CN109553643A - 单糖类似物及包含其的分子探针和该分子探针的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了单糖类似物及包含其的分子探针和该分子探针的应用。本发明所提供的单糖类似物能够通过细胞内糖代谢而被植入细胞膜糖蛋白中，并实现对于细胞的原位标记，而且无需金属催化剂即能够与指示剂分子染料通过点击反应进行键和，实现对于细胞的标记和追踪显示。同时，本发明中新型单糖类似物(BCN‑单糖)及Tz修饰的新型近红外染料的合成方法简便，结构稳定，为实现细胞原位标记功能提供一种新方法，也为进一步细胞进入体内进行活体示踪的应用提供一定的研究基础和应用前景。

Description

单糖类似物及包含其的分子探针和该分子探针的应用
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，具体而言，涉及单糖类似物及包含其的分子探针和该分子探针的应用。
背景技术
为实现纳米探针对肿瘤的特异性，需要在其表面定向连接生物靶向分子(如核酸、蛋白和具有特定生物功能的小分子等)。由于生物活性分子结构的复杂性，纳米颗粒表面生物分子的定向固定难以实现，因而往往会影响所构建的生物探针的活性和特异性。
生物正交反应(Bioorthogonal reaction)是指一类可以在活体细胞中进行的化学反应。这类反应可以在生物体内的生理条件下发生，不会与体内同时发生的其他生化反应互相干扰，也不会对生物体和目标生物分子产生损伤。要完成对活体内肿瘤细胞的标记，首先需要将可参与特异反应的前导性功能基团引入肿瘤细胞表面，然后与带有互补反应基团的标记物进行生物正交反应，最后利用不同标记物特征(荧光或免疫印迹)去检测肿瘤的发生及发展机制。能够发生生物正交反应的这两个反应基团相互之间具有高度的反应活性，同时在生理环境下对周围其它的反应基团是惰性的，迄今为止只有少数的几个反应可以满足这些条件并被应用在生物医学研究中，其中包括由Bertozzi等人发展的StaudingerLigation，由Sharpless等人开发的一价铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反应(Azide-Alkyne Cycloaddition，AAC)，以及由Bertozzi等人进一步发展的不用铜催化叠氮与炔基的环加成反应(Cu-free Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition，SPAAC)以及反应速率相对于前者提高了103倍的四嗪及八元环辛炔之间的环加成化学反应。这些反应也是我们通常所说的“点击”化学反应。将“点击”化学反应引入到肿瘤的标记及示踪将会大大提高靶标分子对肿瘤的特异性结合力和亲合力，同时增加所构建的生物探针的活性和特异性。
点击化学，也译作链接化学、速配接合组合式化学、动态组合化学，是由2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首次提出。主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。目前点击化学的发展极为迅速，涉及到了各个领域，特别是在功能聚合物、表面修饰、生物大分子、DNAs，生物与化学传感器等方面取得了瞩目的成就。
点击化学反应主要有4种类型:环加成反应，亲核开环反应，非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。其中最具代表的是铜催化的叠氮-炔基Husigen[3+3]环加成反应。但是该反应大部分需要铜催化，在生物体内的应用有所限制，2008年，Bertozzi等使用有机叠氮化合物与环炔为底物，无催化剂和室温条件下进行环加成反应，但是二者结合所需时间较长，因而易在体内被清除而影响其结合的效率。同年，Fox等人报道了以四嗪和烯烃为反应物的[4+2]Diels-Alder环加成反应，该反应没有金属催化的快速生物耦合反应，且产物只生成N2，避免了铜催化对细胞素的影响。同时该反应可以通过选择不同的结构的烯烃使反应时间在几秒内完成，是一种快速、高产、适用范围广并且具有生物功能的反应。
目前无铜催化的click反应已经广泛的应用于生物体内及体外的各项研究中。生物体内的代谢过程是维持其生命的一系列有序的化学反应，对代谢过程的研究影响着生物体的生长、繁殖以及结构的保持和对外界环境做出的响应。当生物体从外界获取特殊标记的小分子后，这些物质就会进入生物体内在相应的代谢途径中生成相应的复杂化合物，人们通过对标记物的监测来达到对代谢体的追踪。
单糖代谢标记法即为各种不同类别的单糖通过细胞膜的协助扩散方式被摄取到细胞内，并被用于蛋白质在内质网或高尔基体的糖基化修饰。2001年Bertozzi等人提出了将叠氮标记的非天然单糖前体在细胞中进行代谢，通过细胞的正常代谢，非天然单糖能够代替正常单糖结合到相应的蛋白质结合位点，形成具有特殊标记的糖蛋白。经过标记的细胞在催化剂的作用下与带炔基基团的荧光分子发生偶联，从而达到鉴定糖蛋白，追踪细胞的作用。后又用DBCO代替炔基实现无铜催化的click反应并最终用于活体成像中。
