CN103588864A - 猪瘟病毒c株e2截短蛋白及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种猪瘟病毒C株E2截短蛋白及制备方法与应用。本发明将E2基因主要抗原区进行表达外还将维持其空间结构的三对二硫键进行同时表达，在一定程度上可使得表达蛋白有一定空间结构，更加符合天然蛋白的特点，且包涵体也利于蛋白的纯化。本发明获得的E2截短蛋白，用于建立CSFV IgG抗体ELISA检测方法，结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性；所建立的ELISA试剂盒使用后特异、准确、敏感、重复性佳。本发明使用的底物显色液可起到指示的作用，且终止反应后的几个小时直到4度过夜后，检测结果仍具有可信度；因此本发明的显色系统可减少人为因素的影响，避免出现假阳性，使得阴性结果稳定，保证猪瘟抗体得到更好地监测。

Description

猪瘟病毒C株E2截短蛋白及制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒C株E2截短蛋白及制备方法与应用。
背景技术
猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是严重危害养猪业的重要病毒性传染病，该病呈世界范围流行，为OIE规定的A类主要烈性传染病，其病原体也被《国际生物武器公约》列为重要动物生物战剂或动物生物恐怖病原体，因此受到国际社会的高度重视。
猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，又称猪霍乱。猪瘟病毒（Classic swine fever virus，CSFV，旧称Hog cholera virus,HCV）现属于黄病毒科、瘟病毒属成员，同属成员还包括牛黏膜病病毒群（BVDV）、羊边界病病毒（BPV）。此前，该病毒隶属于披膜病毒科、黄病毒属。该病毒常引起猪呈败血症临床变化，表现为急性、慢性和非典型的病程经过。急性猪瘟症状明显，病死率极高；慢性猪瘟症状较轻、病程较长、病死率低，易复发。病理变化特点为细小的管壁变性，从而引起内脏出血、坏死和梗死。极易出现并发症。本病潜伏期为1周左右，根据病程和其他特征，临床上常分为最急性型、急性型、慢性型和迟发型等病型。
我国于1925年发现该病，1954年成功研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，这是中国一直使用的唯一疫苗株，推广应用至今，己取得显著效果。该苗目前仍然是世界上最有效、应用范围最广的猪瘟疫苗。以此疫苗免疫为基础，我国于1956年提出了消灭猪瘟的规划，到现在57年过去了，猪瘟仍在我国不间断地流行。自然条件下，猪瘟病毒持续感染通常是在免疫力较低的情况下，由于环境中的病毒反复感染产生的，由于感染猪还有一定的免疫力，病毒虽然可以在其体内局部存留，但还不足以引起猪发病。一般情况下，感染猪虽然持续带毒，但不表现临床症状，然而却可以不断向外排毒，再次感染其他猪，污染环境；带毒的种猪可以通过母猪的胎盘和公猪的精液传播给仔猪，造成仔猪的先天免疫耐受,导致疫苗免疫失败。正因为如此，从源头上去截断猪瘟的流行势是最行之有效的办法。
猪瘟检测技术包括多种方法：其一，传统动物实验，即将含毒样品，如病料脏器匀浆，或组织病毒培养物用生理盐水进行适当稀释接种易感猪，观察发病情况，然后分离病毒，进行实验室检测。其二，基于血清学的检测技术，有ELISA免疫检测技术、间接血凝试验、血清中和试验。其三，免疫胶体金技术，以胶体金作为示踪标志物用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。其四，分子生物学检测技术，有RT-PCR检测技术、DNA探针技术。以上几种方法中ELISA免疫检测技术是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，是检测抗体的主要免疫学方法，常用于规模化养猪场的检测。抗体检测技术在血清学调查、流行病学研究、疫苗免疫效果评估及疫病预防控制中发挥重要作用。鉴于ELSIA方法的优异性，建立新型ELISA方法对于猪瘟水平的监测是行之有效的方法。
传统ELISA方法在显色终止时测得的数值将会随时间变化而发生变化，这样子的一个情况将导致结果具有明显的人为、不确定性出现。所以，获得一种显色终止后稳定的方法是迫切需要解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒C株E2截短蛋白。
本发明的另一目的在于提供所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白在制备检测猪瘟病毒试剂盒中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种猪瘟病毒C株E2截短蛋白，氨基酸序列（SEQ ID NO.1）如下所示：
RLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDLQLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVVKGKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTTVENEDLFYCKLG；
编码所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）如下所示：
CGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAACCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAATACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAAAATGAAGATTTATTCTATTGTAAGTTGGGG；
所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白的制备方法，包括如下步骤：
（1）从猪瘟兔化弱毒细胞苗中提取RNA，反转录，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过引物F1和F2进行PCR，将得到的PCR产物和载体pET-32a分别通过BamH I和Hind III进行双酶切，再将双酶切后的PCR产物和pET-32a连接，通过双酶切和测序鉴定，得到阳性重组质粒pET-32a-CSFV-E2；
F1：5′-GATGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3′；
F2：5′-GCGAAGCTT
Figure BDA0000424783020000031
CCCCAACTTACAATAGAATAAATCTTCA-3′；
其中，GAT或GCG为保护碱基，GGATCC为BamH Ⅰ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点，
Figure BDA0000424783020000032
是终止密码子TAA的反向互补序列；
（2）将步骤（1）的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21，得到重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2；
（3）培养步骤（2）中的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，获得重组表达蛋白；
（4）将步骤（3）中得到的重组表达蛋白进行可溶性鉴定，将得到的包涵体用8M尿素溶解后进行了透析复性，并利用His-TRAPTM FF Crude纯化柱进行纯化，获得纯化的CSFV-E2截短蛋白；用此纯化蛋白进行Western Blotting鉴定。
步骤（1）中所述的反转录的反应体系为：总RNA 12μL、dNTPs 2μL、随机引物1μL、RRI 2μL、AMV 1μL，加ddH2O至总体积为20μL；
步骤（1）中所述的PCR的反应体系为：10×KOD FX Buffer 2.5μL，dNTPs10μL，KOD FX1μL，引物F1 1.5μL，引物F2 1.5μL，cDNA 4μL，加水至25μL；
步骤（1）中所述的PCR的反应条件为：94℃预变性2min；94℃热变性15s、57℃ 30s、68℃ 45s，共30个循环；68℃ 8min终延伸；
所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白在制备检测猪瘟病毒试剂盒中的应用。
一种检测猪瘟病毒试剂盒，包括如下组分：
以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板、PBST洗涤液、血清稀释液、标准血清、酶标二抗IgG、底物显色液、终止液。
所述的以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将纯化的CSFV-E2截短蛋白用包被缓冲液稀释到0.313μg/mL，100μL每孔加到酶标板，37℃温育1h后，4℃过夜；取过夜包被好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；200μL/孔封闭液，37℃温育1.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；得到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板；
所述的包被缓冲液优选为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述的pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液优选通过如下步骤制备得到：将碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g溶解于600mL ddH2O，用5mol/L的氢氧化钠水溶液调pH值至9.6，ddH2O定容至1000mL，即得包被缓冲液；
所述的封闭液优选为用PBST洗涤液配制的质量体积比（8g/100mL）8%的大豆卵磷脂溶液；
所述的PBST洗涤液优选为加入体积分数0.05%吐温-20的PBS溶液；
所述的PBS溶液通过如下步骤制备得到：将0.2g KH2PO4，2.08gNa2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.2g KCl，溶解于600mL ddH2O，用浓盐酸调pH值至7.4，ddH2O定容至1000mL，即得PBS溶液；
所述的血清稀释液优选为用PBST洗涤液配制的质量体积比（0.8g/100mL）0.8%的大豆卵磷脂溶液；
所述的标准血清为CSFV阴性血清和CSFV阳性血清；
