JP2001518453A

JP2001518453A - 悪性腫瘍の生体マーカーとしての改変されたｄｎａシンセソーム成分

Info

Publication number: JP2001518453A
Application number: JP2000513602A
Authority: JP
Inventors: リンダエイチ．マルカス，; ロバートジェイ．ヒッキー，; パメライー．ベッテル，
Original assignee: ユニバーシティオブメリーランド，ボルチモア
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2001-10-16
Also published as: US20060073477A1; AU9673798A; KR20010015672A; AU750082B2; EP1019086A4; EP1019086A1; CA2305625A1

Abstract

(57)【要約】悪性細胞において改変されるＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体が開示される。これらの抗体は、とりわけ、悪性腫瘍を診断、予知、および処置するために、ならびに悪性表現型の存在について細胞、組織、および体液をスクリーニングするためのアッセイにおいて使用され得る。これらの抗体は、細胞における悪性表現型を抑制する能力を有する試験化合物を、その悪性表現型に関連するＤＮＡシンセソームの改変された成分の機能を阻害またはブロックする能力についてアッセイすることによって同定するためにさらに使用され得る。本明細書では、容易に入手しうる体液（例えば、血液、血漿、リンパ液、胸膜液、髄液、唾液、痰、尿、および精液）を使用して、例えば、癌の存在を検出し、なおかつその疾患の段階および患者の予後を評価するために、新生物および悪性状態の存在を最小に侵襲的に検出するための方法およびキットがさらに開示される。体液中のＤＮＡシンセソームの成分の改変された形態の存在を検出することによって、悪性腫瘍を診断および予知することができる。それゆえ、開示される方法およびキットは、悪性腫瘍の診断用生体マーカーとして、ならびに治療の進行および有効性をモニターする手段として使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の開発は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｒｙｌａｎｄ，Ｂａｌｔ
ｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄにより援助された。本明細書に記載されている発
明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ
ＣＡ６５７５４ａｎｄＣＡ７３０６０）および米国陸軍（参照番号ＤＡ
ＭＤ１７−９４−Ｊ−４１５１）からの資金により援助された。政府は一定の権
利を有する。

【０００２】（関連出願の引用）本出願は、１９９７年９月２９日に出願された米国仮出願第６０／０６０，２
４９号および１９９８年５月１２日に出願された同第６０／０８５，２００号に
対して優先権を主張する。さらに、本出願は、１９９８年３月２０日出願の同時
係属中の米国特許出願第０９／０４５，６２４号（「ＤＮＡ複製の活性および忠
実度の測定の方法およびそのキット」と題される)、および１９９８年１１月４日出願の米国特許出願第０９／０５８，７６０号（「ＤＮＡシンセソーム（ｓｙ
ｎｔｈｅｓｏｍｅ）の単離と精製」と題される)の一部係属出願である。これらの出願の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

【０００３】（発明の分野）本発明は、細胞増殖、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、ならびに悪性の細胞や組織に
関連した分子の異常の領域に関する。より詳細には、本発明は、悪性細胞の検出
および処置に関する。

【０００４】（発明の背景）哺乳動物細胞増殖を制御している重要な制御点の1つは、ＤＮＡ複製レベルで起こる。ＤＮＡ合成活性の不適当なレベルやタイミングは、結果として異常な細
胞増殖を引き起こし、また、様々な望ましくない状態を導くことがありうる。こ
れらの状態は、良性の増殖性障害から、致死的な新生物までさまざまである。悪
性腫瘍の効果的な処置は、しばしば病気の早期での悪性細胞の存在を確実に検出
する能力に依存する。それは、効果的な処置が、その疾患がそのような処置に最
も感受性である段階で始めることが出来るためである。従って、当該分野で悪性
細胞の早期検出や処置についての信頼性のある技術が必要である。

【０００５】癌治療の分野において、最も主要な進展の1つは、腫瘍の早期同定のための改善された方法や試験の開発である。多くの場合、これらの方法は、それらが触診
できるかなり前に可能性のある悪性腫瘍の同定へと導く。これらの、早期検出法
には、改良された診断的なＸ線技術や、ＣＡＴスキャン、および検出する癌細胞
特異的抗原を信頼性高く検出しうる高アフィニティー抗体を利用した免疫学に基
づくテストが含まれる。このような抗体に基づくテストのちょうど３つの例とし
て、膀胱癌、前立腺癌、および結腸癌のような特異的ＧＩ管の癌がある。そのよ
うなテストから導かれる陽性の抗体反応は、一般的に疑義のある腫瘍位置の潜在
的な生検および引き続く組織学的な検査によって、患者をさらに検査する必要性
を示している。

【０００６】生検試料が良性か悪性腫瘍かどうかの決定は、一般的に、組織学的検査に続い
て行われる。この方法は、細胞の特色および生検材料の解剖学的な構造を検査す
る。この段階で検査されたパラメーターは、分裂形状の割合（％）や、細胞の見
かけの分化状態、細胞倍数性、ＰＣＮＡ発現のレベル、Ｓ期の細胞の割合（％）
、標本中における血管の存在、および解剖学的境界線の規則正しさを含んでいる
。悪性腫瘍に特徴的な１つまたはそれ以上のパラメーターを有する腫瘍は記録さ
れ、そして組織切除が推奨される。このアプローチは、しばしば結果として、悪
性腫瘍および良性腫瘍の除去を生じる。（例えば、マモグラフィーによって最初
にイメージされた潜在的な乳癌の８５〜９０％は、外科切除後に良性だと分かる
。)一度腫瘍が切除されると、それらは、一連の特定の検査に供され、腫瘍の段階を決定するために、そして特異的受容体の発現、特定の遺伝子の変異、マイク
ロサテライトの不安定性、クロモソームの転位などのような特異的細胞の特徴が
評価される。この情報は、内科医に利用可能な生検や診断学上の情報と組み合わ
され、一般的に、治療方針を決定し、そして患者の予後の決定に利用され得る。
これらの潜在的な悪性腫瘍の画像化および同定の技術の進歩は、癌関連死の絶対
数減少の原因であるが、それらは、しばしば不必要な外科手術や長期入院に導く
。それゆえに、潜在的な悪性細胞を信頼性を持って検出できる迅速で最小に侵襲
性の方法が必要である。また、悪性として認識できる組織学的段階へ進行しては
いないが、悪性状態へと進行し得る潜在的に悪性の細胞を、信頼性を有して検出
し得る事が必要である。

【０００７】（発明の要旨) 本発明の目的は、腫瘍細胞、組織、および体液において悪性腫瘍の存在の生体
マーカーとして見いだされた、ＤＮＡシンセソームの改変された成分を利用する
ことである。この目的に対してさらに、新生物の、とりわけ悪性新生物の診断も
しくは予後を補助するための最小に侵襲性の方法、およびそのためのキットを提
供することが本発明の目的である。悪性状態を有すると推測される患者から得ら
れる細胞、組織、または体液の試料のＤＮＡシンセソームにおける変化が検出さ
れた。ＤＮＡシンセソームの改変された形態またはその成分の１つの同定は、患
者において悪性状態が存在することを示している。

【０００８】転位性の悪性腫瘍を検出する非侵襲性の方法を提供することが本発明のさらな
る目的である。転位性の新生物を有すると思われる患者の体液試料を悪性条件下
で変化したＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体と接触させる。体
液試料中の細胞への抗体の特異的結合は、試料中に悪性細胞が存在をすることを
示している。

【０００９】上述した目的は、すぐに利用でき簡単に得られる体液（たとえば血液や血漿、
リンパ液、胸膜液、髄液、唾液、痰、尿、精液など）を利用することで、成し遂
げられ得る。

【００１０】本発明の目的は、ＤＮＡシンセソームの成分を特異的に認識するか、またはそ
れに結合する抗体の単離され精製された調製物を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は、悪性腫瘍の診断や予後を補助する方法を提供することで
ある。本発明のさらなる目的は、悪性腫瘍の診断や予後のためのキットを提供す
ることである。

【００１２】本発明のなお別の目的は、悪性腫瘍の存在の検出方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、転位性悪性腫瘍の存在の検出方法を提供することであ
る。

【００１３】本発明のさらに他の目的は、細胞の悪性の表現型を抑制する能力について試験
化合物をスクリーニングする方法を提供することである。本発明のなお別の目的
は、細胞の悪性表現型を抑制する能力について、試験化合物をスクリーニングす
るためのキットを提供することである。

【００１４】本発明の別の目的は、悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常機能を回復
するための方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、悪性細胞に
おいてＤＮＡシンセソームの正常機能を回復するための治療組成物を提供するこ
とである。

【００１５】本発明のこれらおよび他の目的は、以下に示される１つもしくはそれ以上の実
施態様によって提供される。

【００１６】本発明の１つの実施態様は、ＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗
体の単離および精製された調製物を提供する。抗体によって認識されるＤＮＡシ
ンセソーム成分は、悪性細胞において改変される。

【００１７】本発明の他の実施態様は、悪性腫瘍の診断または予後を補助するための方法を
提供する。その細胞が悪性であることが予測された組織試料のＤＮＡシンセソー
ムにおける改変が検出される。ＤＮＡシンセソームにおける改変の同定は、組織
試料における悪性細胞の存在を示す。

【００１８】本発明の他の実施態様は、画像化技術を使用することにより患者における悪性
腫瘍の存在を検出するための方法を提供する。悪性の表現型に関連したＤＮＡシ
ンセソームの改変された成分は、当該分野で周知の画像化方法によって可視化す
るために標識され得る。改変されたＤＮＡシンセソームの同定もしくは検出は、
患者における悪性細胞の存在を示す。

【００１９】本発明の他の実施態様は、転位性の悪性腫瘍の存在を検出するための方法を提
供する。転位性の新生物を有すると予測される患者の血液試料を、悪性細胞にお
いて改変されているＤＮＡシンセソームの成分に、特異的に結合する抗体と接触
させる。血液中の細胞への抗体の特異的結合のパターンが観察される。細胞への
抗体の特異的結合は、血液試料中の悪性細胞の存在を示す。

【００２０】本発明の他の実施態様は、細胞の悪性の表現型を抑制する能力について、試験
化合物をスクリーニングする方法を提供する。悪性細胞は試験化合物と接触する
。悪性細胞においてＤＮＡシンテソームの改変された性質が観察される。悪性細
胞におけるＤＮＡシンテソームの改変された成分を修復する試験化合物は、悪性
腫瘍を処置するために潜在的な治療薬である。

【００２１】本発明の他の実施態様は、悪性腫瘍の診断もしくは予後のためのキットを提供
する。そのキットは、悪性細胞において改変されたＤＮＡシンテソームの成分へ
特異的に結合する抗体を含む。

【００２２】本発明の他の実施態様は、細胞の悪性の表現型を抑制するための能力について
、試験化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。そのキットは、単
離され精製された抗体および悪性の生細胞の試料を含む。その単離され精製され
た抗体は、悪性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結
合する。

【００２３】本発明の他の実施態様は、悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの正常な機能
を回復する方法を提供する。その細胞は、悪性細胞において改変されたＤＮＡシ
ンテソームの成分と特異的に結合する抗体と接触する。もしくは、ＤＮＡシンセ
ソーム活性の調製に関与する細胞成分へ結合する抗体と接触する。それによって
、制御因子の活性を改変し、そしてシンセソームの正常な機能を回復する。ＤＮ
Ａシンセソームの正常機能は、抗体−タンパク質相互作用の結果として回復する
。

【００２４】本発明の他の実施態様は、悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常機能回
復のための治療組成物を提供する。その治療組成物は、悪性細胞において改変さ
れたＤＮＡシンセソームの成分へ特異的に結合する抗体ならびに薬理学的に適し
た賦形剤を含む。

【００２５】（好ましい実施様態の詳細な説明）ＤＮＡシンセソームの成分が悪性細胞において改変したこと、ならびにこれら
の改変した成分に特異的に結合する抗体がこれらの悪性細胞の検出や処置に有用
であることが本発明の発見である。

【００２６】ＤＮＡシンセソームは、哺乳動物細胞において存在する多タンパク質のＤＮＡ
複製複合体である（Ｈｉｃｋｅｙら，ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．４１−５４，１９８８；Ｍａｌｋａｓら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２９：６３６２，１９９０；Ａｐｐｌｅｇｒｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：９１，１９９５；Ｌｉｎら，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２１（
６）：５０１−１２，１９９７；Ｃｏｌｌら，ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｓｅｒｃ
ｈ８（１０／１１）４３５−４７，１９９６；ＨｉｃｋｅｙおよびＭａｌｋａ
ｓ，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＧｅｎ
ｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ７６１（２），１２５−７，１９９７；Ｔｏｍら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３，２５９−６７１９９６）。ＤＮＡシン
セソームは、ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡプライマーゼ、ヘリカーゼＩ、ヘリ
カーゼＩＶ、ＤＮＡリガーゼＩ、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩ、
ＤＮＡポリメラーゼδ、ＲＰＡ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、ＲＦ
−Ｃ（アクティベーター−Ｉ）、ポリメラーゼＥ、および増殖細胞核抗原（ＰＣ
ＮＡ）を含む少なくとも３５個のタンパク質を含む（同時係属中の米国特許出願
第０９／０５８，７６０号、およびＣｏｌｌら，ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｓｅａ
ｒｃｈ，９：６２９−６３７，１９９７を参照のこと）。以前の研究に加えて、
本発明者らは、以下のさらなる成分がＤＮＡシンセソームの一部であることが実
証されることを見出した：ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ｈＭＳＨ２（バク
テリアのＭｕｔＳの相同体）、ｈＭＬＨ１（バクテリアＭｕｔＬ相同体）、
ｈＭＳＨ６（バクテリアＭｕｔＳのＧＴＢＰ−相同体）、ｈＰＭＳ１（酵母有
糸分裂分離後プロテイン１の相同体）、ｈＰＭＳ２（酵母有糸分裂分離後プロテ
イン２の相同体）、ＭＹＨ（バクテリアのＭｕｔＹの相同体）、Ｋｕ８０、Ｍ
ＣＭ（ミニ染色体維持タンパク質）、ＴＣＴＰ（翻訳制御腫瘍タンパク質）なら
びにＦＥＮ−１（図１を参照のこと）。さらに、以下のＤＮＡ複製タンパク質、
修復タンパク質、細胞周期タンパク質ならびにヌクレオチド代謝タンパク質は、
ＤＮＡシンセソームに明らかに関連しないことが実証される：ＤＮＡポリメラー
ゼβ、Ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＢ、ＴＦＩＩ（Ｈ）、ＸＰＡ、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、ジヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンセターゼ、チミジル酸キナーゼ
ならびにヌクレオチドジホスホキナーゼ。

