CN103898228B - 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记 - Google Patents

一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记 Download PDF

Info

Publication number
CN103898228B
CN103898228B CN201410150470.6A CN201410150470A CN103898228B CN 103898228 B CN103898228 B CN 103898228B CN 201410150470 A CN201410150470 A CN 201410150470A CN 103898228 B CN103898228 B CN 103898228B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tobacco
molecule marker
pvy
seqidno
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410150470.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103898228A (zh
Inventor
刘勇
王丙武
宋中邦
高玉龙
李文正
谢贺
杨大海
陈学军
肖炳光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Original Assignee
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences filed Critical Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority to CN201410150470.6A priority Critical patent/CN103898228B/zh
Publication of CN103898228A publication Critical patent/CN103898228A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103898228B publication Critical patent/CN103898228B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学领域，是一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，该分子标记含有Seq？ID？No.1所示序列。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在烟草抗病资源筛选和抗病育种辅助选择中的用途。本发明的分子标记将基因组DNA序列与烟草PVY抗性基因联系起来，有利于烟草分子标记育种辅助选择体系的建立；所述分子标记与烟草PVY抗性基因的紧密连锁，连锁距离为0.99cM。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于烟草育种实践。

Description

一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种分子标记，特别是涉及一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记。本发明还涉及扩增该分子标记的引物、该分子标记和引物在烟草PVY抗病基因定位或烟草遗传育种中的用途。
背景技术
马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）能侵染34个属170多种植物，对茄科作物（如：烟草、马铃薯、辣椒、番茄等）危害较重。PVY侵染烟草的病害又称为烟草脉斑病，是一种世界性的流行病害，由于缺乏抗病主栽品种和综合防治措施难以落实，在我国烟区危害严重。PVY的侵染可使烟草产量减少7%-18%，产值减少11%-80%。1989年，烟草脉斑病导致加拿大烟草业直接经济损失达100万美元。1993年脉斑病在我国山东烟区开始流行，到1998年成为第一大烟草病害。PVY在河南、陕西、黑龙江、辽宁、安徽、贵州和云南的局部烟区的危害严重，给烟叶生产带来较大损失。
选育抗PVY的烟草品种是防治该病最经济有效的方法。美国G.Koellent对栽培种VirginA的变种VirginAMutant(VAM)的研究后发现VAM的PVY的抗性主要是由隐性单基因（va）控制的，对PVY的多个株系、特别是坏死株系具有抗性。NoguchisS.等对VAM遗传位点的研究后发现VAM对PVY的抗性是由于大段染色体缺失造成的。这个发现与VAM来源于X-射线突变体相吻合。是由于对PVY感病的基因缺失造成的。烟草育种利用的PVY抗性重要来源之一为VAM。
为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分抗源的抗性表现为隐性基因（va）控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。并开发出与Va位点相关的分子标记（RAPD、SCAR）（NoguchiS.,MolGenGenet,1999,262:822-829;Julioetal.,TheorApplGenet.2006,112(2):335-346.）。烤烟种质RY5对PVY坏死株系（PVYN）的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点（Va）紧密连锁的RAPD标记O12V3695与SCAR标记PVYME1（王贵等，分子植物育种,2012,10(1):97-103）。文献报道的RAPD标记和SCAR标记，与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM。与PVY抗性的连锁距离较远，将导致利用标记数据判断抗性表型误差较大。RAPD标记存在扩增产物的特异性不高，非目标条带干扰结果判断、PCR扩增需要循环数多达45个循环等不足。
