DE2912845A1

DE2912845A1 - Verfahren zum nachweis und zur quantitativen bestimmung von antigenen, antikoerpern, oder komplexen aus antigenen und antikoerpern

Info

Publication number: DE2912845A1
Application number: DE19792912845
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Frenzel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-03-30
Filing date: 1979-03-30
Publication date: 1980-10-09

Description

Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung
von Antigenen, 4ntikdrpexn, oder komplexen aus Antigenen und Antikörpern Die Erfindung betrifft ein neues immunologisches Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Antigenen Antikörpern, oder Komplexen aus Antigenen und Antikörpern.
Der Ausdruck "Antigenen" umfasst dabei auch Haptene und andere Substanzen,die durch Antikörper , oder ähnliche Bindeproteine, gebunden werden können. Die Erfindung bezieht eich ebenfalls auf die Reagentien ftir dieses Verfahren.
Es ist bekanntlich von großer Bedeutung,das Vorhandensein und die Quantität von Antigenen, Antikörpern, oder Komplexen aus Antigenen und Antikörpern nachzuweisen und zu messen.
Hierzu bestehen eine Reihe von Verfahren die auf der Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen und bei denen eine Reaktionskomponente durch eine radioaktive Markierung, oder durch eine Konjugierung mit einem Enzym , oder mit einem Pluoreszenzfarbstoff,gekennzeichnet ist.
Da bei der Fluoreszenztechnik durch Bestrahlung mit kurzwelligem Licht, bei Verwendung speziell ausgerüsteter Mikroskope, das emittierte Licht der fluorchrommarkierten Antikörper gemessen, oder durch einen Betrachter beurteilt wird, muß durch eine aufwendige Pilteranlage das Anregungslicht von dem ausgestrahlten Licht getrennt werden. Dies bedingt eine geringe Empfindlichkeit des Fluoreszenstest.
Weiterhin wird durch die subJektive Beurteilung eines quantitative Präparats eine Aussage fast unmöglich.
Bei der Markierung eines Reaktionspartners mit einem Enzym ist die Herstellung der Konjugat nicht immer einfach, da die Enzymaktivität des gebundenen Enzyms erhalten bleiben muß. Weiterhin ist es nötig einen Reaktionspartner an eine feste Phase zu binden, was oft sehr schwer ist und quantitative Aussagen abhängig von der Menge des gebundenen Reaktionspartners und damit unsicher macht.
Die auf radioaktiver Markierung beruhenden Verfahren besitzen verschiedene Vorteile. So vor allem die hohe Sensitivität und die Möglichkeit, sowohl Festphasen-,als auch Flüssigphassnassays durchiUhren zu können. Der große Nachteil dieser Verfahren ist aber die Notwendigkeit mit radioaktises Substanzen umgehen zu müßen und die Notwendigkeit seiner aufwendigen Abfallbeseitigung ( A. Beayr, P.A. Bachmann, B. Bibrack und G. Wittmann t Virologische Arbeitsmethoden, Band II Serologie, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, New York 1977 Seite 52-74 )* Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde im Flüssigphasen assay und im Festphasenassay eine empfindliche und quantitative Aussage, ohne den Gebrauch von radioaktiven Substanzen, zu gestatten0 Dabei sollen direkte, indirekte und antikomplementäre Methoden angewendet werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsmäßig dadurch gelöst, daß ein Partner der Reaktion mit einer organisch-chemischen Substanz verbunden wird, die in trockenem Zustand, oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel, nach Zugabe von Ozon, Chemoluminiszenz zeigt, Solche organischchemischen Substanzen sind z.B.s Aesculin, Benzoin, Dinitrophenol, Fluorisothiocyanat, Hämatoxylin, Methylenblau, Acridinorange, Pluorescein, Phenosafranin, xethylviolett Die Markierung mit solchen organisch-chemischen Stoffen muß 80 erfolgen, daß die serologische Aktivität des Reaktionspartners erhalten bleibt Dies kann dadurch erfolgen, daß der Reaktionspartner an ein Affinitätschromatographie-Gel gebunden wird und die Markierung in diesem serologisch gebundenem Zustand erfolgt.
