CN114354526A - 一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，该检测方法包括以下步骤：S10、将蛋白标准品配制成多个蛋白含量不同的标准液，测试每个标准液在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据蛋白标准品的含量与所述峰图面积的关系绘制标准曲线；S20、获得待测PCV3 Cap纯品蛋白样品的峰图面积，然后根据所述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。本发明提供的检测方法，是基于PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值曲线所形成的峰图面积与样品中的PCV3 Cap蛋白含量线性相关的原理进行检测，线性特性好、重复性好、准确度高，且无需任何化学显色过程，操作简单、检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质含量检测技术领域，特别涉及一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法。
背景技术
猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type3，PCV3)是近几年发现的一种新型猪圆环病毒，能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及心脏和多系统的炎症反应。流行病学研究显示，PCV3已在多个国家的养猪地区发现，该病毒的感染较为普遍，可与多种病毒存在共同感染的现象，患病率高达100％。因此，PCV3相关疫苗的研发至关重要。但由于PCV3在PK15、ST、Vero等细胞上均不产生细胞病变，目前仍未有研究资料报道能够成功通过体外细胞培养分离到PCV3，这也制约了PCV3灭活疫苗的研发。大量研究表明，PCV3Cap蛋白可在多种系统中表达并成功组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，这也为制备PCV3亚单位或者嵌合表位疫苗奠定基础。
PCV3 Cap抗原含量是影响疫苗免疫效果的最主要因素。因此，疫苗抗原中蛋白质的定量检测分析是疫苗质量控制中最重要的工作之一。目前抗原定量检测方法主要有酶联免疫吸附实验法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、BCA蛋白定量法和高效液相色谱法(HPLC)。其中，ELISA定量方法是将已知的抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，然后进行抗原的定量，但是由于反应的显色时间、洗板操作等均会影响实验结果，且涉及的实验步骤较多，因此，不同人员使用ELISA方法针对同一份样品的检测结果往往存在较大差异，对指导抗原配苗带来不利影响，此外，其捕获抗体对不同基因型的抗原亲和力的差异也限制了该方法的应用；BCA定量法由于显色反应与温度和时间的变化有关，因此每次测定都需做相应的标准曲线，且标准液放置一段时间后易染菌变质；HPLC是一种操作简单、高效和灵敏度高的分析方法，但操作起来繁杂，设备及使用成本较高。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，旨在提供一种操作简单、重复性好、准确度高的PCV3型蛋白含量检测方法。
为实现上述目的，本发明提出一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S10、将蛋白标准品配制成多个蛋白含量不同的标准液，测试每个所述标准液在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据蛋白标准品的含量与所述峰图面积的关系绘制标准曲线；
S20、获得待测PCV3 Cap纯品蛋白样品的峰图面积，然后根据所述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
可选地，步骤S1中，所述蛋白标准品为PCV3 Cap蛋白。
可选地，在步骤S10之前还包括以下步骤：
S1、将PCV3 Cap纯品蛋白溶液的pH值调节至所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液中的PCV3Cap蛋白的等电点，然后将所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液离心，得到PCV3 Cap蛋白沉淀；
S2、将所述PCV3 Cap蛋白沉淀干燥，并称重；
S3、根据所述PCV3 Cap蛋白沉淀的干重计算出所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度，然后将已知浓度的所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液作为PCV3 Cap蛋白标准品。
可选地，所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品是由重组工程菌表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统或哺乳动物细胞表达系统表达、然后纯化得到的。
可选地，检测所述紫外吸收连续数值的仪器包括蛋白纯化仪。
本发明提供的技术方案中，提出一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，是基于PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值曲线所形成的峰图面积与样品中的PCV3 Cap蛋白含量线性相关的原理进行检测，线性特性好，准确度高，且无需任何化学显色过程，操作简单、检测成本低；此外，本发明建立的标准曲线的线性范围宽，在溶液缓冲体系不变的情况下，只需建立一次标准曲线即可对不同批次的PCV3 Cap纯品蛋白进行定量，因此，能够有效地减少定量过程中的间接步骤和检测误差，从而进一步提高了准确度，且检测重复性好，更适用于实际生产过程的产品检测和质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1绘制的标准曲线；
图2为6份相同的1mL的PCV3 Cap纯品蛋白样品280nm处紫外检测获得的峰图面积图；
图3为6份相同的2mL的PCV3 Cap纯品蛋白样品280nm处紫外检测获得的峰图面积图；
图4为6份相同的5mL的PCV3 Cap纯品蛋白样品280nm处紫外检测获得的峰图面积图；
图5为1mL、2mL、5mL的PCV3 Cap纯品蛋白体积与其对应的峰图面积平均值绘制的标准曲线。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，旨在提供一种操作简单、重复性好、准确度高的PCV3型蛋白含量检测方法。在本实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
