CN104950106B - 利用循环放大体系构建一种灵敏检测的通用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及整合超支化触发式自降解聚合物与酶促反应构筑的循环放大体系，在该体系中超支化自降解聚合物的释放物质能够在酶的催化下转化为超支化自降解聚合物的触发物质。利用该循环放大体系与额外的超支化触发式自降解聚合物以及酶促反应可以将检测物质扩展为灵敏检测正离子、负离子、多种酶以及其它生命活性物质。此外，本发明还涉及到整合超支化自降解聚合物与酶联免疫吸附检测中的酶联抗体构筑的循环放大检测体系，从而使该体系能够在临床检测中有现实意义。另一方面，本发明还涉及利用超支化触发式自降解聚合物与金纳米粒子之间的静电相互作用，以及酶促反应构筑的比色信号的循环放大检测体系。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料及其应用，更具体地，涉及一种由超支化触发式自降解聚合物与酶有机结合而构成的循环放大体系；并且将这种循环放大体系与酶联免疫吸附检测结合，达到更佳的检测效果。
背景技术
疾病的诊断和治疗通常都需要利用病变组织/部位相对于正常组织的微环境差异，如酸碱环境或氧化-还原环境变化、糖浓度升高或降低、(辅)酶或蛋白质缺失/过量表达等。然而，这些病变特征微环境信号的强度相对于正常组织而言差别比较微弱。因此，为了使诊断或治疗试剂能够对这些病变部位的信号产生响应，必须赋予其放大能力。在自然界中，生物体系通过一系列的信号转导和放大过程来完成对外界信号或刺激的探测、感知与响应；这些弱的原始刺激信号的化学放大是通过一系列相互耦合的精密多分子过程实现的。视觉的产生就是一个很好的例子，视网膜感光时，视紫质中的视黄基发生光致异构导致蛋白质的构型改变，从而触发一系列酶级联反应，激发神经响应；此过程同时伴随着细胞膜Ca2+离子通道打开，大量的Ca2+进入细胞激发神经从而产生视觉。对这些生物过程的模仿催生了很多设计精巧的多分子放大体系，如聚合酶链式反应(PCR)，酶联免疫吸附检测(ELISA)，以及基于其他策略的新体系。这些多分子放大体系的构建极大地推动了高灵敏度临床检测诊断的发展。
为了在单分子层次实现信号的化学放大，化学家们发展了触发式自降解聚合物(Self-Immolative Polymer,SIP)体系，这类聚合物能够在触发解离特定位点的保护基元后自发进行类似多米诺骨牌的串联解聚，同时释放小分子构筑基元。触发式自降解树枝状分子，线性触发式自降解聚合物，以及超支化触发式自降解聚合物是三类主要的触发式自降解聚合物。其中，超支化触发式自降解聚合物兼具触发式自降解聚合物信号放大的特性以 及超支化聚合物合成简单、容易后修饰和官能化两方面的双重优势。
除了超支化触发式自降解聚合物的内在化学放大，信号放大还可以通过结合特异性的酶联反应来进一步的放大信号，而这个酶联反应的作用是利用将触发式自降解聚合物释放的片段转化为能够刺激聚合物解聚的物质，从而达到放大的效果。由于超支化触发式自降解聚合物相比其它的触发式自降解聚合物具有更大的放大效果，因此由其组成的循环放大体系具有更佳的放大效果。综上所述，结合超支化触发式自降解聚合物与酶促反应构筑循环放大用于灵敏检测将非常有实用意义。
发明内容
本发明的目的是为了构建一种能够检测低浓度物质的循环放大试剂盒，并且使其能够检测较多的物质，特别使其具有临床上的检测意义。
具体的，本发明提供一种能够放大信号的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒包括共价连接有荧光分子与酶底物的水溶性的超支化触发式自降解聚合物，和能够将所述酶底物转变为过氧化氢的酶，其中所述超支化触发式自降解聚合物能够在过氧化氢的刺激下释放多个荧光分子与多个酶底物。
在一个优选的实施方案中，所述共价连接有荧光分子与酶底物的超支化触发式自降解聚合物的结构如下：
其中表示酶底物，F表示荧光分子。
在一个优选的实施方案中，
或 或
在一个优选的实施方案中，所述酶的种类与所述酶底物S相对应；其中，S1对应于胆碱氧化酶，S2对应于肌氨酸氧化酶，S3对应于葡萄糖氧化酶，S4对应醇氧化酶。
在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包括额外的超支化触发式自降解聚合物2，所述聚合物2共价连接有待分析物响应基元和酶底物，并且能够在待检测物的刺激下脱去响应基元，并释放酶底物。
