CN113121580A - 一种荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荧光探针及其制备方法和应用，属于过氧化氢检测术领域。本发明提供的荧光探针，具有式I所示的结构。本发明提供的荧光探针的分子中含有能够与过氧化氢发生作用的苯硼酸酯结构，对其它活性氧、活性氮、活性硫等物质具有抗干扰性，对过氧化氢的选择性高；荧光探针中的苯硼酸酯与过氧化氢反应后断开并被氧化成羟基，荧光探针的荧光强度相比于与过氧化氢反应前提高了30倍左右，颜色及荧光变化灵敏度高，从而实现了高选择性、高灵敏度地识别和检测水体或细胞中的过氧化氢；而且，本发明提供的荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，毒性低，可以实现细胞内过氧化氢的荧光检测；在水体或细胞中的过氧化氢检测具有良好的应用前景。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及过氧化氢检测技术领域，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

过氧化氢(H₂O₂)是一种重要活性氧类物质(ROS)，主要产生于细胞线粒体有氧呼吸电子传递链，它不仅在细胞内的氧化应激反应中扮演着细胞毒物的角色，而且还是重要的信使分子，参与包括伤口愈合、免疫和干细胞增殖等许多病理和生理过程。过氧化氢在细胞内过量积聚会引起生物体代谢紊乱，导致炎症，衰老，癌症，糖尿病和神经退行性疾病等一系列疾病产生。同时，过氧化氢和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。因此，过氧化氢检测与分析技术对于相关疾病的研究具有十分重要的意义。

过氧化氢的检测主要包括荧光法、光度法、电化学法及化学发光法等。其中，荧光法具有非侵入性、高灵敏性和高信号特异性的特点，应用广泛。近年来用于检测过氧化氢的常用的荧光探针大多基于硼酸酯为识别基团。然而，现有的以硼酸酯为识别基团的探针存在受到其它活性氧分子(如过氧亚硝基等)干扰的缺点，对过氧化氢的选择性不够高。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和应用，本发明提供的荧光探针对过氧化氢的选择性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种荧光探针，具有式I所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和无水有机溶剂混合进行第一取代反应；将所述第一取代反应得到的反应液与式III所示的结构的第二化合物混合进行第二取代反应，得到式I所示结构的荧光探针；

优选的，所述式II所示的结构的第一化合物由以下方法制备得到：在保护气氛下，将2,4-二羟基苯甲醛、2-环己烯-1-酮和溶剂混合，进行加成反应，得到式II所示的结构的第一化合物。

优选的，所述2,4-二羟基苯甲醛和2-环己烯-1-酮的摩尔比为1:1；

所述溶剂为水和有机溶剂的混合溶剂；所述有机溶剂包括四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；所述水和有机溶剂的体积比为(1～2):1；

所述加成反应的温度为5～40℃，时间为24～72h。

优选的，所述式III所示的结构的第二化合物由以下方法制备得到：将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-硝基苯甲酰氯和无水有机溶剂混合，进行取代反应，得到式III所示的结构的第二化合物。

优选的，所述4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和4-硝基苯甲酰氯的摩尔比为(1～1.5):1；

所述无水有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷；

所述取代反应的温度为5～40℃，时间为1～3h。

优选的，所述式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和式III所示的结构的第二化合物的摩尔比为1:1:1；

所述无水有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷。

优选的，所述第一取代反应的温度为0℃，时间为10～60min；

所述第二取代反应的温度为5～40℃，时间为12～24h。

本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述制备方法制备得到的荧光探针在非疾病的诊断或治疗中过氧化氢检测或荧光成像中的应用。

