CN113030326B

CN113030326B - 一种用于分离柠檬酸和异柠檬酸的衍生试剂盒和方法

Info

Publication number: CN113030326B
Application number: CN202110266932.0A
Authority: CN
Inventors: 高飞; 海云; 谷云云; 罗示齐
Original assignee: Hangzhou Durbrain Medical Inspection Laboratory Co ltd
Current assignee: Hangzhou Durbrain Medical Inspection Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN113030326A

Abstract

本发明公开一种用于分离柠檬酸和异柠檬酸的衍生试剂盒和方法，属于化学分析领域。所述试剂盒包括衍生试剂，所述衍生试剂为C3‑C6醇类，即甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇，进一步地，所述衍生试剂为正构醇或异构醇。利用本发明的试剂盒对样本中柠檬酸和异柠檬酸进行衍生化后，进一步通过液相色谱质谱技术，实现柠檬酸和异柠檬酸的分离，便于后续分析或检测。利用本发明的试剂盒和方法，通过对受试者尿液样本进行检测，可以准确定量柠檬酸含量，从而提高泌尿结石诊断的准确性和灵敏度，具有重要的临床意义和巨大的经济价值。

Description

一种用于分离柠檬酸和异柠檬酸的衍生试剂盒和方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体地，涉及一种用于分离柠檬酸和异柠檬酸的衍生试剂盒和方法。

背景技术

柠檬酸(CA)，又名枸橼酸，分子式分为CHO，是发生在线粒体中的TCA循环的关键中间产物。它由草酰乙酸结合乙酰辅酶A(产生于糖酵解途径)上的乙酰基团而形成.柠檬酸可以被运出线粒体重新变回乙酰辅酶A，用于脂肪酸的合成。柠檬酸是连接脂肪酸合成和糖酵解途径的桥梁。

柠檬酸在体内的代谢路径和处理方式随着性别、年龄以及各种其它因子的不同也会千差万别。研究发现，体液中柠檬酸含量也跟很多疾病的发生息息相关，从而使得柠檬酸成为多种疾病的诊断标志物。

然而，由于柠檬酸还有一种同分异构体——异柠檬酸(图1)，通常与柠檬酸同时存在中体液中，以往检测方法中，常常无法将柠檬酸和异柠檬酸分离，造成两者混为一体进行检测，造成检测误差，甚至造成误诊、漏诊。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种用于分离柠檬酸和异柠檬酸的试剂盒，所述试剂盒包括衍生试剂，所述衍生试剂为C3-C6醇类。

进一步地，利用高效液相色谱法进行所述分离柠檬酸和异柠檬酸。

在本发明的一些实施方案中，所述C3-C6醇类是指具有3～6个C原子的醇类，即丙醇、丁醇、戊醇或己醇。利用醇类进行衍生，由于醇类能够扩展分子的结构，可将柠檬酸与异柠檬酸内部的羟基暴露出来，扩大因羟基位置差异而使柠檬酸与异柠檬酸与色谱填料之间作用力的差异，从而达到完全基线分离的目的。同时由于衍生化后能够提高质谱的响应，能够进一步的提高柠檬酸和异柠檬酸的检测灵敏度。

进一步地，所述醇类为正构醇或异构醇。

在本发明的一些实施方案中，所述丙醇为1-丙醇(正丙醇)或2-丙醇(异丙醇)。

在本发明的一些实施方案中，所述丁醇为1-丁醇(正丁醇)、2-丁醇(仲丁醇)、2-甲基-1-丙醇(异丁醇)或2-甲基-2-丙醇(叔丁醇)。

在本发明的一些实施方案中，所述戊醇为1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇，2-甲基-2-丁醇，3-甲基-2-丁醇，3-甲基-1-丁醇或2,2-二甲基-1-丙醇。

在本发明的一些实施方案中，所述己醇为1-己醇、2-己醇、3-己醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、2-甲基-4-戊醇、2-甲基-5-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、2,2-二甲基-1-丁醇、2,2-二甲基-3-丁醇、2,2-二甲基-4-丁醇、2,3-二甲基-1-丁醇或2,3-二甲基-2-丁醇。