发明内容
为克服现有分子标记的不足，本发明提出一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，采用与PVY隐性抗病基因本身序列及其侧翼序列，开发的分子标记与PVY的抗性连锁距离更近；PCR扩增条件更简便。因此，利用本发明的分子标记判断抗性表型更的准确性更高。利用本发明的烟草PVY隐性抗病基因的分子标记进行辅助选择育种，对加快育种进程和提高我国烟草育种水平起到促进作用。
本发明的另一目的是提供一种可用于PCR扩增与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记的引物对，以及由该引物对扩增获得的分子标记。
本发明的再一目的是提供上述分子标记在烟草PVY隐性抗病基因检测的用途以及在烟草育种辅助选择中的用途。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记，所述分子标记含有SeqIDNo.1所示序列；优选的所述分子标记具有SeqIDNo.1所示序列。
本发明还公开了一种扩增与鉴定烟草PVY抗性的分子标记的引物对，所述引物对的CF2含有SeqIDNo.2所示序列，GR11含有SeqIDNo.3所示序列；优选的所述CF2具有SeqIDNo.2所示序列，GR11具有SeqIDNo.3所示序列；
SeqIDNo.2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’；
SeqIDNo.3：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’。
本发明还公开了一种与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，所述分子标记是由上述的引物对以感PVY烟草基因组DNA为模板经PCR扩增得到的。
优选的由上述引物对扩增得到的分子标记含有SeqIDNo.1所示序列。
在本发明的一个实施方案中，所述分子标记(含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的DNA片段)为烟草基因组中含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的DNA片段，即包含的SeqIDNo.1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列，优选的，为烟草基因组中SeqIDNo.1的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测感PVY的烟草基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增到含有SeqIDNo.1所示的序列。SeqIDNo.1的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,200bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。
本发明还公开了本发明的分子标记的制备方法，包括下述步骤：使用感PVY的烟草的基因组DNA作为模板，以上述引物对进行PCR扩增，得到的446bp扩增产物即含有所述分子标记；优选地，还包括将PCR扩增产物进行纯化和测序的步骤。
对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。
本发明还公开了所述分子标记的检测方法，包括步骤：根据含有上述分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测烟草基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。优选的，所述引物为上述分别含有SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的引物对。
例如，可以以被检测烟草的基因组DNA为模板，以上述引物(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)进行PCR扩增，得到扩增产物。可以将得到的扩增产物进行测序或者凝胶电泳。
本发明还公开了所述的分子标记在烟草种质PVY抗性鉴定中的用途。所述方法包括检测本发明的分子标记或使用本发明中扩增分子标记的引物对的步骤。
本发明还公开了所述的分子标记在烟草育种辅助选择中的用途。
本发明的分子标记可用于分子标记育种辅助选择中，本领域技术人员可以理解，比如通过检测是否存在本发明的分子标记来筛选烟草是否抗PVY(例如，可以参考，高蓝，DNA分子标记在番茄遗传育种研究中的应用，遗传，2003，25（3）：361-366)。所述检测可以是PCR检测的方法，具体地，可以使用上述的本发明的扩增分子标记的引物对。所述检测还可以通过测序方法进行。该烟草育种辅助选择方法具有简便、快速、高通量的优点。
由于采用以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明提供了与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，该分子标记将基因组DNA序列与烟草PVY隐性抗病基因联系起来，有利于烟草分子标记育种辅助选择体系的建立；所述分子标记与烟草PVY隐性抗病基因的遗传紧密连锁距离为0.99cM。与文献已报道的相关分子标记相比，本发明所述分子标记是与特异抗病基因连锁的分子标记，具有连锁距离更近，检测操作简便，结果稳定可靠等优点。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于烟草育种实践和资源及品种鉴定。
附图说明
图1为引物CF2GR11在抗感品种间的多态性：分子标记引物(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)对6个PVY抗性明确单株的扩增结果。其中：泳道M为Marker，其为100bpDNALadder；其分子量包括：1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、200bp、400bp、300bp、200bp以及100bp。泳道阴性对照为水。
