CN102967666A - 一种对猪瘟病毒e2蛋白含量的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响；其步骤为试剂配制及样品处置，以电泳及脱色液脱色，确定蛋白大小，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，再进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；其检测采用N₂气体密封保护，进行液相检测；采用该方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为1.09%，具有很好的重复性和准确性。

Description

一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法

技术领域

本发明利用凝胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量的方法，有效的避免了杂蛋白对定量分析结果的影响。

背景技术

目前对猪瘟病毒的蛋白进行定量的检测方法，有以下几方面：①对蛋白跑胶后的特定条带颜色比对法；②特定波长下的吸光值计算法；③铜离子还原的蛋白定量法；④染料结合的蛋白定量法；其①方法存在人为与试剂差异因素，判定结果最不准确；而后三种方法对样品中所有的蛋白同时进行定量，无法完成针对某一种特殊蛋白的准确定量，换言之，单一的液相色谱难以将这种同源性较接近的蛋白质进行完全分离。

本发明构思使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量分析，既解决了异种蛋白质分离难，造成结果假阳性的问题，又能很大程度的提高对猪瘟E2蛋白定量检测的准确度和精度。

发明内容

本发明的目的在于：针对猪瘟E2蛋白定量分析，即PAGE胶回收-液相色谱联用方法，替代了传统的比色法，检验效果既准确，又易于操作，有重要的推广价值。

本发明的目的是这样实现的：一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下：

步骤1试剂配制：

1）0.1M磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 12H₂O₃ 63g,KH₂PO₄0.24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7.2，加超纯水定容至1L，混匀；

2）0.01M磷酸盐缓冲液：取0.1M磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；

3）匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl 1.Oml，即pH 6.8；10%SDS 6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，超纯水2.8ml，混匀；

4)转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；

5）0.01M磷酸盐缓冲液，即pH7.4：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000ml，混匀；

6）膜染色液：考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀；

7）包被液：5%脱脂奶粉1.0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；

8）显色液：DAB 6.0mg；0.01M磷酸盐缓冲液10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H₂0₂ 1.0μl，混匀；

9）辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗；

10）6mo l/L盐酸溶液：取0.5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；

11）20mM盐酸溶液：取出6.68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；

12）Norleucine溶液:取Norleucine粉末6.56mg，以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；

13）氨基酸标准品配制：取4ml Amino Acid Standard H Stock与13.12mgNorleucine粉末，用超纯水定容至100ml，混匀；

14）HPLC流动相A：100mL Eluent A浓缩液，加入1L的超纯水，混匀；

15）HPLC流动相B：1L的100%Acetonitrile溶液；

16）HPLC流动相C：1L的0.1M磷酸氢二钠缓冲液；

步骤2样品处理：取high five细胞的猪瘟E2蛋白和健康细胞的上清各1-1.5ml，同时置于微量离心管中，以3000rPm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析；由-20°C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80μl离心的上清液与20μl 5倍的蛋白上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGE，将蛋白质分子量标准样品依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，一片以考马斯亮蓝进行染色，时间30min后，以脱色液脱色，初步确定蛋白大小；另一片胶片进行蛋白质免疫印记杂交，条件：40mA，时间2小时，使蛋白质转印到醋酸纤维膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭，时间30min；倒掉脱脂乳，以PBST洗三次后，在PBST中加入一抗WH303，即1:3000，置于4°C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，即1:5000稀释，室温下摇晃感作，时间1h，倒掉二抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min在暗室内，将膜放入平皿中，先加1ml去离子水，再加入DAB显色液，即A液和B液各1滴，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，在约48KD附近见到的特异性条带则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western-blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将SDS-PAGE上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；

其3检测步骤：

将回收的猪瘟E2蛋白经离心浓缩仪浓缩至80-110μL，并抽取10μL浓缩样，加至水解小管中，加6mol/L的HCl 200ul，1-2mg的固体苯酚，抽真空脱气，采用N₂气体密封保护，110℃下反应24小时；反应结束，用离心浓缩仪将水解液旋蒸至干燥状态，加入Norleucine溶液20μL，Borate buffer 60μL，AQC衍生试剂20μL，最终体积100μL，震荡混匀，在55℃温箱中反应10分钟，冷却至室温，进行液相检测；使用Waters的AccQ·Tag^TM，即Size：3.9x150nm的水解衍生柱，柱温设定37℃，样品槽温度10℃，荧光激发波长设为295nm，输入波长设为395nm，进样量为5μL；其中离心浓缩仪的温度45℃，真空度93.3-98.6KPa，转速3500rPm。