在本发明的一些具体实施方案中，所述衍生试剂为正丁醇。

本发明第二方面提供一种分离柠檬酸和异柠檬酸的方法，包括以下步骤：

S1，利用衍生试剂对包含柠檬酸和异柠檬酸的样本进行衍生；

S2，利用高效液相色谱对衍生后的样本进行分离，收集保留时间为2.5-2.8min的组分，为异柠檬酸；收集保留时间为2.85-3.25min的组分，为柠檬酸，

所述衍生试剂为C3-C6醇类，即丙醇、丁醇、戊醇或己醇。

进一步地，所述醇类为正构醇或异构醇。

在本发明的一些具体实施方案中，所述衍生试剂为正丁醇。

进一步地，步骤S1所述利用衍生试剂对包含柠檬酸和异柠檬酸的样本进行衍生步骤具体为：

S11，取10-20μL所述样本，于60℃氮气吹干；

S12，加入100-300μL 3mol/L丁醇溶液，涡旋，于60℃震荡均匀，离心3-5min，于60℃氮气吹干；

S13，加入100-300μL甲醇复溶。

进一步地，步骤S2所述利用高效液相色谱对衍生后的样本进行分离的条件为：采用ACE Excel-2 C18-PFP柱，柱温30-40℃；进样量为10-100μL，流动相A为甲酸和乙酸铵的水溶液，流动性B为甲酸和乙酸铵的甲醇溶液；流速0.1-0.5mL/min，等度洗脱，10-90％B流动相B，具体如下表：

时间/min	B相比例
		0.00	10-90％
3.5	10-90％

在本发明的一些实施方案中，流动相A水溶液中甲酸含量0.1-0.5％，乙酸铵含量0.5-5mM。在本发明的一些具体实施方案中，流动相A水溶液中甲酸含量0.1％，乙酸铵含量5mM。

在本发明的一些实施方案中，流动相B甲醇溶液中甲酸含量0.1-0.5％，乙酸铵含量0.5-5mM。在本发明的一些具体实施方案中，流动相B甲醇溶液中甲酸含量0.1％，乙酸铵含量5mM。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明通过衍生试剂，结合高效液相色谱平台，可以实现柠檬酸和异柠檬的分离，便于后续分析或检测。

利用本发明的试剂盒和方法，通过对受试者尿液样本进行检测，可以准确定量柠檬酸含量，从而提高泌尿结石诊断的准确性和灵敏度，具有重要的临床意义和巨大的经济价值。

附图说明

图1示出了柠檬酸与异柠檬酸的结构和生化反应。

图2示出了PA衍生化柠檬酸与异柠檬酸分离效果图。

图3示出了正丁醇衍生化柠檬酸与异柠檬酸分离效果图。

图4示出了受试者24h尿液样本中异柠檬酸与草酸含量的关系。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

异柠檬酸和柠檬酸是同分异构体的内源性物质(图1)，以往检测方法中，很难实现对柠檬酸和异柠檬酸的，发明人为了利用高效液相色谱对柠檬酸和异柠檬酸进行分离。尝试不同方法对柠檬酸和异柠檬酸进行衍生化。

实施例1 2-吡啶甲基胺(PA)衍生化

异柠檬酸和柠檬酸是同分异构体的内源性物质(图1)，其均含有羧酸。因此发明人初步尝试衍生化羧基。

首先，利用吡啶上氨基与羧基反应：2-吡啶甲基胺(PA)是常用的与羧基反应的衍生试剂，衍生时间短，前处理简单。

衍生步骤及条件：取20μL泌尿结石患者尿液样本，加入20μL同位素标记的柠檬酸，于60℃氮气吹干，依次加入200μL 10mM三苯基膦(TPP)，200μL 2,2'-二硫二吡啶(DPDS)，200μL 1g/L 2-氨甲基吡啶(PA)，涡旋3min，于60℃静置30min，后室温下加入200μL 0.1％甲酸水溶液，待检测。

色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。

洗脱条件：流动性A为0.2％甲酸水溶液，流动性B为0.1％甲酸-2mM甲酸铵甲醇溶液；流速0.2mL/min，梯度洗脱，具体如下表：

时间/min	B相比例
		0.00	5％
2.00	5％
		6.00	70％
10.00	90％
		12.00	90％
13.00	15％
		15.00	15％

分离结果如图2所示。结果显示，PA可以衍生柠檬酸与异柠檬酸，但衍生后产物无法在液相上分开：图2中显示柠檬酸与异柠檬酸在6.63min仍旧无法分离。

发明人对此进行进一步分析，发现柠檬酸与异柠檬酸无法分离是因为两者唯一的差异是羟基位置不同，衍生后添加上的三个基团将柠檬酸与异柠檬酸的羟基包裹住，存在空间位阻，使羟基无法充分与色谱填料作用，羟基因为位置的差异而产生的作用力差异被弱化，故而最终无法达到色谱分离。