优选的，所述过氧化氢为水体中的过氧化氢或细胞内的过氧化氢。

本发明提供了一种荧光探针，具有式I所示的结构。本发明提供的荧光探针的分子中含有能够与过氧化氢发生作用的苯硼酸酯结构，当过氧化氢存在时，会使硼酸酯部分水解，从而释放出荧光团；相比于其它硼酸酯结构，本发明提供的荧光探针分子中的苯硼酸酯部分对过氧化氢有很好的选择性，对其它活性氧、活性氮、活性硫等物质具有抗干扰性。本发明提供的荧光探针是由一种结构清晰、光性质稳定的四氢黄酮类荧光团以及能够提供与特定的活性氧分子——过氧化氢发生反应的苯硼酸酯组成，荧光探针中的苯硼酸酯与过氧化氢反应后断开并被氧化成羟基，荧光探针的荧光强度相比于与过氧化氢反应前提高了30倍左右，荧光探针的颜色由接近无色变为浅黄色，荧光探针的颜色及荧光变化灵敏度高，荧光强度的变化与过氧化氢的浓度之间存在线性关系，从而实现了高选择性、高灵敏度地识别和检测水体或细胞中的过氧化氢。而且，本发明提供的荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，对细胞本身毒副作用小，可以实现细胞内过氧化氢的荧光检测；在水体和细胞中的过氧化氢检测具有良好的应用前景。如实施例测试结果所示，本发明提供的荧光探针对在510nm处对H₂O₂的荧光强度为对NO₂、NO₃、TBHP、ClO-、O₂ ^-和ONOO^-的荧光强度的约30倍，说明本发明提供的荧光探针对过氧化氢表现出高度的荧光选择性；本发明制备的荧光探针对A549、SMMC-7721、HeLa、MCF-7和MDA-MB-231癌症细胞表现出一定的抑制效果，对正常细胞BEAS-2B的细胞活力没有明显影响，说明本发明提供的荧光探针能够应用于正常生物体内成像实验中；而且，本发明提供的荧光探针可以在细胞内对内源性的过氧化氢进行荧光识别，可以对线虫外源性的过氧化氢进行荧光识别。

本发明提供了上述技术方案所述荧光探针的制备方法，本发明提供的制备方法，操作简单，制备成本低，适宜工业化生产。

附图说明

图1为实施例1制备的荧光探针的¹H-NMR谱图；

图2为实施例1制备的荧光探针的¹³C-NMR谱图；

图3为实施例1制备的荧光探针的HRMS(ESI)谱图；

图4为实施例1制备的荧光探针在水溶液体系中对过氧化氢响应荧光光谱变化图；

图5为实施例1制备的荧光探针在水溶液体系中对不同离子在510nm处的荧光强度测试图，其中，1为空白样品，2为NO₂，3为NO₃，4为TBHP，5为ClO^-，6为O₂ ^-，7为ONOO^-，8为H₂O₂；

图6为实施例1制备的荧光探针在水溶液体系中对不同浓度过氧化氢荧光光谱变化图；

图7为实施例1制备的荧光探针在510nm处荧光强度与相对应H₂O₂离子浓度拟合曲线图；

图8为实施例1制备的荧光探针的细胞毒性试验图；

图9为实施例1制备的荧光探针在细胞内对内源性过氧化氢荧光识别图，其中，(c)、(g)和(k)为Pi通道，(b)为只加入荧光探针的荧光图，(f)为加入PMA和荧光探针的荧光图，(j)为加入鱼藤酮和荧光探针的荧光图；

图10为实施例1制备的荧光探针在线虫体内对过氧化氢荧光识别图，其中，其中，(a)、(c)和(e)为明场，(b)为未加入任何物质的线虫的荧光图，(d)为只加入荧光探针的荧光图，(f)为加入H₂O₂和荧光探针的荧光图。

具体实施方式

本发明提供了一种荧光探针，具有式I所示的结构：

本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

将式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和无水有机溶剂混合进行第一取代反应；将所述第一取代反应得到的反应液与式III所示的结构的第二化合物混合进行第二取代反应，得到式I所示结构的荧光探针；

