JPH06180314A - 試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用 - Google Patents
試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 網赤血球と成熟赤色血液細胞との同定と区別
との方法を提供する。 【構成】 血液試料中の網赤血球を染色するための有機
カチオン染料と、約６〜９のｐＨを維持するための緩衝
溶液とを含む試薬組成物を使用する。その染料は青色吸
収染料オキサジン７５０またはニューメチレンブルーで
あってもよい。双性イオン界面活性剤が網赤血球と赤血
球との等積的球形化のため試薬組成物中に含まれ、その
試薬組成物と全血試料との混合物を流通式細胞測定器の
センシング領域を通過させると、各細胞により散乱およ
び吸収された光が測定され、赤血球は網赤血球と区別さ
れ、各網赤血球または赤血球の体積とヘモグロビン濃度
とヘモグロビン含有量並に網赤血球または赤血球の平均
細胞体積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグ
ロビンとが、測定された細胞１つずつの体積とヘモグロ
ビン濃度とから計算される。１つの方法はまた擬似吸収
に関して、測定した吸収信号を調節することを含んでい
る。
との方法を提供する。 【構成】 血液試料中の網赤血球を染色するための有機
カチオン染料と、約６〜９のｐＨを維持するための緩衝
溶液とを含む試薬組成物を使用する。その染料は青色吸
収染料オキサジン７５０またはニューメチレンブルーで
あってもよい。双性イオン界面活性剤が網赤血球と赤血
球との等積的球形化のため試薬組成物中に含まれ、その
試薬組成物と全血試料との混合物を流通式細胞測定器の
センシング領域を通過させると、各細胞により散乱およ
び吸収された光が測定され、赤血球は網赤血球と区別さ
れ、各網赤血球または赤血球の体積とヘモグロビン濃度
とヘモグロビン含有量並に網赤血球または赤血球の平均
細胞体積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグ
ロビンとが、測定された細胞１つずつの体積とヘモグロ
ビン濃度とから計算される。１つの方法はまた擬似吸収
に関して、測定した吸収信号を調節することを含んでい
る。
Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は試薬組成物並に全血試料中
の細胞の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）および特性表
示（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）へのその使用、更
に特別には試薬組成物並に光散乱および吸収流通式細胞
測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）技術による、全
血試料中の（ｉ）網状赤血球の同定および（ｉｉ）多数
の個別の網状赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃
度とヘモグロビン含有量との同時測定へのその使用に関
する。
の細胞の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）および特性表
示（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ）へのその使用、更
に特別には試薬組成物並に光散乱および吸収流通式細胞
測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）技術による、全
血試料中の（ｉ）網状赤血球の同定および（ｉｉ）多数
の個別の網状赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃
度とヘモグロビン含有量との同時測定へのその使用に関
する。
【０００２】
【先行技術の説明】凡ての高等動物においては血液は種
種な小体、即ち赤色血液細胞（赤血球と白色血液細胞
（白血球）と血小板とを懸濁する水性流体部分（血漿）
より成る。血漿は大約水９０％と蛋白質９％と塩０．９
％と他の材料例えば糖、尿素、尿酸等を含む組成物であ
る。
種な小体、即ち赤色血液細胞（赤血球と白色血液細胞
（白血球）と血小板とを懸濁する水性流体部分（血漿）
より成る。血漿は大約水９０％と蛋白質９％と塩０．９
％と他の材料例えば糖、尿素、尿酸等を含む組成物であ
る。
【０００３】末梢血液（即ち、骨髓外の血液）の細胞即
ち小体は２つの主な群即ちその第１目的が酸素の輸送で
ある赤血球と、その第１機能が免疫システムと体に異質
の材料の破壊とである白血球とに分かれる。この２つの
主要な群のほかに、血液はまた、止血において重要な所
謂血小板を含有している。
ち小体は２つの主な群即ちその第１目的が酸素の輸送で
ある赤血球と、その第１機能が免疫システムと体に異質
の材料の破壊とである白血球とに分かれる。この２つの
主要な群のほかに、血液はまた、止血において重要な所
謂血小板を含有している。
【０００４】赤血球の熟成の最終段階はそれが骨髓を離
れた後、これらの細胞が末梢血液中を循環しながら起
る。これらの若い赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、
網赤血球とも言う）はその核を失い、それ故分裂する、
あるいはリボ核酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。こ
れらの機能は停止するが、赤血球は代謝的にはまだ活性
で、しばらくは蛋白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取
り込み、そしてエネルギーに豊んだ状態を維持するのに
要求される必要な代謝反応を行うことができる。これら
の細胞は普通、それを網赤血球中の陰イオン性ＲＮＡと
反応し、網赤血球中の、網赤血球にその名を与えてい
る。細いあるいは粗い染色した“細網”中に沈澱するカ
チオン染料の溶液にさらすことにより、成熟赤血球と非
常に容易に区別される。
れた後、これらの細胞が末梢血液中を循環しながら起
る。これらの若い赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、
網赤血球とも言う）はその核を失い、それ故分裂する、
あるいはリボ核酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。こ
れらの機能は停止するが、赤血球は代謝的にはまだ活性
で、しばらくは蛋白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取
り込み、そしてエネルギーに豊んだ状態を維持するのに
要求される必要な代謝反応を行うことができる。これら
の細胞は普通、それを網赤血球中の陰イオン性ＲＮＡと
反応し、網赤血球中の、網赤血球にその名を与えてい
る。細いあるいは粗い染色した“細網”中に沈澱するカ
チオン染料の溶液にさらすことにより、成熟赤血球と非
常に容易に区別される。
【０００５】網赤血球は正常では全赤血細胞個体群の約
０．５〜２％含まれるが、この百分率は異常状態では劇
的に変化し得る。例えば血液疾患研究における診断補助
として、出血後の赤色血液細胞再生の指針として、並
に、或る種の悪性疾患の化学療法における初期毒性の監
視のため、網赤血球数は長年用いられて来た。
０．５〜２％含まれるが、この百分率は異常状態では劇
的に変化し得る。例えば血液疾患研究における診断補助
として、出血後の赤色血液細胞再生の指針として、並
に、或る種の悪性疾患の化学療法における初期毒性の監
視のため、網赤血球数は長年用いられて来た。
【０００６】核酸（ＲＮＡとＤＮＡ）は実際上どんなカ
チオン染料ででも染色することができるポリアニオンで
ある。網赤血球中のＲＮＡはほんの僅かなカチオン染料
〔ブリリアントクレジルブルー（ＢＣＧ）とニューメチ
レンブルー（ＮＭＢ）とオーラミンＯ（ＡｕＯ）とアク
リジンオレンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）
とピロニンＹ（ＰＹ）とを含む〕で染色できる。これら
の染料のうち、僅か一つの部分集合のみが速に細胞を浸
透（従って染色）できる。この部分集合にはＮＭＢとＡ
Ｏとが含まれる。網赤血球の染色の速さと度合とは染料
の細胞外濃度と染料の網赤血球膜を通しての浸透速度
と、カチオン染料と網赤血球ＲＮＡとの間の比結合恒数
の大きさとに左右される。後２者の性質は各染料で異っ
ていて容易に予見することはできず、それ故有用な網赤
血球染料を発見するには試行錯誤が必要である。凡ての
カチオン物質が元のままの赤色細胞（および網赤血球）
膜を浸透できるわけでなく、必然的にカチオンを伴うア
ニオンの本性が、そのカチオン物質が速に、遅くまたは
全く浸透するか、しないかに影響し得る。疎水性分子は
一般には親水性分子より速に赤色細胞膜を浸透し、小さ
い分子は一般に大きい分子より速に膜を浸透する。網赤
血球を染色できるカチオン染料と混合された塩または緩
衝剤の部分集合のみが速かな染色を可能にする。即ち
“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網赤血球を
染色するのに“永久の”時間がかかる。さらに、網赤血
球染色混合物の有用な処方を発見するためには試行錯誤
が必要である。かくて、手引きとして使用できる種種な
“ルール”にも拘らず、どんな特別なカチオン染料が、
どんな条件の下で速に浸透し、網赤血球を染色するかを
直感的に予見することは未だ不可能である。
チオン染料ででも染色することができるポリアニオンで
ある。網赤血球中のＲＮＡはほんの僅かなカチオン染料
〔ブリリアントクレジルブルー（ＢＣＧ）とニューメチ
レンブルー（ＮＭＢ）とオーラミンＯ（ＡｕＯ）とアク
リジンオレンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）
とピロニンＹ（ＰＹ）とを含む〕で染色できる。これら
の染料のうち、僅か一つの部分集合のみが速に細胞を浸
透（従って染色）できる。この部分集合にはＮＭＢとＡ
Ｏとが含まれる。網赤血球の染色の速さと度合とは染料
の細胞外濃度と染料の網赤血球膜を通しての浸透速度
と、カチオン染料と網赤血球ＲＮＡとの間の比結合恒数
の大きさとに左右される。後２者の性質は各染料で異っ
ていて容易に予見することはできず、それ故有用な網赤
血球染料を発見するには試行錯誤が必要である。凡ての
カチオン物質が元のままの赤色細胞（および網赤血球）
膜を浸透できるわけでなく、必然的にカチオンを伴うア
ニオンの本性が、そのカチオン物質が速に、遅くまたは
全く浸透するか、しないかに影響し得る。疎水性分子は
一般には親水性分子より速に赤色細胞膜を浸透し、小さ
い分子は一般に大きい分子より速に膜を浸透する。網赤
血球を染色できるカチオン染料と混合された塩または緩
衝剤の部分集合のみが速かな染色を可能にする。即ち
“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網赤血球を
染色するのに“永久の”時間がかかる。さらに、網赤血
球染色混合物の有用な処方を発見するためには試行錯誤
が必要である。かくて、手引きとして使用できる種種な
“ルール”にも拘らず、どんな特別なカチオン染料が、
どんな条件の下で速に浸透し、網赤血球を染色するかを
直感的に予見することは未だ不可能である。
【０００７】流通式細胞測定法の根本的概念は本質的に
は特定のセンシング領域を通して１度に１つの細胞を通
過させることである。典型的には、水力学的集束により
単一細胞を、集束された光源と散乱、吸収または蛍光光
線測定のための検出システムとより成るセンシング域を
通過させる。粒子が持つ、それがさえぎった光への影響
は多くの方法で検出できる。一般に、粒子はそれが懸濁
されている媒質の屈折率とは違う屈折率を持っている。
それ故、それは照明されている光を、ある角度範囲を通
じて、屈折率差と粒子寸法と形と屈折率の内部変動と構
造並に照明光の波長とに左右される種種な強度で散乱す
る。（均一球体に関してはＭｉｅの散乱理論が散乱光の
分布と強度とに関し完全な記述を与えている。）また粒
子は入射光の幾らかを吸収してもよい。後者の場合、吸
収光の一部分は、典型的には吸収光の波長より長い波長
で蛍光として再放射されいもよい。
は特定のセンシング領域を通して１度に１つの細胞を通
過させることである。典型的には、水力学的集束により
単一細胞を、集束された光源と散乱、吸収または蛍光光
線測定のための検出システムとより成るセンシング域を
通過させる。粒子が持つ、それがさえぎった光への影響
は多くの方法で検出できる。一般に、粒子はそれが懸濁
されている媒質の屈折率とは違う屈折率を持っている。
それ故、それは照明されている光を、ある角度範囲を通
じて、屈折率差と粒子寸法と形と屈折率の内部変動と構
造並に照明光の波長とに左右される種種な強度で散乱す
る。（均一球体に関してはＭｉｅの散乱理論が散乱光の
分布と強度とに関し完全な記述を与えている。）また粒
子は入射光の幾らかを吸収してもよい。後者の場合、吸
収光の一部分は、典型的には吸収光の波長より長い波長
で蛍光として再放射されいもよい。
【０００８】これらおよび他の影響は種種な角度間隔の
散乱光と非散乱光と蛍光とを測定するために設備した光
検出器を用いて測定できる。
散乱光と非散乱光と蛍光とを測定するために設備した光
検出器を用いて測定できる。
【０００９】粒子が細胞程小さい、典型的には直径１５
μｍより小さい場合、高速度での通過（典型的には１秒
当り広く間隔をあけた細胞数１００乃至数１０００）に
より影響され、そして特に懸濁流の照明された部分に落
ちる毎秒当りの光子の数に比較した〔そして吸収検出器
（そして蛍光検出器）のバックグラウンド照明に比較し
た〕照明ビーム中の光子数は非常に小であり得る。それ
故、粒子間の小さい特別な差異の検出感度の限界は決定
的に光子流束（少くとも光源の固有の“輝度”に左右さ
れる）とその光子流束の、粒子間の他の大小の差異によ
り起される攝動がどの位大きいかに左右される。
μｍより小さい場合、高速度での通過（典型的には１秒
当り広く間隔をあけた細胞数１００乃至数１０００）に
より影響され、そして特に懸濁流の照明された部分に落
ちる毎秒当りの光子の数に比較した〔そして吸収検出器
（そして蛍光検出器）のバックグラウンド照明に比較し
た〕照明ビーム中の光子数は非常に小であり得る。それ
故、粒子間の小さい特別な差異の検出感度の限界は決定
的に光子流束（少くとも光源の固有の“輝度”に左右さ
れる）とその光子流束の、粒子間の他の大小の差異によ
り起される攝動がどの位大きいかに左右される。
【００１０】吸収、散乱および蛍光流通式細胞測定信号
における妨害の主要な源は各信号により全く異り得る。
１次近似として、染色されたまたは未染色の細胞からの
蛍光信号の大きさはその信号を引起す細胞の形または方
向により殆んど影響されないが、散乱および吸収信号は