【００２７】哺乳動物ＤＮＡシンセソームは、高度に組織化された構造である。多タンパク
質複合体の完全性は界面活性剤、塩、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅでの処理、ＤＥ５
２セルロースまたはＱセファロースクロマトグラフィー、グリセロールまたはス
クロース密度勾配遠心沈降、ならびに非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
後、維持される（同時係属中の米国特許出願第０９／０５８，７６０号、および
Ｃｏｌｌら，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．８：４３５−４４７，１９９６；Ｗｕら，１
９９４を参照のこと）。以前の研究に加えて、本発明者らは、ＤＮＡシンセソー
ム複合体が、先に記載されたように特異的修復タンパク質を含んでいることを見
出した。タンパク質のこの複合体は、インビトロでＤＮＡの複製を完全に可能で
ある（Ａｐｐｌｅｇｒｅｎら．，１９９５；Ｌｉｎら．，１９９６；Ｔｏｍら．
，１９９６）。インビトロでの複製は、Ｍｇ⁺⁺、リボヌクレオチド、ならびにデ
オキシリボヌクレオチド三リン酸、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＳＶ４０の複製起点
を含んだ二本鎖ＤＮＡテンプレート、ならびにＡＴＰの再生可能な供給源を要求
する。

【００２８】あるいは、ＤＮＡシンセソームは、乳房上皮細胞あるいはＨｅＬａ細胞のよう
な任意の哺乳動物細胞型から、Ｍａｌｋａｓら．，１９９０，Ｃｏｌｌら，１９
９６，ならびにＡｐｐｌｅｇｒｅｎら．，１９９５に記載されている方法を使用
して、精製され得る。精製されたＤＮＡシンセソームは、精製された改変成分の
調製のための開始材料として使用され得る。ＤＮＡシンセソーム調製物は、約５
２００倍に精製され、それによって結果として比活性の増加が起こる。

【００２９】異常成分の精製調製物は、少なくとも８０％純粋である。好ましくは、調製物
は約９０〜９９％純粋であり、さらに好ましくは、９５〜９９％純粋である。調
製物の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法のような当該分野で公
知の任意の手段で見積もられ得る。次に、精製された異常成分は、当該分野で公
知の標準的な方法を使用することによりポリクローナル抗体あるいはモノクロー
ナル抗体を調製するために免疫原として使用され得る。

【００３０】非悪性細胞の悪性状態への形質転換は、ＤＮＡシンセソームの少なくとも半分
のタンパク質成分の存在比および／または流動性における有意な変化を伴うこと
が見出された（図２を参照すること）。ＤＮＡシンセソームの改変された成分は
、例えば、そのアミノ酸あるいは遺伝子配列、翻訳後修飾、または改変された発
現レベルが、悪性細胞において、非悪性細胞における対応する成分と比較して、
改変されている、などのシンセソームのタンパク質成分である。

【００３１】非悪性細胞は、ＤＮＡ合成または細胞分化の代表的な形態学的および時間的パ
ターンおよびレベルを示す哺乳動物組織または細胞培養物において見い出される
細胞である。悪性細胞は、ＤＮＡ合成および細胞分裂のレベルが、対応する正常
組織または細胞系統の細胞と比較して、より高いか、または非典型的な時期に起
きる。

【００３２】悪性表現型は、複数の遺伝子突然変異の蓄積を要求する、多段階の過程の結果
として発現する。遺伝子変化が起こり得る機構は、エラーを起こしやすくなる細
胞のＤＮＡ複製プロセスを含む（Ｓｅｋｏｗｓｋｉら，１９９８）。ＤＮＡの伸
長のＤＮＡ合成機構に関連したエラーの頻度の増加は、エラーを起こしやすいＤ
ＮＡ複製プロセスの発生を通しての悪性細胞における突然変異の蓄積を導き得る
。ＤＮＡ複製は、ＤＮＡシンセソーム複合体により統合されるので、シンセソー
ムの成分のいくつかの変化は、複製忠実度における減少と相関し得る。

【００３３】ＤＮＡシンセソームの改変した成分に存在し得るアミノ酸の変化は、保存的も
しくは非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含む。観察し得る翻訳後修飾
には、リボシル化、グリコシル化、硫酸化、ミリスチル化、リン酸化あるいは分
子内結合の変化の存在、または非存在が含まれるが、これに限定されない。シン
セソームのそのような改変された成分の発現レベルは、非悪性細胞における検出
不可能から悪性細胞あたり何千のコピーまでさまざまであり得る。同様に、遺伝
子変化はタンパク質の短縮化を生じ得る。

【００３４】悪性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分は、増殖細胞核抗原（
ＰＣＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼアルファ（ＰｏｌＡ）、および複製タンパ
ク質Ａ（ＲＰ−Ａ）を含むが、これらに限定されない。これら改変の多くは、悪
性組織もしくは細胞系統から精製されたＤＮＡシンセソームのタンパク質成分を
分離するために使用された、銀染色された二次元ポリアクリルアミドゲル中に検
出され得る。その改変物は、非悪性組織または細胞系統から単離された対応する
成分と比較すると、シンセソームの存在比または位置における差異を含んでいる
（図２Ａおよび２Ｂ）。

【００３５】悪性細胞において改変された１つのそのようなタンパク質は、増殖細胞核抗原
（ＰＣＮＡ）である（Ｂｅｃｈｔｅｌら．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，
５８：３２６４−３２６９，１９９８）。ＰＣＮＡは３６ｋＤのタンパク質であ
り、それは、高度に能率的で進化性のＤＮＡ複製活性を媒介するＤＮＡポリメラ
ーゼデルタによって要求されるアクセサリ・ファクターである（Ｈｉｃｋｅｙ
およびＭａｌｋａｓ，１９９６）。悪性細胞から精製されたＤＮＡシンセソーム
は、ＰＣＮＡの２つの型を含んでいる。２つの型は、ＰＣＮＡに特異的に結合す
る、市販の抗体（ＰＣ１０，ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）で染色した、
二次元ポリアクリルアミドゲルのウェスタンブロットにより測定すると同じ分子
量を有する。しかし、ＰＣＮＡの２つの種は、それらの全体の電荷において顕著
な差異がある（図８および例４を参照すること)。従って、ＰＣＮＡの酸性（悪性）および塩基性(非悪性）の種は、二次元ポリアクリルアミドゲルで容易に区別され得る。

【００３６】酸性ＰＣＮＡ種の変化した移動度は、ポリ（ＡＤＰ）リボシル化の欠如を含む
翻訳後修飾の欠損のためである（下記の図１３および実施例４を参照すること) 。シンセソームを構成しているポリペプチドのほぼ半分は、ポリ（ＡＤＰ）リボ
シル化によって翻訳後修飾される（Ｓｉｍｂｕｌａｎら．，Ｂｉｏｃｈ．３５（
３６），１１６２２−３３，１９９６）。いかなる特殊な理論によっても束縛さ
れることは望まないが、シンセソームの成分のいくつかのポリ（ＡＤＰ）リボシ
ル化が、シンセソームのＤＮＡ合成活性を調節し得ると仮定する。

【００３７】酸性ＰＣＮＡは、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、Ｈｓ５７８Ｔ（乳癌）、ＨＬ−
６０（ヒト前骨髄性白血病）、ＦＭ３Ａ（マウス乳癌）、ＰＣ１０（前立腺癌）
、ＬｎＣＡＰ（前立腺癌）、ＬＮ９９（前立腺癌）、ＭＤ−ＭＢ４６８（ヒト乳
癌）、ＭＣＦ−７（乳癌）、ＫＧＥ９０（食道−結腸癌）、ＫＹＥ３５０（食道
−結腸癌）、ＳＷ４８（食道−結腸癌）、およびＴ９８（悪性神経膠腫）のよう
な悪性細胞系統において発現する。酸性ＰＣＮＡはまた、ヒト乳房腫瘍、前立腺
腫瘍、脳腫瘍、ヒト胃腸腫瘍あるいは食道−結腸腫瘍、マウス乳房腫瘍に由来す
る悪性細胞において、およびヒト慢性骨髄性白血病において発現する。酸性ＰＣ
ＮＡは、乳房細胞系統Ｈｓ５７８ＢｓｔまたはＭＣＦ−１０Ａのような非悪性細
胞系統において、または非悪性の血清もしくは乳房のような組織の試料において
検出されない。

【００３８】市販の抗体は、ＰＣＮＡの酸性形態と塩基性形態とを区別しない。実際全ての
市販のＰＣＮＡ抗体は、同一のエピトープを認識した。従って、市販の抗ＰＣＮ
Ａ抗体は、ＰＣＮＡの悪性の形態のみを特異的に検出するためには使用し得ない
。しかし、ＤＮＡシセソーム成分の改変された形態に特異的に結合する抗体が、
悪性細胞の検出のために有用であることを見出した。抗体は、治療薬として組織
または細胞系統においてＤＮＡシンセソームの改変された成分を検出するために
、および細胞増殖に影響を及ぼす能力あるいは悪性表現型を抑圧する能力につい
ての試験化合物をスクリーニングするためのアッセイに使用し得る。

【００３９】抗体は、様々な方法論を使用することにより調製され得る。例えば、精製され
たＤＮＡシンセソームの改変された成分は、改変された成分に特異的に結合する
抗体標品を得るための免疫原として使用し得る。当該分野で公知の任意の方法ま
たは方法の組合わせが、所望の改変されたシンセソームの成分を精製するために
使用し得、これらにはサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ−クロマトグラフィー、結晶化、
等電点電気泳動、および分離用のゲル電気泳動が含まれるがこれらに限定されな
い。二次元ポリアクリルアミドゲルで検出され得る、異常シンセソーム成分（例
えば、酸性ＰＣＮＡ）を含むスポットは、当該分野で公知のようにこのようなゲ
ルから切除され、ポリアクリルアミドから溶出され、そして精製され得る。当業
者は、他のタンパク質、炭水化物、脂質、あるいは細胞内小器官を実質的に含ま
ない各々の異常な成分の調製を生じる方法を容易に選択し得る。

【００４０】好ましい実施様態において、抗体はファージディスプレイ法を使用することで
調製される（Ｗｉｎｔｅｒら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３
３（１９９４）。Ｍ１３のような糸状のファージは、Ｍ１３遺伝子３の産物のよ
うなファージコートタンパク質と免疫グロブリン（ｓｓＶ領域）の可変結合領域
ドメインのフラグメントからなる融合タンパク質をその表面に発現するように操
作され得る。目的の抗原を認識する抗原結合部位を発現するファージは、いくつ
かの方法の１つから選ばれる。（例として）抗原は固定化支持体上に固定され、
そして支持体は、目的の特異的抗原を認識するＶ遺伝子結合領域を発現するファ
ージを含むファージライブラリーと一緒にインキュベートされる。抗原に特異的
に結合する組換えファージは、固定された抗原とファージの相互作用を崩壊させ
るために、十分なイオン強度の溶液でその支持体を洗浄することにより単離され
る。次に、単離されたファージは、大腸菌に感染させるために使用され、そして
、特異的ファージはさらに固定された抗原を使用する単離過程を繰り返すことに
より精製される。その過程は、目的の特異的抗原を認識するファージの実質的に
均一な集団を単離するために３回繰り返される。次に、ファージＤＮＡは単離さ
れ、Ｖ遺伝子領域をコードしているインサートは切り出され、ｃ−ｍｙｃ、Ｌａ
ｃＺα遺伝子およびヒスチジン６量体をコードしているヌクレオチド配列を発現
させる発現プラスミド（ｐＳＹＮ１）へ再びクローン化される。ｃ−ｍｙｃ産物
はｃ−ｍｙｃを特異的に認識する抗体により認識され、そしてニッケルスピンカ
ラムは抗体結合領域をアフィニティー精製するために使用される。抗原結合領域
の大規模の単離は、操作されたｐＳＹＮ１プラスミドでトランスフェクトされた
細菌の高浸透圧のショックによって実施され、次に、ニッケルカラム上に放出さ
れたタンパク質を通過させることによる。

【００４１】本発明の抗体は、悪性疾患において改変されたＤＮＡシンセソームの成分を上
に提示されるエピトープに結合する。好ましくは、エピトープは、他の哺乳動物
タンパク質に存在しない。エピトープは、代表的には連続した約５〜１２アミノ
酸から成り立つ。しかしながら、それより多いアミノ酸もエピトープに寄与し得
る。例として、エピトープが不連続の残基を含むならば、約１４〜５０以上のア
ミノ酸がエピトープを含み得る。ＤＮＡシンセソーム成分においてグリコシル化
またはリボシル化のような翻訳後修飾の存在あるいは非存在はまた、エピトープ
へ寄与し得る。そのうえ、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を、上述の
ように精製された抗原を使用する、当該分野で既知の任意の方法により生産し得
る。

【００４２】改変されたＤＮＡシンセソームの成分へ特異的に結合する抗体は、ウエスタン
ブロットまたは他の免疫化学的なアッセイを使用したとき、他のタンパク質で提
示される検出シグナルより約２〜約２０倍高い検出シグナルが提供される。好ま
しくは、改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体は、免疫
化学的なアッセイにおいて対応する改変されてないタンパク質を検出せず、そし
て溶液から改変されたシンセソーム成分を免疫沈降し得る。

【００４３】本発明の抗体は、当該分野で周知の方法により精製し得る。好ましくは、モノ
クローナルまたはポリクローナル抗体は、ＤＮＡシンセソームの抗原性の成分が
結合したカラム上に抗血清を通過させることによりアフィニティー精製される。
次に、結合した抗体は、例えば、高塩濃度あるいは変化したｐＨの緩衝液を使用
することでカラムから溶出し得る。

【００４４】本発明のこの抗体の使用により検出され得る悪性細胞には、乳房、前立腺、血
液、脳、膵臓、平滑筋または横紋筋、肝臓、脾臓、胸腺、肺、卵巣、皮膚、心臓
、結合組織、腎臓、膀胱、腸、胃、副腎、リンパ節または頚部のような組織にお
ける悪性細胞、あるいは細胞株、例えば、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ４６８、ＨｅＬａ、ＨＬ６０、ＦＭ３Ａ、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５
３、Ｔ９８、ＬｎＣＡＰ、ＬＮ９９、ＰＣ１０、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＫＮ−７、
ＫＧＥ９０、ＫＹＥ３５０、またはＳＷ４８が含まれるが、これらに限定されな
い。このようにして、この抗体は悪性疾患を診断するために使用され得る。この
抗体は、例えば、特定の悪性疾患の進行と、１つ以上の改変された成分のレベル
が相関することにより、悪性疾患の発症の予後の予測のために使用され得る。さ
らに、この抗体は悪性疾患の発症した患者のために潜在的な生存結果の予後の予
測のために使用され得る。

【００４５】本発明のこの抗体を使用する診断および予後の予測をし得る病気には、グリア
芽細胞種の様々な形態、神経膠腫、星細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細
胞腫、黒色腫、大腸癌、肺癌、腺癌、子宮頚癌、卵巣癌、膀胱癌、リンパ芽球腫
、白血病、骨髄腫、乳癌、肝細胞腫、腎細胞腫、副腎癌、前立腺癌、あるいは食
道癌が含まれるが、これらに限定されない。

【００４６】この抗体はまた、悪性疾患の進行、または処置に対する患者の反応を追跡する
ために、継続的に腫瘍の１つ以上の異常なＤＮＡシンセソーム成分のレベルを比
較することにより、悪性腫瘍の段階づけに使用され得る。この抗体はまた、腫瘍
から脱離し、患者の血流に存在している悪性細胞を検出するために、異常成分の
存在について血液試料をアッセイする抗体を使用することにより検出するために
、使用され得る。患者はヒトまたは獣医の患者のいずれかであり得る。

