JPH07191037A - 被検物質の癌原性を検出する方法 - Google Patents
被検物質の癌原性を検出する方法Info
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- JPH07191037A JPH07191037A JP34706293A JP34706293A JPH07191037A JP H07191037 A JPH07191037 A JP H07191037A JP 34706293 A JP34706293 A JP 34706293A JP 34706293 A JP34706293 A JP 34706293A JP H07191037 A JPH07191037 A JP H07191037A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 エームステスト等の従来の被検物質の癌原性
を検出する方法では陰性と判定されてしまう癌原性を有
する物質を、特別の設備を用いずに、熟練を要すること
なく短期間に、しかも精度良く陽性として検出できる方
法を提供すること。 【構成】 被検物質を投与し一定期間経過後取出した動
物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反応させ、
該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された細胞の割
合から該被検物質の癌原性を検出する。
を検出する方法では陰性と判定されてしまう癌原性を有
する物質を、特別の設備を用いずに、熟練を要すること
なく短期間に、しかも精度良く陽性として検出できる方
法を提供すること。 【構成】 被検物質を投与し一定期間経過後取出した動
物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反応させ、
該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された細胞の割
合から該被検物質の癌原性を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は被検物質の癌原性を検出
する方法、詳しくは被検物質を投与し一定期間経過後取
出した動物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反
応させ、該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された
細胞の割合から該被検物質の癌原性を検出する方法に関
する。
する方法、詳しくは被検物質を投与し一定期間経過後取
出した動物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反
応させ、該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された
細胞の割合から該被検物質の癌原性を検出する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、被検物質が発癌性（以下癌原性と
いう）を有するか、否かについて調べるにはラット、マ
ウス等の小型動物が用いられている。そして被検物質の
癌原性の評価には数年もの年月と費用が嵩む欠点を有す
る。
いう）を有するか、否かについて調べるにはラット、マ
ウス等の小型動物が用いられている。そして被検物質の
癌原性の評価には数年もの年月と費用が嵩む欠点を有す
る。
【０００３】短期間で簡便に被検物質の癌原性を検出す
る方法として、微生物を用いる復帰突然変異試験（Ａｍ
ｅｓ試験）が開発された（Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ
ａｌ（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７０，２２８１）。本試験により既知癌原
性物質の約９０％が検出された（Ｍｃ Ｃａｎｎ，
Ｊ．，ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５１５３）。しかしな
がら、近年になりその検出率は５０％程度であることが
報告されている（Ｚｅｉｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ（１
９９０） Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．
１６ Ｓｕｐｐｌ（１８），１）。この原因として、Ａ
ｍｅｓ試験では含ハロゲン有機化合物類、ペルオキシゾ
ーム増殖物質などの弱い癌原性物質が陽性として検出で
きないことなどがあげられている（宇野ら （１９９
２）環境変異原研究１４，７５）。
る方法として、微生物を用いる復帰突然変異試験（Ａｍ
ｅｓ試験）が開発された（Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ
ａｌ（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７０，２２８１）。本試験により既知癌原
性物質の約９０％が検出された（Ｍｃ Ｃａｎｎ，
Ｊ．，ｅｔ ａｌ（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５１５３）。しかしな
がら、近年になりその検出率は５０％程度であることが
報告されている（Ｚｅｉｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ（１
９９０） Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｏｌ．Ｍｕｔａｇｅｎ．
１６ Ｓｕｐｐｌ（１８），１）。この原因として、Ａ
ｍｅｓ試験では含ハロゲン有機化合物類、ペルオキシゾ
ーム増殖物質などの弱い癌原性物質が陽性として検出で
きないことなどがあげられている（宇野ら （１９９
２）環境変異原研究１４，７５）。
【０００４】この問題を解決すべく、Ａｍｅｓ試験陰性
の癌原性物質検出法としてラット肝臓を用いたＲＤＳ試
験（Ｕｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｔｏｘｉｃ
ｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６３，１９１）が開発さ
れた。本試験はラットに被検物質を投与し、その後ラッ
ト肝細胞をコラゲナーゼにより分散させ、放射性アイソ
トープで標識されたチミジンを含有する培地で細胞を培
養し、増殖期の細胞のＳ（ＤＮＡ合成）期にあたる細胞
にチミジンを取込ませ、その放射性アイソトープで標識
されたチミジンを測定することにより、核内にアイソト
ープを取込んだ細胞の割合から被検物質の癌原性を検出
する方法である。この試験によりＡｍｅｓ試験陰性癌原
性物質が８０％もの高率で検出可能となった。しかし、
この方法はラジオアイソト−プを使用する点において、
設備費用が嵩み、また操作性が悪く、検出に長時間（約
１週間）を要する等の点で問題を有する。
の癌原性物質検出法としてラット肝臓を用いたＲＤＳ試
験（Ｕｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｔｏｘｉｃ
ｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６３，１９１）が開発さ
れた。本試験はラットに被検物質を投与し、その後ラッ
ト肝細胞をコラゲナーゼにより分散させ、放射性アイソ
トープで標識されたチミジンを含有する培地で細胞を培
養し、増殖期の細胞のＳ（ＤＮＡ合成）期にあたる細胞
にチミジンを取込ませ、その放射性アイソトープで標識
されたチミジンを測定することにより、核内にアイソト
ープを取込んだ細胞の割合から被検物質の癌原性を検出
する方法である。この試験によりＡｍｅｓ試験陰性癌原
性物質が８０％もの高率で検出可能となった。しかし、
この方法はラジオアイソト−プを使用する点において、
設備費用が嵩み、また操作性が悪く、検出に長時間（約
１週間）を要する等の点で問題を有する。
【０００５】一方、増殖期の細胞に発現する蛋白ＰＣＮ
Ａ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅ
ａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ＤＮＡポリメラーゼのδコンポ
ーネントで分子量が３６ＫＤａ）が発見され（Ｍｉｙａ
ｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎ．１２１，２２２８）、そしてラットＰＣＮＡに関す
るＤＮＡ配列がＭａｔｓｕｍｏｔｏらにより同定された
（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ（１９８７）
ＥＭＢＯ Ｊ．６，６３７〜６４２）。また、１９９０
年ＷａｓｅｅｍらによりＰＣＮＡに対するモノクローナ
ル抗体がつくられた（Ｗａｓｅｅｍ，Ｎ．Ｈ．，ｅｔ
ａｌ（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ９６，１２１）。そして、この抗体を用
いてＧ１〜Ｓ期に当たる増殖細胞の検定が可能となり、
手術後の臓器標本の悪性度の判定や予後の経過の判定に
利用されるようになった。即ち、この抗体を用いて、臓
器の一部を切り出し得られた細胞が、激しく増殖してい
るかどうかについて調べたり、そして予後の経過をたど
る患者から、臓器の一部を取出し、増殖の状態が正常で
あるかどうかを調べることが行なわれていた。しかし、
このＰＣＮＡモノクロ−ナル抗体を用いて、被検物質の
癌原性を検定する方法は知られていない。前記のように
手術後の臓器標本の増殖細胞の状態から悪性度を判定す
ることと、被検物質の癌原性の有無を調べることとは異
なる。従来、被検物質の癌原性を検定する優れた方法と