形と方向により非常に強く影響される。極端な例として
人赤血球の本来の両凹形はそれが生じさせる吸収および
散乱信号に対し、深刻な影響を持ち、典型的な、伝統的
に染色された網赤血球の小さな吸収信号より大きい影響
を持つ（図８Ａおよび８Ｂを見よ）。これが本発明の前
には吸収流通式細胞測定法が網赤血球の計数または一般
に、細胞中の低濃度の吸収分子の測定に関して有用でな
かった理由である。他方、細胞中または（例えば結合さ
れていない蛍光染料）それらを囲む媒質中の弱い蛍光材
料は吸収または散乱信号に対し実質的に影響しない。
における妨害の主要な源は各信号により全く異り得る。
１次近似として、染色されたまたは未染色の細胞からの
蛍光信号の大きさはその信号を引起す細胞の形または方
向により殆んど影響されないが、散乱および吸収信号は
形と方向により非常に強く影響される。極端な例として
人赤血球の本来の両凹形はそれが生じさせる吸収および
散乱信号に対し、深刻な影響を持ち、典型的な、伝統的
に染色された網赤血球の小さな吸収信号より大きい影響
を持つ（図８Ａおよび８Ｂを見よ）。これが本発明の前
には吸収流通式細胞測定法が網赤血球の計数または一般
に、細胞中の低濃度の吸収分子の測定に関して有用でな
かった理由である。他方、細胞中または（例えば結合さ
れていない蛍光染料）それらを囲む媒質中の弱い蛍光材
料は吸収または散乱信号に対し実質的に影響しない。
【００１１】全血の抗凝固試料中の網赤血球の百分率の
計数に用いることができる幾つかの半自働化されている
方法が利用できる。現在の各方法では、有機カチオン染
料例えばＡＯ、ＡｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤が網
赤血球内のＲＮＡを染色するのに用いられる。染料細胞
膜を浸透し、ＲＮＡと結合し、そして通常各網赤血球中
の“細網”を沈澱させる。染色されたＲＮＡからの信号
量は大雑把にはＲＮＡ含量に比例する。適当な染色の
後、適当な励起光源を設備した蛍光流通式細胞測定器
（典型的には４８８ｎｍで放射するアルゴンイオンレー
ザーと発光検出器）が流出液中の網赤血球の百分率決定
に使用できる。
計数に用いることができる幾つかの半自働化されている
方法が利用できる。現在の各方法では、有機カチオン染
料例えばＡＯ、ＡｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤が網
赤血球内のＲＮＡを染色するのに用いられる。染料細胞
膜を浸透し、ＲＮＡと結合し、そして通常各網赤血球中
の“細網”を沈澱させる。染色されたＲＮＡからの信号
量は大雑把にはＲＮＡ含量に比例する。適当な染色の
後、適当な励起光源を設備した蛍光流通式細胞測定器
（典型的には４８８ｎｍで放射するアルゴンイオンレー
ザーと発光検出器）が流出液中の網赤血球の百分率決定
に使用できる。
【００１２】蛍光染料と流通式細胞測定法を用いる、全
血中の網赤血球を弁別する実例とする方法は特許文献に
公開されている。
血中の網赤血球を弁別する実例とする方法は特許文献に
公開されている。
【００１３】例えば、ＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙ
との米国特許第３，６８４，３７７号は、人血に関する
正常な生理学的範囲内のｐＨ因子と浸透性とをもつアク
リジンオレンジの水性溶液を含む、示差血液分析分析用
染料組成物を公開している。その染料組成物は赤血球散
乱信号をもつ蛍光信号の有無を測定することによる、網
赤血球の計数に用いることができる。
との米国特許第３，６８４，３７７号は、人血に関する
正常な生理学的範囲内のｐＨ因子と浸透性とをもつアク
リジンオレンジの水性溶液を含む、示差血液分析分析用
染料組成物を公開している。その染料組成物は赤血球散
乱信号をもつ蛍光信号の有無を測定することによる、網
赤血球の計数に用いることができる。
【００１４】Ａｄａｍｓの米国特許第３，８８３，２４
７号は、濃度１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌのアクリジンオレ
ンジを含む染料組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅ
ｎｔｓｋｙとの特許と同じ方法を公開している。
７号は、濃度１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌのアクリジンオレ
ンジを含む染料組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅ
ｎｔｓｋｙとの特許と同じ方法を公開している。
【００１５】Ｎａｔａｌｅの米国特許第４，３３６，０
２９号は、ｐＨ約７．４、等浸透性で、染料ＡＯとクエ
ン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶液を包含
する試薬組成物を公開している。種種な成分の濃度は網
赤血球と血小板との染料取込みを最大にするよう選択さ
れ、染料取込みが血液試料と試薬組成物との混合２〜５
分の中に達成されるよう与えられる。Ｎａｔａｌｅ試薬
を利用する、血小板と網赤血球との自働化検出法はＧｅ
ｒｓｈｍａｎ等の米国特許第４，３２５，７０６号に公
開されている。
２９号は、ｐＨ約７．４、等浸透性で、染料ＡＯとクエ
ン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶液を包含
する試薬組成物を公開している。種種な成分の濃度は網
赤血球と血小板との染料取込みを最大にするよう選択さ
れ、染料取込みが血液試料と試薬組成物との混合２〜５
分の中に達成されるよう与えられる。Ｎａｔａｌｅ試薬
を利用する、血小板と網赤血球との自働化検出法はＧｅ
ｒｓｈｍａｎ等の米国特許第４，３２５，７０６号に公
開されている。
【００１６】Ｓａｇｅ，Ｊｒ．の米国特許第４，７０
７，４５１号に公開されている試薬においては、網赤血
球はチオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色され
る。生理学的食塩水中の染料（０．２ｍｇ／ｍｌ）の２
５μｌアリコートを抗凝固性にされた血液１０μｌと混
合し、その混合物を約７分間培養して効果的に染色され
ることが見出された。
７，４５１号に公開されている試薬においては、網赤血
球はチオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色され
る。生理学的食塩水中の染料（０．２ｍｇ／ｍｌ）の２
５μｌアリコートを抗凝固性にされた血液１０μｌと混
合し、その混合物を約７分間培養して効果的に染色され
ることが見出された。
【００１７】Ｌｅｅ等の米国特許第４，８８３，８６７
号はＲＮＡまたはＤＮＡ染色用の染料組成物を公開して
いる。その染色組成物は好ましい染料化合物としてＴＯ
を含んでいる。網赤血球は最小時間３０分内に染色され
る。
号はＲＮＡまたはＤＮＡ染色用の染料組成物を公開して
いる。その染色組成物は好ましい染料化合物としてＴＯ
を含んでいる。網赤血球は最小時間３０分内に染色され
る。
【００１８】流通式細胞測定技術での網赤血球計数用の
試薬はＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号
に記載されていて、それは染料例えばＡｕＯによる成熟
赤血球の非特異染色を減少し、蛍光流通式細胞測定法に
より分析される場合、成熟赤血球が間違って網赤血球と
して計数されることを防ぐため炭酸塩を含有している。
試薬はＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号
に記載されていて、それは染料例えばＡｕＯによる成熟
赤血球の非特異染色を減少し、蛍光流通式細胞測定法に
より分析される場合、成熟赤血球が間違って網赤血球と
して計数されることを防ぐため炭酸塩を含有している。
【００１９】米国特許第４，９８１，８０３号は２つの
溶液、即ち染料ＡｕＯを非水性溶剤に溶解した染色用の
原溶液と、最適の染色条件を満足させる緩衝溶液とを包
含する、網赤血球計数用試薬を記載している。
溶液、即ち染料ＡｕＯを非水性溶剤に溶解した染色用の
原溶液と、最適の染色条件を満足させる緩衝溶液とを包
含する、網赤血球計数用試薬を記載している。
【００２０】ＡｕＯを含む、蛍光流通式細胞測定技術用
の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａ等の米国特許第
４，９８５，１７６号に公開されている。この文献は３
０秒と２０分との間のどこでもよい、試薬と試料との培
養時間を教えている。
の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａ等の米国特許第
４，９８５，１７６号に公開されている。この文献は３
０秒と２０分との間のどこでもよい、試薬と試料との培
養時間を教えている。
【００２１】前記の如く、カチオン染料の極く小さい部
分集合のみが網赤血球を選択的に染色し、これらの更に
小さい部分集合のみが速に網赤血球に浸透する。この発
明のカチオン染料は網赤血球を５分以下の中に染色し、
それ故血液試料と試薬組成物とを互に混合後すぐ流通式
細胞測定法により網赤血球分析を行い得て、それ故本発
明は自働化された方法に容易に受入れられる。
分集合のみが網赤血球を選択的に染色し、これらの更に
小さい部分集合のみが速に網赤血球に浸透する。この発
明のカチオン染料は網赤血球を５分以下の中に染色し、
それ故血液試料と試薬組成物とを互に混合後すぐ流通式
細胞測定法により網赤血球分析を行い得て、それ故本発
明は自働化された方法に容易に受入れられる。
【００２２】網赤血球定量のための４級化ＡＯ誘導体
が、ここに文献に加えられている、“化合物および試薬
組成物と全血中の網赤血球の定量へのその使用”と題す
る、ＦａｎとＦｉｓｃｈｅｒとの、１９８９年１月１２
日出願の同時係属米国特許出願番号第０７／４４４，２
５５号に記載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラフオル
ムアルデヒドと蓚酸カリウムとを含む緩衝溶液中にＡＯ
誘導体１０-6ｇ／ｍｌを含有する。この試薬組成物は網
赤血球を染色し、血液試料中の網赤血球の定量的蛍光流
通式細胞測定分析を可能にする。この試薬もまた前記の
試薬の何れも以下に論ずるような方向雑音問題を防止す
るための球形化剤を含有してはいなくて、細胞１つずつ
に基いて他の診断学的に重要なパラメーター例えば網赤
血球と赤血球との体積およびヘモグロビン濃度の同時測
定ができない。
が、ここに文献に加えられている、“化合物および試薬
組成物と全血中の網赤血球の定量へのその使用”と題す
る、ＦａｎとＦｉｓｃｈｅｒとの、１９８９年１月１２
日出願の同時係属米国特許出願番号第０７／４４４，２
５５号に記載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラフオル
ムアルデヒドと蓚酸カリウムとを含む緩衝溶液中にＡＯ
誘導体１０-6ｇ／ｍｌを含有する。この試薬組成物は網
赤血球を染色し、血液試料中の網赤血球の定量的蛍光流
通式細胞測定分析を可能にする。この試薬もまた前記の
試薬の何れも以下に論ずるような方向雑音問題を防止す
るための球形化剤を含有してはいなくて、細胞１つずつ
に基いて他の診断学的に重要なパラメーター例えば網赤
血球と赤血球との体積およびヘモグロビン濃度の同時測
定ができない。
【００２３】ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖｅｎｓとはＦｌ
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎｅ７５０ ｏｒ Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｈ６３３ｎｍ
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第１
巻、１０７−１１０頁（１９８６）において、流通式細
胞測定法によるＤＮＡ含有量の測定のためのオキサジン
７５０の使用を公開している。細胞はオキサジン７５０
１０〜３０μＭで染色され、ＤＮＡ測定のためエタノ
ール添加により固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖ
ｅｎｓとはオキサジン７５０はＲＮＡを染色するように
は見えないと主張している。更にその上オキサジン７５
０を用いる実験案は網赤血球計数あるいは他の診断学的
に重要な赤色細胞パラメーター例えば体積とヘモグロビ
ン濃度との細胞１つづつに基く同時測定を可能にしてい
ない。
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎｅ７５０ ｏｒ Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｈ６３３ｎｍ
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第１
巻、１０７−１１０頁（１９８６）において、流通式細
胞測定法によるＤＮＡ含有量の測定のためのオキサジン
７５０の使用を公開している。細胞はオキサジン７５０
１０〜３０μＭで染色され、ＤＮＡ測定のためエタノ
ール添加により固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖ
ｅｎｓとはオキサジン７５０はＲＮＡを染色するように
は見えないと主張している。更にその上オキサジン７５
０を用いる実験案は網赤血球計数あるいは他の診断学的
に重要な赤色細胞パラメーター例えば体積とヘモグロビ
ン濃度との細胞１つづつに基く同時測定を可能にしてい
ない。
【００２４】前記の如く、吸収または散乱光流通式細胞
測定器を利用する網赤血球計数の不利な点は方向雑音と
網赤血球信号との間の弁別が出来ないことである。人お
よび多くの他の哺乳動物の赤色血液細胞は両凹ディスク
の形を持っている。そのような非対称赤色血液細胞によ
り散乱される光の量は細胞の方向に従って変る。従って
同一の赤色血液細胞がセンシング域を通過する時、その
方向がその域で同一でない限り非常に違った散乱光と吸
収信号とを生ずる。その結果正常な赤色細胞に関する散
乱および吸収信号の分布は非常に広く、２つのモードが
あることになる（図１４および１５を参照）。少量の染
色された細網が１つは存在するけれども同一である２つ
の赤色血液細胞は違った方向の故に、一般に散乱光およ
び吸収検出器に対し大きい信号差を生ずる。これが起る
と、染色された細網が生ずるであろう非常に小さい差異
は方向雑音中に埋没してしまう。
測定器を利用する網赤血球計数の不利な点は方向雑音と
網赤血球信号との間の弁別が出来ないことである。人お
よび多くの他の哺乳動物の赤色血液細胞は両凹ディスク
の形を持っている。そのような非対称赤色血液細胞によ
り散乱される光の量は細胞の方向に従って変る。従って
同一の赤色血液細胞がセンシング域を通過する時、その
方向がその域で同一でない限り非常に違った散乱光と吸