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

在本发明中，所述式II所示的结构的第一化合物优选由以下方法制备得到：在保护气氛下，将2,4-二羟基苯甲醛、2-环己烯-1-酮和混合溶剂混合，进行加成反应，得到式II所示的结构的第一化合物。在本发明中，所述2,4-二羟基苯甲醛和2-环己烯-1-酮的摩尔比优选为1：(1～1.5)，更优选为1:1。在本发明中，所述混合溶剂优选为水和有机溶剂的混合溶剂；所述有机溶剂优选包括四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；所述水和有机溶剂的体积比优选为1：(0.5～1)，更优选为1:1。在本发明中，所述2,4-二羟基苯甲醛的物质的量和混合溶剂的体积之比优选为1mmol：(2.5～3.5)mL，更优选为1mmol：3mL。本发明对于所述保护气氛没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的保护气氛即可，具体如氮气或氩气。本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。在本发明中，所述加成反应的温度优选为5～40℃，更优选为20～30℃，最优选为25℃；所述加成反应的时间优选为24～72h，更优选为36～60h，最优选为40～50h。在本发明中，所述加成反应过程中发生的反应如式(1)所示：

所述加成反应后，本发明优选还包括在所述加成反应后的反应液中加入无机酸水溶液进行淬灭反应，然后进行萃取，将所得有机相依次进行干燥剂干燥、过滤、浓缩和硅胶层析柱分离提纯，得到式II所示的结构的第一化合物。在本发明中，所述无机酸水溶液优选包括盐酸溶液或硫酸溶液，所述无机酸水溶液的浓度优选为0.8～1.2mol/L，更优选为1mol/L；所述2,4-二羟基苯甲醛的物质的量和无机酸水溶液的体积之比优选为1mmol：(2.5～3.5)mL，更优选为1mmol：3mL。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选包括乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷；所述萃取的次数优选为2～4次；所述2,4-二羟基苯甲醛的物质的量和单次萃取用萃取剂的体积之比优选为1mmol：(10～15)mL，更优选为1mmol：12.5mL。在本发明中，所述干燥剂干燥采用的干燥剂优选包括无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述过滤的目的是除去干燥剂。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述硅胶层析柱分离提纯用洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为(6～10)：1，更优选为(7～8)：1。

在本发明中，所述式III所示的结构的第二化合物优选由以下方法制备得到：将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-硝基苯甲酰氯和无水有机溶剂混合，进行取代反应，得到式III所示的结构的第二化合物。在本发明中，所述4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和4-硝基苯甲酰氯的摩尔比优选为1：(0.8～1.2)，更优选为1:1。在本发明中，所述无水有机溶剂优选包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷；所述4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯的物质的量和无水有机溶剂的体积之比优选为1mmol：(3～4)mL，更优选为1mmol：3.75mL。本发明对于所述混合的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合。在本发明中，所述取代反应的温度优选为5～40℃，更优选为20～30℃，最优选为25℃；所述取代反应的时间优选为1～3h，更优选为1.5～2.5h，最优选为2h。在本发明中，所述取代反应过程中发生的反应如式(2)所示：

所述取代反应后，本发明优选还包括将所述取代反应后的反应液进行萃取，将所得有机相依次进行干燥剂干燥、过滤、浓缩和硅胶层析柱分离提纯，得到式II所示的结构的第一化合物。在本发明中，所述萃取用萃取剂优选包括乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷；所述萃取的次数优选为2～4次；所述2,4-二羟基苯甲醛的物质的量和单次萃取用萃取剂的体积之比优选为1mmol：(10～15)mL，更优选为1mmol：12.5mL。在本发明中，所述干燥剂干燥采用的干燥剂优选包括无水硫酸钠或无水硫酸镁；所述过滤的目的是除去干燥剂。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述硅胶层析柱分离提纯用洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为(25～15)：1，更优选为19:1。

得到式II所示的结构的第一化合物和式III所示的结构的第二化合物后，本发明将式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和无水有机溶剂混合进行第一取代反应；将所述第一取代反应得到的反应液与式III所示的结构的第二化合物混合进行第二取代反应，得到式I所示结构的荧光探针。

