CN102140542B - 一种用于快速检测马铃薯y病毒的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及马铃薯Y病毒(Potato virus Y，简称PVY)的快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。该快速检测试剂盒包含采样管、漂洗管、核酸变性管、扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、快速干燥液、分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管等，形成的检测方法简化了操作步骤，降低了实验成本，在田间或室内具有更强的实用性。

Description

一种用于快速检测马铃薯Y病毒的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体涉及马铃薯Y病毒(Potato virus Y，简称PVY)的快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

马铃薯Y病毒的基因组是单一RNA正链，其粒体为微弯曲线状，大约长680～900nm，宽11～12nm。从1953年起马铃薯Y病毒在欧洲尤其在马铃薯广泛种植的地区流行，20世纪70年代在美洲扩展，中国东北烟区、黄淮地区和西南烟区等都有发生。如果在烟草移栽4周内感染马铃薯Y病毒脉坏死株系，可导致绝产绝收，即使在临近收获期感染该病毒病，也会导致25～45％的损失，此外更为严重的是烟草病叶烤晒后色泽和烟味较差，其品质大为降低。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测PVY，加强烟草育苗和田间环境的监测，以预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国烟草行业健康持续发展就显得尤为迫切和重要。

目前用于烟草病毒检测的方法主要有生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技术(ELISA)以及分子生物学等方法：生物学方法主要是鉴别寄主反应或指示植物等，这种仅仅以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法，虽曾广泛运用，却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；酶联免疫吸附技术(ELISA)虽具简便、快速等优点，但灵敏度较差，且存在非特异性反应，在PVY尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测烟草普通花叶病毒。近年来发展起来的以分子生物学技术为基础的病毒检测方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板杂交等检测方法，克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了烟草普通花叶病毒的相对快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统，使得RT-PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了RT-PCR检测方法在生产中的推广应用。

进行马铃薯Y病毒早期检测并采取预防措施是烟草生产中降低烟草花叶病毒流行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的检查方法，并开发适于现场应用的马铃薯Y病毒检测试剂盒就显得极为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的马铃薯Y病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使PVY的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

首先，本发明针对PVY的衣壳蛋白基因中保守区段设计4条特异引物，利用反转录酶和DNA聚合酶，无需单独对目的核酸(RNA)进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对PVY的快速和高灵敏检测。

为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在田间开展，本发明对PVY的检测方法进行了优化。现在技术中，在用FTA卡(英国Whatman公司)制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇等)，使润湿的FTA膜片在室温条件下仅需几分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。

在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果。由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；已有报道和已公开专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本。本发明通过在用于扩增反应的小管内预置染料的方法，可有效消除污染风险，又不增加成本。本发明采用两种方法解决上述问题，其一是将金属离子与钙黄绿素形成的配合物(即染料)与扩增反应液预先混合，置于扩增反应小管内；其二是先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合；这样反应结束后无须打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续待检样品被污染的风险。

现在技术中，在用FTA卡制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片。本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，不仅简化了检测的操作步骤，还降低了实验成本。

为了使本发明的检测方法在田间或室内具有更强的实用性，本发明在上述优化整个检测方法的基础上，将检测PVY病毒所需的试剂及器材进行了组装、配套，使之标准化，形成了检测试剂盒。

本发明的马铃薯Y病毒快速检测试剂盒包含：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装灭菌蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl24～10mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.2M，Tris-HCl10～40mM，KCl10～20mM，MgSO₄1～4mM，(NH₄)₂SO₄6～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％(质量体积比)，反转录酶1～20U，Bst DNA聚合酶2～20U；染料可以是金属离子与钙黄绿素形成的配合物(金属离子/钙黄绿素摩尔比例为5～0.5∶1，优选为钙黄绿素和氯化锰形成的配合物)，也可以选核酸染料，只需其中一种即可；金属离子与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中；核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧，核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green I、GelRed、GelGreen、GoldView、GeneFinder等；

(5)阴性对照管，内装无马铃薯Y病毒核酸核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，内装吸附了马铃薯Y病毒核酸核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；

(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。

上述的扩增引物是根据PVY衣壳蛋白保守区序列设计的，其核苷酸序列如下：

上游引物1：5′-ACCCACATCCCGCAGATTTCGTTTTATGCGCAACAAAAAGGAACC-3’(SEQ IDNO：1)

下游引物1：5′-ACATCACGAACACCAGTGAGGGTTTTTTTCAATGCTGCGGCCTTC-3’(SEQ ID NO：2)

上游引物2：5′-CTCAGATGTTGCAGAAGCGT-3’(SEQ ID NO：3)