収信号とを生ずる。その結果正常な赤色細胞に関する散
乱および吸収信号の分布は非常に広く、２つのモードが
あることになる（図１４および１５を参照）。少量の染
色された細網が１つは存在するけれども同一である２つ
の赤色血液細胞は違った方向の故に、一般に散乱光およ
び吸収検出器に対し大きい信号差を生ずる。これが起る
と、染色された細網が生ずるであろう非常に小さい差異
は方向雑音中に埋没してしまう。
【００２５】ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの米国特許第
４，５７５，４９０と４，４１２，００４号とは流通式
細胞測定器での赤色血液細胞体積測定における方向雑音
の除去法を教えている。彼等の方法は、細胞体積のより
一層精密で正確な測定を可能にする細胞間の如何なる差
異も除去するために、未染色の赤色血液細胞の等積球形
化を包含している。各血色血液細胞は界面活性剤球形化
剤により両凹形から完全な球形に変換される。赤血球の
溶血を防止するため、“緩衝”蛋白質および（または）
アルデヒド固定剤とを球形化剤と共に用いる。Ｋｉｍと
Ｏｒｎｓｔｅｉｎとによって記載されているアニオン界
面活性剤は、細網を染色し、沈澱するのに用いられるカ
チオン染料と速に反応し、沈澱することが判っている故
に、網赤血球染料と共には使用できない。
４，５７５，４９０と４，４１２，００４号とは流通式
細胞測定器での赤色血液細胞体積測定における方向雑音
の除去法を教えている。彼等の方法は、細胞体積のより
一層精密で正確な測定を可能にする細胞間の如何なる差
異も除去するために、未染色の赤色血液細胞の等積球形
化を包含している。各血色血液細胞は界面活性剤球形化
剤により両凹形から完全な球形に変換される。赤血球の
溶血を防止するため、“緩衝”蛋白質および（または）
アルデヒド固定剤とを球形化剤と共に用いる。Ｋｉｍと
Ｏｒｎｓｔｅｉｎとによって記載されているアニオン界
面活性剤は、細網を染色し、沈澱するのに用いられるカ
チオン染料と速に反応し、沈澱することが判っている故
に、網赤血球染料と共には使用できない。
【００２６】Ｔｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０
４号はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム、即ち抗凝
固性にされている全血試料中の個別および平均赤血球体
積（ＭＣＶ）並に赤血球の個別および平均小体ヘモグロ
ビン濃度（ＭＣＨＣ）の測定のための完全自働化法およ
び手段を与えている流通式細胞測定器の赤色血液細胞チ
ャネルを公開している。この方法においては、全血試料
の２μｍアリコート中の赤色血液細胞を始めに希釈し、
それから、今記載したＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方
法を用いて等積的に球形化する。２０秒培養後、これら
の細胞を、本質的に１度に１個、分析器の赤色細胞チャ
ネル内の照明されている測定域を通過させる。２つの個
別の角度間隔中に、これらの細胞により散乱される光の
量を測定する。光源と検出角との選択がこの適用におい
ては決定的に重要である。６３３ｎｍの光を放射するヘ
リウムネオンレーザーが光源である場合、２つの散乱光
集光角度間隔は２−３°および５−１５°である。ある
細胞について、１度各間隔中の散乱光の水準が知られる
と、その細胞に関する体積およびヘモグロビン濃度はＭ
ｉｅの散乱原理の予測する値と比較して決定される。各
細胞に関する体積（Ｖ）とヘモグロビン濃度（ＨＣ）と
はメモリーに記憶され、Ｔｙｃｋｏで議論した如く、こ
の技術で知られている技術により、試料測定サイクルの
終了時にＭＣＶとＭＣＨＣとが計算される。これらの計
算を用い、ＶとＨＣとの分布サイトグラム（ｃｙｔｏｇ
ｒａｍ）およびＶとＨＣとのヒストグラムができる。
４号はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム、即ち抗凝
固性にされている全血試料中の個別および平均赤血球体
積（ＭＣＶ）並に赤血球の個別および平均小体ヘモグロ
ビン濃度（ＭＣＨＣ）の測定のための完全自働化法およ
び手段を与えている流通式細胞測定器の赤色血液細胞チ
ャネルを公開している。この方法においては、全血試料
の２μｍアリコート中の赤色血液細胞を始めに希釈し、
それから、今記載したＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方
法を用いて等積的に球形化する。２０秒培養後、これら
の細胞を、本質的に１度に１個、分析器の赤色細胞チャ
ネル内の照明されている測定域を通過させる。２つの個
別の角度間隔中に、これらの細胞により散乱される光の
量を測定する。光源と検出角との選択がこの適用におい
ては決定的に重要である。６３３ｎｍの光を放射するヘ
リウムネオンレーザーが光源である場合、２つの散乱光
集光角度間隔は２−３°および５−１５°である。ある
細胞について、１度各間隔中の散乱光の水準が知られる
と、その細胞に関する体積およびヘモグロビン濃度はＭ
ｉｅの散乱原理の予測する値と比較して決定される。各
細胞に関する体積（Ｖ）とヘモグロビン濃度（ＨＣ）と
はメモリーに記憶され、Ｔｙｃｋｏで議論した如く、こ
の技術で知られている技術により、試料測定サイクルの
終了時にＭＣＶとＭＣＨＣとが計算される。これらの計
算を用い、ＶとＨＣとの分布サイトグラム（ｃｙｔｏｇ
ｒａｍ）およびＶとＨＣとのヒストグラムができる。
【００２７】前記の方法の何れも網赤血球と非網赤血球
との間を区別しないし、前記し、実施されている方法
は、網赤血球と赤血球との診断学的に重要なパラメータ
ー例えば細胞１つづつに基いた体積およびヘモグロビン
濃度を個別に決定するのには用いることができない。
との間を区別しないし、前記し、実施されている方法
は、網赤血球と赤血球との診断学的に重要なパラメータ
ー例えば細胞１つづつに基いた体積およびヘモグロビン
濃度を個別に決定するのには用いることができない。
【００２８】流通式細胞測定器を用いる、網赤血球計数
の監視における他の困難さは網赤血球検出信号と成熟赤
色血液細胞信号とシステム雑音との間の弁別の困難さに
ある。ＲＮＡの染色された系状体は若い網赤血球に多
く、流通式細胞測定器により検出する場合比較的大きい
量の信号を生む。しかし一層成熟した細胞は染色された
ＲＮＡの含有が少く、流通式細胞測定器システムの雑音
におおわれてしまうかもしれないより小さい信号を生
む。
の監視における他の困難さは網赤血球検出信号と成熟赤
色血液細胞信号とシステム雑音との間の弁別の困難さに
ある。ＲＮＡの染色された系状体は若い網赤血球に多
く、流通式細胞測定器により検出する場合比較的大きい
量の信号を生む。しかし一層成熟した細胞は染色された
ＲＮＡの含有が少く、流通式細胞測定器システムの雑音
におおわれてしまうかもしれないより小さい信号を生
む。
【００２９】光散乱と吸収あるいは蛍光流通式細胞測定
技術により、全血試料中の網赤血球を同定し、同時に、
網赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグ
ロビン含有量とを個別に測定するのに有用な方法と試薬
との要求が存在している。
技術により、全血試料中の網赤血球を同定し、同時に、
網赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグ
ロビン含有量とを個別に測定するのに有用な方法と試薬
との要求が存在している。
【００３０】我我は細網を染色するのによく知られてい
る技術の変形でカチオン染料を使用したと云う前提で出
発した。また蛍光および（または）吸収を網赤血球検出
するために利用できる流通式細胞測定法の開発に関心が
あった。更にその上吸収の場合、方向雑音除去のため赤
色細胞の球形化を用いることを望んだ（図１６及び図１
７を参照）。（若し元の細胞体積を同時に回復させ、精
密に測定することに関心がなければ、多くの方向雑音除
去のために、等容積的または完全な球形化の必要はない
ことに注意。）我我はまた等容積的球形化とＴｙｃｋｏ
の前記の方法とを用いることにより、蛍光および吸収法
に関して、選択的に網赤血球を染色する試薬を用いて、
細胞１つずつに基き網赤血球と成熟赤色細胞との体積と
ヘモグロビンとを同時に測定できるであろうことを希望
した。若し球形化が完全で、等容積的でないが等張性に
関する或る既知の係数Ｘであるならば、体積に関しては
１／Ｘによる補正と蛋白質例えばヘモグロビン濃度に関
してはＸによる補正を行うＴｙｃｋｏ法を用いて元の値
を計算できることに注意。）
る技術の変形でカチオン染料を使用したと云う前提で出
発した。また蛍光および（または）吸収を網赤血球検出
するために利用できる流通式細胞測定法の開発に関心が
あった。更にその上吸収の場合、方向雑音除去のため赤
色細胞の球形化を用いることを望んだ（図１６及び図１
７を参照）。（若し元の細胞体積を同時に回復させ、精
密に測定することに関心がなければ、多くの方向雑音除
去のために、等容積的または完全な球形化の必要はない
ことに注意。）我我はまた等容積的球形化とＴｙｃｋｏ
の前記の方法とを用いることにより、蛍光および吸収法
に関して、選択的に網赤血球を染色する試薬を用いて、
細胞１つずつに基き網赤血球と成熟赤色細胞との体積と
ヘモグロビンとを同時に測定できるであろうことを希望
した。若し球形化が完全で、等容積的でないが等張性に
関する或る既知の係数Ｘであるならば、体積に関しては
１／Ｘによる補正と蛋白質例えばヘモグロビン濃度に関
してはＸによる補正を行うＴｙｃｋｏ法を用いて元の値
を計算できることに注意。）
【００３１】Ｔｙｃｋｏ法を利用するためには、ヘモグ
ロビンが非常に透明な領域の単色光を放射する光源が要
求される。即ち、赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レー
ザーまたは均一なより長波長のレーザーのような光源が
要求される。このことは、その波長が吸収測定のために
用いられるはずならば、染料は赤色光の強い吸収をもつ
青色染料でなければならない。
ロビンが非常に透明な領域の単色光を放射する光源が要
求される。即ち、赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レー
ザーまたは均一なより長波長のレーザーのような光源が
要求される。このことは、その波長が吸収測定のために
用いられるはずならば、染料は赤色光の強い吸収をもつ
青色染料でなければならない。
【００３２】我我はカチオン染料との相溶性のため、そ
してＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの教えにより示唆され
ているような赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオ
ンおよび双性イオン界面活性剤を探究した。Ｋｉｍ並に
Ｏｒｎｓｔｅｉｎ法におけるごとく、我我は赤色細胞溶
血を遅くするため、界面活性剤濃度を“緩衝”するのに
蛋白質（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多く
のそのような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ×１００
およびラウラミドプロピルアミドベタイン）が満足に働
いた。それで我我はラウラミドプロピルアミドベタイン
および他の幾つかの双性イオン界面活性剤（例えばＤＡ
ＰＳとＴＤＡＰＳ）とが赤色細胞溶血を遅延するために
緩衝する蛋白質を必要とせず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉ
ｎとの方法について、凡ての種類の血液細胞に対する理
想的な代りの球形化剤であることを見出した。それらは
蛋白質緩衝を必要としない故に、製造するのに安定で、
より簡単な試薬を可能にした。（ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅ
ｉｎとの固定段階は最早絶対的なものではなく、蛋白質
含有試薬中での細胞増殖の問題も避られる。）この発明
は、別の特許出願の主題となっている。
してＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの教えにより示唆され
ているような赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオ
ンおよび双性イオン界面活性剤を探究した。Ｋｉｍ並に
Ｏｒｎｓｔｅｉｎ法におけるごとく、我我は赤色細胞溶
血を遅くするため、界面活性剤濃度を“緩衝”するのに
蛋白質（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多く
のそのような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ×１００
およびラウラミドプロピルアミドベタイン）が満足に働
いた。それで我我はラウラミドプロピルアミドベタイン
および他の幾つかの双性イオン界面活性剤（例えばＤＡ
ＰＳとＴＤＡＰＳ）とが赤色細胞溶血を遅延するために
緩衝する蛋白質を必要とせず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉ
ｎとの方法について、凡ての種類の血液細胞に対する理
想的な代りの球形化剤であることを見出した。それらは
蛋白質緩衝を必要としない故に、製造するのに安定で、
より簡単な試薬を可能にした。（ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅ
ｉｎとの固定段階は最早絶対的なものではなく、蛋白質
含有試薬中での細胞増殖の問題も避られる。）この発明
は、別の特許出願の主題となっている。
【００３３】
【本発明の要約】従って、改善された試薬組成物と、吸
収流通式細胞測定法による、血液試料中における網赤血
球を他の細胞から弁別する方法を提供するのが本発明の
主要な目的である。
収流通式細胞測定法による、血液試料中における網赤血
球を他の細胞から弁別する方法を提供するのが本発明の
主要な目的である。
【００３４】本発明の他の目的は吸収流通式細胞測定法
による全血試料中の網赤血球を教える、前記のような試
薬と方法とを提供することである。
による全血試料中の網赤血球を教える、前記のような試
薬と方法とを提供することである。
【００３５】本発明のその上の目的は赤色血液細胞と網
赤血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するため
の、前記のような試薬と方法とを提供することである。
赤血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するため
の、前記のような試薬と方法とを提供することである。
【００３６】本発明の更にその上の目的は吸収および散
乱光流通式細胞測定法による、全血試料中の網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有
