CN101875980A

CN101875980A - 一种用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101875980A
Application number: CN2010102278808A
Authority: CN
Inventors: 张庆利; 黄倢; 王勤涛; 杨冰
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: CN101875980B

Abstract

本发明涉及一种用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及缩短待检测样品核酸制备时间的快速干燥液等。本发明的试剂盒结合了等温扩增和染料快速检测的优点，检测过程无需昂贵的仪器设备；同时采用内置染料的方法进行显色，提高了检测的可靠性。本试剂盒检测成本低，使用方便，且对人和环境都非常安全，可以替代已有的相关检测方法。本发明的试剂盒可在野外的生产现场使用，对于加强罗氏沼虾诺达病毒监测、防止其大规模爆发流行，具有重大的推广应用价值。

Description

一种用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是一种用于罗氏沼虾诺达病毒(MacrobrachiumrosenbergiiNodavirus，简称MrNV)的试剂盒及检测方法。

背景技术

罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)是一种无囊膜的RNA病毒，大小约26-27nm，呈二十面体状，其基因组由两条单链RNA组成；常与罗氏沼虾诺达病毒伴随出现的还有一种被称作极小病毒(Extra smallvirus，简称XSV)的卫星病毒，XSV大小约14-16nm，其基因组由一段RNA组成。该病毒主要感染罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)，侵染部位主要是虾的横纹肌肌肉以及肝胰腺结缔组织，感染虾的体干呈乳色，不透明，所以又称被称为白尾病(White tail disease，简称WTD)、肌肉白浊病(White muscledisease，简称WMD)，该病毒感染可引起高达90％的死亡率。该病毒目前主要分布于法属西印度群岛、泰国、印度。1996年我国在广东、广西一带发现该病毒，此后该病毒迅速传播到江苏、浙江、上海等地；2001年起，该病开始在各主要罗氏沼虾苗种场广泛流行，已成为罗氏沼虾养殖业的主要威胁。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测罗氏沼虾诺达病毒，加强虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，以预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。

目前，罗氏沼虾诺达病毒检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法、抗体杂交法和RT-PCR检测法。病理切片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；用抗体检测法检测罗氏沼虾诺达病毒虽然在速度上优于病理切片法，但其灵敏度较低，在罗氏沼虾诺达病毒尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；罗氏沼虾诺达病毒的RT-PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对罗氏沼虾诺达病毒的相对快速、准确检测，但由于常规的RT-PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。

进行罗氏沼虾诺达病毒早期检测并采取预防措施是水产养殖中降低罗氏沼虾诺达病毒流行风险、减少发病造成的巨额经济损失的有效手段。所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的罗氏沼虾诺达病毒检测试剂盒就显得极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒及检测方法，以弥补现有技术的不足，使之适用于生产现场快速、高灵敏度的检测罗氏沼虾诺达病毒。同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，使罗氏沼虾诺达病毒的检测更加灵敏准确、快速和方便。

本发明利用针对罗氏沼虾诺达病毒的衣壳蛋白基因中保守区段设计的4条特异性引物、一种反转录酶和一种DNA聚合酶，利用等温扩增方法来完成对目的核酸片段的扩增，省略了反转录的步骤。并且，同常规PCR方法相比，等温扩增所有的步骤都是在60～65℃的某一恒定温度下进行的。从而可以实现罗氏沼虾诺达病毒的现场检测。同时，为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染，使检测实验能够在养殖现场开展，本发明对罗氏沼虾诺达病毒的检测方法进行了优化：

1、缩短了待检测样品核酸制备的时间

在用FTA卡制备待检测样品核酸的标准步骤中，需要将样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗。而本发明通过在待检测样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(例如：叔醇、伯醇或仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。

2、优化了扩增样品的检测步骤

在利用环介导等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加染料以判断检测结果的方法。由于等温扩增反应的产物量大，这种打开反应管再添加染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性。为了克服这一问题，已有技术采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本。而本发明通过在用于扩增反应的小管内预置染料的方法，可有效消除污染风险，又不增加成本。第一种方法是将金属离子与钙黄绿素形成的配合物(即染料)与扩增反应液预先混合，置于扩增反应小管内；第二种方法是先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合；这样扩增反应结束后无须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。