して知られるラット肝臓を用いたＲＤＳ試験では、前述
したようにラットに被検物質を投与し、その後ラット肝
細胞をコラゲナーゼにより個々に分離、分散させ、以下
必要な操作を行うものであるが、細胞を個々に分離、分
散させた後に増殖細胞の検定を行う場合と、臓器から組
織の一部を取出しこれに必要な操作を行い多くの細胞が
密に接触している状態において増殖細胞の検定を行う場
合とでは、増殖細胞の調製手段及び環境が異なることか
ら、こような被検定物質の癌原性を検定するＲＤＳ試験
法が知られていても、このことからＰＣＮＡモノクロ−
ナル抗体を利用し本発明を想到することは容易でない。
Ａ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅ
ａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ＤＮＡポリメラーゼのδコンポ
ーネントで分子量が３６ＫＤａ）が発見され（Ｍｉｙａ
ｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎ．１２１，２２２８）、そしてラットＰＣＮＡに関す
るＤＮＡ配列がＭａｔｓｕｍｏｔｏらにより同定された
（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ（１９８７）
ＥＭＢＯ Ｊ．６，６３７〜６４２）。また、１９９０
年ＷａｓｅｅｍらによりＰＣＮＡに対するモノクローナ
ル抗体がつくられた（Ｗａｓｅｅｍ，Ｎ．Ｈ．，ｅｔ
ａｌ（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ９６，１２１）。そして、この抗体を用
いてＧ１〜Ｓ期に当たる増殖細胞の検定が可能となり、
手術後の臓器標本の悪性度の判定や予後の経過の判定に
利用されるようになった。即ち、この抗体を用いて、臓
器の一部を切り出し得られた細胞が、激しく増殖してい
るかどうかについて調べたり、そして予後の経過をたど
る患者から、臓器の一部を取出し、増殖の状態が正常で
あるかどうかを調べることが行なわれていた。しかし、
このＰＣＮＡモノクロ−ナル抗体を用いて、被検物質の
癌原性を検定する方法は知られていない。前記のように
手術後の臓器標本の増殖細胞の状態から悪性度を判定す
ることと、被検物質の癌原性の有無を調べることとは異
なる。従来、被検物質の癌原性を検定する優れた方法と
して知られるラット肝臓を用いたＲＤＳ試験では、前述
したようにラットに被検物質を投与し、その後ラット肝
細胞をコラゲナーゼにより個々に分離、分散させ、以下
必要な操作を行うものであるが、細胞を個々に分離、分
散させた後に増殖細胞の検定を行う場合と、臓器から組
織の一部を取出しこれに必要な操作を行い多くの細胞が
密に接触している状態において増殖細胞の検定を行う場
合とでは、増殖細胞の調製手段及び環境が異なることか
ら、こような被検定物質の癌原性を検定するＲＤＳ試験
法が知られていても、このことからＰＣＮＡモノクロ−
ナル抗体を利用し本発明を想到することは容易でない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】チミジンを利用してラ
ット肝細胞のＲＤＳを測定し発癌物質を検出する方法で
は、予めチミジンを細胞に取込ませる必要がある。そし
てコラゲナーゼを用いた肝細胞分散法では分散した肝細
胞を培養する必要があり、なおかつ操作に熟練を要し、
しかもラジオアイソトープを用いるのでアイソトープの
設備が必須であった。本発明の目的は簡便な操作で実施
でき、再現性のよい発癌物質の検出方法を提供すること
にある。
ット肝細胞のＲＤＳを測定し発癌物質を検出する方法で
は、予めチミジンを細胞に取込ませる必要がある。そし
てコラゲナーゼを用いた肝細胞分散法では分散した肝細
胞を培養する必要があり、なおかつ操作に熟練を要し、
しかもラジオアイソトープを用いるのでアイソトープの
設備が必須であった。本発明の目的は簡便な操作で実施
でき、再現性のよい発癌物質の検出方法を提供すること
にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を解決
すべく種々検討を重ねた結果完成されたものであって、
即ち、被検物質を投与し一定期間経過後取出した動物肝
臓組織切片に対して、ＰＣＮＡモノクローナル抗体を抗
原抗体反応させ、その後該反応細胞に発色試薬を作用さ
せて染色し、全肝実質細胞に対する発色されたＰＣＮＡ
陽性細胞の割合から該被検物質の癌原性を検出できるこ
とを知り、この知見に基ずいて本発明を完成した。即
ち、本発明は、被検物質を投与し一定期間経過後取出し
た動物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反応さ
せ、該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された細胞
の割合から該被検物質の癌原性を検出する方法である。