在优选的实施方案中，所述共价连接有待分析物响应基元的超支化触发式自降解聚合物2的分子结构如下所示：
其中，AG为待分析物响应基元，为酶底物。
在一个优选的实施方案中，
或
在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包含额外的酶2，该酶2能够催化前底物分解成酶底物。
在一个优选的实施方案中，对于酶底物S1，酶2为乙酰胆碱酯酶，前底物为乙酰胆碱；对于底物S3，酶2为蔗糖酶或碱性磷酸酶，前底物为蔗糖或葡萄糖-6-磷酸。
在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包含酶标检测抗体和捕获抗体。
在一个优选的实施方案中，所述循环放大检测试剂盒还包含与带正/负电的超支化触发式自降解聚合物静电络合的金纳米粒子，但所述超支化触发式自降解聚合物不连接荧光基团。
发明详述
以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
现今的大多数的检测方法都是通过线性放大来测量信号，免疫PCR过程是一种诊断技术，因为该放大技术能够指数的产生DNA从而极大的提高检测灵密度。最近，报道了首例不基于PCR技术的指数放大技术，用于检测醋酸阴离子。这个设计精巧的研究使用了一个醋酸根能够激活的超分子催化剂，而该催化剂本身就能够催化醋酸酐分解产生醋酸根。因此少量的醋酸根就可推动全部催化剂的活化，从而实现非线性的放大。近年 来，开发一种新的技术，该技术基于放大的链式反应使用触发式自降解树枝状聚合物的解聚。通过一个单个的刺激事件引发树枝聚合物的自发解聚并释放外围端基分子。该端基分子释放后，能够通过特定的化学反应诱导另外的一个触发式自降解树枝状聚合物解聚，继续释放端基分子。因此，一个单一的活化事件就可以诱导链式反应，从而使所有树枝状分子的通过一个指数速率解聚，从而释放所有的末端基元。具体而言，末端基元使用的是胆碱，刺激基元是苯硼酸，胆碱能够在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢，而过氧化氢能够分解苯硼酸从而导致整个自降解分子的解离。由于释放的末端的基元不能直接刺激另外分子的降解，从而导致体系比较复杂。
本发明使用超支化触发式自降解聚合物与酶结合来构建循环放大体系，超支化触发式自降解聚合物具有比其他的触发式自降解聚合物更容易的合成与更大的自身放大倍率，而更具优势。
具体而言，在一方面，本发明提供一类能够放大信号的循环放大组合试剂盒，所述试剂盒包括一种水溶性的超支化触发式自降解聚合物，该超支化触发式自降解聚合物能够在过氧化氢的刺激下释放多个荧光分子与多个酶的底物，以及能够将酶底物转变为过氧化氢的酶。所述试剂盒的组成与工作原理如图1所示。
所述超支化触发式自降解聚合物以及共价连接在超支化触发式自降解聚合物上并可以过氧化氢触发释放的荧光分子F与酶底物S的分子结构具体如下所示：
其中，F为荧光分子，为用于酶促产生过氧化氢的底物。
在一个优选的实施方案中，
或
或
根据以上所述，所选择的酶的种类与超支化触发式自降解聚合物能够释放的酶底物相对应；其中，S1对应胆碱氧化酶，S2对应肌氨酸氧化酶，S3对应葡萄糖氧化酶，S4对应醇氧化酶。
在优选的实施方案中，根据以上所述的循环放大体系构建通用的检测体系：在前述的循环放大体系的基础上引入额外的超支化触发式自降解聚合物2，该聚合物2能够在待检测物的刺激下脱去响应基元AG，并释放酶底物S从而触发循环放大体系，实现对通用检测物信号放大的目的。体系的具体组成与放大原理如图2所示：
其中，所述的超支化触发式自降解聚合物2以及对待测物质响应的基元AG的分子结构如下所示：
其中，
或
其中，含不同AG基元的超支化触发式自降解聚合物对应着检测不同的待测物，其中，AG1检测钯离子，AG2检测氟离子，AG3检测醌氧化还原酶。
根据上述的循环放大体系构建扩展检测体系：在循环放大体系的基础上引入额外的酶2，该酶能够催化前底物ProS分解成酶底物S从而引发循环放大体系，达到检测酶2或者前底物ProS的目的。体系的具体组成与放大原理如图3所示：
其中，根据所述的酶的底物可以分别使用以下几种酶2催化生成酶底物对于S1，酶2为乙酰胆碱酯酶，ProS为乙酰胆碱；对于S3，酶2为蔗糖酶，ProS为蔗糖；对于S3，酶2另一种为碱性磷酸酶，ProS为葡萄糖-6-磷酸。
