MX2014014188A - Metodos para tratar un sindrome metaboilico mediante la modulacion de la proteina de choque termico (hsp) 90-beta. - Google Patents

Metodos para tratar un sindrome metaboilico mediante la modulacion de la proteina de choque termico (hsp) 90-beta.

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insulin
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Rangaprasad Sarangarajan
Vivek K Vishnudas
Enxuan Jing
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Abstract

La invención proporciona los métodos de tratamiento de síndrome metabólico con inhibidores de HSP90, en particular, inhibidores de HSP90P. La invención proporciona los métodos de diagnosis y vigilancia del síndrome metabólico empleando la expresión y el nivel de actividad de HSP90, en particular, HSP90p.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR UN SÍNDROME METABOLICO MEDIANTE LA MODULACIÓN DE LA PROTEÍNA DE CHOQUE TÉRMICO (HSP) 90-BETA INFORMACIÓN DE PRIORIDAD Esta solicitud reclama prioridad ante la Solicitud Provisional DE E.U.A. No.61/652023, presentada El 25 de mayo de 201.2, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia.
LISTA DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que ha sido sometida en formato ASCII a través de EFS-Web y se incorpora a la presente para referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada el 14 de mayo de 2013, se llama SeqLst.txt y tiene un tamaño de 22,186 bytes.
ANTECEDENTE A medida que los niveles de glucosa en la sangre aumentan posprandialmente, la insulina es secretada y estimula las células de los tejidos periféricos (músculos esqueléticos y grasas) para capturar activamente la glucosa de la sangre como una fuente de energía. La pérdida de homeostasia de glucosa como resultado de la secreción o acción desregulada de la insulina comúnmente da lugar a trastornos metabólicos como la diabetes, la cual puede ser coactivada o además exacerbada por la obesidad. Debido a que estas condiciones frecuentemente son mortales, se requieren estrategias para restaurar el aclaramiento de glucosa adecuado desde la corriente sanguínea.
Aunque la diabetes puede surgir en forma secundaria a cualquier condición que ocasione daño extenso al páncreas (por ej., pancreatitis, tumores, administración de ciertos fármacos, como pueden ser corticosteroides o pentamidina, sobrecarga de hierro (es decir, hemocromatosis), endocrinopatías adquiridas o genéticas, y escisión quirúrgica) , las formas más comunes de diabetes comúnmente surgen de trastornos primarios del sistema de señalización de la insulina. Hay dos tipos principales de diabetes, a saber, diabetes tipo 1 (también conocida como diabetes dependiente de insulina (IDDM)) y diabetes tipo 2 (también conocida como diabetes independiente de insulina o no dependiente de insulina (NIDDM)), las cuales comparten las complicaciones a largo plazo a pesar de sus mecanismos patogénicos diferentes.
La diabetes tipo 1, representa aproximadamente el 10% de todos los casos de diabetes primaria, es una enfermedad autoinmune especifica del órgano, caracterizada por la destrucción extensiva de las células beta que producen la insulina del páncreas. La reducción consecuente en la producción de insulina inevitablemente origina la desregulación del metabolismo de glucosa. Aunque la administración de insulina proporciona beneficios importantes a los pacientes que sufren de esta condición, la breve vida media en suero de la insulina es un impedimento principal para el mantenimiento de la normoglucemia. Un tratamiento alternativo es el trasplante de islotes, pero esta estrategia ha sido asociada con éxito limitado.
La diabetes tipo 2, la cual afecta una proporción más grande de la población, se caracteriza por una desregulación en la secreción de insulina y/o una respuesta disminuida de los tejidos periféricos a la insulina, es decir, resistencia a la insulina. Aunque la patogénesis de la diabetes tipo 2 permanece no clara, los estudios epidemiológicos sugieren que esta forma de diabetes resulta de una colección de defectos genéticos múltiples o polimorfismos, cada uno contribuyendo con sus propios riesgos de predisposición y modificados por los factores ambientales, incluyendo exceso de peso, dieta, inactividad, fármacos y exceso de consumo de alcohol. Aunque están disponibles diversos tratamientos terapéuticos para el manejo de la diabetes tipo 2, ellos están asociados con diversos efectos colaterales debilitantes. Por consiguiente, a los pacientes diagnosticados con/o en riesgo de tener diabetes tipo 2, frecuentemente se les aconseja adoptar un estilo de vida más saludable, incluyendo pérdida de peso, cambio en la dieta, ejercicio, y consumo moderado de alcohol. Esos cambios en su estilo de vida, sin embargo, no son suficientes para invertir los daños vasculares y orgánicos ocasionados por la diabetes.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un síndrome metabólico en un individuo, que consiste en administrar al individuo un modulador de HSP90, tratando con esto el síndrome metabólico en el individuo.
En una modalidad, el modulador de HSP90 es un inhibidor de HSP90.
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 es un inhibidor de H3R90b.
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 es un inhibidor especifico de H3R90b.
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 es un inhibidor de HSP90a.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 2.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 1.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en resistencia a la insulina.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste insuficiencia de insulina.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en obesidad.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en hiperinsulinemia.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en deficiencia de tolerancia a la glucosa (IGT).
En una modalidad, un individuo con síndrome metabólico presenta tres o más de los siguientes signos: a)presión sanguínea igual a o mayor de 130/85 mrnHg; b)glucosa en sangre en ayuno igual a o mayor de 100mg/dL; c)circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d)colesterol HDL bajo en donde el colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL para varones y debajo de 50mg/dL para mujeres; y e)triglicéridos igual a o mayor que 150mg/dL.
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 consiste en un inhibidor de ácido nucleico. En una modalidad, el inhibidor de ácido nucleico consiste en una molécula de ácido nucleico antisentido. En una modalidad, el inhibidor de ácido nucleico consiste en una molécula de ácido nucleico bicatenario. En una modalidad, el inhibidor de ácido nucleico consiste en un RNA bicatenario, seleccionado del grupo que consiste en siRNA, un shRNA, y un sustrato Dicer siRNA (DsiRNA).
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 consiste en un anticuerpo.
En una modalidad, el inhibidor de HSP90 consiste en una molécula pequeña. En una modalidad, la molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste en lonidamida o un análogo de ésta, celastrol o análogo de éste, gedunina o un análogo de éste, y coumermicina o un análogo de éste.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la normalización del nivel de glucosa en la sangre de un individuo.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la normalización de un nivel HblAc en un individuo.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la prevención de al menos una complicación de la diabetes asociada con mala circulación.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de la diabetes tipo 2.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de la diabetes tipo 1.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de la resistencia a la insulina.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de insuficiencia de insulina.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de la hiperinsulinemia.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de la deficiencia de tolerancia a la glucosa (IGT).
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos un signo o síntoma de obesidad.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de al menos uno de: a)presión sanguínea igual a o mayor de 130/85 mmHg; b)glucosa en sangre en ayuno igual a o mayor de 100mg/dL; c)circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d)colesterol HDL bajo en donde el colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL para varones y debajo de 50mg/dL para mujeres; y e)triglicéridos igual a o mayor que 150mg/dL.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de la presión arterial elevada igual a o más alta que 130/85 mmHg.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de glucosa en sangre en ayuno elevada igual a o mayor que 100 mg/dL.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de la circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de colesterol DHL bajo aumentando el colesterol HDL en donde el colesterol LDH bajo está debajo de 40 mg/dL para varones y debajo 50 mg/dL para mujeres.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de triglicéridos elevados igual a o más altos 150 mg/dL.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la mejora de hígado graso.
En una modalidad, el tratamiento del síndrome metabólico consiste en la modulación de los depósitos grasos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar un síndrome metabólico en un individuo, que consiste en: a)determinar un nivel de expresión o actividad de HSP90p en una muestra del individuo; y b)comparar el nivel de la expresión o actividad de HSP90p en la muestra del individuo con una muestra testigo, en donde la expresión o actividad aumentados de HXRQOb en la muestra del individuo comparada con la muestra testigo es indicativa de un trastorno metabólico en el individuo.
En una modalidad, el nivel de la expresión de HSP90p consiste en el nivel de expresión de la proteina HSP90 o del gen HSP90AB1.
En una modalidad, el método además consiste en tratar en el individuo el trastorno metabólico.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 2.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 1.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en resistencia a la insulina tipo.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en insuficiencia a la insulina.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en obesidad.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en hiperinsulinemia.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en deficiencia de tolerancia a la glucosa (IGT).
En una modalidad, el individuo con síndrome metabólico además presenta uno o más de los siguientes signos: a)presión sanguínea igual a o mayor de 130/85 mmHg; b)glucosa en sangre en ayuno igual a o mayor de 100mg/dL; c)circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d)colesterol HDL bajo en donde el colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL para varones y debajo de 50mg/dL para mujeres; y e)triglicéridos igual a o mayor que 150mg/dL.
En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para vigilar un síndrome metabólico en un individuo que consiste en: a)obtener una muestra del individuo en un.primer punto temporal y en un segundo punto temporal; b)determinar un nivel de expresión o actividad de HSP90p en el primer punto temporal y en el segundo punto temporal; y c)comparar el nivel de expresión o actividad de H3R90b en el primer punto temporal con el nivel de expresión o actividad de H3R90b en el segundo punto temporal, en donde un cambio en el nivel de expresión o actividad de HeR90b en el segundo punto temporal en relación con el primer punto temporal es indicativo de un cambio en el síndrome metabólico en el individuo.
En una modalidad, el nivel de la expresión de H3R90b consiste en el nivel de la expresión de la proteína H3R90b o del gen HSP90AB1.
En una modalidad, un aumento en la expresión o actividad de H3R90b es indicativo de empeoramiento del síndrome metabólico. En una modalidad, una disminución en la expresión o actividad de H3R90b es indicativa de una mejora en el síndrome metabólico.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 2.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en diabetes tipo 1.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en resistencia a la insulina.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en insuficiencia de insulina.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en obesidad.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en hiperinsulinemia.
En una modalidad, el síndrome metabólico consiste en deficiencia de tolerancia a la glucosa (IGT).
En una modalidad, el individuo con síndrome metabólico además presenta uno o más de los siguientes signos: a)presión sanguínea igual a o mayor de 130/85 mmHg; b) glucosa en sangre en ayuno igual a o mayor de 100mg/dL; c)circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres ; d)colesterol HDL bajo en donde el colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL para varones y debajo de 50mg/dL para mujeres; y e)triglicéridos igual a o mayor que 150mg/dL.
Otras modalidades se proporcionan más adelante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de las redes Delta-Delta utilizadas en el método de la plataforma interrogatoria que emplea el modelo de diabetes. HG es hiperglucemia; HGT1 es hiperglucemia con tratamiento con coenzima Q10; y NG es glucemia normal.
La Figura 2 es una representación esquemática de una red en modelos celulares diabéticos contra normales que fueron generados por el método de la plataforma interrogatoria descrita en la presente. Los nodos más obscuros representan los cinco nodos predominantes de actividad identificados utilizando el método.
La Figura 3 es una versión amplificada de la sección de la red indicada por el cuadro en la Figura 2, que muestra un mapa de asociación de HSP90AB1 (H3R90b) y los nodos causales que interesan a partir de los resultados del modelo de diabetes utilizando el método de la plataforma descrito en la presente.
La Figura 4 proporciona una clave de los símbolos y códigos de color utilizados para delinear las asociaciones causales de las proteínas en las redes Delta-Delta.
La Figura 5 muestra la inducción del mRNA y la proteína para la expresión de H3r90b en respuesta a los factores metabólicos e inflamación.
La Figura 6 muestra los resultados del silenciamiento de Hsp90 en los miotubos que originan un aumento importante en la fosforilación estimulada por insulina de DKT, ERK y GSK3p. El efecto del silenciamiento sobre pERK fue importante cuando se comparó con el siRNA mezclado.
La Figura 7 muestra los resultados del silenciamiento de HerQOb en los miotubos, originando un aumento importante en la captación de glucosa estimulada por insulina cuando se comparó con un siRNA mezclado (si mezclado).
La Figura 8 muestra los resultados del silenciamiento de Her90b en los miotubos, originando un aumento importante en el desacoplamiento inducido por CCCP en comparación con siRNA mezclado. Se observó que la respiración basal en los miotubos en los que se se silenció Hsp90 fue moderadamente mayor que en los miotubos tratados con un siRNA mezclado (si mezclado).
Las Figuras 9A y 9B muestran los análisis 9(A) western blot y 9 (B) cuantitativo que demuestra los efectos del tratamiento de los miotubos con inhibidor de Hsp90 (CCT018159), que según se observó aumentan los niveles de fosfo-AKT en comparación con los cultivos no tratados. No se observaron cambios importantes en pERK o pGSK3 .
La Figura 10 muestra los resultados del tratamiento de los miotubos del músculo esquelético con el inhibidor de Hsp90 (CCT018159) a una concentración de 1 mM, 3mM y IOmM, el cual no tuvo efecto inportante sobre la respuesta de desacoplamiento inducido por CCP en el metabolismo mitocondrial.
Las Figuras 11A y 11B muestran los efectos del silenciamiento de Her90b en los miotubos sobre: (A) la expresión génica de las enzimas metabólicas (hexocinasa 2 (HK2); lactato deshidrogenasa (LDH); glucógeno sintasa 1 (GYS1); carnitina palmitoilfransferasa 1 (CPT-1); Acetil CoA carboxilasa 1 y 2 (ACC1 y ACC2); lipasa sensible a hormonas (HSL); y proteína de desacoplamiento mitocondrial 3 (UCP 3)); y sobre (B) la expresión de UCP3 en los miotubos del músculo esquelético.
Las Figuras 12A a 12D muestran el efecto del silenciamiento de HXR90b sobre el flujo glucolítico en los miotubos del músculo esquelético en: (A) ECAR inducida por glucosa; (B) ECAR inducida por oligomicina; (C) OCR basal; y (D) OCR desacoplada.
Las Figuras 13A y 13B muestran el efecto del silenciamiento de HSP90p sobre la relación de los niveles de Erk fosforilada a los niveles de Erk total en un modelo inflamatorio de resistencia a insulina en los miotubos del músculo como se muestra en 13(A) el análisis western blot y 13(B) anáisis cuantitativo.
La Figura 14 muestra el efecto del silenciamiento de HSP90P sobre la relación OCR/DNA relativa en una OCR inducida con palmitato en condiciones de glucosa normal en miotubos del músculo esquelético.
La Figura 15 muestra la secuencia del gen HSP90AA1 humano (ID SEC NO: 7) y de la proteína HSP90a (ID SEC NO: 8).
La Figura 16 muestra la secuencia del gen HSP90AB humano (ID SEC NO: 9) y la proteína HeR90b (ID SEC NO: 10).
La Figura 17 muestra los alineamientos de las secuencias del gen HSP90AA1 (ID SEC NO: 7) con el gen humano HSP90AB (ID SEC NO: 9); y de la proteína HSP90a humana (ID SEC NO: 8) con la proteína HSP90p humana (ID SEC NO: 10).
DESCRIPCIÓN DETALLADA Y MODALIDADES PREFERIDAS Se utilizó una Plataforma Teenológica De Descubrimiento tilizó para delinear distintas firmas moleculares que motivan la fisiopatología de diabetes y el síndrome metabólico. Se identificó a H£R90b a través de esta plataforma tecnológica de descubrimiento como un nodo crítico que es modulado de forma importante en modelos in vitro primarios, humanos de diabetes y están asociados con múltiples mecanismos que están implicados con el metabolismo de lípidos, la función del proteasomas, tráfico endosomal, y el corte y empalme del RNA.
Las proteínas de choque térmico (HSP) son chaperones moleculares que estabilizan una gran serie de proteínas cliente. Los vertebrados tienen dos isoforinas de HSP90 citosólico, a saber, HSP90a (gen HSP90AA1) y H3R90b (gen HSP90AB1). En vertebrados, las isoformas de HSP90 son generalmente aproximadamente 85% idénticos a nivel de la secuencia de aminoácidos. En los humanos, la secuencia de aminoácidos HSP90a es 86% idéntica y 93% similar a la secuencia de los aminoácidos de HXR90b. Ambas proteínas incluyen un dominio de unión al ATP. La proteína H3R90b se expresa de forma constitutiva a un nivel alto en la mayor parte de las células y generalmente es más abundante que la HSP90a. La expresión de HSP90a es inducible por estrés y la proteína se sobre expresa en muchas células cancerosas. Las proteínas cliente de las isoformas HSP90 se traslapan grandemente, sin embargo, HSP90OÍ es responsable de chaperonizar múltiples proteínas señalizadoras, por ej., c-Src, A-raf, después del choque térmico.
Aunque los análisis in vitro sugieren funciones similares y altamente redundantes, los fenotipos para los ratones con silencionamiento de HSP90 son fuertemente diferentes. Los ratones con silenciamiento de Hbr90b presentan letalidad embriónica temprana. Por el contrario, el único defecto identificado en ratones deficientes de Hsp90a ocurre en los machos adultos, los cuales presentan una falla de la espermatogénesis. En el caso de Her90b, la letalidad ocurre en el día embriónico 9 debido a una incapacidad del embrión para desarrollar una placenta, originando una falla de la omplantación y la muerte dentro de 24 horas. Estos mutantes expresan Hsp90a, pero la falla todavía ocurre, sugiriendo que Hsp90a no puede compensar para Herqqb en este paso crucial del desarrollo. Contrario a H5r90b, tanto los ratones macho como hembras con silenciamiento de HSP90a son viables y con fenotipo normal en la adultez, con la excepción de la esterilidad en los ratones macho. Estos resultados demuestran que las dos isoformas de HSP90 desempeñan diferentes funciones in vivo en los ratones.