在本发明中，所述氢化盐优选包括氢化钠和/或氢化钾。在本发明中，所述式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和式III所示的结构的第二化合物的摩尔比优选为1：1：1，更优选为1:1:1。在本发明中，所述无水有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷；所述式II所示的结构的第一化合物的物质的量和无水有机溶剂的体积之比优选为1mmol：(10～20)mL，更优选为1mmol：15mL。在本发明中，所述第一取代反应的温度优选为0℃；所述第一取代反应的时间优选为10～60min，更优选为20～40min，最优选为30min。在本发明中，所述第二取代反应的温度优选为5～40℃，更优选为20～30℃，最优选为25℃；所述第二取代反应的时间优选为12～24h，更优选为15～20h，最优选为18h。在本发明中，所述第一取代反应和第二取代反应过程中发生的反应如式(3)所示：

所述取代反应后，本发明优选还包括将所述取代反应后的反应液浓缩后硅胶层析柱分离提纯，得到荧光探针。本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。在本发明中，所述硅胶层析柱分离提纯用洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为(25～15)：1，更优选为19:1。

本发明还提供了上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述制备方法制备得到的荧光探针在过氧化氢检测或荧光成像中的应用。在本发明中，所述过氧化氢优选水体中的过氧化氢或细胞内的过氧化氢。

在本发明中，所述荧光探针应用于水体中过氧化氢的定量检测。在本发明中，所述水体中过氧化氢的定量检测方法，优选包括以下步骤：(1)将荧光探针溶液与含过氧化氢水体混合后静置，检测待测溶液的荧光强度；(2)根据步骤(1)得到的荧光强度与预定的线性曲线，得到含过氧化氢水体中过氧化氢的浓度。

本发明优选将所述荧光探针以二甲基亚砜-磷酸盐缓冲液的混合溶剂配制成荧光探针溶液，将所述荧光探针溶液与含过氧化氢水体混合后，进行荧光强度的检测，得到待测溶液的荧光淬灭率。在本发明中，所述混合溶剂中二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液(PBS)的体积比优选为(1～9)：(9～1)，更优选为7:3；所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01mol/L，pH值优选为7.4；所述荧光探针溶液的浓度优选为10～30μmol/L，更优选为20μmol/L。在本发明中，所述含过氧化氢水体的浓度优选≤960μmol/L，更优选为0.01～960μmol/L，进一步优选为4～440μmol/L。在本发明中，所述静置的温度优选为0～40℃，更优选为20～37℃，所述静置的时间优选为10～20min，更优选为15min。本发明对所述荧光强度的检测方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的荧光强度检测的操作即可。在本发明中，所述荧光强度的检测的激发波长优选为444nm，发射波长优选为510nm。

在本发明中，得到荧光强度后，本发明优选根据所述荧光强度与预定的线性曲线，得到含过氧化氢水体中过氧化氢的浓度。在本发明中，所述线性曲线为过氧化氢浓度与荧光强度的线性曲线；所述线性曲线优选为y＝1.06x+6.22，其中，x为过氧化氢浓度，y为荧光强度，相关系数R²＝0.9995；所述线性曲线优选按照如下方法获得：

提供梯度浓度的过氧化氢标准溶液；

将所述过氧化氢标准溶液与荧光探针溶液混合，得到待测标准溶液；

将所述待测标准溶液进行荧光强度检测，得到待测标准溶液的荧光强度；

根据所述待测标准溶液的荧光强度与对应的过氧化氢浓度，得到线性曲线。

在本发明中，所述线性曲线的线性范围为0.01～440μmol/L。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在氮气保护下，将4mmol 2,4-二羟基苯甲醛和4mmol 2-环己烯-1-酮溶于12mL四氢呋喃水溶液(水：四氢呋喃体积比＝1:1)中，在室温、搅拌条件下取代反应3天，加入12mL浓度为1mol/L的稀盐酸淬灭反应，用乙酸乙酯萃取所得反应液3次，每次加入的乙酸乙酯体积为50mL，合并有机相后无水硫酸钠干燥，过滤，将所得滤液减压蒸馏后胶层析柱分离提纯，得到式II所示的结构的第一化合物(产率为19％)，其中，胶层析柱分离提纯采用的洗脱剂为体积比为6:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂；