实施例2醇类衍生化

为达到成功分离柠檬酸与异柠檬酸的目的，发明人尝试大量新的衍生剂。意外地发现，使用醇类进行衍生化可以使得柠檬酸与异柠檬酸的羟基位置差异扩大。

以正丁醇衍生为例：

衍生化步骤及条件：取20μL尿液样本，加入20μL同位素标记的柠檬酸、草酸和胱氨酸内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶，待检测。

色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。

洗脱条件：流动性A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动性B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速0.3mL/min，等度洗脱，80％B流动相B，具体如下表。

时间	B相比例
		0.00	80％
3.5	80％

检测结果如图3所示，结果显示，全部目标物衍生成功，同时可实现柠檬酸与异柠檬酸基线分离，异柠檬酸保留时间为2.5-2.8min；柠檬酸保留时间为2.85-3.25min。

进一步，发明人尝试利用1-丙醇、2-丁醇、1-戊醇等醇类对泌尿结石患者尿液样本进行衍生化，发现均可以实现柠檬酸和异柠檬酸的分离，如下表所示。

发明人进一步分析发现，由于醇类衍生不是利用氨基来衍生，因此，氨基酸上的氨基不会对醇类衍生剂产生干扰。另外一方面，丁醇等醇类不存在空间位阻，可将柠檬酸与异柠檬酸内部的羟基暴露出来，扩大因羟基位置差异而使柠檬酸与异柠檬酸与色谱填料之间作用力的差异，从而达到完全基线分离的目的。

以上结果表明，利用醇类作为衍生试剂，可以有效地实现柠檬酸和异柠檬酸的分离。

实施例3柠檬酸和异柠檬酸分离在诊断泌尿结石中的应用

(一)标准溶液的配制。

(1)内标溶液配制：分析天平精确称取柠檬酸-D₄，内标用纯水溶解，配制浓度为10mg/mL内标母液。

(2)标准品配制：分析天平精确称取柠檬酸和异柠檬酸，各标准品分别用纯水配制成浓度为10mg/mL和50mg/mL的标准品母液。

(3)内标储备液：吸取100μL内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个内标储备液。

(4)标准品储备液：依次吸取500μL和300μL柠檬酸与异柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个标准品储备液。

(5)人工尿配制：10mL超纯水，加180mg尿素，5mg尿酸，110mgNaCl，超声10min，混匀3min，静置5min后，取上清溶液待用。

(6)标准曲线工作液：使用人工尿稀释标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线。标准曲线工作液配制过程如下表：

(二)样本前处理

尿液的离心：取待检尿液样本(受试者24h尿液)至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液尿液，置于-80℃保存备用。

(三)衍生化

取20μL待测尿液样本/标准曲线工作液，加入20μL内标，于60℃氮气吹干，加入100μL 3mol/L盐酸正丁醇溶液，涡旋3min，于60℃震荡20min，离心3min，于60℃氮气吹干，待提取。

(四)提取：样品衍生化后，经过氮气干燥，分别加入1mL 0.3％的氨水·乙酸乙酯，超声15min，震荡15min，15000rpm离心5min，取上清500μL，于60℃氮气吹干，加入100μL甲醇复溶，待检测。

(五)待测尿液样本/标准曲线工作液检测

色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。

洗脱条件：流动性A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动性B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速-0.3mL/min，等度洗脱，-90％B流动相B，具体如下表：

时间	B相比例
		0.00	90％
3.5	90％

对上述待测尿液样本/标准曲线进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测尿液样本的峰面积计算出待测尿液样本中的柠檬酸和异柠檬酸的含量。柠檬酸正常范围应该>400mg/d，如果检测到柠檬酸含量小于400mg/d，则，如果个体未被诊断具有结石，该结果表示个体患有泌尿结石或具有患泌尿结石的风险；如果患者正在治疗中，则表示患者结石治疗效果不好；如果患者已经治疗康复，则表示其仍有复发风险。