すべく種々検討を重ねた結果完成されたものであって、
即ち、被検物質を投与し一定期間経過後取出した動物肝
臓組織切片に対して、ＰＣＮＡモノクローナル抗体を抗
原抗体反応させ、その後該反応細胞に発色試薬を作用さ
せて染色し、全肝実質細胞に対する発色されたＰＣＮＡ
陽性細胞の割合から該被検物質の癌原性を検出できるこ
とを知り、この知見に基ずいて本発明を完成した。即
ち、本発明は、被検物質を投与し一定期間経過後取出し
た動物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反応さ
せ、該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された細胞
の割合から該被検物質の癌原性を検出する方法である。
【０００８】以下本発明を詳細に説明する。ＰＣＮＡモ
ノクローナル抗体は増殖期にある肝細胞のＰＣＮＡ陽性
細胞（核にＰＣＮＡが存在する細胞）と特異的に反応す
る。ＰＣＮＡは、Ｇ０（静止期）、Ｇ１（間期）、Ｓ
（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（間期）そしてＭ（分裂期）か
らなる一連の細胞周期の該Ｇ1〜Ｓの核に存在するの
で、本発明でいうＰＣＮＡ陽性細胞とはＧ1-Ｓ期にある
細胞のことである。
ノクローナル抗体は増殖期にある肝細胞のＰＣＮＡ陽性
細胞（核にＰＣＮＡが存在する細胞）と特異的に反応す
る。ＰＣＮＡは、Ｇ０（静止期）、Ｇ１（間期）、Ｓ
（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（間期）そしてＭ（分裂期）か
らなる一連の細胞周期の該Ｇ1〜Ｓの核に存在するの
で、本発明でいうＰＣＮＡ陽性細胞とはＧ1-Ｓ期にある
細胞のことである。
【０００９】肝細胞とＰＣＮＡモノクローナル抗体との
反応は例えばマウスやラットの肝臓を摘出、固定、パラ
フィン埋入、切片作製、脱パラフィン、親水化した後、
ＰＣＮＡモノクローナル抗体に酵素を標識させた酵素標
識抗体と反応させ、その後、未反応の酵素標識抗体を除
去することによって実施される。
反応は例えばマウスやラットの肝臓を摘出、固定、パラ
フィン埋入、切片作製、脱パラフィン、親水化した後、
ＰＣＮＡモノクローナル抗体に酵素を標識させた酵素標
識抗体と反応させ、その後、未反応の酵素標識抗体を除
去することによって実施される。
【００１０】ここで使用されるＰＣＮＡモノクローナル
抗体はこの抗体を含むマウス腹水またはこの抗体を産生
する細胞株をインビトロで培養した培養上清をプロテイ
ンＡセファロース等によりＩｇＧ画分を分離精製して得
られたものなどが挙げられる。
抗体はこの抗体を含むマウス腹水またはこの抗体を産生
する細胞株をインビトロで培養した培養上清をプロテイ
ンＡセファロース等によりＩｇＧ画分を分離精製して得
られたものなどが挙げられる。
【００１１】ＰＣＮＡモノクローナル抗体に酵素を標識
するには、他のモノクローナル抗体に酵素を標識する場
合の公知の手法に従えばよい。その際利用する酵素とし
てはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等があ
る。
するには、他のモノクローナル抗体に酵素を標識する場
合の公知の手法に従えばよい。その際利用する酵素とし
てはペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等があ
る。
【００１２】肝細胞と酵素標識抗体の反応後、未反応抗
体を除去し発色剤を用いＰＣＮＡ陽性細胞を検出する。
発色剤にはＤＡＢ（ジアミノベンジジン）、ＡＥＣ（ア
ミノエチルカルバゾ−ル）等が利用される。
体を除去し発色剤を用いＰＣＮＡ陽性細胞を検出する。
発色剤にはＤＡＢ（ジアミノベンジジン）、ＡＥＣ（ア
ミノエチルカルバゾ−ル）等が利用される。
【００１３】酵素標識抗体と発色剤により染色されたＰ
ＣＮＡ陽性細胞を検出し、全肝実質細胞に対するＰＣＮ
Ａ陽性細胞の割合（被検物質により値は変動するが、殆
どは陰性対照の２倍以上で且つ、２．５％を越えるもの
が、癌原性を有すると評価することができる）を求める
ことによって被検物質の発癌性を検出することができ
る。
ＣＮＡ陽性細胞を検出し、全肝実質細胞に対するＰＣＮ
Ａ陽性細胞の割合（被検物質により値は変動するが、殆
どは陰性対照の２倍以上で且つ、２．５％を越えるもの
が、癌原性を有すると評価することができる）を求める
ことによって被検物質の発癌性を検出することができ
る。
【００１４】
【発明の効果】本発明は、最も一般的に行われている検
出法である、エームステストでは陰性と判定されてしま
う発癌物質を短期間の試験で陽性として検出できる。本
発明の発癌物質検出法は検出がラジオアイソトープを用
いたオートラジオグラフィーではなく、抗体、酵素を用
いた染色のた特別の設備を必要とせず、検出時間も大幅
に短縮される（数時間）。従来法は、肝臓をコラゲナー
ゼにより分散させ、得られた細胞を培養するため熟練を