所述的酶标二抗IgG优选为辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗猪IgG二抗；
所述底物显色液包括显色A液、显色B液、显色剂C和显色液D；
所述的底物显色液优选为通过如下步骤制备得到：将显色A液与显色B液按体积比1:1混匀后，加入40mg/L的显色剂C，反应30min后再加入150μL/L的显色液D，即得底物显色液；
所述的显色A液优选为柠檬酸水溶液；
所述的柠檬酸水溶液通过如下步骤制备得到：将21g/L柠檬酸加入到ddH2O中溶解，即得柠檬酸水溶液；
所述的显色B液优选为磷酸盐水溶液；
所述的磷酸盐水溶液通过如下步骤制备得到：将72g/L Na2HPO4·12H2O加入到ddH2O中溶解，即得磷酸盐水溶液；
所述的显色剂C优选为邻苯二胺；
所述的显色液D优选为质量体积比（g/mL）30%的H2O2水溶液；
所述的终止液优选为2M硫酸（H2SO4）。
所述的检测猪瘟病毒试剂盒的应用，包括如下步骤：
（1）将待检样品用血清稀释液稀释，然后按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将标准血清分别按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中作为对照，37℃温育1.5h；
（2）用PBST洗涤液进行洗板3次，200μL/孔，每次3min；
（3）将酶标二抗IgG用PBST洗涤液稀释，每个反应孔加100μL，37℃温育90min；
（4）用PBST洗涤液进行洗板4次，200μL/孔，每次3min；
（5）避光条件下每个反应孔加100μL底物显色液，室温避光显色10min；
（6）每个反应孔加50μL终止液终止反应；
（7）在492nm单波长下测OD值；
（8）结果判读：OD492nm(样本)≥0.163判为阳性；OD492nm介于0.149～0.163（OD492nm(样本)+2SD）判为可疑，OD492nm(样本)＜0.149判为阴性。
步骤（1）中所述的将待检样品用血清稀释液稀释优选为将待检样品用血清稀释液按体积比1:200倍稀释；
步骤（3）中所述的将酶标二抗IgG用PBST洗涤液稀释优选为将酶标二抗IgG用PBST洗涤液按体积比1:5000倍稀释。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
（1）本发明针对目前原核表达中连接载体过于复杂，需要连接T载体，酶切后再与表达载体连接；为了简化此过程做到一步到位的与表达载体连接，进行了相关试验，实现了连接过程的简便化。
（2）本发明还针对目前猪瘟E2蛋白在表达后获得的蛋白基本上丧失了其天然结构的特点，将E2基因主要抗原区进行表达外还将维持其空间结构的三对二硫键进行了同时表达，在一定程度上可以使得表达的蛋白有一定的空间结构，更加地符合天然蛋白的特点，而且包涵体对于蛋白的纯化也是有利的，因此，可以解决蛋白纯度不足的缺陷，获得一单一的蛋白。
（3）本发明针对用于猪瘟抗体检测的间接ELISA方法在显色过程中所使用的TMB显色在终止后OD450数值容易发生变化，影响结果判定等问题，提供了一种可以稳定地读取数值，以达到结果准确判定的ELISA新方法，并且实现了初步的可视化读取结果。
（4）本发明用于IgG抗体的ELISA检测方法是，将获得的上述重组截短E2蛋白包被酶标板，通过抗原包被浓度与血清稀释度和作用时间、酶标板选择、包被条件优化、封闭液选择及时间优化、二抗浓度选择和作用时间优化、显色时间优化以及终止后读数时间，优化间接ELISA方法，检测阴性血清临界值并作出判定标准。
（5）针对当前检测猪瘟抗体使用的间接ELISA方法大多以E2重组蛋白作为基础，检测的抗体有IgG、IgM，其中IgM检测方法报道较少，但是，鉴于血清中免疫球蛋白IgG处于主要部分，则选择检测IgG方法具有更高的可靠性。本发明构建了表达猪瘟E2截短蛋白的重组大肠杆菌，并将其用于建立CSFVIgG抗体ELISA检测方法，初步应用结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性，所建立的ELISA试剂盒使用后特异、准确、敏感、重复性佳，这将为系统研究猪瘟免疫后IgG抗体产生规律、临床感染情况的监测和鉴别诊断方法的建立奠定基础。
（6）本发明使用磷酸盐缓冲液及柠檬酸盐缓冲液以合适的比例混合在一起加入邻苯二胺及过氧化氢等多种试剂后，可以起到指示结果作用，并且终止反应后的几个小时直到4度过夜后检测结果仍然具有可信度。鉴于此，将显色系统进行改进可减少人为因素的影响，避免了假阳性出现，也将会使得阴性结果稳定，保证了猪瘟抗体能得到更好地监测。
附图说明
图1为CSFV-E2基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1为以F1、F2为引物的PCR扩增产物。
图2为重组质粒pET-32a-CSFV-E2双酶切鉴定结果的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为DNA Marker DL10000，泳道1为重组质粒pET-32a-CSFV-E2用BamHI和Hind III进行双酶切后的产物。
图3为IPTG诱导重组表达菌株获得的表达蛋白的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2诱导表达产物，泳道2为空载体BL21-pET-32a诱导表达产物。