【００４７】細胞は、改変された成分の存在について、当該技術で公知の任意の手段により
本発明の抗体が、特異的に結合するアッセイされ得る。例えば、組織切片または
細胞培養物は、ガラスまたはプラスチックスライド上にマウントされ、そして標
準的な免疫細胞化学の手順によって本発明の抗体と接触され得る。抗体は、放射
活性、蛍光、化学発光、酵素学的なあるいはビオチン化部分のような検出可能な
標識を含み得る。あるいは、抗体と改変された成分との間の特異的な結合を、二
次抗体を使用することにより検出し得る。結合した抗体の検出のための多くのシ
ステムは、当該分野で公知である。あるいは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ
）あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を、可溶化された細胞において抗体
の特異的結合を検出するために使用し得る。本発明の抗体もまた、試験される細
胞または組織からタンパク質を分離するために使用した一次元または二次元ポリ
アクリルアミドゲルのウエスタンブロットにおいて使用し得る。そのような方法
は当該分野で慣用的であり広く実行される。

【００４８】使用される抗体の濃度は、特定の抗体およびＤＮＡシンセソームの異常成分に
対するその親和性に依存する。代表的には、抗体の親和性は約１０⁴Ｍ^-1〜１０⁹ Ｍ^-1である。例えば、上記で議論された免疫化学の方法において使用される特異
的に結合する抗体の濃度は、１ｍｌあたり約２５０から約２０００ナノグラムの
抗体であり得る。または、１ｍｌあたり５０〜５００μｇまでである。好ましい
実施様態において、その抗体はＰＣＮＡの酸性形態だけを認識する。例えば、酸
性ＰＣＮＡに特異的に結合する抗体は、１ｍｌあたり約０．５μｇから約５００
μｇの濃度で使用され得る。

【００４９】本発明の抗体はまた、キットで提供される。そのキットは追加の成分を含み得
る。例えば、血清をブロッキングするための試薬、二次抗体、緩衝液、または抗
体を用いる免疫化学染色、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを実行するための標識試薬を
含み得る。そのキットはまた、悪性疾患の診断あるいは予後の補助として、キッ
トを使用するための使用説明書を含み得る。

【００５０】その抗体は細胞の悪性表現型を抑制する能力について、試験化合物をスクリー
ンするアッセイにおいて使用され得る。そのアッセイは、試験化合物と悪性細胞
を接触させる工程、悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの改変された性質を観
察する工程を含む。本発明の抗体は、そのようなスクリーニングアッセイにおい
て使用するための悪性細胞の生存可能な試料と共に、キットで提供され得る。悪
性細胞は、ＤＮＡシンセソームの改変された性質を発現する、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｍ
ＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨｅＬａ、ＦＭ３Ａ、またはＬＮ９９を含むい
くつかの細胞株由来であり得るが、これらに限定されない。抑制されるべき悪性
の表現型は、増殖の増加、ＤＮＡ合成活性の増加、ＤＮＡ複製の忠実度の減少、
タンパク質発現の変化したレベル、およびＤＮＡシンセソームの改変された成分
のような特徴を含む。

【００５１】ＤＮＡシンセソームの変化した性質は、発現レベルの変化、アミノ酸配列、翻
訳後修飾、またはタンパク質成分の電気移動度、あるいはＤＮＡ合成活性のレベ
ル、または複製の忠実度のレベルのような悪性細胞におけるシンセソームと関連
したいくつかの性質であり得る。ＤＮＡ合成活性または複製の忠実度は、以下に
述べるように測定され得る。好ましくは、ＤＮＡシンセソームの改変された性質
は、改変された成分に特異的に結合する抗体を使用して、検出され得るＤＮＡシ
ンセソームの改変された成分である。最も好ましくは、改変された成分は、ＰＣ
ＮＡの酸性形態である。

【００５２】試験化合物は、悪性の表現型への効果、または他の薬理学的な効果を持つ、当
該分野で既に公知の薬理学的な化合物で有り得るか、あるいは、薬理学的活性を
有することが全く公知でなかった化合物で有り得る。その試験化合物は、天然に
生じ得るか、または研究室内で設計され得る。その試験化合物は、微生物、動物
または植物から単離され得るか、あるいは、組換え的にか、または当該分野で公
知の化学的方法により合成され得る。異常なシンセソームの成分の発現を減少す
るか、精製されたシンセソームのＤＮＡ合成活性のレベルを減少するか、または
精製されたＤＮＡシンセソームの複製の忠実度のレベルを増加する試験化合物は
、悪性の表現型を抑制するために、そして悪性疾患を処置するための可能性のあ
る治療薬である。

【００５３】本発明の抗体はまた、悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常機能を回復
するための治療薬として使用され得る。その抗体は、当該分野で既に公知のいく
つかの方法を使用する、ヒトまたは獣医学の患者において悪性細胞に送達され得
る。例えば、悪性細胞において改変されたシンセソームタンパク質に特異的に結
合する全長の抗体、抗体フラグメント、または抗体融合タンパク質は、そのよう
な患者に投与され得る。

【００５４】好ましくは、その治療組成物は本発明の診断方法を使用して陽性の結果が得ら
れる直後に投与される。治療用組成物の用量および投与手段の両方は、その組成
物の特定の品質、患者の状態、年齢、および体重、処置される特定の疾患の進行
、ならびに、他の関連する要因を基に決定され得る。投与は局所的にあるいは全
身であり得、注射、経口投与、カテーテル投与、そして局部投与を含む。

【００５５】好ましくは、本発明の抗体を含む治療組成物のレセプターを介した標的化送達
は、特定の組織へ抗体を送達するために使用される。乳癌、肺癌、そして卵巣癌
を含む多くの腫瘍は、グリコプロテインｐ１８５^HER2のような悪性細胞へ特異的
な抗原を過剰発現する。これらの抗原に特異的に結合する抗体は、本発明の抗体
を含むリポソームへ結合され得る。患者の血流中に注射されたとき、抗ｐ１８５ ^HER2 抗体はリポソームを標的の癌細胞へ方向付けし、そこでそのリポソームはエ
ンドサイトーシスされ、従って悪性細胞へそれらの含有物を送達する（Ｋｉｒｐ
ｏｔｉｎら．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：６６，１９９７を参照すること）。

【００５６】好ましい実施様態において、ｐ１８５^HER2抗体の標的化送達系は、乳癌細胞に
おいて酸性ＰＣＮＡタンパク質に対して特異的に結合する抗体の送達のために使
用される。リポソームは当該分野で公知のように抗体をロードし得る（Ｐａｐａ
ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８
：１１６４０，１９９１；Ｇａｂｉｚｏｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２：８９
１，１９９２；ＬａｓｉｃａｎｄＭａｒｔｉｎ，ＳｔｅａｌｔｈＬｉｐｏ
ｓｏｍｅｓ，１９９５；ＬａｓｉｃａｎｄＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：１２７５，１９９５；およびＰａｒｋら．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：１３２７，１９９５を参照すること
）。そのようなリポソームは抗酸性ＰＣＮＡ抗体を１μｌのリポソームあたり０
．１〜０．１５ｍｇ含んでおり、そして、約５ｍｇ／ｋｇの範囲で患者に投与さ
れ得る。治療用組成物はエトポシドまたはシトシンアラビノシドのような薬学的
賦形剤、またはアドリアマイシンを含み得る。悪性細胞から精製されたＤＮＡシ
ンセソームは、正常な増殖をする細胞から精製されたシンセソームより２〜８倍
低いＤＮＡ複製の忠実度を有する。このように、精製されたＤＮＡシンセソーム
の機能的性質はまた、悪性細胞を検出するために使用され得る。ＤＮＡ複製の忠
実度は例えば、Ｓｅｋｏｗｓｋｉら．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．ＡｐｐｌｉｅｄＰ
ｈａｒｍａｃｏｌ．１４５：２６８（１９９７）およびＳｅｋｏｗｓｋｉら．
，１９９８において教示されているように、評価され得る。。

【００５７】（実施例）以下は、例示のみ目的で提供され、そして上記に広い範囲の用語において記載
された発明を限定する意図でない。

【００５８】実施例１で議論されている実験は、悪性および非悪性ＤＮＡシンセソームの複
製の特性に関連している。この実施例は悪性ＤＮＡシンセソームがエラー発生し
やすいＤＮＡ複製を媒介することを実証する（実施例１Ａおよび１Ｂ）。しかし
ながら、悪性および非悪性ＤＮＡシンセソームの複製活性は比較的似ていた（実
施例１Ｃ）。従って、複製の忠実度の減少は、複製活性の結果ではない、という
ことが明らかである。図３および４は実施例１における知見と関連している。

【００５９】実施例２で議論されている実験は、悪性胸部細胞および組織においてＰＣＮＡ
の改変された形態（酸性形態）の発見に関連している。実施例２Ａは乳房細胞に
、実施例２Ｂおよび２Ｃは乳房腫瘍および組織に焦点を当てている。図５および
７は実施例２における知見と関連している。

【００６０】実施例３における実験は、他の悪性細胞におけるＰＣＮＡの改変された形態（
酸性形態）の発見に関連している。実施例３Ａは前立腺癌の細胞に、実施例３Ｂ
は悪性食道−結腸細胞に、そして実施例３Ｃは子宮頚癌、脳腫瘍、および白血病
由来の悪性細胞に焦点を当てている。図８から１０は実施例３における知見と関
連している。

【００６１】実施例４における実験はＰＣＮＡの悪性形態の特徴に関連している。実施例４
Ａの結果は、ＰＣＮＡの悪性形態（酸性形態）はポリＡＤＰリボシル化されてい
ないことを示している。実施例４Ｂの結果は、ＰＣＮＡの悪性形態は細胞増殖の
結果でない事を示している。実施例４Ｂの結果は、ＰＣＮＡの悪性形態は遺伝子
変異の結果でないということを示している。図１１から１３は実施例４における
知見と関連している。

【００６２】実施例５における実験は、血液（実施例５Ａ）および血清（実施例５Ｂ）のよ
うな体液におけるＰＣＮＡの悪性形態の発見に関連している。図１４および１５
は実施例５の知見に関連している。

【００６３】実施例６における実験は、悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの他の成分の
改変形態の発見に関連している。実施例６Ａは悪性乳房細胞に見いだされたが非
悪性乳房細胞においては未だ見出されていないポリメラーゼαの改変形態を議論
する。実施例６Ｂは悪性乳房細胞に見出されたが非悪性乳房細胞においては未だ
見出されていないＲＰ−Ａの改変形態を議論する。図１６と１７は実施例６にお
ける知見と関連している。

【００６４】実施例７における実験は、ＤＮＡシンセソームのＤＮＡ複製成分はＤＮＡ修復
成分と密接に関係しているという決定に関連している。共精製ならびに共沈殿の
研究（実施例７Ａ）、およびミスマッチＤＮＡテンプレートを使用したホモポリ
マーならびにヘテロポリマーの競合アッセイ（実施例７Ｂ）を使用することによ
って、ＤＮＡシンセソームの複製成分と修復成分との間のシンセソームの成分の
タンパク質−タンパク質相互作用の強さが実証される。図１８から２０は実施例
７における知見と関連している。

【００６５】（実施例１：複製の忠実度および活性）この実施例は、悪性乳房細胞およびヒト胸部腫瘍から由来するＤＮＡシンセソ
ームがＤＮＡ複製のエラーの易発性を媒介することを実証する。さらに、この実
施例は、悪性および非悪性ＤＮＡシンセソーム複製活性が、比較的似ていること
を実証し、このことは複製の忠実度の減少が複製活性の結果でないことを示す。

【００６６】（実施例１Ａ：ヒト乳房細胞）悪性胸部細胞のＤＮＡ複製装置がエラーの易発性のＤＮＡ複製を行うかどうか
評価するために、培養物中で増殖した悪性および非悪性のヒト乳房細胞から単離
されたＤＮＡシンセソームのＤＮＡ複製の忠実度が調べられた。同時係属中の米
国特許出願第０９／０５８，７６０号で述べられた手順を使用して、悪性ヒト乳
房細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４６８、Ｈｓ５７８Ｔ、およびＭＣＦ−７、ならびに非悪
性ヒト乳房細胞株Ｈｓ５７８Ｂｓｔおよび初期継代ＭＣＦ−１０Ａ由来ＤＮＡシ
ンセソームを単離および精製した。これらの調製物の複製忠実度を同時係属中の
米国特許出願第０９／０４５，６２４号で述べられた手順を使用して評価した。
ＭＣＦ−７から由来したＤＮＡシンセソームは、非悪性ＭＣＦ−１０Ａ細胞のシ
ンセソームよりも発生するＤＮＡにおいてより顕著により多数のヌクレオチドエ
ラーが発生した（表１および図３を参照すること）。詳細には、ＭＣＦ−７Ｄ
ＮＡシンセソームによって発生した変異の頻度は、非悪性ＭＣＦ−１０Ａ細胞か
ら由来したＤＮＡシンセソームによって発生したそれよりも４．４倍以上高かっ
た。同様に、悪性Ｈｓ５７８Ｔ細胞から由来したＤＮＡシンセソームは、それに
遺伝的に一致する対応物であるＨｓ５７８Ｂｓｔからのシンセソームより５．７
倍高いＤＮＡ複製エラー頻度を示した。

【００６７】エストロゲン受容体の陰性の悪性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４６８からのシンセソー
ムはまた、エラーの易発性の機構を使用するＤＮＡ複製を媒介した。ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ４６８シンセソームは、ＭＣＦ−７およびＨｓ５７８Ｔ細胞株からのＤＮＡシ
ンセソームによって実証されたレベルに匹敵するエラーを組み入れる。これらの
データは、悪性ヒト乳房細胞はＤＮＡ複製装置のエラーの傾向性を含む。

【００６８】（実施例１Ｂ：ヒト乳房組織）実施例１Ａにおける結果がヒト乳房組織において起こる分子事象を反映したこ
とを確かめるために、上述の正方向変異誘発アッセイが外科的に切除された、悪
性および非悪性ヒト乳房組織から調製されたＤＮＡシンセソームを使用すること
により行われた。ＤＮＡシンセソームは、Ｓｔａｍｐｆｅｒによって述べられた
プロセスにより精製された（Ｓｔａｍｐｆｅｒ，ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：１０７−１１５，１９８５）。複製忠実度における潜在
的な差異が、患者間の個々の遺伝的多様性のためでないことを確実にするため、
以前に全く処置を受けたことのない数人の異なった乳癌患者から、遺伝的に一致
した（すなわち同じ患者）悪性および非悪性の組織から由来したＤＮＡシンセソ
ームがまた調べられた。悪性乳房組織ＤＮＡシンセソームにより媒介された複製
の忠実度は、遺伝的に一致した非悪性乳房組織から由来したＤＮＡシンセソーム
により実行されたものと比較された。