Utilizando diversos ensayos funcionales con las células del músculo esquelético humanas, primaria (HSMM) y células de hepatoma (HepG2), los solicitantes han demostrado que el silenciamiento mediado con RNAi de la proteína H3R90b dio lugar a una disminución de la relación basal OCR/ECAR en un ~50%. La relación disminuida se debió a la OCR disminuida y la ECAR elevada tanto en las células HSMM como en las HepG2, indicando que la proteína H3R90b regula la respiración oxidativa y la glucólisis. Más aún, el silenciamiento de HSP90 en células HSMM aumentó la ECAR inducida por glucosa, demostrando una glucólisis mejorada inducida por la HSP90 disminuida.
Además, los solicitantes han demostrado que en células del músculo esquelético humanas, primarias, el silenciamiento de HSP90 indujo un aumento en la captación de glucosa estimulada por insulina, indicando que HSP90 está implicada con el metabolismo de la glucosa y la acción de la insulina del músculo esquelético. Además, la observación de los solicitantes de que el silenciamiento de H£r90b en los miotubos da lugar a una inducción importante corriente abajo de pERK y una influencia moderada sobre pAKT y pGSK3 sugiere una bifurcación funcional de la señalización de la insulina y que la H3r90b está implicada en un mecanismo selectivo. En otros experimentos, los solicitantes han demostrado que un pan-inhibidor de la molécula pequeña HSP90 (CCT018159) que inhibe tanto a HSP90o¡como HSP90 tuvo un efecto menos intenso que el silenciamiento de H3R90b por sí solo sobre la señalización de la insulina y la bioenergética. Por consiguiente, se encontró que la inhibición especifica de HXRqOb es más eficaz que un enfoque de pan-inhibición de HSP90.
En resumen, los solicitantes encontraron que la HSP90 silenciada tiene un efecto importante sobre la bioenergética y el metabolismo del sustrato mitocondrial. En particular, la HSP90p surgió de los estudios descritos en la presente como un regulador critico del metabolismo celular y un conmutador molecular entre la respiración oxidativa y la glucólisis en las células del músculo esquelético. La proteina HSP90 por tanto, es un objetivo terapéutico viable en la diabetes.
Definiciones Cuando se utiliza en la presente, el término "inhibidor de HSP90" es un agente terapéutico que reduce la expresión o actividad de HSP90. Un inhibidor de HSP90 puede reducir la actividad de HSP90 ya sea interactuando directamente con HSP90 o reduciendo o impidiendo la formación del complejo HSP90/CDC37 de modo que se inhibe la expresión y el plegamiento apropiado de al menos una proteina cliente de HSP90. Cuando se utiliza en la presente, un inhibidor "HSP90" puede actuar mediante cualquier mecanismo, por ej., inhibiendo la expresión de HSP90 a nivel de RNA o la proteína; inhibiendo la actividad de HSP90, por ej., inhibiendo la unión a ATP o por hidrólisis; o inhibiendo la interacción de HSP90 con una o más de sus proteínas interactuantes; o disminuyendo la estabilidad de HSP90. Los inhibidores de HSP90 pueden inhibir la actividad de una o más isoformas de HSP90. Por ejemplo, un inhibidor de HSP90a también puede inhibir la HSP90¡3. De forma similar, un inhibidor de HSP90 también puede inhibir HSP90a. En una modalidad, los inhibidores de HSP90 pueden ser específicos para la inhibición de una isoforma especifica de HSP90, por ejemplo, específico para la inhibición de HSP903, es decir, inhibiendo de forma predominante HSP90p al mismo tiempo que inhibe mucho menos HSP90a.
Los inhibidores de HSP90 incluyen: (i) inhibidores de moléculas pequeñas, muchos de los cuales inhiben la actividad de múltiples isoformas de HSP90, por ej., radicicol y geldanamicina y sus derivados; (ii) inhibidores de ácidos nucleicos, por ej., antisentido, siRNA, shRNA, dsiRNA, etc. que pueden elegir una o más isoformas específicas de HSP90 (véase, por ej., los ejemplos proporcionados en la presente; Kuo et al . , 2007, J. Immunol . 1 78: 600 ; Didelotet al . , 2008, Cell .
DeathDiff. , 15: 859, el contenido completo de cada uno de los cuales se incorpora en la presente para referencia); y (iii) los anticuerpos que pueden elegir una o más isoformas especificas de HSP90 ( Cortes-González et al . , 2010, Cell Physiol . Biochem . 26: 657, los contenidos completos de los cuales se incorporan en la presente para referencia). Las clases especificas y ejemplos de los inhibidores de HSP90 se describen a detalle en la presente.
Cuando se utiliza en la presente, un inhibidor de HSP90 que es "especifico" para una isoforma de HSP90 particular, por ej., especifico para HSP903, puede tener una actividad significativamente menor contra otra isoforma de HSP. Sin embargo, como se utiliza en la presente, un inhibidor "especifico" de una isoforma de HSP90 particular es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 50 veces, al menos 75 veces, o al menos 100 veces más eficaz inhibiendo la actividad o expresión de la isoforma especifica de H3R90b. Por ejemplo, si el inhibidor es un siRNA especifico para HSP90 que sea al menos 10 veces más eficaz inhibiendo una isoforma de HSP90 específica, entonces una concentración 1 nM del siRNA disminuirá la expresión de H3R90b en la misma medida que una concentración 10 nM del siRNA disminuirá la expresión de HSP90a. Los análisis similares se pueden realizar para comparar el efecto de los inhibidores sobre la actividad de las isoformas HSP90, por ej., el nivel de inhibición de la fosforilación de los efectores corriente abajo, la inhibición del pliegue de las proteínas cliente, la inhibición de la producción de fosfato inorgánico, etc. En ciertas modalidades, un inhibidor específico de una isoforma de HSP90 inhibe la expresión o actividad de HSP90p en al menos 50%, pero no inhibe la expresión o actividad de HSP90a en 50%, 40%, 30%, 20%, 10% a la misma concentración. En ciertas modalidades, un inhibidor específico de una isoforma de H3R90b inhibe la expresión o actividad de HSP90 en al menos 60%, pero no inhibe la expresión o actividad de HSP90a en 50%, 40%, 30%, 20%, 10% a la misma concentración. En ciertas modalidades, un inhibidor específico de una isoforma H3R90b inhibe la expresión o actividad de HSP90 por al menos 70%, pero no inhibe la expresión o actividad de HSP90a en 50%, 40%, 30%, 20%, 10% a la misma concentración. En ciertas modalidades, un inhibidor específico de una isoforma H3R90b inhibe la expresión o actividad de HSP90 por al menos 80%, pero no inhibe la expresión o actividad de HSP90a en 50%, 40%, 30%, 20%, 10% a la misma concentración. En ciertas modalidades, un inhibidor especifico de una isoforma HSP90p inhibe la expresión o actividad de H3R90b por al menos 90%, pero no inhibe la expresión o actividad de HSP90a en 50%, 40%, 30%, 20%, 10% a la misma concentración.
Los métodos analíticos para determinar la especificidad y actividad de los inhibidores de HSP90 están dentro de las habilidades de los expertos en la téenica. El método de ensayo específico puede depender del inhibidor utilizado, por ej., un inhibidor de la actividad o un inhibidor de la expresión. Los kits para las pruebas de actividad de HSP90a y HSP90 están disponibles en el comercio (por ej., BPS Bioscience, San Diego, CA). Los métodos para las pruebas de actividad de HSP90a y HSP90p también son conocidos en la técnica (véase por ej . , Kim et al . , J. Biomol . Screening 2004; 9: 375-381 ; y Howes et al . , Anal . Biochem. 2006; 350:202-2013, el contenido completo de ambos se incorpora en la presente para referencia).
Por ejemplo, la inhibición de la actividad de Hsp90 se puede determinar en una prueba de la actividad de ATPasa, por ej., la Prueba del verde de Malaquita como se describe en Methods Mol Med, 2003 , 85:149. En resumen, una proteina Hsp90 (por ej., las proteínas Hsp90a y Hsp90p) en solución amortiguadora para el ensayo (Tris-HCl 100 nm, pH7.4, KC1 20 mM, MgCl26 mM), se mezclan con ATP por sí solo (un testigo negativo), ATP con geldanamicina (testigo positivo), ATP con un compuesto a ensayar a diferentes concentraciones, o un compuesto a ensayar por sí solo (otro testigo negativo) en una placa de 96 pozos. Para detectar el fosfato inorgánico producido por hidrólisis de ATP, el reactivo verde de Malaquita se adiciona entonces a la reacción. Las mezclas se incuban a 37°C durante 4 horas y, al final de la incubación, se adiciona a la reacción la solución amortiguadora de citrato de sodio (citrato de sodio al 34% p/volumen). La placa se lee mediante un lector ELISA con una absorbencia de 620 nm. La actividad contra HSP90a y HSP90p se puede comparar para determinar la especificidad, si hay alguna, del inhibidor. Esos análisis permiten la comparación directa de la actividad de los inhibidores contra cada una de las isoformas de HSP90.
De forma alternativa, la inhibición de la actividad de Hsp90 se puede determinar en una prueba de unión competitiva. Se sabe que la gendanamicina interactúa con el sitio de unión al ATP de Hsp90a o Herqqb y se puede desplazar fácilmente mediante otros inhibidores de Hsp90. La determinación del desplazamiento se facilita marcando la geldanamicina ya sea de forma fluorescente o no fluorescente. Una prueba de unión competitiva ejemplar utilizando gendana icina marcada de forma fluorescente está descrita en Yin , et al . , Int J Cáncer. 2010 Mar 1 ; 126 (5) : 1216-25 (incorporado a la presente para referencia). En resumen, una sonda de geldanamicina-FITC se reduce primero con TCEP a temperatura ambiente durante 3 horas, después de las cuales la solución se divide en alícuotas y se almacena a -80°C hasta que se utiliza. La Hsp90a o Hbr90b humana recombinante y la geldanamicina con FITC reducida se incuban en una microplaca de 96 pozos a temperatura ambiente durante 3 horas en presencia de la solución amortiguadora para la prueba que contenga HEPES 20 mM (pH 7.4), KC1 50 mM, MgCl25 mM, Ma2 Mo0420 mM, DTT 2 M, 0.1 mg/mL de BGG y CHAPS al 0.1% (v/v). Como testigo negativo no se incluye la proteína Hsp90 en la preincubación. Después de esta preincubación, un compuesto de prueba (como un competidor) en un disolvente se adiciona después a las concentraciones finales de 0.2 nM a 10mM (volumen final 100 pL). Como testigo positivo se utiliza geldanamicina no marcada como competidor. Como testigo negativo no se adiciona un compuesto de prueba ni geldanamicina no marcada. La reacción se incuba durante 16 h a temperatura ambiente y la fluorescencia se mide después en un lector de placas Analyst, excitación = 485 nm, emisión = 535 nm. Los testigos altos y bajos no contienen compuestos o Hsp90, respectivamente. Los datos se ajustan a una curva de 4 parámetros utilizando GraphPadPrism y se obtienen los valores de la IC50. Los valores de la I.C50 se convierten en constantes de inhibición (Ki) utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff modificada, como se describe en, por ej . , Machida , et al . , Cáncer Sci 2005; 96: 911-17 (3D . La actividad contra Hsp90a y Hsp90p se puede comparar para determinar la especificidad, si hay alguna, del inhibidor.
De forma alternativa, la actividad de HSP90 se puede analizar en células que expresen únicamente una isoforma de HSP90 simple, presente (por ej., levadura, C. elegans o células de mamíferos que expresen únicamente HSP90a o HSP90 ). La inhibición del plegado y/o estabilidad de una proteína cliente de ambas isoformas de HSP90 se probaron para determinar las actividades relativas de los inhibidores. Como se utiliza en la presente, un inhibidor de "ácido nucleico" de HSP90 es cualquier inhibidora a base de ácido nucleico que ocasione una disminución en la expresión de una HSP90 hibridando con al menos una parte del transcrito de RNA del gen HSP90AA1 y/o HSP90AB1 para dar lugar a una disminución en la expresión del HSP90a o HSP90. Los inhibidores de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico monocatenario, por ej., ácidos nucleicos antisentido y ácidos nucleicos bicatenarios, como pueden ser siRNA, shRNA, dsiRNA (véase, por e ., la publicación de la patente E.U.A. 20070104688). Como se utiliza en la presente, las moléculas de ácido nucleico bicatenario están diseñadas para ser bicatenarias en al menos 12, preferentemente al menos 15 nucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico bicatenarias pueden ser de ácido nucleico monocatenarias diseñadas para hibridarse a si mismas, por ej., una shRNA. Se entiende que un inhibidor de HSP90 se puede administrar como un ácido nucleico aislado. De forma alternativa, el inhibidor de ácido nucleico se puede administrar como un constructo de expresión para producir el inhibidor en la célula. En ciertas modalidades, el inhibidor de ácido nucleico incluye una o más modificaciones químicas para mejorar la actividad y/o estabilidad del inhibidor de ácido nucleico. Esas modificaciones son bien conocidas en la téenica. Las modificaciones específicas que se utilizarán dependerán, por ejemplo, del tipo de inhibidor de ácido nucleico.
Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo" es una proteina que incluye al menos una región determinadora de la complementariedad que se une con un antigeno diana especifico. Un anticuerpo frecuentemente incluye al menos una región variable de inmunoglobulina, por ej., una secuencia de aminoácidos que proporcionan un dominio variable de inmunoglobulina o secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada en la presente como VH), y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada en la presente como VL). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regiones variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El término "anticuerpo" abarca fragmentos de unión al antigeno de los anticuerpos (por ej., anticuerpos de cadena simple, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, y fragmentos dAb) asi como anticuerpos completos, por ej., inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (asi como subtipos de éstos). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. En una modalidad, el anticuerpo es glucosilado. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo modificado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo remodelado, un anticuerpo humanizado, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb, Fv de cadena simple, un fragmento de la región variable dimerizada (región V) (diacuerpo), un fragmento de la región V estabilizada con disulfuro (dsFv), aficuerpos, miméticos de los anticuerpos y una o más regiones determinadoras de la complementariedad aisladas (CDR) que conservan la unión especifica a la carga útil. Como se utiliza en la presente, una CDR "aislada" es una CDR que no está en el contexto de un anticuerpo natural. El anticuerpo puede ser de cualquier tipo de inmunoglobulina, por ej., IgG, IgM, IgAl, IgA2, IgD o IgE. En una modalidad, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano.
Como se utiliza en la presente, un inhibidor "molécula pequeña" es una molécula inhibidora que tiene un peso molecular menor de 1000 Da, preferiblemente menor de 750 Da o preferiblemente menor de 500 Da. En ciertas modalidades, una molécula pequeña no incluye una molécula de ácido nucleico. En ciertas modalidades, una molécula pequeña no incluye un péptido de más de tres aminoácidos de longitud.
Como se utiliza en la presente, para fines de simplicidad, un cambio o modulación en la expresión o actividad, es decir, aumento o disminución de una HSP90, por ej., HSP90a y/o H3R90b, la expresión o actividad se entiende que incluye un cambio en la expresión o actividad del gen y/o la proteína. En una modalidad, la expresión o actividad se reduce en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 99%.
Como se utiliza en la presente, un cambio en la "actividad" de HSP90 se puede detectar, por ejemplo, detectando un cambio en la actividad de la hidrólisis de ATP de HSP90, por ej., HSP90a y/o HXR90b, detectando un cambio en el plegado de las proteínas cliente de HSP90 específica. Los métodos para la detección de la hidrólisis de ATP, son bien conocidas en la téenica. El plegado de las proteínas cliente puede ser evaluado, por ejemplo, determinando la cantidad de una proteína cliente presente en la muestra o determinando la actividad de la proteína cliente en la muestra cuando la proteína cliente es una proteína de señalización que tiene actividad enzimática, por ej., actividad cinasa. Los equipos para evaluar la actividad de HSP90a y H3R90b también están disponibles en el comercio (por ej., de BSP Bioscience).
Como se utiliza en la presente, un individuo que sufre del "síndrome metabólico" se pretende que se refiera a un individuo que tiene una oo más de las siguientes condiciones: diabetes tipo 2, resistencia a la insulina, insuficiencia de insulina, obesidad, hiperinsulinemia o deficiencia de la tolerancia a la glucosa (IGT); o que tiene tres o más de los siguientes signos del síndrome metabólico. a)presión sanguínea igual a o mayor de 130/85 mmHg; b) glucosa en sangre en ayuno igual a o mayor de 100mg/dL; c)circunferencia de cintura grande en donde una circunferencia de cintura grande es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d) colesterol HDL bajo en donde el colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL para varones y debajo de 50mg/dL para mujeres; y e) triglicéridos igual a o mayor que 150mg/dL.
