CN103743830A - 一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法，采用杆状病毒的稀释、杆状病毒的固定、杆状病毒的透化、杆状病毒的染色、染色后的杆状病毒在高效液相色谱仪上进行标准曲线的制定和待测样品的定量;按上述方法同时进行待测杆状病毒的稀释、杆状病毒的固定、杆状病毒的透化、杆状病毒的染色、染色后色杆状病毒在高效液相色谱仪上测定样品的最大吸收峰值，根据确立的标准曲线计算样品的待测样品的病毒毒价。采用的新方法与常规方法相比，极大的缩短了杆状病毒定量的时间，提高了病毒定量的灵敏度，降低了实验成本，提高实验功效。
Description
技术领域
本发明涉及对昆虫杆状病毒定量分析，采用的新方法缩短了杆状病毒定量的时间，灵敏度，降低了实验成本，提高实验功效。
背景技术
常规的昆虫杆状病毒定量方法是使用细胞培养液将杆状病毒定进行连续10倍梯度稀释，稀释后将病毒接种于96孔板中，然后将昆虫细胞接种于96孔板中，将96孔板置于27℃恒温培养箱中培养约7日，用间接免疫荧光进行病毒的毒价测定。此方法检测周期为8～9天，毒价的判定受人员和设备的影响而造成差异，导致检测结果的误差。
文献检索披露的昆虫杆状病毒定量的SOP：用昆虫细胞培养液将杆状进行连续10倍梯度稀释(10-1～10-11)，每个稀释度取100μl加至96孔板中(每个稀释倍数做八重复)，然后将昆虫细胞密度调整至约为1×105个细胞/ml，于96孔板中加入100μl/孔的细胞悬浮液，将96孔板置于27℃恒温培养箱中培养约7日，用间接免疫荧光法进行病毒的毒价测定，培养7日后倒去细胞培养液，用4%多聚甲醛固定细胞，加入特异性的一抗和二抗，通过免疫荧光进行判断，用Reed-Muench法计算病毒半数组织感染量（TCID50）。
本发明构思将同一批杆状病毒分别用常规的间接免疫荧光法和高效液相色谱法进行病毒的毒价测定，结果表明前者耗时8天完成了昆虫杆状病毒的毒价测定，而高效液相色谱法用4小时即可完成了杆状病毒的毒价测定，且灵敏度高于前者，达到了设计要求。
发明内容
本发明的目的在于：提供的高效液相色谱仪进行昆虫杆状病毒定量的新方法，与间接免疫荧光法进行昆虫杆状病毒定量的常规方法比较，简单、实用、快捷、灵敏。
本发明是这样实现的：一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法，包括杆状病毒的稀释、杆状病毒的固定、杆状病毒的透化、杆状病毒的染色、染色后的杆状病毒在高效液相色谱仪上标准曲线的建立和待测样本的定量；
溶液制备:
磷酸缓冲液（PBS）:称取磷酸二氢钠38.0g，磷酸氢二钠5.04g，加超纯水至1000ml，混匀。
5%的多聚甲醛固定液:称取多聚甲醛5克，溶解于磷酸缓冲液（PBS）中，定容至100ml，即为5%的多聚甲醛固定液。
进样缓冲液：称取1.36克磷酸二氢钾粉末，加超纯水800ml，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.5，用超纯水定容至1L。
其中1)杆状病毒的稀释：在冻存管中将已知和未知病毒毒价TCID50(半数组织感染量)的杆状病毒分别用磷酸缓冲液（PBS）进行10倍梯度稀释（10-1、10-2…10-7）；然后在冻存管中分别加入850μl的PBS和100μl梯度稀释好的病毒备用；
其中2)杆状病毒的固定：在上述1)冻存管内的杆状病毒中加入20μl5%的多聚甲醛置于4℃，作用1h后，将其在液氮中放至10min后，置于37℃水浴中溶解，固定完毕备用；
其中3)杆状病毒的透化：上述2)固定好的杆状病毒中加入10μl10%的TritonX-100，室温反应5min后，透化完毕备用；
其中杆状病毒的染色：SYBR Green I染料进行200倍稀释，在3)透化好的杆状病毒中加入200μl稀释好的染料，混匀后避光在80℃水浴作用10min，染色完毕备用；
用间接免疫荧光法测定的已知TCID50的杆状病毒作为标准品，按倍数方法稀释成5份，准备制作标准曲线。
其中染色后的杆状病毒在高效液相色谱仪上进行定量：