步骤S10、将蛋白标准品配制成多个蛋白含量不同的标准液，测试每个所述标准液在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据蛋白标准品的含量与所述峰图面积的关系绘制标准曲线；
步骤S20、获得待测PCV3 Cap纯品蛋白样品的峰图面积，然后根据所述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
本发明提供的技术方案中，提出一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，是基于PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值曲线所形成的峰图面积与样品中的PCV3 Cap蛋白含量线性相关的原理进行检测，线性特性好，准确度高，且无需任何化学显色过程，操作简单、检测成本低；此外，本发明建立的标准曲线的线性范围宽，在溶液缓冲体系不变的情况下，只需建立一次标准曲线即可对不同批次的PCV3 Cap纯品蛋白进行定量，因此，能够有效地减少定量过程中的间接步骤和检测误差，从而进一步提高了准确度，且检测重复性好，更适用于实际生产过程的产品检测和质量控制。
在本实施例中，所述蛋白标准品为PCV3 Cap蛋白，通过选用PCV3 Cap蛋白作为检测PCV3 Cap蛋白含量的标准品，能减少系统误差，从而提高检测准确度。
目前，标准蛋白一般是购买所得的已知浓度的蛋白，成本较高，且蛋白浓度为厂家测试所得，无法确定其标注的蛋白浓度是否准确，若不够准确，则会降低测试的蛋白含量的准确度。在本实施例中，所述标准蛋白为自行制得，因此，在步骤S10之前，还包括以下步骤：
步骤S1、将PCV3 Cap纯品蛋白溶液的pH值调节至所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液中的PCV3 Cap蛋白的等电点，然后将所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液离心，得到PCV3 Cap蛋白沉淀；
步骤S2、将所述PCV3 Cap蛋白沉淀干燥，并称重；
步骤S3、根据所述PCV3 Cap蛋白沉淀的干重计算出所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度，然后将已知浓度的所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液作为PCV3 Cap蛋白标准品。
也即，通过等电点沉淀并干燥PCV3 Cap纯品蛋白，然后直接称量干燥纯品蛋白，从而可以计算出PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度，将其作为PCV3 Cap蛋白标准品。本发明直接对标准品蛋白进行称量定量，避免了任何间接定量的步骤，使测得的PCV3 Cap纯品蛋白溶液中的PCV3 Cap蛋白的含量准确，从而使蛋白标准品的含量准确，进而使猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法中的系统误差降低。
需要说明的是，本发明提供的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，检测的是待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量(即蛋白质量)，而非PCV3 Cap纯品蛋白样品浓度。在一实施例中，步骤S10包括：分别取已知浓度的蛋白标准品的1mL、2mL、4mL和8mL，以得到蛋白含量不同的标准液。
在一具体实施例中，步骤S20包括：检测待测PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据所述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
在步骤S10和步骤S20中，分别需要检测不同含量的蛋白标准品、待测PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值，在本实施例中，检测所述紫外吸收连续数值的仪器为蛋白纯化仪，蛋白纯化仪为实验室常规仪器，可以直接使用，且操作简单，准确性高。
本发明不限制所述待测PCV3纯品蛋白样品的具体来源，只要为PCV3 Cap纯品蛋白即可，在一实施例中，所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品是由重组工程菌表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统或哺乳动物细胞表达系统中的任意一种表达系统表达、然后纯化得到的。
以下给出本发明提供的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法的一实施例：
(1)将PCV3 Cap纯品蛋白溶液的pH值调节至所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液中的PCV3Cap蛋白的等电点，然后将所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液离心，得到PCV3 Cap蛋白沉淀；将所述PCV3 Cap蛋白沉淀干燥，并称重；根据所述PCV3 Cap蛋白沉淀的干重计算出所述PCV3Cap纯品蛋白溶液的浓度，然后将已知浓度的所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液作为PCV3 Cap蛋白标准品。
(2)分别取已知浓度的蛋白标准品的1mL、2mL、4mL和8mL，以得到蛋白含量不同的标准液，使用蛋白纯化仪测试各标准液在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后以蛋白标准品的含量作为横坐标，所述峰图面积作为纵坐标，绘制标准曲线。
(3)使用蛋白纯化仪检测待测PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据上述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)取3批PCV3 Cap纯品蛋白用于定量检测。从第1批PCV3 Cap蛋白纯品溶液中精确吸取45mL至50mL离心管中(离心管已用分析天平精确称重)，然后将离心管中的PCV3 Cap纯品蛋白溶液pH值调节至PCV3 Cap蛋白的等电点以使蛋白质完全沉淀，再将所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液离心，得到PCV3 Cap蛋白沉淀；将所述PCV3 Cap蛋白沉淀烘干，并用电子分析天平精确称重得0.01368g(已扣除离心管重量)；根据所述PCV3 Cap蛋白沉淀的干重计算出所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度为304μg/mL(即0.01368g÷45mL)，然后将浓度为304μg/mL的所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液作为PCV3 Cap蛋白标准品。