Los métodos para diagnosticar las condiciones indicadas y para detectar los signos indicados del síndrome metabólico son rutinarios en la téenica. En ciertas modalidades, el síndrome metabólico además incluye diabetes tipo 1. En ciertas modalidades, el síndrome metabólico no incluye diabetes tipo 1. Las enfermedades y signos asociados incluyen hiperuricemia, hígado graso (especialmente en obesidad concurrente) progresando a enfermedad de ácido graso no alcohólico (NAFLD), síndrome de ovario poliquístico (en mujeres), y acanthosis nigricans. En ciertas modalidades, la invención incluye tratamiento de una o más de estas enfermedades o signos asociados. En ciertas modalidades, la invención no incluye tratamiento de una o más de estas enfermedades o signos asociados.
Como se utiliza en la presente, se pretende que "diabetes" se refiera a cualquier tipo: diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2 o ambas, diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2. En ciertas modalidades, la diabetes incluye prediabetes. En ciertas modalidades, la diabetes no incluye prediabetes.
Como se utiliza en la presente, "resistencia a la insulina" e "insensibilidad a la insulina" se pueden utilizar de forma intercambiable y se refieren a las condiciones en donde la cantidad de insulina es menos efectiva para bajar el azúcar en la sangre que en un individuo normal que resulta en un aumento en azúcar en la sangre arriba del intervalo normal que no se debe a la ausencia de insulina. Sin estar limitado a algún mecanismo, las condiciones comúnmente están asociadas con una disminución en la señalización a través del receptor de insulina. Comúnmente, la resistencia a la insulina en el músculo y células grasas reduce la captación de glucosa y almacenamiento como glucógeno y triglicéridos , respectivamente. La resistencia a la insulina en las células hepáticas resulta en la sintesis glucógena reducida y una falla para suprimir la producción de glucosa y liberación en la sangre .
La resistencia a la insulina frecuentemente está presente en el mismo individuo junto con "insuficiencia de insulina", lo cual también resulta en un aumento de azúcar en la sangre arriba del intervalo normal que no se debe a la ausencia de insulina. La insuficiencia de insulina es una condición relacionada con una falta de acción de la insulina en la cual la insulina está presente y es producida por el cuerpo. Es distinto de la diabetes tipo 1 en la cual la insulina no se produce debido a la falta de células del islote.
Para el propósito de determinar si un individuo tiene síndrome metabólico, no es importante distinguir si un individuo sufre de resistencia a la insulina, insuficiencia de insulina o ambas.
Como se utiliza en la presente, la "obesidad" se puede definir utilizando cualquier definición pertinente clínicamente. Por ejemplo, en adultos, el índice de masa corporal (BMI (IMC) ) , Kg/m2) frecuentemente se utiliza como una medida de sobrepeso y obesidad, siendo definido el sobre peso como un BMI25-29.9 Kg/m2, obesidad como un BMI igual a o mayor que 30 Kg/m2, y obesidad mórbida siendo definida como BMI sobre 40 Kg/m2. La obesidad también se puede definir en los adultos mediante la adiposidad central midiendo la circunferencia de la cintura, con circunferencia de la cintura elevada definida como igual a o mayor de 102 cm en hombres e igual a o mayor de 88 cm en mujeres. El tratamiento para la obesidad no requiere una disminución de BMI o circunferencia de la cintura a los niveles normales. En su lugar, el tratamiento preferiblemente incluye una disminución de al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, o más del exceso del valor BMI o exceso de la circunferencia de la cintura sobre un límite normal superior para el individuo. Por ejemplo, una mujer con una circunferencia de cintura de 100 cm podría tener un exceso de circunferencia de cintura de 12cm (100cm-88 cm). La reducción del exceso en 20% sería una reducción de 2.4 cm.
La "hiperinsulinemia" se define como la condición en la cual un individuo con resistencia a la insulina, con o sin glucemia, en la cual la concentración de insulina en el suero postprandial o plasma en ayuno se eleva arriba de la normal, los individuos delgados sin resistencia a la insulina (es decir, >100 mg/dL en una prueba de glucemia en ayuno o >140 mg/dL en una prueba oral de tolerancia a la glucosa), además de tener una relación de cadera a cintura <1.0 (para hombres) o <0.8 (para mujeres).
El término "deficiencia de la tolerancia a la glucosa" (IGT) o "prediabetes" se utiliza para describir a una persona que, cuando se hace una determinada prueba de tolerancia a la glucosa, tiene un nivel de glucosa en la sangre que cae entre el valor normal e hiperglucemia. Esa persona está en un riesgo elevado de desarrollar diabetes, aunque no se considera que tenga diabetes. Por ejemplo, la deficiencia de la tolerancia a la glucosa se refiere a una condición en la cual un paciente tiene una concentración de glucosa en san'gre en ayuno o concentración de glucosa en suero en ayuno mayor de 110 mg/dL y menor de 126 rng/dL (7.00 mmol/L), o una concentración de glucosa en sangre o concentración de glucosa en el suero, posprandial de 2 horas, mayor de 140 mg/dL (7.78 mmol/L) y menor de 200 mg/dL (11.11 mmol/L). La creciente evidencia sugiere que la condición de prediabetes puede ser un factor de riesgo para desarrollar la enfermedad cardiovascular (Diabetes Care, 26:2910-2914, 2003). La prediabetes, también mencionada como una deficiencia de tolerancia a la glucosa o deficiencia a la glucosa en ayuno es un factor de riesgo principal para el desarrollo de la diabetes mellitus tipo 2, enfermedad cardiovascular y mortalidad. Se ha prestado mucha atención el desarrollo de intervenciones terapéuticas que prevengan el desarrollo de la diabetes tipo 2 tratando de forma eficaz la prediabetes (Farmacotherapv, 24 : 362-71 , 2004) .
La condición de "hiperglucemia" (concentración elevada del azúcar en la sangre) es una condición en la que el nivel de glucosa en la sangre es demasiado alto. Comúnmente, la hiperglucemia ocurre cuando el nivel de glucosa en la sangre aumenta arriba de 180 mg/dL. Los síntomas de la hiperglucemia incluyen orina frecuente, sed excesiva y, en un periodo de tiempo más largo, pérdida de peso.
La condición de "hipogluce ia" (baja concentración de azúcar en la sangre) es una condición en la que es demasiado bajo el nivel de glucosa en la sangre. Comúnmente, la hipoglucemia ocurre cuando el nivel de glucosa en la sangre cae debajo de 70 mg/dL. Los síntomas de la hipoglucemia incluyen mal humor, entumecimiento de las extremidades (especialmente en las manos y brazos), confusión, temblores o mareos. Debido a que esta condición surge cuando hay un exceso de insulina sobre la cantidad de glucosa disponible, algunas veces se menciona como una reacción a la insulina.
Como se utiliza en la presente, por el término "nivel de HbAlc" se entiende un nivel de hemoglobina Ale (HbAlc) determinado a partir de una prueba HbAlc, que evalúa los niveles promedio de la glucosa en la sangre que evalúa los niveles promedio de glucosa en la sangre durante los dos y tres meses anteriores. Una persona sin diabetes comúnmente tiene un valor HbAlc que varía entre 4% y 6% . La prediabetes se caracteriza por un nivel de HbAlc desde 5.7% hasta 6.5%, siendo un nivel de HbAlc mayor de 6.5% indicativo de diabetes. Para cada 1% de aumento en HblAc, los niveles de glucosa en la sangre aumentan en aproximadamente 30 mg/dL y el riesgo de complicaciones debido a los aumentos elevados de glucosa en la sangre, persistentes. Preferentemente, el valor HbAlc de un paciente que está siendo tratado de acuerdo con la presente invención se reduce a menos de 9%, menos de 7%, menos de 6%, y más preferentemente alrededor de 5%. De este modo, el nivel de HbAlc en exceso del paciente que está siendo tratado (es decir, el nivel de HblAc en exceso de 5.7%) preferentemente se disminuye en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en relación con esos niveles antes del tratamiento.
Como se utiliza en la presente, el término "individuo" se refiere a animales humanos y no humanos, incluyendo individuos veterinarios. El término " animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ej ., mamíferos y no mamíferos, como pueden ser primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, y reptiles. En una modalidad preferida, el individuo es un humano y se puede mencionar como un paciente.
Como se utiliza en la presente, los términos "tratar," "tratando" o "tratamiento" se refieren, preferiblemente, a una acción para obtener un resultado clínico benéfico o deseado que puede ser, mas no se limita a, el alivio o mejora de uno o más signos o síntomas de una enfermedad o condición, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilidad (es decir, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad. Como se utiliza en la presente, el tratamiento puede incluir una o más se las siguientes:: reducciones de la resistencia a la insulina, aumento en la sensibilidad a la insulina, disminución de la deficiencia de la insulina, mejoramiento o normalización de los niveles HbAcl, mejora o normalización de los niveles de glucosa en la sangre, reducción del peso corporal, reducción de la medida de la cintura, normalización o reducción de los niveles de HDL, normalización o reducción de los niveles de triglicéridos y mejoramiento de al menos un signo o síntoma de la diabetes. No es necesario que el tratamiento sea curativo. No es necesario que el resultado del tratamiento se determine cuantitativamente. Sin embargo, en ciertas modalidades, el resultado del tratamiento se puede cuantificar considerando el porcentaje de mejora hacia un valor normal al final del intervalo. Por ejemplo, el síndrome metabólico se caracteriza por un exceso de algunas medidas (por ej., peso/BMI, circunferencia de la cintura, niveles de triglicéridos) y una deficiencia en otras medidas (por ej., una deficiencia en el colesterol HDL o respuesta a la insulina). Una mujer con una circunferencia de la cintura de 100 cm tendría un exceso de circunferencia de cintura de 12 cm (100cm-88cm, la máxima circunferencia de cintura normal). La reducción del exceso de circunferencia de cintura en 20% sería una reducción de 2.4 cm en exceso de la circunferencia de la cintura. Los cálculos similares se pueden hacer para otros valores Un hombre con un HDL de 30 mg/dl tendría una deficiencia de 20 mg/dL (el valor normal para hombres es al menos 50 mg/dL). Un aumento desde 5 mg/dL hasta 25 mg/dL se considerarla que reduce la deficiencia de HDL en 25%.
Como se utiliza en la presente, "reducir los niveles de glucosa" significa reducir el nivel elevado de glucosa en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más para obtener un nivel de glucosa normalizado, es decir, un nivel de glucosa no mayor de 150 mg/dL. De forma deseable, los niveles de glucosa se reducen a niveles normoglucémicos, es decir, entre 150 a 60 mg/dL, entre 140 a 70 mg/dL, entre 130 a 70 mg/dL, entre 125 a 80 mg/dL, y preferiblemente entre 120 a 80 mg/dL. Tal reducción en los niveles de glucosa se puede obtener aumentando cualquiera de las actividades biológicas asociadas con el aclaramiento de la glucosa de la sangre. Por consiguiente, un agente que tiene la habilidad de reducir los niveles de glucosa puede aumentar la producción, secreción o acción de la insulina. La acción de la insulina se puede aumentar, por ejemplo, aumentando la captación de glucosa por los tejidos periféricos y/o reduciendo la producción de glucosa hepática. De forma alternativa, el agente de la invención puede reducir la absorción de carbohidratos desde los intestinos, alterar la actividad transportadora de la glucosa (por ej., aumentando la expresión, actividad intrínseca, o translocación de GLUT4), aumentar la cantidad de tejido sensible a la insulina (por ej., aumentando la diferenciación de las células de los músculos o de las células adipocitos) o alterar la transcripción del gen en los adipocitos o células del músculo (por ej., secreción alterada de factores de la expresión de adipocitos de los genes de la vía metabólica). De forma deseable, el agente de la invención aumenta más de una de las actividades asociadas con el aclaramiento de la glucosa.
Por "reducir los niveles de lípidos" se entiende que se reduce el nivel del exceso de lípidos en al menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más para obtener un nivel de lípidos normal, es decir, no mayor de 150 mg/dL.
Por "alterar la vía de señalización de la insulina para que los niveles de glucosa se reduzcan" se entiende que se altera (incrementando o disminuyendo) cualquiera de las actividades implicadas en la señalización de insulina de modo que el resultado total sea un aumento en el aclaramiento de la glucosa desde el plasma. Por ejemplo, alterando la vía de señalización de insulina ocasionando con esto un aumento en la producción, secreción de la insulina, un aumento en la captación de glucosa mediante los tejidos periféricos, una reducción en la producción de glucosa hepática, o una reducción de la absorción de carbohidratos desde los intestinos.
Una "cantidad terapéutica eficaz" es la cantidad suficiente para tratar una enfermedad en un individuo. Una cantidad terapéutica eficaz se puede administrar en una o más administraciones.
Por "diagnóstico" y similares, como se utiliza en la presente, se refiere a una evaluación clínica u otra evaluación de la condición de un individuo con base en la observación, prueba, o circunstancias para identificar que un individuo tiene una enfermedad, trastorno o condición con base en la presencia de al menos un indicador, como puede ser un signo o síntoma de la enfermedad, trastorno, o condición. Comúnmente, el diagnóstico, utilizando el método de la invención, incluye la observación en el individuo de indicadores múltiples de la enfermedad, trastorno o condición, junto con los métodos proporcionados en la presente. Los métodos de diagnóstico proporcionan un indicador de que una enfermedad está o no está presente. Una prueba de diagnóstico simple comúnmente no proporciona una conclusión definitiva en relación con el estado de la enfermedad del individuo que está siendo analizado.
Como se utiliza en la presente, "monitorización" se entiende como una evaluación de al menos un signo o síntoma de una enfermedad en un individuo en un primer punto de tiempo y en un segundo punto de tiempo posterior, comparando la gravedad del signo o signos o síntoma o síntomas de la condición, y determinando si la condición se vuelve más o menos grave durante el tiempo.
Los términos "administrar", "administrando" o "administración" incluyen cualquier método de entrega de una composición o agente de uso farmacéutico en un sistema del individuo o a una región particular en o sobre un individuo. En ciertas modalidades, el agente se administra por la vía enteral o parenteral. En otras modalidades de la invención, se administra un agente por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intranasal, oral, transcutánea o mucosa. En ciertas modalidades preferidas, se administra un agente por la via intravenosa. En ciertas modalidades, el agente se administra en forma local o sistemática. La administración de un agente la puede realizar un grupo de personas que trabajen en forma coordinada. Administrar un agente incluye, por ejemplo, prescribir un agente que se va a administrar a un individuo y/o proporcionar instrucciones directamente o a través de otro, tomar un agente especifico, ya sea mediante autoentrega, por ej., como puede ser por entrega oral, entrega subcutánea, entrega intravenosa a través de una linea central, etc.; o para entrega mediante un profesional entrenado, por ej., entrega intravenosa, entrega intramuscular, etcétera.
El término "muestra" como se utiliza en la presente se refiere a una recolección de fluidos similares, células, o tejidos aislados de un individuo. El término "muestra" incluye cualquier fluido corporal (por ej., orina, suero, fluidos sanguíneos, linfa, fluidos ginecológicos, fluidos quísticos, fluido aséptico, fluidos oculares y fluidos recolectados mediante lavado bronquial y/o enjuague peritoneal), ascites, muestras de tejido (por ej., muestras de tumor) o una célula de un individuo. Otras muestras del individuo incluyen lágrimas, suero, fluido cerebroespinal, heces, esputo y extractos de células. En una modalidad particular, la muestra es orina o suero. En otra modalidad, la muestra no incluye ascites o no es una muestra de ascites. En una modalidad, la muestra consiste en células. En otra modalidad, 1a.muestra no consiste en células.
El término "muestra testigo," como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier muestra comparativa clínicamente pertinente, incluyendo, por ejemplo, una muestra, de un individuo saludable no afligido con el síndrome metabólico o una muestra de un individuo en un punto de tiempo anterior, por ej., antes del tratamiento, en una etapa anterior del tratamiento. Una muestra testigo puede ser una muestra purificada, proteína y/o ácido nucleico proporcionado con un equipo. Estas muestras testigo se pueden diluir, por ejemplo, en una serie de diluciones para permitir las mediciones cuantitativas de analitos en las muestras de prueba. Una muestra testigo puede incluir una muestra obtenida de uno o más individuos. Una muestra testigo también puede ser una muestra del individuo que se va a evaluar, tomada en un punto de tiempo anterior. Por ejemplo, la muestra testigo puede ser una muestra del individuo que se va a evaluar tomada antes de iniciar el síndrome metabólico, en una etapa anterior de la enfermedad, o antes de la administración del tratamiento o de una parte del tratamiento. La muestra testigo también puede ser una muestra de un modelo animal, o de un tejido o líneas de células derivadas del modelo animal del síndrome metabólico. El nivel de HSP90, por ej., HSP90a y/o H3R90b, actividad o expresión en una muestra testigo que consiste en un grupo de mediciones que se pueden determinar, por ej ., con base en cualquier medida estadísticamente adecuada, como puede ser, por ejemplo, las medidas de tendencia central que incluyen los valores promedio, media o moda.