发明人利用本实施例的方法对三位受试者的尿液样本(24h尿液)进行了检测，结果如下表：

↓表示低于正常范围。

同时，结合其他临床信息，如医学影像B超检测或者病史，发现上述1号和2号受试者患有不同程度的尿结石，3号受试者患有肾结石。

由此表明，将柠檬酸和异柠檬酸分离后，具有较高的诊断准确度，尤其是对柠檬酸和异柠檬酸总含量超过400mg/d的受试者来说，意义尤为明显。

实施例4柠檬酸和异柠檬酸分离结合草酸和胱胺酸在诊断泌尿结石中的应用

(一)标准溶液的配制。

(1)内标溶液配制：分析天平精确称取草酸-¹³C₂、柠檬酸-D₄、胱氨酸-D₄，称量质量依次为10mg、100mg和10mg，各内标分别用纯水溶解，配制浓度依次为10mg/mL、10mg/mL和10mg/mL内标母液。

(2)标准品配制：分析天平精确称取草酸、柠檬酸、异柠檬酸和胱氨酸，称量质量依次为20mg、500mg、50mg和30mg，各标准品分别用纯水配制成浓度依次为20mg/mL、500mg/mL、50mg/mL和30mg/mL的标准品母液。

(3)混合内标储备液：依次吸取100μL草酸-¹³C₂、100μL柠檬酸-D₄和100μL胱氨酸-D₄内标母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合内标储备液。

(4)混合标准品储备液：吸取500μL草酸母液、500μL胱氨酸母液、500μL异柠檬酸母液、500μL柠檬酸标准品母液，用纯水定容到1mL，稀释成一个混合标准品储备液。

(5)标准曲线工作液：使用人工尿稀释混合标准品储备液，可以得到一系列不同浓度的标准曲线工作液(W1-W7)，用于制作标准曲线。标准工作液配制过程如下表：

待测尿液样本(受试者24h尿液)的前处理，以及待测尿液样本/标准曲线处理的衍生化和提取步骤同实施例2。

(二)待测样本的检测

色谱柱条件：ACE Excel-2 C18-PFP柱(100×2.1mm，2.6μm)，柱温35℃。

洗脱条件：流动性A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵水溶液，流动性B为0.1％甲酸-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速0.5mL/min，等度洗脱，90％B流动相B，具体如下表。

时间	B相比例
		0.00	90％
3.5	90％

对上述待测尿液样本/标准曲线工作液进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测尿液样本的峰面积计算出待测尿液样本中的草酸、柠檬酸、异柠檬酸和胱氨酸的浓度。

草酸的正常范围应在10-60mg/d，柠檬酸正常范围应该>400mg/d，胱氨酸正常范围应该<75mg/d。

如果检测到的草酸含量>60mg/d，或检测到的校正异柠檬酸含量小于400mg/d，或检测到的胱氨酸含量≥75mg/d，此时，如果个体未被诊断具有结石，该结果表示个体患有泌尿结石或具有患泌尿结石的风险；如果患者正在治疗中，则表示患者结石治疗效果不好；如果患者已经治疗康复，则表示其仍有复发风险。

发明人利用本实施例的方法，对6位受试者的尿液样本(24h尿液)进行了检测，结果如下表：

↑表示高于正常范围；↓表示低于正常范围。

发明人经过对大量样本进行了检测，统计发现，受试者尿液样本中异柠檬酸和草酸含量存在一个显著正相关的关系，Pearson线性相关系数r＝0.397(图4)，表明异柠檬酸作用和柠檬酸不一致，其可能能够促进草酸的形成。同时，也意味着，对柠檬酸和异柠檬酸进行分离并检测，对诊断泌尿结石具有重大的临床意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离柠檬酸和异柠檬酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2，利用高效液相色谱质谱对衍生后的样本进行分离，收集保留时间为2.5-2.8min的组分，为异柠檬酸；收集保留时间为2.85-3.25min的组分，为柠檬酸，

所述衍生试剂为丁醇，

步骤S1所述利用衍生试剂对包含柠檬酸和异柠檬酸的样本进行衍生步骤具体为：

S11，取10-20μL所述样本，于60℃氮气吹干；

S13，加入100-300μL甲醇复溶，

步骤S2所述利用高效液相色谱对衍生后的样本进行分离的条件为：采用ACE Excel-2C18-PFP柱，柱温30-40℃；进样量为10-100μL，流动相A为甲酸和乙酸铵的水溶液，流动性B为甲酸和乙酸铵的甲醇溶液；流速0.3mL/min，等度洗脱，80%流动相B，具体如下表：

时间/min B相比例 0.00 80% 3.5 80%

。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A水溶液中甲酸含量0.1-0.5%，乙酸铵含量0.5-5mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相B甲醇溶液中甲酸含量0.1-0.5%，乙酸铵含量0.5-5mM。