要するが、本発明は、肝臓をメタノール等で固定するだ
けなので熟練を要する操作が必要でない。本発明は増殖
中の細胞の内Ｓ期にある細胞のみを検出するのではな
く、Ｇ1、Ｓ期にある細胞を検出できる。本発明は細胞
の増殖のみならず肝組織の形態変化も同時に観察でき、
被検物質の肝臓に対する傷害性を検知するのにも好適で
ある。
出法である、エームステストでは陰性と判定されてしま
う発癌物質を短期間の試験で陽性として検出できる。本
発明の発癌物質検出法は検出がラジオアイソトープを用
いたオートラジオグラフィーではなく、抗体、酵素を用
いた染色のた特別の設備を必要とせず、検出時間も大幅
に短縮される（数時間）。従来法は、肝臓をコラゲナー
ゼにより分散させ、得られた細胞を培養するため熟練を
要するが、本発明は、肝臓をメタノール等で固定するだ
けなので熟練を要する操作が必要でない。本発明は増殖
中の細胞の内Ｓ期にある細胞のみを検出するのではな
く、Ｇ1、Ｓ期にある細胞を検出できる。本発明は細胞
の増殖のみならず肝組織の形態変化も同時に観察でき、
被検物質の肝臓に対する傷害性を検知するのにも好適で
ある。
【００１５】以下実施例を示して本発明をより具体的に
説明する。
説明する。
【実施例１】 （Ａｍｅｓ試験陰性の既知癌原性物質の検出）
【００１６】（１）ＰＣＮＡモノクローナル抗体の作
製、精製、酵素標識 ａ)ＰＣＮＡモノクローナル抗体はＪｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９６，１２１（１９９
０）記載の方法に準じて作製した。
製、精製、酵素標識 ａ)ＰＣＮＡモノクローナル抗体はＪｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９６，１２１（１９９
０）記載の方法に準じて作製した。
【００１７】ａ−１；ＰＣＮＡ-プロテインＡ融合蛋白
の調製 ＰＣＮＡを大量に精製するため、以下に記載の方法によ
り、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と特異的に結合するプ
ロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁成分の蛋白）と、Ｐ
ＣＮＡとを融合した蛋白を調製した。まずプロテインＡ
融合蛋白作製用プラスミドｐＲ１Ｔ２Ｔ（ファルマシア
社製、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ（１９８５）
ＥＭＢＯ Ｊ．４，１０７５，、Ｚａｂｅａｕ，Ｍ．ａ
ｎｄ Ｓｔａｎｋｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．（１９８５）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．４，１０７５，、Ｚａｂｅａｕ，Ｍ．ａｎｄ
Ｓｔａｎｋｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．（１９８２）ＥＭＢＯ
Ｊ．１，１２１７及び公表特許公報昭５９−５０１６９
３参照）に準じて、ラットＰＣＮＡに関するＤＮＡ（Ｍ
ａｔｓｕｍ ｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ(１９８７)ＥＭ
ＢＯ Ｊ．６，６３７)を遺伝子工学的手法によって組
込み、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。この大
腸菌を培養し、遠心操作（７，０００ｒｐｍ）によって
集菌し生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて再懸濁し、こ
れをリゾチームや超音波処理により溶菌する。再び遠心
（３０，０００ｒｐｍ）し上清をヒトＩｇＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラムに通すことによりＰＣＮＡ-プロテイ
ンＡ融合蛋白を調製した。
の調製 ＰＣＮＡを大量に精製するため、以下に記載の方法によ
り、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と特異的に結合するプ
ロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁成分の蛋白）と、Ｐ
ＣＮＡとを融合した蛋白を調製した。まずプロテインＡ
融合蛋白作製用プラスミドｐＲ１Ｔ２Ｔ（ファルマシア
社製、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ（１９８５）
ＥＭＢＯ Ｊ．４，１０７５，、Ｚａｂｅａｕ，Ｍ．ａ
ｎｄ Ｓｔａｎｋｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．（１９８５）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．４，１０７５，、Ｚａｂｅａｕ，Ｍ．ａｎｄ