【００６９】表１にまた示される結果は、悪性乳房組織から由来したシンセソームの複製忠
実度が遺伝的に一致する非悪性乳房組織のシンセソームによって媒介されたそれ
よりも、２．４〜４．４分の１であったことを示す。くわえて、悪性乳房組織か
ら由来したシンセソームについて観察された複製忠実度のレベルは、非悪性乳房
細胞培養（例えば、ＭＣＦ−１０Ａ）から精製されたシンセソームのそれと本質
的に匹敵した。胸部腫瘍組織シンセソームの変異頻度の程度は悪性ＭＣＦ−７細
胞培養から由来した複合体について観察されたそれと似ていた。これらのデータ
は、明確にエラー易発性のＤＮＡ複製装置は、たんに培養された乳癌細胞の特徴
であるのみならず、全ての悪性ヒト乳房細胞に共通する有意な特徴であることを
示している。

【００７０】（実施例１Ｃ：ＤＮＡ複製活性）精製された悪性細胞の複製装置の観察された突然変異頻度の増加は、単にイン
ビトロＤＮＡ合成のレベルにおいての増加に起因するのではないことを確証する
ために、遺伝的に一致した悪性および非悪性乳房組織から由来したＤＮＡシンセ
ソームによって媒介されたＤＮＡ複製レベルが調べられた。これらの異なった組
織から由来したシンセソームと、そのインビトロＳＶ４０ＤＮＡ複製活性（結
果は以下の表２および図４に示す）についてアッセイした（同時係属中の米国特
許出願第０９／０４５，６２４号および公開されている手順Ｃｏｌｌら．１９
９６を参照すること）。活性の１単位は、３５℃で２時間あたりＳＶ４０複製起
点を含むＤＮＡへ取りこまれる１ピコモルの[³²−Ｐ]−ｄＣＭＰとして定義され
た。悪性および非悪性組織の間でＤＮＡ複製活性のレベルにおいて有意な差異は
検出されなかった。これらのデータは、悪性細胞シンセソームについて観察され
た複製忠実度の有意な減少が複製複合体によって示されたインビトロＤＮＡ複製
活性の増加の結果ではないということを実証する。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】（実施例２：悪性胸部細胞および組織における変化したＰＣＮＡ）この実施例は、悪性胸部細胞および組織において、ＤＮＡシンセソーム成分Ｐ
ＣＮＡが、構造的に変化していることを実証する。

【００７３】（実施例２Ａ：ヒト胸部細胞）ＰＣＮＡが悪性胸部細胞において構造的に変化したかどうかを決定するために
、ＤＮＡシンセソームを、樹立された４つのヒト胸部細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４
６８、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ−１０ＡおよびＭＣＦ−７から、本発明者らが公開
した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて
単離した。非悪性の初代胸部細胞は、ヒト胸部切除サンプルから、Ｓｔａｍｐｆ
ｅｒにより記載されるように（Ｓｔａｍｐｆｅｒ、ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ、９：１０７−１１５、１９８５）、調製した。これらの悪性胸部細胞株ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＨｓ５７８Ｔは、動物
の乳癌モデルにおいて腫瘍を生成する（Ｈ．Ｄ．Ｓｏｕｌｅら、Ｊ．Ｎａｔｌ．
ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．５：１４０９（１９７３）が、一方、非悪性胸部細胞株ＭＣＦ−１０Ａは、生成しない（Ｓｏｕｌｅら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０：６０７５（１９９０）、Ｔａｉｔら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５：６０８７（１９９０））。

【００７４】各々５つの細胞／細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＣＦ−７
、ＭＣＦ−１０Ａおよび初代乳房細胞）から単離したＤＮＡシンセソームタンパ
ク質の３０μｇを、個々の２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡ
ＧＥ）に供した。このポリアクリルアミドゲルは、９．２Ｍ尿素、４％アクリル
アミド、２％両性電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成された
。ポリペプチドを、１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭＨ₃ＰＯ₄を用いて形成さ
れたｐＨ勾配に従って分離した。次いで、チューブのゲルを８％アクリルアミド
ＳＤＳゲルに置き、そしてこのポリペプチドを分子量によって分離した。

【００７５】分離したシンセソームポリペプチドを含むゲルを、ニトロセルロースフィルタ
ーへ２０ボルトで、１８時間、転写した。次いで、このフィルターのウエスタン
ブロット分析を、３６ｋＤＰＣＮＡポリペプチド（ＰＣ１０、Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅＳｃｉｅｎｃｅ）に対して指向される抗体を１：１０００の希釈で用いて行った。ウエスタンブロットにおけるＰＣＮＡのプロフィールは光増幅化学発光法
（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）によって示した。

【００７６】細胞由来のＤＮＡシンセソームのＰＣＮＡ成分の移動度と量の比較は、このタ
ンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥプロフィールにおける、悪性対、非悪性細胞型につい
ての、明確でそして有意な差異を示す。この結果を図５Ａから５Ｅに示す。特に
、いずれもＰＣＮＡの酸性型を含む、悪性細胞ＭＣＦ−７（図５Ａ）、Ｈｓ５７
８Ｔ（図５Ｃ）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図５Ｅ）は悪性細胞に特有であ
る。非悪性細胞ＭＣＦ−１０Ａ（図５Ｂ）および非悪性初代胸部細胞（図５Ｄ）
はＰＣＮＡの塩基型のみを含む。

【００７７】非悪性型ＭＣＦ−１０Ａシンセソームに関連するＰＣＮＡは単一種であり、そ
して胸部上皮初代細胞からのＰＣＮＡと同様に（図５Ｄ）塩基ｐＩ（図５Ｄ）を
提示する。。悪性細胞シンセソームはＰＣＮＡの２つの種（図５Ａ、Ｃ、および
Ｅ）、量の少ない種、およびより量の多い種を示す。量の少ないＰＣＮＡ種は非
悪性シンセソームとして観察されたそれらと全く一致する移動度、および塩基性
のｐＩを有する。悪性細胞由来のシンセソームの、より量の多いＰＣＮＡ種は酸
性ｐＩを有する。

【００７８】このように、悪性細胞ＤＮＡシンセソームは、非悪性ＤＮＡシンセソームのＰ
ＣＮＡと比較する場合、変化しているＰＣＮＡ種を含む。

【００７９】（実施例２Ｂ：ヒトおよびマウス胸部腫瘍および胸部組織）この実施例は、乳癌がまたＰＣＮＡの酸性型を発現もすることを実証する。Ｄ
ＮＡシンセソームを、ウイルス的誘導されたマウス乳房腫瘍から、および６つの
ヒト胸部小葉癌組織、４つの胸部管癌組織から単離した。比較のために、２つの
起源（乳房切除手術中に摘出された組織、および乳房腫瘍の患者から得られた非
悪性組織）由来の非悪性胸部組織からのＤＮＡシンセソームに関連するＰＣＮＡ
を分析した。

【００８０】これらの組織から単離されたＤＮＡシンセソームのタンパク質を、上記のよう
に、２ＤＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、そしてＰＣＮＡに対して指向される抗体で探査した。

【００８１】マウスおよびヒトの両方の腫瘍組織から得られたＰＣＮＡが、悪性胸部細胞株
のものと一致する２ＤＰＡＧＥプロフィールを有するということが認められた。これはＰＣＮＡの酸性型および塩基型の両方を示す。非悪性型胸部シンセソー
ムタンパク質のウエスタンブロットにおいて、ＰＣＮＡの塩基型を検出したか、
あるいはＰＣＮＡを検出しなかったのいずれかであった（図６）。特に、図６Ａ
および６Ｂは、ヒト管腫瘍からのＰＣＮＡのタンパク質移動を示す；ＰＣＮＡの
酸性型および塩基型の両方は、悪性度と一致するように存在する。図６Ｃ、およ
び６Ｄは、ヒト小葉腫瘍からのＰＣＮＡのタンパク質移動を示す：ＰＣＮＡの酸
性型および塩基型の両方は、悪性度と一致するように存在する。図６Ｅは非悪性
のヒト胸部組織からのＰＣＮＡのタンパク質移動を示す；ＰＣＮＡの塩基型のみ
が、健康で、疾患のない組織と一致するように存在する。図６Ｆはマウス胸部腫
瘍からのＰＣＮＡのタンパク質移動を示す；ＰＣＮＡの酸性型および塩基型の両
方は、悪性度と一致するように存在する。図６Ｃおよび６Ｅにおいてアッセイさ
れた組織は遺伝的に適合する（同じ患者から得られた）。非悪性の組織サンプル
は、サンプリングした悪性組織に近接する、非悪性腫瘍組織に由来する。

【００８２】従って、悪性乳房腫瘍は、悪性胸部細胞株で発現されたＰＣＮＡの変化した（
酸性の）型を発現する。

【００８３】（実施例２Ｃ：形質転換された細胞株における癌特異的ＰＣＮＡ）この実施例は、ＰＣＮＡの酸性型の出現が、特に細胞の悪性形質転換に関連す
ることを示す。

【００８４】細胞株Ａ１Ｎ４（非悪性の不死化された胸部上皮細胞株）を、２つの安定な細
胞株（Ａ１Ｎ４ｍｙｃおよびＡ１Ｎ４Ｔ）を樹立するために、癌遺伝子ｃ−ｍｙ
ｃおよびＳＶ４０Ｔ抗原で形質転換した。このＡ１Ｎ４、Ａ１Ｎ４ｍｙｃ、およ
びＡ１Ｎ４Ｔ細胞株は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成性ではない。ＤＮＡシン
セソームを非悪性の胸部細胞株Ａ１Ｎ４、および、形質転換された非悪性の胸部
細胞株Ａ１Ｎ４ｍｙｃならびにＡ１Ｎ４Ｔから、上記に詳細に記載した手順で単
離した。この成分は既出の実施例に記されたように、２ＤＰＡＧＥにより分離した。ＰＣＮＡに対して指向される抗体を用いたウエスタンブロット分析を、図
７に各々の細胞株について示す。親の細胞株（Ａ１Ｎ４）（図７Ａ）は、癌に特
異的な、ＰＣＮＡの酸性型を含まない。しかし、ｃ−ｍｙｃ遺伝子およびＳＶ４
０Ｔ抗原で形質転換された非悪性細胞株、Ａ１Ｎ４ｍｙｃ（図７Ｂ）およびＡ１
Ｎ４Ｔ（図７Ｃ）は、特異的に癌に関連する、ＰＣＮＡの変化型を含む。ＳＶ４
０Ｔ−抗原とともに、Ａ１Ｎ４細胞株において過剰発現したｃ−ｍｙｃ遺伝子は
、ＰＣＮＡの酸性型のみの過剰発現をもたらした。

【００８５】従って、この知見は、ＰＣＮＡの型の変化が癌遺伝子的な細胞形質転換事象か
らもたらされることを実証する。

【００８６】（実施例３；他の細胞および組織におけるＰＣＮＡの悪性型）この実施例は、変化したＰＣＮＡが他の癌タイプに見られることを実証する。

【００８７】ＤＮＡシンセソームを、ＬＮＣａＰ、ＰＣ５０、ＫＧＥ９０、ＫＹＥ３５０、
ＨＬ６０、ＨｅＬａ、Ｔ９８および白血病細胞ペレットから、公開されている手順（わずかに改変した）（Ｃｏｌｌら、１９９６）に従って単離した。簡略に
は、細胞ペレットを、２００ｍＭショ糖、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、５ｍＭＫＣ
ｌ、２ｍＭＤＴＴおよび０．１ｍＭＰＭＳＦを含む緩衝液中でＤｏｕｎｃｅ
ホモジナイズし、そして、細胞残滓および核のペレットを除くために遠心分離し
た。ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを、上清に最終濃度５ｍＭで加えた。１容量の核抽
出緩衝液（３５０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＰＭＳＦ
）をそのペレットに加え、そして４℃で２時間、振とうした。この上清を１８，
０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。この上清を取り出し、そして６０，０００
ｒｐｍで２２分間、遠心分離した。得られた上清を収集した（Ｓ３画分）。この
核ペレットを、２２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。この上清を取り出し
、そして６０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた上清（ＮＥ画分
）をＳ３画分と混合し、２Ｍショ糖クッションの上部に上層し、そして４０，０
００ｒｐｍで、一晩、遠心分離した。このシンセソーム画分を分析のために集め
た。

【００８８】（実施例３Ａ：前立腺癌細胞）ＤＮＡシンセソームを、本発明者らの公開した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ
．Ｒｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて前立腺癌から単離した。この悪性細
胞株、ＬｎＣＡＰおよびＰＣ１０は動物の前立腺癌モデルにおいて腫瘍を生じる
。

【００８９】各々の悪性細胞株、ＬｎＣＡＰおよびＰＣ１０から単離したＤＮＡシンセソー
ムタンパク質の３０μｇを、個々の２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２
Ｄ−ＰＡＧＥ）に供した。このポリアクリルアミドゲルは、９．２Ｍ尿素、４％
アクリルアミド、２％両性電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成されていた。ポリペプチドは、１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭＨ₃ ＰＯ₄を用いて形成されたｐＨ勾配により分離した。次いで、チューブのゲルを８％アクリルアミドＳＤＳゲルに置き、そしてポリペプチドを分子量によって分
離した。２つの細胞型のＰＣＮＡ種を直接的に比較するために、ＬｎＣＡＰとＰ
Ｃ１０シンセソームタンパク質の各々の３０μｇの混合物について第三の２Ｄ−
ＰＡＧＥを実施した。

【００９０】分離されたシンセソームポリペプチドを含有するこのゲルを、２０ボルトで１
８時間、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いで、このフィルターのウ
エスタンブロット分析を、３６ｋＤのＰＣＮＡポリペプチドに対して指向される抗体（ＰＣ１０、ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）を、１：１０００の希
釈で用いて、行った。この３つのウエスタンブロットにおけるＰＣＮＡのプロフ
ィールは光増強化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）により示した。この結果を、図８Ａと図８Ｂに示す。特に、ＬｎＣＡＰ（図８Ａ）およびＰＣ１０（図
８Ｂ）由来の悪性細胞は悪性細胞に特有のＰＣＮＡの酸性型を含む。

【００９１】従って、悪性前立腺細胞のＤＮＡシンセソームは、非悪性のＤＮＡシンセソー
ムのＰＣＮＡと比べた場合、変化しているＰＣＮＡの種を含む。

【００９２】（実施例３Ｂ：悪性食道結腸癌細胞）ＤＮＡシンセソームを、本発明者らの発表した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ
．Ｒｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて食道結腸癌細胞から単離した。悪性
細胞系、ＫＧＥ９０、ＫＹＥ３５０およびＳＷ４８は動物の食道−結腸癌モデル
において腫瘍を生じる。