具体实施方式
本发明公开了一种引物对以及与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记PVY01。利用本发明的引物对，以烟草基因组DNA为模板进行PCR，可以得到与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记，该分子标记在本发明中命名为分子标记PVY01。需要指出的是，本领域技术人员可以理解，除了通过上述PCR扩增获得本发明的分子标记外，还可以通过化学合成获得本发明的分子标记。
本发明的引物对分别含有序列表SeqIDNo.2和SeqIDNo.3所示序列，
SeqIDNo.2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’；
SeqIDNo.3：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’。
本领域技术人员熟知，在上述SeqIDNo.2和SeqIDNo.3所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～10个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与SeqIDNo.2和SeqIDNo.3相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在SeqIDNo.2和SeqIDNo.3的5’端或3’端分别增加1～10个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为SeqIDNo.2和SeqIDNo.3所示序列。
优选的PVY01分子标记开发方法如下：
烟草品种NC55、NC102、K326PVY和TN90为抗PVY材料，Coker176、云烟87、中烟100、红花大金元和K326为感PVY材料，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。本发明将抗PVY的父本NC55和感PVY的母本Coker176的纯合子杂交，获得F1代，再以F1代自交产生F2代群体，共101个单株。
pCR-BluntII-TOPO载体、农杆菌GV3101购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109；；反转录试剂盒、5’端RACE试剂盒、DNAMarker、TaqDNA聚合酶、T4DNA聚合酶及T4DNA连接酶均购自大连宝生物公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司。其他化学试剂均为市售产品。
据文献报道番茄和辣椒中eIF4E家族基因与PVY抗性相关，烟草与辣椒/番茄同属茄科作物，因此我们推测烟草中的eIF4E基因也与PVY抗性相关。根据已发表文献、Genbank数据库的综合分析，初步获得烟草eIF4E家族7个基因成员的编码序列，并进行系统进化分析。根据保守序列设计简并引物，正向引物DegenerateP_F：5’-TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物DegenerateP_R：5’-TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以NC55（染色体未知片段缺失赋予PVY抗性）和中烟100（感PVY材料）的cDNA作为模板扩增eIF4E家族基因。结果表明，eIF4E-1基因的转录本仅在中烟100样本中出现，这表明eIF4E-1基因可能与PVY抗性有关。由于eIF4E基因家族的成员较多，直接利用eIF4E-1基因的编码区序列，不能设计特异扩增eIF4E-1的片段。本发明根据eIF4E-1基因的部分序列，通过5’端RACE获得eIF4E-1基因起始密码子上游的序列，包含本发明的分子标记(SeqIDNo.1)。根据eIF4E-1的基因组序列和eIF4E家族成员的序列，设计特异引物CF2GR11，检测已知抗性的烟草材料的基因组DNA，验证抗性是否与本发明的分子标记(SeqIDNo.1)有无吻合。结果表明：感病品种K326、云烟87和红花大金元的eIF4E-1目标片段检测为阳性，而抗病品种NC102、NC55、K326PVY的eIF4E-1目标片段检测为阴性。6个品种对PVY的抗性与CF2GR11的PCR检测结果吻合。因此，将CF2GR11特异扩增的eIF4E-1基因片段作为获选分子标记，用于在抗性分离群体中验证。
利用CF2GR11的引物对，对F2群体的101个单株进行PCR检测和PVY抗性鉴定，得到基因型分型数据和PVY抗性数据，统计分析后，用MapMaker3.0软件进行遗传图谱绘制，得到本发明所述的与PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记与抗性的遗传距离。利用引物对进行抗PVY烟草育种辅助选择和抗PVY烟草种质筛选。
下面通过具体实验例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1：分子标记的制备
一、烟草RNA提取：
（1）取100mg幼嫩叶片放入用DEPC水处理过的研钵；
（2）加入1mlTrizol研磨成均浆，转移至DEPC水处理过的EP离心管中，室温静置5min；
（3）加入0.2ml氯仿（三氯甲烷），振荡15sec，静置3min；
（4）12000rcf，4℃，离心15min；
（5）转移上清液（最多400ul）至新的EP管；
（6）向上清液中加入0.5ml异丙醇，静置10min；
（7）12000rcf，4℃，离心10min；
（8）弃异丙醇，用移液枪将残余的异丙醇吸出丢弃，加入1ml75%的乙醇清洗底部残留物；
（9）7500rcf，4℃，离心2min；
（10）弃乙醇，用移液枪将残余的乙醇吸出丢弃，室温干燥2-3min；
（11）加入30ulDEPCH2O溶解沉淀块，若不易溶解则放入55℃水浴锅中水浴10min；
(12）-20℃短期保存，-80℃长期保存待用。
二、cDNA第一链的合成