El término "nivel testigo" se refiere a un nivel aceptado o predeterminado de un signo de un trastorno metabólico en un individuo o una muestra del individuo. Se considera que los siguientes son niveles normales: --Presión arterial menor que o igual a 120/80 mmHG — Glucosa en sangre en ayuno menor que o igual a 100 mg/dL.
— Circunferencia de la cintura menor de 40 pulgadas (102 cm) para varones y menor de 35 pulgadas (88 cm) para mujeres.
— HDL al menos 50 mg/dL para mujeres, al menos de 40 mg/dL para hombres.
— Triglicéridos menos de o igual a 150 mg/dL.
— HbAlc menor de o igual a 5.7%.
--Prueba de tolerancia a la glucosa oral menor de o igual a 140 mg/dL.
Como se utiliza en la presente, el término "se obtiene", se entiende que se refiere a la preparación, compra o de otra manera, la posesión de.
Como se utiliza en la presente, "detectar", "detección" y similares se entiende que se refieren a un ensayo realizado para la identificación de un analito especifico en una muestra, por ej., una HSP90, por ej., HSP90o¡ y/o HSP90p, nivel de expresión o actividad en una muestra. La cantidad de analito o la actividad detectada en la muestra puede ser ninguna o debajo del nivel de detección del ensayo o método.
Los términos "modular" o "modulación" se refieren a la regulación ascendente (es decir, activación o estimulación), regulación descendente (es decir, inhibición o supresión) de un nivel, o las dos, en combinación o separadas. Un "modulador" es un compuesto o molécula que modula, y puede ser, por ej., un agonista, antagonista, activador, estimulador, supresor o inhibidor El término "expresión" se utiliza en la presente para significar el proceso por el cual un polipéptido se produce a partir del DNA. El proceso implica la transcripción del gen en el mRNA y la traducción de este mRNA en un polipéptido. Dependiendo del contexto en el que se utilice, el término "expresión" se puede referir a la producción de RNA, o proteína, o ambos.
Los términos "nivel de expresión de un gen" o " nivel de expresión del gen" se refiere al nivel de mRNA, así como el(los) transcrit(s) naciente del pre-mRNA, transcrito que procesa intermedios, los mRNA maduros y los productos de la degradación o el nivel de proteína, codificado por el gen en la célula.
Como se utiliza en la presente, "nivel de actividad" se entiende como la cantidad de actividad de la proteína, comúnmente actividad enzimática, tal y como se determina mediante un ensayo cuantitativo, semi-cuantitativo o cualitativo. La actividad comúnmente se determina monitorizando la cantidad de producto producido en un ensayo utilizando un sustrato que produce un producto detectable fácilmente, por ej., producto coloreado, producto fluorescente o producto radioactivo. El ensayo específico que se realice depende, por ejemplo, de la actividad que se va a medir .
Los artículos "un", "una" y "el" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo, a menos que se indique claramente de otro modo. Por ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
El término "incluyendo" se utiliza en la presente para significar, y se utiliza de forma intercambiable con, la frase "que incluye mas no limitado a".
El término "o" se utiliza en la presente para significar, y se utiliza de forma intercambiable con, el término "y/o" a menos que el contexto claramente lo indique de otro modo.
El término "como puede ser" se utiliza en la presente para significar, y se utiliza de forma intercambiable con, la frase "como puede ser, mas no se limita a".
A menos que se mencione específicamente o sea evidente a partir del contexto, como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" se entiende que está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la téenica, por ejemplo dentro de 2 deviaciones estándar del significado. Aproximadamente se puede entender como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% del valor mencionado. A menos que de otro modo sea claro del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en la presente se pueden modificar mediante el término aproximadamente .
La mención de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en la presente incluye las definiciones de esa variable como cualquier grupo simple o combinación de los grupos listados. La mención de una modalidad para una variable o aspecto en la presente incluye esa modalidad como cualquier modalidad simple o en combinación con cualquier otra modalidad o partes de ésta.
Cualquier composición o método proporcionado en la presente se puede combinar con una o más cualesquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en la presente.
Los intervalos proporcionados en la presente se entienden en una forma conveniente para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, un intervalo desde 1 hasta 50 se entiende que incluye cualquier número, combinación of números, o sub-intervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.
Ahora se hará referencia en detalle a las modalidades preferidas de la invención. Aunque la invención se describirá junto con las modalidades preferidas, se entenderá que no se pretende limitar la invención a esas modalidades preferidas. Por el contrario, se intenta cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden estar incluidas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.
I. Síndrome Metabólico.
El síndrome metabólico (Síndrome X) es un nombre para un grupo de factores de riesgo que ocurren juntos y aumentan el riesgo de enfermedades de la arteria coronaria, derrame cerebral y diabetes tipo 2 (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0004546/). El síndrome metabólico se está volviendo cada vez más común en Estados Unidos de Norteamérica. Los investigadores no están seguros si el síndrome se debe a una sola causa, pero todos los riesgos para el síndrome están relacionados con la obesidad. Como se utiliza en la presente, el término síndrome metabólico se entiende que incluye resistencia a la insulina, insuficiencia de insulina, pre-diabetes, diabetes tipo 2 y obesidad. Un individuo que cubre los criterios de diagnostico que se dan más adelante también se entiende que tiene síndrome metabólico. En algunas modalidades de la invención, el síndrome metabólico también puede incluir la diabetes tipo 1. En otras modalidades, el síndrome metabólico no incluye la diabetes tipo 1.
Los dos factores de riesgo más importantes para el síndrome metabólico son mayor peso alrededor de las partes superior y media del cuerpo (obesidad central) y resistencia a la insulina, en la cual e.1 cuerpo no puede utilizar la insulina de forma eficaz. La insulina controla la cantidad de azúcar en el cuerpo. En individuos en los que el cuerpo no produce suficiente insulina y/o el cuerpo no responde al nivel de insulina que se produce, los niveles de azúcar en la sangre y grasa aumentan. Otros factores de riesgo para el síndrome metabólico incluyen edad, factores genéticos, cambios hormonales y un estilo de vida sedentario. La gente con síndrome metabólico frecuentemente sufre de uno o ambos de: coagulación excesiva de la sangre y bajos niveles de inflamación sistémica, ambos de los cuales pueden exacerbar el estado.
La Asociación Americana del Corazón y el Instituto Nacional de Corazón, Pulmón y Sangre, consideran que el síndrome metabólico está presente en individuos que tienen tres o más de los siguientes signos: • Presión arterial igual a o mayor de 130/85 mHg • Azúcar (glucosa) en sangre en ayuno igual a o mayor de 100 mg/dL • Circunferencia grande de la cintura (longitud alrededor de la cintura): o Hombres - 40 pulgadas o más o Mujeres - 35 pulgadas o más • Baja concentración de colesterol HDL: o Hombres - debajo de 40 mg/dL o Míajeres - debajo de 50 mg/dL • Triglicéridos igual a o más altos que 150 mg/dL.
El tratamiento incluye cambios en el estilo de vida recomendados o medicinas para ayudar a reducir la presión arterial, el colesterol LDL y el azúcar en la sangre, por ej., pérdida de peso, aumento de ejercicio. La presión arterial y el colesterol también se pueden regular utilizando los fármacos apropiados.
Además de tener un aumento de riesgo a largo plazo para el desarrollo de la enfermedad cardiovascular y la diabetes tipo 2, las complicaciones del síndrome metabólico además incluyen aterosclerosis, ataque cardiaco, enfermedad de los riñones, enfermedad de hígado graso no alcohólico, enfermedad de las arterias periféricas y derrame cerebral, así como complicaciones comúnmente asociadas con la diabetes.
A. Diabetes, Resistencia a la insulina, Insuficiencia de insulina.
La diabetes mellitus (DM) frecuentemente sólo se menciona como diabetes, es un grupo de enfermedades metabólicas en las cuales una persona tiene azúcar elevada en la sangre, ya sea porque el cuerpo no produce insulina o porque las células no responden a la insulina que se produce. Esta azúcar en la sangre elevada produce los síntomas clásicos de poliuria (orina frecuente), polidipsia (aumento de sed) y polifagia (aumento de hambre).
La diabetes tipo 2 resulta de la resistencia a la insulina, una condición en la cual las células fallan al utilizar adecuadamente la insulina, algunas veces combinado con una deficiencia absoluta de insulina. La respuesta defectuosa de los tejidos corporales a la insulina, se cree, al menos en parte, implica al receptor de insulina. Sin embargo, los defectos específicos no se conocen.
En una etapa temprana de la diabetes tipo 2, la anormalidad predominante se reduce a la sensibilidad a la insulina. En esta etapa la hiperglucemia se puede invertir mediante una variedad de medidas y medicaciones que mejoran la sensibilidad a la insulina o reducen la producción de glucosa por el hígado. La prediabetes indica una condición que ocurre cuando los niveles de glucosa en la sangre de una persona son más altos que los normales, pero no suficientemente altos para un diagnóstico de diabetes tipo 2.
La diabetes tipo 2 se debe a la producción insuficiente de insulina a partir de las células beta en el contexto de resistencia a la insulina. La resistencia a la insulina, que es la inhabilidad de las células para responder adecuadamente a los niveles normales de insulina, ocurre principalmente dentro de los músculos, hígado y tejido graso. En el hígado la insulina normalmente suprime la liberación de glucosa. Sin embargo, en el contexto de resistencia a la insulina, el hígado libera de forma inadecuada glucosa en la sangre. La proporción de resistencia a la insulina contra la disfunción de las células beta difiere entre los individuos, teniendo algunos resistencia a la insulina principalmente y sólo un defecto menor en la secreción de insulina, y otros con ligera resistencia a la insulina y principalmente una falta de la secreción de la insulina.
Otros mecanismos potencialmente importantes asociados con la diabetes tipo 2 y resistencia a la insulina son: mayor fragmentación de lípidos en las células grasas, resistencia a, y ausencia de incretina, altos niveles de glucagon en la sangre, retención aumentada de sal y agua en los riñones, y regulación inapropiada del metabolismo por el sistema nervioso central. Sin embargo no toda la gente con resistencia a la insulina desarrolla diabetes, ya que también se requiere una deficiencia en la secreción de insulina de las células pancreáticas beta.
La diabetes tipo 1 resulta de la falla del cuerpo para producir insulina, y actualmente requiere tratamiento con insulina inyectable. La diabetes tipo 1 se caracteriza por pérdida de las células beta que producen insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, originando la deficiencia de insulina. Cuando se inicia, la gente más afectada es de otro modo saludable y de un peso saludable. La sensibilidad y respuesta a la insulina generalmente son normales, especialmente en las etapas tempranas. Sin embargo, particularmente en las etapas posteriores, puede ocurrir la resistencia a la insulina. 6. Patologías secundarias de diabetes, resistencia a la insulina, e insuficiencia de insulina Las regulación anormal de la glucosa que resulta de la diabetes, tipo 1 y tipo 2, resistencia a la insulina, e insuficiencia de insulina están asociadas con patologías secundarias, muchas de las cuales resultan de la mala circulación. Esas patologías secundarias incluyen degeneración macular, neuropatías periféricas, úlceras y disminución de la cicatrización y función disminuida de los riñones. Se ha sugerido que si se mantienen los niveles de glucosa y/o los niveles de HbAcl dentro de los intervalos normales se disminuye la presencia de estas patologías secundarias. Se entiende que la normalización de la glucosa en la sangre, de la insulina y los niveles de HblAc reducirá el desarrollo de patologías secundarias limitando la patología primaria, por ej., el síndrome metabólico. En ciertas modalidades, los inhibidores de HSP90, especialmente los inhibidores de H3R90b e inhibidores específicos de HSP90p, no se utilizan para el tratamiento de patologías secundarias asociadas con la diabetes y el síndrome metabólico. En ciertas modalidades, los inhibidores de HSP90, especialmente los inhibidores de H3R90b e inhibidores específicos de H3R90b, se utilizan para el tratamiento de patologías secundarias asociadas con la diabetes y el síndrome metabólico.
II. Dosis y modos de administración Las téenicas y dosis para la administración varían dependiendo del tipo de compuesto (por ej., compuesto químico, anticuerpo o ácido nucleico) y son bien conocidos por los expertos en la técnica o se determinan fácilmente.
Los compuestos terapéuticos de la presente invención se pueden administrar con un diluyente, portador o excipiente aceptable para uso farmacéutico, en formas farmacéuticas unitarias. La administración puede ser parenteral, intravenosa, ssuubbccuuttáánneeaa,, oral, tópica o local. La administración de un agente la puede realizar un grupo de personas que trabajen en forma coordinada. La administración de un agente, puede ser, por ejemplo, la prescripción de un agente que se va administrar a un individuo y/o proporcionar instrucciones, directamente o a través de otro, para tomar un agente especifico, ya sea mediante autoentrega, por ej., mediante entrega oral, entrega subcutánea, entrega intravenosa a través de una linea central, etc.; o para entrega mediante un profesional entrenado, por ej., entrega intravenosa, entrega intramuscular, entrega intratumoral, etcétera.
La composición puede estar en la forma de una pildora, tableta, cápsula, liquido o tableta de liberación sostenida para la administración oral; o un liquido para la administración intravenosa, subcutánea, o parenteral; o un polímero u otros vehículos de liberación sostenida para administración local.
Los métodos bien conocidos en la téenica para preparar las formulaciones se encuentran en "Remington : The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed. , ed. A. R. Gennaro , 2000, Lippincott Williams & Wilkíns, Philadelphia , Pa . ) . Las formulaciones para la administración parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilen glicol, como puede ser polietilen glicol, aceites de origen vegetal o naftálenos hidrogenados. Los polímeros lácticos biodegradables, biocompatibles, copolímero lacturo/glicro o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno se pueden utilizar para controlar la liberación de los compuestos. Las formaciones nanoparticuladas (por ej., nanopartículas biodegradables, nanopartículas de lípidos sólidos, liposomas) se pueden utilizar para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de entrega parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímeros de acetato de vinilo-etileno, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. La concentración del compuesto en la formulación varía dependiendo de diversos factores, como pueden ser la dosis del fármaco que se va administrar y la vía de administración.
El compuesto se puede administrar, como una opción, como una sal aceptable para uso farmacéutico, como pueden ser las sales de adición ácida, no tóxicas o complejos metálicos que comúnmente se utilizan en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición ácida incluyen ácidos orgánicos, como pueden ser los ácidos: acético, láctico, pamóico, maléico, cítrico, mélico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metansulfónico, toluensulfónico o trifluoroacético y similares; los ácidos poliméricos, como puede ser, ácido tánico, carboximetilcelulosa y similares; y ácidos inorgánicos como pueden ser ácido clohídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares. Los complejos metálicos incluyen zinc, hierro y similares.
Las formulaciones para uso oral pueden ser tabletas que contienen los ingredientes activos en una mezcla con excipientes aceptables para uso farmacéuticos, no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, deslizantes, y antiadhesivos (por ej., estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido estéarico, silicios, aceites vegetales hidrogenados o talco). Las formulaciones para uso oral también se pueden proporcionar como tabletas masticables o como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluvente sólido inerte, o como cápsulas de gelatina suave, en donde el ingrediente se mezcla con agua o un medio oleoso.
La dosis y el tiempo de administración del compuesto dependen de diversos factores clínicos que inluyen la salud general del individuo y la gravedad de los síntomas de la enfermedad, por ej., diabetes, síndrome metabólico.
III. Productos terapéuticos de ácido nucleico Los ácidos nucleicos terapéuticos son bien conocidos en la téenica. Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen ácidos nucleicos tanto monocatenarios como bicatenarios (es decir, ácidos nucleicos terapéuticos que tienen una región de complementariedad de al menos 15 nucleótidos de longitud) que son complementarios a una secuencia diana de una célula. Los ácidos nucleicos terapéuticos se pueden liberar a una célula en cultivo, por ej ., adicionando el ácido nucleico al medio de cultivo por sí solo o con un agente para promover la captación del ácido nucleico en la célula. Los ácidos nucleicos terapéuticos se pueden entregar a una célula en un individuo, es decir, in vivo, mediante cualquier vía de administración. La formulación específica dependerá de la vía de administración.
Como se utiliza en la presente, y a menos que se indique de otro modo, el término "complementaria", cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la habilidad de un oligonucleótido o un poligonucleótido que contiene la primera secuencia de nucleótidos para hibridar y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o poligonucleótido que contiene la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderán las personas con experiencia. Estas condiciones, por ejemplo, pueden ser condiciones rigurosas, donde las condiciones rigurosas pueden ser: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM, pH 6.4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C, durante 12-16 horas, seguido por lavado. Pueden emplearse otras condiciones, como pueden ser las condiciones fisiológicas pertinentes que se pueden encontrar dentro de un organismo. La persona con experiencia será capaz de determinar la serie de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias pueden ser "totalmente complementarias" entre si cuando haya apareamiento de bases de los nucleótidos de la primera secuencia de nucleótidos, con los nucleótidos de la segunda secuencia de nucleótidos a todo lo largo de la primera y segunda secuencias de nucleótidos. Sin embargo, cuando en la presente se menciona una primera secuencia como "considerablemente complementaria" con respecto a una segunda secuencia, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias, o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 4, 3 o 2 pares de bases mal apareadas tras la hibridación, al mismo tiempo que retienen la habilidad para hibridar bajo las condiciones más pertinentes a su aplicación definitiva. Sin embargo, donde estos dos oligonucleótidos están diseñados para formar, tras la hibridación, uno o más, colgantes monocatenarios como es común en los ácidos nucleicos terapéuticos bicatenarios, tales colgantes no se deben considerar como mal apareados con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un dsRNA que contenga un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud, y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo consiste en una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, también se puede mencionar como "totalmente complementario" para los propósitos descritos en la presente.