量とを同時に測定する、前記のような試薬組成物と方法
とを提供することである。
乱光流通式細胞測定法による、全血試料中の網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有
量とを同時に測定する、前記のような試薬組成物と方法
とを提供することである。
【００３７】本発明尚他の目的は、同時に血液試料中で
の赤色血液細胞と網赤血球とを区別し、それぞれを計数
し、細胞１つに基いての測定から決定した各細胞型の体
積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血
球体積と平均小体ヘモグロビン濃度とを測定するため
の、前記の如き試薬組成物と方法とを提供するにある。
の赤色血液細胞と網赤血球とを区別し、それぞれを計数
し、細胞１つに基いての測定から決定した各細胞型の体
積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血
球体積と平均小体ヘモグロビン濃度とを測定するため
の、前記の如き試薬組成物と方法とを提供するにある。
【００３８】本発明の１つの態様に従えば、試薬組成物
は網赤血球染色のための有機カチオン染料と約６〜約９
のｐＨを維持するための緩衝溶液とを含む。その染料は
構造式
は網赤血球染色のための有機カチオン染料と約６〜約９
のｐＨを維持するための緩衝溶液とを含む。その染料は
構造式
【化７】 を持つ青色吸収染料オキサジン７５０（Ｅｘｃｉｔｏ
ｎ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏから入手可
能）、あるいは構造式
ｎ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏから入手可
能）、あるいは構造式
【化８】 を持つ青色吸収染料ニューメチレンブルーであってもよ
い。
い。
【００３９】試薬組成物の緩衝システムはその試薬組成
物のｐＨを約６〜９に維持するため、適当な緩衝剤を含
んでいる。その溶液はＫＣｌまたはＮａＣｌを用いて約
２５０ｍ Ｏｓｍから約３３０ｍ Ｏｓｍに調節された
最終浸透性をもっていて、次の成分の１つまたはそれ以
上を記載の濃度で含んでいてもよい。成分 濃度（ｍＭ） Ｋ／ＮａＨＣＯ3 ５−５０ ＭｇＣｌ2 ０−８８ ＫＣｌ ４−１０４ Ｎａ3ＰＯ4 ０−１．５ ＣａＣｌ2 ０−０．６
物のｐＨを約６〜９に維持するため、適当な緩衝剤を含
んでいる。その溶液はＫＣｌまたはＮａＣｌを用いて約
２５０ｍ Ｏｓｍから約３３０ｍ Ｏｓｍに調節された
最終浸透性をもっていて、次の成分の１つまたはそれ以
上を記載の濃度で含んでいてもよい。成分 濃度（ｍＭ） Ｋ／ＮａＨＣＯ3 ５−５０ ＭｇＣｌ2 ０−８８ ＫＣｌ ４−１０４ Ｎａ3ＰＯ4 ０−１．５ ＣａＣｌ2 ０−０．６
【００４０】好ましくは、その試薬組成物のｐＨを約７
〜８に維持するために溶液を処方し、それは次の成分を
与えられている濃度で１つまたはそれ以上を含んでいて
もよく、約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍの浸透性を維持す
る。成分 濃度（ｍＭ） Ｔｒｉｓ／ＴＥＡ ０−１５０ Ｋ2Ｏｘ／ＥＤＴＡ ０−１２１ ＫＣｌ／ＮａＣｌ ０−１５５
〜８に維持するために溶液を処方し、それは次の成分を
与えられている濃度で１つまたはそれ以上を含んでいて
もよく、約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍの浸透性を維持す
る。成分 濃度（ｍＭ） Ｔｒｉｓ／ＴＥＡ ０−１５０ Ｋ2Ｏｘ／ＥＤＴＡ ０−１２１ ＫＣｌ／ＮａＣｌ ０−１５５
【００４１】試薬組成物は赤色細胞膜を通しての染料の
透過を助長するために、あるアニオンとカチオンとを含
有すべきことが発見された。そのようなアニオンは重炭
酸イオン、塩素イオン、硼酸イオン、バルビタール、蓚
酸イオンあるいはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を含んでいてもよい。しかし凡てのアニオンが細胞
膜を横切る染料の透過を促進するのに効果的であるわけ
ではなかった。例えば、次のアニオン、即ちリンゴ酸イ
オン、酒石酸イオン、リン酸イオンが唯一つの主要なア
ニオンとして試薬組成物中に含まれている場合、若しあ
っても、網赤血球と赤血球との間の区別は殆んど出来な
い。可能なカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイ
オン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）またはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれ
る。
透過を助長するために、あるアニオンとカチオンとを含
有すべきことが発見された。そのようなアニオンは重炭
酸イオン、塩素イオン、硼酸イオン、バルビタール、蓚
酸イオンあるいはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）を含んでいてもよい。しかし凡てのアニオンが細胞
膜を横切る染料の透過を促進するのに効果的であるわけ
ではなかった。例えば、次のアニオン、即ちリンゴ酸イ
オン、酒石酸イオン、リン酸イオンが唯一つの主要なア
ニオンとして試薬組成物中に含まれている場合、若しあ
っても、網赤血球と赤血球との間の区別は殆んど出来な
い。可能なカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイ
オン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）またはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれ
る。
【００４２】この試薬組成物は、散乱／吸収流通式細胞
測定法技術を用いて、全血試料中の網赤血球を同定する
のに用いてもよい。最も広い適用におけるその方法には
全血のアリコートを前記試薬組成物の１つと混合するこ
とが含まれる。適当な培養期間の後、その試料／試薬混
合物を、１度に１細胞ずつ、流通式細胞測定器の特定な
センシング領域を通過させる。水力学的集束により、単
一細胞がそのセンシング域を通過し、そこで適当な照明
波長をもつ集束された光源で照明される。細胞１つずつ
に基き、その細胞に関して少くとも１つの散乱光信号と
少くとも１つの吸収信号とが測定される。これらの測定
値から網赤血球が赤血球から区別され得る。
測定法技術を用いて、全血試料中の網赤血球を同定する
のに用いてもよい。最も広い適用におけるその方法には
全血のアリコートを前記試薬組成物の１つと混合するこ
とが含まれる。適当な培養期間の後、その試料／試薬混
合物を、１度に１細胞ずつ、流通式細胞測定器の特定な
センシング領域を通過させる。水力学的集束により、単
一細胞がそのセンシング域を通過し、そこで適当な照明
波長をもつ集束された光源で照明される。細胞１つずつ
に基き、その細胞に関して少くとも１つの散乱光信号と
少くとも１つの吸収信号とが測定される。これらの測定
値から網赤血球が赤血球から区別され得る。
【００４３】本発明の好ましい態様に従えば、前記試薬
組成物は更に、赤色血液細胞と網赤血球とを等積的に球
形化するため、双性イオン界面活性剤を含む。その双性
イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベタインま
たはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピルベタイ
ン（ＬＡＢ）とココアミドプロピルベタン（ＣＡＰＢ）
とココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）とである。他
の好ましい球形化剤はＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（Ｔ
ＤＡＰＳ）とＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）と
である。ＴＤＡＰＳとＤＤＡＰＳとは、最も安定した試
料調製物を与える故に最も好ましい球形化剤である。
組成物は更に、赤色血液細胞と網赤血球とを等積的に球
形化するため、双性イオン界面活性剤を含む。その双性
イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベタインま
たはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピルベタイ
ン（ＬＡＢ）とココアミドプロピルベタン（ＣＡＰＢ）
とココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）とである。他
の好ましい球形化剤はＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（Ｔ
ＤＡＰＳ）とＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ア
ンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）と
である。ＴＤＡＰＳとＤＤＡＰＳとは、最も安定した試
料調製物を与える故に最も好ましい球形化剤である。
【００４４】血液試料中の網赤血球と赤色血液細胞との
効果的な等積的球形化のためには、試薬組成物中の球形
化剤濃度は約３．９〜１４８μｇ／ｍｌである。球形化
剤は好ましくはＬＡＢは約１２〜８７．５μｇ／ｍｌ量
で、ＴＤＡＰＳは約３．９〜１１．８μｇ／ｍｌ量で、
ＤＤＡＰＳは約４９．３〜１４８μｇ／ｍｌ量で、ＣＡ
ＰＳは約８．８〜１７．５μｇ／ｍｌ量で、あるいはＣ
ＡＳＢは約１２．５〜１５μｇ／ｍｌ量で存在する。
効果的な等積的球形化のためには、試薬組成物中の球形
化剤濃度は約３．９〜１４８μｇ／ｍｌである。球形化
剤は好ましくはＬＡＢは約１２〜８７．５μｇ／ｍｌ量
で、ＴＤＡＰＳは約３．９〜１１．８μｇ／ｍｌ量で、
ＤＤＡＰＳは約４９．３〜１４８μｇ／ｍｌ量で、ＣＡ
ＰＳは約８．８〜１７．５μｇ／ｍｌ量で、あるいはＣ
ＡＳＢは約１２．５〜１５μｇ／ｍｌ量で存在する。
【００４５】我我は、前記緩衝システムの存在の下で、
ＲＮＡ染色に要する試薬組成物中のニューメチレンブル
ーの濃度は約１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であること
を見出した。
ＲＮＡ染色に要する試薬組成物中のニューメチレンブル
ーの濃度は約１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲であること
を見出した。
【００４６】例えば、我我は、前記緩衝システムの存在
の下で、ＲＮＡ染色に要する試薬組成物中のオキサジン
濃度は低く、即ち、約２〜１５μｇ／ｍｌの範囲であ
り、緩衝剤で増大された透過の結果、網赤血球中ＲＮＡ
の染料染色は５分以内になることを見出した。そのよう
な低濃度の染料は成熟赤血球の非網赤血球染色を最小に
し、それは雑音バックグラウンドからの信号の良好な分
離となる。その様な速やかな染色はこの試薬組成物を自
働化された方法に非常に適合させている。
の下で、ＲＮＡ染色に要する試薬組成物中のオキサジン
濃度は低く、即ち、約２〜１５μｇ／ｍｌの範囲であ
り、緩衝剤で増大された透過の結果、網赤血球中ＲＮＡ
の染料染色は５分以内になることを見出した。そのよう
な低濃度の染料は成熟赤血球の非網赤血球染色を最小に
し、それは雑音バックグラウンドからの信号の良好な分
離となる。その様な速やかな染色はこの試薬組成物を自
働化された方法に非常に適合させている。
【００４７】この全血／試薬組成物混合物が流通式細胞
測定器のセンシング領域を通過する時各細胞により散乱
および吸収された光を測定し、赤血球が網赤血球と区別
でき、各網赤血球または赤血球の体積およびヘモグロビ
ン濃度が決定できる。網赤血球と赤血球との数および網
赤血球または赤血球のヘモグロビン含有量と平均細胞体
積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグロビン
は測定された細胞１つづの体積とヘモグロビン濃度から
計算される。
測定器のセンシング領域を通過する時各細胞により散乱
および吸収された光を測定し、赤血球が網赤血球と区別
でき、各網赤血球または赤血球の体積およびヘモグロビ
ン濃度が決定できる。網赤血球と赤血球との数および網
赤血球または赤血球のヘモグロビン含有量と平均細胞体
積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグロビン
は測定された細胞１つづの体積とヘモグロビン濃度から
計算される。
【００４８】従って、本発明は組成物と以下記載の方法
とを包含し、本発明の範囲は請求項において示される。
とを包含し、本発明の範囲は請求項において示される。
【００４９】
【好ましい態様の説明】図１及び図２を参照すると、本
発明の原理を実施するのに利用されてもよい流通式細胞
測定装置の部分の様式化した機能的、構造的描写を示し
ている。その装置は、出願人により販売されている、商
標、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手でき
るシステムの変形である特別なシステムを描いている。
発明の原理を実施するのに利用されてもよい流通式細胞
測定装置の部分の様式化した機能的、構造的描写を示し
ている。その装置は、出願人により販売されている、商
標、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手でき
るシステムの変形である特別なシステムを描いている。
【００５０】この装置は細胞分析のための流通式細胞測
定法の原理を具体化していて、特定の型の照明に対する
細胞の光散乱および光吸収の応答を知覚する能力を含ん
でいる。本発明に関して主要な関心のある構成要素のみ
が示されている。従って図面は、この装置のいろいろな
構成要素を動かしそして制御するのに要する機械的およ
び電気的構成要素即ちモーター、ソレノイド、ポンプ、
弁、センサーの凡てを説明してはいない。これら構成要
素の凡てはどんな既知の在来の形をもっていてもよく、
それらは、意図されている方法で試料を処理するため
の、本発明に従う流通式細胞測定装置における種種な構
成要素の操作の望ましい様式に関して以下与えられる情
報に関する知識を持っている技術に塾達した正常な人に
より容易に実現できるものである。
定法の原理を具体化していて、特定の型の照明に対する
細胞の光散乱および光吸収の応答を知覚する能力を含ん
でいる。本発明に関して主要な関心のある構成要素のみ
が示されている。従って図面は、この装置のいろいろな
構成要素を動かしそして制御するのに要する機械的およ
び電気的構成要素即ちモーター、ソレノイド、ポンプ、
弁、センサーの凡てを説明してはいない。これら構成要
素の凡てはどんな既知の在来の形をもっていてもよく、