所述的方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为1.09%，具有很好的重复性和准确性。

本发明的构思及作用机理：根据已知的猪瘟E2蛋白上的比较稳定存在的5种氨基酸数目，通过计算得到该样品的含量，将已知浓度的猪瘟E2蛋白标准品，经过梯度稀释，进行HPLC检测，色谱柱：Phenomenex的BioSep-SEC-S2000色谱柱（Size：300x7.80mm），柱温65℃，样品槽温度8℃，使用流动相C，波长扫描时间20分钟，紫外检测器在226nm处有最大吸收峰，即得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品的猪瘟E2蛋白的含量，相对于传统的比色法对蛋白定量的方式，采用的PAGE胶回收-液相色谱联用法对猪瘟E2蛋白定量分析方式，可以有效的避免杂蛋白对结果的干扰，判定结果更精确，结果可信度更高。机理：通过SDS-PAGE胶回收目的蛋白片段，有效的避免了杂蛋白对浓度结果的影响，当标准品蛋白经过HCl水解法确定含量后，并使用液相色谱建立一条标准曲线，未知样品根据此标准曲线就可以得知其浓度，该结果的准确度可以精确到ng级别，使我们对于蛋白定量的精度有了大幅度的提高，为以后的研究、生产工作提供了更加可靠的数据。

本发明使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式对猪瘟E2蛋白定量分析方法，包括16种试剂配制；经样品处理：经考马斯亮蓝进行染色，初步确定蛋白大小；根据蛋白质印迹法确定E2蛋白的位置，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，并采用蛋白印迹法确定其正确性，方法精准可靠，彰显技术进步。

附图说明

本发明结合附图作进一步阐明。

附图1为蛋白电泳图；

如图所示：蛋白经蛋白印迹法分析，可以确定E2蛋白的大小。

附图2为蛋白电泳图；

如图所示：显示了我们准备回收的E2蛋白。

附图3为蛋白电泳图；

如图所示：E2蛋白经蛋白印迹法分析，确定回收的目的蛋白的正确性。

附图4采用上海生物工程的PAGE胶蛋白微量回收试剂盒（产品编号：BSP062）进行回收；使用了6种E2上稳定存在的氨基酸(Asn，Asp，Leu，Lys，Thr，Val)对未知样品的蛋白水解产物进行浓度分析，使用waters的蛋白水解衍生试剂，通过计算可以得到该样品的含量。

如图所示：使用Phenomenex的BioSep-SEC-S2000的色谱柱（Size：300x7.80mm），柱温设为65℃，样品槽温度为8℃，流动相为0.1M磷酸氢二钠缓冲液，波长扫描时间20分钟，紫外检测器吸收光波值为226nm，得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品中的猪瘟E2蛋白含量。

附图5、图5-1为第一天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；

如图所示：Name:E2;Processing Method:Std;Fit Type:线性(一阶);Cal Curve Id:2954;A:2.288351e+005;B:4.986142e+003;C:0.000000e+000;D:0.000000e+000;R^2:0.995065；X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。

附图6、图6-1为第二天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；

如图所示：Name:E2;Processing Method:Std;Fit Type:线性(一阶);Cal Curve Id:2941;A:2.199966e+005;B:5.014100e+003;C:0.000000e+000;D:0.000000e+000;R^2:0.994154；X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。

附图7、图7-1为第三天的校准曲线数据图与E2样品的HPLC分析图；

如图所示：Name:E2;Processing Method:Std;Fit Type:线性(一阶);Cal Curve Id:2932;A:2.199785e+005;B:5.019950e+003;C:0.000000e+000;D:0.000000e+000;R^2:0.994323；X轴显示时间；Y轴显示的峰面积。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步阐明。

实施例

使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式对猪瘟E2蛋白定量分析方法的具体实施步骤：

（一）反应试剂的制备：

0.1M酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 12H₂O ₃.63g,KH₂PO₄ 0.24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7.2，加超纯水定容至1L，混匀；

0.01M酸盐缓冲液：取0.1M酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；

SDS-PAGE试剂：水8.2ml，30%丙烯酰胺溶液10ml，1.5mol/L Tris 6.3ml，10%SDS 0.25ml，10%过硫酸铵0.25ml，TEMED 0.01ml；

匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml，10%SDS 6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，超纯水2.8ml，混匀；

转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；

0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO40.24g，加超纯水至1000ml，混匀；

膜染色液：考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀；

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；

显色液：二氨基联苯胺6.0mg；0.01M磷酸盐缓冲液10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H₂0₂ 1.0μl，混匀；

辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG（二抗）；

WH303：由英国皇家兽医学院惠赠；

6mol/L盐酸溶液：取0.5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；

20mM盐酸溶液：取出6.68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；

Norleucine溶液:精确称取Norleucine粉末6.56mg，以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；

氨基酸标准品配制：取4ml Amino Acid Standard H Stock及13.12mgNorleucine粉末用超纯水定容至100ml，混匀；

HPLC流动相A：100mL Eluent A浓缩液，加入1L的超纯水，混匀；

HPLC流动相B：1L的100%Acetonitrile溶液；

HPLC流动相C：1L的0.1M磷酸氢二钠缓冲液；

（二）样品处理：

取High five细胞上表达的E2蛋白和健康细胞上清各1ml至1.5ml微量离心管中，以3000rpm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析。由-20°C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80μl离心的上清液与20μl 5×上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGE×2片，将protein marker、样品蛋依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，第一块SDS-PAGE胶以考马斯亮蓝进行染色，时间30min，以液脱色，初步确定蛋白大小（见图1）。

第二块SDS-PAGE胶进行Western-blot分析，条件：40mA，时间2hr，使蛋白质转渍到PVDF膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭时间30min。倒掉脱脂乳，以0.1%的吐温20洗三次后，在0.1%的吐温20中加入一抗WH303（1:3000），置于4°C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以0.1%的吐温20洗三次后，再以0.1%的吐温20洗五次每次25ml，每次时间10min加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗(1:5000稀释)，室温下摇晃感作，时间1h，倒掉二抗，以0.1%的吐温20洗三次后，再以0.1%的吐温20洗五次每次25ml，每次时间10min在暗室内，将膜放入平皿中，先加1ml去离子水，再加入二氨基联苯胺显色液2滴，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，在约48KD附近见到的特异性条带则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western-blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将第一块SDS-PAGE胶上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白（见图2）。将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性（见图3）。

本方法使用上海生物工程的PAGE胶蛋白微量回收试剂盒（产品编号：BSP062）进行回收；其二使用了6种E2上稳定存在的氨基酸(Asn，Asp，Leu，Lys，Thr，Val)对未知样品的蛋白水解产物进行浓度分析，使用waters的蛋白水解衍生试剂，货号：WAT052880，通过计算可以得到该样品的含量。其三使用已知浓度的E2蛋白作为标准品，经过梯度稀释，使用Phenomenex的BioSep-SEC-S2000的色谱柱（Size：300x7.80mm），柱温设为65℃，样品槽温度为8℃，流动相为0.1M磷酸氢二钠缓冲液，波长扫描时间20分钟，紫外检测器吸收光波值为226nm，得到一条标准曲线，依据此标准曲线，计算出未知样品中的猪瘟E2蛋白含量。

（三）检测流程：

将回收的猪瘟E2蛋白经过离心浓缩系统（温度45℃，真空度93.3-98.6KPa，转速3500rpm），浓缩至100μL，记录准确的体积数，并抽取10μL浓缩样，加至水解管中，加6mo l/L的HCl 200ul，1-2mg的固体苯酚，抽真空脱气，N₂密封保护，110℃下反应24小时；反应结束后用离心浓缩系统将水解液旋蒸干（温度45℃，真空度93.3～98.6KPa，转速3500rpm），加入Norleucine溶液20μL，Borate buffer 60μL，AQC衍生试剂20μL，终体积100μL，震荡混匀，在55℃温箱中反应10分钟，冷却至室温，准备进行液相检测；使用Waters的AccQ·Tag^TM（Size：3.9x150nm）的水解衍生柱，柱温设定37℃，样品槽温度10℃，荧光激发波长295nm，输入波长395nm；进样量5μL，流动相设定见表1。

表1    流量设定

根据已知的猪瘟E2蛋白上的比较稳定存在的6种氨基酸数目(Asn[14]Asp[21],Leu[26],Lys[19],Thr[34],Val[25])，见表2。

表2

通过计算得到该样品的含量。

计算公式：

未知样品含量=平均pmol浓度/进样体积×被检测样品分子量

平均pmol浓度为：1.7822；进样体积5μL；E2蛋白分子量为38259；计算得到PAGE胶回收的E2蛋白浓度为136.370μg/ml。

将已知浓度的标准品（0.41mg/ml），经过5次梯度稀释，浓度依次变为：0.205mg/ml，0.1025mg/ml，0.05125mg/ml，0.025625mg/ml，0.0128125mg/ml，经过HPLC检测，色谱柱：Phenomenex的BioSep-SEC-S2000色谱柱（Size：300x7.80mm），柱温65℃，样品槽温度8℃，使用流动相C，波长扫描时间20分钟，紫外检测器设定为226nm，得到一条标准曲线，连续实验结果见图五、图六、图七；依据此标准曲线，计算PAGE胶回收的猪瘟E2蛋白含量，实验结果见表3、表4、表5。

表3

表4

表5

上表结果显示：连续三天的线性的R²值都达到了99%以上，证明线性情况良好，具有很好的重复性，PAGE胶回收E2蛋白浓度依次为：139.117μg/ml，138.702μg/ml和139.884μg/ml，通过蛋白水解所得到的浓度136.370μg/ml相比相对标准偏差为1.09%，证明本方法具有很好的重复性和准确性。

本方法选用的原料：WH303由英国皇家兽医学院惠赠；1.5mol/L Tris购自Sigma公司，货号：B9745-100G；10%SDS购自Sigma公司，货号08091-1kt-f；TEMED购自Sigma公司，货号：110-18-9、1.0M Tris-HCl购自罗氏制药，货号：10812846001；β-巯基乙醇购自Amresco，货号：60-24-2Synonym(s)；甘氨酸购自NOVON，货号ZZ02782；考马斯亮兰购自Sigma，货号B-1131；脱脂奶粉购自北京普博斯生物科技有限公司，货号：P1662；二氨基联苯胺购自Sigma公司，货号D-5637；硫酸镍胺购自成都贝斯特试剂有限公司，货号15699-18-0；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG（二抗）购自Sigma，货号A5670；Norleucine购自Sigma公司，货号N6877-1G、Amino Acid Standard H Stock购自Thermo，货号NC20180；Eluent A溶液购自Waters公司，货号WAT052890；Acetonitrile溶液购自B&J公司，货号AH015-4；AQC衍生试剂购自waters公司，货号：WAT052880；丙烯酰胺溶液购自博美科生物，货号A005-1。

试验选用的离心浓缩系统购自Thermo，型号为SPD121P-230；Waters的AccQ·Tag^TM（Size：3.9x150nm）购自Waters公司，型号为WAT052885；Phenomenex的BioSep-SEC-S2000色谱柱（Size：300x7.80mm）购自Phenomenex公司，型号为OOH-2145-KO；使用的超纯水用美国millipore TANKMPK01型超纯水仪制备。

本方法选用的high five细胞生产的猪瘟E2蛋白由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产，生产日期为2012年5月14号，生产批号20120514。

1猪瘟病毒E2基因的来源。

1.1新疆天康畜牧生物技术股份有限公司从新疆某猪场采集疑似被猪瘟病毒感染的发病猪的扁桃体、淋巴结、脾脏、血液等病料，对组织进行研磨，经过冻融，离心后，收集上清，提取上清中的RNA，用根据GenBank E2基因片段设计的引物进行PCR扩增，结果扩增出与猪瘟E2基因大小一致的基因片段，经核苷酸序列测定后与国内报道的的猪瘟E2序列和猪瘟各亚群的参考进行比对，结果显示本实验室扩增出的猪瘟E2基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株的同源性达97.8%，确定为同一群。

1.2氨基酸序列

将测序所得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，结果如下：

TTAFLICLVKVLRGQIVQGVIWLLLVTGAQGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYTHDLQLNDGTVKATCVAGSFKITALNAVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTRPVVKGKYNATLVNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMNCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGLVKQCRWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETSYRVVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVRVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPAMKTSCTFNYAKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDATDHHSDYFAEF

2、猪瘟病毒E2蛋白表达载体的构₉建及表达。

2.1E2蛋白表达载体的构建：猪瘟病毒E2基因的扩增、猪瘟病毒E2基因序列测定、Gateway系统构建转移载体、猪瘟病毒E2转移载体的筛选和鉴、猪瘟病毒E2转移载体的提取、转染至Sf-9细胞（BaculoDirect N-Term LinearDNA）、猪瘟病毒E2重组病毒杆状病毒的筛选、猪瘟病毒E2重组病毒的鉴定（PCR、Western-blot、IFA）猪瘟病毒E2重组杆状病毒的扩繁等步骤。

2.2E2蛋白的表达：

将猪瘟病毒E2重组杆状病毒接种High five(接毒剂量MOI为1)，放置于27°C恒温震荡培养箱中以180转/分钟震荡培养约4日后，以3000转/分钟离心20分钟，收取上清液即为猪瘟病毒E2重组蛋白。

Claims (2)

1.一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，其特征在于：用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下：

步骤1试剂配制：

1）0.1M磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 12H₂O₃ 63g,KH₂PO₄0.24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7.2，加超纯水定容至1L，混匀；

2）0.01M磷酸盐缓冲液：取0.1M磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；

3）匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl 1.Oml，即pH 6.8；10%SDS 6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，超纯水2.8ml，混匀；

4)转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；

5）0.01M磷酸盐缓冲液，即pH7.4：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000ml，混匀；

6）膜染色液：考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀；

7）包被液：5%脱脂奶粉1.0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；

8）显色液：DAB 6.0mg；0.01M磷酸盐缓冲液10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H₂0₂ 1.0μl，混匀；

9）辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗；

10）6mol/L盐酸溶液：取0.5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；

11）20mM盐酸溶液：取出6.68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；

12）Norleucine溶液:取Norleucine粉末6.56mg，以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；

13）氨基酸标准品配制：取4ml Amino Acid Standard H Stock与13.12mgNorleucine粉末，用超纯水定容至100ml，混匀；

14）HPLC流动相A：100mL Eluent A浓缩液，加入1L的超纯水，混匀；

15）HPLC流动相B：1L的100%Acetonitrile溶液；

16）HPLC流动相C：1L的0.1M磷酸氢二钠缓冲液；

步骤2样品处理：取high five细胞的猪瘟E2蛋白和健康细胞的上清各1-1.5ml，同时置于微量离心管中，以3000rPm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析；由-20°C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80μl离心的上清液与20μl 5倍的蛋白上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS-PAGE，将蛋白质分子量标准样品依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，一片以考马斯亮蓝进行染色，时间30min后，以脱色液脱色，确定蛋白大小；另一片胶片进行蛋白质免疫印记杂交，条件：40mA，时间2小时，使蛋白质转印到醋酸纤维膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭，时间30min；倒掉脱脂乳，以PBST洗三次后，在PBST中加入一抗WH303，即1:3000，置于4°C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，即1:5000稀释，室温下摇晃感作，时间1h，倒掉二抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min在暗室内，将膜放入平皿中，先加1ml去离子水，再加入DAB显色液，即A液和B液各1滴，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，在48KD处见到特异性条带，则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western-blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将SDS-PAGE上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，将回收的目的蛋白再次进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；

其3检测步骤：

将回收的猪瘟E2蛋白经离心浓缩仪浓缩至80-110μL，并抽取10μL浓缩样，加至水解小管中，加6mol/L的HCl 200ul，1-2mg的固体苯酚，抽真空脱气，采用N₂气体密封保护，110℃下反应24小时；反应结束，用离心浓缩仪将水解液旋蒸至干燥状态，加入Norleucine溶液20μL，Borate buffer 60μL，AQC衍生试剂20μL，最终体积100μL，震荡混匀，在55℃温箱中反应10分钟，冷却至室温，进行液相检测；使用Waters的AccQ·Tag^TM，即Size：3.9x150nm的水解衍生柱，柱温设定37℃，样品槽温度10℃，荧光激发波长设为295nm，输入波长设为395nm，进样量为5μL；其中离心浓缩仪的温度45℃，真空度93.3-98.6KPa，转速3500rPm。

2.依据权利1所述的方法，其特征在于：采用该方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为1.09%，具有很好的重复性和准确性。

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