Ｓｔａｎｋｌｅｙ，Ｋ．Ｋ．（１９８２）ＥＭＢＯ
Ｊ．１，１２１７及び公表特許公報昭５９−５０１６９
３参照）に準じて、ラットＰＣＮＡに関するＤＮＡ（Ｍ
ａｔｓｕｍ ｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ(１９８７)ＥＭ
ＢＯ Ｊ．６，６３７)を遺伝子工学的手法によって組
込み、得られたプラスミドを大腸菌に導入した。この大
腸菌を培養し、遠心操作（７，０００ｒｐｍ）によって
集菌し生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて再懸濁し、こ
れをリゾチームや超音波処理により溶菌する。再び遠心
（３０，０００ｒｐｍ）し上清をヒトＩｇＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラムに通すことによりＰＣＮＡ-プロテイ
ンＡ融合蛋白を調製した。
【００１８】ａ−２；ＰＣＮＡモノクロ−ナル抗体の調
製 上記ａ−１で調製したＰＣＮＡ-プロテインＡ融合蛋白
をフロイントの完全アジュバント（抗原に対する免疫応
答を修飾、即ちこの場合、強化する目的で用いられる）
などを用いマウスに腹腔内投与により免疫を施した。血
清中の抗体価を測定し、抗体価の上昇を確認後マウスか
ら脾臓を摘出し、脾臓リンパ球を得た。一方、ミエロー
マ Ｓｐ−２／０−Ａｇ１４細胞を用意し、これと上記
脾臓リンパ球をＰＥＧ（ポリエチレングリコ−ル）を用
い細胞融合させた。得られた融合細胞をＨＡＴ培地（Ｈ
ｙｐｏｘａｎｔｉｎ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ Ｔｈｙ
ｍｉｄｉｎｅを含む動物細胞用液体栄養培地）にて培養
し、培養上清を採取して、その抗体価を測定し、ＰＣＮ
Ａモノクローナル抗体を産生する細胞株を得た。
製 上記ａ−１で調製したＰＣＮＡ-プロテインＡ融合蛋白
をフロイントの完全アジュバント（抗原に対する免疫応
答を修飾、即ちこの場合、強化する目的で用いられる）
などを用いマウスに腹腔内投与により免疫を施した。血
清中の抗体価を測定し、抗体価の上昇を確認後マウスか
ら脾臓を摘出し、脾臓リンパ球を得た。一方、ミエロー
マ Ｓｐ−２／０−Ａｇ１４細胞を用意し、これと上記
脾臓リンパ球をＰＥＧ（ポリエチレングリコ−ル）を用
い細胞融合させた。得られた融合細胞をＨＡＴ培地（Ｈ
ｙｐｏｘａｎｔｉｎ Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ Ｔｈｙ
ｍｉｄｉｎｅを含む動物細胞用液体栄養培地）にて培養
し、培養上清を採取して、その抗体価を測定し、ＰＣＮ
Ａモノクローナル抗体を産生する細胞株を得た。
【００１９】ｂ)ＰＣＮＡモノクローナル抗体の製造及
び酵素標識 前記ａ)で得られたＰＣＮＡモノクローナル抗体を産生
する細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ)を含む培養
液(ＲＰＭＩ１６４０)にて培養し、その培養上清を採取
し抗体の精製材料とした。もう一方の方法としてヌード
マウスに１匹あたり１×１０6〜１×１０8個の前記ａ）
で得られたモノクローナル抗体産生細胞株を腹腔内投与
し、モノクローナル抗体を含む腹水を得、精製抗体の材
料とした。次いで、上記で得られた精製抗体の材料は、
ピアス社Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ（Ａ／Ｇ）ＩｇＧ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。
び酵素標識 前記ａ)で得られたＰＣＮＡモノクローナル抗体を産生
する細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ)を含む培養
液(ＲＰＭＩ１６４０)にて培養し、その培養上清を採取
し抗体の精製材料とした。もう一方の方法としてヌード
マウスに１匹あたり１×１０6〜１×１０8個の前記ａ）
で得られたモノクローナル抗体産生細胞株を腹腔内投与
し、モノクローナル抗体を含む腹水を得、精製抗体の材
料とした。次いで、上記で得られた精製抗体の材料は、
ピアス社Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ（Ａ／Ｇ）ＩｇＧ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した。
【００２０】また、上記で得られた精製ＰＣＮＡモノク
ローナル抗体の酵素標識を行なった。即ち、上記ＰＣＮ
Ａモノクローナル抗体にピアス社製酵素標識キット「Ｉ
ｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ」を反応させ酵素標識ＰＣＮＡモ
ノクローナル抗体を得た。酵素標識ＰＣＮＡ抗体は、上
記の如き調製法により得たのもを用いるか、または市販