使用ReverseTranscriptaseM-MLV（Takara）进行模板cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)1550ng,10mMdNTPmix1μl,用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reactionbuffer4μl，25mMMgCl24μl，0.1MDTT2μl,RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μlM-MLVReverseTranscriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，cDNA的合成完成，-20℃保存备用。
三、DNA提取
用常规CTAB法分别提取烟草基因组DNA，方法为：（1）称取烟草叶片100mg左右置于1.5mL离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；（2）加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HClpH7.5100mM,EDTA20mM,NaCl1.4M,CTAB2%），65℃度水浴20分钟后取出冷却；（3）加入200μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7200rpm）后转移上清至1.5mLEP管；（4）再次加入200μl氯仿－异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7200rpm）；（5）取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3MpH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min（12000rpm）；（6）弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液融解，放置－20℃保存备用。
四、PCR扩增
PCR反应体系如下：总体积为20μL，其中50ng/μLDNA样品2.5μL、10×PCRbuffer2.0μL，dNTPs1.2μL，引物对(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)各1.5μL，Ex-TaqDNA酶0.3μL，ddH2O12.6μL。所用试剂购自宝生物公司。
PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，运行35个循环；最后72℃延伸5分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。
五、分子标记获得
在Genbank中搜索获得eIF4E基因家族成员的保守序列，根据烟草eIF4E基因家族成员的保守序列设计简并引物，正向引物DegenerateP_F：5’-TGGACWTTYTGGTWYGATAA-3’，反向引物DegenerateP_R：5’-TCCTTCCAYTKYYTACCAATGC-3’。以NC55（染色体未知片段缺失赋予PVY抗性）和中烟100（感PVY材料）的cDNA作为模板扩增eIF4E家族基因。将扩增获得约420bp的片段割胶回收，克隆到pMD18-T载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌JM109中。来源于NC55和中烟100的cDNA样品，分别挑选阳性单克隆50个，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，采用M13通用引物(序列信息参考TaKaRa商品目录)对克隆片段进行测序，将所得序列在Genbank中进行BLAST比对。结果显示，eIF4E-1基因的转录本仅在感PVY的中烟100样本中出现，eIF4E-1基因的转录本抗PVY的NC55样本中缺失（表1），这表明eIF4E-1基因可能与PVY抗性有关。
表1抗感PVY烟草材料的eIF4E家族基因的转录本检测
根据eIF4E-1基因的部分序列，通过5’端RACE获得eIF4E-1基因起始密码子上游的序列，包含本发明的分子标记(SeqIDNo.1)。
根据eIF4E-1的基因组序列和eIF4E家族成员的序列，设计特异引物CF2GR11，检测已知抗性的烟草材料的基因组DNA，验证抗性是否与本发明的分子标记(SeqIDNo.1)有无吻合。结果表明：感病品种K326、云烟87和红花大金元的eIF4E-1目标片段检测为阳性，而抗病品种NC102、NC55、K326PVY的eIF4E-1目标片段检测为阴性（图1）。6个品种对PVY的抗性与CF2GR11的PCR检测结果吻合。因此，将CF2GR11特异扩增的eIF4E-1基因片段作为获选分子标记，用于在抗性分离群体中验证。
上述克隆、转化、培养、质粒提取、5’端RACE等步骤参考《分子克隆实验指南第三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。对本领域技术人员而言，可以理解，也可以通过DNA化学合成的方法得到该分子标记。
实施例2：扩增分子标记的引物对的开发
根据分子标记的序列(SeqIDNo.1)，在Genbank（www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中，采用BLAST方法，获得序列一致率高于80%的烟草基因组序列。采用引物设计软件PRIMER5.0，设计特异扩增含有全部或部分分子标记的序列(SeqIDNo.1)的候选引物对。
利用抗PVY烟草品种NC55、和感PVY烟草品种Coker176、红花大金元的基因组DNA，筛选候选引物对。
PCR反应体系如下：总体积为20μL，其中50ng/μLDNA样品2.5μL、10×PCRbuffer2.0μL，dNTPs1.2μL，引物对(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)各1.5μL，Ex-TaqDNA酶0.3μL，ddH2O12.6μL。所用试剂购自宝生物公司。
PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃（退火温度根据具体引物对的Tm值设定）退火30s，72℃延伸60s；循环结束后72℃延伸5min；4℃保存。
PCR产物电泳检测：1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，EB染色10min，照胶并记录。
按照如下的筛选标准进行候选引物对的筛选：NC55无扩增产物，并且Coker176和红花大金元的扩增产物均只有一条明晰的带型。
筛选结果：根据上述筛选标准，从设计的3对引物中优选选出1对引物(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)。
实施例3：分子标记与PVY抗性的遗传距离确定
一、烟草F2代分离群体的构建
父本：烟草品种NC55，抗PVY。母本：烟草品种Coker176，感PVY。F2群体构建：父本和母本杂交得到F1代，F1自交得到F2种子。
二、烟草F2代个体的表型鉴定
播种父本、母本和F2种子。盆栽共得到父本单株30株、母本单株30株、F2代单株101株。烟苗4-5片叶时，每株分别采集半片叶，-20℃保存，用于提取DNA。采样完毕后，采用高压喷枪接种PVY病毒坏死株系ZT-5（公众可从云南省烟草农业科学研究院获得）的病叶汁液40倍。接种后21天调查PVY症状。调查时无花叶、脉带和叶脉坏死等PVY症状，记为抗病（R）。调查时表现花叶、脉带和叶脉坏死等PVY症状，记为感病（S）。得到父本、母本和F2的101个单株的表型数据。
三、烟草F2代个体的基因型分型
父母本以及F2代个体基因组DNA的提取用常规CTAB法分别提取。
四、PCR扩增与检测
利用分子标记引物(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)，的F2代的101个单株DNA进行的PCR扩增，PCR反应体系同实施例2。PCR反应程序：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，51℃，退火30s，72℃延伸60s；循环结束后72℃延伸5min；4℃保存。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到分子标记引物对101个单株扩增的结果。扩增结果是：40株感PVY植株的PCR扩增产物均有446bp大小的条带，2株感PVY植株PCR扩增产物均没有446bp的条带,59株抗PVY植株PCR扩增产物均没有446bp的条带。并且经测序证明该446bp的片段的序列包含在SeqIDNo.1中。可见，本发明的分子标记(SeqIDNo.1)为与烟草PVY隐性抗病基因紧密连锁的分子标记。
五、遗传距离计算
将全部电泳结果进行数据统计分析，具体方法如下：将F2群体单株扩增条带为父本型的记为a，扩增条带为母本型的记为b，带型模糊或者缺失记为-，相当于数据缺失，最终得到F2群体101个个体的CF2GR11引物扩增的基因型数据。所得即为该F2群体的基因型数据。用MapMaker3.0软件(ConstructinggeneticmapswithMAPMAKER/EXP3.0，SLincoln，MDaly，ELander-Cambridge，MA：WhiteheadInstitute，1992)对101个单株的表型数据和基因型数据进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。从该得到的遗传连锁图上确定供试引物与烟草PVY隐性抗病基因的遗传距离。本发明分子标记CF2GR11与烟草PVY隐性抗病基因的遗传距离为0.99cM，小于文献报道的分子标记RAPD标记O12V3695和SCAR标记PVYME1的遗传距离。文献报道的RAPD标记O12V3695和SCAR标记PVYME1与PVY抗性的连锁距离分别为2.10cM和2.52cM（王贵等，分子植物育种,2012,10(1):97-103）。
实施例4：分子标记在烟草育种辅助选择中的用途
对抗感PVY的亲本配制的杂交自交后代（如F2）或者回交自交后代(如BC1F2，BC2F2)种子，常规方法育苗，烟苗3-4片叶时，采用CTAB法提取基因组DNA，以已知抗PVY的烟草品种NC55和已知感PVY的烟草品种Coker176为对照。采用实施例3中的方法，采用分子标记引物对(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)，进行的PCR扩增，PCR反应体系和PCR反应程序同实施例3。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照胶并记录。
抗病对照无446bp扩增产物，感病对照有446bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准判断烟草种质的PVY抗性：无446bp扩增产物，初步判断该F2单株抗PVY，有446bp扩增产物，初步判断该F2单株感PVY。结果表明：抗PVY的烟草品种NC55无446bp扩增产物；感PVY的烟草品种Coker176有446bp扩增产物。筛选出的抗PVY的F2单株供进一步育种利用。表明该分子标记可用于鉴定烟草种质资源的抗性。与常规苗期接种PVY抗性鉴定方法相比，利用分子标记鉴定抗性具有以下优点：减少人为接种病害对其他实验材料的污染；减少人为接种病害对温室条件的需求；同一个F2单株的DNA，可用于其他分子标记的检测，可用于其他性状的分子标记辅助选择。实施例5：分子标记在烟草种质PVY抗性鉴定中的用途
按照常规方法育苗，烟苗4-5片叶时，采用CTAB法提取待鉴定烟草种质TN90和云烟87的基因组DNA，以已知抗PVY的烟草品种NC55和已知感PVY的烟草品种Coker176为对照。采用分子标记引物对(SeqIDNo.2和SeqIDNo.3)，进行的PCR扩增，PCR反应体系和PCR反应程序同实施例3。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照胶并记录。