由于糖类化合物在生物体和药物中扮演着重要角色，它的修饰和改性工作一直备受关注。但由于糖类化合物结构复杂，使其改性时常伴随副反应发生且产物收率低。而点击化学具有有的反应条件温和、产物收率高以及选择性好等特性，通过代谢将click标记的前体物质标记在细胞上，再通过化学衍生的方法在细胞内或细胞膜对一些大分子进行显微可视化分析，可避免传统改性方法存在的问题。
对此也有研究人员进行探索：Basu等用糖基叠氮化物与苯乙炔在Cu催化下制得了1-糖基-4-苯基三唑及相应的糖基化合物库，用于糖基酶的活性测试。北大陈兴课题组利用叠氮化修饰的单糖研究了单糖在脑部以及心血管系统及免疫系统的影响，并实现了其在活细胞及活体动物的糖代谢标记。
由于铜的细胞毒性，铜催化的反应很难直接应用于活体细胞。Bertozzi等利用新型非铜催化的click基团修饰唾液酸，并将此技术应用于斑马鱼的胚胎发育研究，克服了传统技术障碍。但是由于唾液酸极性太大，不利于其进入细胞因而限制了其广泛应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种单糖类似物，本发明单糖类似物能够通过细胞内糖代谢而被植入细胞膜糖蛋白中，并实现对于细胞的原位标记，而且无需金属催化剂即能够与指示剂分子通过点击反应进行键和，实现对于细胞的标记和追踪显示。
本发明的第二目的在于提供一种分子探针，所述分子探针包括作为细胞标记物的本发明单糖类似物以及作为追踪指示试剂的染料分子。
本发明的第三目的在于提供一种所述分子探针的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种单糖类似物，所述单糖类似物结构如下：
其中，式(I)中，R1为单糖基或单糖衍生物基。
优选的，本发明所述的单糖类似物中，所述单糖基为甘露糖基、葡萄糖基，半乳糖基，唾液酸、鼠李糖，岩藻糖等单糖结构；
所述单糖衍生物基为氨基甘露糖基、氨基葡萄糖基，氨基半乳糖基，氨基鼠李糖，氨基岩藻糖等单糖结构。
优选的，本发明所述的单糖类似物中，所述单糖类似物的通式结构如下：
更优选的，所述单糖类似物的结构如下：
或者，所述单糖类似物的结构如下：
或者，所述单糖类似物的结构如下：
其中，如上式(II)、(III)，以及式(IV)中，R2-R5、R6-R9、R10-R13分别独立的为氢或乙酰基。
同时，本发明还提供了所述的单糖类似物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇活化后，与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应，即得产物；
或者，(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇活化后，与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应，所得产物酰化后，得到产物。
优选的，本发明所述制备方法包括如下步骤：将(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇与对硝基苯基氯甲酸酯反应，即得到(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇的活化产物；
然后将所得(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇的活化产物与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应。
进一步的，本发明还提供了一种分子探针，所述分子探针包括本发明所述的单糖类似物。
优选的，本发明所述的分子探针还包括如下式(V)所示的染料分子：
其中，式(V)中，R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；
X1为酰胺基或者酯基；
R15为染料分子基。
优选的，本发明所述的分子探针中，式(V)中，R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；
X1为酰胺基；
R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种。
同时，本发明也提供了式(V)染料分子的制备方法，其包括如下步骤：
将(i)与R15-X3(ii)反应缩合，即得到式(V)染料分子；
其中式(i)中R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；
X2为氨基、羧基，或者羟基；
式(ii)中，R15为染料分子基，X3为氨基、羧基，或者羟基；
优选的，式(i)中R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；
X2为氨基或者羧基；
R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种；
X3为氨基或者羧基。
同样的，本发明还提供了所述的分子探针在制备细胞标记和活体追踪和显示试剂中的应用；