将上步的稀释的样品混合均匀，使用0.45μm的滤膜进行过滤，抽取200μl滤液加至液相色谱仪的进样管中，使用BioSep SEC-s2000色谱柱，进样缓冲液为pH值7.5的0.1mol磷酸二氢钾溶液，样品温度8℃，柱温60℃，流速1ml/分钟，进样量为5μl，荧光检测波长为概述：最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
利用检测的标准品制作标准曲线，标准曲线确立后，根据此标准曲线可以完成今后待测样品的定量分析。
所述方法，使常规的杆状病毒定量周期由8天缩短为4h，检验周期缩短了约48倍，提高了检测的灵敏度。避免了人为判定造成毒价的误差，同时节省了人力、物力，此法具稳定性和可重复性。
本方法在检测批同批次病毒的前提下，使用高效液相色谱仪定量出的病毒毒价和常规方法定量出的病毒毒价均在同一数量级上，但前者较后者灵敏，而且显著的缩短了检验周期，简化了程序，远远超越了传统的检测方法，彰显技术进步。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
附图1为标准品曲线示意图；
如图所示：该曲线的R2达到0.999542，线性结果良好。
附图2为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013001批次检测毒价结果为3.48×107。
附图3为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013002批次检测毒价结果为5.61×107。
附图4为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013003批次检测毒价结果为9.28×107。
附图5为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013004批次检测毒价结果为9.30×107。
附图6为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013005批次检测毒价结果为5.20×107。
附图7为猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）液相色谱仪检测曲线图；
如图所示：2013006批次检测毒价结果为9.26×107。
具体实施方式
下面将结合实例对发明作进一步说明。
采用间接免疫荧光进行昆虫杆状病毒的定量（猪瘟病毒E2重组杆状病毒为亦为昆虫杆状病毒的一种，以其例阐述）；
其中：猪瘟病毒E2重组杆状病毒稀释
从-70℃冰箱取出6支不同批次的猪瘟病毒E2重组杆状病毒用SF900II无血清昆虫细胞培养液分别进行连续10倍梯度稀释(10-1～10-11)，即取100μl猪瘟病毒E2重组杆状病毒加入到900μl SF900II无血清昆虫细胞培养液，如此稀释，每个稀释度取100μl稀释的猪瘟E2重组杆状病毒液（以下称杆状病毒液）加至96孔板中(每个稀释度数做八重复)。
其中：昆虫细胞Sf-9细胞的接种
将生长致密的昆虫细胞Sf-9细胞从培养箱中取出，倒去细胞瓶中的培养液加入新鲜的SF900II无血清昆虫细胞培养液，用吸管反复吹打贴壁的细胞，使细胞分散成单个细胞；取其中100μl，加900μl的Hanks液，混匀后滴于细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞；计数完毕后将细胞稀释到1.0×105/ml，加入上述接毒后的96孔细胞培养板内，每孔100μl含有1.0×104个细胞，然后置于27℃恒温培养箱中培养，连续培养7天；
其中：细胞的固定
培养7日后取出细胞板，将病毒液倒入含有2%NaOH的废液桶中，每孔加入200μl的PBST(0.1mol/L的PBS中加入0.05%的吐温20，以下同)洗6次后，每孔加入100μl的4%的多聚甲醛，固定10分钟。
其中：一抗的反应
固定完毕后每孔加入200μl的PBST洗6次，以1%PBA（PBS+1%BSA）1000倍稀释一抗每孔加入50μl的一抗，置于室温反应1小时后,每孔加入200μl的PBST洗6次。
其中：二抗的反应