【００９３】それぞれの悪性細胞系から単離したＤＮＡシンセソームタンパク質の３０μｇ
を、個別の２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に供した
。このポリアクリルアミドゲルは９．２Ｍ尿素、４％アクリルアミド、２％両性
電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成されていた。ポリペプチドは、１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭＨ₃ＰＯ₄を用いて形成されたｐ
Ｈ勾配により分離した。次いで、チューブのゲルを、８％アクリルアミドＳＤＳ
ゲルに置き、そしてポリペプチドを分子量によって分離した。２つの細胞型のＰ
ＣＮＡ種を直接的に比較するために、ＫＧＥ９０、ＫＹＥ３５０およびＳＷ４８
シンセソームタンパク質の各々の３０μｇの混合物について第三の２Ｄ−ＰＡＧ
Ｅを実施した。

【００９４】分離されたシンセソームポリペプチドを含有するこのゲルを、２０ボルトで１
８時間、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いで、このフィルターのウ
エスタンブロット分析は、３６ｋＤのＰＣＮＡポリペプチド（ＰＣ１０Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）に対して指向される抗体を、１：１０００の希釈で用いて、行った。この３つのウエスタンブロットにおけるＰＣＮＡのプロフィ
ールは光増強化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）により示した。この結果を、図１３Ａと図１３Ｃに示す。特に、ＫＧＥ９０（図９Ａ）、ＫＹＥ３５０（
図９Ｂ）およびＳＷ４８（図９Ｃ）由来の悪性細胞は悪性細胞に特有なＰＣＮＡ
の酸性型を含む。

【００９５】従って、悪性の食道結腸細胞ＤＮＡシンセソームは、非悪性のＤＮＡシンセソ
ームのＰＣＮＡと比べた場合、変化しているＰＣＮＡの種を含む。（実施例３Ｃ：他の癌細胞）ＤＮＡシンセソームを、本発明者らの発表した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ
．Ｒｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて食道結腸癌細胞から単離した。悪性
細胞株であるＨｅｌａ（頚部の癌細胞株）、Ｔ９８（神経膠腫瘍細胞株）および
Ｈｌ６０（白血病細胞株）は、動物の癌モデルにおいて腫瘍を生じる。

【００９６】それぞれの悪性細胞株ＨｅＬａ、Ｔ９８、およびＨｌ６０から単離したＤＮＡ
シンセソームタンパク質の３０μｇを別個の２次元ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）にかけた。このポリアクリルアミドゲルは、９．２Ｍ尿
素、４％アクリルアミド、２％両性電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成されていた。ポリペプチドを１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭ
Ｈ₃ＰＯ₄を用いて形成されたｐＨ勾配により分離した。次いで、チューブのゲ
ルを８％アクリルアミドＳＤＳゲルに置き、そしてポリペプチドを分子量によっ
て分離した。２つの細胞型のＰＣＮＡ種を直接的に比較するために、ＨｅＬａ、
Ｔ９８およびＨＬ６０シンセソームタンパク質の各々の３０μｇの混合物につい
て第三の２Ｄ−ＰＡＧＥを実施した。

【００９７】分離されたシンセソームポリペプチドを含有するこのゲルを、２０ボルトで１
８時間、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いで、フィルターのウエス
タンブロット分析を、３６ｋＤのＰＣＮＡポリペプチド（ＰＣ１０Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）に対して指向される抗体を、１：１０００の希釈で用いて、行った。この３つのウエスタンブロットにおけるＰＣＮＡのプロフィール
は、光増強化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）により示した。この結果を、図１０Ａ〜図１０Ｃに示す。特に、ＨｅＬａ（図１０Ａ）、Ｔ９８（図１０Ｂ
）およびＨＬ６０（図１０Ｃ）由来の悪性細胞は、悪性細胞に特有なＰＣＮＡの
酸性型を含む。

【００９８】従って、悪性細胞ＤＮＡシンセソームは、非悪性のＤＮＡシンセソームのＰＣ
ＮＡと比べた場合、変化しているＰＣＮＡの種を含む。（実施例４：ＰＣＮＡの悪性型）（実施例４Ａ：変化したＰＣＮＡのリボシル化）この実施例は、悪性胸部細胞におけるＰＣＮＡの酸性型がポリ（ＡＤＰ）リボ
シル化されていないことを実証する。

【００９９】悪性ＭＣＦ−７細胞を、〔³²−Ｐ〕−ＮＡＤ⁺で標識した。悪性（ＭＣＦ−７）および非悪性（ＭＣＦ−１０）の胸部細胞ペレットを、３０ストロークのＤｏ
ｕｎｃｅホモジナイザーを用いてホモジナイズした。それぞれの懸濁液の１００
μｇを、ＰＣＮＡ抗体とインキュベートした。ＰＣＮＡ抗体のレベルは、そのタ
ンパク質についてその画分を完全に免疫学的枯渇させるのに十分であった。

【０１００】このシンセソーム画分からＰＣＮＡの免疫沈降に続き、免疫沈降したＰＣＮＡ
の種を上記のように、２Ｄ−ＰＡＧＥで分離した。次いで、この分離したポリペ
プチドをニトロセルロースフィルター膜に転写した。次いで、分離したＰＣＮＡ
ポリペプチドのウエスタンブロット分析を、抗ポリ（ＡＤＰ）リボース部分抗体
（ＭａｒｃＳｍｕｌｓｏｎより寄贈）を、１：５００の希釈で用いて、実施し
た。ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ法を用いて、免疫反応性のペプチド種を検出した。

【０１０１】このように得られたウエスタンブロットは、悪性細胞における、酸性のｐＩ値
を有する（上記、実施例１を参照のこと）ＰＣＮＡの特有の型が、ポリ（ＡＤＰ
）リボシル化（図１３）されていないことを実証する。悪性および非悪性の細胞
の両方でみられるＰＣＮＡの塩基型はポリ（ＡＤＰ）−リボシル化されている。

【０１０２】（実施例４Ｂ：細胞増殖研究）この実施例は、悪性細胞で検出されたＰＣＮＡの酸性型が、細胞増殖の結果で
はないことを実証する。

【０１０３】ＰＣＮＡの酸性型の豊富なレベルが、増殖反応に反対する悪性胸部細胞に特有
の特性であるかどうかを検出するために、エストロゲン刺激性ＭＣＦ−７細胞、
コントロールＭＣＦ−７細胞、および良性増殖性乳房腫瘍から単離したＰＣＮＡ
のＰＣＮＡプロフィールを分析した。エストロゲンは細胞の増殖に対して刺激性
の効果を有していることが示されている（ＬｅｖｅｎｓｏｎＡ．およびＪｏｒ
ｄａｎＶ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７：３０７１（１９９７））。

【０１０４】３０〜６０μｇのＤＮＡシンセソームを、各々の細胞または組織から、上記の
工程により単離した。

【０１０５】エストロゲン刺激された細胞がコントロール細胞に比較して増殖の速度を増加
させたことが、いくらかのパラメーター（³Ｈチミジン取り込み、ポリメラーゼ活性およびフローサイトメトリー）で実証されたように、および他の刊行物（Ｌ
ｅｖｅｎｓｏｎ，Ａ．およびＪｏｒｄａｎ，Ｖ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５７
：３０７１（１９９７））；Ｋｙｕｎｇ−Ｓｕｎ，Ｋ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅ
ｎｅｓｉｓ１８：２５１−７７（１９９７）；Ｍ．Ｂｒｏｗｎ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／ＯｎｃｏｌｏｇｙＣｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．８：１０１（１９９
４））で記載されたように、認められた。以下の表３を参照のこと。

【０１０６】

【表３】これらの細胞からのＤＮＡシンセソームを単離し、そして成分を２Ｄ−ＰＡＧ
Ｅで分離し、そしてニトロセルロース膜に転写した。この膜を上記のように抗Ｐ
ＣＮＡ抗体でプローブした。コントロールおよびエストロゲン処理細胞の両方に
おいて同様の２ＤＰＡＧＥプロフィールが観察された（図１１を参照のこと）。特に、エストロゲン処理したＭＣＦ−７細胞（図１１Ａ）で認められた２ＤＰＡＧＥプロフィールは未処理のＭＣＦ−７細胞のプロフィールと同一であり（
図１１Ｂ）、この両者は悪性疾患に特有のＰＣＮＡの酸性型を含んでいた。良性
乳房腫瘍組織（図１１Ｃ）はＰＣＮＡの塩基型のみを含んでいた。このように酸
性ＰＣＮＡは悪性腫瘍の生物マーカーであり、これは正常組織にも良性腫瘍にも
存在しない。

【０１０７】４つの良性の増殖性乳房腫瘍からのＤＮＡシンセソームも単離した。これらの
腫瘍からのシンセソームタンパク質の２ＤＰＡＧＥプロフィールはわずかなレベルのＰＣＮＡを示した。これらの結果は、ＰＣＮＡの酸性型は悪性細胞に独特
であり、そして細胞増殖の結果ではないということを実証する。

【０１０８】これらのデータはＰＣＮＡの酸性型は悪性胸部細胞に特有であるという強い証
拠を提供する。

【０１０９】（実施例４Ｃ：変化したＰＣＮＡの遺伝子分析）この実施例は、遺伝的変異体が悪性細胞におけるＰＣＮＡ酸性型の原因ではな
いということを実証する。ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ａ細胞から単離した、
細胞の全ＲＮＡを、各々の細胞株から、全ＰＣＮＡ翻訳単位をコードするｃＤＮ
Ａをクローニングするために用いた。このｃＤＮＡは指数関数的に増殖するＭＣ
Ｆ−７およびＭＣＦ−１０Ａから単離された全細胞ＲＮＡから、逆転写酵素ＰＣ
ＴおよびベクターｐＣＲ２．１を用いて、クローニングした。ＭＣＦ−７細胞に
由来するＰＣＮＡ遺伝子をコードする４つの独立クローン、およびＭＣＦ−１０
Ａからの４つの独立クローンを配列決定した。ｃＤＮＡを含むアンピシリン抵抗
性コロニーを、ブルー／ホワイト選択アッセイを用いて選んだ。そして、選択し
たコロニーからＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを単離し、ヌクレオチド配列分析のために、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｒｙｌａｎｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｂ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙに送った。配列分析は、これら
の８つの独立したコロニーが一つの同一のヌクレオチド配列を有していることを
示した（図１２、Ａ−Ｃの個所、配列番号１〜３を参照のこと）。さらに、この
ヌクレオチド配列はヒトリンパ肝細胞株ＭＯＬＴ−４（図１２Ａ、Ａｌｍｅｎｄ
ｒａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１５７５−
１５７９、１９８７）由来の、ＰＣＮＡ遺伝子クローンとして公表された配列の
ヌクレオチド配列と異なっていない。

【０１１０】（実施例５：体液中でのＰＣＮＡの悪性型）この実施例は、ＰＣＮＡの変化した酸性型は癌患者の血液および血清の両方か
ら容易に検出され得るが、癌のない患者の血清には検出されないことを実証する
。特に、ＩＩＩ期の乳癌患者の血清ならびに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急
性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の血液を研究した。

【０１１１】白血病のサンプルに関しては、ＣＭＬサンプルはＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａ
ｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒの協力によりＭｏｓｈｅＴａｌｐａｚ博士から得た。Ａ
ＭＬサンプルはＧｒｅｅｎｅｂａｕｍＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒの協力により
ＬｙｎｎＡｂｒｕｚｚｏ博士から入手した。

【０１１２】腺管内癌の患者から採取した血清をＤｏｕｎｃｅホモジナイズし、そして２５
００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１容量の核抽出緩衝液（３５０ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、５ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、および０．１ｍＭＰＭＳＦ）をペレットに加え、そ
して４℃で２時間、振とうした。この核ペレットを２２，０００ｒｐｍで３分間
遠心分離した。上清を採取し、そして６０，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離
した。この上清を採取し、そして分析に用いた。

【０１１３】ＤＮＡシンセソームは、以上に詳細に記載されたプロセスで試料から単離し、
精製した。シンセソームの成分は２ＤＰＡＧＥで分離し、そしてＰＣＮＡに対して指向される抗体を用いて、ウエスタンブロット分析に供した。次いで、この
ＰＣＮＡの電気泳動移動度を測定した。

【０１１４】具体的には、このＤＮＡシンセソームタンパク質（２０〜４０ｍｇ）を一次元
目のチューブゲル（９．２Ｍ尿素、４％アクリルアミド、２％両性電解質（ｐＨ
３〜１０）、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にロードした。ポリペプチドを１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭＨ₃ＰＯ₄を用いて形成されたｐＨ
勾配により分離した。チューブのゲルを、８％アクリルアミドＳＤＳゲルの上に置き、そしてポリペプ
チドを分子量によって分離した。次いで、タンパク質を電気泳動的にニトロセル
ロース膜に転写した。ＰＣＮＡに対して指向される抗体（ＰＣ１０、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）を１：１０００の希釈で用いた。ＰＣＮＡの免疫検出は光増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて施行した。

【０１１５】（実施例５Ａ：乳癌患者におけるＰＣＮＡ）胸部悪性疾患の検出のための腫瘍マーカーとして潜在的に有利で有り得るため
には、ＰＣＮＡの変化型は、乳癌患者の血清中に容易に検出可能であるべきであ
る。癌発達の評価において、特異的な腫瘍マーカーについての血清試料分析は、
乳癌患者の進行度の診断およびモニタリングに使用するための満足のいくマーカ
ーを同定するのには失敗してきた（Ｈａｙｅｓ、１９９６；Ｓｃｈｗａｒｔｚら
、１９９３）。一般に、ＰＣＮＡは、患者の予後を予想するための腫瘍マーカー
としては、非常に有用ではなかった（Ｈａｅｒｓｌｅｖら、１９９６；Ｓｃｈｍｉｔｔら、１９９４）。本研究では、ＰＣＮＡの変化型は腺管内乳癌ＩＩＩ期
の患者から採取された血清中に容易に検出され得ること、およびＰＣＮＡは癌の
ない被検体の血清からは検出可能でないことを実証した。この知見は、ＰＣＮＡ
についての血清試験が、乳癌患者において、残留疾患あるいは疾患再発の検出の
ために有益であり得ることを示唆する。

【０１１６】ＰＣＮＡの悪性型が、乳癌を有する個体を確認するための、有用なマーカーで
あり得るかどうかを決定するために、乳癌患者から採取した血清をＰＣＮＡの酸
性型の存在について調べた。乳腺管内乳癌のＩＩＩ期の乳癌患者から採取した血
清試料を、ＰＣＮＡに対して指向される抗体を用いて、２ＤＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により分析した。このウエスタンブロット分析は、血清サ
ンプルがＰＣＮＡの変化型を含むことを示した（図１４Ａ）。ＰＣＮＡは二人の
癌のない被検体から採取したコントロールの血清サンプルには検出されなかった
。この結果は、ＰＣＮＡの癌特異型が、腫瘍細胞から末梢血中に放出されたこと
を示した。さらに、このデータは非悪性細胞は検出可能なレベルのＰＣＮＡを放
出しないことを示す。