和/或，分子探针在制备细菌标记和活体追踪和显示试剂中的应用；
和/或，分子探针在制备病毒标记和活体追踪和显示试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用新一代非铜催化的双烯体BCN修饰单糖来标记细胞，而用亲双烯体Tz基团修饰的近红外染料做指示剂检验细胞膜表面的BCN，二者可直接在生物体环境内通过点击反应进行键和，从而避免了金属催化对细胞及活体的毒性影响，并且反应速率高，专一性强，在反应过程中仅产生N2的副产物，因而在活细胞的示踪方法中有更高的灵敏度和分辨率。
同时，本发明中新型单糖类似物(BCN-单糖)及Tz修饰的新型近红外染料的合成方法简便，结构稳定，为实现细胞原位标记功能提供一种新方法，也为进一步细胞进入体内进行活体示踪的应用提供一定的研究基础和应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1、2、3反应流程示意图；
图2为本发明实施例4、5反应流程示意图；
图3为本发明实验例中，实例一检测结果图；
图4为本发明实验例中，实例二检测结果图；
图5为本发明实验例中，实例三检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于现有的基于点击反应的探针化合物需要金属催化剂的作用才能够实现键和反应，而金属催化剂在生物体内会产生严重的毒害作用，本发明特提供了一种新型的双组分探针，该双组分探针中，细胞标记化合物与细胞追踪指示化合物无需金属催化即能够通过点击反应键和，从而起到细胞的定位和追踪显示的功能。
具体的，本发明所提供的双组分探针中，作为细胞标记化合物的为单糖类似物，而该单糖类似物为以双烯体(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇(BCN)进行结构修饰的单糖胺化合物；
具体的，所述单糖类似物结构如下：
式(I)中，R1为单糖基或单糖衍生物基；
优选的，如上所述的单糖基所述单糖基为甘露糖基、葡萄糖基，半乳糖基，唾液酸、鼠李糖，岩藻糖等单糖结构；
所述单糖衍生物基为氨基甘露糖基、氨基葡萄糖基，氨基半乳糖基，氨基鼠李糖，氨基岩藻糖等单糖结构。
更优选的，所述单糖类似物的通式结构如下：
如上结构的化合物中，单糖环(含氧六元环)上至少含有一个-OAc取代基或-(C1-C4)亚烷基-OAc取代基(直接与环上碳原子相连接)，且每个碳原子至多与一个上述取代基相连接；其余碳原子(除与氨基相连碳原子外)连有羟基。
具体的，在本发明最为优选的实施方式中，单糖类似物的结构如下通式(II)-(IV)中的一个或多个：
其中，如上式(II)、(III)，以及式(IV)中，R2-R5、R6-R9、R10-R13分别独立的为氢或乙酰基；
而由于乙酰化单糖类似物细胞相容性更佳，因而，如上通式(II)中，R2-R5中至少有一个R基为乙酰基；更优选的，R2-R5均为乙酰基；
通式(III)中，R6-R9中至少有一个R基为乙酰基；更优选的，R6-R9均为乙酰基；
通式(IV)中，R10-R13中至少有一个R基为乙酰基；更优选的，R10-R13均为乙酰基。
而如上单糖类似物的制备方法步骤可参考如下：
首先，是将(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇活化，其活化方法优选包括如下步骤：
将(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇(BCN)与对硝基苯基氯甲酸酯(PNC)反应，即得到(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇的活化产物BCN-PNC；
然后将所得BCN-PNC与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应，即得到非乙酰化的单糖类似物；
进一步的，为了得到乙酰化单糖类似物，则需要将如上所制备的非乙酰化单糖类似物进一步进行酰化反应，所用酰化试剂优选的为乙酸酐或者乙酰氯，更优选的，所用酰化试剂为乙酸酐。
本发明分子探针的另一组分，也是作为追踪和指示剂的组分则为染料分子，其结构如下：
其中，式(V)中，R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；优选的，R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；更优选的，R14为C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基，例如，R14可以为亚苯基亚甲基、亚苯基亚乙基、亚苯基亚丙基、亚苯基亚异丙基、亚苯基亚丁基、亚甲基亚苯基、亚乙基亚苯基、亚丙基亚苯基、亚异丙基亚苯基，或者亚丁基亚苯基等；
X1为酰胺基(或)或者酯基(或)；优选的，X1为酰胺基；
R15为染料分子基，优选的，R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种。
更优选的，所述染料分子的结构如下：