另外，在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；而本发明无需专门的纯化试剂，只采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，这不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。为了使该检测方法在生产现场具有更强的实用性，本发明在优化检测方法的基础上，将检测罗氏沼虾诺达病毒所需的试剂及器材进行了组装、配套，使之标准化，形成了检测试剂盒。

本发明的技术方案包括：

1、用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒，包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂4～10mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄1～4mM，(NH₄)₂SO₄6～12mM，TritonX-1000.05％～1.0％，反转录酶1～20U，BstDNA聚合酶2～20U；染料可以选金属离子与钙黄绿素形成的配合物，也可以选任一种核酸染料，核酸染料为分子生物学研究中常用的染料，包括SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM、GeneFinder^TM等。金属离子与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中，而核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；

(5)阴性对照管，装有无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，装有吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；

(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。

上述的扩增引物是根据罗氏沼虾诺达病毒衣壳蛋白保守区序列设计的，其核苷酸序列如下：

上游引物1：5′-AGCCTGCCTAAGTAACTGATCAATTTTGATACAAATCCACTAGATGACC-3’

下游引物1：5′-CGCGGCAGTGGAATTTCTCTTTTTGATCATCACGCCTGACAA-3’

上游引物2：5′-GCTTGCCAACTTATTGGTT-3’

下游引物2：5′-ACGTTCTCTTTATCTTGACCA-3’。

使用上述的引物，并采用试剂盒中的扩增反应液对诺达病毒的核酸样品进行扩增，扩增产物电泳检测后测序，测序结果表明扩增得到的产物为罗氏沼虾诺达病毒的对应片段；而用不含诺达病毒的核酸样品进行扩增，结果扩增反应不能发生。

2、本发明的试剂盒的检测方法，按下列步骤进行：

(1)取样品组织约0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1～20min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片；

(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55～65℃条件下保温40～70min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动1-3min；

(7)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阴性。

在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片从阴性对照管中取出、作为阳性对照的吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片从阳性对照管中取出，同吸附了样品核酸的FTA膜片一起分别处理，直至完成检测。

本发明的试剂盒中汇集罗氏沼虾诺达病毒现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得罗氏沼虾诺达病毒的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化。而依据罗氏沼虾诺达病毒衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测罗氏沼虾诺达病毒的所有毒株，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，使检测特异性高。采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。本发明将目的核酸的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅需1.5～2小时就可完成罗氏沼虾诺达病毒的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别。与罗氏沼虾诺达病毒已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代罗氏沼虾诺达病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和RT-PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强罗氏沼虾诺达病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

具体实施方式

实施例1

本发明的检测试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，分别装有20μL的TE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH8.0)；

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有24μL扩增反应液和1μL的染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl₂8mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，Triton X-1000.1％，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U；染料为50μM钙黄绿素和氯化锰形成的配合物；

(5)阴性对照管，1个，内装无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，1个，内装吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；

包装盒内装一块有4×6个小孔的海绵块，各个管插在小孔中，同时有使用说明书1份。

实施例2

本发明的检测试剂盒也可由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，分别装有20μL的TE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH8.0)

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25μL扩增反应液和1μL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl₂8mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-1000.1％，反转录酶5U，BstDNA聚合酶8U；核酸染料1μL，成份为稀释10倍的GeneFinder^TM，且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

实施例3

使用本发明的检测试剂盒检测罗氏沼虾诺达病毒的方法如下：

(1)取样品组织约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；

(5)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，57℃保温60min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动2min；

(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阴性；即颜色变化作为检测的样品是否存在诺达病毒的定性数据。

在上述步骤中从第4步开始，应将无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片、吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。阴性对照的扩增检测管应为橙黄色，而阳性对照的扩增检测管应为绿色。