Las secuencias "complementarias" como se utilizan en la presente, también pueden incluir, o estar formadas totalmente de, pares de bases no de Watson-Crick y/o pares de bases formados de nucleótidos modificados y no naturales, en tanto se cumplan los requerimientos antes mencionados con respecto a su habilidad para hibridar. Esos pares de basea no de Watson-Crick incluyen, mas no se limitan a, el apareamiento de bases G:U de Wobble o de Hoogstein.
Los términos "complementarios", "totalmente complementario" y "considerablemente complementario" en la presente se pueden utilizar con respecto a la base que concuerda entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un dsRNA, o entre un ácido nucleico antisentido o la hebra antisentido de dsRNA y una secuencia elegida como se entenderá a partir del contexto de su uso.
Como se utiliza en la presente, un polinucleótido, que es "considerablemente complementario con al menos parte de" un RNA mensajero (mRNA) se refiere a un polinucleótido que es considerablemente complementario con una parte contigua del mRNA de interés (por ej., un mRNA que codifica HSP90, especialmente H5R90b) incluyendo un UTR 5', un marco de lectura abierta (ORF) o un UTR 3'. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario con al menos una parte de una HSP90, especialmente el mRNA de HSP90p si la secuencia es considerablemente complementaria con una parte no interrumpida de un mRNA que codifica HSP90, especialmente HSP9Qp.
Las patentes dirigidas a los ácidos nucleicos antisentido, las modificaciones químicas y los usos terapéuticos se proporcionan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos de América No. 5,898,031 relacionada con los compuestos terapéuticos que contienen RNA modificado químicamente, y la Patente de Estados Unidos de América No.6,107,094 relacionada con los métodos para utilizar estos componentes como agentes terapéuticos. La patente de Estados Unidos de América No. 7,432,250 relacionada con los métodos para tratar a los pacientes administrando compuestos tipo RNA monocatenarios, modificados químicamente; y la patente de Estados Unidos de América No. 7,432,249 relacionada con las composiciones de uso farmacéutico que contienen compuestos tipo RNA monocatenarios modificados químicamente. La patente de Estados Unidos de América No. 7,629,321 se relaciona con los métodos para desdoblar el mRNA elegido utilizando un oligonucleótido monocatenario que tiene una pluralidad de nucleósidos de RNA y al menos una modificación química. Cada una de las patentes enlistadas en el párrafo, se incorporan en la presente para referencia.
El ácido nucleico terapéutico puede incluir bases naturales (es decir, A, G, U, C o T) o modificadas (7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases de los nucleótidos se pueden unir mediante un enlace diferente a un enlace fosfodiéster, mientras no interfiera con la hibridación. De este modo, los ácidos nucleicos inhibitorios pueden ser ácidos nucleicos péptidos en los cuales las bases constituyentes se unen mediante enlaces peptidicos en lugar de enlaces de fosfodiéster. Los ácidos nucleicos inhibitorios se pueden preparar convirtiendo el RNA a cDNA utilizando los métodos conocidos (véase, por ej., Ausubel et . al . , Current Protocols in Molecular Biology Wiley 1999) . Los ácidos nucleicos inhibitorios también pueden ser cRNA (véase, por ej . , Park et. al . , (2004) Biochem. Biophys. Res . Commun . 325 (4) : 1346-52) .
Los ácidos nucleicos terapéuticos se pueden producir a partir de métodos sintéticos, como pueden ser los métodos de fosforamidita, metodología de H-fosfonato y los métodos del triméster de fosfito. Los ácidos nucleicos inhibitorios también se pueden producir mediante los métodos PCR. Esos métodos producen las secuencias de cDNA y cRNA complementarias para el mRNA. El método de síntesis del ácido nucleico terapéutico no es una limitación de la invención.
Los ácidos nucleicos terapéuticos comúnmente incluyen una o más modificaciones químicas para mejorar su estabilidad y para modular sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas. Por ejemplo, las modificaciones en los nucleótidos pueden incluir, mas no se limitan a, LISIA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-alquilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-fluoro, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo y combinaciones de éstas.
Los ácidos nucleicos terapéuticos además puede contener al menos un enlace internucleótido de fosforotioato o metilfosfonato. La modificación del enlace internucleótido fosforotioato o metilfosfonato puede ocurrir en cualquier nucleótido de la hebra sentido o la hebra antisentido, o en ambas (en los ácidos nucleicos terapéuticos que tengan una hebra sentido) en cualquier posición de la hebra. Por ejemplo, la modificación del enlace internucleótido puede ocurrir en cada nucleótido en la hebra sentido o la hebra antisentido; cada modificación del enlace internucleótido puede ocurrir en un patrón alternante de la hebra sentido o la hebra antisentido; o la hebra sentido o la hebra antisentido pueden contener ambas modificaciones del enlace internucleótido en un patrón alternante. El patrón alternante de la modificación del enlace internucleótido en la hebra sentido puede ser el mismo o diferente de la hebra antisentido, y el patrón alternante de la modificación de enlace internucleótido en la hebra sentido puede tener una conmutación en relación con y el patrón alternante de la modificación del enlace internucleótido en la hebra antisentido.
Otras modificaciones incluye la incorporación de bases modificadas (o nucleósidos modificados o nucleótidos modificados) que son variaciones de las bases normales, azucares y/o estructuras químicas del esqueleto de fosfato que ocurren en los ácidos ribonucleicos (es decir, A, C, G y U) y ácidos desoxirribonucléicos (es decir, A, C, G y T). Incluidos dentro de este alcance están, por ejemplo: Gm (ácido 2'-metoxiguanílico), Am (ácido 2'-metoxiadenílico), Cf (ácido 2'-fluorocitidílico), Uf (ácido 2'-fluorouridílico), Ar (ácido riboadenílico). Los aptámeros también pueden incluir citosina o cualquier base relacionada con citosina, incluyendo 5-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 3-metilcitosina, 5-hidroximetil citosina, 2-tiocitosina, 5-halocitosina (por ej., 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, 5-clorocitosina y 5-yodocitosina), 5-propinil citosina, 6-azocitosina, 5-trifluorometilcitosina, N4,N4-etanocitosina, fenoxazina citidina, fenotiazina citidina, carbazol citidina o piridoindol citidina. El aptámero además puede incluir guanina o cualquier base relacionada con guanina, que inccluye 6-metilguanina, 1-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metilguanina, 7-metilguanina, 2-propilguanina, 6-propilguanina, 8-haloguanina (por ej., 8-fluoroguanina, 8-bromoguanina, 8-cloroguanina y 8-yodoguanina), 8-aminoguanina, 8-sulfhidrilguanina, 8-tioalquilguanina, 8-hidroxilguanina, 7-metilguanina, 8-azaguanina, 7-deazaguanina o 3-deazaguanina. El aptámero además puede incluir adenina o cualquier base relacionada con adenina, orno puede ser 6-met.iladenina, N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, 8-haloadenina (por ej., 8-fluoroadenina, 8-bromoadenina, 8-cloroadenina y 8-yodoadenina), 8-aminoadenina, 8-sulfhidriladenina, 8-tioalquiladenina, 8-hidroxiladenina, 7-metiladenina, 2-haloadenina (por ej., 2-fluoroadenina, 2-bromoadenina, 2-cloroadenina y 2-yodoadenina), 2-aminoadenina, 8-azaadenina, 7-deazaadenina o 3-deazaadenina. También están incluidos uracilo o cualquier base relacionada con uracilo, incluyendo 5-halouracilo (por ej ., 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo), 5- (carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil- 2-tiouracilo 5-carboximetilaminometiluracilo dihidrouracilo, 1-metilseudouracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5 '-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, seudouracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, 5-metilaminometiluracilo, 5-propinil uracilo, 6-azouracilo o 4-t.iouracilo.
Los ejemplos de otras variantes de bases modificadas conocidos en la téenica incluyen, sin imitación, por ej., 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroxilmetil)uridina, 2'-metoxicitidina, 5-carboximetila:minometil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino etiluridina, dihidrouridina, 2'-O-metilseudouridina, b-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilseudouridina, 1-metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-met.ilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, b-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-Nb-isopenteniladenosina, N- ((9-b-D-ribofuranosil-2-metiltiopur.ina-6-il)carbamoil)treonina, 2' -0-metil-5- metiluridina, 2'-O-metiluridina y wibutosina, 3-3(amino- 3-carboxipropil)uridina.
También están incluidas las nucleobases modificada descritas en las patentes de Estados Unidos de América Nos. 3,687,808, 3,687,808, 4,845,205, 5,130,302, 5,134,066, 5,175,273, 5,367,066, 5,432,272, 5,457,187, 5,459,255, 5,484,908, 5,502,177, 5,525,711, 5,552,540, 5,587,469, 5,594,121, 5,596,091, 5,614,617, 5,645,985, 5,830,653, 5,763,588, 6,005,096, y 5,681,941, cada de las cuales se incorpora a la presente para referencia en su totalidad. Los ejemplos de los nucleósidos modificados y las variantes del esqueleto de azúcar del nucleótido conocidas en la téenica incluyen, sin limitación, aquellos que tienen, por ejemplo, sustituyentes 2'ribosilo como pueden ser F, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2, CH3, 0NO2, N02, N3, NH2, OCH2CH2OCH3, 0(OCH2)2ON (CH3)2, OCH2OCH2N(CH3)2, O(alquilo de C1-10), O(alquenilo de C2-10) > O(alquinilo de C2-io) S(alquilo de C1-10), S(alquenilo de C2-io), S(alquinilo de C2-io) NH(alquilo de Ci_io), NH(alquenilo de C2-io) NH(alquinilo de C2-io) , Y O-alquil-O-alquilo. Los sustituyentes 2'ribosilo deseables incluyen 2'-metoxi(2'-OCH3), 2'-aminopropoxi(2'OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-alil(2'-CH2—CH=CH2), 2'-O-alil(2'-O—CH2—CH=CH2), 2'-amino(2'-NH2) y 2'fluoro(2'-F). El sustituyente 2' - puede estar en la posición arabino (arriba) o en la posición ribo (abajo).
A. Ácidos nucleicos terapéuticos monocatenarios Los agentes ácidos nucleicos terapéuticos antisentido son productos ácidos nucleicos terapéuticos monocatenarios, comúnmente de aproximadamente 16 a 30 nucleótidos de longitud, y son complementarios a una secuencia de ácido nucleico elegida en la célula elegida, sea en cultivo o en un organismo.
En otro aspecto, el agente es una molécula de RNA monocatenaria, antisentido. Una molécula de RNA antisentido es complementaria a una secuencia del RNA. El RNA antisentido puede inhibir la traducción en una manera estequiométrica mediante el apareamiento de bases con el mRNA y obstruyendo físicamente la maquinaria de la traducción, véase Dias, N. et al, (2002) Mol Cáncer Ther 1 :347-355. La molécula de RNA antisentido puede tener aproximadamente 15-30 nucleótidos que sean complementarios con el mRNA elegido. Por ejemplo, la molécula de RNA antisentido puede tener una secuencia de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos que sean complementarios con el mRNA elegido.
Las Patentes dirigidas a los ácidos nucleicos antisentido, las modificaciones químicas y los usos terapéuticos, se proporcionan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos de América No.5,898,031 que se refiere a los compuestos terapéuticos que contienen RNA modificado químicamente, y la Patente de Estados Unidos de América No. 6,107,094 que se refiere a los métodos para utilizar estos compuestos como agentes terapéuticos. La Patente de Estados Unidos de América No. 7,432,250 que se refiere a los métodos para tratar a los pacientes administrando los compuestos tipo RNA monocatenario modificado químicamente,; y la Patente de Estados Unidos de América No. 7,432,249 relacionada con las composiciones aceptadas para uso farmacéutico que contienen compuestos tipo RNA monocatenario, modificado químicamente. La Patente de Estados Unidos de América No.7,629,321 relacionada con los métodos de desdoblamiento del mRNA elegido utilizando un oligonucleótido monocatenario que tiene una pluralidad de nucleósidos de RNA y al menos una modificación química. El contenido completo de cada una de las patentes listadas en este párrafo se incorpora en la presente para referencia.
B. Ácidos nucleicos terapéuticos bicatenarios Los agentes ácidos nucleicos terapéuticos de la invención también incluyen ácidos nucleicos terapéuticos bicatenarios. Un "agente RNAi," "agente RNAi bicatenario, "molécula de RNA bicatenario" (dsRNA), también mencionados como "agente dsRNA," "dsRNA", "siRNA", "agente iRNA, " se utilizan de forma intercambiable en la presente, se refieren a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tienen una estructura dúplex, que consiste en dos hebras de ácido nucleico anti-paralelas y considerablemente complementarias, como se define más adelante. Como se utiliza en la presente, un agente RNAi también puede incluir dsiRNA (véase, por ej., la publicación de la Patente de Estados Unidos de América No. 20070104688, incorporada en la presente para referencia). En general, la mayor parte de nucleótidos de cada hebra son ribonucleótidos, pero como se describe en la presente, cada una o ambas hebras también pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, por ej., un desoxiribonucleót.ido y/o un nucleótido modificado. Además, como se utiliza en esta especificación, un "agente RNAi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente RNAi puede incluir modificaciones considerables en múltiples nucleótidos. Esas modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones descritas en la presente o conocidas en la téenica. Cualquiera de esas modificaciones, cuando se utilizan en una molécula tipo siRNA, están comprendidas por el término "agente RNAi" para los propósitos de esta especificación y las reivindicaciones.
Las dos hebras que forman la estructura dúplex pueden ser partes diferentes de una molécula de RNA más grande, o pueden ser moléculas de RNA diferentes. Donde las dos hebras son parte de una molécula más grande, y por lo tanto están conectadas mediante una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5' de la otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la cadena de RNA que conecta se menciona como un "bucle en horquilla." Donde las dos hebras están conectadas de forma covalente por medios diferentes a la cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una hebra y el extremo 5'de otra hebra respectiva que forma la estructura dúplex, la estructura que conecta se menciona como un "ligador." Las hebras de RNA pueden tener el mismo o un número diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la hebra más corta del dsRNA menos cualquier colgante que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un agente RNAi puede contener uno o más colgantes del nucleótido. El término "siRNA" también se utiliza en la presente para referirse a un agente RNAi como se describe anteriormente.
En muchas modalidades, la región dúplex es 15-30 pares de nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la región dúplex es de 17-23 pares de nucleótidos de longitud, de 17-25 pares de nucleótidos de longitud, de 23-27 pares de nucleótidos de longitud, de 19-21 pares de nucleótidos de longitud o de 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
En ciertas modalidades, cada hebra tiene de 15-30 nucleótidos.
Los agentes RNAi que se utilizan en los métodos de la invención incluyen agentes con modificaciones químicas como las descritas, por ejemplo, en la solicitud de Provisional E.U.A. No. 61/561,710, presentada en Noviembre 18, 2011, la Solicitud Internacional No. PCT/US2011/051597, presentada en 15 de septiembre de 2010 y la Publicación PCT O 2009/073809, los contenidos completos de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. El término "hebra antisentido" se refiere a la hebra de un agente RNAi bicatenario que incluye una región que es considerablemente complementaria a la secuencia elegida (por ej., un mRNA de TTR (transtiretrina) humana). Como se utiliza en la presente, el término "región complementaria a parte de un mRNA que codifica transtiretina" se refiere a una región en la hebra antisentido que es considerablemente complementaria a parte de una secuencia del mRNA de TTR. Donde la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia elegida, los malos apareamientos son más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, generalmente están en una región o regiones terminales, por ej., dentro de 6, 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.
El término "hebra sentido, " como se utiliza en la presente, se refiere a la hebra de un dsRNA que incluye una región que es considerablemente complementaria a una región de la hebra antisentido.
Tanto los métodos de diagnóstico y terapéuticos de la invención pueden incluir el uso de anticuerpos, incluso anticuerpos policlonales y monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienen sólo una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccíonar con un epítopo en particular. Los anticuerpos para uso en la invención incluyen anticuerpos que se unen a HSP90, preferiblemente anticuerpos que son específicos para HSP90 · Los anticuerpos pueden obtenerse de fuentes comerciales o producirse usando métodos conocidos.