其中，X1为酰胺基(或)，R15为染料分子基，优选的，R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种。
更进一步优选的，所述染料分子的结构如下：
其中，R15为染料分子基，优选的，R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种。
例如，式(VII)化合物可以为
即R15为IR783衍生物分子基，记为Tz-IR783。
如上染料分子的合成则可以采用如下方法进行：
将(i)与R15-X3(ii)反应缩合，即得到式(V)染料分子；
其中式(i)中R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；优选的，R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；更优选的，R14为C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基，例如，R14可以为亚苯基亚甲基、亚苯基亚乙基、亚苯基亚丙基、亚苯基亚异丙基、亚苯基亚丁基、亚甲基亚苯基、亚乙基亚苯基、亚丙基亚苯基、亚异丙基亚苯基，或者亚丁基亚苯基等；
X2为氨基、羧基，或者羟基；优选的，X2为氨基或者羧基；更优选的，X2为氨基；
式(ii)中，R15为染料分子基，优选的，R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种；
X3为与X2对应的氨基、羧基，或者羟基；优选的，X3为与X2对应的氨基或者羧基；更优选的，X3为氨基；
优选的，如上的缩合反应是在促进剂存在下进行的，具体的：
其中，当X2、X3为对应的氨基和羧基时可以以EDC和/或NHS为活化剂，从而促进酰胺键的形成，并使得反应条件更加温和；优选的，是以EDC和NHS共同作为活化剂；
而当X2、X3为对应的羧基或羟基时，则可以以EDC和/或DMAP为活化剂，从而促进酯键的形成，并使得反应条件更加温和。
优选的，如上反应中，式(ii)化合物的结构如下：
(iii)，其中式(iii)中，X2为氨基、羧基，或者羟基；优选的，X2为氨基或者羧基；更优选的，X2为氨基；
而式(ii)化合物优选的为R15-COOH (iv)；
其中，R15为染料分子基，优选的，R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种；
例如，R15可以为(v)，即IR783-COOH。
而由如上方法所得到的双组分分子探针还可以进一步用于细胞定位，其中，被BCN修饰的单糖类似物能够通过细胞代谢作用而整合于细胞膜的糖蛋白上，实现对于细胞的标记，而以Tz修饰的染料分子则能够通过Tz与BCN的点击键和反应，靶向定位于细胞之上，而且点击键和反应的效率高，专一性强，在生物体环境中就能够自主进行，无需加入催化剂，且在反应过程中仅产生N2作为副产物，因而具有较好的生物安全性；
同时，靶向固定于细胞的染料分子可以通过红外等光谱检测方法以实现其定位，从而进一步也能够实现对于其所靶向固定细胞的定位和追踪，进而提供一种具有更高灵敏度和更好的分辨率的一种新型活细胞示踪方法。
同样的，由于部分细菌和病毒中同样也存在糖蛋白，因而，也可以进一步将本发明探针用于相应细菌和病毒的定位和追踪。
进一步的，本发明双组分探针还能够用于不同细胞系的代谢标记中，例如，可以用于癌症细胞系Raji、A549、4T1、HepG2、RD、MCF-7、Hela细胞系等；以及正常细胞系293T、NIH3T3细胞系等；和免疫细胞系Jucat、T细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞等。
实施例1
(1)BCN的活化
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol的BCN，并加入10mmol的吡啶，搅拌数分钟后加入对5mmol的对硝基苯基氯甲酸酯(pNC)，常温下反应30min；
结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC，产率为70％。
(2)BCN-Man的合成：
将4.4mmol的甘露糖胺盐酸盐溶解于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入10mmol的BCN-pNC和10mmol的吡啶，常温下反应半个小时；
反应结束后，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Man，产率为72％；
(3)四乙酰化的BCN-甘露糖类似物(Ac4BCN-Man)的合成
将5mmol BCN-Man溶解于20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入10mmol的乙酸酐及10mmol吡啶，充分搅拌后，常温反应过夜；
反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体Ac4BCN-Man，产率为65％。