品（ＥＰＯＳ Ａｎｔｉ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ
Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ／ＨＲＰ
ダコ社）などを用いることもできる。
ローナル抗体の酵素標識を行なった。即ち、上記ＰＣＮ
Ａモノクローナル抗体にピアス社製酵素標識キット「Ｉ
ｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ Ｋｉｔ」を反応させ酵素標識ＰＣＮＡモ
ノクローナル抗体を得た。酵素標識ＰＣＮＡ抗体は、上
記の如き調製法により得たのもを用いるか、または市販
品（ＥＰＯＳ Ａｎｔｉ−Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ
Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ／ＨＲＰ
ダコ社）などを用いることもできる。
【００２１】２）ラット肝臓組織切片標本の作製 被検物質（エームス試験陰性で動物試験では発癌性を示
した物質ならび、両試験でそれぞれ陰性を示す対照物質
コ−ンオイル）をラットにＭＴＤ（最大耐量；被検物質
を動物に投与したときに、１匹の動物も死なない投与量
を示す）、１／２ＭＴＤ、１／４ＭＴＤの用量で強制経
口投与し、２４時間、３９時間、４８時間後にラット肝
臓を摘出し、１００％メタノールにて固定し、パラフィ
ン埋入組織ミクロトーム切片法により３〜５μｍの切片
を作製した。パラフィン埋入組織はキシレン中で清浄に
し、エタノールの段階稀釈により親水化し、組織にスキ
ムミルク液等のブロッキング液を数１０分作用させ、そ
の後ブロッキング液で稀釈した酵素標識ＰＣＮＡモノク
ローナル抗体を約６０分作用させた。これをトリス緩衝
液（ＴＢＳ ｐＨ７．６)で洗浄後、発色基質（ＤＡＢ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ
ベクター社）を加え肝細胞の核を染色し、水洗後ヘマ
トキシリン液に５〜１０分浸しその後十分に水洗するこ
とで全ての肝細胞の核を染色した。乾燥後カバーグラス
をかけ、バルサムにて封入し標本を得た。
した物質ならび、両試験でそれぞれ陰性を示す対照物質
コ−ンオイル）をラットにＭＴＤ（最大耐量；被検物質
を動物に投与したときに、１匹の動物も死なない投与量
を示す）、１／２ＭＴＤ、１／４ＭＴＤの用量で強制経
口投与し、２４時間、３９時間、４８時間後にラット肝
臓を摘出し、１００％メタノールにて固定し、パラフィ
ン埋入組織ミクロトーム切片法により３〜５μｍの切片
を作製した。パラフィン埋入組織はキシレン中で清浄に
し、エタノールの段階稀釈により親水化し、組織にスキ
ムミルク液等のブロッキング液を数１０分作用させ、そ
の後ブロッキング液で稀釈した酵素標識ＰＣＮＡモノク
ローナル抗体を約６０分作用させた。これをトリス緩衝
液（ＴＢＳ ｐＨ７．６)で洗浄後、発色基質（ＤＡＢ
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ
ベクター社）を加え肝細胞の核を染色し、水洗後ヘマ
トキシリン液に５〜１０分浸しその後十分に水洗するこ
とで全ての肝細胞の核を染色した。乾燥後カバーグラス
をかけ、バルサムにて封入し標本を得た。
【００２２】３）癌原性の有無の評価 上記２）によって作製されたラット肝臓組織切片標本に
おいて、顕微鏡を用いて肝実質細胞を１，０００個数
え、ＰＣＮＡ陽性細胞の割合が全肝実質細胞に対し、い
ずれかの投与量または経過時間で最大値が陰性対照の値
の２倍以上であって且つ２．５％を越えた場合、被検物
質は癌原性を有する、すなわち陽性と評価した。
おいて、顕微鏡を用いて肝実質細胞を１，０００個数
え、ＰＣＮＡ陽性細胞の割合が全肝実質細胞に対し、い
ずれかの投与量または経過時間で最大値が陰性対照の値
の２倍以上であって且つ２．５％を越えた場合、被検物
質は癌原性を有する、すなわち陽性と評価した。
【００２３】
【表１】
【００２４】表１の結果より、被検物質の動物への投与
量がＭＴＤ及び１／２ＭＴＤにおいて、作用時間３９時
間で癌原性の検出が可能であることが判る。また、本発
明の被検物質の癌原性の検出法は、従来のエームステス
トでは陰性と判定されてしまう癌原性物質を短期間の試
験で陽性として検出できる。また、検出には抗体、酵素
を用いた染色のため、ラジオアイソトープを用いたオー
トラジオグラフィー等の特別の設備を必要とせず、また
検出時間も大幅に短縮される（数時間）利点を有する。
また、ラット肝臓を用いたＲＤＳ試験法とは異なるた
め、肝臓をコラゲナーゼにより分散させ、得られた細胞
を培養するため熟練を要しない。また、肝臓をアルコ−
ル等で固定するだけなので熟練を要する操作が必要でな
い。本発明は細胞の増殖のみならず肝組織の形態変化も
同時に観察でき、被検物質の肝臓に対する傷害性を検知
するのにも好適である。
量がＭＴＤ及び１／２ＭＴＤにおいて、作用時間３９時
間で癌原性の検出が可能であることが判る。また、本発