根据上述的循环放大体系，循环体系中的酶为酶联免疫吸附检测中酶标抗体上的酶，构建临床使用的超灵敏检测体系。体系的具体组成与放大原理如图4所示：
所述酶标抗体上的酶可以选自胆碱氧化酶、肌氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶或者醇氧化酶。
另外的一个方面，根据之前的循环放大体系，带正电的酶底物为S1的超化触发式自降解聚合物与带负点的金纳米粒子络合，通过金纳米粒子的聚集解离的颜色变化来实现灵敏检测的目的。体系的具体组成与放大原理如图5所示。
另外的一个方面，根据之前所述的循环放大体系，带负电的酶底物为S2的超化触发式自降解聚合物与带正点的金纳米粒子络合，通过金纳米粒 子的聚集解离的颜色变化来实现灵敏检测的目的。体系的具体组成与放大原理如图6所示：
附图说明
图1是过氧化氢触发的循环放大检测试剂盒的组成与工作原理示意图。
图2是连接有待分析物响应元件的循环放大检测试剂盒的组成和工作原理示意图。
图3是检测酶与酶底物的循环放大检测试剂盒的组成和工作原理示意图。
图4是酶联免疫吸附检测与循环放大检测结合的信号放大检测试剂盒的组成和工作原理示意图。
图5是通过金纳米粒子比色信号输出的循环放大检测试剂盒的组成和工作原理示意图(金纳米粒子带负电)。
图6是通过金纳米粒子比色信号输出的循环放大检测试剂盒的组成和工作原理示意图(金纳米粒子带正电)。
图7示出了根据本发明一个实施方式的超支化触发式自降解P1、后修饰超支化触发式自降解P1-F1-S1的核磁氢谱以及凝胶渗透色谱曲线。
图8示出了根据本发明一个实施方式的P1-F1-S1与胆碱氧化酶循环放大体系用于检测过氧化氢的荧光变化曲线。
图9示出了根据本发明一个实施方式的P1-F1-S1与胆碱氧化酶循环放大体系用于检测胆碱氧化酶的荧光变化曲线。
图10示出了根据本发明一个实施方式的P1-F1-S1与人癌胚抗原酶联免疫吸附检测试剂构筑的循环放大体系用于检测人癌胚抗原的荧光变化曲线，以及与商用的辣根过氧化酶体系进行比较。
图11示出了根据本发明一个实施方式的P1-F1络合金纳米粒子以及胆碱氧化酶构筑的比色显示循环体系检测过氧化氢。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的目的，而不是限制本发明的保护范围。
制备例1
第一步，保护基元的引入可以通过其醇的方式在聚合过程中加入来完成。为了更清楚地帮助理解，以下选用苯硼酸频哪醇酯保护触发式自降解聚合物为例说明。该苯硼酸频哪醇酯保护的触发式自降解聚合物，在可见光照条件下，脱去羟甲基苯硼酸频哪醇酯，引发聚合物触发式自降解，生成4-氨基苯甲醇和CO2。疏水触发式自降解聚合物的聚合度m可以通过改变聚合参数和条件来有效的改变，优选地m＝10～30。本领域技术人员理解，对于本发明来说，聚合度m不是关键，只要对本发明没有有害影响即可。为了更清楚地帮助理解，以下选用m＝19的聚合物(P1)为例说明。其反应通式如下所示：
制备方法：将支化基元(0.313g,1mmo1，按照文献J.Am.Chem.Soc.2014,136,7492合成)、DBTL(31.6mg,0.05mmol，国药集团试剂)和干DMSO(1mL)加入反应烧瓶内，以干燥氮气鼓泡除氧1h。之后，于110℃搅拌1h，加入羟甲基苯硼酸频哪醇酯(0.296g,1mmol按照文献Macromolecules 2011,44,429合成)，反应体系再于110℃搅拌5h。以液氮淬灭反应，并在过量甲醇中沉淀，再溶解，该沉淀-溶解循环进行3次。真空干燥箱室温干燥过夜，最终得到产物(0.28g，产率89.5％)，为黄色固体。该触发式自降解聚合物P1的结构的通过核磁氢谱与GPC进行表征，结果分别显示于图7。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的单体结构。
第二步，使用羰基二咪唑(CDI)活化超支化触发式自降解聚合物的外围羟基，然后进行后改性，其反应通式如下所示：
其特征为：先使用CDI活化，从而能够连接含氨基或者羟基的功能分子；首先的CDI应该保证完全活化，第二步的反应可以控制酶底物与荧光分子的修饰量，从而控制放大的效率。