抗病对照无446bp扩增产物，感病对照有446bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准判断烟草种质的PVY抗性：无446bp扩增产物，初步判断该种质抗PVY，有446bp扩增产物，初步判断该种质感PVY。结果表明：抗PVY的烟草品种TN90无446bp扩增产物；感PVY的烟草品种云烟87有446bp扩增产物。表明该分子标记可用于鉴定烟草种质资源的抗性。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
本发明中的各分子标记的核苷酸序列如下：
SeqIDNo.1:
TTGGTTTGATAATCCTATGGCTAAATCTAGACAAGCTGCTTGGGGCAGTTCCCTTCGCGAACTTTACACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTTGGGGGTAAGTTATTTCATATTCCCTCGGTTCCAATTTAGGTTACAGTCTTTCCTTTTTAGTCAACTTTTAGTCTCCTTAAATGATATATTTCTATATTTAGTAATAATTTAATATTTATAGTGACACAAATGTATCACTCATTTTAGATGAATTTTTTTTTTCTTAAACTCCGTACCAAATCAAACACTACTAATGTAAATTGGGACGAAGCGAGTATTATATTTCGTGTTAAGCTGTTGTGTTCTTTGGTTGTAAATAAATCATGGGGTTTTATTTTACTGTTCAAGAATTTTGTGGGTGCTGTAGGATTTTGTTGAATTATGGTTTTGAATAGCTCCTGAATATCTTGCCTTC；
SeqIDNo.2(CF2):
TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT；
SeqIDNo.3(GR11):
GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT。

Claims (5)

1.SeqIDNo.1所示分子标记在鉴定烟草PVY抗性中的用途。
2.一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记的制备方法，其特征在于：用感染PVY的烟草的基因组DNA作为模板，以引物对进行PCR扩增，得到446bp扩增产物，将PCR扩增产物进行纯化和测序即为所述分子标记；
所述引物对的引物1为SeqIDNo.2所示序列，引物2为SeqIDNo.3所示序列；
SeqIDNo.2：5’-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3’；
SeqIDNo.3：5’-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3’。
3.根据权利要求1所述的鉴定烟草PVY抗性的分子标记在烟草育种辅助选择或者烟草种质PVY抗性鉴定中的用途。
4.根据权利要求2所述的鉴定烟草PVY抗性的分子标记引物对在烟草育种辅助选择或者烟草种质PVY抗性鉴定中的用途。
5.一种鉴定烟草PVY抗性的分子标记的检测方法，其特征在于步骤为：根据SeqIDNo.1分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测烟草基因组DNA为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。
CN201410150470.6A 2014-04-15 2014-04-15 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记 Active CN103898228B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410150470.6A CN103898228B (zh) 2014-04-15 2014-04-15 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410150470.6A CN103898228B (zh) 2014-04-15 2014-04-15 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103898228A CN103898228A (zh) 2014-07-02
CN103898228B true CN103898228B (zh) 2016-03-02

Family

ID=50989793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410150470.6A Active CN103898228B (zh) 2014-04-15 2014-04-15 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103898228B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624277B (zh) * 2014-11-28 2021-05-18 中国农业科学院烟草研究所 与烟草株高发育性状紧密连锁分子标记的获得方法
CN107058335A (zh) * 2017-02-16 2017-08-18 云南省烟草农业科学研究院 一种产生PVY抗性的NteIF4E‑1基因突变体及其应用
CN110029183A (zh) * 2018-01-12 2019-07-19 中国农业科学院烟草研究所 一种鉴定烟草pvy抗性的引物、检测方法和试剂盒
CN109486992B (zh) * 2018-12-11 2021-08-20 贵州省烟草科学研究院 烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用
CN112094942B (zh) * 2020-10-23 2023-09-12 贵州省烟草科学研究院 与烟草pvy抗性紧密连锁的分子标记、引物及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101875981A (zh) * 2010-07-21 2010-11-03 陕西省烟草研究所 一种同步检测多种烟草病毒的引物组和试剂盒