Los anticuerpos policlonales se pueden preparar mediante la inmunización de un individuo adecuado con una proteina de la invención como un inmunógeno. El titulo de los anticuerpos en el individuo inmunizado se puede controlar a través del tiempo mediante téenicas normalizadas, tales como con un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) usando polipéptido inmovilizado. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de los anticuerpos específicos sean más altos, las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse del individuo y utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales (mAb) mediante; técnicas normalizadas tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497, la técnica de hibridoma de células B humanas (ver Kozbor et ah, 1983, Immunol Today 4:72), la técnica de hibridoma de EBV (ver Colé et al., pp 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (ver, en general, Current Protocols in Immunologv, Coligan et. al. EcL, John Wílcy & Sons, Nueva York, 1994). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan mediante el cribado o la exploración de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para detectar los anticuerpos que se unen al polipéptido de interés, por ejemplo, usando un ensayo ELISA normalizado.
Como alternativa a la preparación de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína de la invención puede ser identificado y aislado por el cribado de una biblioteca combinatoria de inmunoglobulina recombinante (por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos para presentación en fagos) con el polipéptido de interés. Los kits para generar y explorar bibliotecas de presentación en fagos están disponibles en el comercio (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, No. de Catálogo 27-9400-01; y el Kit de Stratagene SurfZAP Phage Display, No. de catálogo 240612). Más aún, los ejemplos de los métodos y reactivos particularmente susceptibles para uso en la generación y selección de la biblioteca de presentación de anticuerpos se pueden encontrar en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Publicación PCT No. WO 92/18619; Publicación PCT No. WO 91/17271; Publicación PCT No. WO 92/20791; Publicación PCT No. WO 92/15679; Publicación PCT No. WO 93/01288; Publicación PCT No. WO 92/01047; Publicación PCT No. WO 92/09690; Publicación PCT No. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum . Antibod. Hybrídomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734.
Los anticuerpos recombinantes que se unen específicamente a una proteína de interés también se pueden utilizar en los métodos de la invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos recombinantes se unen específicamente a una proteína de interés o fragmento de ésta. Los anticuerpos recombinantes pueden ser, mas no se limitan a, los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multi-específicos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, como los que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Cabilly et al, Patente de Estados Unidos No.4,816,567; y Boss et al, Patente de Estados Unidos No. 4,816,397, que se incorporan en este documento por referencia en su totalidad) . Los anticuerpos de cadena sencilla tienen un sitio de unión al antigeno y consisten en un único polipéptido. Éstos pueden ser producidos empleando téenicas conocidas en la materia, por ejemplo usando los métodos descritos en Ladner et. Al, patente de EE.UU. al. No. 4,946,778 (que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad); Bird et al, (1988) Science 242: 423-426; Whitlow et al, (1991) Methods in Enzymology, 2: 1--9; Whitlow et al, (1991) Methods in Enzymology 2: 97-105; y Huston et al, ( 1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modelíng: . Concepts and Applica tions 203: 6-88. Los anticuerpos multi-específicos son moléculas de anticuerpos que tienen al menos dos sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a antígenos diferentes. Tales moléculas se pueden producir por técnicas conocidas en la materia, por ejemplo usando métodos descritos en Segal, Patente de Estados Unidos No. 4.676.980 (cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad); Holliger et al, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU.90: 6444-6448; Whitlow et al, (1994) Protein Eng. 7: 1017- 1026 y la Patente de Estados Unidos No. 6,121,424.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (las CDR) de las especies no humanas y una región de entramado de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, p. ej., Queen, patente de Estados Unidos No. 5,585,089, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.) Los anticuerpos monoclonales humanizados se pueden producir por téenicas de ADN recombinante conocidas en la materia, por ejemplo usando métodos descritos en la Publicación PCT No. WO 87/02671; Solicitud de Patente Europea 184,187; Solicitud de Patente Europea 171,496; Solicitud de Patente Europea 173,494; Publicación PCT No. WO 86/01533; U.S. Patente No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol.139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cáncer Res.47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Nati. Cáncer Inst.80: 1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; Patente de Estados Unidos 5,225,539; Jones et al (1986) Nature 321 :552-525; Verhocyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol . 141: 4053-4060.
Más particularmente, los anticuerpos humanizados pueden producirse, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar los genes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas endógenas, pero que puedan expresar los genes de la cadena pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal. con un antigeno seleccionado, por ejemplo, todo o una parte de un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno pueden obtenerse usando teenología de hibridoma tradicional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B, y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando una técnica como esta es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE útiles como terapéuticos. Para tener una visión general de esta tecnología para la producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para revisar una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ej., la patente de Estados Unidos 5,625,126; patente de Estados Unidos 5,633,425; patente de Estados Unidos 5,569,825; patente de Estados Unidos 5,661,016; y la patente de Estados Unidos 5,545,806. Además, las empresas pueden comprometerse a proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando teenología semejante a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque un anticuerpo monoclonai, seleccionado, no humano, por ejemplo, un anticuerpo murino, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al, 1994, Bio/Technology 12: 899-903).
Los anticuerpos de la invención pueden ser aislados después de la producción (por ejemplo, de la sangre o suero del individuo) o la síntesis, y además purificados mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos IgG pueden purificarse usando cromatografía de proteína A. Los anticuerpos específicos para una proteína de la invención se pueden seleccionar o (por ejemplo, purificar parcialmente) o purificar por, por ejemplo, cromatografía de afinidad. Por ejemplo, una proteína expresada en forma recombinante y purificada (o parcialmente purificada) de la invención se produce como se describe en la presente, y se acopla de forma covalente o no covalente a un soporte sólido como puede ser, por ejemplo, una columna de cromatografía. La columna puede entonces usarse para purificar por afinidad anticuerpos específicos para las proteínas de la invención a partir de una muestra que contenga anticuerpos dirigidos contra un gran número de diferentes epítopos, generando de ese modo una composición de anticuerpos considerablemente purificada, es decir, uno que esté prácticamente libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de anticuerpos considerablemente purificada se entiende, en este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene a lo sumo sólo un 30% (en peso seco) de anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopos distintos de los de la proteína deseada de la invención, y preferiblemente a lo sumo 20 %, aún más preferiblemente a lo sumo 10%, y más preferiblemente a lo sumo 5% (en peso seco) de la muestra es de anticuerpos contaminantes. Una composición de anticuerpo purificado significa que al menos 99% de los anticuerpos de la composición se dirigen contra la proteína deseada de la invención.
Un anticuerpo dirigido contra una proteína se puede utilizar para aislar la proteína por téenicas normales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo de este tipo puede ser utilizado para detectar la proteína marcadora, por ejemplo, HXRqOb, o fragmento ésta (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar el nivel y el patrón de expresión del marcador. Los anticuerpos también se pueden utilizar como diagnóstico para controlar los niveles de proteína en tejidos o fluidos corporales (por ejemplo, en el fluido corporal asociado con el cuadro de la enfermedad o estado de toxicidad) como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse mediante el uso de un derivado de anticuerpo, que comprenda un anticuerpo de la invención acoplado a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables pueden ser las diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas pueden ser peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ios ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados son umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente puede ser luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de los materiales radiactivos apropiados incluyen 125I, 131I, J5S o JH.
Los anticuerpos también pueden ser utilizados como agentes terapéuticos para tratar síndrome etabólico y/o diabetes.
V. Inhibidores de moléculas pequeñas HSP90 Los inhibidores de moléculas pequeñas HSP90 pueden ser, mas no se limitan a, geldanamicina: . análogo (GM) (por ej., IPI-493 ' (tanespimicma) . (aívespimicina) ), análogo de tnacbecin (p. ej. BC-274) .. . _ . , . • - . · · , - . ! ; - · · . . ; - 6 . .
·. , , , CJI -5164840 NXD-30001 . - _ · ! · · ' ; - - .
' · . . - Dimero coumermieina, Genudin, gamendazol , o H2-gameodazol Dependiendo de su mecanismo de acción, algunos inhibidores de moléculas pequeñas inhiben preferentemente HSP90 al interferir con la unión y/o la hidrólisis del ATP en el dominio de unión al ATP N-terminal, por ejemplo, geldanamicina (véase Sausville, et al, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2003; 43: 199-231, que se incorpora en la presente como referencia). Otros inhibidores de HSP90 inhiben la proteína HSP90 cuando interfieren con la unión y/o hidrólisis del ATP en el dominio de unión a ATP C-terminal, por ejemplo, novobiocina (véase Marcu, et al, J Biol Che 2000; 275: 37181-37186, que se incorpora en la presente por referencia). No todos los inhibidores de HSP90 actúan sobre HSP90 mediante la interacción con el sitio de unión al ATP en cualquier grupo terminal de la proteína HSP90. Los ejemplos de estos inhibidores de HSP90 incluyen KU174, coumermicina Al, celastrol, gedunina, H2-gamendazol y gamendazol (véase Matts, et al, B100rganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692 y Tash, et al, Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152, que se incorporan en la presente por referencia). Entre estos inhibidores, por ejemplo, celastrol interrumpe la interacción entre Hsp90 y la cinasa Cdc37 co-chaperona para deshabilitar eficazmente HSP90 (ver Matts, et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692, que se incorpora en la presente como referencia).
Muchos inhibidores de HSP 90 conocidos inhiben tanto las isoformas HSP90a y HSP90 , por ejemplo, geldanamicina y NVP-HS990. Otros inhibidores muestran una preferencia por uno de los dos isotipos, como gamendazol y H2- gamendazol, que son específicos para H3R90b (véase Tash, et al, Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152). Además, HSP90 es más sensible a radicicol que HSP90a (ver Mi11son et al, FEBS J 2007; 274, 4453 hasta 4463, incorporada en la presente por referencia). Más aún, los inhibidores novedosos que son específicos para H3R90b pueden ser seleccionados a partir de los inhibidores de HSP90 conocidos o desarrollados por el experto en la téenica modificando los inhibidores específicos conocidos, tales como gamendazol, o mediante el diseño de inhibidores basados en el dominio de unión determinado por co-cristalografía de HSP90 y un inhibidor específico de H3R90b, por ejemplo, gamendazol El gamendazol antes mencionado, un inhibidor específico de H3R90b, es un análogo de lonidamina. Los análogos de lonidamina son conocidos en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de los análogos de lonidamina se describen en W02006 / 023704 y WO2011 / 005759 (todo el contenido de los cuales se incorpora en la presente como referencia) y están representados por la siguiente fórmula: la que R1 es carboxilo, o hidrazida del ácido carboxilico; En la que R2 es hidrógeno, halógeno, alcohol, alquilo, alcoxi, aralquilo, cicloalquilo, haloalquilo, haloalcoxi, amino, o carboxilo; en la que X y Y son iguales o diferentes entre sí y son halógeno o alquilo inferior; en la que Z, Z2, Z3 y Z4 son independientemente nitrógeno o carbono; y las sales aceptadas para uso farmacéutico y los ásteres de éstas.
Los ejemplos de tales análogos de lonidamina incluyen: hidrazida del ácido 6-cloro-1-(2,4-diclorobencil)-1H-indazol-3-carboxílico; áster metílico del ácido 1-(2,4-diclorobencil)-6-fluoro-1H-indazol-3-carboxílico; hidrazida del ácido 6-fluoro-1-(2,4-diclorobencil)-1H-indazol-3-carboxílico; ácido 3-[1-(2,4-diclorobencil)-6-fluoro-lH-indazol-3-il]-acrílico; ácido 3-[1-(2,4-diclorobencil)-6-cloro-1H-indazol-3-il]-acrílico; ácido 3-[1-(2,-diclorobencil)-6-trifluorometoxi-lH-indazol-3-il]acrilico; ácido 3-[1-(2,4-diclorobencil)-6-cloro-lH-indazol-3-il]-propiónico; ácido 3-[1-(2,4-diclorobencil)-6-metil-lH-indazol-3-il]-acrilico (TH 2—192); ácido 1-(2,4-diclorobencil)-6-metil-lH-indazol-3-carboxílico (TH 2-178); hidrazida del ácido 1- (2,-diclorobencil)-6-metil-lH-indazol-3-carboxílico (TH 2- 179); ácido 3-[1-(2,4-diclorobencil)-6-cloro-lH-indazol-3-il]-acrilico (JWS 1-190); hidrazida del ácido 1-(2-cloro-4-fluorobencil)-6-cloro-lH-indazol-3-carboxilico (JWS 2-22); y hidrazida del ácido 1- (2,4-difluorobencil)-6-cloro-lH-indazol-3-carboxílico (JWS 1-282).
Otros análogos de lonidamina están descritos en el documento W02006/015263 y W02006/015191 y también en Mok et al, Reproduction, 2011, 141, 571-580 (cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia). Ejemplos de tales análogos de lonidamina incluyen lonidamina, Adjudina (AF-2364), AF2785 y CDB-4022, Algunos análogos de coumermicina y coumermicina Al están descritos en W02001/87309 y WO2012/162054 (ambos de las cuales se incorpora en la presente por referencia), en las que un análogo de cumermicina está representado por la siguiente fórmula: en la que la que: 1 9 1 2 1 2 R , R, X , X , Y y Y incluye una porción seleccionada independientemente de: hidrógeno, halógenos, hidroxilos, alcóxidos, compuestos alifáticos lineales, alifáticos ramificados, alifáticos cíclicos, alifáticos heterocíclicos, alifáticos sustituidos, alifáticos no sustituidos, alifáticos saturados, alifáticos insaturados, compuestos aromáticos, compuestos poliaromáticos, aromáticos sustituidos, hetero-aromáticos, aminas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, aminas alifáticas, carbonilos, carboxilos, amidas, ásteres, aminoácidos, péptidos, polipéptidos, azúcares, miméticos de azúcar, derivados de los mismos, o combinaciones de los mismos, los grupos alifáticos que tienen cadenas de carbono de aproximadamente 0-20 átomos de carbono o heteroátomos u 0, N , S o P ; y un enlazador que incluye un aiifático lineal, alifático ramificado, aiifático cíclico, aiifático heterocíclico, alifático sustituido, alifático no sustituido, alifático saturado, alifático insaturado, aromático, poliaromático, aromático sustituido, hetero-aromático, amina, amina primaria, amina secundaria, amina terciaria, amina alifática, carbonilo, carboxilo, amida, éster, aminoácido, péptido, polipéptido, azúcares, mimético de azúcar, derivados de éstos, o combinaciones de éstos.
Los ejemplos de los análogos de coumermicina están representados por la siguiente fórmula: en la que X es un enlazador que contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 54 átomos, que conecta las dos mitades de la molécula.
Algunos análogos de celastrol y gendunin están descritos en W02007 / 117466 (que se incorpora en la presente por referencia). En ciertas modalidades, los inhibidores de molécula pequeña HSP90 inhiben HSP90p. En ciertas realizaciones, los inhibidores de molécula pequeña HSP90 inhiben específicamente HSP90p.
VI. Métodos de diagnóstico para el síndrome metabólico La invención proporciona además métodos para identificar un individuo que tiene o está en riesgo de tener síndrome metabólico y/o diabetes, que consiste en detectar el nivel de expresión de una proteína marcadora y/o un ácido nucleico en una muestra del individuo.
Un método ejemplar para detectar la presencia o ausencia de una proteína marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica, por ejemplo, HSP90, en particular HSPSOP, implica obtener una muestra biológica (por ejemplo, muestra de tejido) de un individuo de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico o ADNc). Los métodos de detección de la invención por lo tanto se pueden utilizar para detectar ARNm, proteína, ADNc o ADN genómico, por ejemplo, en una muestra biológica in vitro así como in vivo para el diagnóstico del síndrome metabólico. Por ejemplo, las téenicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de una proteína marcadora incluyen ensayos de inmunoabsorción de enzimas ligadas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Las técnicas in vivo para la detección de ARNm incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Además, las técnicas in vivo para la detección de una proteína marcadora consisten en introducir en un individuo un anticuerpo marcado dirigido contra la proteína o fragmento de ésta. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un individuo puede detectarse por técnicas de imagen normales.
Un principio general de tales ensayos de diagnóstico y pronóstico implica la preparación de una muestra o de la mezcla de reacción que puede contener un marcador, y una sonda, en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el marcador y la sonda interaccionen y se unan, formando así un complejo que puede ser separado y/o detectado en la mezcla de reacción. Estos ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de maneras.
Por ejemplo, un método para llevar a cabo un ensayo de este tipo implicaría anclar el marcador o sonda sobre un soporte en fase sólida, también conocido como un sustrato, y la detección de los complejos marcador diana/sonda anclados en la fase sólida al final de la reacción. En una modalidad de tal método, una muestra de un individuo, que se ha de ensayar para buscar la presencia y/o concentración del marcador, se puede anclar sobre un portador o soporte en fase sólida.
En otra modalidad, es posible la situación inversa, en la que la sonda puede ser anclada a una fase sólida y una muestra de un individuo puede hacerse reaccionar como un componente no anclado del ensayo.
Hay muchos métodos establecidos para el anclaje de los componentes del ensayo a una fase sólida. Estos incluyen, sin limitación, moléculas marcadoras o sonda que se inmovilizan mediante la conjugación de biotina y estreptavidina. Tales componentes de ensayo biotinilados se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi- succinimida) usando téenicas conocidas en la materia (por ejemplo, el kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), y pueden ser inmovilizados en los pocilios de placas de 96 pocilios recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical) . En ciertas modalidades, las superficies con los componentes del ensayo inmovilizados se pueden preparar por adelantado y se almacenan.