下游引物2：5′-AAGTCGAGGTTGGGCTGA-3’(SEQ ID NO：4)。

用本发明的检测试剂盒检测PVY的方法，包括下列步骤：

(1)取样品组织0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于FTA膜片上，静置1～20min；

(4)用牙签将上述吸附了样品核酸的FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片；

(5)用牙签将上述漂洗管内的膜片转移到的核酸变性管内，70℃保温5分钟，然后再迅速置于冷水中或室温条件下2分钟；

(6)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55～65℃条件下保温40～70min；

(7)将扩增检测管上下反复甩动1-3min；用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的PVY检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的PVY检测结果为阴性。

从第(4)步骤开始，将作为阴性对照的无马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片，转移到漂洗管内并完成后续步骤作为对照。

本发明的积极效果在于：本发明的试剂盒中汇集PVY快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得PVY的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依据优选的PVY衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测几乎所有PVY的病毒株系，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。本发明将目的核酸(RNA)的反转录和扩增结合起来同步进行，节省了时间，仅需1.5～2小时就可完成PVY的检测；并且检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别；与PVY已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代马铃薯Y病毒之前的相关检测方法如生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技术(ELISA)和RT-PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室内使用，也可在野外的生产现场使用，对加强PVY的流行病学监测和病害防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。本发明中所述的FTA膜片是将英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片，即制成FTA膜片。

实施例1本发明的检测试剂盒由以下部件组成(以可检测4个样品的包装为例，也可据此原理设计为检测多个样品)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的灭菌蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和1mMEDTA，pH8.0)；

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有24μL扩增反应液和1μL的染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.6mM，MgCl₂7mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH4)₂SO₄10mM，Triton X-1000.1％(质量体积比)，反转录酶5U，BstDNA聚合酶8U；

染料为50μM钙黄绿素和氯化锰形成的配合物(氯化锰/钙黄绿素的摩尔比例为5～0.5∶1)；

(5)阴性对照管，1个，内装无马铃薯Y病毒(PVY)核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，1个，内装吸附了马铃薯Y病毒(PVY)核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4×6个，用于盛放上述部件及试剂；

(10)使用说明书，1份。

实施例2本发明的检测试剂盒也可由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和1mMEDTApH8.0)；

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25μL扩增反应液和1μL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl28mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，Triton X-1000.1％(质量体积比)，反转录酶5U，Bst DNA聚合酶8U；核酸染料1μL(稀释10倍的GeneFinder)，且核酸染料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。

(5)阴性对照管，1个，内装无马铃薯Y病毒(PVY)核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，1个，内装吸附了马铃薯Y病毒(PVY)核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4×6个，用于盛放上述部件及试剂；

(10)使用说明书，1份。

实施例3使用本发明的检测试剂盒检测马铃薯Y病毒的检测效果实验

(1)分别取马铃薯Y病毒感染和非感染的样品组织约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；

(4)用牙签将上述吸附了样品核酸的FTA膜片转移到漂洗管内，同时将无马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片(阴性对照)和吸附了马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片(阳性对照)转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；

(5)用牙签将上述漂洗管内的膜片转移到相应编号的核酸变性管内，70℃保温5分钟，然后再迅速置于冷水中或室温条件下2分钟；

(6)再用牙签将上述核酸变性管内的全部FTA膜片分别转移到扩增检测管内，57℃保温60min；

(7)将扩增检测管上下反复甩动2min；

(8)然后用力向下甩动扩增检测管，用眼睛观察扩增反应液。

结果显示，马铃薯Y病毒感染样品和阳性对照均呈现绿色，非马铃薯Y病毒感染样品和阴性对照均呈现橙黄色，证明检测快速灵敏、结果可靠。

实施例4利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法制备马铃薯Y病毒核酸的效果对比

1、为了验证本发明中快速核酸制备方法制备核酸的效果，分别利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法和本发明快速核酸制备方法分别从感染PVY的烟草叶片中制备病毒核酸。

首先利用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备病毒核酸：

(1)取约10-20毫克感染马铃薯Y病毒的鲜烟叶放入1.5mL离心管中，加入100μLPBS缓冲液，用研磨棒将烟叶研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加25μL；

(3)将加好样品的FTA卡室温放置干燥至少一个小时；

(4)用一个钻取工具从上述干燥后的FTA卡上取下直径约2.0mm的圆片，放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入200μLFTA纯化试剂(Whatman公司产品编号：WG120204)，静置5分钟；