【０１１７】（実施例５Ｂ：白血病患者におけるＰＣＮＡ）ＣＭＬの発達と進行におけるＰＣＮＡの役割は、十分には特徴づけられていな
い。ＣＭＬは、芽球期に続く、早期慢性期で特徴づけられる二相性の疾患である
（Ｚａｃｃａｒｉａら、１９９５）。Ｔａｋａｓａｋｉら（１９８４ｂ）は、Ｐ
ＣＮＡを発現する白血球の数と、ＣＭＬ芽球期の間の血中の芽球細胞のパーセン
トの間に相関があることを実証した。これらの研究者はまた、ＣＭＬの芽球期の
間に末梢血中でＰＣＮＡ陽性である非芽球細胞の存在を同定した。この結果は、
非芽球細胞が慢性期にＰＣＮＡ陰性であるという観察（Ｔａｋａｓａｋｉら、１
９８４）と異なっている。ＣＭＬ細胞のＰＣＮＡ標識指数は正常骨髄細胞と有意
に異ならない（Ｔｈｉｅｌｅら、１９９３）。しかし、慢性骨髄性増殖性疾患で
ある骨髄繊維症（ｏｓｌｅｍｙｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）において、ＰＣＮＡ標識
指数の有意な上昇がある（Ｔｈｉｅｌｅら、１９９４）。インターフェロン処置
はＰＣＮＡ標識の減少をもたらした。本研究において、この結果は、調べた白血
病サンプルがＰＣＮＡの変化型を含み、一方、癌のない被検体から採取した試料
はＰＣＮＡの変化型を含まなかったことを実証した。

【０１１８】慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者からの
血液試料を、ＰＣＮＡの酸性型が存在するかどうかを決定するために分析した。
ＰＣＮＡで示されたタンパク質移動パターンを図１４に示す。ＰＣＮＡの酸性型
は、ＡＭＬサンプル（図１４Ｂ）およびＣＭＬの全サンプル（図１４Ｃ−Ｅ）で
同定された。

【０１１９】（実施例５Ｃ：癌のない血清でのＰＣＮＡ欠如）癌のない患者からの血液サンプルをＰＣＮＡの酸性型が存在するかどうかを決
定するために分析した。ＤＮＡシンセソームを、上記のプロセスによりサンプル
から単離した。その成分を、２ＤＰＡＧＥで分離し、続いてＰＣＮＡに対して指向される抗体を用いてウエスタンブロット分析した。この移動パターン分析の
結果を図１５に示す。ＰＣＮＡの酸性型は癌のない血清には検出不能であった。

【０１２０】血清および血液は詳細に議論したが、リンパ、胸膜液、脊髄液、唾液、痰、尿
、および精液のような他の容易に入手可能で、容易に獲得できる体液を利用し得
ることは明白である。

【０１２１】（実施例６：悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの変化した成分）この実施例はＤＮＡシンセソームの他の成分が悪性細胞では構造的に変化して
いることを実証する。

【０１２２】（実施例６Ａ：ポリメラーゼαの変化型）悪性胸部細胞において、ＰｏｌＡ（ポリメラーゼα）が構造的に変化している
かどうかを決定するために、４つの樹立されたヒト胸部細胞株ＭＣＦ−１０Ａお
よびＭＣＦ−７から、本発明者らが公開した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒ
ｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて、ＤＮＡシンセソームを単離した。悪性
胸部細胞株ＭＣＦ−７は動物の乳癌モデルにおいて腫瘍を生じる（Ｈ．Ｄ．Ｓｏ
ｕｌｅら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．５：１４０９（１９７３））が、一方、非悪性胸部細胞株ＭＣＦ−１０Ａは生じない（Ｓｏｕｌｅら、Ｃａ
ｎｃｅｒＲｅｓ．５０：６０７５（１９９０）、Ｔａｉｔら、ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．５：６０８７（１９９０））。

【０１２３】各々の細胞株（ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ａ）から単離されたＤＮＡシン
セソームタンパク質の３０μｇを別個の２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に供した。このポリアクリルアミドゲルは、９．２Ｍ尿素、
４％アクリルアミド、２％両性電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成されていた。ポリペプチドを１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭＨ ₃ ＰＯ₄を用いて形成されたｐＨ勾配により分離した。次いで、チューブのゲルを
、８％アクリルアミドＳＤＳゲル上に置き、そしてポリペプチドを分子量によっ
て分離した。

【０１２４】分離されたシンセソームポリペプチドを含有するこのゲルを、２０ボルトで１
８時間、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いで、フィルターのウエス
タンブロット分析を、１２０ｋＤのＰｏｌＡポリペプチドに対して指向される
抗体を、１：１０００の希釈で用いて、行った。ウエスタンブロットにおけるこ
のＰｏｌＡプロフィールは光増強化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）により示した。

【０１２５】細胞由来ＤＮＡシンセソームのＰｏｌＡ成分の移動度の比較は、悪性細胞型と非悪性細胞型とのこのタンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥプロフィールの明白、かつ
有意な違いを示す。この結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。詳細には、悪性細
胞ＭＣＦ−７（図１６Ａ）は、荷電的に異なり、一つは塩基性、そして一つは酸
性であるＰｏｌＡの２つの種を含む。非悪性細胞ＭＣＦ−１０Ａ（図１６Ｂ）は、ＰｏｌＡの単一の塩基性種のみを含む。

【０１２６】従って、悪性細胞ＤＮＡシンセソームは、非悪性ＤＮＡシンセソームのＰｏｌ
Ａと比較した場合、変化しているＰｏｌＡの種を含む。

【０１２７】（実施例６Ｂ：ＲＰ−Ａの変化型）悪性胸部細胞において、ＲＰ−Ａ（複製タンパク質Ａ）が構造的に変化してい
るかどうかを決定するために、４つの樹立されたヒト胸部細胞株ＭＣＦ−１０Ａ
およびＭＣＦ−７から、本発明者らが公開した手順（Ｃｏｌｌら、Ｏｎｃｏｌ．
Ｒｅｓ．８：４３５、１９９６）を用いて、ＤＮＡシンセソームを単離した。悪
性胸部細胞株ＭＣＦ−７は、動物の乳癌モデルにおいて腫瘍を生じる（Ｈ．Ｄ．
Ｓｏｕｌｅら、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．５：１４０９（１９７３））が、一方、非悪性胸部細胞株ＭＣＦ−１０Ａでは生じない（Ｓｏｕｌｅら
、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５０：６０７５（１９９０）、Ｔａｉｔら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５：６０８７（１９９０））。

【０１２８】各々の細胞株（ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ａ）から単離されたＤＮＡシン
セソームタンパク質の３０μｇを、個別の２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に供した。このポリアクリルアミドゲルは、９．２Ｍ尿素
、４％アクリルアミド、２％両性電解質、および２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００から構成されていた。ポリペプチドを１００ｍＭＮａＯＨおよび１０ｍＭ
Ｈ₃ＰＯ₄を用いて形成されたｐＨ勾配により分離した。次いで、チューブのゲル
を８％アクリルアミドＳＤＳゲル上に置き、そしてポリペプチドを分子量によっ
て分けた。

【０１２９】分離されたシンセソームポリペプチドを含有するこのゲルを、２０ボルトで１
８時間、ニトロセルロースフィルターに転写した。次いで、フィルターのウエス
タンブロット分析は、ＲＰ−Ａポリペプチドに対して指向される抗体を、１：１
０００の希釈で用いて、行った。ウエスタンブロットにおけるこのＲＰＡプロフ
ィールは光増強化学発光法（ＡｍｅｒｓｈａｍＥＣＬ）により示された。

【０１３０】細胞由来ＤＮＡシンセソームのＲＰ−Ａ成分の移動度および量の比較は、悪性
細胞型と非悪性細胞型とのこのタンパク質の２Ｄ−ＰＡＧＥプロフィールの明白
かつ有意な違いを示す。この結果を図１７Ａおよび１７Ｂに示す。詳細には、悪
性細胞ＭＣＦ−７（図１７Ａ）は、７０ｋＤａのサブユニットの２つの種を含み
、一方、非悪性細胞ＭＣＦ-１０(図１７Ｂ)は、単一の種のみを含む。悪性細胞に特有のＲＰ-Ａの型は、ＲＰ-Ａの非悪性細胞種に見られるより高い分子量であ
ること、および量が多いことが認められた。ＰＣＮＡおよびＰｏｌＡに関連した変化の比較において、ＲＰ−Ａの癌特異型は荷電が変化しないようである。

【０１３１】従って、悪性細胞ＤＮＡシンセソームは、非悪性ＤＮＡシンセソームのＲＰ−
Ａと比較した場合、変化しているＲＰ−Ａの種を含む。

【０１３２】（実施例７：ＤＮＡシンセソームの成分）上記で詳細に議論したように、ＤＮＡシンセソームは、哺乳動物細胞に存在す
る、多タンパク質性ＤＮＡ複製複合体である。このタンパク質複合体はインビト
ロにおいてＤＮＡを十分に複製し得る（Ａｐｐｌｅｇｒｅｎら、１９９５；Ｌｉ
ｎら、１９９６；Ｔｏｍら１９９６）。これらの知見に加えて、ＤＮＡシンセソ
ーム（ＤＮＡ合成タンパク質）およびＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）タンパク
質が、細胞のＤＮＡ複製プロセスにおいて示される高い程度の忠実度を媒介する
ために、一緒にはたらくということが、本発明者らによって発見された。本明細
書において開示されたのは、ヒトＤＮＡシンセソームの核となる成分と、ＤＮＡ
ＭＭＲタンパク質、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ６、ｈＰＭＳ１、ｈＰ
ＭＳ２、ＭＹＨ，およびＫｕ８０との間の構造的および機能的相互作用の証拠で
ある。高度に精製されたＤＮＡシンセソームにより媒介される複製活性のピーク
を含む、ＨｅＬａ細胞ショ糖勾配フラクションのウエスタンブロットおよび共免
疫沈降分析は、これらのＭＭＲタンパク質が、精製されたシンセソームの核とな
る成分と強固に会合していることを示す。さらに、精製されたＤＮＡシンセソー
ムは異種単一塩基対の誤った対合および、２〜４ヌクレオチドの挿入−欠失ルー
プを含むテンプレートについての、高いレベルのＤＮＡ複製活性および精緻な結
合特性の両方を実証する。ＤＮＡシンセソームによるこれらの型のミスマッチの
認識は、さらに、ミスマッチ修復タンパク質が、ＤＮＡシンセソームに強固に会
合しており、ＭＭＲタンパク質はシンセソームの精製を通して機能を保持してい
るいるという前提を示す。本明細書において記載されるこの結果は、ＭＭＲタン
パク質はＤＮＡシンセソームの成分であること、および複製の誤りの認識は、娘
ＤＮＡ鎖が合成されたすぐ後でなければならないことを実証する。

【０１３３】（実施例７Ａ：タンパク質−タンパク質相互作用）ＤＮＡシンセソームの複製成分と修復成分との間の結合の強さを実証するため
に、本発明者らは、シンセソーム成分のタンパク質−タンパク質相互作用を直接
試験するための、同時精製および共沈殿研究を実施した。

【０１３４】ＨｅＬａ細胞の懸濁培養物を、公開された手順に従って増殖させ、そして回収
した。このＤＮＡシンセソームを、ＨｅＬａ細胞から単離し、上記のプロセスに
よって、複製活性およびポリメラーゼ活性を決定した。この結果は、ＤＮＡポリ
メラーゼα（ＰｏｌＡ）、ＤＮＡポリメラーゼδ（ＰｏｌＤ）およびＳＶ４０
のインビトロＤＮＡ複製活性が、ショ糖勾配フラクション４〜７に独占的に（フ
ラクション５にピーク活性が集中して）認められるということを示した。

【０１３５】２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を用いて、レーンあたり３０〜１００μｇのショ糖勾配フ
ラクションを、分離し、そしてニトロセルロース膜へ電気泳動的に転写した。特
異的なＤＮＡミスマッチ修復タンパク質および複製タンパク質の免疫検出を、上
に議論された光増強化学発光（ＥＣＬ）検出システムを用いて実施した。ＭＭＲ
タンパク質に対して指向される個々の抗体、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ
６、ｈＰＭＳ２、およびｈＰＭＳ１を、１μｇ／ｍＬの希釈で用いた（Ｓａｎｔ
ａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）。ＭＹＨに対して指向される抗体を、１：２００の希釈で用いた（ＡｎｉｎｄｙａＤｕｔｔａ博士から寄贈）。Ｋｕ−８０（Ｓｉｇｍａ）に対して指向される抗体
を１：１０００の希釈で用いた。ＰＣＮＡ（ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）に対して指向される抗体を１：１０００の希釈で用いた。ＰｏｌＡ（ＳＪＫ
１３２−２０）に対して指向される抗体を１：５００の希釈で用いた。適当な、
種特異的、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体を、イムノブロット上
でこれらの特異的な複製および修復タンパク質の位置を可視化するために用いた
。予備的に染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子サイズマーカーを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。この結果を図１８に示す。

【０１３６】共免疫沈降反応を、ＤＮＡポリメラーゼδ、ＰＣＮＡ、およびｈＭＳＨ２に対して指向される抗体とともにショ糖勾配フラクション（フラクション５）の１
００μｇを用いて、Ｃｏｌｌら（１９９７）の改変手順に従って、実施した。こ
のデータの概要を以下の表４に提示する。

【０１３７】

【表４】（実施例７Ｂ：複製と特異的に関連する修復）単一Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ、またはＡ／７、８−ジヒドロ−８−オキソデオキシグア
ニン（Ａ／ＧＯ）の誤った対合、あるいは２または４ヌクレオチドの単一挿入−
欠失ループを含む、４０塩基対のオリゴヌクレオチドはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭａｒｙｌａｎｄＣｏｒｅＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒＦａｃｉｌｉｔｙ（Ｕ
ＭＢ）によって構築された。ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖テンプレートを作製
するためにオリゴマーをアニーリングした後、これらの３’末端を、〔α−³²−
Ｐ〕ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍモルの５０μＣｉ）、２０μモルｄＴＴＰ、
２０μモルｄＡＴＰ、２０μモルｄＴＧＰの存在下で、ＥｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで、３０分間、２５℃で標識した。得
られた平滑末端の４０ｂｐ二重鎖、ＤＮＡ混合物を、組み込まれていないヌクレ
オチドを除くために、１ｍＬのＢｉｏｇｅｌＰ−６０カラムに通過させた。

【０１３８】結合反応物は、ショ糖勾配ピークから精製された１μｇのＤＮＡシンセソーム
からなり、これを１．８ｆモルの標識されたテンプレートと、２０分間３７℃で
インキュベートし、その後、グルタルアルデヒドを終濃度０．１％に添加し、反
応物をさらに１０分間、２５℃でインキュベートした。反応混合物にショ糖を終
濃度１４％に添加した後、結合タンパク質−ＤＮＡ複合体を、４℃で、５％非変
性ポリアクリルアミドゲルを通して、１２５ボルト、１時間の間、分離した。次
いで、このゲルを乾燥させ、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５フィルム（Ｋｏｄａｋ，ＩｎｃＲｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に、−８０℃で１２〜１９時間、曝露した。

【０１３９】ヘテロポリマー競合反応は、単一ヌクレオチドミスマッチ、あるいはＩＤＬ（
２または４のミスマッチしたヌクレオチドからなる）を含む、ＤＮＡテンプレー
トとのシンセソーム結合反応が、単独ミスマッチまたはＩＤＬを含む、対応する
標識されていないＤＮＡテンプレートにより、完全に競合解離されうることを実
証した（図１９Ａ〜１９Ｄ）。