Otros vehículos adecuados o soportes en fase sólida para tales ensayos incluyen cualquier material capaz de unirse a la clase de molécula a la que pertenece el marcador o sonda. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen, mas no se limitan a, vidrio, poliestireno, nylon, polipropileno, nylon, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gafaros, y magnetita.
Para llevar a cabo ensayos con los abordajes mencionados anteriormente, se adiciona el componente no inmovilizado a la fase sólida sobre la cual está anclado el segundo componente. Después de que la reacción sea completa, los componentes no acomplejados se pueden eliminar (por ejemplo, medicinte lavado) en condiciones tales que cualesquiera de los complejos formados permanecerán inmovilizados sobre la fase sólida. La detección de complejos de marcador / sonda ancladas a la fase sólida se puede lograr en un número de métodos descritos en este documento.
En una modalidad preferida, la sonda, cuando es el componente de ensayo no anclado, se puede marcar para la detección y lectura del ensayo, ya sea directa o indirectamente, con marcadores detectadles mencionados en este documento y que son bien conocidos para un experto en la téenica.
También es posible detectar directamente la formación del complejo marcador/sonda sin manipulación adicional o el etiquetado de cualquiera de los componentes (marcador o sonda), por ejemplo mediante la utilización de la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (véase, por ejemplo, Lakowicz et al, Patente de Estados Unidos No.5.631.169; Stavrianopoulos, et al, Patente de Estados Unidos No. 4.868.103). En la primera molécula "donante" se selecciona una etiqueta de fluoróforo de tal manera que, tras la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida sea absorbida por un marcador fluorescente en una segunda molécula aceptora, que a su vez sea capaz de emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. De otro modo, la molécula de proteína "donante" puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de residuos de triptófano. Se eligen las etiquetas que emiten diferentes longitudes de onda de la luz, de modo que la etiqueta de la molécula aceptora pueda diferenciarse de la del "donante". Dado que la eficiencia de la transferencia de energía entre las etiquetas se relaciona con la distancia que separa las moléculas, se pueden evaluar las relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente de la etiqueta de la molécula aceptora en el ensayo debe ser máxima. Un suceso de unión FRET se puede medir convenientemente utilizando medios de detección fluorométrica normalizados, bien conocidos en la téenica (por ejemplo, usando un fluorímetro).
En otra modalidad, la determinación de la capacidad de una sonda para reconocer un marcador se puede lograr sin el etiquetado de cualquiera de los componentes de ensayo (sonda o marcador) mediante la utilización de una tecnología tal como análisis de en Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real (véase, por ejemplo, Sjolander, S. y Urbanicz y, C, 1991, Anal Chem 63: 2338 a 2345 y Szabo et al, 1995, Curr Opin Struct Biol 5: 699- 705). Cuando se utiliza en la presente, "BIA" o "resonancia de plasmen superficial" es una teenología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore) . Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un episodio de unión) dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)), dando como resultado una señal detectable que se puede utilizar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.
De otro modo, en otra modalidad, los ensayos de diagnóstico y pronóstico análogos pueden llevarse a cabo con el marcador y la sonda como solutos en una fase líquida. En un ensayo de este tipo, el marcador acomplejado y la sonda se separan de ios componentes no acomplejados por cualquiera de una serie de técnicas normalizadas, que incluyen, más no se limitan a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforeáis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, los complejos marcador/sonda pueden ser separados de los componentes del ensayo no acomplejados a través de una serie de pasos centrífugas, debido al diferente equilibrio de sedimentación de los complejos basados en sus diferentes tamaños y densidades (véase, por ejemplo, Rivas, G., y Minton, AP, 1993, Trends Biochem Sci 18 (8): 284-7). También pueden utilizarse téenicas cromatográficas normalizadas para separar moléculas acomplejadas de las no acomplejadas. Por ejemplo, la cromatografía de filtración en ge.l separa las moléculas en base al tamaño, y por medio de la utilización de una resina de filtración en gel apropiada en un formato de columna, por ejemplo, el complejo relativamente más grande puede ser separado de los componentes no acomplejados relativamente más pequeños. Del mismo modo, las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo marcador/sonda en comparación con los componentes no acomplejados pueden ser explotadas para diferenciar el complejo de los componentes no acomplejados, por ejemplo a través de la utilización de resinas de cromatografía de intercambio iónico. Tales resinas y técnicas cromatográficas son bien conocidos para un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Heegaard, NH, 1998, J. Mol Recognit. Winter 11 (1-6): 141-8; Hage, DS, y Tweed, SA J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997, 10 de octubre; 699 (1-2): 499-525). También se puede emplear la electroforesis en gel para separar los componentes del ensayo acomplejados de los componentes no unidos (véase, por ejemplo, Ausubel et al, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John ilcy & Sons, Nueva York, 1987-1999). En esta téenica, los complejos de proteína o ácido nucleico se separan basándose en el tamaño o carga, por ejemplo. A fin de mantener la interacción de unión durante el proceso electrofcrético, comúnmente se prefieren los materiales de matriz gel no desnaturalizante y condiciones en ausencia de agente reductor. Las condiciones expropiadas para el ensayo particular y componentes de los mismos serán bien conocidas para un experto en la técnica.
En una modalidad particular, el nivel de ARNm marcador se puede determinar por formatos in si tu e in vi tro en una muestra biológica utilizando los métodos conocidos en la técnica. El término "muestra biológica" está destinado a incluir tejidos, células, fluidos biológicos y aislados de los mismos, aislados de un individuo, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un individuo. Muchos métodos de detección de expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitro, cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm se puede utilizar para la purificación de ARN de las células (véase, por ejemplo, Ausubel et al, ed., Current Protocola in Molecular Biology, John Wilcy & Sons, Nueva York 1987-1999). Además, un gran número de muestras de tejido pueden ser fácilmente procesados mediante téenicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de una sola etapa de Chomczynski (1989, Patente US No. 4,843,155).
El ARNm aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, más no se limitan a, análisis Southern o Northern, los análisis de reacción en cadena de la polimerasa y matrices de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridar con el ARNm codificado por el gen que se detecta. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones estrictas a un ARNm o ADN genómico que codifica un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en la presente. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el marcador en cuestión está siendo expresado.
En un formato, el ARN se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo corriendo el ARNm aislado en un gel de agarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, la(s) sonda (s) se inmoviliza(n) sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la(s) sonda(s), por ejemplo, en una matriz de chips de genes Affymetrix. Un experto en la téenica puede adaptar fácilmente los métodos de detección conocidos de ARNm para uso en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención.
Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm marcador en una muestra implica el proceso de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, por RT-PCR (la modalidad experimental indic¿ída en Mullís, 1987, Patente US No.4,683,202), reacción en cadena de la ligasa (Barany , 1991, Proc Nati Acad Sci EE.UU., 88: 189-193), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al, 1990, Proc Nati Acad Sci E.U.A.87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al, 1989, Proc Nati Acad Sci EUA 86: 1173 a 1177), Q-Beta replicasa (Lizardi et al, 1988, Bio/Technology 6: 1197), replicación de círculo rodante (Lizardi et al, Patente de Estados Unidos No. 5,854,033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando téenicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos. Cuando se utiliza en la presente, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que puede hibridar con 5 1o 3' regiones de un gen (hebras más y menos, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entre ellos. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.
Para los métodos in si tu, el ARNm no necesita ser-aislado de la antes de la detección. En tales métodos, una muestra de células o tejido se prepara/procesa utilizando métodos histológicos conocidos. La muestra se inmoviliza sobre un soporte, comúnmente un portaobjetos de vidrio, y luego se pone en contacto con una sonda que pueda hibridar a ARNm que codifica el marcador.
Como una alternativa a hacer determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones pueden basarse en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador mediante la comparación de su expresión a la expresión de un gen que no es un marcador, por ejemplo, un gen housekeeping que se expresa de forma constituti a. Los genes adecuados para la normalización incluyen genes housekeeping tales como el gen de actina, o genes específicos de células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo, una muestra de paciente, a otra muestra, por ejemplo, muestras de células no enfermas de diferente fuente.
De otro modo, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Para determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, el nivel de expresión del marcador se determina para 10 o más muestras de células normales frente a aislados de células enfermas, preferentemente 50 o más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los genes ensayados en el mayor número de muestras y se utiliza como un nivel de expresión de línea base para el marcador. El nivel de expresión del marcador determinado para la muestra a ensayar (nivel absoluto de expresión) se divide entre el valor de expresión medio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.
Preferentemente, las muestras utilizadas en la determinación de la línea base serán de células no enfermas. La elección de la fuente de células depende del uso del nivel de expresión relativo. El uso de la expresión que se encuentra en los tejidos normales como una puntuación de expresión media ayuda para validar si el marcador ensayado es especifico de la enfermedad (frente a las células normales). Además, a medida que se acumulan más datos, el valor medio de expresión puede ser revisado, proporcionando la mejora de los valores relativos de expresión basados en los datos acumulados. Los datos de expresión de células enfermas proporcionan un medio de clasificación de la gravedad del estado de enfermedad.
En otra modalidad de la presente invención, se detecta una proteína marcadora, HSP90, preferentemente HSP90p. Un agente preferido para la detección de la proteína marcadora de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a tal proteína o un fragmento de ésta, preferentemente un anticuerpo con una etiqueta detectable. Los anticuerpos pueden ser políclonales, o más preferentemente, monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento o derivado del mismo (por ejemplo, Fab o F (ab')2)· El término "etiquetado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el etiquetado directo de la sonda o anticuerpo por acoplamiento (es decir, físicamente unido) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está etiquetado directamente. Los ejemplos de etiquetado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente y etiquetado final de una sonda de ADN con biotina de manera que puede ser detectada con estreptavidina marcada con fluorescenci .
Las proteínas de las células se pueden aislar utilizando téenicas que son bien conocidas por los expertos en la materia. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados pueden, por ejemplo, ser tales como los descritos en Harlow y Lañe (Harlow y Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York).
Se puede emplear una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteina que se una a un anticuerpo dado. Los ejemplos de tales formatos incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), análisis Western blot y ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA). Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente los métodos de detección de proteína/anticuerpo conocidos para uso en la determinación de si las células expresan un marcador de la presente invención.
En un formato, los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos o derivados, puede ser utilizado en métodos tales como Western blot o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, en general, es preferible inmovilizar el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Los soportes en fase sólida adecuados o vehículos incluyen cualquier soporte capaz de unirse a un antígeno o un anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros, y magnetita.
Un experto en la téenica conocerá muchos otros portadores adecuados para anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar este tipo de soporte para su uso con la presente invención. Por ejemplo, la proteína aislada de células enfermas se puede correr en una electroforesis en gel de poiiacrilarnida y se inmoviliza sobre un soporte en fase sólida tal como nitrocelulosa. El soporte se puede lavar con soluciones amortiguadas adecuadas seguido por el tratamiento con el anticuerpo etiquetado de forma detectable. El soporte de fase sólida puede entonces lavarse con la solución amortiguadora una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido etiquetado de forma detectable. La cantidad de anticuerpo etiquetado unido sobre el soporte sólido se puede detectar entonces por medios tradicionales.
La invención también abarca kits para detectar la presencia de una proteína marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica. Tales kits se pueden utilizar para determinar si un individuo está sufriendo o está en mayor riesgo de desarrollar ciertas enfermedades, por ejemplo, diabetes y/o síndrome metabólico. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto etiquetado o agente capaz de detectar una proteína marcadora o ácido nucleico en una muestra biológica y medios para determinar la cantidad de la proteína o ARNm en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se une la proteína o un fragmento del mismo, o una sonda de oligonucleótido que se une a ADN o ARNm que codifica la proteína). Los kits también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.
Para los kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a una proteína marcadora; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo, diferente que se une a la proteína o bien el primer anticuerpo y se conjuga con una etiqueta detectable.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado de forma detectable, que híbrida a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína marcadora o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico marcador. El kit también puede comprender, por ejemplo, un agente amortiguador, un preservador, o un agente estabilizante de proteínas. El kit puede comprender, además, los componentes necesarios para detectar la etiqueta detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra testigo o una serie de muestras testigo que pueden ensayarse y compararse con la muestra a ensayar. Cada componente del kit puede adjuntarse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo paquete, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el kit.
En los métodos que se proporcionan en la presente, un nivel modulado de HSP90, específicamente HSP903, se puede utilizar como un indicador de diagnóstico junto con uno o más indicadores del síndrome metabólico, tales como los proporcionados en la presente.
Pueden utilizarse ensayos de diagnóstico repetidos para vigilar el estado de enfermedad del individuo.
VII. Tratamiento del Síndrome Metabólico Como se demuestra en la presente, la inhibición de la expresión o actividad de HSP90, específicamente la expresión o actividad de HSP90p, mejora la captación de glucosa, la señalización de la insulina y el metabolismo de los lípidos. La invención proporciona métodos de tratamiento de individuos que sufren de síndrome metabólico que consiste en administrar un inhibidor de HSP90, preferentemente un inhibidor de HSP90P, más preferentemente un inhibidor de H3R90b, tales como los proporcionados en la presente, para mejorar al menos un signo o síntoma del síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, el inhibidor de HSP90, preferentemente el inhibidor específico de HSP90 , se puede administrar a un individuo en donde se al menos se administre un agente adicional para el tratamiento del síndrome metabólico al individuo. Cuando se utiliza en la presente, los agentes se pueden administrar secuencialmente, en cualquier orden, o al mismo tiempo. La administración de múltiples agentes a un individuo no requiere co-formulación de los agentes o el mismo régimen de administración.
El método de tratamiento del síndrome metabólico usando inhibidores de HSP90p se puede combinar con métodos y agentes conocidos para el tratamiento del síndrome metabólico. Muchos agentes y regímenes están disponibles actualmente para el tratamiento del síndrome metabólico y la. diabetes. El agente específico seleccionado para el tratamiento depende del individuo, los síntomas específicos y de la gravedad del estado de enfermedad. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los inhibidores de HSP90p pueden ser administrados junto con la dieta y/o la modificación del comportamiento, por ejemplo, la restricción calórica, sola o en combinación con cirugía bariátrica, y/o con el aumento de la actividad física. En ciertas modalidades, los inhibidores de HSP90 se pueden administrar con los agentes para el tratamiento de la diabetes tipo 2, por ejemplo, metformina (Glucophage, Glu etza, otros), glitazonas, por ejemplo, pioglitazona (Actos), glipizida (Glucotrol), gliburida (Diabeta, Glynase), glimepirida (Amaryl), acarbosa (Precose), metformina (Glucophage), sitagliptina (Januvia), saxagliptina (Onglyza), repaglinida (Prandin), nateglinida (Starlix), exenatida (Byetta), liraglutida (Victoza), o insulina.
VIII. Modelos animales de síndrome metabólico Un núnruero de modelos animales genéticos e inducidos de síndromes metabólicos tales como diabetes tipo 1 y tipo 2, resistencia a la insulina, hiperlipide ia, están bien caracterizados en la téenica. Dichos animales se pueden utilizar para demostrar el efecto de los inhibidores de HSP90, por ejemplo, inhibidores de HSP90 en el tratamiento de la diabetes. Los modelos de diabetes tipo 1 incluyen, más no se limitan a, los ratones NOD y ratas y ratones con diabetes inducida por estreptozotocina (modelos de diabetes tipo 1). Los modelos genéticos e inducidos de diabetes tipo 2 incluyen, más no se limitan a, ratones ob/ob deficientes de leptina, ratones db/db deficientes de receptores de leptina y modelos de ratón o rata alimentados alto contenido de grasa. En cada uno de los modelos, la linea de tiempo para el desarrollo de las características específicas de la enfermedad es bien conocida. Los inhibidores de HSP90 pueden administrarse antes o después de la aparición de los síntomas de la diabetes para demostrar la eficacia de los inhibidores de HSP90, en particular los inhibidores de H3R90b, en la prevención o tratamiento de la diabetes en estos modelos animales.
Dependiendo del modelo animal específico seleccionado y el tiempo de la intervención, por ejemplo, antes o después de la aparición del síndrome metabólico, los modelos animales se pueden utilizar para demostrar la eficacia de los métodos proporcionados en la presente para la prevención, el tratamiento, el diagnóstico y el seguimiento de síndrome metabólico.
IX. Kits La invención también proporciona composiciones y kits para el diagnóstico de un estado de enfermedad, por ejemplo, síndrome metabólico. Estos kits incluyen uno o más de los siguientes: un anticuerpo detectadle que se une específicamente a H3R90b y uno o más anticuerpos detectadles que se unen específicamente al anticuerpo H3R90b, reactivos para la obtención y/o la preparación de muestras de tejido del individuo para la tinción, y las instrucciones para su uso.
Los kits de la invención pueden, como una opción, contener componentes adicionales útiles para realizar los métodos de la invención. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender líquidos (por ejemplo, solución amortiguadora SSC, TBST) adecuados para hibridar ácidos nucleicos complementarios o para la unión de un anticuerpo con una proteína con la que se une específicamente, uno o más compartimentos de la muestra, un material instructivo que describe el desempeño de un método de la invención y testigos/patrones específicos del tejido.