(6)用吸液管将离心管内的FTA纯化试剂全部吸出；

(7)重复步骤(5)——(6)两次；

(8)在上述离心管中加入200μLTE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)，静置5分钟；

(9)用吸液管将离心管内的TE缓冲液全部吸出；

(10)重复步骤(8)——(9)两次；

(11)将上述离心管内的圆片在室温下干燥大约一个小时，圆片即可用于核酸的扩增了。

本发明的快速核酸制备方法按下面的步骤制备马铃薯Y病毒核酸：

(1)取约10-20毫克感染马铃薯Y病毒的鲜烟叶放入1.5mL离心管中，用研磨棒将烟叶研磨成浆状；

(2)用吸液管将研磨的组织匀浆液加到3个FTA卡的样品圆圈内，大约每个圆圈加5μL；

(3)将3个FTA卡上分别滴加100μL甲醇、无水乙醇和异丙醇，室温放置3～5分钟；

(4)用一个钻取工具从所上述3个FTA卡上分别取下直径约2.0mm的圆片放进1.5mL离心管中；

(5)在上述离心管中加入700μL灭菌水，剧烈震荡3分钟；

(6)取出离心管内的圆片即可用于核酸的扩增了。

从上述过程中可以看出，采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法大约需要2个多小时才能完成核酸制备，而采用本发明的快速核酸制备方法大约只需要6～10分钟就可以完成核酸制备；所以与Whatman-FTA卡标准核酸制备方法相比，本发明的快速核酸制备方法具有操作简单、快速的优点。

2、效果对比

分别以上述方法制备的马铃薯Y病毒核酸作为模板，进行等温扩增反应，每个扩增反应中含25μL扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.6mM，MgCl₂7mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，Triton X-1000.1％，反转录酶2U，Bst DNA聚合酶8U；等温扩增反应条件为：60℃保温60分钟，然后85℃保持5分钟；最后将每个反应管中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

结果发现，利用本发明快速核酸制备方法(制备核酸过程中采用了甲醇、无水乙醇和异丙醇等挥发性醇类作为快速干燥液)制备的核酸均可以有效用作等温扩增反应的模板，并且扩增效果略好于采用Whatman-FTA卡标准核酸制备方法制备的核酸的扩增效果。

本发明的试剂盒所使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、Triton X-100购自TOYOBO生物工程有限责任公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇、钙黄绿素、氯化锰等购自国药集团化学试剂北京有限公司；等温扩增用的Bst DNA聚合酶购自NEB公司；反转录酶购自FERMENTAS生物有限公司；核酸染料SYBR Green I、GelRed、GelGreen、GoldView、GeneFinder购自北京索莱宝生物科技有限公司。

Claims (7)

1.一种用于快速检测马铃薯Y病毒的试剂盒，其特征在于包含： 

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品； 

(2)漂洗管，内装灭菌蒸馏水； 

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液； 

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和染料； 

(5)阴性对照管，内装无马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片； 

(6)阳性对照管，内装吸附了马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片； 

(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质； 

(8)分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管； 

所述TE缓冲液含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0； 

所述的扩增反应液组成成分如下：如SEQ ID NO：1所示的上游引物1和如SEQ ID NO：2所示的下游引物1各1～2μM，如SEQ ID NO：3所示的上游引物2和如SEQ ID NO：4所示的下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂4～10mM，甜菜碱0.6～1.2M，Tris-HCl10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄1～4mM，(NH₄)₂SO₄6～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％(W/V)，反转录酶1～20U，Bst DNA聚合酶2～20U； 

所述的染料是氯化锰与钙黄绿素形成的配合物，或者是核酸染料。 

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于： 

所述的氯化锰与钙黄绿素形成的配合物预混于扩增反应液中；所述的核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧。 

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于： 

核酸染料选自SYBR Green I、GelRed、GelGreen、GoldView或GeneFinder。 

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于： 

氯化锰/钙黄绿素的摩尔比例为5～0.5∶1。 

5.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述的FTA膜片是将英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片。 

6.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测马铃薯Y病毒上的应用。 

7.用权利要求1-5任一所述的试剂盒检测马铃薯Y病毒的方法，包括下列步骤： 

(1)取样品组织0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状； 

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿； 

(3)吸取快速干燥液滴于FTA膜片上，静置1～20min； 

(4)用牙签将上述吸附了样品核酸的FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片； 

(5)用牙签将上述漂洗管内的膜片转移到核酸变性管内，70℃保温5分钟，然后再迅速置于冷水中或室温条件下2分钟； 

(6)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55～65℃条件下保温40～70min； 

(7)将扩增检测管上下反复甩动1-3min；用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的PVY检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的PVY检测结果为阴性。

8、如权利要求7的方法，其特征在于： 

从第(4)步骤开始，将作为阴性对照的无马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了马铃薯Y病毒核酸的FTA膜片，转移到漂洗管内并完成后续步骤作为对照。