それらは、意図されている方法で試料を処理するため
の、本発明に従う流通式細胞測定装置における種種な構
成要素の操作の望ましい様式に関して以下与えられる情
報に関する知識を持っている技術に塾達した正常な人に
より容易に実現できるものである。
【００５１】最も一般的な言葉で言えば、シース流れ流
通セル（ｓｈｅａｔｈ−ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗ ｃｅ
ｌｌ）とこれを支持する水力学手段とにより、調製され
た細胞を測定点に送る。その細胞は、流通セルの正方形
断面流通チャネルに対し中心にある円筒状体積に局限さ
れている。流通セル構造はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システム中に用いられているものと同一である。水力学
的システムは非常に簡単で、唯２つの蠕動ポンプとそれ
に連結されている配管である。シースポンプ（ｓｈｅａ
ｔｈ ｐｕｍｐ）と管とはシース（さや）を１．６×１
０-7ｍ3／ｓｅｃの速さで送り、試料は３．５×１０-10
ｍ3／ｓｅｃの速さで送られ、流通セル中における流通
チャネルは２５０μｍ×２５０μｍである。被覆流れ中
軸方向に流れている、得られた円筒状の試料流は直径７
μｍ、速さ２．５ｍ／ｓをもっている。
通セル（ｓｈｅａｔｈ−ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗ ｃｅ
ｌｌ）とこれを支持する水力学手段とにより、調製され
た細胞を測定点に送る。その細胞は、流通セルの正方形
断面流通チャネルに対し中心にある円筒状体積に局限さ
れている。流通セル構造はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システム中に用いられているものと同一である。水力学
的システムは非常に簡単で、唯２つの蠕動ポンプとそれ
に連結されている配管である。シースポンプ（ｓｈｅａ
ｔｈ ｐｕｍｐ）と管とはシース（さや）を１．６×１
０-7ｍ3／ｓｅｃの速さで送り、試料は３．５×１０-10
ｍ3／ｓｅｃの速さで送られ、流通セル中における流通
チャネルは２５０μｍ×２５０μｍである。被覆流れ中
軸方向に流れている、得られた円筒状の試料流は直径７
μｍ、速さ２．５ｍ／ｓをもっている。
【００５２】第１目標は、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システムにより提供されている２つの赤色細胞散乱チャ
ネルに加えて、吸収測定を演ずる光学的システムを提供
することにある。散乱／吸収流通式細胞測定器の光学シ
ステムは一般に２つの二次システム（ａ）照明光学系
（図１）と（ｂ）検出光学系（図２）とに分けることが
できる。
システムにより提供されている２つの赤色細胞散乱チャ
ネルに加えて、吸収測定を演ずる光学的システムを提供
することにある。散乱／吸収流通式細胞測定器の光学シ
ステムは一般に２つの二次システム（ａ）照明光学系
（図１）と（ｂ）検出光学系（図２）とに分けることが
できる。
【００５３】図１を先ず参照すると、照明光学システム
は一般的に整理番号１０で示されていて、６３３ｎｍの
光の２ｍＷビームを放射するヘリウム−ネオンレーザー
１２を組入れている。そのビームはレーザービームの位
置の調節をする２つの反射鏡１４と１６とにより折りま
げられる。その調節でビーム軸を照明光学系の物理的光
学軸と一致させることができる。それからそのビームを
１対の円柱レンズ１８と２０とにより１９２×７７μｍ
楕円形ビーム（１／ｅ2において）に形づくられる。１
９２μｍの寸法は焦点距離１５０ｍｍ円柱レンズ１８で
形成され、それはＡ−１孔口２２の長軸（それは図１の
頁の面と並行である）を照明する。７７μｍの寸法は焦
点距離６０ｍｍ円柱レンズ２０により形成され、Ａ−１
孔口の短軸を照明する。孔口Ａ−１は６５３×８９μｍ
である。照明二重レンズ２３は流通セル２４に３７．４
×１２．６μｍの楕円形ガウス強度分布を生じさせる。
その楕円の短軸は垂直である流れの方向に並行、即ち矢
印２６の方向にある。
は一般的に整理番号１０で示されていて、６３３ｎｍの
光の２ｍＷビームを放射するヘリウム−ネオンレーザー
１２を組入れている。そのビームはレーザービームの位
置の調節をする２つの反射鏡１４と１６とにより折りま
げられる。その調節でビーム軸を照明光学系の物理的光
学軸と一致させることができる。それからそのビームを
１対の円柱レンズ１８と２０とにより１９２×７７μｍ
楕円形ビーム（１／ｅ2において）に形づくられる。１
９２μｍの寸法は焦点距離１５０ｍｍ円柱レンズ１８で
形成され、それはＡ−１孔口２２の長軸（それは図１の
頁の面と並行である）を照明する。７７μｍの寸法は焦
点距離６０ｍｍ円柱レンズ２０により形成され、Ａ−１
孔口の短軸を照明する。孔口Ａ−１は６５３×８９μｍ
である。照明二重レンズ２３は流通セル２４に３７．４
×１２．６μｍの楕円形ガウス強度分布を生じさせる。
その楕円の短軸は垂直である流れの方向に並行、即ち矢
印２６の方向にある。
【００５４】測定空間を通過する細胞は入射放射線を散
乱し、吸収する。散乱および吸収された光は図２で図示
して説明されている検出光学系中に捕捉され、測定され
る。散乱されない光と１９．５°までに散乱された光は
高開口数（Ｈｉ−ＮＡ）レンズ２８により集光され、平
行にされる。そのビームは３０／７０（３０％反射、７
０％透過）ビームスプリッター３０により２つの部分に
分割される。そのビーム３２はフォトダイオードに反射
され、吸収測定に用いられ、一方透過ビーム３４は更に
２０／８０（２０％反射、８０％透過）ビームスプリッ
ター３６により分割され、２つの散乱チャネルを作る。
反射された散乱チャネル３８は５−１５°絞り（ｄａｒ
ｋｓｔｏｐ）４０を持ち、一方透過チャネル４２は２−
３°絞り４４を持っている。これらの絞り４０、４４の
それぞれを透過する光はそれぞれレンズ４６と４８とを
通りフォトダイオード５０および５２に集光される。濃
度フィルター５４と５４と５６とは各フォトダイオード
における光水準を標準検出器と前置増幅器とに適当であ
る水準に低下させるのに用いられる。
乱し、吸収する。散乱および吸収された光は図２で図示
して説明されている検出光学系中に捕捉され、測定され
る。散乱されない光と１９．５°までに散乱された光は
高開口数（Ｈｉ−ＮＡ）レンズ２８により集光され、平
行にされる。そのビームは３０／７０（３０％反射、７
０％透過）ビームスプリッター３０により２つの部分に
分割される。そのビーム３２はフォトダイオードに反射
され、吸収測定に用いられ、一方透過ビーム３４は更に
２０／８０（２０％反射、８０％透過）ビームスプリッ
ター３６により分割され、２つの散乱チャネルを作る。
反射された散乱チャネル３８は５−１５°絞り（ｄａｒ
ｋｓｔｏｐ）４０を持ち、一方透過チャネル４２は２−
３°絞り４４を持っている。これらの絞り４０、４４の
それぞれを透過する光はそれぞれレンズ４６と４８とを
通りフォトダイオード５０および５２に集光される。濃
度フィルター５４と５４と５６とは各フォトダイオード
における光水準を標準検出器と前置増幅器とに適当であ
る水準に低下させるのに用いられる。
【００５５】ビーム３２はレンズ５８を通して検出器／
前置増幅器６０に集光される。前置増幅器出力はそのシ
ステムを透過する光出力に比例する。それは散乱されな
い光と約１９．５°までの角度中に散乱される光とを集
める。この角度間隔内で、球形化された赤血球と網赤血
球とによる散乱光の約９８％が集められる。
前置増幅器６０に集光される。前置増幅器出力はそのシ
ステムを透過する光出力に比例する。それは散乱されな
い光と約１９．５°までの角度中に散乱される光とを集
める。この角度間隔内で、球形化された赤血球と網赤血
球とによる散乱光の約９８％が集められる。
【００５６】市場で入手できるＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１機器の吸収チャネルは細胞吸収測定には最適にさ
れていない。吸収信号は吸収前置増幅器での雑音と同じ
水準である。吸収検出法の数学モデルが開発された。こ
のモデルは、流通セル中におけるレーザーによる照射領
域の減少で、信号は劇的に改善するであろうと予見し
た。スリットの寸法を公称１５０×２０μｍ（ＴＥＣＨ
ＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムにおいて）から公称４０×
２０μｍに減少してＳＮ比を係数３．７５も増加させ
た。
Ｈ’１機器の吸収チャネルは細胞吸収測定には最適にさ
れていない。吸収信号は吸収前置増幅器での雑音と同じ
水準である。吸収検出法の数学モデルが開発された。こ
のモデルは、流通セル中におけるレーザーによる照射領
域の減少で、信号は劇的に改善するであろうと予見し
た。スリットの寸法を公称１５０×２０μｍ（ＴＥＣＨ
ＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムにおいて）から公称４０×
２０μｍに減少してＳＮ比を係数３．７５も増加させ
た。
【００５７】吸収前置増幅器からの信号（パルス高さ）
は２０〜５０ｍＶである。これは処理電子工学系が要求
する信号より非常に小さい。約２５の利得のある吸収前
置増幅器に第２の利得段階を加えた。これは約１Ｖまで
のパルス高さをもたらした。
は２０〜５０ｍＶである。これは処理電子工学系が要求
する信号より非常に小さい。約２５の利得のある吸収前
置増幅器に第２の利得段階を加えた。これは約１Ｖまで
のパルス高さをもたらした。
【００５８】各散乱チャネルにおける前置増幅器回路の
利得および濃度フィルターの光学密度を、Ｔｅｃｈｎｉ
ｃｏｎ（ＴＣＮ）Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅ
ｒｉａｌ（ＯＴＭ，ＴＣＨ Ｔ０３−１７０４）を検定
した場合に、各チャネルの出力で約２Ｖの平均パルス信
号水準を生じるように選択した。この材料は出願人から
市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム
への使用に適合している。このことは、後置検出信号処
理ハードウエア（Ｐｏｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｉ
ｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｈａｒｄｗａｒｅ）
中に可変利得増幅器を用いて、各チャネル中の総括利得
の微細な調節を可能にしている。
利得および濃度フィルターの光学密度を、Ｔｅｃｈｎｉ
ｃｏｎ（ＴＣＮ）Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅ
ｒｉａｌ（ＯＴＭ，ＴＣＨ Ｔ０３−１７０４）を検定
した場合に、各チャネルの出力で約２Ｖの平均パルス信
号水準を生じるように選択した。この材料は出願人から
市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システム
への使用に適合している。このことは、後置検出信号処
理ハードウエア（Ｐｏｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｉ
ｇｎａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｈａｒｄｗａｒｅ）
中に可変利得増幅器を用いて、各チャネル中の総括利得
の微細な調節を可能にしている。
【００５９】後置検出信号処理システムの機能ブロック
図を図３に示めす。このシステムは前置増幅器６２と可
変利得増幅器６４とパルス高さ分析器６６とアナログ−
デジタル変換器６８とデータ利得ハードウエア（コンピ
ューター）７０とソフトウエアとから成る。
図を図３に示めす。このシステムは前置増幅器６２と可
変利得増幅器６４とパルス高さ分析器６６とアナログ−
デジタル変換器６８とデータ利得ハードウエア（コンピ
ューター）７０とソフトウエアとから成る。
【００６０】そのシステム用の電子工学システムは大部
分Ｈｏｗａｒｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｐ．
Ｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，から入手できる４Ｃ
ｙｔｅシステム（４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒ
ｏｎｔ Ｅｎｄと４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｉｎｔ
ｅｒｆａｃｅ Ｃａｒｄ）より成る。パルス高さ分析器
とアナログ−デイジタル変換器とデータ利得ソフトウエ
アと、この４Ｃｙｔｅシステムの凡て構成要素である。
これらの構成要素は４つまでの入力信号についてのパル
ス高さを表わす保持パルスを作り出し、“妥当な”パル
ス高さしきい水準を作ることを可能にする。４Ｃｙｔｅ
テンターフェイスカードは、４つまでの入力信号のアナ
ログ−デイジタル変換のための４Ｃｙｔｅソフトウエア
と、主コンピューターのＲＡＭ記憶装置へのこれらの値
の捕獲と共に用いる。このデイジタル化した信号はリス
トモード中に記憶される。各細胞に関する情報と測定さ
れた４つのパラメーターのおのおのの情報とフラギング
（ｆｌａｇｇｉｎｇ）に関する情報との５つの８ビット
バイトがある。これらの実験の主コンピューターはカラ
ーモニターとマッチ副処理器（ｍａｔｃｈ ｃｏ−ｐｒ
ｏｃｅｓｓｏｒ）とを備えたＩＢＭ ＰＣ／ＸＴクロー
ンであった。データ整理はどんなＩＢＭ両立コンピュー
ターでも実行できる。
分Ｈｏｗａｒｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｐ．
Ｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，から入手できる４Ｃ
ｙｔｅシステム（４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒ
ｏｎｔ Ｅｎｄと４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｉｎｔ
ｅｒｆａｃｅ Ｃａｒｄ）より成る。パルス高さ分析器
とアナログ−デイジタル変換器とデータ利得ソフトウエ
アと、この４Ｃｙｔｅシステムの凡て構成要素である。
これらの構成要素は４つまでの入力信号についてのパル
ス高さを表わす保持パルスを作り出し、“妥当な”パル
ス高さしきい水準を作ることを可能にする。４Ｃｙｔｅ
テンターフェイスカードは、４つまでの入力信号のアナ
ログ−デイジタル変換のための４Ｃｙｔｅソフトウエア
と、主コンピューターのＲＡＭ記憶装置へのこれらの値
の捕獲と共に用いる。このデイジタル化した信号はリス
トモード中に記憶される。各細胞に関する情報と測定さ
れた４つのパラメーターのおのおのの情報とフラギング
（ｆｌａｇｇｉｎｇ）に関する情報との５つの８ビット