图4为不同IPTG浓度诱导重组表达菌株获得的表达蛋白的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1～7是IPTG浓度依次为0mmol/L IPTG、0.25mmol/L、0.5mmol/L、0.75mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L。
图5为以0.5mmol/L IPTG诱导重组表达菌株不同时间获得的表达蛋白的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1～7是以0.5mmol/L IPTG诱导的时间依次为0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h。
图6为表达蛋白的可溶性鉴定的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为重组表达菌菌体破碎后上清中的表达产物，泳道2为重组表达菌菌体破碎后的沉淀经复溶后的表达产物。
图7为蛋白纯化条件咪唑结合缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为30mmol/L，泳道2为40mmol/L，泳道3为50mmol/L。
图8为蛋白纯化条件用30mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，咪唑洗脱缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为100mmol/L，泳道2为200mmol/L，泳道3为500mmol/L。
图9为蛋白纯化条件用40mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，咪唑洗脱缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为100mmol/L，泳道2为200mmol/L，泳道3为500mmol/L。
图10为蛋白纯化条件用50mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，咪唑洗脱缓冲液浓度优化的SDS-PAGE结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为100mmol/L，泳道2为200mmol/L，泳道3为500mmol/L。
图11为蛋白纯化条件用50mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，100mmol/L咪咪洗脱缓冲液洗脱蛋白的体积优化的SDS-PAGE结果图，分别为泳道M为蛋白Marker，泳道1～5分别为收集第1、2、3、4、5mL的蛋白。
图12为蛋白纯化条件用50mmol/L咪唑结合缓冲液结合后，200mmol/L咪咪洗脱缓冲液洗脱蛋白的体积优化的SDS-PAGE结果图，分别为泳道M为蛋白Marker，泳道1～5分别为收集第1、2、3、4、5mL的蛋白。
图13为纯化重组蛋白的Western Blotting的结果图；泳道M为蛋白Marker，泳道1为纯化重组蛋白。
图14为CSFV-E2基因片段选择的位置图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
Ⅰ材料
RNA抽提试剂盒购自OMEGA公司；KOD FX酶为TOYOBO公司产品；
PCR清洁试剂盒购自SIMGEN公司；PCR回收试剂盒购自SIGMA公司；
原核表达载体pET-32a购于Novagen公司；
限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、DNA Marker、蛋白Marker、大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21感受态细胞等购自TaKaRa公司；
His-TRAPTM FF Crude纯化柱购自GE Healthcare公司；
猪瘟兔化弱毒细胞苗购自广东永顺生物制药股份有限公司；
ELISA标准试剂盒购自IDEXX公司，标准血清参照IDEXX公司ELISA试剂盒中的阴、阳性猪血清。
Ⅱ具体制备过程
一、纯化的CSFV E2截短蛋白的制备，包含以下步骤：
（1）引物设计
根据Genbank公布的CSFV兔化弱毒株序列（GenBank:Z46258.1），应用Primer5.0生物软件设计引物。引物扩增区域包含E2蛋白A/D区的主要抗原区和对蛋白构象起决定作用3对二硫键区域（区域位置如图14所示），扩增长度为549bp的引物序列如下：
F1（上游引物，从2068-2087）：
5′-GATGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3′；
F2（下游引物，从2589-2616）：
5′-GCGAAGCTT
Figure BDA0000424783020000081
CCCCAACTTACAATAGAATAAATCTTCA-3′；
其中，GAT或GCG为保护碱基，GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点，
Figure BDA0000424783020000082
是终止密码子TAA的反向互补序列；
上述引物由上海生物工程有限公司合成。
（2）RT-PCR扩增目标基因片段：