实施例1反应流程参考图1。
实施例2
1)BCN的活化：
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol BCN，并加入15mmol吡啶，搅拌数分钟后加入对6mmol对硝基苯基氯甲酸酯(pNC)，常温下反应30min；
结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC，产率为74％。
2)BCN-葡萄糖(BCN-Glc)的合成：
将4.4mmol甘露糖胺盐酸盐溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入20mmolBCN-pNC和15mmol的吡啶，常温反应半小时；
反应结束后，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Man，产率为78％。
3)四乙酰化的BCN单糖类似物(Ac4BCN-Glc)的合成
将5mmol BCN-Man溶解于20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入15mmol乙酸酐及15mmol吡啶，充分搅拌后，常温反应过夜。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体Ac4BCN-Glc，产率为70％。
实施例2反应流程参考图1。
实施例3
1)BCN的活化：
在100mL无水二氯甲烷中溶解5mmol BCN，并加入15mmol吡啶，搅拌数分钟后加入对6mmol对硝基苯基氯甲酸酯(pNC)，常温下反应30min；
结束后加入饱和氯化铵溶液，萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-pNC，产率为74％。
2)BCN-半乳糖(BCN-Gal)的合成：
将4.4mmol半乳糖胺盐酸盐溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入20mmolBCN-pNC和15mmol的吡啶，常温反应半小时；
反应结束后，蒸干，硅胶柱层析分离纯化，得到白色固体BCN-Man，产率为78％。
3)四乙酰化的BCN-半乳糖糖类似物(Ac4BCN-Gal)的合成
将5mmol BCN-Man溶解于20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入15mmol乙酸酐及15mmol吡啶，充分搅拌后，常温反应过夜。反应液浓缩，硅胶柱层析分离纯化的到白色固体Ac4BCN-Gal，产率为70％。
实施例3反应流程参考图1。
实施例4
将5mmol的IR-783-COOH溶解于5mL DMF中，加入10mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，10mmol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)和5mmol四嗪(Tz)；
常温搅拌过夜，反应结束后浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到粉末Tz-IR783，产率为75％。
实施例4反应流程参考图2。
实施例5
将5mmol IR-783-COOH溶解于30ml DMF中，加入20mmol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和7mmol四嗪(Tz)，常温搅拌过夜；
反应结束后浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到粉末Tz-IR783，产率为80％。
实施例5反应流程参考图2。
实验例1
细胞代谢通用方法：
将适量的Raji、4T1或HEK29T细胞等种在24孔板中，培育过夜后，将不同浓度10-150uM的通式(I)化合物加入到培养基中与细胞培养48-72小时。待通式(I)化合物在Raji细胞中代谢植入细胞膜表面的糖蛋白中后，去除培养基，加入0.05～1ug/mL的本发明通式(V)的化合物共孵育10～60分钟，然后用激光共聚焦或流式细胞仪分析通式(I)化合物在细胞中的代谢标记情况，其代谢标记的阳性细胞数可达到30～100％。
实例一：
将适量的Raji细胞等种在24孔板中，培育过夜后，将20uM的Ac4ManNBCN(实施例1产物)加入到培养基中与细胞培养48小时。待Ac4ManNBCN在Raji细胞中代谢植入细胞膜表面的糖蛋白中后，去除培养基，加入0.25ug/mL实施例4产物化合物共孵育30分钟，然后用激光共聚焦或流式细胞仪分析Ac4ManNBCN在细胞中的代谢标记情况，其代谢标记的阳性细胞数可达到30～100％，检测结果如图3所示。
实例二：
将适量的4T1细胞等种在24孔板中，培育过夜后，将50uM的Ac4ManNBCN(实施例1产物)加入到培养基中与细胞培养48小时。待Ac4ManNBCN在Raji细胞中代谢植入细胞膜表面的糖蛋白中后，去除培养基，加入0.25ug/mL的实施例4产物化合物共孵育30分钟，然后用激光共聚焦或流式细胞仪分析Ac4ManNBCN在细胞中的代谢标记情况，其代谢标记的阳性细胞数可达到30～100％，检测结果如图4所示。