バイトがある。これらの実験の主コンピューターはカラ
ーモニターとマッチ副処理器（ｍａｔｃｈ ｃｏ−ｐｒ
ｏｃｅｓｓｏｒ）とを備えたＩＢＭ ＰＣ／ＸＴクロー
ンであった。データ整理はどんなＩＢＭ両立コンピュー
ターでも実行できる。
【００６１】次の実施例は試薬組成物と、網赤血球の同
定と網赤血球と赤色血液細胞との特性表示のための、吸
収流通式細胞測定技術を用い、同じ試薬組成物を組込ん
だ方法とを説明する。可能性がある場合はいつでも、標
準の市場で入手出来る試薬級材料を用いた。次の処方と
方法とは唯説明の目的のためにのみ提供されているこ
と、及び他の成分と割合と方法とがこの発明の開示に従
って採用できることは理解されよう。
定と網赤血球と赤色血液細胞との特性表示のための、吸
収流通式細胞測定技術を用い、同じ試薬組成物を組込ん
だ方法とを説明する。可能性がある場合はいつでも、標
準の市場で入手出来る試薬級材料を用いた。次の処方と
方法とは唯説明の目的のためにのみ提供されているこ
と、及び他の成分と割合と方法とがこの発明の開示に従
って採用できることは理解されよう。
【００６２】
【実施例１】本発明の試薬組成物と方法とを用いる、血
液試料中の網赤血球と赤血球との区別のための散乱およ
び吸収測定 オキサジン７５０染料を１ｍｇ／ｍｌＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド原液中に貯蔵する。作業試薬はその原液
を、次の成分を記載の濃度で含有する緩衝溶液に加える
ことにより作る。 オキサジン７５０ ６μｇ／ｍｌ 塩化カルシウム ０．３ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ８８．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍＭ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
液試料中の網赤血球と赤血球との区別のための散乱およ
び吸収測定 オキサジン７５０染料を１ｍｇ／ｍｌＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド原液中に貯蔵する。作業試薬はその原液
を、次の成分を記載の濃度で含有する緩衝溶液に加える
ことにより作る。 オキサジン７５０ ６μｇ／ｍｌ 塩化カルシウム ０．３ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ８８．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍＭ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
【００６３】この研究に用いた作業試薬の最終浸透性並
にｐＨはそれぞれ２７２ｍ ｍｏｌ／ｋｇおよび８．１
であった。
にｐＨはそれぞれ２７２ｍ ｍｏｌ／ｋｇおよび８．１
であった。
【００６４】試料は、自働化ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’
１システム赤色細胞試料処理案を模した方法で手で混合
した。ガラス試験管に作業試薬５ｍｌを満した。それか
ら血液試料５μｌを、試薬を渦式混合機上撹拌し乍ら、
その作業試薬にピペットで加えた。それからその血液
１：１０００希釈物を流通式細胞測定装置の試料ライン
に供給する。約２分間でその試料は流通セルを通過し、
赤色細胞と網赤血球との分析のためのヘリウム−ネオン
レーザー光源にさらされる。若し試料体積が許されるな
らば各試料は２回測定される。顕微鏡試験ではこの混合
物中の大部分の赤色細胞と網赤血球とは球形化されてい
ること示した。
１システム赤色細胞試料処理案を模した方法で手で混合
した。ガラス試験管に作業試薬５ｍｌを満した。それか
ら血液試料５μｌを、試薬を渦式混合機上撹拌し乍ら、
その作業試薬にピペットで加えた。それからその血液
１：１０００希釈物を流通式細胞測定装置の試料ライン
に供給する。約２分間でその試料は流通セルを通過し、
赤色細胞と網赤血球との分析のためのヘリウム−ネオン
レーザー光源にさらされる。若し試料体積が許されるな
らば各試料は２回測定される。顕微鏡試験ではこの混合
物中の大部分の赤色細胞と網赤血球とは球形化されてい
ること示した。
【００６５】分析終了時、粗データは赤色散乱対赤色吸
収サイトグラムの形、図４で表示される。明確な細胞個
体群がその特別な散乱並に吸収信号に基き、明らかに観
察される。赤血球個体群は縦軸と縦線Ｘとの間の領域Ａ
に来る。これらの細胞は高い散乱信号と低い細胞吸収信
号を示す。網赤血球の主要部分はＸの右の領域、領域Ｂ
に来る。これらの細胞はそのオキサジン７５０染色ＲＮ
Ａからのより高い吸収信号により、成熟赤血球から区別
される。血小体個体群は線Ｙの下の領域Ｃ内に落ち、合
致領域は線Ｚの上の領域Ｄにある。血小体は網赤血球に
比較すると、比較的低い散乱信号を持っている。
収サイトグラムの形、図４で表示される。明確な細胞個
体群がその特別な散乱並に吸収信号に基き、明らかに観
察される。赤血球個体群は縦軸と縦線Ｘとの間の領域Ａ
に来る。これらの細胞は高い散乱信号と低い細胞吸収信
号を示す。網赤血球の主要部分はＸの右の領域、領域Ｂ
に来る。これらの細胞はそのオキサジン７５０染色ＲＮ
Ａからのより高い吸収信号により、成熟赤血球から区別
される。血小体個体群は線Ｙの下の領域Ｃ内に落ち、合
致領域は線Ｚの上の領域Ｄにある。血小体は網赤血球に
比較すると、比較的低い散乱信号を持っている。
【００６６】成熟赤血球と網赤血球との間の吸収分離に
基き、患者試料の網赤血球数を、網赤血球と赤血球とを
同定する、散乱光と吸収との領域を限定する電子工学的
“窓”を創ることによって決定してもよい。各“窓”に
落ちる網赤血球並に成熟赤血球の数が測定され、従って
全細胞個体群中の網赤血球と赤血球との百分率が計算さ
れる。図４の（１）において網赤血球“窓”は領域Ｂで
測定され、成熟赤血球“窓”は領域Ａで測定される。図
４の（２）および凡ての次の散乱／散乱サイトグラムに
おいて、非線形のグリッド重複はＴｙｃｋｏの前記の方
法に従う、完全球形に就いての一定体積と一定屈折率の
場所を示していることに注意。
基き、患者試料の網赤血球数を、網赤血球と赤血球とを
同定する、散乱光と吸収との領域を限定する電子工学的
“窓”を創ることによって決定してもよい。各“窓”に
落ちる網赤血球並に成熟赤血球の数が測定され、従って
全細胞個体群中の網赤血球と赤血球との百分率が計算さ
れる。図４の（１）において網赤血球“窓”は領域Ｂで
測定され、成熟赤血球“窓”は領域Ａで測定される。図
４の（２）および凡ての次の散乱／散乱サイトグラムに
おいて、非線形のグリッド重複はＴｙｃｋｏの前記の方
法に従う、完全球形に就いての一定体積と一定屈折率の
場所を示していることに注意。
【００６７】各試料中の網赤血球の参照百分率はＮａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により勧告されている手動顕微鏡手順を用い
て測定される。この手順においては、少量の試料を調製
し、その試料中の網赤血球の百分率を顕微鏡の助けをか
りて数える。その顕微鏡は１００×の油浸対物レンズと
１０×接眼レンズとを備えている。各試料について最低
１０００個の細胞を数える。顕微鏡の接眼レンズ中にＭ
ｉｌｌｅｒデイスクを挿入して計数精度を改善した。染
色後青色の材料の２つまたはそれ以上の粒子を含有する
どの赤色細胞も網赤血球と分類した。
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により勧告されている手動顕微鏡手順を用い
て測定される。この手順においては、少量の試料を調製
し、その試料中の網赤血球の百分率を顕微鏡の助けをか
りて数える。その顕微鏡は１００×の油浸対物レンズと
１０×接眼レンズとを備えている。各試料について最低
１０００個の細胞を数える。顕微鏡の接眼レンズ中にＭ
ｉｌｌｅｒデイスクを挿入して計数精度を改善した。染
色後青色の材料の２つまたはそれ以上の粒子を含有する
どの赤色細胞も網赤血球と分類した。
【００６８】患者試料の網赤血球数はこの流通式細胞測
定技術により２．３％と測定された。同じ血液試料をＮ
ＣＣＬＳ法でも分析した。その結果は網赤血球数１．７
％であった。
定技術により２．３％と測定された。同じ血液試料をＮ
ＣＣＬＳ法でも分析した。その結果は網赤血球数１．７
％であった。
【００６９】第２の実験が、細胞がニューメチレンブル
ーで染色され、散乱／吸収流通式細胞測定器により測定
された場合網赤血球と赤血球との個体群間を区別するの
に実施された。緩衝剤処方はオキサジン７５０を含有す
る試薬組成物についてのそれと同じである。オキサジン
７５０を置きかえた、作業試薬中のニューメチレンブル
ーの濃度は６０μｇ／ｍｌである。前記のような試料調
製と分析案とに従った。しかし、顕微鏡的検査は、赤色
細胞並に網赤血球はオキサジン７５０混合物におけるよ
り球形化されていないことを明らかにした。分析からの
粗データは赤色散乱対赤色吸収サイトグラムの形で（図
５の（１））表示される。図４の（１）と比較すると、
吸収と散乱信号は、多分方向雑音のため、より拡がって
いることに注意すること。赤血球と網赤血球との間の吸
収分離に基くと、患者試料の網赤血球数は２．２％と測
定された。ＮＣＣＬＳ法により分析された場合、網赤血
球数１．７％が得られた。
ーで染色され、散乱／吸収流通式細胞測定器により測定
された場合網赤血球と赤血球との個体群間を区別するの
に実施された。緩衝剤処方はオキサジン７５０を含有す
る試薬組成物についてのそれと同じである。オキサジン
７５０を置きかえた、作業試薬中のニューメチレンブル
ーの濃度は６０μｇ／ｍｌである。前記のような試料調
製と分析案とに従った。しかし、顕微鏡的検査は、赤色
細胞並に網赤血球はオキサジン７５０混合物におけるよ
り球形化されていないことを明らかにした。分析からの
粗データは赤色散乱対赤色吸収サイトグラムの形で（図
５の（１））表示される。図４の（１）と比較すると、
吸収と散乱信号は、多分方向雑音のため、より拡がって
いることに注意すること。赤血球と網赤血球との間の吸
収分離に基くと、患者試料の網赤血球数は２．２％と測
定された。ＮＣＣＬＳ法により分析された場合、網赤血
球数１．７％が得られた。
【００７０】
【実施例２】双性イオン界面活性剤を含有する、実施例
１の試薬組成物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血
球とを識別するための散乱並に吸収さ測定 実施例１の試薬組成物を利用したが、赤色血液細胞と網
赤血球とを等積的に球形化するために、更に双性イオン
界面活性剤を含めて、第２の実験セットを実施した。
１の試薬組成物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血
球とを識別するための散乱並に吸収さ測定 実施例１の試薬組成物を利用したが、赤色血液細胞と網
赤血球とを等積的に球形化するために、更に双性イオン
界面活性剤を含めて、第２の実験セットを実施した。
【００７１】各実験について、作業試薬は、試薬組成物
に界面活性剤、ラウラミドプロピルベタインを、試薬中
の界面活性剤最終濃度が６３μｇ／ｍｌであるように加
えて創った。
に界面活性剤、ラウラミドプロピルベタインを、試薬中
の界面活性剤最終濃度が６３μｇ／ｍｌであるように加
えて創った。
【００７２】実施例１に関する前記と同様の試料調製に
従った。
従った。
【００７３】顕微鏡を通しての観察で、調製された試料
中の成熟赤色細胞と網赤血球とは完全に球形化され、網
赤血球は染色されていることが判った。球形化の完全さ
の増大と共に、方向雑音の減少が増していることを示す
図１４、図１５、図４〜図７の差異に注目せよ。
中の成熟赤色細胞と網赤血球とは完全に球形化され、網
赤血球は染色されていることが判った。球形化の完全さ
の増大と共に、方向雑音の減少が増していることを示す
図１４、図１５、図４〜図７の差異に注目せよ。
【００７４】図６の（１）は、細胞をオキサジン７５０
染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で染色
した場合、網赤血球個体群と赤色球個体群との間のより
高い弁別度を示している。図１６において未染色対照、
領域Ｂには細胞がないことに注目すること。
染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で染色
した場合、網赤血球個体群と赤色球個体群との間のより
高い弁別度を示している。図１６において未染色対照、
領域Ｂには細胞がないことに注目すること。
【００７５】患者試料の網赤血球数はこの技術で８．０
％と測定された。同じ血液試料がＮＣＣＬＳ法によって
も分析された。その結果は網赤血球数９．１％である。
％と測定された。同じ血液試料がＮＣＣＬＳ法によって
も分析された。その結果は網赤血球数９．１％である。
【００７６】図７の（１）は、細胞をニューメチレンブ
ルー染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で
染色した場合の、網赤血球個体群と赤血球個体群との弁
別度を示している。
ルー染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で
染色した場合の、網赤血球個体群と赤血球個体群との弁
別度を示している。
【００７７】患者試料の網赤血球数はこの技術により
５．０％と測定された。同じ血液試料がＮＣＣＬＳ法に
よっても分析された。その結果は網赤血球数９．１％で
あった。
５．０％と測定された。同じ血液試料がＮＣＣＬＳ法に
よっても分析された。その結果は網赤血球数９．１％で
あった。
【００７８】
【実施例３】擬似吸収について補正された吸収データを
用いる、本発明の試薬組成物と方法並にＮＣＣＬＳ参照
方法とに就いての相関研究 検出光学サブシステムが、流通セル中のレーザービーム
を通過する細胞からの、散乱光および非散乱光を集め
る。細胞は凡ての方法に光を散乱する。前記の光学シス
テム中の比較的Ｈｉ−ＮＡレンズは、１９．５°までの
半角を持つ光学軸に中心を置く円錐中に散乱される光を
受ける。１９．５°より大きい角度に散乱される光は失
はれる。その結果、細胞の吸収を測定しょうとする場
合、完全に非吸収の細胞は入射光の数パーセントまでを
吸収（擬似吸収）する“ようである。”測定される吸収
は次の如く表わすことができる。
用いる、本発明の試薬組成物と方法並にＮＣＣＬＳ参照
方法とに就いての相関研究 検出光学サブシステムが、流通セル中のレーザービーム
を通過する細胞からの、散乱光および非散乱光を集め
る。細胞は凡ての方法に光を散乱する。前記の光学シス
テム中の比較的Ｈｉ−ＮＡレンズは、１９．５°までの
半角を持つ光学軸に中心を置く円錐中に散乱される光を
受ける。１９．５°より大きい角度に散乱される光は失
はれる。その結果、細胞の吸収を測定しょうとする場
合、完全に非吸収の細胞は入射光の数パーセントまでを
吸収（擬似吸収）する“ようである。”測定される吸収