以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG二抗(避光)，每孔加入50μl的FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，避光置于室温反应1小时。然后每孔加入200μl的PBST洗4次；
其中：病毒毒价判定
将PBST倒干后，再加入50μl PBST，于倒立荧光显微镜下判读CSFV-rBaculovirusE2病毒毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID50/ml表示，即获得该病毒的毒价。
采用高效液相色谱仪进行昆虫杆状病毒的定量
其中杆状病毒的稀释：从-70℃冰箱取出6支不同批次的猪瘟病毒E2重组杆状病毒（与间接免疫荧光方法使用的为同批次病毒）和一支已知病毒毒价为1.0×108的杆状病毒（病毒毒价用间接免疫荧光检测三次后取其平均值所得）的杆状病毒同时用磷酸缓冲液（PBS）分别进行10倍梯度稀释（10-1、10-2…10-7）；然后在冻存管中加入850μl的PBS和100μl梯度稀释好的病毒备用；
其中杆状病毒的固定：在上述冻存管中稀释好的950μl杆状病毒加入20μl5%的多聚甲醛置于4℃作用1h后，将其在液氮中放置10min后在37℃水浴中溶解，固定完毕备用；
其中杆状病毒的透化：固定好的杆状病毒中加入10μl10%的TritonX-100，室温反应5min后，透化完毕备用；
其中杆状病毒的染色：SYBR Green I染料原液进行200倍稀释，在固定好的杆状病毒中加入200μl的稀释好的染料，混匀后避光在80℃水浴作用10min，染色完毕备用；
用免疫荧光法测定的已知TCID50的杆状病毒作为标准品，按倍数方法稀释成5份，准备制作标准曲线；待测样品以相同方式处理。
其中染色后的杆状病毒在高效液相色谱仪上的定量：
将上步的1×细胞培养基，混合均匀，使用0.45μm的滤膜进行过滤，将滤液200μl加入到液相色谱仪的进样管中，使用BioSep SEC-s2000色谱柱，进样缓冲液为pH值7.5的0.1mol磷酸二氢钾溶液，样品温度8℃，柱温60℃，流速1ml/分钟，进样量为5ul，荧光检测波长为概述：最大吸收波长为497nm,发射波长最大为520nm。
取间接免疫荧光法测得的100×106样品作为标准品，并用0.45μm的滤膜进行过滤后，进行倍数稀释，见表1：
表1标准品倍数稀释
| 编号 | 稀释后重组杆状病毒病毒毒价（TCID50/ml） |
| STD1 | 100×106 |
| STD2 | 50×106 |
| STD3 | 25×106 |
| STD4 | 12.5×106 |
| STD5 | 6.25×106 |
将稀释后的样品取200μl加入到液相色谱仪的进样管中，使用BioSepSEC-s2000色谱柱，进样缓冲液为pH值7.5的0.1mol磷酸二氢钾溶液，样品温度8℃，柱温60℃，流速1ml/min，进样量为5μl，荧光检测波长：最大吸收波长为497nm，发射波长最大为520nm，每个标准品进行2重复进样，利用检测到的标准品制作标准曲线（见图1），该曲线的R2达到0.999542，线性结果良好，达到了我们的预期。
为了验证该方法的可行性及准确性，挑选了6个不同批次的猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2），利用间接免疫荧光法和液相色谱法分别进行定量，比较两种方法间的差别。
根据标准曲线图谱，计算出2013001-2013006这6批次猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）的毒价，结果见表2。
表2液相色谱法定量猪瘟病毒E2重组杆状病毒毒价结果
| 批次 | 保留时间(分钟) | 峰面积 | 病毒毒价 |
| 2013001 | 2.852 | 958401 | 3.48×107 |
| 2013002 | 2.839 | 1543764 | 5.61×107 |
| 2013003 | 2.832 | 2552625 | 9.28×107 |
| 2013004 | 2.833 | 2558404 | 9.30×107 |