【０１４０】ホモポリマー競合アッセイは、標識されていない競合物（コンペティター）ホ
モポリマーＤＮＡ（ミスマッチもＩＤＬも含まない完全にマッチしたＤＮＡ）を
、範囲濃度で含んでいた。競合物が標識テンプレートの９００倍多く存在する。
これらのアッセイは、Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ、またはＡ／ＧＯの誤った対合、あるいは
、そしてＩＤＬ２またはＩＤＬ４を含むＤＮＡテンプレートへのＤＮＡシンセソ
ームの結合が、ミスマッチを含まないホモポリマーＤＮＡテンプレートにより競
合解離され得ないことを実証した。この結果（図２０に示した）は、ＤＮＡシン
セソームが、完全にマッチしたＤＮＡテンプレートよりも、ミスマッチを含むＤ
ＮＡ（ミスマッチのタイプにかかわらず）に対してより高い親和性を有すること
を示す。図２０はホモポリマー競合アッセイの代表的な結果を示す。このアッセ
イは、Ｇ／Ｔミスマッチおよび標識されてない競合物（すべてのマッチした位置
で、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ配列と同一である）を含む標識されたヘテロ二重鎖テン
プレートを用いている。

【０１４１】これらの知見は、ＤＮＡシンセソームの新しいモデル（図１に示される）を支
持する。このモデルは、ＤＮＡＭＭＲ成分ならびにＤＮＡ複製成分を含む。

【０１４２】結論として、悪性であることの１つのホールマークは、多くのタイプの癌細胞
により示される遺伝的不安定性に寄与する遺伝的変異の蓄積である。これらの変
異のいくらかは、ほとんどの腫瘍に観察された制御されていない細胞増殖に寄与
すると仮定される。癌細胞における遺伝的エラーのこの蓄積は、特に、非悪性細
胞が、平均１．４×１０^-10変異／塩基対／細胞分裂を生じると見積もられるという事実を考慮すると比較的高い（ＣｈｅｎｇおよびＬｏｅｂ、１９９３；Ｌｏ
ｅｂ１９９８）。悪性および非悪性の胸部細胞のＤＮＡ複製装置は、それ自体が変異促進性であるという初期の観察の後、本発明者らは本明細書中で、悪性胸
部細胞と非悪性胸部細胞との間に存在する特定のＤＮＡ複製タンパク質における
構造的な差異を発見した（その全体が参考として本明細書に具体的に援用されて
いる、Ｓｅｋｏｗｓｋｉら、１９９８、もまた参照のこと）。ＰＣＮＡ、ＲＰ−
Ａおよびポリメラーゼαの構造的に変化した型は詳細に議論される。さらに、Ｄ
ＮＡシンセソームの他の種々の成分はまた、悪性型に変化しているとことが明白
である（図２を参照のこと）。これらの変化した型は、悪性であることの生物マ
ーカーとして働き得、そして、癌の多くの型の診断および予後判定のために、容
易に測定および定量され得る。

【０１４３】本発明は詳細に、そして特定の実施態様を参照として記載されたが、種々の変
化および改変が、その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得ることは
、当業者には明白である。本明細書に引用されたすべての参考文献は、それらの
全体が参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＤＮＡシンセソームの模式図である。

【図２】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、悪性（ＭＣＦ−７）および非悪性（初代乳房
上皮細胞）の乳房細胞から単離された、精製ＤＮＡシンセソーム由来のタンパク
質の２次元ポリアクリルアミドゲル分離を示す。図２Ａは、ＭＣＦ−７シンセソ
ームから分離されたタンパク質を示す。図２Ｂは、非悪性初代乳房上皮細胞シン
セソームからの分離されたタンパク質を示す。各細胞型において同一の電気泳動
移動度を有するシンセソーム調製物の成分を丸で囲む。全ての他の成分は、悪性
表現型において改変されている。

【図３】図３は、悪性および非悪性乳房細胞から単離されたＤＮＡシンセソームのＤＮ
Ａ複製忠実度のインビトロレベルを示す。

【図４】図４は、悪性および非悪性乳房細胞から単離されたＤＮＡシンセソームのＤＮ
Ａ複製活性のインビトロレベルを示す。

【図５】図５Ａ〜５Ｅは、悪性および非悪性細胞由来のＤＮＡシンセソームから単離さ
れたＰＣＮＡの移動パターンを示すウェスタンブロットである。図５Ａは、悪性
ＭＣＦ−７細胞のＤＮＡシンセソームから単離されたＰＣＮＡの移動パターンを
示す。図５Ｂは、非悪性ＭＣＦ−１０Ａ細胞のＤＮＡシンセソームから単離され
たＰＣＮＡの移動パターンを示す。図５Ｃは、悪性Ｈｓ５８７Ｔ細胞のＤＮＡシ
ンセソームから単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す。図５Ｄは、非悪性初
代乳房細胞のＤＮＡシンセソームから単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す
。図５Ｅは、悪性ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞のＤＮＡシンセソームから単離された
ＰＣＮＡの移動パターンを示す。

【図６】図６Ａ〜６Ｆは、悪性および非悪性乳房組織由来のＤＮＡシンセソームから単
離されたＰＣＮＡの移動パターンを示すウェスタンブロットである。図６Ａおよ
び６Ｂは、ヒト腺管腫瘍から単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す。図６Ｃ
および６Ｄは、ヒト小葉腫瘍から単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す。図
６Ｅは、非悪性ヒト乳房組織から単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す。図
６Ｆは、マウス乳房腫瘍から単離されたＰＣＮＡの移動パターンを示す。

【図７】図７Ａ〜７Ｃは、Ａ１Ｎ４（図７Ａ）、Ａ１Ｎ４ｍｙｃ（図７Ｂ）、およびＡ
１Ｎ４Ｔ（図７Ｃ）細胞由来のＰＣＮＡのタンパク質移動パターンを示すウェス
タンブロットである。図７Ａに示される親細胞株であるＡ１Ｎ４は、ＰＣＮＡの
癌特異的な酸性形態を含有しない。しかし、ｃ−ｍｙｃ遺伝子で形質転換した非
悪性細胞株、ならびにＳＶ４０Ｔ抗原、Ａ１Ｎ４ｍｙｃ、およびＡ１Ｎ４Ｔは
、ＰＣＮＡの癌特異的形態を含まない。

【図８】図８Ａ〜８Ｂは、前立腺癌細胞株であるＬｎＣＡＰ（図８Ａ）およびＰＣ１０
（図８Ｂ）由来のタンパク質の移動パターンを示すウェスタンブロットである。
悪性前立腺細胞は、ＰＣＮＡの癌特異的形態を含む。

【図９】図９Ａ〜９Ｃは、悪性食道−結腸細胞株であるＫＧＥ９０（図９Ａ）、ＫＹＥ
３５０（図９Ｂ）、およびＳＷ４８（図９Ｃ）からのＰＣＮＡのタンパク質移動
パターンを示すウェスタンブロットである。悪性細胞は全て、ＰＣＮＡの癌特異
的形態を含む。

【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、他の癌細胞株ＨｅＬａ−−子宮頸癌（図１０Ａ）、Ｔ９
８−−悪性神経膠腫（図１０Ｂ）、およびＨＬ６０−−前骨髄性白血病（図１０
Ｃ）由来のＰＣＮＡのタンパク質移動パターンを示すウェスタンブロットである
。悪性細胞は全て、ＰＣＮＡの癌特異的形態を含む。

【図１１】図１１Ａから１１Ｃは、エストロゲン処置ＭＣＦ−７細胞、コントロールＭＣ
Ｆ−７細胞、および良性乳癌由来のＤＮＡシンセソームから単離されたＰＣＮＡ
の移動パターンを示すウェスタンブロットである。図１１Ａは、エストロゲン処
置されたＭＣＦ−７から単離したＰＣＮＡの移動パターンを示す。図１１Ｂは、
コントロールＭＣＦ−７細胞から単離したＰＣＮＡの移動パターンを示す。図１
１Ｃは、良性乳房腫瘍から単離したＰＣＮＡの移動パターンを示す。

【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−１０Ａ由来のＰＣＮＡｃＤ
ＮＡクローンについてのヌクレオチド配列を示す。乳房細胞株由来のＰＣＮＡ
ｃＤＮＡクローンについてのヌクレオチド配列は、急性リンパ芽球白血病細胞に
ついて報告されている配列と整列されている。示されたＰＣＮＡヌクレオチド配
列は、ＭＯＬＴ−４（１２Ａ、配列番号１）；ＭＣＦ−７（１２Ｂ、配列番号２
）；およびＭＣＦ−１０Ａ（１２Ｃ、配列番号３）のヌクレオチド配列である。
下線を付した配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび内部のＥｃｏＲＩ制限エンドヌク
レアーゼ切断部位の位置を示す。

【図１３】図１３は、悪性乳房細胞（悪性ＭＣＦ−７細胞由来）におけるＰＣＮＡの独特
の形態が、ポリ−（ＡＤＰ）−リボシル化されていないことを例示するウェスタ
ンブロットである。

【図１４】図１４Ａ〜１４Ｅは、癌患者から採取した血液または血清サンプル由来のＰＣ
ＮＡのタンパク質移動パターンを示すウェスタンブロットである。全ては、ＰＣ
ＮＡの癌特異的酸性形態を含有する。図１４Ａは、管内乳癌を有する患者からの
血清サンプルを示す。図１４Ｂは、急性の骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者
からの血液サンプルを示す。図１４Ｃ〜１４Ｅは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
を有する患者からの血液サンプルを示す。

【図１５】図１５は、コントロールの癌を有さない患者から採取した血清サンプル由来の
ＰＣＮＡのタンパク質移動パターンのウェスタンブロットを示す。ＰＣＮＡの酸
性形態は、検出されなかった。

【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、悪性および非悪性ヒト乳房細胞から単離したポリメラー
ゼαのタンパク質移動パターンを示すウェスタンブロットである。図１６Ａは、
悪性ＭＣＦ−７のＤＮＡシンセソームから単離したポリメラーゼαの移動パター
ンを示す。図１６Ｂは、非悪性ＭＣＦ−１０ＡのＤＮＡシンセソームから単離し
たポリメラーゼαの移動パターンを示す。悪性細胞は、ポリメラーゼαの改変さ
れた（酸性）形態を含む。

【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、悪性および非悪性ヒト乳房細胞から単離したＲＰ−Ａの
タンパク質移動パターンを示すウェスタンブロットである。図１７Ａは、悪性Ｍ
ＣＦ−７のＤＮＡシンセソームから単離したＲＰ−Ａの移動パターンを示す。図
１７Ｂは、非悪性ＭＣＦ−１０ＡのＤＮＡシンセソームから単離したＲＰ−Ａの
移動パターンを示す。悪性細胞は、ＲＰ−Ａの改変された（７０ｋＤａ）形態を
含む。

【図１８】図１８は、ＤＮＡシンセソーム活性のピーク（画分５）を用いての同時精製ア
ッセイの結果を示す。その結果は、複製および修復タンパク質の両方がＤＮＡシ
ンセソーム複合体の成分であることを示す。

【図１９】図１９は、ＤＮＡシンセソーム活性のピーク（画分５）での電気泳動移動度シ
フトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。図１９Ａは、２ヌクレオチドの挿入／
欠失ループとのインキュベーションを表す。図１９Ｂは、４ヌクレオチドの挿入
／欠失ループとのインキュベーションを表す。図１９Ｃは、Ｇ／Ｔミスペアとの
インキュベーションを表す。図１９Ｄは、Ａ／ＧＯミスペアとのインキュベーシ
ョンを表す。上部にシフトしたバンドは、ＤＮＡシンセソームが、放射標識した
ＤＮＡテンプレートに結合し、従って非変性ポリアクリルアミドゲルを通過する
移動度を妨害していることを示す。

【図２０】図２０は、ホモポリマー競合アッセイの代表的な結果を示す。このアッセイは
、Ｇ／Ｔミスマッチおよび非標識化コンペティター（全てのマッチ位置における
ヘテロ二本鎖ＤＮＡ配列に同一）を含有する放射標識ヘテロ二本鎖テンプレート
を使用する。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年９月８日（２０００．９．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項７】悪性腫瘍の診断または予後のためのキットであって、悪性細
胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体を含む
、キット。

【請求項８】請求項７に記載のキットであって、ＤＮＡシンセソームの成
分に特異的に結合する前記抗体が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種
、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテイン
Ａ（ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選択される、キット。

【請求項９】試験化合物を、細胞の悪性表現型を抑制する能力についてス
クリーニングするためのキットであって、以下：該悪性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する
単離および精製された抗体；および生存悪性細胞のサンプル、を含む、キット。

【請求項１０】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、増殖細胞核
抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変
された種、および複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選
択される、請求項９に記載のキット。

【請求項１１】悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常な機能を回復
する方法であって、該細胞を、該悪性細胞において改変された該ＤＮＡシンセソ
ームの成分に特異的に結合する抗体に接触させる工程を包含し、ここで該ＤＮＡ
シンセソームの該正常な機能が回復される、方法。

【請求項１２】請求項１１に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポ
リメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（ＲＰＡ
）の改変された種からなる群から選択される、方法。

【請求項１３】悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常な機能を回復
するための治療組成物であって、以下：該細胞において改変された該ＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗
体；および薬理学的に適切な賦形剤、を包含する、治療組成物。

【請求項１４】請求項１３に記載の治療組成物であって、前記ＤＮＡシン
セソームの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、Ｄ
ＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（
ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選択される、治療組成物。

【請求項１５】悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの異常な機能をブロ
ックし、悪性状態を静止させ、そして悪性腫瘍の増殖を中止させる方法であって
、該悪性細胞を、該悪性細胞において改変された該ＤＮＡシンセソームの成分に
特異的に結合する抗体に接触させる工程を包含し、ここで該ＤＮＡシンセソーム
の該異常な機能がブロックされる、方法。

【請求項１６】請求項１５に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポ
リメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（ＲＰＡ
）の改変された種からなる群から選択される、方法。

【請求項１７】哺乳動物から得られたサンプルのＤＮＡシンセソームにおける改変を検出するためにアッセイする工程を包含する方法であって、ここで、該ＤＮＡシンセソームにおける該改変が悪性状態を示す、方法。

【請求項１８】前記サンプルが、哺乳動物の体液または組織を含み、そして該サンプルのＤＮＡシンセソームにおける改変が、該哺乳動物の悪性状態の診断または予後である、請求項１７に記載の方法。

【請求項１９】前記サンプルが、哺乳動物の体液を含む、請求項１７または請求項１８のいずれかに記載の方法。

【請求項２０】前記体液が、血液、血漿、リンパ液、血清、胸膜液、髄液、唾液、痰、尿、および精液からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。