将4mmol 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和4mmol 4-硝基苯甲酰氯置于15mLN,N-二甲基甲酰胺中，在室温、搅拌条件下取代反应1h，加入30mL乙酸乙酯混合，将所得反应液依次用浓度为1mol/L的稀盐酸、饱和碳酸氢钠分别洗涤3次，合并有机相后无水硫酸钠干燥，过滤，将所得滤液减压蒸后硅胶层析柱分离提纯，得到式III所示的结构的第二化合物(产率为80％)，其中，胶层析柱分离提纯采用的洗脱剂为体积比为19:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂；

(3)将1mmol式II所示的结构的第一化合物加入到15mLN,N-二甲基甲酰胺中，在冰浴下向其中加入1mmol氢化钠，取代反应30min，然后在向反应液中加入1mmol式III所示的结构的第二化合物，在室温、搅拌条件下取代反应24h，减压蒸馏后经硅胶层析柱分离提纯，得到荧光探针(产率20％)，其中，胶层析柱分离提纯采用的洗脱剂为体积比为19:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂。

本实施例制备的荧光探针的¹H-NMR谱图如图1所示，¹H-NMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm 1.25～1.35(s,12H),1.65～1.75(m,1H),1.85～1.95(m,2H),2.35～2.45(m,3H),5.05～5.15(m 1H),5.28～5.35(s,2H),6.85～6.95(m,2H),7.38～7.41(d,1H),7.45～7.52(t,3H),7.71～7.75(d,2H)。本实施例制备的荧光探针的¹³C-NMR谱图如图2所示，¹³C-NMR(100MHz,d6-DMSO):δ(ppm)17.72,25.16,29.51,38.82,75.12,84.69,110.23,116.21,120.41,129.55,129.63,130.90,131.18,131.51,135.21,153.44,156.55,164.59。本实施例制备的荧光探针的HRMS(ESI)谱图如图3所示，ESI-(M):476.1897,calcd for(M):476.2006。由图1～3可知，本发明制备得到具有式I所示结构的荧光探针。

测试例1

将实施例1制备的荧光探针置于过氧化氢水溶液中，配制成荧光探针-过氧化氢水溶液，其中，荧光探针的浓度为20μmol/L，过氧化氢的浓度为100mmol/L。

将实施例1制备的荧光探针置于水中，配制成荧光探针水溶液，其中，荧光探针的浓度为20μmol/L。

测试荧光探针-过氧化氢水溶液和荧光探针水溶液的荧光光谱，荧光探针在水溶液体系中对过氧化氢响应荧光光谱变化结果如图4所示。由图4可知，本发明制备的荧光探针能够在水溶液体系中检测过氧化氢。

测试例2

荧光探针对过氧化氢荧光检测的选择性测试

以体积比为7:3的二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液(PBS，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4)作为混合溶剂；将实施例1制备的荧光探针溶解于DMSO-PBS混合溶剂中，配制成荧光探针浓度为20μmol/L的荧光探针溶液；

取8个样品瓶，每个样品瓶中分别加入5mL浓度为20μmol/L荧光探针溶液，分别加入22μL浓度均为0.01mol/L的NO₂、NO₃、TBHP(叔丁基过氧化氢)、ClO-、O₂ ^-、ONOO-和H₂O₂的水溶液，以荧光探针溶液作为空白样品，在37℃条件下静置15min后，将8个样品分别转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱，其中，激发波长为444nm，发射波长为510nm，荧光探针在水溶液体系中对不同离子在510nm处的荧光强度测试结果如图5所示，其中，1为空白样品，2为NO₂，3为NO₃，4为TBHP，5为ClO-，6为O₂ ^-，7为ONOO^-，8为H₂O₂。由图5可知，本发明制备的荧光探针在510nm处仅对H₂O₂有明显的荧光增强现象(约30倍增强)。表明，本发明制备的荧光探针对过氧化氢表现出高度的荧光选择性。