CN102140546A (zh) * 2011-03-20 2011-08-03 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯y病毒的方法及其引物
CN102140542A (zh) * 2011-02-28 2011-08-03 中国农业科学院烟草研究所 一种用于快速检测马铃薯y病毒的试剂盒及检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101875981A (zh) * 2010-07-21 2010-11-03 陕西省烟草研究所 一种同步检测多种烟草病毒的引物组和试剂盒
CN102140542A (zh) * 2011-02-28 2011-08-03 中国农业科学院烟草研究所 一种用于快速检测马铃薯y病毒的试剂盒及检测方法
CN102140546A (zh) * 2011-03-20 2011-08-03 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯y病毒的方法及其引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of PVY (Potato Virus Y) resistance in tobacco: potential role of an eIF4E gene identified by high throughput sequencing technologies.;E. Julio等;《PLANT & ANIMAL GENOME XXI》;20130116;第1、14页 *
烟草马铃薯Y病毒病抗性遗传及分子标记;陈万胜;《中国农业科学院学位论文集》;20081231;全文 *
烟草马铃薯Y病毒病相关基因elF4E的片段克隆及RNAi载体构建;皮金鹏等;《中国农学通报》;20121231;第28卷(第18期);第189-193页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103898228A (zh) 2014-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103898228B (zh) 一种鉴定烟草pvy抗性的分子标记
Luo et al. Marker-assisted breeding of Xa4, Xa21 and Xa27 in the restorer lines of hybrid rice for broad-spectrum and enhanced disease resistance to bacterial blight
CN104651494B (zh) 控制玉米穗行数和穗粒数的dna片段、分子标记与应用
CN101892304B (zh) 分子标记检测n基因控制的烟草tmv抗性的方法
BR112017023275B1 (pt) Métodos para selecionar uma planta ou semente de milho braquítica
Sun et al. Discovery of a novel er1 allele conferring powdery mildew resistance in Chinese pea (Pisum sativum L.) landraces
CN102154281A (zh) 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0010
CN105154531A (zh) 鉴别水稻千粒重基因tgw6野生型和突变体的分子标记
CN104450932B (zh) 稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SSR及其制备方法和应用
CN109735512A (zh) 玉米基因ZmACO2在提高玉米产量中的应用
CN108866234B (zh) 烟草eIF4E-1突变位点特异性共显性分子标记及其应用
BR112016019007B1 (pt) Métodos para produzir uma planta de milho, que expressa vip3a ou germoplasma de milho com fertilidade masculina aumentada, programa de melhoramento, método para melhorar a produção de sementes de uma planta de milho que expressa vip3a, e programa de produção de sementes
CN105200149A (zh) 估算烟草n导入片段右端长度的分子标记、引物及方法
CN106498068A (zh) 一种与烟草tmv抗性基因n紧密连锁的共显性ssr标记及其应用
CN101838645A (zh) 一对大白菜芜菁花叶病毒病est-ssr标记及其应用
CN105200052A (zh) 估算烟草n导入片段左端长度的分子标记、引物及方法
CN113481316A (zh) 玉米抗旱标记dresh8及其应用
CN109486992A (zh) 烟草eIF4E-1位点大片段缺失突变的特异性共显性分子标记及应用
CN105713983B (zh) 一种与水稻江南晚穗瘟抗性基因紧密连锁的分子标记及其应用
CN108342506B (zh) 甘蓝型油菜MI CMS系统恢复基因Rfm的分子标记及其应用
CN102154284B (zh) 与谷子花粉颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0408
CN102690817A (zh) 与谷子花粉颜色基因紧密连锁的分子标记SIsv0659
CN102690818A (zh) 与谷子抽穗期基因紧密连锁的分子标记SIsv0832
CN109797234A (zh) 与水稻稻瘟病抗性基因Pi2紧密连锁的分子标记R060939-2
WO2015066832A1 (zh) 与玉米粗缩病抗性相关的主效数量性状位点及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant