sete. Protein A-"Sepharose" er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige. ;Disse og andre egnede fremgangsmåter for isolering og rensing av monoklonale antistoffer er generelt beskrevet av Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, London og New York, 1983, og US-PS 4,533,496. ;C. Affinitetskromatografi ;De CK-MB-spesifikke monoklonale antistoffene fremstilt som beskrevet ovenfor er nyttige for affinitetsrensing av CK-MB fra biologiske fluider eller kulturmedia. Ved anvendelse av slike antistoffer i disse rensefremgangsmåtene benyttes affinitetskromatografI-teknikker som generelt er velkjente. I en typisk fremgangsmåte konjugeres de monoklonale antistoffene eller deres immunologisk reaktive fragmenter til en fast bærer som agarose, polyakrylamid, eller lateks ved standard sammenbindingsteknologi, som for eksempel anvendelse av bifunksjonelle forbindingsmidler eller ved direkte binding. Blandingen fra hvilken CK-MB-rensingen er ønsket føres deretter gjennom en kolonne eller et filter inneholdende det understøttede antistoffpreparatet ved anvendelse av betingelser hvorunder en immunologisk reaksjon finner sted mellom antistoffet og CK-MB. CK-MB elueres deretter ved å pålegge betingelser som dissosierer antigen-antistoffkomplekset selektivt. Slike betingelser innbefatter endring av pH, endring av temperatur, og kontroll av ionestyrken. ;D. Analyse med henblikk på CK- MB ;De CK-MB-spesifikke antistoffene i følge oppfinnelsen er spesielt nyttige som komponenter av en analyse for nærværet, fraværet eller mengden av CK-MB i biologiske eller andre prøver, innbefattende for eksempel analyse i serum som en indikasjon på myokardialt infarkt. Fremgangsmåter for analyser ved anvendelse av dette antistoffet varierer innenfor vide grenser, og kan anvende direkte måling av gjenvunnet CK-MB ved anvendelse av dette antistoffet, eller kan anvende kompetitive eller sandwich-analyseteknikker. ;Eksempler på egnede fremgangsmåter innbefatter følgende. ;I en spesielt nyttig serie av fremgangsmåter kan det benyttes kompetitive immunoanalyser hvori merket CK-MB konkurrerer med CK-MB som finnes i prøven om immobiliserte CK-MB-spesifikke antistoffer. Ved denne analysetypen plasseres de CK-MB-spesif ikke antistoffene, bundet til fast bærer som mikro-titerbrønner, perler eller til en kolonne, i kontakt med prøven hvortil det er tilsatt varierende mengder av merket CK-MB. Jo høyere konsentrasjonen av CK-MB er i prøven, jo mindre merket CK-MB får anledning til å bindes til den faste bæreren. Mengden av merker som gir en indikasjon på prøve CK-MB kan måles enten i oppløsningen som er igjen etter behandling med bæreren, eller kan måles på bæreren selv eller elueres fra bæreren. Dersom merket måles som det som er igjen i oppløsning vil mengden av merke som måles være direkte proporsjonalt med CK-MB-innholdet i prøven; det omvendte gjelder dersom merket bundet til bæreren benyttes som et mål. Merket kan være et hvilket som helst av de som er vanlig kjente og anvendte innen slike analyser, innbefattende, uten begrensning, radioaktive isotoper, fluorescente forbindelser, kromogene forbindelser, eller enzymer som katalyserer reaksjoner som gir detekterbare resultater. ;I en alternativ type fremgangsmåte kan en sandwich-analyse benyttes hvori det MB-spesifikke monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen benyttes til å ekstrahere CK-MB i prøven, som deretter detekteres ved anvendelse av merkede anti-CK-M eller anti-CK-B - for eksempel antistoffer som er spesifikke til hver underenhet (eller, polyklonale antisera eller andre monoklonale stoffer reaktive med CK-MB). Denne analysen kan gjennomføres på en bærer i fast fase eller en Immunoutfelling kan innledningsvis dannes og deretter separeres og merkes. Fremgangsmåten kan naturligvis reverseres og anti-CK-M eller anti-CK-B kan benyttes som oppfangingsimmunoglobulin og merkede MB-spesifikke antistoffer benyttes til å detektere immunoutfellingen eller adsorbatet. ;Antistoffer som er spesifikke for M- eller B-underenhetene av CK kan benyttes som enten polyklonale eller monoklonale preparater. De er tilgjengelige kommersielt, eller kan fremstilles ved anvendelse av standard fremgangsmåter svarende til de som er beskrevet ovenfor, som er beskrevet innen teknikken for lg av disse spesielle spesfisitetene. ;I tillegg til ovennevnte kan en direkte immunoanalyse utføres ved inkubering av prøven som skal undersøkes med de MB-spesifikke antistoffene ifølge oppfinnelsen hvori antistoffene eller deres fragmenter er immobilisert på faste partik-ler som for eksempel bærerkuler, eller på faste overflater. Perlene eller andre inerte faste stoffer vaskes deretter og CK-MB-aktiviteten bundet til antistoffet måles etter inkubering med en spesifikk CK-reagens som komponentene av et koblet enzymreaksjonssystem. Ved slike fremgangsmåter kan den innledende inkuberingen utføres ved romtemperatur, mens inkuberingen med CK-reagensen ofte utføres ved ca. 37°C. ;Ved disse fremgangsmåtene, som bygger på CK-aktivitet, er det ønskelig å ta forholdsregler for å forhindre denaturering. ;Siden CK-enzymer er kjent for å være relativt ustabile i blodserumprøver, kan tilsats av en liten, men aktiverende mengde av en sulfhydryl (thiol) forbindelse som for eksempel P-merkaptoetanol, cystein, glutation eller ditiotreltol tilsettes til analysereaksjonsmediet. Se for eksempel US-PS 3,403,077 og 3,540,984 vedrørende anvendelse av slike additiver. ;De inerte baerepartiklene kan for eksempel være glass, silisiumdioksyd, agarose, dekstran, polystyren, polyvinyl-klorid, styren/divinylbenzenkopolymer og andre slike organiske eller uorganiske materialer som kan være fremstilt i form av sfæriske kuler, selv om ikke-sfæriske overflater også kan benyttes. I tillegg kan magnetiserte perler benyttes for å lette separasjonen. Perlene kan være av partlkkelstørrelse under en pm eller større, for eksempel opptil ca. en centimeter i diameter. Den ikke-sfæriske overflaten kan være en glass- eller plastrøroverflate, eller en mikrotiterbrønn. ;I en illustrasjon nedenfor benyttes latekskuler, og disse kan være polystyren-latekskuler av en partikkelstørrelse mindre enn ca. en pm i diameter. Slike kuler er vanlig anvendt som bærerpartikler i antigen/antistoff-reaksjoner såsom beskrevet, for eksempel av Singer og Plotz, "Amer. J. Med." (1956) 21:888-892 og TJS-PS 3,088,875. ;Det finnes et antall alternative kjemiske teknikker tilgjengelig. I en illustrert utførelse er CK-reagens en bufret vandig oppløsning inneholdende effektive mengder av kreatin-fosfat, ADP, glukose, HK, G-6-PDH og NAD, pH ca. 7. ;CK-reagenskomponentene for denne utførelsen og lateksperlene eller andre inerte bærepartikler er velkjente materialer og er også tilgjengelige kommersielt. Følgelig kan ADP og NAD<+ >forbindelsene oppnås fra pattedyr-muskelvev, og er generelt tilgjengelig kommersielt som vannoppløselige salter, vanligvis som natriumsaltene. Kreatin-fosfat er også tilgjengelig fra pattedyr-muskelvev, mens glukose generelt oppnås kommersielt ved hydrolyse av maisstivelse. HK- og G-6-PDH-enzymene kan oppnås fra gjær og andre mikroorganismer som det fremgår fra for eksempel US-PS 3,794,562. HK-enzymet har et absolutt kofaktorbehov for Mg<+2->ion for aktivitet, og dette kan tilføres ved tilsetning av en liten, men effektiv mengde av et vannoppløselig magnesiumsalt, for eksempel magnesiumsulfat eller magnesiumacetat, til reaksjonsmediet. Dannelsen av NADH i dette systemet kan detekteres spektrofotometrisk ved 340 nanometer eller ved fluorescens. I tillegg kan dannet NADH benyttes til å redusere fargestoffer, såsom jodonitrotetrazolium-fiolett (INT) via en elektronbærer som diaforase, slik at det dannes fargede forbindelser som kan detekteres spektrofotometrisk i det synlige området. ;Andre enzymsystemer som genererer NADH eller NADPH kan også benyttes. ;I tillegg kan koblede enzymsystemer eller andre innretninger for å detektere spesifikt ett eller flere av produktene fra den CK-katalyserte reaksjonen i den valgte retningen, anvendes istedenfor den angitte CK-reagensen. For eksempel kan det også benyttes materialer som danner spesifikke fargede komplekser med kreatin eller kreatin-fosfat, eller som videre reagerer med ATP på en hvilken som helst måte. ;I ett spesielt alternativ kan ATP som genereres i kreatin-kinase reaksjonen detekteres ved anvendelse av et luciferase-system. Dette enzymet, ekstrahert fra ildfluer og kommersielt tilgjengelig, katalyserer omvandlingen av luciferin i nærvær av oksygen til produkter som er av tilstrekkelig lavere energi til at lys emitteres under forløpet av reaksjonen. Denne bioluminescensen kan anvendes som en direkte fremgangsmåte for deteksjon av CK-MB kvantitativt eller kvalitativt. ;De følgende detaljerte eksemplene illustrerer oppfinnelsen ytterligere, selv om det skal understrekes at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse. Deler er vektdeler med mindre annet er angitt. ;Eksempel 1 ;Fremstilling og karakterisering av monoklonale antistoffer. Innledende forsøk viste at immuniserte A/J-mus hadde mye høyere antistofftitere for CK-MB i deres serum enn konvensjo-nelt benyttede BALB/c-mus. ;Fremgangsmåtene ble gjennomført som følger: ;A. Immunlseringsfremgangsmåte: Åtte uker gamle A/J hunmus, H-2a haplotype, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA 04609), ble injisert intraperitonealt med 25 pg av humant kreatin-kinase-MB emulgert i et like stort volum av fullstendig Freund's adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178). Fire uker og åtte uker senere ble den samme mengden antigen i ufullstendig Freund's adjuvans (Sigma Chemical Co.) og fosfat-bufret saltvannsoppløsning (PBS, 60 mmol/liter natriumfosfat, pH 7.2, inneholdende 150 mmol/liter NaCl) administrert på tilsvarende måte. En endelig porsjon på 25 jjg antigen i PBS ble tilført fire dager før fusjon, minst tre uker etter den tredje injeksjonen. ;CK-MB-isoenzymet som ble benyttet ved denne immuniseringen var isolert fra human hjertemuskel og renset ved en kombinasjon av ionevekslingkromatografi og affinitetskromatografi. Følgelig ble hjertevevet ekstrahert med en buffer innbefattende 50 mmol Tris, pH 7.3, inneholdende 100 mmol/liter EDTA, 10 mmol/liter 2-merkaptoetanol (Buffer A). En 40-70$ ;(NH4)2S04 utskjæring av vevekstraktet ble dialysert, og deretter underkastet DEAE-"Sepharose" ionevekslingskolonne-kromatografi ved anvendelse an en 0-325 mmol/liter NaCl lineær gradient i Buffer A. CK-MB-toppen ble detektert ved hjelp av agarosegel-elektroforese. CK-MB-fraksjonene ble deretter underkastet "Affi-Gel Blue"-affinitetskolonne-kromatografi for å fjerne albumin ved anvendelse av en 0-250 ;mmol/liter NaCl-gradient i Buffer A for å eluere CK-MB. Forurensende LDH ble fjernet ved å underkaste CK-MB til 5'-AMP-"Sepharose" affinitetskolonne-kromatografi som binder NAD<+->avhengige dehydrogenaser og ATP-avhengige kinaser. Det rensede CK-MB ble samlet i gjennomstrømningen, konsentrert, dialysert og lagret ved -70°C i 50$ glyserol. ;B. FusJonsteknlkk: Milter ble fjernet aseptisk fra de immuniserte musene. Splenocytter (10<8>) ble sammensmeltet med Sp2/0-Agl4-celler (IO<7>), en BALB/c-myelomcellelinje, i nærvær av polyetylenglykol (PEG 1500) i det vesentlige ved den publiserte fremgangsmåten ifølge Kohler og Milstein, "Nature" 25b., 495-497 (1975 ). C. Undersøkelse: Undersøkelse av hybridomene som fremstil-ler antistoffer mot CK-MB ble utført ved å anvende fast-fase-radioimmunoanalyse. Geit-anti-mus-IgG (H + L) antistoffer ("Pel-Freeze" Biologicals, Rogers, AR 72756) (2 mg/liter i 100 mmol/liter natriumborat, pH 8.5, inneholdende 150 mmol/liter NaCl) ble belagt på 96 godt rundbundede mikrotiterplater (Dynatech, Alexandria, VA 22314) ved inkubering av 100 pl geit-anti-mus-IgG over natten ved 4°C og i 2 timer ved 37°C. Platene ble vasket med "Tween"-saltvannsoppløsning (0,5 ml "Tween-20", 8.77 g NaCl, 0.02 g NaN3 pr. liter). Dette ble etterfulgt av tilsetning av 100 pl hybridomsupernatant etterfulgt av inkubering og vasking som ovenfor. Antistoffene som var til stede i supernatantene mot humant CK-MB ble detektert ved å tilsette 100.000 cpm radiomerket antigen (CK-MB, renset som ovenfor) per brønn og inkuberer over natten ved 4°C. Det radiomerkede CK-MB ble fortynnet i PBS inneholdende 10 g/liter bovinserumalbumin og 1 mmol/liter 2-merkaptoetanol. Platene ble vasket, tørket og det bundne, radiomerkede CK-MB ble tellet på en "Packard" -y-teller. Resultatene ble betraktet som positive dersom tellingene bundet til brønnen var minst dobbelt så store som for de negative kontrollbrønnene inneholdende urelaterte hybridom-supernatanter. Som positive kontroller ble brønner utviklet ved anvendelse av egnet fortynnede anti-CK-M underenhet og anti-CK-B underenhet spesifikke monoklonale antistoffer oppnådd fra Hybritech (San Diego, CA 92121). Hybridomer produserende antistoffer til CK-MB ble klonet i myk agar og lagret under flytende nitrogen i "Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM) med 10$ dimetylsulfoksyd og 30$ hesteserum. D. Rensing av monoklonalt antistoff fra ascltes: Pristan-primer behandlede CAF^/J-mus (Jackson Laboratories) ble injisert intraperitonealt med 10^ hybridceller, og ascites-fluid ble samlet 1-2 uker senere. Ascitesfluid fremstilt av hver cellelinje ble samlet og lagret ved -20"C etter fjerning av celleavfallet ved sentrifugering. Monoklonalt antistoff fra ascites-fluidet ble renset ved anvendelse av et protein A-affinitetskolonnesystem ("MAPS", Bio-Rad, Richmond, CA 94804). Antistofftoppen eluert fra kolonnen ble konsentrert ved anvendelse av en "Amicon YM-50" ultrafiltreringscelle som hadde en molekylvekt-sperregrense på 50.000 Dalton, og deretter dialysert mot PBS og lagret ved -70°C. Renheten av de monoklonale antistoffene ble undersøkt ved elektroforese på agarosegel. ;E. Agarosegel- elektroforese: ;Elektroforese av ascites-fluid ble utført ved anvendelse av agarosegel ("Corning agarose film No. 470100", American Scientific Products, Palo Alto, CA 94306) og barbitol-buffer ("PEAB, Corning No. 470180"). Elektroforese ble utført i 40 minutter ved 90V. Elektroforetisk separasjon av CK-isoenzymer ble utført på tilsvarende måte i 30 minutter ved anvendelse av Corning Agarose film (Nr. 470104) og "Mopso" buffer: 3-(N-Morfolino)-2-hydroksypropan-sulfonsyre (Corning No. 470046). For farging av proteinene ble geler fiksert og farget i en blanding av metanol, eddiksyre og vann (40:10:50) inneholdende 0.125$ "Coomassie blue". Bakgrunnen ble avfarget i den samme blandingen uten "Coomassie blue"-sjølufttørking. ;F. Bestemmelse av isotype: Isotypebestemmelse av det monoklonale antistoffet ble utført ved Ouchterlony radial-immunodiffusjonsteknikken. (Se Ouchterlony, "Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis", Ann Arbor Sc. Publ., 1968). Doble immunodiffusjonsskiver og muse-isotype spesifikke antisera ble oppnådd fra Miles Scientific, Naperville, IL 60566. ;G. Bestemmelse av spesifisitet: Spesifisiteten av de monoklonale antistoffene ble bestemt ved kompetitiv radio-immunoanalyse. Denne analysen var tilsvarende den RIA som ble benyttet for undersøkelse av hybridomsupernatant, bortsett fra at bindingen av radiomerket CK-MB til de monoklonale antistoffene foregikk i konkurranse med forskjellige konsentrasjoner av rensede CK-isoenzymer. 100 pl av affinitetsrenset monoklonalt antistoff (2 mg/liter i PBS inneholdende 10 g/liter bovinserum albumin) ble bundet til geit-anti-mus-IgG immobilisert på mikrotiterplaten. En 100 pl blanding av merket CK-MB (100.000 cpm) og 0-1000 ng av konkurrerende isoenzym av CK, (CK-BB eller CK-MM) ble deretter tilsatt og inkubert over natten ved 4°C. Platene ble deretter vasket og tørket, og bundet radiomerket CK-MB ble tellet på en "Packard" •y-teller. ;Spesifisiteten av Conan-MB ble bekreftet ved å la radiomerket antistoff bindes til CK-isoenzymer separert på agarosegel ved elektroforese. Etter elektroforese ble geler fiksert i en blanding av isopropanol, eddlksyre og vann (25:10:65) i 30 minutter, vasket to ganger med deionisert vann i samme tidsrom og inkubert i 50 ml PBS inneholdende 10 g/liter bovinserumalbumin (BSA) og 500.000 cpm av ^<25>I-merket antistoff i 4 timer ved romtemperatur. Ubundet radioaktivi-tet ble vasket av med PBS. Geler ble deretter tørket, eksponert mot "XAR-5" røntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, NY 14650) i 24 timer ved -70°C med en intensiver-ende, skjerm og utviklet i en automatisk filmbearbeidelses-enhet. ;Resultater ;Fremgangsmåtene ovenfor ga følgende resultater: ;Karakterisering av monoklonalt antistoff ;Fusjon av miltcellene fra fire immuniserte A/J-mus med BALB/c-myelomcellelinje Sp2/0-Agl4 genererte opp 13 hybridomer som utskilte antistoffer mot humant CK-MB. Ved kompet!tiv RIA, ble det funnet at åtte av de 13 hybridomene produserte antistoffer spesifikke for human-CK-MB som ikke gjenkjente humant CK-MM eller CK-BB. I tillegg ble det funnet fire hybridomer som produserte antistoffer spesifikke for B-underheten og et antistoff spesifikt for M-underenheten. ;Ascites-fluid fremstilt ved injeksjon av en av de klonede hybridomene som ga antistoff spesifikt for CK-MB (Conan-MB) ble karakterisert ved Immunodiffusjon til å være av IgG-2b-underklassen med kappa-lette kjeder. ;Kompetitiv RIA som demonstrerer spesifisiteten av Conan-MB er vist i figur 1. Conan-MB gjenkjente ikke CK-MM eller CK-BB, selv i konsentrasjoner opp til 10 mg/liter. Spesifisiteten av Conan-MB blir bekreftet ved anvendelse av hybrid CK-MB, som ga et identisk inhiberingsmønster som det native CK-MB, renset fra menneskehjerte. Videre, separert radiomerket Conan-MB bundet til CK-MB, men ikke til CK-MM eller CK-BB ved agarosegelelektroforese. ;Videre karakterisering avslørte at binding av Conan-MB til CK-MB ikke syntes å påvirke enzymaktiviteten. Dette var også tilfellet når CK-MB ble ekstrahert fra oppløsningen ved hjelp av Conan-MB, immobilisert på lateksperler. På grunn av spesifisiteten og evnen til å ekstrahere enzymatisk aktivt CK-MB, ble Conan-MB benyttet i en klinisk analyse for direkte måling av CK-MB-aktivitet. ;Eksempel 2 ;Bestemmelse av CK- MB ;Kliniske prøver og standarder ;Serumprøver innsendt til kjemilaboratoriet ved Barnes Hospital eller Coronary Care enhet laboratorie for CK-MB-analyse ble lagret ved 4<*>C etter stabilisering til en endelig konsentrasjon på 10 mmol/liter 2-merkaptoetanol og analysert i løpet av 5 dager. Prøver ble analysert ved den direkte CK-MB-fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og også, for sammenligning, til hjelp av en kommersielt tilgjengelig to-sete enzymimmunoanalyse ("Enzygnost CK-MB", Behring Diagnostics, La Jolla, CA 92037). Most common assay procedures for CK-MB consist of measuring the enzymatic activity of CK-MB after separation from other CK isoenzymes on the basis of differences in charge using electrophoresis or ion exchange, or by immunoinhibition or a combination of immunoinhibition and immunoprecipitation. Alternatively, the mass of CK-MB is measured by immunoassay, either using an antibody for the analysis of B subunits (CK-MB plus CK-BB) or two-site antibody techniques. In the two-site antibody techniques, an antibody, for example, to the B subunit is attached to a solid phase to extract the isoenzymes containing this subunit and, after washing, a labeled (enzyme or <*25>j) antibody is added to the other , in this case M, the subunit. In a recently developed, typical example of the solid-phase two-site antibody technique for the analysis of CK-MB (such as the "Enzygnost" immunoassay manufactured by Cal Biochem-Boehring, La Jolla, California), serum is added to tubes that are coated with antibodies specific for the CK-B subunit so that they bind CK-MB, CK-BB, and macro-CK-1 (CK-BB associated with immunoglobulin). After a washing step that removes the CK-MM isoenzyme and all other enzymes that do not contain a CK-B subunit, a second antibody (which is specific for the CK-M subunit and labeled with horseradish peroxidase enzyme) is added, thereby labeling only the CK-MB that remains in the test tube. The substrate, urea peroxide, is then added. The concentration of the generated color product is then related to the concentration of CK-MB in the sample. The recently described methods for quantitative measurement of the amount of CK-MB in sera are consequently those based on an immunological approach. See, for example, US-PS 4,260,678, 4,353,982 and 4,387,160. Monoclonal antibodies (as distinct from polyclonal antibodies) to the B and M subunits of CK have also been developed for such assays and are described, for example, by Wurzburg and Strobel, "J. Cl in. Chem. Clin. Biochem ." (1981) 19:543-544; Morris and Head, "FEBS Lett." (1982) 145:163-168; Morris and Head, "Biochem. J." (1983), 213:417-425; Jackson et al, Ibid. (1983) 215:505-512. Assays for CK-MB using such antibodies have been further developed and reported by Jackson et al, "Clin. Chem." (1984) 30:1157-1162; Sheedan and Haythorn, Ibid (1985) 31:160-161; Chan et al., Ibid (1985) 31:465-469; McBride et al, Ibid (1985) 31;1099-1100. The previous analyzes have varying degrees of sensitivity to the other two isoenzymes of CK, namely CK-MM and CK-BB. In addition, interference by adenylate kinase (when CK activity is measured), by macro-CK-1 (CK associated with immunoglobulin) and by macro-CK-2 (mitochondrial CK) has also occurred. Furthermore, interference due to non-specific binding is a frequent problem in two-seat assays (Boscato, L.M. et al., "Clin. Chem." (1986) 32:1491-1495). The invention provides improved methods and materials for the determination of CK-MB isoenzyme in serum and other biological fluids. These methods use a monoclonal antibody, or derivatives thereof, which recognize only CK-MB and not the other isoenzymes. Use of this antibody allows direct specific measurement of the isoenzyme in serum and other biological fluids, based on its enzymatic activity in a solid phase assay. Accordingly, this class of antibody, one element of which is designated Conan-MB, is used to extract CK-MB isoenzymes from serum and other biological fluids. CK-MB in the biological sample can then be determined by exposing the adsorbed CK-MB isoenzyme to a CK reagent system and measuring the catalytic activity, or can be detected by other methods. For example, the enzyme activity in catalyzing ATP/ADP conversion can be determined by monitoring the absorbance change at 340 nm caused by NADH or NADPH, or the reaction can be associated with another known reaction that can be followed spectrophotometrically. In representative examples, this method is employed using the Conan-MB monoclonal antibody coated on latex particles. This method version showed no interference and gave excellent agreement with a commercially available solid phase two-site enzyme immunoassay. Other method variants in which the MB-specific antibody is useful can of course also be used. As mentioned in the introduction, the invention relates to a preparation for use in vitro including a monoclonal antibody or an immunologically reactive derivative thereof, and this preparation is characterized by the fact that the antibody or derivative is immunologically reactive with CK-MB isoenzyme, but not with CK-MM or CK-BB isoenzymes. As mentioned at the outset, the invention also relates to the use of the preparation as described in the previous section for the determination of CK-MB isoenzyme in a sample, where the sample is brought into contact with the preparation to cause an immunoreaction between CK-MB in the sample and the antibody or its derivative in the preparation, and separation of the immunoreacted components from the rest of the sample. ;The invention further relates to a cell line which is characterized by the fact that it produces an antibody which is immunologically reactive with CK-MB isoenzyme, but not with CK-MM or CK-BB isoenzymes, and which is constituted by ATCC HB 8939. ;Finally relates to the invention as indicated at the outset, a monoclonal antibody that is specific for CK-MB or an immunologically reactive derivative thereof to purify CK-MB from a mixture, whereby the mixture is brought into contact with the antibody or derivative. ;A particular embodiment of the MB-specific monoclonal antibody preparations is designated Conan-MB, and the hybridoma cell line producing the Conan-MB monoclonal antibody has been deposited at the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under accession number ATCC HB 8939 on 6 November 1985. Figure 1 is a graphical representation showing the specificity of Conan-MB monoclonal antibody as determined by competitive RIA. Immobilized monoclonal antibody Conan-MB was exposed to different concentrations of CK-MM (X), CK- ;BB (0), native CK-MB (.), and hybrid CK-MB (A) together with 100,000 cpm of 125I CK -MB. The counts for 125I CK-MB bound to Conan-MB as a percentage of the counts bound without competitor present are plotted against the logarithm of added competitor (jjg/1). Figure 2 is a graphic representation showing the coating of latex beads with monoclonal antibody Conan-MB according to an embodiment of the invention. Conan-MB Immobilized on 0.8 pm latex beads (5g/litre) after overnight incubation at 4°C is deposited against increasing concentrations of antibody. Figure 3 is a graphical representation showing the impact of CK-MM, CK-BB, mitochondrial CK and hemolysis on the direct analysis of CK-MB according to an embodiment of the invention. The control CK-MB value was 62 U/l of purified human CK-MB. The hemolysate was prepared by freezing washed human red cells stored less than 24 hours. Purified CK-MM, CK-BB and mitochondrial CK were used. The values in the presence of the higher amounts of isoenzymes are corrected for a small residual activity present after two washes of the latex beads. This residual activity was determined using control beads for the assay and was 35.9 U/l for 200,000 U/l of CK-MM and 25.0 U/l for 250,000 U/l of CK-BB. Figure 4 is a graphical representation showing the comparison of CK-MB activity (U/l) determined by direct assay in one embodiment of the invention and CK-MB concentration determined by a commercially available two-site immunoassay (jig/ l). Fifty samples were measured by both analyses. The linear regression was Y = 0.915 X +0.35 with a correlation coefficient of 0.997. A. Definitions As the term is used here, "immunologically reactive with" refers to typical antibody-antigen reactions which are effected by the specificity of the variable region of immunoglobulins to specific epitopes. ;"Immunologically reactive derivative" of an antibody refers to portions of the antibody that retain the ability to recognize the epitopes ordinarily recognized by antibodies from which they are derived. Such derivatives usually include, for example, Fab, Fab' and F(ab')2 fragments of immunoglobulins. Production of such immunologically reactive derivatives is well known in the art, and often provides advantages when the antibodies are to be used in vivo, or when the functional effects of the overall immunoglobulin molecule are not desired. "Cross-reactive with" when describing the properties of an immunoglobulin or its derivative refers to the ability to recognize the same epitope found in the indicated antibody or derivative. This ability can be recognized by assessing the ability of the cross-reacting material to block the immunological reaction of the indicated immunoglobulin. As the size is used here, an activity unit (U) is defined as one micromole of ATP formed per minute at 37°C. "Cell line" refers to an immortalized cell, cell culture, a larger number of identical cells, and their descendants. It is known that the progeny and some of the members of the "identical" collection are not necessarily absolutely identical to the original cell from which the line is derived, but may differ from each other in genetic makeup due to random mutations. This mutated progeny is, however, included within the definition as long as the essential characteristics of the cell line are preserved. "Specificity for the CK-MB isoenzyme" refers to the ability of an antibody or derivative to react immunologically with CK-MB, to the exclusion of CK-BB or CK-MM. ;The designation "Conan-MB" refers specifically to the antibody secreted by ATCC HB-8939 and this particular cell line. Accordingly, "Conan-MB" is used to designate both the cell line and its product. The term "Conan-type MB" refers to antibodies that compete with Conan-MB in reaction with CK-MB and the cell lines that secrete these. The term "MB-specific antibodies" refers to any monoclonal antibody specific for CK-MB, whether or not it recognizes the same epitope as Conan-MB. ;Therefore, there are three levels of similarity to the antibodies secreted by the deposited cell line. The antibodies secreted by the cell line per se, Conan-MB, cross-react with "Conan-type MB" monoclonal antibodies since both compete for the same or a similar epitope. The general class of MB-specific monoclonal antibody preparations react with CK-MB to the exclusion of CK-BB or CK-MM, and these latter isoenzymes do not compete with CK-MB for immunoreactions with MB-specific monoclonal antibodies; however, not all members of the general class of MB-specific monoclonal antibodies compete or cross-react with Conan-MB. Some may recognize different epitopes on the CK-MB isoenzyme as Conan-MB itself, although the epitopes are unique to CK-MB as opposed to CK-BB or CK-MM. ;"CK reagent" means, as the term is used here, a collection of components that can be used to measure the enzymatic activity of creatine kinase. Creatine kinase is enzymatically active in all three of its isoenzyme forms and catalyzes the interconversion of creatine phosphate-and-ADP with creatine-and-ATP, as indicated above. The reagent will therefore contain the appropriate reactants for carrying out this reaction, plus reagents to produce a detectable result from the products. In Example 2, for example, the "CK reagent" is a commercially available reagent mixture containing AMP, ADP, creatine phosphate, NAD, yeast HK, and G-6-PDH and various buffering and stabilizing components. This mixture is marketed by Electro-Nucleonics, Inc. under the designation "Gemini C^LTS" reagent. ;In Example 3, the "CK reagent" is a 30:1 mixture of a "substrate" solution containing 20.92 g/liter Bis-Tris, 1.010 g/liter ADP, 2.14 g/liter Mg(oAc)2, 3.60 g/liter D-glucose, 2.00 g/liter NAD, 1.85 g/liter AMP, 0.95 g/liter EGTA, 2500 U/liter HK and 1650 U/liter G-6-PDH, and a "kicker" solution containing 2.092 g/liter Bis -Tris and 332.8 g/litre creatine phosphate. B. Production of MB-specific antibodies. ;Generally, the MB-specific antibodies can be prepared by a specific method which involves immunizing a suitable mammal with purified CK-MB, so that anti-MB-secreting cells are obtained from the peripheral blood lymphocytes or the spleen of the immunized animal at a time when the antibody titers in the serum are high, immortalization of these antibody-secreting cells, and then examination of the immortalized cells regarding the production of the desired antibodies. The examination procedure is of the utmost importance, and includes immunoreactions with purified CK-MB and verification of a lack of cross-reactivity for the antibodies with purified CK-BB and CK-MM. ;It is important for the successful production of MB-specific antibody-secreting cell lines to use a purified CK-MB isoenzyme as the immunogen in the initial immunization. The enzyme can be purified from human skeletal and cardiac muscle as described by Leykam, Dietzler, and Ladenson, "Clin. Chem." (1983) 29:1219 (Abstract 413-A), and by Vaidya, Dietzler, Leykam and Ladenson, "Biochlm. Biophys. Acta" (1984) 790:230237. This purification procedure uses tissue homogenization, ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography such as with DEAE-Sepharose, followed by affinity chromatography and chromatofocusing. Variations of this described method can also be used. ;In affinity chromatography, for example, a substance is specifically and reversibly adsorbed by a complementary binding substance (ligand) immobilized on an insoluble carrier (matrix). A variety of matrices and ligands can be used. Preferred affinity chromatography materials are "Affi-Gel Blue", which is an agarose with reactive blue dye, commercially available from Bio-Rad, Richmond, California, and 5'-AMP-"Sepharose" which is prepared by coupling N^(6- aminohexyl-) 5'-AMP to "Sepharose" (agarose), commercially available from Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. A particularly preferred method for purifying CK-MB is made possible by the availability of Conan-MB secreted by the hybridoma ATCC EB-8939 or other MB-specific antibodies according to the invention. Because these antibodies are so highly specific for the desired isoenzyme, they make suitable ligands for affinity chromatography in procedures for purifying this material. The antibody can be conjugated to any suitable matrix, including Sepharose, latex, agarose, or polyacrylamide. Procedures for the immobilization of antibodies to solid supports are of course numerous and well known in the art. ;In the chromatofocusing procedure, proteins are eluted as sharply focused, well-separated zones in a linear pH gradient depending on their isoelectric point. The proteins, after initial binding at the top of the column to a polybuffer exchange resin, migrate downward as the pH gradient develops. The rate of movement of a particular level in the pH gradient down the column is lower than the rate of flow of the polybuffer. Subsequent proteins are carried downwards and reach the area where they bind to the column and thereby maintain a narrow zone width. Further information regarding chromatofocusing can be found by reference to the manufacturer's document "Cromato-focusing with "Polybuffer" and "PBE"", Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden, 1982; Richey and Beadling, "Amer. Lab." 13, October 1981, pages 100-102; and Sluyterman, "Trends in Biochem. Sei." (1982) 7:168-170. ;The purified CK-MB isoenzyme is then used as an immunogen to produce cells capable of secreting MB-specific antibodies. Mice (or other suitable mammals) are immunized by injection with the purified CK-MB isoenzyme until a high titer of the antibody is detectable in the serum. A well-immunized object that is thereby identified is preferably injected with additional CK-MB. After a suitable period of time, the spleen cells or peripheral blood lymphocytes, preferably spleen cells, are harvested and immortalized. A preferred mouse strain for use in the immunization is the A/J strain available from Jackson Laboratories, Bar Earbor, Maine. This is a well-known mouse strain having genetic characteristics as defined in "Biological Handbooks III: Inbred and Genetically Defined Strains of Laboratory Animals", Part 1, Mice and Rats, compiled and edited by Altman and Katz, FASEB, Bethesda, Maryland, 1979, page 21. For additional information regarding the A/J strain, see also Bangham, "Mouse News Lett." (1965) 33:68; Dickie, Ibid (1966) 34:30; and "Handbook of Genetically Standardized JAX Mice", Eeiniger and Dorey, editors, The Jackson Laboratory, Bar Earbor, Maine, 3rd ed., 1980, especially Part 2, pages 1-32. Immortalization can be effected by fusion with a myeloma as originally described by Kohler and Milstein, "Nature" (1975) 256:495-497; "Eur. J. Immunol" (1976) 6:511-519. According to this method, mouse myeloma cells adapted to tissue culture are fused to spleen cells from immunized mice so that the hybrid cells that produce large amounts of a single antibody molecule are obtained. Naturally, other immortalization methods known in the art, for example infection with Epstein-Barr virus, or transfection with viral DNA, can also be used. For the method of Kohler and Milstein, a preferred mouse myeloma cell line is the Sp2/0-Agl4 cell line. This is a well-known cell line of BALB/c origin, defined by Schulman, Wilde and Kohler, "Nature" (1978) 276:269-270. These cells, which do not synthesize immunoglobulin (Ig) chains, are available from the Basel Institute for Immunology, Basel, Switzerland, and the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland under accession no. ATCC CRL-1581. A preferred method for carrying out the fusion of the myeloma cells and the spleen cells is by the general method described by Galfre et al, "Nature" (1977) 266:550-552. in which polyethylene glycol (PEG), for example PEG 1500, is used as the fusion agent for the cells growing in monolayers. Immortalized cells can be selected by culturing in HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine) selection medium as described, for example, by Littlefield, "Science" (1964) 145:709. The choice of selection medium naturally depends on the nature of the immortalization process. If immortalization occurs by fusion, the fusion partner, for example the myeloma, confers immortality on the antibody-secreting line and must have deficient properties that are complemented by the antibody-secreting partner in connection with the selection medium. The immortalized cells must then be examined for those secreting antibody of the correct specificity. A critically important part of the process for producing the MB-specific non-antibodies according to the invention is the selection of a suitable examination method which will result in the identification of immortalized cells secreting antibodies of the correct specificity. ;The supernatants from the immortalized cells are first examined for the secretion of antibodies that bind CK-MB. This can be performed using conventional immunoassay methods such as immunoassay. Conventional general RIA procedures were originally described, for example, by Yalow et al, "J. Clin. Invest.", 39: 1157 (1960); and solid-phase RIA was first developed by Catt and Tregear, "Science" 158, 1570-1572 (1967). Since polyvinyl surfaces will generally strongly adsorb nanogram amounts of most proteins, an immobilized second antibody (antiserum) is used to capture primary antibody which in turn can bind radiolabelled antigen in a competitive-type analysis. As an example, RIA can be performed by applying the supernatants to multi-well microtiter plates coated with, for example, anti-mouse antibody, and then detecting bound antibody using labeled, purified ;CK-MB. The group of hybridomas or other cells that are thereby identified as secreting antibodies that are capable of binding CK-MB is then examined with a view to those that do not bind to CK-MM or CK-BB. This can be done by a number of methods, but the simplest and preferred method is a comp! tive analysis using purified monoclonal antibodies from the supernatants. The purified preparations are applied to microtiter wells coated with anti-mouse IgG and the wells are treated with labeled CK-MB in the presence of varying amounts of competing CK-BB or CK-MM. Those cell lines that produce antibodies that continue to bind CK-MB and thereby resist the competition of either CK-MM or CK-BB are then selected. ;The preceding method can be applied either to the original culture supernatants, or can use partially purified culture medium or ascites fluid after amplification of the cultures which have been shown to secrete antibody reactive with CK-MB. Based on the experience described here, the majority of the CK-MB-reactive antibodies produced by the indicated method are specific for this isoenzyme and do not react with CK-MM and CK-BB; consequently, there is little waste in the amplification procedure, which may be the case if the majority of the immortalized cell lines do not produce antibodies of the desired specificity. A useful confirmatory assay for the specificity of the desired isoenzyme is more conveniently performed on partially purified antibodies from such amplified supernatants or ascites fluids. In this method, the antibodies produced using, for example, <125>j or another label are labeled and brought into contact with electrophoresis gels containing bands corresponding to the separated Isoenzymes. Preparations in which the immunoglobulins bind exclusively to the separated isoenzyme CK-MB, but not to bands corresponding to CK-BB or CK-MM, are then selected. In the procedure illustrated below, it was found that of 13 hybridomas obtained that secreted antibodies to CK-MB, eight produced antibodies specific for this isoenzyme. ;To increase antibody production, the immortalized cells are cultured in vitro in culture medium or, alternatively, injected into mice in which they produce ascites tumors that allow growth of the cells and generation of large amounts of monoclonal antibody. After production, the monoclonal antibody can be isolated and purified from the tissue culture medium or the ascites fluid by various known methods such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, affinity chromatography, ion exchange chromatography, ultrafiltration, adsorption with polyelectrolyte copolymers and similar methods for protein separation. Preferred methods employ affinity chromatography on protein A-agarose columns, for example protein A-"Sepharose", followed by dialysis or ultrafiltration. Protein A is a polypeptide (molecular weight 42,000) isolated from Staphylococcus aureus that binds the lg molecule without interaction with the antigen-binding site. Protein A-"Sepharose" is commercially available from Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. These and other suitable methods for the isolation and purification of monoclonal antibodies are generally described by Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, London and New York, 1983, and US-PS 4,533,496. C. Affinity Chromatography ; The CK-MB-specific monoclonal antibodies prepared as described above are useful for affinity purification of CK-MB from biological fluids or culture media. When using such antibodies in these purification procedures, affinity chromatography techniques are used which are generally well known. In a typical method, the monoclonal antibodies or their immunologically reactive fragments are conjugated to a solid carrier such as agarose, polyacrylamide, or latex by standard joining technology, such as the use of bifunctional binding agents or by direct binding. The mixture from which the CK-MB purification is desired is then passed through a column or filter containing the supported antibody preparation using conditions under which an immunological reaction takes place between the antibody and CK-MB. CK-MB is then eluted by imposing conditions that selectively dissociate the antigen-antibody complex. Such conditions include changing the pH, changing the temperature, and controlling the ionic strength. D. Analysis for CK-MB; The CK-MB-specific antibodies according to the invention are particularly useful as components of an analysis for the presence, absence or amount of CK-MB in biological or other samples, including for example analysis in serum as a indication of myocardial infarction. Methods for assays using this antibody vary widely, and may employ direct measurement of recovered CK-MB using this antibody, or may employ competitive or sandwich assay techniques. Examples of suitable methods include the following. In a particularly useful series of methods, competitive immunoassays can be used in which labeled CK-MB competes with CK-MB present in the sample for immobilized CK-MB-specific antibodies. In this type of analysis, the CK-MB-specific antibodies, bound to a solid support such as micro-titer wells, beads or to a column, are placed in contact with the sample to which varying amounts of labeled CK-MB have been added. The higher the concentration of CK-MB in the sample, the less labeled CK-MB has the opportunity to bind to the solid support. The amount of label indicative of sample CK-MB can be measured either in the solution remaining after treatment with the carrier, or can be measured on the carrier itself or eluted from the carrier. If the label is measured as what remains in solution, the amount of label measured will be directly proportional to the CK-MB content in the sample; the reverse applies if the mark tied to the carrier is used as a target. The label may be any of those commonly known and used in such assays, including, without limitation, radioactive isotopes, fluorescent compounds, chromogenic compounds, or enzymes that catalyze reactions that produce detectable results. In an alternative type of method, a sandwich analysis can be used in which the MB-specific monoclonal antibody according to the invention is used to extract CK-MB in the sample, which is then detected using labeled anti-CK-M or anti-CK-B - for example, antibodies specific to each subunit (or, polyclonal antisera or other monoclonal substances reactive with CK-MB). This analysis can be carried out on a support in solid phase or an Immunoprecipitate can be initially formed and then separated and labeled. The procedure can of course be reversed and anti-CK-M or anti-CK-B can be used as capture immunoglobulin and labeled MB-specific antibodies are used to detect the immunoprecipitate or adsorbate. Antibodies specific for the M or B subunits of CK can be used as either polyclonal or monoclonal preparations. They are available commercially, or can be prepared using standard methods similar to those described above, which are described in the art for these particular specifications. In addition to the above, a direct immunoassay can be performed by incubating the sample to be examined with the MB-specific antibodies according to the invention in which the antibodies or their fragments are immobilized on solid particles such as carrier beads, or on solid surfaces. The beads or other inert solids are then washed and the CK-MB activity bound to the antibody is measured after incubation with a specific CK reagent as the components of a coupled enzyme reaction system. In such methods, the initial incubation can be carried out at room temperature, while the incubation with the CK reagent is often carried out at approx. 37°C. With these methods, which are based on CK activity, it is desirable to take precautions to prevent denaturation. ;Since CK enzymes are known to be relatively unstable in blood serum samples, the addition of a small but activating amount of a sulfhydryl (thiol) compound such as P-mercaptoethanol, cysteine, glutathione or dithiothreltol can be added to the assay reaction medium. See, for example, US-PS 3,403,077 and 3,540,984 regarding the use of such additives. The inert carrier particles can be, for example, glass, silicon dioxide, agarose, dextran, polystyrene, polyvinyl chloride, styrene/divinylbenzene copolymer and other such organic or inorganic materials which can be produced in the form of spherical spheres, although non-spherical surfaces can also used. In addition, magnetized beads can be used to facilitate separation. The beads can be of particle size below one pm or larger, for example up to approx. one centimeter in diameter. The non-spherical surface can be a glass or plastic tube surface, or a microtiter well. In an illustration below, latex balls are used, and these can be polystyrene latex balls of a particle size smaller than approx. a pm in diameter. Such beads are commonly used as carrier particles in antigen/antibody reactions as described, for example, by Singer and Plotz, "Amer. J. Med." (1956) 21:888-892 and TJS-PS 3,088,875. ;There are a number of alternative chemical techniques available. In an illustrated embodiment, CK reagent is a buffered aqueous solution containing effective amounts of creatine phosphate, ADP, glucose, HK, G-6-PDH and NAD, pH approx. 7. The CK reagent components of this embodiment and the latex beads or other inert carriers are well known materials and are also commercially available. Accordingly, the ADP and NAD<+> compounds can be obtained from mammalian muscle tissue, and are generally available commercially as water-soluble salts, usually as the sodium salts. Creatine phosphate is also available from mammalian muscle tissue, while glucose is generally obtained commercially by hydrolysis of corn starch. The HK and G-6-PDH enzymes can be obtained from yeast and other microorganisms as is apparent from, for example, US-PS 3,794,562. The HK enzyme has an absolute cofactor requirement for Mg<+2->ion for activity, and this can be supplied by adding a small but effective amount of a water-soluble magnesium salt, for example magnesium sulfate or magnesium acetate, to the reaction medium. The formation of NADH in this system can be detected spectrophotometrically at 340 nanometers or by fluorescence. In addition, the NADH formed can be used to reduce dyes, such as iodonitrotetrazolium violet (INT) via an electron carrier such as diaphorase, so that colored compounds are formed that can be detected spectrophotometrically in the visible range. Other enzyme systems that generate NADH or NADPH can also be used. In addition, coupled enzyme systems or other devices for detecting specifically one or more of the products from the CK-catalyzed reaction in the chosen direction can be used instead of the specified CK reagent. For example, materials can also be used which form specific colored complexes with creatine or creatine phosphate, or which further react with ATP in any way. In one particular alternative, ATP generated in the creatine kinase reaction can be detected using a luciferase system. This enzyme, extracted from fireflies and commercially available, catalyzes the conversion of luciferin in the presence of oxygen to products of sufficiently lower energy that light is emitted during the course of the reaction. This bioluminescence can be used as a direct method for the detection of CK-MB quantitatively or qualitatively. The following detailed examples further illustrate the invention, although it should be emphasized that the invention is not limited to these. Parts are parts by weight unless otherwise stated. ;Example 1 ;Production and characterization of monoclonal antibodies. Initial experiments showed that immunized A/J mice had much higher antibody titers for CK-MB in their serum than conventionally used BALB/c mice. The procedures were carried out as follows: A. Immunization Procedure: Eight-week-old female A/J mice, H-2a haplotype, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA 04609), were injected intraperitoneally with 25 µg of human creatine kinase-MB emulsified in an equal volume of complete Freund's adjuvant ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178). Four weeks and eight weeks later, the same amount of antigen in incomplete Freund's adjuvant (Sigma Chemical Co.) and phosphate-buffered saline (PBS, 60 mmol/liter sodium phosphate, pH 7.2, containing 150 mmol/liter NaCl) was administered similarly. A final aliquot of 25 µg antigen in PBS was added four days before fusion, at least three weeks after the third injection. The CK-MB isoenzyme used in this immunization was isolated from human heart muscle and purified by a combination of ion exchange chromatography and affinity chromatography. Accordingly, the heart tissue was extracted with a buffer comprising 50 mmol Tris, pH 7.3, containing 100 mmol/liter EDTA, 10 mmol/liter 2-mercaptoethanol (Buffer A). A 40-70% (NH 4 ) 2 SO 4 cut of the tissue extract was dialyzed, and then subjected to DEAE-Sepharose ion exchange column chromatography using a 0-325 mmol/liter NaCl linear gradient in Buffer A. The CK-MB peak was detected by agarose gel electrophoresis. The CK-MB fractions were then subjected to Affi-Gel Blue affinity column chromatography to remove albumin using a 0-250 mmol/liter NaCl gradient in Buffer A to elute CK-MB. Contaminating LDH was removed by subjecting CK-MB to 5'-AMP-"Sepharose" affinity column chromatography which binds NAD<+->dependent dehydrogenases and ATP-dependent kinases. The purified CK-MB was collected in the flow-through, concentrated, dialyzed and stored at -70°C in 50% glycerol. B. FusJonsteknlkk: Spleens were removed aseptically from the immunized mice. Splenocytes (10<8>) were fused with Sp2/0-Agl4 cells (10<7>), a BALB/c myeloma cell line, in the presence of polyethylene glycol (PEG 1500) essentially by the published method of Kohler and Milstein , "Nature" 25b., 495-497 (1975 ). C. Examination: Examination of the hybridomas producing antibodies against CK-MB was performed using solid-phase radioimmunoassay. Goat anti-mouse IgG (H + L) antibodies ("Pel-Freeze" Biologicals, Rogers, AR 72756) (2 mg/liter in 100 mmol/liter sodium borate, pH 8.5, containing 150 mmol/liter NaCl) were coated in 96 well-rounded microtiter plates (Dynatech, Alexandria, VA 22314) by incubating 100 µl goat anti-mouse IgG overnight at 4°C and for 2 hours at 37°C. The plates were washed with "Tween" saline solution (0.5 ml "Tween-20", 8.77 g NaCl, 0.02 g NaN 3 per liter). This was followed by the addition of 100 µl hybridoma supernatant followed by incubation and washing as above. The antibodies present in the supernatants against human CK-MB were detected by adding 100,000 cpm radiolabeled antigen (CK-MB, purified as above) per well and incubating overnight at 4°C. The radiolabeled CK-MB was diluted in PBS containing 10 g/liter bovine serum albumin and 1 mmol/liter 2-mercaptoethanol. The plates were washed, dried, and the bound, radiolabeled CK-MB was counted on a "Packard"-y counter. The results were considered positive if the counts bound to the well were at least twice as large as for the negative control wells containing unrelated hybridoma supernatants. As positive controls, wells were developed using appropriately diluted anti-CK-M subunit and anti-CK-B subunit specific monoclonal antibodies obtained from Hybritech (San Diego, CA 92121). Hybridomas producing antibodies to CK-MB were cloned in soft agar and stored under liquid nitrogen in "Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM) with 10% dimethylsulfoxide and 30% horse serum. D. Purification of Monoclonal Antibody from Ascites: Pristan-primed CAF^/J mice (Jackson Laboratories) were injected intraperitoneally with 10^ hybrid cells, and ascites fluid was collected 1-2 weeks later. Ascites fluid produced by each cell line was collected and stored at -20°C after removal of cell debris by centrifugation. Monoclonal antibody from the ascites fluid was purified using a protein A affinity column system ("MAPS", Bio-Rad, Richmond, CA 94804 ).The antibody peak eluted from the column was concentrated using an "Amicon YM-50" ultrafiltration cell having a molecular weight cutoff of 50,000 Dalton, and then dialyzed against PBS and stored at -70° C. The purity of the monoclonal antibodies was examined by electrophoresis on agarose gel. ;E. Agarose gel electrophoresis: ;Electrophoresis of ascites fluid was performed using agarose gel ("Corning agarose film No. 470100", American Scientific Products, Palo Alto, CA 94306) and barbitol buffer ("PEAB , Corning No. 470180"). Electrophoresis was performed for 40 minutes at 90V. Electrophoretic separation of CK isoenzymes was performed in a similar manner for 30 minutes using Corning Agarose film (No. 4701 04) and "Mopso" buffer: 3-(N-Morfolino)-2-hydroxypropane-sulfonic acid (Corning No. 470046). For staining the proteins, gels were fixed and stained in a mixture of methanol, acetic acid and water (40:10:50) containing 0.125$ "Coomassie blue". The background was destained in the same mixture without "Coomassie blue" sea air drying. F. Isotype determination: Isotyping of the monoclonal antibody was performed by the Ouchterlony radial immunodiffusion technique. (See Ouchterlony, "Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis", Ann Arbor Sc. Publ., 1968). Double immunodiffusion slides and mouse isotype specific antisera were obtained from Miles Scientific, Naperville, IL 60566. ;G. Determination of specificity: The specificity of the monoclonal antibodies was determined by competitive radio-immunoassay. This analysis was similar to the RIA used for examination of hybridoma supernatant, except that the binding of radiolabeled CK-MB to the monoclonal antibodies took place in competition with different concentrations of purified CK isoenzymes. 100 µl of affinity-purified monoclonal antibody (2 mg/liter in PBS containing 10 g/liter bovine serum albumin) was bound to goat anti-mouse IgG immobilized on the microtiter plate. A 100 µl mixture of labeled CK-MB (100,000 cpm) and 0-1000 ng of competing isoenzyme of CK, (CK-BB or CK-MM) was then added and incubated overnight at 4°C. The plates were then washed and dried, and bound radiolabeled CK-MB was counted on a "Packard" y counter. ;The specificity of Conan-MB was confirmed by allowing radiolabeled antibody to bind to CK isoenzymes separated on agarose gel by electrophoresis. After electrophoresis, gels were fixed in a mixture of isopropanol, acetic acid and water (25:10:65) for 30 minutes, washed twice with deionized water for the same period of time and incubated in 50 ml PBS containing 10 g/liter bovine serum albumin (BSA) and 500,000 cpm of ^<25>I-labeled antibody for 4 hours at room temperature. The unbound radioactivity was washed off with PBS. Gels were then dried, exposed to "XAR-5" x-ray film (Eastman Kodak Company, Rochester, NY 14650) for 24 hours at -70°C with an intensifier end, screen and developed in an automatic film processing unit. ;Results ;The above procedures yielded the following results: ;Characterization of monoclonal antibody ;Fusion of the spleen cells from four immunized A/J mice with the BALB/c myeloma cell line Sp2/0-Agl4 generated 13 hybridomas that secreted antibodies against human CK-MB. By competition! tive RIA, eight of the 13 hybridomas were found to produce antibodies specific for human CK-MB that did not recognize human CK-MM or CK-BB. In addition, four hybridomas were found that produced antibodies specific for the B subunit and one antibody specific for the M subunit. Ascites fluid prepared by injection of one of the cloned hybridomas that produced antibody specific for CK-MB (Conan-MB) was characterized by immunodiffusion to be of the IgG-2b subclass with kappa light chains. ;Competitive RIA demonstrating the specificity of Conan-MB is shown in Figure 1. Conan-MB did not recognize CK-MM or CK-BB, even at concentrations up to 10 mg/liter. The specificity of Conan-MB is confirmed using hybrid CK-MB, which gave an identical inhibition pattern to the native CK-MB, purified from human heart. Furthermore, separated radiolabeled Conan-MB bound to CK-MB but not to CK-MM or CK-BB by agarose gel electrophoresis. ;Further characterization revealed that binding of Conan-MB to CK-MB did not appear to affect enzyme activity. This was also the case when CK-MB was extracted from the solution using Conan-MB, immobilized on latex beads. Due to its specificity and ability to extract enzymatically active CK-MB, Conan-MB was used in a clinical assay for direct measurement of CK-MB activity. ;Example 2 ;Determination of CK-MB ;Clinical samples and standards ;Serum samples submitted to the chemistry laboratory at Barnes Hospital or Coronary Care unit laboratory for CK-MB assay were stored at 4<*>C after stabilization to a final concentration of 10 mmol /liter of 2-mercaptoethanol and analyzed over 5 days. Samples were analyzed by the direct CK-MB method of the present invention and also, for comparison, by means of a commercially available two-site enzyme immunoassay ("Enzygnost CK-MB" , Behring Diagnostics, La Jolla, CA 92037).

En varme-inaktivert serumsamling (56°C i 30 minutter) ble fremstilt fra overskudd av sera oppnådd fra kjemilaboratoriet og lagret ved -70°C. Varmebehandlingen var tilstrekkelig til å inaktivere kreatin-kinase-aktiviteten og tillot at serumsamlingen kunne benyttes som en matriks for CK-MB-standarder og fortynning av prøver med høy CK-MB-aktivitet. CK-MB benyttet som standard ble renset som beskrevet ovenfor. Enzymaktiviteten for standarden med høyt innhold ble bestemt med en "Flexigem" sentrifugeanalysator ved 37°C ved anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten i følge Rosalki, "J. Lab. Clin. Med." b9, 696-705 (1967), hvori kreatin-fosfat tjente som substrat og heksokinase og glukose-6-fosfat dehydrogenase var de koblende enzymene (Electronucleonics Inc., Fairfield, NJ 07006). "Calibrator 4" (matriks for BSA) fra "Enzygnost CK-MB"-analysen (Behring Diagnostics) og serumsamlinger av lav og høy CK-MB-aktivitet ble benyttet som kontrollprøver. Alle andre reagenser var innkjøpt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178. A heat-inactivated serum pool (56°C for 30 minutes) was prepared from excess sera obtained from the chemistry laboratory and stored at -70°C. The heat treatment was sufficient to inactivate the creatine kinase activity and allowed the serum collection to be used as a matrix for CK-MB standards and dilution of samples with high CK-MB activity. CK-MB used as a standard was purified as described above. The enzyme activity of the high content standard was determined with a "Flexigem" centrifuge analyzer at 37°C using a modification of the method of Rosalki, "J. Lab. Clin. Med." b9, 696-705 (1967), in which creatine phosphate served as the substrate and hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase were the coupling enzymes (Electronucleonics Inc., Fairfield, NJ 07006). "Calibrator 4" (matrix for BSA) from the "Enzygnost CK-MB" assay (Behring Diagnostics) and serum pools of low and high CK-MB activity were used as control samples. All other reagents were purchased from Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178.

Immobilisering av antistoff på lateksperler Immobilization of antibody on latex beads

Monoklonalt antistoff ble immobilisert ved passiv adsorpsjon på polystyren lateksperler av diameter 0.8 pm ("LB-8", Sigma Chemical Co.). Perlene ble fortynnet 20 ganger til en 5 g/liter suspensjon i belegglngsbuffer (0.1 mol/liter natrlumfosfat, pH 6.0) og pelletisert i en "Eppendorf mlcrofuge" (15.000 x g, 5 min.). Perlene ble resuspendert til 5 g/liter i belegglngsbuffer inneholdende 0.1 g/liter monoklonalt antistoff og inkubert over natten ved 4°C under forsiktig rotasjon. De belagte perlene ble pelletisert, vasket to ganger med Tris-bufret saltvann (TBS) (20 mmol/liter Tris, pH 7.2, 150 mmol/liter NaCl) og resuspendert til 5 g/liter i TBS. Mengden av muse-immunoglobulin som var tilbake i supernatanten ble bestemt ved en sandwich-enzym-immunoanalyse. Mengden av monoklonalt antistoff bundet til lateksperlene ble bestemt ved å subtrahere konsentrasjonen av monoklonalt antistoff som var tilbake i supernatanten fra konsentrasjonen i beleggingsoppløsningen. Mer enn 90$ av antistoffet var bundet til perlene under disse betingelsene, slik at 10 pl av belagt perlesuspensjon inneholdt ca. 1.0 pg monoklonalt antistoff. Monoclonal antibody was immobilized by passive adsorption on polystyrene latex beads of diameter 0.8 pm ("LB-8", Sigma Chemical Co.). The beads were diluted 20 times to a 5 g/liter suspension in coating buffer (0.1 mol/liter sodium phosphate, pH 6.0) and pelletized in an "Eppendorf microfuge" (15,000 x g, 5 min.). The beads were resuspended to 5 g/liter in coating buffer containing 0.1 g/liter monoclonal antibody and incubated overnight at 4°C with gentle rotation. The coated beads were pelletized, washed twice with Tris-buffered saline (TBS) (20 mmol/liter Tris, pH 7.2, 150 mmol/liter NaCl) and resuspended to 5 g/liter in TBS. The amount of mouse immunoglobulin remaining in the supernatant was determined by a sandwich enzyme immunoassay. The amount of monoclonal antibody bound to the latex beads was determined by subtracting the concentration of monoclonal antibody remaining in the supernatant from the concentration in the coating solution. More than 90% of the antibody was bound to the beads under these conditions, so that 10 µl of coated bead suspension contained approx. 1.0 pg monoclonal antibody.

Direkte analvsefremgangsmåte for CK- MB Direct assay method for CK-MB

Analysen for CK-MB bestod av to inkuberinger separert av et vasketrinn. Under den innledende ekstraksjonen eller immunoadsorpsjonsfasen var serum-CK-MB bundet til monoklonalt antistoff immobilisert på lateksperler. Det adsorberte enzymet ble deretter eksponert mot CK-reagens i den enzymatiske fasen. Den resulterende absorbansen ble målt ved 340 nm og var proporsjonal med enzymaktiviteten. The assay for CK-MB consisted of two incubations separated by a washing step. During the initial extraction or immunoadsorption phase, serum CK-MB was bound to monoclonal antibody immobilized on latex beads. The adsorbed enzyme was then exposed to CK reagent in the enzymatic phase. The resulting absorbance was measured at 340 nm and was proportional to the enzyme activity.

Analysen ble utført som følger: The analysis was performed as follows:

(1) Pipetter 100 pl serumprøver, standardoppløsninger eller kontrollprøver i 1.5 ml polypropylenrør fra "Eppendorf mlcrofuge". Standarder ble fremstilt ved fortynnet, renset CK-MB til en aktivitet på ~125 U/liter. Fortynninger av denne oppløsningen ble utført for å tilveiebringe standarder varierende fra 4 til 128 U/liter. Den enzymatiske aktiviteten for standarden med høyt innhold ble målt kinetisk, og aktiviteten for de andre standardene ble beregnet ved anvendelse av den aktuelle fortynningsfaktoren. Tilsett 100 pl varme-inaktivert serumsamling til rør inneholdende standard og ikke-serum-holdig kontrollprøve. Bring volumet til 1 ml med analysebuffer (TBS + 1 mmol/1 2-merkaptoetanol). (2) Tilsett 25 pl monoklonalt antistoff-belagte latekspartikler som inneholder ca. 2.5 pg monoklonalt antistoff. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. (3) Nedkjøl rør i vannbad av 4°C og pelletiser perler i "Eppendorf mlcrofuge" (15.000 x g, 5 min.). Vask perlene to ganger med 1 ml analysebuffer. (4) Resuspender perler i 0.25 ml analysebuffer. Tilsett 0.50 ml CK-reagens. Overfør rørene til et vannbad på 37°C 1 30 minutter. (5) Pelletiser perler, fjern 0.5 ml supernatant og avles A34Q. Beregn U/liter av CK-MB ved sammenligning med stigningen med minstekvadratets regresjon A34Q og aktivitet for standardene. (1) Pipette 100 µl of serum samples, standard solutions or control samples into 1.5 ml polypropylene tubes from the "Eppendorf mlcrofuge". Standards were prepared by diluting purified CK-MB to an activity of ~125 U/liter. Dilutions of this solution were made to provide standards ranging from 4 to 128 U/liter. The enzymatic activity of the high content standard was measured kinetically, and the activity of the other standards was calculated using the relevant dilution factor. Add 100 µl of heat-inactivated serum pool to tubes containing standard and non-serum-containing controls. Bring the volume to 1 ml with assay buffer (TBS + 1 mmol/l 2-mercaptoethanol). (2) Add 25 µl of monoclonal antibody-coated latex particles containing approx. 2.5 pg monoclonal antibody. Incubate for 30 minutes at room temperature. (3) Cool tubes in a 4°C water bath and pelletize beads in "Eppendorf mlcrofuge" (15,000 x g, 5 min.). Wash the beads twice with 1 ml of assay buffer. (4) Resuspend beads in 0.25 ml assay buffer. Add 0.50 ml of CK reagent. Transfer the tubes to a 37°C water bath for 1 30 minutes. (5) Pelletize beads, remove 0.5 ml supernatant and culture A34Q. Calculate U/liter of CK-MB by comparison with the slope with the least squares regression A34Q and activity for the standards.

Absorbansavlesninger ble foretatt med "Flexigem"-sentrifuge-analysatoren. Prøver med verdier >100 U/liter ble gjenanaly-sert etter 2- og 4-gangers fortynning i varme-inaktivert serum. Absorbance readings were taken with the "Flexigem" centrifuge analyzer. Samples with values >100 U/litre were reanalyzed after 2- and 4-fold dilution in heat-inactivated serum.

Analvsefremgangsmåte Analvse procedure

Analysen ble utført i to trinn, og hvert ble optimalisert med hensyn på serumkonsentrasjon, tid og temperatur. Latekspartikler (0.8 pm) ble valgt som den faste fasen på grunn av høyoppnåelig beleggingstetthet og deres lette tilgjengelig-het. Ved konsentrasjonen som ble benyttet for belegging (0.1 g/liter) adsorberes mer enn 95$ Conan-MB til perlene i en suspensjon på 5 g/liter. Ved lavere konsentrasjoner adsorberer tilnærmet 100$ Conan-MB, men den endelig belagte konsentrasjonen er lavere. Ved høyere beleggingskonsentra-sjoner er en større andel av antistoff ikke bundet, hvilket tyder på metning av proteinMndings-setene på perlene. Se figur 2. The analysis was carried out in two steps, and each was optimized with respect to serum concentration, time and temperature. Latex particles (0.8 pm) were chosen as the solid phase due to the high achievable coating density and their easy availability. At the concentration used for coating (0.1 g/liter), more than 95% Conan-MB is adsorbed to the beads in a suspension of 5 g/liter. At lower concentrations, approximately 100$ Conan-MB adsorbs, but the final coated concentration is lower. At higher coating concentrations, a greater proportion of antibody is not bound, which indicates saturation of the protein binding sites on the beads. See figure 2.

Den optimale mengden av immobilisert Conan-MB ble bestemt ved å tilsette økende mengder av en 5 g/liter suspensjon av belagte perler til fire doser av CK-MB i PBS inneholdende 10 g/liter BSA som representerer enzymaktivitet fra 32 til 256 U/liter. Etter en inkubering over natten ved 4°C ble de Conan-MB-belagte perlene pelletisert og vasket. Enzymaktiviteten som ble adsorbert på perlene ble målt som A34Q etter 30 minutters inkubering med CK-reagens ved 37° C, og enzymaktiviteten tilbake i supernatantene ble målt ved kinetisk CK-analyse, også ved 37°C. Omfanget av enzymaktiviteten på perlene øket med økende mengde immobilisert Conan-MB inntil et platå nåes ved 2 pg Conan-MB. Mer enn 90$ CK-MB kunne være bundet ved hver aktivitet av enzymet som ble undersøkt. Tilsvarende konklusjoner kunne trekkes ved undersøkelse av enzymaktiviteten som var igjen i supernatanten. Det er foretrukket å anvende 2.5 pg Conan-MB i analysen. The optimal amount of immobilized Conan-MB was determined by adding increasing amounts of a 5 g/liter suspension of coated beads to four doses of CK-MB in PBS containing 10 g/liter BSA representing enzyme activity from 32 to 256 U/liter . After an overnight incubation at 4°C, the Conan-MB coated beads were pelleted and washed. The enzyme activity adsorbed on the beads was measured as A34Q after 30 minutes of incubation with CK reagent at 37°C, and the enzyme activity back in the supernatants was measured by kinetic CK analysis, also at 37°C. The extent of enzyme activity on the beads increased with increasing amounts of immobilized Conan-MB until a plateau was reached at 2 pg Conan-MB. More than 90$ CK-MB could be bound at each activity of the enzyme examined. Corresponding conclusions could be drawn by examining the enzyme activity that remained in the supernatant. It is preferred to use 2.5 pg Conan-MB in the analysis.

Når CK-MB ble tilsatt til normalt serum, blir en mindre prosentandel av enzymaktivitet adsorbert av immobilisert Conan-MB etter inkubering over natten ved 4°C. Denne effekten fant sted selv ved høye doser antistoff (opp til 16 pg), men syntes å bli minimalisert ved økende fortynning av serum. Det er derfor foretrukket å fortynne 100 pl serum til et volum på 1000 pl med analysebuf fer. Standarder og kont-rollprøver ble blandet med 100 pl varme-inaktivert serum og deretter fortynnet til 1000 pl med analysebuffer. Disse betingelsene tillot ca. 70$ CK-MB i standardene å binde alle dosene undersøkt. Utvinningen av CK-MB ble vurdert ved å tilsette 10.2 U/liter eller 77.9 U/liter til en serumprøve som innledningsvis ble analysert til å være 21.7 U/liter. Utvinningen var henholdsvis 106.9$ og 94.1$. When CK-MB was added to normal serum, a smaller percentage of enzyme activity is adsorbed by immobilized Conan-MB after overnight incubation at 4°C. This effect occurred even at high doses of antibody (up to 16 pg), but appeared to be minimized with increasing dilution of serum. It is therefore preferred to dilute 100 µl of serum to a volume of 1000 µl with analysis buffer. Standards and controls were mixed with 100 µl of heat-inactivated serum and then diluted to 1000 µl with assay buffer. These conditions allowed approx. 70$ CK-MB in the standards to bind all the doses examined. The recovery of CK-MB was assessed by adding 10.2 U/liter or 77.9 U/liter to a serum sample initially analyzed to be 21.7 U/liter. The recovery was 106.9$ and 94.1$ respectively.

Virkningene av temperatur og tid på immunoadsorpsjonstrinnet ble også vurdert. Aktiviteten for CK-MB var konstant i 24 timer ved både romtemperatur og 4°C, som bestemt i supernatantene fra inkubering med kontrollperler (belagt med muse-IgG). Ved 37°C avtok aktiviteten gradvis etter 30 minutters inkubering med kontrollperlene. CK-MB-aktivitet var maksi-malt bundet til de Conan-MB-belagte perlene etter 30 minutter ved romtemperatur eller 2 timer ved 4°C. Etter disse tidene var det en liten reduksjon i bundet CK-MB ved 4°C, men en gradvis økning ved romtemperatur. Disse endringene var forbundet med proporsjonale økninger i CK-MB i supernatantene, dette tyder på dissosiering av CK-MB fra det monoklonale antistoffet eller dissosiering av CK-MB-antistoffkomplekset fra lateksperlene. Det er foretrukket å inkubere prøver med Conan-MB-belagte perler i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av øyeblikkelig nedkjøling i et isvannbad for å minimalisere frigivelsen av CK-MB under de etterfølgende vasketrinnene. The effects of temperature and time on the immunoadsorption step were also assessed. The activity of CK-MB was constant for 24 hours at both room temperature and 4°C, as determined in the supernatants from incubation with control beads (coated with mouse IgG). At 37°C, the activity gradually decreased after 30 minutes of incubation with the control beads. CK-MB activity was maximally bound to the Conan-MB coated beads after 30 minutes at room temperature or 2 hours at 4°C. After these times, there was a slight decrease in bound CK-MB at 4°C, but a gradual increase at room temperature. These changes were associated with proportional increases in CK-MB in the supernatants, suggesting dissociation of CK-MB from the monoclonal antibody or dissociation of the CK-MB-antibody complex from the latex beads. It is preferred to incubate samples with Conan-MB coated beads for 30 minutes at room temperature, followed by immediate cooling in an ice water bath to minimize the release of CK-MB during the subsequent washing steps.

Etter vasking og resuspensjon av perlene ved 4°C, initieres det andre trinnet av analysen ved tilsetning av CK-reagensen og overføring av rørene til et vannbad ved 37°C. Volumet og tiden for inkubering ble innstilt slik at man fikk Å340 på 1.3 for standarder med høyt innhold (~125 U/liter) og A340 på 0.16 for en standard inneholdende 15 U/liter CK-MB, hvilket er den ventede øvre referansegrensen for normale forsøksob-jekter. Økningen i A340 var lineær for konsentrasjoner av standarder undersøkt i løpet av inkuberingen på 30 minutter. Betingelsene for det andre trinnet kan endres ved å øke eller redusere sensitiviteten for analysen. After washing and resuspending the beads at 4°C, the second step of the assay is initiated by adding the CK reagent and transferring the tubes to a water bath at 37°C. The volume and time of incubation were adjusted to obtain Å340 of 1.3 for high-content standards (~125 U/liter) and Å340 of 0.16 for a standard containing 15 U/liter CK-MB, which is the expected upper reference limit for normal experimental objects. The increase in A340 was linear for concentrations of standards examined during the 30 min incubation. The conditions for the second step can be changed by increasing or decreasing the sensitivity of the assay.

En liten mengde (1 mmol/liter) av 2-merkaptoetanol ble tilsatt til analyseblandingen for å øke den enzymatiske aktiviteten og opprettholde stabiliteten. Tilsetningen av 10 mmol/liter fremmer også aktiviteten, men synes å øke dissosieringen av oppfanget enzym fra immobilisert Conan-MB. A small amount (1 mmol/liter) of 2-mercaptoethanol was added to the assay mixture to increase the enzymatic activity and maintain stability. The addition of 10 mmol/liter also promotes the activity, but seems to increase the dissociation of captured enzyme from immobilized Conan-MB.

Innvirkningen av potensielt interfererende stoffer ble vurdert. Under de foretrukne analysebetingelsene ble det funnet at serum ikke påvirket resultatene, selv ved tilstede-værelse ved opp til 80$ av det innledende analysevolumet. Disse resultatene, utført med en inkubering i 30 minutter ved romtemperatur, var forskjellige fra de funnet med inkubering over natten ved 4"C (se ovenfor). Varme-inaktivert serum ble benyttet som en matriks for fortynninger og standarder, idet den tilsynelatende dissosieringen av CK-MB fra lateksperlene var større når serum var tilstede enn når bare buffer var tilstede. Tilsetningen av lyserte røde blodceller som en kilde for adenylatkinase påvirket ikke resultatene selv når hemoglobinet (som en fastsetning av hemolyse) var så høyt som 246 g/liter. Se figur 3. Tilsetningen av opp til 200.000 U/liter av CK-MM eller 250.000 U/liter CK-BB forårsaket bare en ikke-spesifikk effekt. Med slike høye mengder av tilsatt enzym var det bare en gjenværende enzymatisk aktivitet som ikke ble fjernet ved to vaskinger av lateksperlene. Når analysen ble utført med kontrollperler og den lave gjenværende enzymaktiviteten, for eksempel 36 U/liter for 200.000 U/liter CK-MM, var trukket fra, ble det ikke funnet noen innvirkning av CK-BB eller CK-MM. Se figur 3. Disse resultatene ble bekreftet ved gjentatte interferens-undersøkelser ved anvendelse av fire vaskinger av lateksperlene. Ingen innvirkning på grunn av mitokondrisk CK ble funnet. The impact of potentially interfering substances was assessed. Under the preferred assay conditions, serum was found not to affect the results, even when present at up to 80% of the initial assay volume. These results, performed with an incubation for 30 minutes at room temperature, differed from those found with overnight incubation at 4"C (see above). Heat-inactivated serum was used as a matrix for dilutions and standards, as the apparent dissociation of CK-MB from the latex beads was greater when serum was present than when buffer alone was present.The addition of lysed red blood cells as a source of adenylate kinase did not affect the results even when the hemoglobin (as a measure of hemolysis) was as high as 246 g/liter. See Figure 3. The addition of up to 200,000 U/liter of CK-MM or 250,000 U/liter of CK-BB caused only a non-specific effect. With such high amounts of enzyme added, only a residual enzymatic activity was not removed by two washings of the latex beads When the assay was performed with control beads and the low residual enzyme activity, for example 36 U/liter for 200,000 U/liter CK-MM, was subtracted, no fu no effect of CK-BB or CK-MM. See Figure 3. These results were confirmed by repeated interference studies using four washes of the latex beads. No impact due to mitochondrial CK was found.

CV innen analysen (n = 10) ble bestemt to ganger og funnet å være 5.3$ og 9.5$ for en serumsamling med lavt innhold (13.0 U/llter); ble bestemt to ganger og funnet å være 3.2$ og 1.2$ for en serumsamling med høyt innhold (105.1 U/liter). CV-mellomanalysen var 13.2$ for kalibrator 4 (12.8 U/liter) (11 forskjellige dager); 18.7$ for serumsamlingen med lavt innhold (11 analyser) og 4.5$ for serumsaml ingen med høyt Innhold (11 analyser). Intra-assay CV (n = 10) was determined twice and found to be 5.3$ and 9.5$ for a low content serum pool (13.0 U/l); was determined twice and found to be 3.2$ and 1.2$ for a high content serum pool (105.1 U/liter). The CV interim assay was 13.2$ for calibrator 4 (12.8 U/liter) (11 different days); 18.7$ for the low content serum collection (11 analyses) and 4.5$ for the high content serum collection (11 analyses).

Resultatene med den direkte analysen for CK-MB ifølge foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet med to-sete-immunoanalysen anvendt ved Barnes Hospital Clinical Laboratories. Se figur 4. Korrelasjonen var 0.997 og stigningen 0.915, dette indikerer sammenlignbarhet mellom resultatene. The results of the direct assay for CK-MB according to the present invention were compared with the two-seat immunoassay used at Barnes Hospital Clinical Laboratories. See figure 4. The correlation was 0.997 and the slope 0.915, this indicates comparability between the results.

Eksempel 3 Example 3

Direkte analyse på makroperler Direct analysis on macrobeads

En direkte analyse svarende til den angitt i eksempel 2 ovenfor kan også gjennomføres på makroperler av diameter ca. 0.635 cm. Analysen utføres som følger: Flerbrønns reaksjonsbrett, som for eksempel de som er tilgjengelige fra Abbott Laboratories, benyttes for analysen, og 10/pl av 0.2 M p<->merkaptoetanol pipetteres inn i hver brønn. 100 pl prøver av standarder eller forsøksmaterialer benyttes, fortynninger utføres, om nødvendig, i varme-inaktivert serumsamling (EISP). EISP fremstilles ved å oppvarme overskuddet av serum i 30 minutter ved 56°C, og deretter lagre det inkuberte serumet ved -70°C i porsjoner på 50 ml. Standarder fremstilles ved å anvende serie-fortynninger fra den høyeste konsentrasjonsstandarden (S4), som er 10 pl forråds-CK-MB (ca. 62.000 U/liter) i 5 ml EISP og undersøke aktiviteten kinetisk på "Flexigem", som beskrevet I eksempel 2. En standardkurve fremstilles ved å anvende fortynninger av denne standarden (S4), hvorved for en bestemt verdi av S4 på 108 U/liter, S3 inneholder 36 U/liter, S2 inneholder 12 U/liter, og Sl inneholder 4 U/liter. SO er blindprøve. Standardoppløsnlngene er.stabile i 1 uke når de lagres ved 4°C eller i minst 3 måneder når de lagres ved -70°C. A direct analysis similar to that indicated in example 2 above can also be carried out on macrobeads of diameter approx. 0.635 cm. The assay is performed as follows: Multi-well reaction trays, such as those available from Abbott Laboratories, are used for the assay, and 10 µl of 0.2 M p<->mercaptoethanol is pipetted into each well. 100 µl samples of standards or test materials are used, dilutions are carried out, if necessary, in heat-inactivated serum collection (EISP). EISP is prepared by heating the excess serum for 30 minutes at 56°C, and then storing the incubated serum at -70°C in 50 ml aliquots. Standards are prepared by using serial dilutions from the highest concentration standard (S4), which is 10 µl stock CK-MB (approx. 62,000 U/liter) in 5 ml EISP and examining the activity kinetically on "Flexigem", as described in Example 2. A standard curve is prepared by applying dilutions of this standard (S4) whereby for a particular value of S4 of 108 U/liter, S3 contains 36 U/liter, S2 contains 12 U/liter, and Sl contains 4 U/liter . SO is a blind test. The standard solutions are stable for 1 week when stored at 4°C or for at least 3 months when stored at -70°C.

En Conan-MB-perle tilsettes deretter til hver brønn. Perlene fremstilles som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at det i stedet for lateks-mikroperler anvendes polystyren-perler på 0,635 cm med speilblank sluttbehandling. Perlene renses før tilsats til brønnene i 50 mM tris, pE 7.5. A Conan-MB bead is then added to each well. The beads are produced as described in example 2, except that instead of latex microbeads, polystyrene beads of 0.635 cm with a mirror-gloss finish are used. The beads are purified before addition to the wells in 50 mM tris, pE 7.5.

Brønnene inkuberes deretter i 1 time ved romtemperatur på en plattf ormrister ved ca. 150 opm og vaskes deretter på en automatisert vaskeinnretning som "Proquantum" (Abbott Laboratories) ved anvendelse av 10 ml vann per brønn. Hver perle overføres deretter til et separat rør, hvortil det tilsettes 300 pl CK-reagens, som tilsvarer den i eksempel 2, men uten tilsetning av sulfhydrylaktivator som 2-merkaptoetanol. The wells are then incubated for 1 hour at room temperature on a plate shaker at approx. 150 rpm and then washed on an automated washing device such as "Proquantum" (Abbott Laboratories) using 10 ml of water per well. Each bead is then transferred to a separate tube, to which is added 300 µl of CK reagent, which corresponds to that in Example 2, but without the addition of sulfhydryl activator such as 2-mercaptoethanol.

Rørene inneholdende de individuelle perlene inkuberes ved 37°C i 45 minutter før reaksjonen stoppes ved tilsetning av 1 ml farge-stoppereagens som inneholder 100 mM tris, pH 7.5, 5 mM 1,2-diaminocykloheksan-N,N,N',N'-tetraedikksyre (DCTA), 0.1 mg/ml R-jodonitrotetrazolium-fiolett (INT), og 1 U/ml diaforase. Disse reagensene er kommersielt tilgjengelige og ble innkjøpt fra Sigma Chemical Co. The tubes containing the individual beads are incubated at 37°C for 45 minutes before the reaction is stopped by the addition of 1 ml of color-stopping reagent containing 100 mM Tris, pH 7.5, 5 mM 1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N' -tetraacetic acid (DCTA), 0.1 mg/ml R-iodonitrotetrazolium violet (INT), and 1 U/ml diaphorase. These reagents are commercially available and were purchased from Sigma Chemical Co.

Etter at reaksjonen er stoppet fjernes rørene fra vannbadet, og absorbansen avledes ved 492 nm etter 5 minutter. After the reaction has stopped, the tubes are removed from the water bath, and the absorbance is derived at 492 nm after 5 minutes.

Resultatene viste god korrelasjon med CK-MB-konsentrasjon bestemt ved to-sete-immunoanalysen anvendt ved Barnes Hospital Clinical Laboratories. Korrelasjonen var 0.978 og stigningen 0.800 funnet ved sammenligning av 639 prøver, hvilket indikerer sammenlignbarhet av resultatene. The results showed good correlation with CK-MB concentration determined by the two-site immunoassay used at Barnes Hospital Clinical Laboratories. The correlation was 0.978 and the slope 0.800 found when comparing 639 samples, indicating comparability of the results.

Claims

1. Preparation for use in vitro including monoclonal antibody or immunologically reactive derivative thereof, characterized in that the antibody or derivative is immunologically reactive with CK-MB isoenzyme, but not with CK-MM or CK-BB isoenzymes.

2. Preparation according to claim 1, characterized in that the antibody or derivative is cross-reactive with Conan-MB.

3. Preparation according to claim 1, characterized in that the antibody or derivative is Conan-MB or a derivative thereof.

4. Cell line, characterized in that it produces an antibody that is immunologically reactive with CK-MB isoenzyme, but not with CK-MM or CK-BB isoenzymes, and which is constituted by ATCC HB 8939.

5. Use of the preparation according to claim 1 for the determination of CK-MB isoenzyme in a sample, where the sample is brought into contact with the preparation to cause an immunoreaction between CK-MB in the sample and the antibody or derivative thereof in the preparation, and separation of the immunoreacted components from the rest of the sample.

6. Use according to claim 5, where incubation of the sample is carried out with a carrier in solid phase to which the said antibody or derivative thereof is bound; the support is removed from contact with the sample; and the amount of CK-MB bound to the carrier is measured with a CK reagent.

7. Use of a monoclonal antibody specific for CK-MB or an immunologically reactive derivative thereof to purify CK-MB from a mixture, whereby the mixture is brought into contact with the antibody or derivative.