测试例3

荧光探针对过氧化氢的定量荧光检测

以体积比为7:3的二甲基亚砜(DMSO)和磷酸盐缓冲液(PBS，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4)作为混合溶剂；将实施例1制备的荧光探针溶解于DMSO-PBS混合溶剂中，配制成荧光探针浓度为20μmol/L的荧光探针溶液。

配制浓度为0.01mol/L的H₂O₂水溶液。

取12个样品瓶，在每个样品瓶中分别加入5mL浓度为20μmol/L的荧光探针溶液，然后分别加入0～22μL浓度为0.01mol/L的H₂O₂水溶液，配制成过氧化氢浓度依次为80μmol/L、160μmol/L、240μmol/L、320μmol/L、400μmol/L、480μmol/L、560μmol/L、640μmol/L、720μmol/L、800μmol/L、880μmol/L、960μmol/L的一系列H₂O₂混合溶液，在37℃条件下静置15min后，将一系列H₂O₂混合溶液分别转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱，其中，激发波长为444nm，发射波长为510nm，荧光探针在水溶液体系中对不同浓度过氧化氢荧光光谱的测试结果如图6所示，其中，荧光强度由低到高对应的过氧化氢的浓度依次增大；将荧光光谱在510nm处的荧光强度与对应的过氧化氢浓度进行拟合，在过氧化氢浓度为0μmol/L～25μmol/L范围内得到拟合曲线，结果如图7所示。由图6～7可知，本发明制备的荧光探针在水溶液体系中，过氧化氢水浓度为0～25μmol/L范围内，荧光探针的强度与过氧化氢浓度呈线性相关，线性回归方程为y＝1.06x+6.22，其中，x为过氧化氢浓度，y为荧光强度，相关系数R²＝0.9995，检测极限为24μmol/L，说明，本发明制备的荧光探针在水溶液体系中可以定量检测过氧化氢浓度。

测试例4

荧光探针的细胞毒性测试

细胞包括：肺癌细胞(A549)、肝癌细胞(SMMC-7721)、宫颈癌细胞(HeLa)、结肠癌细胞(SW480)、乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)和正常上皮肺细胞(BEAS-2B)。

以浓度为10wt％胎牛血清的培养液(DMEM)配制细胞悬液，按每孔3000～5000个细胞接种到96孔板中，使得每孔溶液体积为100μL，细胞提前12～24小时接种培养。将实施例1制备的荧光探针用DMSO溶解，然后向每孔中加入体积100μL的荧光探针母液，使得荧光探针的最终浓度为40μmol/L，每种细胞培养均设3个平行孔。将得到的96孔板在37℃条件下培养2天，待所测细胞贴壁后，弃去孔内剩余的培养液，然后分别向每孔中加20μL的MTS(甲臜)溶液和100μL的浓度为10wt％胎牛血清的培养液，每组设置3个平行孔。在多功能酶标仪(MULTISKAN FC)测试波长为492nm处各孔的光吸收值，以荧光探针的溶液为横坐标，细胞活力为纵坐标绘制细胞的细胞活力图，荧光探针对不同细胞的活力图(即细胞毒性试验图)如图8所示，由图8可知，本发明制备的荧光探针对A549、SMMC-7721、HeLa、MCF-7和MDA-MB-231癌症细胞表现出一定的抑制效果，对正常细胞BEAS-2B的细胞活力没有明显影响。说明本发明制备的荧光探针能够一定程度上抑制癌症细胞的生长，能够应用于正常生物体内成像实验中。