| 2013005 | 2.820 | 1430552 | 5.20×107 |
| 2013006 | 2.831 | 2548507 | 9.26×107 |
上述的实验结果分析，见下表3。
表3猪瘟病毒E2重组杆状病毒病毒毒价（TCID50/ml）
| 批次 | 间接免疫荧光法 | 高效液相色谱法 |
| 2013001 | 3.2×107 | 3.48×107 |
| 2013002 | 5.5×107 | 5.61×107 |
| 2013003 | 8.9×107 | 9.28×107 |
| 2013004 | 9.0×107 | 9.30×107 |
| 2013005 | 5.0×107 | 5.20×107 |
| 2013006 | 9.3×107 | 9.26×107 |
由以上表格数据得知：通过已知杆状病毒毒价建立标准曲线，通过标准曲线对待测病毒毒价进行测定，该方法具有检测周期短、灵敏度高、结果稳定、批间差异小等优势，为细胞生长提供了最适合的环境，是常规方法无可比拟的。
本研究选用的猪瘟病毒E2重组杆状病毒（CSFV-rBaculovirusE2）由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司构建、传代和保存。CSFV-rBaculovirusE2应用Gateway系统构建，将优化后的猪瘟病毒的E2基因克隆到转移载体上，与商品化的昆虫杆状病毒进行重组，在重组过程中加入Ganciclovir药物抑制未重组的杆状病毒，最终获得CSFV-rBaculovirusE2。将获得的CSFV-rBaculovirusE2在Sf-9细胞上进行传代，收获后冻存于-70℃冰箱备用。
本研究所用BioSep-SEC-S2000色谱柱购自Phenomenex，型号：300x7.80mm；高效反相液相色谱仪购自Waters公司，型号：2695+2475荧光检测器；冻存管为Nuc公司生产，货号：5000-0012C；多聚甲醛为Sigma公司生产，货号：P-6148；TritonX-100购自AMRESCO公司，货号：N1663-2；SYBR Green I染料为roche公司生产，货号：4673492001；SF900II无血清昆虫细胞培养基购自Gibco公司，货号：10902。FITC标记的兔抗猪的IgG二抗购自Sigma公司，货号：bsF-0309R。牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司，货号：A2153。
Claims (2)
1.一种用高效液相色谱仪进行杆状病毒定量的新方法，其特征在于：分步骤实施：
1）杆状病毒的稀释：在冻存管中将已知和未知病毒毒价TCID50的杆状病毒分别用磷酸缓冲液进行10倍梯度稀释；然后在冻存管中分别加入850μl的磷酸缓冲液和100μl梯度稀释好的病毒备用；
2）杆状病毒的固定：取1）稀释好的950μl杆状病毒，加入20μl 5%的多聚甲醛置于4℃作用1h后，将含有病毒的冻存管置于液氮中，放至10-12min，在37℃水浴中溶解，固定完毕备用；
3）杆状病毒的透化：取2）固定好的970μl杆状病毒，加入10μl 10%的TritonX-100，室温反应5-6min，透化完毕备用；
4）杆状病毒的染色：取3）透化好的980μl杆状病毒中加入200μl的稀释好的染料，混匀后避光在80℃水浴作用10min，染色完毕备用；
5）将染色后的杆状病毒，用0.45μm的滤膜过滤，取滤液200μl加入到液相色谱仪中检测，其中检测使用BioSep SEC-s2000 色谱柱，上样缓冲液为pH值7.5的0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液，样品温度8℃，柱温60℃，流速1ml/min，上样量为5μl，荧光检测的吸收波长为 497nm，发射波长为520nm；
6）取已知TCID50的杆状病毒100μl，按倍数方法稀释制作标准曲线,利用标准曲线，得到6批未知样品的定量分析结果。
2.按照权利要求1所述的新方法，其特征在于：试验所用的制剂均为市售产品。
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