参照RNA抽提试剂盒（购自OMEGA公司）从猪瘟兔化弱毒细胞苗（广东永顺生物制药股份有限公司）中提取猪瘟病毒RNA，反转录的反应体系为：总RNA12μL、dNTPs 2μL、随机引物1μL、RRI 2μL、AMV 1μL，加ddH2O至总体积为20μL；42℃反转录1h后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，应用上述引物进行PCR扩增，反应体系为10×KOD FX Buffer 2.5μL，dNTPs 10μL，KOD FX 1μL，引物F1 1.5μL，引物F2 1.5μL，cDNA 4μL，加ddH2O至25μL。反应条件为：94℃预变性2min；94℃热变性15s、57℃ 30s、68℃ 45s，共30个循环；68℃ 8min终延伸。用质量体积比1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示。
（3）重组表达质粒pET-32a-CSFV-E2的构建
参照PCR清洁试剂盒（购自SIMGEN公司），纯化PCR产物后，以BamH Ⅰ和HindⅢ分别对纯化后的PCR产物和质粒pET-32a（Novagen公司）进行双酶切，双酶切的反应体系为：BamH Ⅰ和HindⅢ各1μL，10×K buffer 2μL，纯化后的PCR产物或质粒pET-32a 1μg，加ddH2O至20μL。参照PCR回收试剂盒（购自SIGMA公司），将双酶切后的产物分别进行回收，回收产物用T4DNA连接酶（反应体系和反应条件按说明书操作）于16℃进行过夜连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa公司）。用引物F1和F2进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定为阳性克隆菌落进行挑菌在LB（Amp+终浓度为50mg/L）培养基中37℃、200r/min培养过夜，小量制备质粒，经双酶切分析（结果见图2）与测序鉴定，得到的序列与SEQ ID NO.2完全一致，标明获得阳性重组质粒，并将其命名为pET-32a-CSFV-E2。
（4）重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2的构建
将上述阳性重组质粒pET-32a-CSFV-E2及空载体质粒pET-32a分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞（TaKaRa公司），得到重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2及BL21-pET-32a。
（5）重组蛋白诱导表达及表达条件优化
重组蛋白的诱导表达：将上述阳性重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2及BL21-pET-32a分别在Amp+终浓度为100mg/L的LB平板上进行划线培养，分别挑取单菌落与LB（Amp+终浓度为100mg/L）培养基中37℃、200r/min过夜培养，得到活化的菌液；第二天，将活化的菌液分别与LB（Amp+终浓度为100mg/L，）培养基以体积比1：50进行混合，重新37℃、200r/min培养，2～3h后用0.5mmol/LIPTG诱导3h。取1mL菌液离心收集菌体，加入100μL ddH2O重悬和同体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，在水中煮沸10min，进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶的浓度为3%，其中先进行80V 30min，后用120V 50min的电压条件）试验。SDS-PAGE结果见图3。
IPTG诱导浓度、诱导时间优化：按照上述步骤，IPTG浓度分别用0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2mmol/L IPTG以同样的条件分别诱导3h；然后以同样0.5mmol/L IPTG浓度分别诱导0，1，2，3，4，5，6h。将获得的菌体上述步骤进行SDS-PAGE（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶的浓度为3%，其中先进行80V 30min，后用120V 50min的电压条件）试验。SDS-PAGE结果分别见图4和图5。
从图4中可以看出IPTG浓度为0.5mmol/L时能得到大量表达；从图5中可以看出以0.5mmol/L IPTG浓度诱导3h时能得到大量表达；因此，最佳诱导条件为在0.5mmol/L IPTG浓度下诱导3h。
（6）重组蛋白纯化及纯化条件优化、Western blotting鉴定
重组蛋白大量表达：挑上述重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2阳性菌落，接种于1L LB（Amp+终浓度为100mg/L）培养基中，按上述优化的诱导条件进行诱导表达，离心收集菌体，按每100mL菌液离心后收集的菌体加入5mL钠盐缓冲液（Na2HPO4·12H2O 1.7895g，NaH2PO4·2H2O 0.78g，NaCl 14.6075g，定容至500mL，调节pH至7.4。），重悬菌体沉淀，超声破碎离心，分为上清和沉淀（包涵体）。包涵体用5mL 8M尿素钠盐缓冲液（8M尿素与上述钠盐缓冲液混合，得到8M尿素钠盐缓冲液）进行溶解，4℃过夜溶解。溶解后4℃、8000r/min离心15min，取上清；再将上清进行梯度透析复性；作为过柱纯化的预处理样品。将菌体破碎后收集的上清和菌体破碎后得到的包涵体重新溶解后收集的上清，进行SDS-PAGE分析（使用不连续缓冲系统，分离胶的浓度是12%，浓缩胶的浓度为3%，其中先进行80V 30min，后用120V 50min的电压条件），结果如图6所示。从图6中看出，表达蛋白主要以包涵体的形式存在。