实施例4

使用本发明试剂盒检测饵料中病毒存在情况

使用实施例1或实施例2中的检测试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取罗氏沼虾鲜活饵料约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(6)将扩增检测管上下反复甩动2min；

(7)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阴性。

在上述步骤中从第4步开始，应将无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片、吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。

实施例5

为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用现有的Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明试剂盒从感染诺达病毒的虾中制备病毒核酸样品。

首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备病毒核酸样品：

(1)取约10-20毫克的虾附肢放入1.5mL离心管中，加入100μL份PBS缓冲液，用研磨棒将附肢研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加25μL；

(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；

(4)用一个钻取工具从所上述干燥后的FTA卡上取下直径约2.0mm的圆片，放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入200μLFTA纯化试剂(Whatman产品编号：WG120204)，静置5分钟；

(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；

(7)重复步骤(5)——(6)两次；

(8)在上述离心管中加入200μLTE缓冲液(10mMTris-HCl，0.1mMEDTA，pH8.0)，静置5分钟；

(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；

(10)重复步骤(8)——(9)两次；

(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。

利用本发明试剂盒按下面的步骤制备虾病毒核酸：

(1)取约10-20毫克的虾附肢放入1.5mL离心管中，用研磨棒将虾附肢研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加5μL；

(3)将3个FTA卡上分别滴加100μL甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3～5分钟；

(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2.0mm的圆片放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入800μL灭菌水，剧烈震荡3分钟；

(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。

从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采样本发明试剂盒大约只需要6～10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。

实施例6

Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸样品和本发明试剂盒制备的核酸样品得效果对比。

用实施例5中Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明试剂盒制备的虾病毒核酸样品分别作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25μL扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.5μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.3μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.5mM，MgCl₂7mM，Betaine(甜菜碱)1.3M，Tris-HCl20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，TritonX-10.1％，反转录酶2U，BstDNA聚合酶8U；等温扩增反应条件为：58℃保温60分钟，然后90℃保持5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现，利用本发明试剂盒(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。

综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法不仅可以应用于虾样品中罗氏沼虾诺达病毒的检测，还可应用于虾饵料中罗氏沼虾诺达病毒的检测。

本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA卡片裁切成尺度为长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片即可制成FTA膜片。

本发明的试剂盒所使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、TritonX-100购自上海生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇、钙黄绿素、氯化锰等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶、反转录酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinddr^TM购自厦门百维信生物科技有限公司。

Claims

1.一种用于检测罗氏沼虾诺达病毒的试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料；

(5)阴性对照管，内装无罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，内装吸附了罗氏沼虾诺达病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液；内装亲水性且易挥发的醇类物质；

(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述的染料为钙黄绿素或分子生物学中应用的核酸染料，核酸染料包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM或GeneFinder^TM。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于上述的钙黄绿素染料与扩增检测管内的扩增反应液混合。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于上述的核酸染料粘附于扩增检测管内。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的FTA膜片是由英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于1平方毫米的纸片。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的扩增反应液由以下组份组成：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂ 4～10mM，甜菜碱0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄ 6～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％，反转录酶1～20U，具有链置换活性的DNA聚合酶2～20U。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增反应液中的扩增引物的核酸序列是：

上游引物1：

5′-AGCCTGCCTAAGTAACTGATCAATTTTGATACAAATCCACTAGATGACC-3’

下游引物1：

5′-CGCGGCAGTGGAATTTCTCTTTTTGATCATCACGCCTGACAA-3’

上游引物2：5′-GCTTGCCAACTTATTGGTT-3’

下游引物2：5′-ACGTTCTCTTTATCTTGACCA-3’。

8.权利要求1所述检测试剂盒应用于检测罗氏沼虾诺达病毒。

9.使用权利要求1所述检测试剂盒检测罗氏沼虾诺达病毒的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)取样品0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置1～20min；

(6)将扩增检测管上下反复甩动1-3min

(7)向下甩动扩增检测管，直接观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样品的罗氏沼虾诺达病毒检测结果为阴性。