制备方法：P1(0.05g,羟基含量235μmol)溶于干DMF(1mL)中，加入CDI(0.38g,2.4mmol，安耐吉试剂)。氮气氛围下，室温搅拌24h，反应在过量乙醚中沉淀，沉淀-溶解循环进行3次。之后P1-CDI再以干DMF溶解，加入胆碱(0.082g,150μmol，阿拉丁试剂)和三乙胺(0.03g,300μmol)，反应室温搅拌12h，然后加入7-氨基-4-甲基香豆素(0.082g,70μmol，安耐吉试剂)，最后加入炔丙胺(0.055g,1mmol，TCI中国)，再室温搅拌24h，以过量的乙醚/甲醇(1/1,v/v)沉淀，沉淀-溶解循环进行3次，以真空干燥箱干燥过夜后，得到P1-S1-F1前体(0.062g)，为棕色固体。该触发式自降解聚合物前体P1-S1-F1的结构的通过核磁氢谱表征，结果分别显示于图7。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的单体结构。约有9个S1、3个F1和7个炔基接枝到一个超支化分子上。
按照类似的方法，也合成了其它的聚合物比如不含有功能基元F1的超支化触发式自降解聚合物P1-S1。
第三步，通过click反应将亲水的聚乙二醇连接在聚合物外围，其反应通式如下所示：
制备方法：P1-S1-F1前体(0.05g,炔基含量49μmol)、PEG45-N3(120mg,60μmol，苏州诺德派森)、Me6TREN(10.6mg,50μmol，Aldrich)和1mL DMF加入有磁子的玻璃封管内。经历三次冷冻-抽真空-解冻循环后，在N2保护下加入CuBr(7.2mg,50μmol，国药试剂)，烧结封管。于50℃下搅拌24h后，液氮淬灭反应。混合物经由以THF为淋洗剂的硅胶柱除去铜催化剂，除去溶剂、乙醚沉淀，经由溶解-沉淀循环三次。产物再通过去离子水透析的方法纯化(纤维素膜，截留分子量/MWCO为14000Da)，冻干后得到黄色固体P1-S1-F1(74mg)。该触发式自降解聚合物P1-S1-F1的结构的通过核磁氢谱与GPC进行表征，结果分别显示于图7。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的单体结构。约有6个PEG45接枝到一个超支化分子上。
应用例1：胆碱循环放大体系的构筑以及过氧化氢与胆碱氧化酶检测
体系的构筑如前所述，对于检测过氧化氢一个具体的条件为胆碱氧化酶(50μL,100mg/L，Aldrich)，50μL从制备例1获得的超支化触发式自降解聚合物P1-S1-F1(50μM)溶解在磷酸缓冲溶液中(pH 7.4)，震荡混合1h，然后加入待检测的过氧化氢样品，在37℃下缓冲溶液中培养4～8h，检测450nm处的荧光发射(激发光为350nm)。对于检测胆碱氧化酶一个具体的条件为待检测的胆碱氧化酶样品，50μL超支化触发式自降解聚合物P1-S1-F1(50μM)溶解在磷酸缓冲溶液中(pH 7.4)，震荡混合1h，然 后5μM过氧化氢，在37℃下缓冲溶液中培养4～8h，检测450nm处的荧光发射(激发光为350nm)。
实验结果表明，结合超支化触发式自降解聚合物自身的放大效果与循环放大构筑了荧光信号的放大体系。相对聚合物只有0.02个当量的过氧化氢经历一个诱导期也能够是全部的聚合物解聚，其最终荧光强度与加入1个当量的结果相同(参见图8)。因为体系中只加入了0.2倍当量的过氧化氢，因此反应需要诱导期。而不同胆碱氧化酶对诱导期的影响很小，但是对加速期的恒速期的速率影响很大，而恒速期的反应速率决定于循环的效率，所以直接与胆碱氧化酶的含量相关。相同的时间(4h)的荧光强度对胆碱氧化酶的浓度作图(参见图9)，可以看到两者线性相关。如果以初始值的10增加为检测下限，该体系胆碱氧化酶的检测限为0.95ng/mL。
应用例2：超支化触发式自降解聚合物结合酶联免疫吸附构建可用于临床的灵敏检测体系
该体系的一个实验条件：100μL含有不同癌胚抗原(上海源叶)浓度的样品加入到以捕获抗体(癌胚抗原单抗)修饰的96孔板(上海源叶)，37℃下培养1h。之后，每个孔洞洗3次，加入人癌胚抗体-胆碱氧化酶酶联抗体(50μL,100mg/L，郑州博赛)，37℃下培养1h。洗涤3次后，50μL超支化触发式自降解聚合物P1-S1-F1(50μM)和50μL胆碱(5μM)加入每个孔洞中。室温培养4h～8h后，用酶标仪测试每个孔450nm处的荧光发射(激发光为350nm)。