重组蛋白纯化条件优化及Western Blotting鉴定：按照GE Healthcare公司His-TRAPTM FF Crude纯化柱说明书进行纯化。分别用30、40、50mmol/L咪唑结合缓冲液各5mL体积结合激活柱子，加入1mL预处理样品，上述各浓度的咪唑结合缓冲液各5mL体积冲洗纯化柱，收集此时各浓度咪唑结合缓冲液，检测重组目的蛋白有无被冲洗下来（见图7），结果显示，并没有目的蛋白被咪唑结合缓冲液冲洗下来。接着再分别用同体积（5mL）的100、200、500mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱柱子，收集各浓度咪唑洗脱缓冲液，检测重组蛋白在哪个浓度可以最大限度洗脱下来（分别见图8、9、10）。选定咪唑结合缓冲液、咪唑洗脱缓冲液的浓度后用不同体积进行洗脱柱子，SDS-PAGE检测哪个体积下就可以将蛋白洗尽，以获得相对多的蛋白（分别见图11、12）。结果显示1mL样品用5mL50mM咪唑结合缓冲液结合，5mL 100mM和2mL 200mM的咪唑洗脱缓冲液洗脱纯化效果最好。
Western Blotting检测纯化蛋白的抗原性（如图13所示）。结果显示纯化的CSFV-E2蛋白具有抗原性。
二、重组蛋白包被板的制备
（1）抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的的选择
通过方阵滴定方法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，结果如表1；从表1可以看出，用包被缓冲液进行稀释抗原，用血清稀释液进行稀释血清，随着抗原浓度的减少和血清稀释度的增大，P/N值不断降低。当重组蛋白1:320稀释，即重组抗原最佳包被浓度为0.313μg/mL，对照血清1:200稀释时，P/N最大。其中，包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，血清稀释液为用PBST洗涤液配制的质量体积比（0.8g/100mL）0.8%的大豆卵磷脂溶液。
表1
Figure BDA0000424783020000111
（2）酶标板选择
以最佳的蛋白浓度及血清稀释度包被Extragene、厦门美怡、Coring、Jet等不同公司生产的四种酶标板，结果如表2，当选择Extragene酶标板时，与其他相比具有最大的P/N值。
表2
Figure BDA0000424783020000112
（3）包被条件、时间优化
按照选定的酶标板，以最佳包被抗原浓度包被，进行4℃包被12h～18h以及先37℃温育1h和2h再4℃过夜等多种包被条件，结果如表3，当选择37℃温育1h再4℃过夜时，P/N有最大值。
表3
Figure BDA0000424783020000121
（4）封闭液及浓度选择
分别用不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）、牛血清白蛋白与酪蛋白、脱脂奶粉、大豆卵磷脂（LHP）对已包被抗原的酶标板进行封闭，结果如表4所示；从表4可以看出P/N值基本随着封闭液浓度降低而减少，遂选择质量体积比（g/mL）8%大豆卵磷脂溶液（PBST洗涤液配制）作为封闭液。
表4
（5）封闭时间优化
按照最佳包被浓度抗原包被酶标板后，用质量体积比（g/mL）8%大豆卵磷脂溶液（PBST洗涤液配制）封闭酶标板，37℃条件下分别采用0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h封闭时间进行封闭，试验结果如表5所示；从表5可以看出，在封闭时间为1.5h时，P/N值最大，因此确定最佳封闭时间为1.5h。
表5
Figure BDA0000424783020000131
综上所述，重组蛋白包被板的制备步骤如下：将纯化的CSFV-E2截短蛋白用包被缓冲液稀释到0.313μg/mL，100μL每孔加到Extragene酶标板，37℃温育1h后，4℃过夜；取过夜包被好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3次，每次3min；200μL/孔质量体积比（g/mL）8%大豆卵磷脂溶液（PBST洗涤液配制）进行封闭，37℃温育1.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3次，每次3min；得到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板。
三、检测猪瘟病毒试剂盒的应用，各条件的优化步骤包括如下：
（1）一抗温育时间优化
使用上述以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，一抗（猪瘟标准阳性血清、阴性血清）在37℃分别温育0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，从表6可以看出，在一抗温育时间为1.5h时，P/N值最大，因此确定最佳一抗温育时间为1.5h。
表6
Figure BDA0000424783020000132
（2）二抗浓度选择