は次の如く表わすことができる。
【数１】
【００７９】成熟赤色血液細胞の擬似吸収信号は典型的
には染色された網赤血球からの実際の吸収信号と同じ大
きさである。このことは染色された網赤血球の未染色赤
色血液細胞からの、吸収サイトグラムでの分離度を減少
する。吸収チャネルのＳ／Ｎ比は、擬似吸収およびヘモ
グロビン吸収成分を各赤色細胞と網赤血球との吸収信号
から除去するためにその信号を補正することにより改善
できる。擬似吸収とヘモグロビン吸収との量は前記のＴ
ｙｃｋｏ特許中に記載の、よく知られているＭｉｅ光散
乱原理を用いることにより、どんな与えられた細胞につ
いても計算できる。角度間隔１９．５〜１８０°につい
ての散乱断面、その上にヘモグロビン吸収成分δ3を加
えたものは次の如く計算できる。
には染色された網赤血球からの実際の吸収信号と同じ大
きさである。このことは染色された網赤血球の未染色赤
色血液細胞からの、吸収サイトグラムでの分離度を減少
する。吸収チャネルのＳ／Ｎ比は、擬似吸収およびヘモ
グロビン吸収成分を各赤色細胞と網赤血球との吸収信号
から除去するためにその信号を補正することにより改善
できる。擬似吸収とヘモグロビン吸収との量は前記のＴ
ｙｃｋｏ特許中に記載の、よく知られているＭｉｅ光散
乱原理を用いることにより、どんな与えられた細胞につ
いても計算できる。角度間隔１９．５〜１８０°につい
ての散乱断面、その上にヘモグロビン吸収成分δ3を加
えたものは次の如く計算できる。
【数２】
【００８０】ここで、ａは球形化された細胞の半径であ
り、λは励起（または照明）光波長であり、ηｓは試料
流およびシース（ｓｈｅａｔｈ）の屈折率であり、Ｑｅ
ｘｔは細胞の励起効率であり、擬似吸収の場合、θ3＝
０°およびΔθ3＝１９．５°である。δ3値はＶおよび
ＨＣの凡ての期待値に関し、表にされている。
り、λは励起（または照明）光波長であり、ηｓは試料
流およびシース（ｓｈｅａｔｈ）の屈折率であり、Ｑｅ
ｘｔは細胞の励起効率であり、擬似吸収の場合、θ3＝
０°およびΔθ3＝１９．５°である。δ3値はＶおよび
ＨＣの凡ての期待値に関し、表にされている。
【００８１】擬似吸収の補正は次の如く行う。ＶとＨＣ
とは先ず、Ｔｙｃｋｏに記載のような散乱−散乱サイト
グラムの細胞からの２つの散乱信号から決定する。それ
からδ3を、測定されたＶとＨＣとに関してのルックア
ップ表記載項目中に見出し、吸収チャネルで測定された
値から引き去る。その結果が細胞の染色による実際の吸
収である。測定された吸収信号は次の関係式により各細
胞に関する染料吸収のみを残すように調節できる。
とは先ず、Ｔｙｃｋｏに記載のような散乱−散乱サイト
グラムの細胞からの２つの散乱信号から決定する。それ
からδ3を、測定されたＶとＨＣとに関してのルックア
ップ表記載項目中に見出し、吸収チャネルで測定された
値から引き去る。その結果が細胞の染色による実際の吸
収である。測定された吸収信号は次の関係式により各細
胞に関する染料吸収のみを残すように調節できる。
【数３】
【００８２】凡てのデータに関しスレショールディング
とフラギングとに先立ち、この調節された値が粗データ
パラメータに替る。赤色散乱パラメーターがＶ−ＨＣ図
中に現れない対象はいずれもデータ分析計画では無限さ
れている。それで、このデータは図１０と図１１とに示
されている補正された値を反映する赤色散乱対吸収サイ
トグラムで再表示してある。
とフラギングとに先立ち、この調節された値が粗データ
パラメータに替る。赤色散乱パラメーターがＶ−ＨＣ図
中に現れない対象はいずれもデータ分析計画では無限さ
れている。それで、このデータは図１０と図１１とに示
されている補正された値を反映する赤色散乱対吸収サイ
トグラムで再表示してある。
【００８３】研究は、ＮＣＣＬＳ手働法を用い、散乱／
吸収流通式細胞測定器中で試薬組成物の中に用いた場合
のオキサジン７５０の性能を比較するため行った。血液
試料はその試薬組成物で染色した。血液試料の同じセッ
ト中の網赤血球もＮＣＣＬＳ法を用いて計数した。
吸収流通式細胞測定器中で試薬組成物の中に用いた場合
のオキサジン７５０の性能を比較するため行った。血液
試料はその試薬組成物で染色した。血液試料の同じセッ
ト中の網赤血球もＮＣＣＬＳ法を用いて計数した。
【００８４】試料調製と分析計画とは、加えられた擬似
吸収補正を除いては、実施例２について記載したものと
同じものである。
吸収補正を除いては、実施例２について記載したものと
同じものである。
【００８５】顕微鏡を通して見ると、調製された試料中
の成熟赤色細胞と網赤血球とが完全に球形化され、網赤
血球は染色されていることが判った。
の成熟赤色細胞と網赤血球とが完全に球形化され、網赤
血球は染色されていることが判った。
【００８６】これら２つの方法から得られた百分率網赤
血球数は図１２中で比較されている。試薬組成物中オキ
サジン７５０濃度２μｇ／ｍｌで、試薬組成物と図１〜
図３の流通式細胞測定装置とを用いた測定値と、ＮＣＣ
ＬＳ参照法により得た測定値との間に密接な相関がある
ことを示している。直交回帰分析により得られた測定値
の相関係数は０．９２であった。
血球数は図１２中で比較されている。試薬組成物中オキ
サジン７５０濃度２μｇ／ｍｌで、試薬組成物と図１〜
図３の流通式細胞測定装置とを用いた測定値と、ＮＣＣ
ＬＳ参照法により得た測定値との間に密接な相関がある
ことを示している。直交回帰分析により得られた測定値
の相関係数は０．９２であった。
【００８７】
【実施例４】擬似吸収に対する補正を行った吸収データ
を用いた、吸収流通式細胞測定器とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１参照法とに就いての相関研究 擬似吸収補正と適当なゲーティングの後、赤血球と網赤
血球との指数ＭＣＶとＭＣＨＣとが別別に測定され、散
乱／吸収流通式細胞測定器中に本発明の試薬組成物を用
いて得られた値とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１測定値と
を比較した。図８と図９とはそれぞれ、全体の赤色血液
細胞のＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関データを示す。
を用いた、吸収流通式細胞測定器とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１参照法とに就いての相関研究 擬似吸収補正と適当なゲーティングの後、赤血球と網赤
血球との指数ＭＣＶとＭＣＨＣとが別別に測定され、散
乱／吸収流通式細胞測定器中に本発明の試薬組成物を用
いて得られた値とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１測定値と
を比較した。図８と図９とはそれぞれ、全体の赤色血液
細胞のＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関データを示す。
【００８８】図１３はＨＣ対Ｖサイトグラム中“＋”で
印された網赤血球を示す。
印された網赤血球を示す。
【００８９】前記の記載から明らかな、本発明の幾つか
の有利さには、全血試料の中の網赤血球の同定に関す
る、そして吸収流通式細胞測定技術による、網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃
度との同時定量に関する試薬組成物と方法とを含んでい
る。
の有利さには、全血試料の中の網赤血球の同定に関す
る、そして吸収流通式細胞測定技術による、網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃
度との同時定量に関する試薬組成物と方法とを含んでい
る。
【００９０】前記の見地から、本発明の幾つかの目的が
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
【００９１】本発明の範囲から逸脱することなく、前記
の構造と方法とにおいていろいろな変更がなされ得るの
で、前記の記載中に含まれるかあるいは添付図面で示さ
れた凡ての事項は説明としてで、限定の意味ではないと
解釈されるべきものであるとする。例えば血液の画分試
料は同様な方法で処置し得る。
の構造と方法とにおいていろいろな変更がなされ得るの
で、前記の記載中に含まれるかあるいは添付図面で示さ
れた凡ての事項は説明としてで、限定の意味ではないと
解釈されるべきものであるとする。例えば血液の画分試
料は同様な方法で処置し得る。
【図１】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
通式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
【図２】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
通式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
【図３】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の検出信号処理システムの説明図であ
る。
通式細胞測定器の検出信号処理システムの説明図であ
る。
【図４】実施例１に従い、オキサジン７５０により染色
された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と網赤
血球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と網赤
血球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
【図５】実施例１に従い、ニューメチレンブルーにより
染色された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と
網赤血球とを含有する全血試料についてのサイトグラム
である。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラム
であり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱
のサイトグラムである。
染色された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と
網赤血球とを含有する全血試料についてのサイトグラム
である。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラム
であり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱
のサイトグラムである。
【図６】実施例２に従い、オキサジン７５０により染色
された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球と
を含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球と
を含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
【図７】実施例２に従い、ニューメチレンブルーにより
染色された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血
球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
染色された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血
球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
【図８】実施例４に従う、オキサジン７５０染料により
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＶの相関を示
す。
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＶの相関を示
す。
【図９】実施例４に従う、オキサジン７５０染料により
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＨＣの相関を示
す。
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＨＣの相関を示
す。
【図１０】実施例３に従う、擬似吸収補正をした、オキ
サジン７５０で染色された、完全に球形化された赤色血
液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイト
グラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイト
グラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角
度散乱のサイトグラムである。
サジン７５０で染色された、完全に球形化された赤色血
液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイト
グラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイト
グラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角
度散乱のサイトグラムである。
【図１１】実施例３に従う、擬似吸収相関を持つ、ニュ
ーメチレンブルーで染色された完全に球形化された赤色
血液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイ
トグラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイ
トグラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高
角度散乱のサイトグラムである。
ーメチレンブルーで染色された完全に球形化された赤色
血液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイ
トグラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイ
トグラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高
角度散乱のサイトグラムである。
【図１２】実施例３に従う本発明の試薬を含有するオキ
サジン７５０とＮＣＣＬＳ参照方法とを用いた、全血試
料中に検出された網赤血球百分率の比較である。
サジン７５０とＮＣＣＬＳ参照方法とを用いた、全血試
料中に検出された網赤血球百分率の比較である。
【図１３】網赤血球（＋字で示す）と赤色細胞（黒塗正
方形で示す）とに関する、ＨＣ対Ｖのサイトグラムであ
る。
方形で示す）とに関する、ＨＣ対Ｖのサイトグラムであ
る。
【図１４】未染色で球形化されていない赤色血液細胞に
関する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムである。
