CN104592207A - 一种新型单糖荧光衍生方法和应用 - Google Patents

一种新型单糖荧光衍生方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型单糖荧光衍生方法和应用，本发明的式（I）所示的非荧光化合物可以应用于还原糖的荧光衍生试剂方面，其中Ar为芳基或杂芳基。本发明所使用的荧光衍生试剂不具有荧光特性，与还原糖发生化学反应后能够使糖具有荧光特性，因此反应后无须去除多余的衍生物从而可以快速地进行HPLC分析，此外，此方法中衍生物能够与糖进行分子量1：1的反应从而实现对糖的定量分析。

Description

一种新型单糖荧光衍生方法和应用
技术领域
本发明涉及一种新的荧光衍生试剂及其使用方法，并涉及将其应用于生物样品的单糖组分分析。
背景技术
随着科学研究的发展，人们逐渐认识到由不同单糖组成的糖链是除蛋白质和核酸外体现生命现象的第三类生物大分子，糖链的研究已被公认为继蛋白质和核酸的研究后探索生命奥秘的第三个里程碑。
糖链在生物体内发挥着重要作用，如细胞识别，细胞相互作用，炎症和疾病恶化等。另外，糖链是很多病毒、细菌等的受体，并作为肿瘤的标记物受到越来越多的关注。
然而，由于糖链结构的复杂性和多样性，其研究进展远远落后于蛋白质和核酸的研究，而单糖组分研究是深入研究糖链结构和功能的第一步。由于糖分子本身不具有（或只具有极弱的）发光性，人们通常先将糖进行化学衍生标记，使其具有较强的紫外或荧光吸收，然后经高效液相色谱或毛细管电泳等技术进行进一步解析。
目前，人们已经开发出多种单糖衍生标记化合物如2-氨基吡啶（2-PA）、2-邻氨基苯甲酸（2-AA）和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）等，但这些方法都存在着一定局限性：如使用2-PA时需要过葡聚糖凝胶柱除去过量的2-PA，这使得样品准备需要大量的时间以及造成样品损失；使用2-AA标记葡糖胺时，会有15%的葡糖胺异构成甘露糖胺；而PMP标记时也需要经过多次乙醚萃取除去过量PMP，并且PMP标记的糖定量效果不可靠。基于以上原因有必要开发出一种能够避免上述缺陷的新的糖荧光衍生方法。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种新的荧光衍生试剂。本发明所使用的化学衍生物本身不具有荧光特性，与还原糖发生化学反应后能够使糖具有荧光特性，因此反应后无须去除多余的衍生物从而可以快速地进行HPLC分析，此外此方法可实现对糖的定量分析。
本发明的另一目的是提供一种将上述荧光衍生试剂应用于单糖组分分析的方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
式（I）所示的非荧光化合物在作为还原糖的荧光衍生试剂方面的应用，
其中，Ar为杂芳基，优选的Ar为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基或吡唑啉基，最优选为吡啶基。
本发明包括一种单糖荧光衍生方法，将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到用于单糖结构定性或定量检测的荧光标记产物；所述还原糖选自己糖、己糖衍生物、戊糖或戊糖衍生物中的一种或几种。
本发明所适用的还原糖包括己糖和戊糖，以及被修饰的己糖和戊糖。如C3，C4，C5和C6位置上的羟基有一个或多个被R基取代的还原糖。进一步的，本发明的还原糖选自式（II）或式（III）化合物中的一种或几种，
其中，R1、R2、R3或R4分别独立地选自氢、羟基、氨基、乙酰基、羧基、磷酸基、卤素、硫酸基或糖基。
优选的，R1、R2或R4分别独立地选自羟基，R3选自氢或羟基；进一步优选的，还原糖选自半乳糖、甘露糖、古洛糖、甘露糖、阿拉伯糖、芹菜糖、木糖、岩藻糖或鼠李糖中的一种或几种。
本发明中的碱为碳酸氢钠或碳酸氢钾，碱的用量为还原糖总质量的0.1～1倍，具体可根据反应进行调整；反应溶液选自水和/或甲醇；反应温度为50～130℃。本发明得到的荧光标记产物的激发波长为300-600nm，吸收波长为360-650nm。
在本发明中，采用新的荧光衍生试剂，还原糖与其活泼亚甲基经缩合并进一步经分子内环化脱去一分子水形成荧光标记产物。其反应原理如下：
本发明进一步提供了一种单糖荧光衍生测定方法：将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到荧光标记产物，采用HPLC方法以激发波长300-600nm、吸收波长360-650nm进行测定得到的标记产物。其中各反应原料和条件如上所述。
本发明的有益效果：
本发明所使用的荧光衍生试剂不具有荧光特性，与还原糖发生化学反应后能够使糖具有荧光特性，因此反应后无须去除多余的衍生物从而可以快速地进行HPLC分析，此外，此方法中衍生物能够与糖进行分子量1：1的反应从而实现对糖的定量分析。
附图说明
图1是本发明实施例1的HPLC分析结果图。
图2是本发明实施例1的ESI MS结果图。
图3是本发明实施例2的HPLC分析结果图。
图4是本发明实施例3的HPLC分析结果图。
具体实施方式
实施例1：
取半乳糖0.25g，NaHCO367mg，再加入1,3-二（2-吡啶）-1,3-丙烷二酮0.67g，之后加入40ml甲醇水溶液（3:1，v/v）充分混匀后，于110℃反应过夜。经减压除去甲醇后，溶于适量水，进一步经C18固相萃取柱（10%乙腈洗脱）及硅胶柱纯化（10%甲醇氯仿溶液）。
用HPLC测定得到的标记产物。使用C18反相柱（HyperClone5u ODS120A250x4.60mm），以激发波长330nm、吸收波长390nm进行测定。
HPLC分析结果如图1所示，ESI MS结果如图2所示。
实施例2：
取D-半乳糖（D-Galactose），D-甘露糖（D-Mannose），D-古洛糖（D-Gulose），D-阿拉伯糖（D-Arabinose），D-芹菜糖（D-Apiose），D-木糖（D-Xylose），L-岩藻糖（L-Fucose），L-鼠李糖（L-Rhamnose）水溶液各8ul(20mM)，加入2ul0.4M的碳酸氢钠水溶液，再加入30ul0.1M1,3-二（2-吡啶）-1,3-丙烷二酮甲醇溶液，密封并充分混匀后于110℃反应过夜。反应完成后分别用水稀释到2ml，13000r/m离心1分钟，取上清进行HPLC分析。
HPLC分析结果如图3所示，其中，峰编号1-8分别是D-半乳糖、D-古洛糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-芹菜糖、D-木糖、L-岩藻糖和L-鼠李糖的衍生产物。
实施例3：
称取糖蛋白辣根过氧化物酶（HRP）100ug，加入40ul4M的三氟乙酸（TFA）水溶液，115℃水解3小时，经真空旋转蒸发仪除去TFA，为了尽量除去TFA，再加入100ul50%甲醇水溶液并旋干，重复3次。经1,3-二（2-吡啶）-1,3-丙烷二酮标记后进行HPLC分析。
其结果如图4所示，其中峰编号1-4分别是D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和L-岩藻糖的衍生产物。