使用上述以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适条件下温育一抗，将按照1:1000、1:3000、1:5000、1:8000、1:10000、1:30000比例稀释的HRP-羊抗猪IgG二抗包被酶标板，试验结果如表7所示；从表7中可以看出，HRP-羊抗猪IgG二抗稀释浓度1:5000稀释时，P/N值最大，因此将1:5000确定为重组蛋白的HRP-羊抗猪IgG二抗的最佳工作浓度。
表7
Figure BDA0000424783020000141
（3）二抗时间优化
使用上述以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适的条件下温育一抗，按照1:5000例稀释的HRP-羊抗猪IgG二抗包被酶标板，在37℃条件下，HRP-羊抗猪IgG二抗作用时间分别采用15、30、45、60、90、120min温育，试验结果如表8，从中可以看出，HRP-羊抗猪IgG二抗孵育时间90min时，P/N值最大，因此确定HRP-羊抗猪IgG二抗温育时间为90min。
表8
Figure BDA0000424783020000142
（4）显色时间优化
使用上述以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，在最适的条件下温育一抗和HRP-羊抗猪IgG二抗后，加入底物显色液后分别作用5、10、20、30、50、80min，试验结果如表9所示，从表9可见，10min时，P/N值最大，因此确定底物显色液的最佳反应时间为室温反应10min。本发明所用的底物显色液（采用4份样品进行试验，证明不同的样品在不同的时间内的差异显著性），在终止反应后几个小时之内测得的数值在比较小的变异范围之内，数值具有可信度，结果见表10。
表9
Figure BDA0000424783020000151
表10
Figure BDA0000424783020000152
（5）临界值界定与敏感性试验
利用已经建立的间接ELISA检测方法对某国外ELISA试剂盒（美国IDEXX公司试剂盒）鉴定CSFV为阴性的检测猪血清16份（广东省）进行检测，试验结果如表11所示，对结果进行统计学分析，得出平均值x=0.120，标准方差SD=0.017，从而计算出x+3SD=0.163为临界值，将OD492nm(样本)≥0.163判为阳性；介于0.149～0.163（OD492nm(样本)+2SD）判为可疑，OD492nm(样本)＜0.149判为阴性。与此同时将CSFV为阳性的猪血清（广东省）进行倍比稀释，可见将其稀释至6400倍时其OD492值为0.209（见表12），大于0.163阳性判定值。
表11
Figure BDA0000424783020000161
表12
Figure BDA0000424783020000162
（6）特异性试验
用本试验建立的猪瘟E2-间接ELISA方法检测JEV、PCV2、PRRSV、PR、细小病毒、FMD病原体阳性血清，同时设猪瘟标准阳、阴性对照（以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）。结果显示如表13所示，除猪瘟阳性血清外，其余血清的OD492nm值均低于0.163，判定为阴性血清，表明建立的ELISA试剂盒特异性比较好。
表13
（7）重复性试验
①批内重复性试验
用同一批次包被的酶标板对8份已知背景的血清（5份阳性血清和3份阴性血清样品，以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）做批内重复试验，每份血清作8个平行，结果如表14所示，从表中可以看出批内变异系数在1.614%～9.595%，都在10%以内，说明该检测方法具有较好的批内重复性。
表14
Figure BDA0000424783020000171
②批间重复试
用同批蛋白在4个不同时间包被的酶标板对6份已知背景的血清（4份阳性血清和2份阴性，以上血清均来自广东省农科院兽医研究所）做批间重复试验，每份血清作8个平行，结果如表15所示，从表中可以看出批间变异系数在5.007～11.412%之间，都在15%以内，说明该检测方法具有较好的批间重复性。
表15
Figure BDA0000424783020000172
Figure BDA0000424783020000181
（8）临床血清样品检测
应用本试验组装的试剂盒检测自广东地区猪场的192份猪血清样本，并与国外某ELISA试剂盒（美国IDEXX公司试剂盒）结果比较，结果显示两者的阳性符合率94.34%，阴性符合率90.91%，总符合率95.31%。
综上所述，检测猪瘟病毒试剂盒的应用，包括如下步骤：
（1）将待检样品（待测猪血清，来自广东省农业科学院兽医研究所）用血清稀释液按体积比1:200稀释，然后按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将标准血清分别按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中，37℃温育1.5h；
（2）用PBST洗涤液进行洗板3次，200μL/孔，每次3min；
（3）将HRP-羊抗猪IgG二抗用PBST洗涤液按体积比1:5000稀释，每个反应孔加100μL，37℃温育90min；
（4）用PBST洗涤液进行洗板4次，200μL/孔，每次3min；
（5）避光条件下每个反应孔加100μL底物显色液，室温避光显色10min；
（6）每个反应孔加50μL终止液终止反应；
（7）在492nm单波长下测OD值；
（8）结果判读：OD492nm(样本)≥0.163判为阳性；OD492nm介于0.149～0.163（OD492nm(样本)+2SD）判为可疑，OD492nm(样本)＜0.149判为阴性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000424783110000011