(2)分别取上述蛋白标准品的1mL(304μg)、2mL(608μg)、4mL(1216μg)和8mL(2432μg)，以得到蛋白含量不同的标准液，每个标准液设置3个平行实验，使用蛋白纯化仪测试每个含量在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，其峰图面积如下表1所示，然后以蛋白标准品的含量作为横坐标，所述峰图面积的平均值作为纵坐标，绘制标准曲线，其标准曲线如图1所示。
(3)使用蛋白纯化仪分别检测1mL的第2批和第3批PCV3 Cap蛋白纯品溶液在280nm处的紫外吸收连续数值(设置3个平行实验)，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，其结果如下表2所示，然后根据上述标准曲线、以及峰图面积的平均值，确定第2批和第3批PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
表1实施例1中第1批不同含量的蛋白标准品的峰图面积结果
由表1可以看出，使用蛋白纯化仪检测相同的蛋白样品，其在280nm处的信号峰图面积具有很好的重复性。
由图1可以看出，绘制得到的标准曲线的R2＝1，说明PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值曲线所形成的峰图面积与PCV3 Cap纯品蛋白样品含量具有良好的线性关系，也即，本发明提供的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法的检测准确度高。
表2第2、3批PCV3 Cap纯品蛋白的峰图面积结果
由表2可以看出，第2批样品的峰图面积的平均值为110030mAU·s，第3批样品的峰图面积的平均值为85025mAU·s，根据图1所示的标准曲线计算得到第2批和第3批的样品浓度分别为334μg/mL和258μg/mL。
1、准确度检测
分别从实施例1中的第2批和第3批PCV3 Cap蛋白纯品溶液中精确吸取45mL至50mL离心管中(离心管已用分析天平精确称重)，按照实施例1步骤(1)中方法对PCV3 Cap蛋白进行沉淀干燥，并称重，计算得到第2批和第3批PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度分别为330μg/mL和255μg/mL。
这与实施例1的测试结果基本一致，由此可以看出，本发明提供的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法的检测准确度高。并且，在溶液缓冲体系不变的情况下，只需建立一次标准曲线即可对不同批次的PCV3 Cap纯品蛋白进行定量检测，更适用于实际生产过程的产品检测和质量控制。
2、系统误差检测
将同一来源的纯化后的PCV3 Cap蛋白溶液(即PCV3 Cap纯品蛋白)分别分装为1mL、2mL、5mL的3组样品(即3组样品中的蛋白含量不同)，每组样品6份，使用蛋白纯化仪检测6份1mL的PCV3 Cap纯品蛋白样品在280nm处的紫外吸收连续数值，每两份样品之间使用水作为空白样品进行分隔进样(即：样品1-水-样品2-水-样品3-水……)，直至检测信号归零，连续采取6份1mL PCV3 Cap纯品蛋白样品的检测信号，并对6份样品检测信号的峰图面积进行积分计算，然后统计6份峰图面积数值的误差，并根据1mL、2mL、5mL PCV3 Cap蛋白纯品与其对应的峰图面积平均值绘制的标准曲线。按照与上述检测1mL样品相同的方法分别检测2mL和5mL样品的检测误差，其结果如图2-5和下表3所示。
表3 3组PCV3 Cap纯品蛋白样品的峰图面积结果
由表3和图2-4可以看出，使用蛋白纯化仪检测含量相同的蛋白样品，其在280nm处的信号峰图面积具有很好的重复性。
图5中，横坐标指的是样品体积，纵坐标指的是峰图面积，而3组样品的来源相同(即蛋白浓度相同)，仅体积不同，也即样品中的蛋白含量不同，且呈倍比关系。由图5可以看出，PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白含量与其在280nm处的紫外吸收连续数值曲线所形成的峰图面积具有良好的线性关系。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将蛋白标准品配制成多个蛋白含量不同的标准液，测试每个所述标准液在280nm处的紫外吸收连续数值，并计算所述连续数值的曲线所形成的峰图面积，然后根据蛋白标准品的含量与所述峰图面积的关系绘制标准曲线；
S20、获得待测PCV3 Cap纯品蛋白样品的峰图面积，然后根据所述标准曲线，确定所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品中的PCV3 Cap蛋白总含量。
2.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述蛋白标准品为PCV3 Cap蛋白。
3.如权利要求2所述的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，其特征在于，在步骤S10之前还包括以下步骤：
S1、将PCV3 Cap纯品蛋白溶液的pH值调节至所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液中的PCV3 Cap蛋白的等电点，然后将所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液离心，得到PCV3 Cap蛋白沉淀；
S2、将所述PCV3 Cap蛋白沉淀干燥，并称重；
S3、根据所述PCV3 Cap蛋白沉淀的干重计算出所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液的浓度，然后将已知浓度的所述PCV3 Cap纯品蛋白溶液作为PCV3 Cap蛋白标准品。
4.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述待测PCV3 Cap纯品蛋白样品是由重组工程菌表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统或哺乳动物细胞表达系统表达、然后纯化得到的。
5.如权利要求1所述的猪圆环病毒3型纯品蛋白的定量检测方法，其特征在于，检测所述紫外吸收连续数值的仪器包括蛋白纯化仪。
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