関する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムである。
【図１５】未染色で球形化されていない赤色血液細胞に
関する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイト
グラムである。
関する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイト
グラムである。
【図１６】未染色で球形化されている赤色血液細胞に関
する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、擬
似吸収に対して補正してある。
する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、擬
似吸収に対して補正してある。
【図１７】未染色で球形化されている赤色血液細胞に関
する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイトグ
ラムである。
する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイトグ
ラムである。
１０ 照明光学システム １２ Ｈｅ−Ｎｅレーザー １４ 反射鏡 １６ 反射鏡 １８ 円柱レンズ ２０ 円柱レンズ ２２ 孔口 ２３ 照明二重レンズ ２４ 流通セル ２６ 矢印
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ 7055−2Ｊ (72)発明者 グレガリ、エム、コゥレラ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州07003、 ブルームフィールド、ニューエル・ドライ ヴ 61番 (72)発明者 ダニュアル、ベン・デイヴィド アメリカ合衆国ニューヨーク州10588、シ ュラブ・オゥク、アスペン・ロゥド 1335 番 (72)発明者 アルバト、キューポ アメリカ合衆国ニューヨーク州10583、ス カースデイル、ウインディング・レイン 11番 (72)発明者 ソフィー、エス、ファン アメリカ合衆国ニューヨーク州10546、ミ ルウッド、グレンウッド・ロゥド 21番 (72)発明者 ジェナ、フィシァ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州07640、 ハリングタン・パーク、ノーマ・ロゥド 144番 (72)発明者 グレイス、イー、マーティン アメリカ合衆国ニューヨーク州10549、マ ウント・キスコ、パーク・ドライヴ 99番 (72)発明者 レナド、オーンスタイン アメリカ合衆国ニューヨーク州10607、ホ ワイト・プレインズ、ビルタム・ロゥド ５番
Claims (31)
- 【請求項１】 次の各工程 （ａ）血液試料のアリコートを、球形化剤を含有する溶
液から成る水性試薬組成物と混合して懸濁液を形成する
工程、（ｂ）工程（ａ）の前記懸濁液を、集束した光学
的照明領域に、１度に実質的に１つの細胞ずつ、通す工
程、（ｃ）各細胞により散乱された光および吸収された
光を検出及び測定する工程、及び（ｄ）前記の散乱およ
び吸収された光の強さに少とも部分的に基いて、関心あ
る亜綱の細胞を識別する工程、を含んで成る流通式細胞
測定法による、血液試料中の関心ある細胞の亜綱の同定
方法。 - 【請求項２】 工程（ａ）が、関心ある亜綱を選択的に
染色する染料化合物を添加することを含む、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 工程（ｄ）が、集光光学系の孔口の外に
散乱する光による擬似吸収成分除去のため、吸収信号の
量を修正することを含む、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 次の各工程 （ａ）関心のある亜綱の細胞のリボ核酸を染色する染料
化合物と、約６〜約９のｐＨを維持するための緩衝剤と
球形化剤とを包含する水性試薬組成物と血液試料のアリ
コートを混合して懸濁液を形成する工程、（ｂ）工程
（ａ）の懸濁液を、集束した光学的照明領域に、１度に
実質的に１つの細胞ずつ、通す工程、（ｃ）各細胞によ
り散乱および吸収された光を検出及び測定する工程、及
び（ｄ）前記の散乱および吸収された光の強さに少くと
も部分的に基いて、関心ある亜綱の細胞を識別する工
程、を含んで成る流通式細胞測定法による、血液試料中
の関心ある細胞の亜綱の同定方法。 - 【請求項５】 細胞の亜綱が網状赤血球である請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 工程（ｂ）における光学的照明がスペク
トルの赤色領域における励起波長をもつ、請求項４に記
載の方法。 - 【請求項７】 球形化剤が双性イオン界面活性剤であ
り、全緩衝剤濃度が血液試料中の細胞を等容積的に球形
にするよう等張である、請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 染料化合物が構造式 【化１】 を持つオキサジン７５０あるいは染料化合物が構造式 【化２】 を持つニューメチレンブルーである、請求項４に記載の
方法。 - 【請求項９】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタイ
ンとＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモ
ニオ−１−プロパンスルホナートとＮ−ドデシル−Ｎ，
Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナ
ートとココアミドプロピルベタインとココアミドスルホ
ベタインとから成る群から選択される、請求項７に記載
の方法。 - 【請求項１０】 次の各工程 （ａ）有機のカチオン染料化合物と球形化剤と緩衝剤溶
液とを包含する試薬組成物を、血液試料のアリコートと
混合して懸濁液を形成させ、その染料化合物が網状赤血
球のリボ核酸を染色し、（ｂ）工程（ａ）の懸濁液を、
集束した光学的照明領域に、１度に実質的に１つの細胞
ずつ、通す工程、（ｃ）各細胞により散乱および吸収さ
れた光を検出及び測定する工程、（ｄ）前記の散乱並に
吸収された光の強さに基き染色された細胞と染色されて
いない細胞とを同定する工程、及び（ｅ）前記の散乱お
よび吸収された光の強さに基き網状赤血球または赤血球
の数と体積とヘモグロビン濃度とＲＮＡ濃度とを決定す
る工程、を含んで成る流通式細胞測定法による、全血試
料中の網状赤血球と赤血球との同定方法。 - 【請求項１１】 染料化合物が濃度範囲約２μｇ／ｍｌ
〜約１５μｇ／ｍｌのオキサジン７５０である、請求項
１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 試薬組成物のｐＨが約６〜約９であ
る、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 緩衝溶液が、濃度約５〜５０ｍＭのＫ
／ＮａＨＣＯ3と、濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ2と濃
度約４〜１０４ｍＭのＫＣｌと濃度約０〜１．５ｍＭの
Ｎａ3ＰＯ4と濃度約０〜０．６ｍＭのＣａＣｌ2との１
つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が
約２５０〜３３０ｍ Ｏｓｍである、請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１４】 緩衝溶液が濃度約０〜１５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ／ＴＥＡ、濃度約０〜１２１ｍＭのＫ2Ｏｘ／Ｅ
ＤＴＡ、または濃度約０〜１５５ｍＭのＫＣｌ／ＮａＣ
ｌの１つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸
透性が約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍである、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１５】 界面活性剤がアルキルベタインまたは
アルキルアミドベタインである、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１６】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インとＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アン
モニオ−１−プロパンスルホナートとＮ−デシル−Ｎ，
Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナ
ートとココアミドプロピルベタインとココアミドスルホ
ベタインとより成る群から選択される、請求項１０に記
載の方法。 - 【請求項１７】 界面活性剤が約３．９〜１４８μｇ／
ｍｌの量で存在する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１８】 染料化合物が濃度約１０〜１００μｇ
／ｍｌのニューメチレンブルーである、請求項１０に記
載の方法。 - 【請求項１９】 染料化合物が構造式 【化３】 を持つオキサジン７５０または染料化合物が構造式 【化４】 を持つニューメチレンブルーである細胞のリボ核酸を染
色する染料化合物と、ｐＨを約６〜８．１に維持するた
めの緩衝剤とを包含する、流通式細胞測定法による、全
血試料中の関心ある細胞の亜綱の同定のための試薬組成
物。 - 【請求項２０】 緩衝溶液が、濃度約５〜５０ｍＭのＫ
／ＮａＨＣＯ3と濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ2と濃度
約４〜１０４ｍＭのＫＣｌと濃度約０〜１．５ｍＭのＮ
ａ3ＰＯ4と濃度約０〜０．６ｍＭのＣａＣｌ2との１つ
またはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が約
２５０〜３３０ｍ Ｏｓｍである、請求項１９に記載の
試薬組成物。 - 【請求項２１】 緩衝溶液が、濃度約０〜１５０ｍＭの
Ｔｒｉｓ／ＴＥＡ、濃度約０〜１２１ｍＭのＫ2Ｏｘ／
ＥＤＴＡ、あるいは濃度約０〜１５５ｍＭのＫＣｌ／Ｎ
ａＣｌの１つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最
終浸透性が約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍである、請求項
１９に記載の試薬組成物。 - 【請求項２２】 染料オキサジン７５０を濃度約２〜１
５μｇ／ｍｌで含有する、請求項１９に記載の試薬組成
物。 - 【請求項２３】 染料ニューメチレンブルーを濃度約１
０〜１００μｇ／ｍｌで含有する、請求項１９に記載の
試薬組成物。 - 【請求項２４】 染料化合物が構造式 【化５】 を持つオキサジン７５０か、または構造式 【化６】 を持つニューメチレンブルーである、網状赤血球中のリ
ボ核酸染色のための染料化合物の有効量と、網状赤血球
および赤血球の等容積的球形化を行う量の双性イオン界
面活性剤と約６〜９のｐＨを維持するための緩衝溶液と
を包含する、流通式細胞測定法による全血試料中の網状
赤血球同定のための試薬組成物。 - 【請求項２５】 緩衝溶液が濃度約５〜５０ｍＭのＫ／
ＮａＨＣＯ3と、濃度約０〜８８ｍＭのＭｇＣｌ2と濃度
４〜１０４ｍＭのＫＣｌと濃度約０〜１．５ｍＭのＮａ
3ＰＯ4と濃度０〜０．６ｍＭのＣａＣｌ2との１つまた
はそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が約２５
０〜３３０ｍ Ｏｓｍである、請求項２４に記載の試薬
組成物。 - 【請求項２６】 緩衝溶液が濃度約０〜１５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ／ＴＥＡ、濃度約０〜１２１ｍＭのＫ2Ｏｘ／Ｅ
ＤＴＡ、または濃度０〜１５５ｍＭのＫＣｌ／ＮａＣｌ
の１つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透
性が約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍである、請求項２４に
記載の試薬組成物。 - 【請求項２７】 濃度約２〜１５μｇ／ｍｌの染料オキ
サジン７５０を含有する、請求項２４に記載の試薬組成
物。 - 【請求項２８】 濃度約１０〜１００μｇ／ｍｌの染料
ニューメチレンブルーを含有する、請求項２４に記載の
試薬組成物。 - 【請求項２９】 界面活性剤を約３．９〜１４８μｇ／
ｍｌ含有する、請求項２４に記載の試薬組成物。 - 【請求項３０】 界面活性剤がアルキルベタインまたは
アルキルアミドベタインである請求項２４に記載の試薬
組成物。 - 【請求項３１】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インとＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アン
モニオ−１−プロパンスルホナートとＮ−ドデシル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１プロパンスルホ
ナートとココアミドプロピルベタインとココアミドスル
ホベタインとから成る群から選択される、請求項２４に
記載の試薬組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/802593 | 1991-12-05 | ||
| US07/802,593 US5350695A (en) | 1991-12-05 | 1991-12-05 | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
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|---|---|
| JPH06180314A true JPH06180314A (ja) | 1994-06-28 |
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|---|---|---|---|
| JP4350136A Expired - Lifetime JP2802710B2 (ja) | 1991-12-05 | 1992-12-04 | 全血中の網状赤血球を識別する方法及びそのための試薬組成物 |
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| IL (1) | IL103054A (ja) |
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