Der solchermaßen markierte Reaktionspartner kamm nun in einem Festphasenassay, oder in einem Pltssigphasenassay, eingesetzt werden0 Nach erfolgter Trennung von serologisch gebundenem und nicht gebundenem markierten Reaktionspartner kann die Menge des markierten Reaktionspartners der serologisch reagiert hat durch die Messung der Ohemoluminiszenz ermittelt werden Dazu kann der gebundene, oder der nicht gebundene Anteil, oder beide Teile des markierten Reaktionspartners gemessen werden. Der zu messende Teil wird in einem organischen Lösungsmittel, wie z03. Aceton, gelöst und sofort mittels Xurchblasen von Ozon, oder nach erfolgter Trocknung mittels Anblasen mit Ozon, gemessen.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß außerordentlich sensitiv quantitative Aussagen über Antigene, Antikörper, oder Komplexen aus Antikörpern und Antigenen , gemacht werden könnens Dabei ist jede serologische Methode wie die direkte, die indirekte und die antikomplementäre Methode möglich.
Ein erstes Ausführungsbeispiel ist im folgenden näher dargestellt.
1 Markierung eines Antiserums mit Methylenblaut An eine CnBr-aktiv1erte Sepharose wurde chemisch Rinderserumalbumin gebunden. ueber die solchermaßen hergestellte Affinitätschromatographiesäule mit einem Volumen von 0,5 ml wurde 1 ml eines Kaninchen-Hyperimmunserums gegen Rinderserumalbumin gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 2 ml hosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde eine 1:2 in PBS verdünnte Methylenblaulösung über die Säule gegeben. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die gebundenen1 spezifischen und gefärbten Antikörper gegen Rinderserumalbumin mit einer 3 molaren Kaliumthiocyanatlösung eluiert.
Die eluierte Probe wurde anschließend durch Siebchromatographie auf einer Sephadex G 25 Säule mit PBS umgesalzen.
2. Festphasenassay In Plastik-Szintillationsgefänc wurde 0,5 ml einer Rind erserumalbuminlösung ( 5mg pro ml #Ea in Veronalpuffer pH 8,5 ) gegeben und dem Rinderserumalbumin 4 Stunden bei 4 °C Gelegenheit zur Bindung an das Plastikmaterial gegeben.
Anschließend wurden die Gefäße 3x mit PBS und Tween 20 ( 0,05 % ) gewaschen und je 0,4 ml einer Verdünnung der methylenblaumarkierten Antikörper in Je ein Szintillationsgefäß gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 30 Win. bei 37 oC wurden die Gefäße 3x mit PBS und Tween 20 gewaschen.
In die Szintillationsgefäße wurde nun 0,1 ml Aceton gegeben und nach dem Verdunsten des Acetons mittels eines Ozonisators Ozon und Luft in das Gefäß geblasen, Die auftretende Ohemoluminiszenz wurde mittels eines Photonenzählers ( Beckman LS 8000 ) gemessen. Bis zu einer Verdünnung der Antikörper von 2 15 konnte noch Ohemoluminiszenz nachgewiesen werden.
Ein zweites Anwendungsbeispiel der Erfindung ist im folgenden dargestellt: Ein käuflich erworbenes Fluorisothiocyanat konJugiertes Antiserum gegen Komplement C3 wurde im Plüssigphasenassay in unterschiedlichen VerdünnShgen mit Komplement inkubiert.
Nach einer Inkubationszeit von 30 min. wurden die entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexe bei 5000 Umdrehungen pro Minute abtentrifugiert und nach Abgießen des Überstands in 100 Aceton aufgenommen. Die Antigen-Antikörper-Komplexe, aufgelöst in Aceton, wurden in ein Szintillationsgefäß überführt und nach Einblasen von Ozon und tuft die auftretende Chemoluminiszenz gemessen. Dabei konnte noch bei einer Verdünnung des Antiserums von to5 eine deutliche Chemoluminiszenz gemessen werden.

Claims

PATENT ANS PRtIOHE 1. Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Komplexen aus Antigenen und Antikörpern dadurch gekennzeichnet, daß organischchemische Substanzen)die nach Zuführung von Ozon Chemoluminissenz zeigen1 an einen der Reaktionspartner gebunden und nach stattgefundener serologischer Reaktion durch ihre Chemoluminiszenz nachgewiesen werden.
2 Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung mit der organisch-chemischen Substanz während der Bindung des zu markierenden Reaktionspartners an ein Affinitätachromatographie-Gel erfolgt.