实例三：
将适量的HEK29T细胞等种在24孔板中，培育过夜后，将75uM的Ac4ManNBCN(实施例1产物)加入到培养基中与细胞培养48小时。待Ac4ManNBCN在Raji细胞中代谢植入细胞膜表面的糖蛋白中后，去除培养基，加入0.25ug/mL的实施例4的产物化合物共孵育30分钟，然后用激光共聚焦或流式细胞仪分析Ac4ManNBCN在细胞中的代谢标记情况，其代谢标记的阳性细胞数可达到30～100％，检测结果如图5所示。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种单糖类似物，其特征在于，所述单糖类似物结构如下：
其中，式(I)中，R1为单糖基或单糖衍生物基。
2.根据权利要求1所述的单糖类似物，其特征在于，所述单糖基为甘露糖基、葡萄糖基，半乳糖基，唾液酸、鼠李糖，岩藻糖等单糖结构；
所述单糖衍生物基为氨基甘露糖基、氨基葡萄糖基，氨基半乳糖基，氨基鼠李糖，氨基岩藻糖等单糖结构。
3.根据权利要求2所述的单糖类似物，其特征在于，所述单糖类似物的通式结构如下：
优选的，所述单糖类似物的结构如下：
或者，所述单糖类似物的结构如下：
或者，所述单糖类似物的结构如下：
其中，如上式(II)、(III)，以及式(IV)中，R2-R5、R6-R9、R10-R13分别独立的为氢或乙酰基。
4.权利要求1-3中任一项所述的单糖类似物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇活化后，与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应，即得产物；
或者，(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇活化后，与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应，所得产物酰化后，得到产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇与对硝基苯基氯甲酸酯反应，即得到(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇的活化产物；
然后将所得(1R,8S,9r)-双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基甲醇的活化产物与单糖胺或单糖胺盐酸盐反应。
6.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针包括权利要求1-3中任一项所述的单糖类似物。
7.根据权利要求6所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针还包括如下式(V)所示的染料分子：
其中，式(V)中，R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；
X1为酰胺基或者酯基；
R15为染料分子基。
8.根据权利要求7所述的分子探针，其特征在于，式(V)中，R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；
X1为酰胺基；
R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种。
9.根据权利要求7或8所述的分子探针，其特征在于，式(V)染料分子的制备包括如下步骤：
将与R15-X3(ii)反应缩合，即得到式(V)染料分子；
其中式(i)中R14为化学键，C1-C30的亚烷基，C3-C30的亚环烷基，C5-C30的亚芳基，C5-C30的亚芳基亚烷基，或者C5-C30的亚烷基亚芳基；
X2为氨基、羧基，或者羟基；
式(ii)中，R15为染料分子基，X3为氨基、羧基，或者羟基；
优选的，式(i)中R14为C1-C20的亚烷基，C5-C20的亚芳基，C5-C20的亚芳基亚烷基，或者C5-C20的亚烷基亚芳基；
X2为氨基或者羧基；
R15为IR-755及其衍生物基、IR-780及其衍生物基、IR-783及其衍生物基、IR-797及其衍生物基、IR-806及其衍生物基、IR-808及其衍生物基，或者IR-820及其衍生物基中的一种；
X3为氨基或者羧基。
10.权利要求6-8中任一项所述的分子探针在制备细胞标记和活体追踪和显示试剂中的应用；
和/或，权利要求6-8中任一项所述的分子探针在制备细菌标记和活体追踪和显示试剂中的应用；
和/或，权利要求6-8中任一项所述的分子探针在制备病毒标记和活体追踪和显示试剂中的应用；
和/或，权利要求6-8中任一项所述的分子探针在制备细胞系代谢标记试剂中的应用；
其中，所述细胞系包括：癌症细胞系，正常细胞系，以及免疫细胞系中的至少一种。
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