明の被検物質の癌原性の検出法は、従来のエームステス
トでは陰性と判定されてしまう癌原性物質を短期間の試
験で陽性として検出できる。また、検出には抗体、酵素
を用いた染色のため、ラジオアイソトープを用いたオー
トラジオグラフィー等の特別の設備を必要とせず、また
検出時間も大幅に短縮される（数時間）利点を有する。
また、ラット肝臓を用いたＲＤＳ試験法とは異なるた
め、肝臓をコラゲナーゼにより分散させ、得られた細胞
を培養するため熟練を要しない。また、肝臓をアルコ−
ル等で固定するだけなので熟練を要する操作が必要でな
い。本発明は細胞の増殖のみならず肝組織の形態変化も
同時に観察でき、被検物質の肝臓に対する傷害性を検知
するのにも好適である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 被検物質を投与し一定期間経過後取出し
た動物臓器細胞にＰＣＮＡモノクローナル抗体を反応さ
せ、該反応細胞に発色試薬を作用させ、発色された細胞
の割合から該被検物質の癌原性を検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34706293A JPH07191037A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 被検物質の癌原性を検出する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34706293A JPH07191037A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 被検物質の癌原性を検出する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07191037A true JPH07191037A (ja) | 1995-07-28 |
Family
ID=18387664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34706293A Pending JPH07191037A (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | 被検物質の癌原性を検出する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07191037A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1019086A1 (en) * | 1997-09-29 | 2000-07-19 | University of Maryland, Baltimore | Altered dna synthesome components as biomarkers for malignancy |
| US6803232B1 (en) | 1998-06-29 | 2004-10-12 | The Garvan Institute Of Medical Research | NPY-Y7 receptor gene |
| US7294471B2 (en) | 2002-02-27 | 2007-11-13 | Cskeys, Llc | Method for purifying cancer-specific proliferating cell nuclear antigen |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP34706293A patent/JPH07191037A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1019086A1 (en) * | 1997-09-29 | 2000-07-19 | University of Maryland, Baltimore | Altered dna synthesome components as biomarkers for malignancy |
| EP1019086A4 (en) * | 1997-09-29 | 2004-01-07 | Univ Maryland | MODIFIED DNA SYNTHESOME COMPONENTS |
| US6803232B1 (en) | 1998-06-29 | 2004-10-12 | The Garvan Institute Of Medical Research | NPY-Y7 receptor gene |
| US7294471B2 (en) | 2002-02-27 | 2007-11-13 | Cskeys, Llc | Method for purifying cancer-specific proliferating cell nuclear antigen |
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