【請求項２１】前記サンプルが、哺乳動物から得られた組織を含む、請求項１７または請求項１８のいずれかに記載の方法。

【請求項２２】前記組織が、乳房、前立腺、血液、膵臓、脳および他の神経系組織、食道、結腸、平滑筋および横紋筋、肝臓、脾臓、胸腺、肺、卵巣、皮膚、心臓、結合組織、腎臓、膀胱、腸、胃、副腎、リンパ節、骨、ならびに頸部からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項２３】前記サンプルが細胞株の細胞を含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項２４】前記哺乳動物がヒトである、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項２５】請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、前記アッセイする工程が、前記サンプルの細胞をインビトロで溶解することにより、該細胞の内部からＤＮＡシンセソームを放出させる工程を包含する、方法。

【請求項２６】請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、前記アッセイする工程が、以下：前記哺乳動物から得られた試験サンプルのＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製の忠実度のレベルを測定すること、および非悪性細胞のコントロールＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製の忠実度のレベルを測定すること、を包含し、ここで、非悪性細胞の該コントロールＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製忠実度のレベルに対して、該試験サンプルのＤＮＡシンセソームのＤＮＡ複製忠実度の減少したレベルが、悪性状態を示す、方法。

【請求項２７】請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、ＤＮＡシンセソームの成分の改変を検出するためにアッセイする工程を包含する、方法。

【請求項２８】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態、ＰｏｌＡの改変された形態、およびＲＰ−Ａの改変された形態からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項２９】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態である、請求項２８に記載の方法。

【請求項３０】請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで前記ＤＮＡシンセソームの改変を検出するためにアッセイする工程が、ＤＮＡシンセソーム成分をゲル電気泳動により分離することを含み、ここで試験サンプルのＤＮＡシンセソームの少なくとも１つの成分の相対的な電気泳動の移動度の、非悪性細胞のＤＮＡシンセソームの対応する非改変成分の相対的な電気泳動の移動度との比較における改変が、該試験サンプルのＤＮＡシンセソームの該少なくとも１つの成分の改変の証拠である、方法。

【請求項３１】前記ＤＮＡシンセソームにおける成分の改変が、該ＤＮＡシンセソームの該改変された成分と特異的に結合する抗体で検出される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項３２】前記抗体が前記改変された成分に結合する親和性が、該抗体が前記ＤＮＡシンセソームの対応する非改変成分に結合する親和性よりも高い、請求項３１に記載の方法。

【請求項３３】前記抗体が、乳房、前立腺、血液、膵臓、脳および他の神経系組織、食道、結腸、平滑筋および横紋筋、肝臓、脾臓、胸腺、肺、卵巣、皮膚、心臓、結合組織、腎臓、膀胱、腸、胃、副腎、リンパ節、骨、ならびに頸部からなる群から選択される組織の細胞のＤＮＡシンセソームの改変された成分に特異的に結合する、請求項３１または３２のいずれかに記載の方法。

【請求項３４】前記抗体が、乳房細胞のＤＮＡシンセソームの改変された成分に特異的に結合する、請求項３３に記載の方法。

【請求項３５】前記抗体が、前立腺細胞のＤＮＡシンセソームの改変された成分に特異的に結合する、請求項３３に記載の方法。

【請求項３６】哺乳動物細胞の悪性表現型を抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって、該方法が、以下の工程：悪性哺乳動物細胞を試験化合物と接触させ、そして該細胞のＤＮＡシンセソームにおける改変を検出するためにアッセイする工程；および該試験化合物と接触されていなかったコントロール悪性細胞のＤＮＡシンセソームにおける改変を検出するためにアッセイする工程；を包含し、ここで、該コントロール細胞のＤＮＡシンセソームにおける改変のレベルに対して、該試験化合物と接触された該細胞のＤＮＡシンセソームにおける改変の減少したレベルの検出が、該試験化合物が悪性を処置するための潜在的な治療剤であることを示す、方法。

【請求項３７】前記悪性細胞が悪性状態を有する哺乳動物から得られる、請求項３６に記載の方法。

【請求項３８】前記悪性細胞が細胞株の細胞である、請求項３６または３７のいずれかに記載の方法。

【請求項３９】前記アッセイする工程が、インビトロでの細胞の溶解によって、該細胞の内部からＤＮＡシンセソームを放出させることを包含する、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項４０】請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、以下の工程：前記試験化合物と接触された前記細胞のＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製の忠実度のレベルを測定する工程；および該試験化合物と接触されていなかった前記コントロール悪性細胞のＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製の忠実度のレベルを測定する工程；を包含し、ここで、該コントロール悪性細胞のＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製の忠実度のレベルに対して、該試験化合物と接触された該細胞のＤＮＡシンセソームによるＤＮＡ複製忠実度の増大したレベルが、該試験化合物が悪性を処置するための潜在的な治療剤であることを示す、方法。

【請求項４１】前記アッセイする工程が、ＤＮＡシンセソームの成分の改変を検出するためにアッセイすることを包含する、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項４２】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態、ＰｏｌＡの改変された形態、およびＲＰ−Ａの改変された形態からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。

【請求項４３】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態である、請求項４２に記載の方法。

【請求項４４】請求項４１〜４３に記載のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＤＮＡシンセソームの改変を検出するためにアッセイする工程が、ＤＮＡシンセソーム成分をゲル電気泳動により分離することを包含し；そしてここで、試験サンプルのＤＮＡシンセソームの少なくとも１つの成分の相対的な電気泳動の移動度の、非悪性細胞のＤＮＡシンセソームの対応する非改変成分の相対的な電気泳動の移動度との比較における改変が、該試験サンプルのＤＮＡシンセソームの該少なくとも１つの成分の改変の証拠である、方法。

【請求項４５】前記ＤＮＡシンセソームにおける成分の改変が、該ＤＮＡシンセソームの該改変された成分に特異的に結合する抗体で検出される、請求項４１〜４４のいずれかに１項に記載の方法。

【請求項４６】前記抗体が前記改変された成分に結合する親和性が、該抗体が前記ＤＮＡシンセソームの対応する非改変成分に結合する親和性よりも高い、請求項４５に記載の方法。

【請求項４７】単離されたＤＮＡシンセソームタンパク質を含む組成物であって、悪性についてのマーカーであるＤＮＡシンセソームの少なくとも１つの改変された成分を含む、組成物。

【請求項４８】悪性についてのマーカーである前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態、ＰｏｌＡの改変された形態、およびＲＰ−Ａの改変された形態からなる群から選択される、請求項４７に記載の組成物。

【請求項４９】悪性についてのマーカーである前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、ＰＣＮＡの改変された形態である、請求項４８に記載の組成物。

【請求項５０】前記ＤＮＡシンセソームタンパク質が、乳房、前立腺、血液、膵臓、脳および他の神経系組織、食道、結腸、平滑筋または横紋筋、肝臓、脾臓、胸腺、肺、卵巣、皮膚、心臓、結合組織、腎臓、膀胱、腸、胃、副腎、リンパ節、骨、および頸部からなる群から選択される組織の悪性細胞から単離される、請求項４７に記載の組成物。

【請求項５１】前記ＤＮＡシンセソームタンパク質が、悪性乳房細胞から単離される、請求項５０に記載の組成物。

【請求項５２】前記ＤＮＡシンセソームタンパク質が、悪性前立腺細胞から単離される、請求項５０に記載の組成物。

【請求項５３】請求項４７の組成物を含む容器を包含するキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 1/68 ＺＧ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヒッキー，ロバートジェイ. アメリカ合衆国メリーランド 21009, アビンドン，ケンジントンパークウェイ 239 (72)発明者ベッテル，パメライー. アメリカ合衆国メリーランド 21061, グレンバーニー，スミシースクエア 6385ディー.

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】悪性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特
異的に結合する抗体の単離および精製された調製物。
【請求項２】請求項１に記載の抗体の単離および精製された調製物であっ
て、前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、増殖している細胞核抗原（Ｐ
ＣＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）、および複製タンパク質Ａ（Ｒ
ＰＡ）の改変された種からなる群から選択される、調製物。
【請求項３】前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗
体の単離および精製された調製物。
【請求項４】前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗
体の単離および精製された調製物。
【請求項５】前記抗体がアフィニティー精製された、請求項１に記載の抗
体の単離および精製された調製物。
【請求項６】前記抗体がファージディスプレイ法を使用して得られる、請
求項１に記載の抗体の単離および精製された調製物。
【請求項７】悪性腫瘍を診断または予知するための方法であって、悪性状
態を有すると予想される患者から得られる体液サンプルのＤＮＡシンセソームに
おける改変を検出する工程を包含し、ここで該ＤＮＡシンセソームの成分におけ
る改変が、該体液サンプルにおける悪性細胞またはその成分の存在を示す、方法
。
【請求項８】前記体液が、血液、血漿、リンパ液、血清、胸膜液、髄液、
唾液、痰、尿、および精液からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記体液が循環される体液である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記体液が血液である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記ＤＮＡシンセソームにおける改変が、ＰＣＮＡ、Ｐｏ
ｌＡ、およびＲＰ−Ａからなる群の１つの改変された形態である、請求項７に
記載の方法。
【請求項１２】前記ＤＮＡシンセソームにおける改変がＰＣＮＡの改変さ
れた形態である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】悪性腫瘍を診断または予知することを補助するための方法
であって、組織サンプルのＤＮＡシンセソームにおける改変を検出する工程を包
含し、ここで該組織サンプルの細胞が、悪性であると予想され、ここで該ＤＮＡ
シンセソームにおける改変が、該組織サンプルにおける悪性細胞の存在を示す、
方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムにおける改変が、該ＤＮＡシンセソームの改変された成分に特異的に結合する
抗体で検出される、方法。
【請求項１５】請求項１３に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムにおける改変が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏ
ｌＡ）、および複製プロテインＡ（ＲＰ−Ａ）からなる群の少なくとも１つの
改変された形態である、方法。
【請求項１６】請求項１２に記載の方法であって、ここでＤＮＡシンセソ
ームにおける改変が、以下：第１の組織サンプルにおけるＤＮＡ複製忠実度の第１のレベルを検出する工程
であって、該第１の組織サンプルの細胞が悪性ではない、工程；第２の組織サンプルにおけるＤＮＡ複製忠実度の第２のレベルを検出する工程
であって、該第２の組織サンプルの細胞が悪性であると予想される、工程；およ
びＤＮＡ複製忠実度の第１および第２のレベルを比較する工程であって、該第２
の組織サンプルにおけるＤＮＡ複製忠実度のより低いレベルが、悪性である、該
第２の組織サンプルにおける細胞の存在を示す、工程、によって検出される、方法。
【請求項１７】請求項１２に記載の方法であって、悪性である細胞を含有
すると予想される前記組織が、乳房、血液、前立腺、脳、食道、子宮頸部、およ
び結腸からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】前記組織が乳房組織である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】転移性悪性腫瘍の存在を検出する方法であって、以下の工
程：転移性の新生物を有すると予想される患者の血液サンプルを、悪性細胞におい
て改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体と接触させる工
程；ならびに該血液中の細胞への該抗体の特異的結合のパターンを観察する工程であって、
該血液サンプル中の該抗体の該細胞への特異的結合が、該血液サンプル中の悪性
細胞またはその成分の存在を示す、工程、を包含する、方法。
【請求項２０】細胞の悪性表現型を抑制する能力について試験化合物をス
クリーニングする方法であって、以下の工程：悪性細胞を試験化合物と接触させる工程；および該悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの改変された成分を検出する工程であ
って、該悪性細胞における該ＤＮＡシンセソームの改変された成分の機能を阻害
する試験化合物が、悪性腫瘍を処置するための潜在的な治療剤である、工程、を包含する、方法。
【請求項２１】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、該ＤＮＡシ
ンセソームの該成分へ特異的に結合する抗体で検出される、請求項２０に記載の
方法。
【請求項２２】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分に特異的に結合
する前記抗体が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポリメラ
ーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（ＲＰＡ）の改
変された種からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記ＤＮＡシンセソームの改変された特性が、前記悪性細
胞におけるＤＮＡ複製忠実度の減少したレベルである、請求項２０に記載の方法
。
【請求項２４】悪性腫瘍を診断または予知するためのキットであって、悪
性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体を
含む、キット。
【請求項２５】請求項２４に記載のキットであって、ＤＮＡシンセソーム
の成分に特異的に結合する前記抗体が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変され
た種、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテ
インＡ（ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選択される、キット。
【請求項２６】試験化合物を、細胞の悪性表現型を抑制する能力について
スクリーニングするためのキットであって、以下：該悪性細胞において改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する
単離および精製された抗体；および生存悪性細胞のサンプル、を含む、キット。
【請求項２７】前記ＤＮＡシンセソームの改変された成分が、増殖細胞核
抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変
された種、および複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選
択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常な機能を回復
する方法であって、該細胞を、該悪性細胞において改変された該ＤＮＡシンセソ
ームの成分に特異的に結合する抗体に接触させる工程を包含し、ここで該ＤＮＡ
シンセソームの該正常な機能が回復される、方法。
【請求項２９】請求項２８に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポ
リメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（ＲＰＡ
）の改変された種からなる群から選択される、方法。
【請求項３０】悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの正常な機能を回復
するための治療組成物であって、以下：該細胞において改変された該ＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗
体；および薬理学的に適切な賦形剤、を包含する、治療組成物。
【請求項３１】請求項３０に記載の治療組成物であって、前記ＤＮＡシン
セソームの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、Ｄ
ＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（
ＲＰＡ）の改変された種からなる群から選択される、治療組成物。
【請求項３２】悪性腫瘍の存在を検出する方法であって、以下の工程：転移性の新生物を有すると予想される患者の血液サンプルを、悪性細胞におい
て改変されたＤＮＡシンセソームの成分に特異的に結合する抗体と接触させる工
程；および該血液中の細胞に対する抗体の特異的結合のパターンを観察する工程であって
、ここで該血液サンプル中の該細胞への該抗体の特異的結合が、該血液サンプル
における悪性細胞またはその成分の存在を示す、工程、を包含する、方法。
【請求項３３】細胞の悪性表現型を抑制する能力について試験化合物をス
クリーニングするための方法であって、以下の工程：悪性細胞を試験化合物と接触させる工程；および該悪性細胞においてＤＮＡシンセソームの改変された成分を検出する工程であ
って、該悪性細胞中の該ＤＮＡシンセソームの改変された成分の機能をブロック
する試験化合物が、悪性腫瘍を処置するための潜在的な治療剤である、工程、を包含する、方法。
【請求項３４】悪性細胞におけるＤＮＡシンセソームの異常な機能をブロ
ックし、悪性状態を静止させ、そして悪性腫瘍の増殖を中止させる方法であって
、該細胞を、該悪性細胞において改変された該ＤＮＡシンセソームの成分に特異
的に結合する抗体に接触させる工程を包含し、ここで該ＤＮＡシンセソームの該
異常な機能がブロックされる、方法。
【請求項３５】請求項３４に記載の方法であって、前記ＤＮＡシンセソー
ムの改変された成分が、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の改変された種、ＤＮＡポ
リメラーゼα（ＰｏｌＡ）の改変された種、および複製プロテインＡ（ＲＰＡ
）の改変された種からなる群から選択される、方法。