Figure IDA0000424783110000021
Figure IDA0000424783110000031

Claims (10)

1.一种猪瘟病毒C株E2截短蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利1所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白，其特征在于：编码所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）从猪瘟兔化弱毒细胞苗中提取RNA，反转录成cDNA，以反转录的cDNA为模板，通过引物F1和F2进行PCR，将得到的PCR产物和载体pET-32a分别通过BamH I和Hind III进行双酶切，再将双酶切后的PCR产物和pET-32a连接，通过双酶切和测序鉴定，得到阳性重组质粒pET-32a-CSFV-E2；
F1：5′-GATGGATCCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3′；
F2：5′-GCGAAGCTTTTACCCCAACTTACAATAGAATAAATCTTCA-3′；
（2）将步骤（1）的阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21，得到重组表达菌株BL21-pET-32a-CSFV-E2；
（3）培养步骤（2）中的重组表达菌株，加入IPTG进行诱导表达，获得重组表达蛋白；
（4）将步骤（3）中得到的重组表达蛋白进行可溶性鉴定，将得到的包涵体用8M尿素溶解后进行了透析复性，并利用His-TRAPTM FF Crude纯化柱进行纯化，获得纯化的CSFV-E2截短蛋白；用此纯化蛋白进行Western Blotting鉴定。
4.权利要求1或2所述的猪瘟病毒C株E2截短蛋白在制备检测猪瘟病毒试剂盒中的应用。
5.权利要求4所述的检测猪瘟病毒试剂盒，其特征在于包括如下组分：
以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板、PBST洗涤液、血清稀释液、标准血清、酶标二抗IgG、底物显色液、终止液。
6.根据权利要求5所述的检测猪瘟病毒试剂盒，其特征在于：所述的以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到：将纯化的CSFV-E2截短蛋白用包被缓冲液稀释到0.313μg/mL，100μL每孔加到酶标板，37℃温育1h后，4℃过夜；取过夜包被好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；200μL/孔封闭液，37℃温育1.5h，取封闭好的酶标板，200μL/孔PBST洗涤液洗板3～5次，每次3～5min；得到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板。
7.根据权利要求6所述的检测猪瘟病毒试剂盒，其特征在于：所述的包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述的封闭液为用PBST洗涤液配制的质量体积比8%的大豆卵磷脂溶液。
8.根据权利要求5所述的检测猪瘟病毒试剂盒，其特征在于：所述的PBST洗涤液为加入体积分数0.05%吐温-20的PBS溶液；
所述的血清稀释液为用PBST洗涤液配制的质量体积比0.8%的大豆卵磷脂溶液；
所述的标准血清为CSFV阴性血清和CSFV阳性血清；
所述的酶标二抗IgG为辣根过氧化物酶-羊抗猪IgG二抗；
所述底物显色液包括显色A液、显色B液、显色剂C和显色液D；
所述的终止液优选为2M硫酸。
9.根据权利要求8所述的检测猪瘟病毒试剂盒，其特征在于：所述的底物显色液为通过如下步骤制备得到：将显色A液与显色B液按体积比1:1混匀后，加入40mg/L的显色剂C，反应30min后再加入150μL/L的显色液D，即得底物显色液；
所述的显色A液为柠檬酸水溶液；
所述的显色B液为磷酸盐水溶液；
所述的显色剂C为邻苯二胺；
所述的显色液D为质量体积比30%的H2O2水溶液。
10.权利要求5～9任一项所述的检测猪瘟病毒试剂盒的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）将待检样品用血清稀释液稀释，然后按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将标准血清分别按100μL/孔的量加到以纯化的CSFV-E2截短蛋白作为包被抗原的酶标板中作为对照，37℃温育1.5h；
（2）用PBST洗涤液进行洗板3次，200μL/孔，每次3min；
（3）将酶标二抗IgG用PBST洗涤液稀释，每个反应孔加100μL，37℃温育90min；
（4）用PBST洗涤液进行洗板4次，200μL/孔，每次3min；
（5）避光条件下每个反应孔加100μL底物显色液，室温避光显色10min；
（6）每个反应孔加50μL终止液终止反应；
（7）在492nm单波长下测OD值；
（8）结果判读：OD492nm≥0.163判为阳性；OD492nm介于0.149～0.163判为可疑，OD492nm＜0.149判为阴性。
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