实验结果表明，当测定的方法按照标准的方法，利用人癌胚抗体-胆碱氧化酶酶联抗体，用超支化触发式自降解聚合物构建循环体系来检测吸附上去的酶，随着癌胚抗原的增加，450纳米的荧光增强。使用癌胚抗原的浓度对荧光强度作图，就可以看出在什么浓度下可以开始检测到癌胚抗原，从而在曲线上出现拐点。如果我们以拐点为检测限，就可以看出使用超支化触发式自降解聚合物的检测限是1.6ng/mL，这比标准的HRP与小分子的BAC的检测限(1.6ng/mL)高6倍左右(参见图10)。
应用例3：通过金纳米粒子比色信号输出的络合的循环放大检测
水相比色检测的制备始于混合柠檬酸稳定的AuNP水溶液(按照文献Macromolecules 2011,44,429制备)、超支化聚合物P1-S1和胆碱氧化酶(COx)，用容量瓶定容到终浓度分别为60μg/mL、80μg/mL和10ng/mL。检测试剂中H2O2响应的苯硼酸单元的浓度测算为9.5μM。以比色检测H2O2时，将10μL H2O2水溶液(0-10当量相对于苯硼酸单元)加入1.0mL的比色检测试剂中，得到的水溶液在25℃和pH 7.4的环境下反应。
实验结果表明，紫外可见吸收由570纳米蓝移到520纳米，表观颜色由蓝色变为红色。TEM的结果表明，超支化触发式自降解聚合物/金纳米粒子的络合已经解离。接下来考察了不同过氧化氢刺激下，紫外可见吸收的变化。在过量10倍过氧化氢的情况下，吸收信号快速蓝移，在5h左右完全蓝移到初始金纳米粒子的吸收520纳米。而当过氧化氢的浓度降低到0.1倍聚合物当量的时候，反应具有一个比较长的诱导期，大约需要4h才启动反应，因为此时还没有积累足量的过氧化氢使全部的聚合物解聚，导致络合物解离。如果我们以6h为检测时间，可以做出吸光度的比值A520/A570相对过氧化氢量的关系，该关系是一个指数关系，我们以初始值增大10％为检测下限，得出的检测限是0.13μM(见图11)。
以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具体实施方式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以作出其他更改和变形。本发明的范围由所附权利要求限定。
Claims (8)
1.一种能够放大信号的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒包括共价连接有荧光分子与酶底物的水溶性超支化触发式自降解聚合物，和能够将所述酶底物转变为过氧化氢的酶，其中所述超支化触发式自降解聚合物能够在过氧化氢的刺激下释放多个荧光分子与多个酶底物，所述共价连接有荧光分子与酶底物的超支化触发式自降解聚合物的结构如下：
其中S表示酶底物，F表示荧光分子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，
所述酶的种类与所述酶底物相对应；其中，S1对应于胆碱氧化酶，S2对应于肌氨酸氧化酶，S3对应于葡萄糖氧化酶，S4对应醇氧化酶。
3.根据权利要求1-2任一项所述的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒还包括额外的超支化触发式自降解聚合物2，所述超支化触发式自降解聚合物2共价连接有待分析物响应基元和酶底物，并且能够在待检测物的刺激下脱去响应基元，并释放酶底物，所述共价连接有待分析物响应基元的超支化触发式自降解聚合物2的分子结构如下所示：
其中，AG为待分析物响应基元，为酶底物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，
5.根据权利要求2所述的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒还包含额外的酶2，该酶2能够催化前底物分解成酶底物。
6.根据权利要求5所述试剂盒，对于酶底物S1，酶2为乙酰胆碱酯酶，前底物为乙酰胆碱；对于底物S3，酶2为蔗糖酶或碱性磷酸酶，前底物为蔗糖或葡萄糖-6-磷酸。
7.根据权利要求1-2任一项所述的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒还包含酶标检测抗体和捕获抗体。
8.根据权利要求1-2任一项所述的循环放大检测试剂盒，所述试剂盒还包含与带正/负电的超支化触发式自降解聚合物静电络合的金纳米粒子，所述超支化触发式自降解聚合物用金纳米粒子代替荧光基团。
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