Claims (10)

1.式（I）所示的非荧光化合物在作为还原糖的荧光衍生试剂方面的应用，
其中，Ar为杂芳基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于Ar为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基或吡唑啉基。
3.一种单糖荧光衍生方法，其特征在于将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到用于单糖结构定性或定量检测的荧光标记产物；所述还原糖选自己糖、己糖衍生物、戊糖或戊糖衍生物中的一种或几种，式（I）非荧光化合物的结构如下：
其中，Ar为杂芳基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述还原糖选自式（II）或式（III）化合物中的一种或几种，
其中，R1、R2、R3或R4分别独立地选自氢、羟基、氨基、乙酰基、羧基、磷酸基、卤素、硫酸基或糖基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于R1、R2或R4分别独立地选自羟基，R3选自氢或羟基。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述还原糖选自半乳糖、甘露糖、古洛糖、甘露糖、阿拉伯糖、芹菜糖、木糖、岩藻糖或鼠李糖中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述碱为碳酸氢钠或碳酸氢钾，碱的用量为还原糖总质量的0.1～1倍；反应溶液选自水和/或甲醇；反应温度为50～130℃。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于Ar为吡啶基、嘧啶基、喹啉基、异喹啉基或吡唑啉基。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述荧光标记产物的激发波长为300-600nm，吸收波长为360-650nm。
10.一种单糖荧光衍生测定方法，其特征在于将一种或多种还原糖，或者含有一种或多种还原糖的溶液，与碱和式（I）所示的非荧光化合物进行缩合和环化脱水反应，得到荧光标记产物，采用HPLC方法以激发波长300-600nm、吸收波长360-650nm进行测定得到的标记产物；所述还原糖选自己糖、己糖衍生物、戊糖或戊糖衍生物中的一种或几种，式（I）非荧光化合物的结构如下：
其中，Ar为杂芳基。
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