测试例5

荧光探针在细胞内对内源性过氧化氢的荧光识别测试

取A、B和C三个有HeLa细胞的培养皿，将培养皿中的HeLa细胞用PBS缓冲液清洗三次，以除去培养液，其中，PBS缓冲液中Na₂HPO₄·12H₂O的浓度为2.90g/L，NaH₂PO₄·2H₂O的浓度为0.3g/L。再向这三培养皿的HeLa细胞中分别加入1mLPBS缓冲液，B培养皿中加入浓度为40mol/L的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)，C培养皿中加入浓度为4mol/L的鱼藤酮(Rotenone)，然后将3个培养皿置于无菌培养箱中，在37℃条件下孵育0.5h，HeLa细胞用PBS缓冲液洗涤3次，向培养皿中分别加入浓度为2mmol/L的荧光探针10μL后继续孵育1h；HeLa细胞再次用PBS溶液洗涤3次后，加入10μL浓度为2mmol/L的细胞核染色剂PI后继续孵育0.5h，然后放置在Olympus FV-10i激光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验，结果如图9所示，其中，(c)、(g)和(k)为Pi通道，(b)为只加入荧光探针的荧光图，(f)为加入PMA和荧光探针的荧光图，(j)为加入鱼藤酮和荧光探针的荧光图，比例尺为20μm。由图9可知，本发明制备的荧光探针自身在细胞质内基本无荧光发射，当用上述刺激物孵育后，细胞内发射出绿色荧光(图9中(b)、(f)和(j))。表明，本发明制备的荧光探针可以在细胞内对内源性的过氧化氢进行荧光识别。

测试例6

荧光探针在线虫体内对外源性过氧化氢的荧光识别

取含有处于L4阶段的野生型线虫的培养皿，用M9盐溶液(pH＝7.4)清洗后分装到3个1.5mL的离心管中，向每个离心管中分别加入0、10μL、10μL浓度为2mol/L的荧光探针水溶液，在20℃条件下恒温孵育2h后，离心后清洗3次，向每个离心管加入浓度分别为0、0、1920μmol/L的过氧化氢溶液，再恒温孵育2h后，M9盐溶液清洗后置于Olympus BX51荧光显微镜下成像，荧光探针在线虫体内的荧光成像结果如图10所示，其中，(a)、(c)和(e)为明场，(b)为未加任何物质线虫的荧光团，(d)为只加入荧光探针的荧光图，(f)为加入H₂O₂和荧光探针的荧光图，比例尺为200μm。由图10可知，荧光探针自身在线虫体内荧光发射较弱，当用过氧化氢溶液孵育后，线虫体内发射出明显的绿色荧光(图10中(b)、(d)和(f))。表明，本发明制备的荧光探针可以对线虫外源性的过氧化氢进行荧光识别。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，具有式I所示的结构：

2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和无水有机溶剂混合进行第一取代反应；将所述第一取代反应得到的反应液与式III所示的结构的第二化合物混合进行第二取代反应，得到式I所示结构的荧光探针；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式II所示的结构的第一化合物由以下方法制备得到：在保护气氛下，将2,4-二羟基苯甲醛、2-环己烯-1-酮和溶剂混合，进行加成反应，得到式II所示的结构的第一化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述2,4-二羟基苯甲醛和2-环己烯-1-酮的摩尔比为1:1；

所述溶剂为水和有机溶剂的混合溶剂；所述有机溶剂包括四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；所述水和有机溶剂的体积比为(1～2):1；

所述加成反应的温度为5～40℃，时间为24～72h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式III所示的结构的第二化合物由以下方法制备得到：将4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯、4-硝基苯甲酰氯和无水有机溶剂混合，进行取代反应，得到式III所示的结构的第二化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯和4-硝基苯甲酰氯的摩尔比为(1～1.5):1；

所述无水有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷；

所述取代反应的温度为5～40℃，时间为1～3h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述式II所示的结构的第一化合物、氢化盐和式III所示的结构的第二化合物的摩尔比为1:1:1；

所述无水有机溶剂包括无水N,N-二甲基甲酰胺、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷或无水三氯甲烷。

8.根据权利要求2或7所述的制备方法，其特征在于，所述第一取代反应的温度为0℃，时间为10～60min；

所述第二取代反应的温度为5～40℃，时间为12～24h。

9.权利要求1所述的荧光探针或权利要求2～8任一项所述制备方法制备得到的荧光探针在非疾病的诊断或治疗中过氧化氢检测或荧光成像中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述过氧化氢为水体中的过氧化氢或细胞内的过氧化氢。

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