La invención también proporciona kits para el tratamiento de trastorno metabólico. Los kits incluyen al menos un inhibidor de HPS90, preferentemente un inhibidor de H3R90b específico, y una o más de las instrucciones de uso y un dispositivo para la administración, según sea apropiado.
EJEMPLOS Ejemplo 1 — Empleo de la plataforma teenológica para identificar HSPAB1 (HSP90P) como un nodo de actividad importante en la etiología de la diabetes En este ejemplo, la plataforma tecnológica que se describe en detalle en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US2012/027615 fue empleada para integrar los datos obtenidos de un modelo de diabetes construido a la medida, y para identificar proteínas/vías novedosas de conducción de la patogénesis de la diabetes. Los mapas relaciónales resultantes de este análisis han identificado HSPAB1 (HXR90b) como un nodo importante de la actividad en la etiología de la diabetes. Por lo tanto, HSPAB1 (HSP90p) es una diana importante del tratamiento de la diabetes, así como un marcador de diagnóstico/pronóstico asociado con la diabetes.
Cinco líneas principales de células humanas, a saber, adipocitos, miotubos, hepatocitos, células del músculo liso de aorta (HASMC), y las células tubulares proximales (HK2) fueron sometidas a una de las cinco condiciones que simulan un ambiente experimentado por estas células importantes de la enfermedad, in vivo. Específicamente, cada una de las cinco lineas de células se expusieron por separado a cada una de las siguientes condiciones: condiciones de hiperglucemia, condiciones hiperlipidémicas, condiciones de hiperinsulinemia, condiciones hipóxicas y la exposición a ácido láctico. La condición hiperglucémica se indujo mediante el cultivo de células en medio que contenia glucosa 22 mM. El estado hiperlipidémico se indujo mediante el cultivo de las células en medios con un contenido de palmitato de sodio 0.15 M. La condición de hiperinsulinemia se indujo mediante el cultivo de las células en medios que contienen insulina 1,000 nM. La condición hipóxica se indujo mediante la colocación de las células en una Cámara Incubadora Modular (MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA), que fue inundada con una mezcla de gas industrial con un contenido de 5% 002, 2% 02 y 93% de nitrógeno. Cada linea celular también se trató con ácido láctico 0 ó 12.5 mM.
Además, los experimentos de interferencia entre dos pares diferentes de células, células del músculo liso aórtico humano (HASMC) (sistema celular 1) y células humanas de riñón 2 (HK2) (sistema celular 2); o las células del hígado (sistema celular 1) y los adipocitos (sistema celular 2) se llevaron a cabo en los que se co cultivaron las células apareadas. Este enfoque de cocultivo se conoce como un experimento de secretoma extracelular (ECS). El primer sistema celular (por ejemplo, HASMC) primero fue sembrado en los insertos de los pozos de una cámara de crecimiento tipo Transwell. Se utilizaron placas de seis pozos para permitir un mejor análisis estadístico. En el momento del sembrado con el primer sistema celular en los insertos, los insertos se colocaron en una placa de 6 pozos por separado. El segundo sistema celular (por ejemplo, HK2) se sembró en la bandeja principal. La bandeja del inserto que contiene el primer sistema celular y la bandeja principal que contiene el segundo sistema celular fueron incubadas a 37°C durante la noche. Cada uno de los sistemas celulares fue crecido en medios específicos de células específicas (en la que, de otro modo, cada uno de los sistemas celulares podría ser crecido en un medio adaptado para soportar el crecimiento de ambos tipos de células). En el segundo día, el tratamiento pre-determinado se dio por intercambio de medios. Específicamente, los insertos que contienen el primer sistema celular se colocaron en la bandeja principal que contiene el segundo sistema celular. La bandeja se incubó durante un período de tiempo pre-determinado, por ejemplo, 24 horas o 48 horas. Los pozos duplicados se establecieron con las mismas condiciones, y las células se agruparon para obtener material suficiente para el análisis 2D. Los medios (alícuotas de 1 mL), las células de los insertos y las células de los pozos de la bandeja principal se cosecharon como muestras separadas. Los experimentos se realizaron por triplicado con el fin de proporcionar una mejor potencia de análisis estadístico.
Los experimentos de interferencia también se llevaron a cabo mediante experimentos de "intercambio de medios". Específicamente, un medio de cultivo o "secretoma" desde el primer sistema celular, HASMC fue recolectado después de 24 horas o 48 horas después de perturbación o acondicionamiento y luego se adicionó al segundo sistema celular, Adipoct.es, durante 24-48 horas. El medio de cultivo final o "secretoma" del segundo sistema celular fue luego recolectado. Todos los secretomas finales se sometieron a análisis proteómico.
El modelo celular que comprende las células mencionadas anteriormente, en donde las células fueron expuestas a cada condición antes descrita, fue adicionalmente "interrogado" mediante la exposición de las células a una "alteración ambiental" mediante el tratamiento con coenzima Q10. Específicamente, las células fueron tratadas con coenzima Q10 en 0, 50 mM, o 100 mM.
Las muestras celulares para cada línea celular, condición y tratamiento coenzima Q10 se recolectaron en diversos momentos después del tratamiento, incluso después de 24 horas y 48 horas de tratamiento. Para ciertas células y bajo ciertas condiciones, también se recogieron y analizaron muestras de los medios.
El perfilado iProfiling de los cambios en la expresión total de proteina celular por proteómica cuantitativa para muestras de células y medios recolectados para cada línea celular en cada condición y con cada "alteración ambiental", es decir, el tratamiento de coenzima QIC), utilizando las téenicas antes descritas en la descripción detallada.
Los datos proteómicos recolectados para cada línea celular antes enlistados en cada condición y con cada alteración, y los datos de perfilado bioenergético recolectados para cada línea celular en cada condición y con cada alteración, fueron procesados por el sistema REFS™. Se generó una red compuesta después de la alteración a partir de datos combinados obtenidos de todas las líneas celulares para una condición específica (por ejemplo, la hiperglucemia) expuesta a alteración (CoQlO). Una red inalterable compuesta se generó de datos combinados obtenidos a partir de todas las líneas celulares para la misma condición específica (por ejemplo, la hiperglucemia), sin alteración (sin CoQlO). Del mismo modo, una red alterada compuesta se a partir de los datos combinados obtenidos a partir de todas las líneas celulares durante una segunda condición de control (por ejemplo, la glucemia normal) expuesta a la alteración (CoQlO). Una red inalterable compuesta se generó a partir de datos combinados obtenidos de todas las líneas celulares para la misma segunda condición de control (por ejemplo, la glucemia normal), sin alteración (sin CoQlO).
Se simuló cada nodo en las redes compuesto consenso antes descritas (aumentando o disminuyendo por 10 veces) para generar redes de simulación utilizando REFS™, como se describe en detalle anteriormente en la descripción detallada.
El área bajo la curva y los cambios para cada borde que conecta un nodo padre a un nodo hijo en las redes de simulación se extrajeron por un programa hecho a la medida usando el lenguaje de programación R, en donde el lenguaje de programación R es un entorno de software de fuente abierta para la estadística informática y gráficas.
Las redes Delta fueron generadas a partir de las redes compuestas simuladas. Para generar una red diferencial del estado de enfermedad diabetes frente al cuatro normal en respuesta a la coenzima Q10 (red delta-delta), se llevaron a cabo los pasos de comparación como se ilustra en la Figura 1, por un programa construido según especificaciones utilizando el lenguaje de programación PERL.
Específicamente, como se muestra en la Figura 1, el tratamiento TI se refiere al tratamiento Coenzima Q10, y NG y HG se refieren a las condiciones normal y de hiperglucemia. Los bordes únicos de GN en la red NGnHG delta se comparó con los bordes únicos de TGH1 en la red HGHnHGTl delta. Los bordes en la intersección de la NG y TGH1 son bordes HG que se restauran a NG con TI. Los bordes HG restaurados a NG con Ti se superpusieron en la red NGnHG delta (mostrada en los circuios de color más oscuro en la figura 2).
Específicamente, un mapa compuesto simulado de la condición de glucemia normal (NG) y un mapa compuesto simulado de la condición de hiperglucemia (HG) se compararon mediante un programa construido según especificaciones PERL para generar bordes únicos de la condición normal de la glucemia. Un mapa compuesto simulado de la condición hiperglucemia sin tratamiento de Coenzima Q10 (HG) y un mapa simulado de la condición hiperglucemia con tratamiento de coenzima Q10 (TGH1) se compararon mediante un programa construido según especificaciones PERL para generar bordes únicos de la condición de la hiperglucemia con tratamiento de Coenzima Q10 (TGH1). Los bordes en la intersección de los bordes únicos de condición normal de la glucemia (NG) y los bordes únicos de condición de la hiperglucemia con tratamiento de coenzima Q10 (TGH1) se identificaron utilizando el programa PERL. Estos bordes representan factores/redes que se restauran a su condición normal de glucemia a partir de la condición de hiperglucemia por el tratamiento de la coenzima Q10. La red delta-delta de los bordes de hiperglucemia restaurados a su estado normal con el tratamiento Coenzima Q10 se superpuso en la red delta de glucemia normal de n hiperglucemia.
Los resultados de los programas PERL y R se introdujeron en Cytoscape, un programa de código abierto, para generar una representación visual de la red superpuesta entre los bordes de hiperglucemia restaurados a su condición normal con tratamiento de coenzima Q10 delta-delta y la red delta glucemia normal frente a hiperglucemia. Un resultado del programa Cytoscape que representa la red superpuesta se muestra en la Figura 2. Los circuios de color más oscuro en la Figura 2 son identificados como bordes que se restauraron a una condición normal de glucemia a partir de una condición de la hiperglucemia por tratamiento de la coenzima Q1.0. Los circuios de color más claro en la Figura 2 se identifican como bordes de hypercemia normales únicos. La sub-red en el cuadro mostrado en la Figura 2 se amplia y se representa en la Figura 3. HSP90AB1 (HSP90b) es uno de los marcadores identificados que son bordes restaurados a una condición normal de glucemia a partir de una condición de hiperglucemia por el tratamiento de la coenzima 10 (véase la Figura 3).
La Figura 3 representa un mapa de asociación de HSP90AB1 (HSP90b) y nodos causales de interés de los resultados de diabetes utilizando Interrogative Biology©.
La Figura 4 representa la lista de símbolos y códigos de color usados en los mapas de la red diferencial para delinear las asociaciones causales de proteínas en modelos de células normales y enfermas. HSP90AB1 (HSP90 ) fue identificado en esta red delta-delta superpuesta como un factor terapéutico potencial, diana fármaco y biomarcador para diabetes.
Ejemplo 2 - H3R90b Regulación del metabolismo del sustrato celular y la señalización de insulina A. Materiales y métodos: 1. Diferenciación de miohlastos humanos en miotubos : Mioblastos de músculo esquelético humano (HSMM) se adquirieron de PromoCe.il y se cultivaron en un medio de crecimiento recomendado por el proveedor. Los cultivos confluentes fueron reemplazados con medio de diferenciación (DMEM, 2% de suero de caballo, piruvato y HEPES) y las células se dejaron diferenciar durante 7 a 10 días. 2. siARN de Hepqqb/ Inhibición de HSP90: siARN trifecta disponible en el mercado de IDT® se utilizó para el silenciamiento (knockdown) específico de Hbr90b. Como testigo se incluyó en todos los experimentos siARN mezclado. Los tres siARN proporcionados por IDT® se transíectaron por separado usando un reactivo de transfección Mirus® TKO®. El silenciamiento de H.br90b fue confirmado por Western Blot y qPCR usando anticuerpos y sondas de cebadores disponibles en el comercio que son específicos para 1a proteína Hsp90fí humana y ARNm. Se obtuvo el inhibidor CCT018159 de HSP90 de Tocris Bioscience. 3. Información de la secuencia siHsp90 Hl: Secuencias dúplex 5*-rArGrG rCrCrG rArCrA rArGrA rArUrG rArürA rArGrG rCrAG T-3* (ID SEC NO: 1) 5*-rArCrU rGrCrC rürürA rUrCrA rürUrC rürürG rUrCrG rGrCrC rürCrA-3* (ID SEC NO: 2) H2: Secuencias dúplex 5*-rCrArA rCrGrA ·rürGrA rUrGrA rArCrA rGrürA rürGrC rürUG G-3* (ID SEC NO: 3) 5*-rCrCrA rArGrC rArürA rCrUrG rUrürC rArürC rArUrC rGrürU rGrürG-3* (ID SEC NO: 4) H3: Secuencias dúplex 5*-rCrGrU rürGrC rUrCrA rCrürA rUrürA rCrGrU rArürA rArUC C-3 (ID SEC NO: 5) 5*-rGrGrA rürürA rUrArC rGrUrA rArUrA rGrUrG rArGrC rArArC rGrürA-3* (ID SEC NO: 6) 4. Experimentos de señalización de insulina : Se utilizaron células de miotubos HSMM humanos que fueron cultivadas en placas de 12 pozos de la semana anterior. El medio se aspiró y el medio reciente con diluciones apropiadas de la siARN NC y H3 para silenciamiento de Hsp90 se adicionaron de tal manera que la concentración final en los pozos de la placa fuera de 100 nM. Se utilizó reactivo de transfección Mirus TKO para la transfección de las células. La placa se incubó a 37°C durante la noche.
El medio se aspiró y las células se lavaron dos veces - primero con PBS caliente y segundo con BSA al 0.1% que contenia medio de crecimiento. Las células fueron privadas de suero durante 2-3 horas en medio de diferenciación 0.1% que contenia los inhibidores apropiados a 37°C seguido por la estimulación de insulina durante 5 minutos (insulina 0, 10, y 100 nM).
Los pozos fueron lavados una vez con PBS y se cosecharon en 100 ml, de solución amortiguadora RIFA que contenía inhibidores de la proteasa y fosfatasa. La placa se colocó en hielo y, usando un raspador de células, las células se rasparon de la placa. Los U sados se recolectaron en tubos Eppendorf de 1.5 mL y se homogeneizaron mediante el uso de una jeringa y aguja. Los U sados luego se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 14.000 RPM. Los U sados se pueden almacenar a -20°C para uso futuro.
El contenido de proteina se estimó por el ensayo BCA y las muestras fueron preparadas para electroforesis en gel y Western blot como se describe en las secciones siguientes. Se calculó el volumen total requerido para cargar 10 yg de proteina total.
Las muestras se cargaron en un gel bis-tris o Tris-glicina-SDS. Las proteínas se transfirieron a un PVDF o una membrana de nitrocelulosa utilizando métodos de transferencia rutinarios en húmedo o seco. Las membranas fueron luego bloqueadas durante al menos una hora usando la solución amortiguadora de bloqueo. Las membranas se cortaron antes de la exposición a los anticuerpos primarios apropiados diluidos en solución amortiguadora de bloqueo para la incubación. Los anticuerpos primarios para pAKT (p-Akt, S473), pERK (p-Erk, fosfo-p44 / 42 MAPK (Erkl/2) <Thr202/Tyr204), y pGSK3p (fosfo-GSK-3p (Ser9) se obtuvieron de Cell Signaling Inc.® Otros anticuerpos también se obtuvieron de fuentes comerciales. La membrana se colocó en el agitador y se incubó en el refrigerador (4°C) durante la noche.
La visualización de las proteínas y la cuantificación de los análisis Western blot se realizó como sigue. Las membranas se lavaron tres veces usando IX PBS-T (10 minutos cada uno). Los anticuerpos secundarios HRP apropiados fueron diluidos (1:10.000) en solución amortiguadora de bloqueo y se adicionaron a cada una de las membranas. Las membranas se incubaron durante al menos una hora en el agitador a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces (10 minutos cada una) con PBS-T. Después del lavado final, las membranas se mantuvieron en el PBS-T hasta la detección de las proteínas.
Cada tira de la membrana fue tomada colocándola en una superficie plana y limpia. El sustrato quimioluminiscente (Pierce© PICO o DURA) se adicionó a cada una de las membranas y se incubó durante 5 minutos. Las membranas fueron luego colocadas entonces en una hoja de plástico limpia para la visualización utilizando el generador de imágenes de quimioluminiscencia BioRad®. Las bandas se cuantificaron utilizando el software BioRad®. 5. La insulina estimula la captación de glucosa : Mioblastos HSM (20.000 células/pozo) se diferenciaron con 2% de suero de caballo en placas de 96 pozos durante 7 días antes del experimento. Las células se lavaron dos veces con 200 uL de solución amortiguadora MBSS que contenia BSA 0.1%, y luego el suero fue privado de nutrientes con 100 uL MBSS-BSA al 0.1% durante 4 horas. Algunos pozos también se trataron previamente con el compuesto LY 25 uM durante 20 minutos. Después de la iniciación de la estimulación de insulina, se adicionaron 2 veces 100 uL de reactivos en solución amortiguadora MBSS - BSA al 0.1% a 100 uL de medio privado de nutrientes para hacer la concentración lx para el experimento. Los reactivos 2x son: insulina (0, 20 nM, y 200 nM); 2NBDG (500 uM). Las células fueron tratadas con insulina y 2NBDG durante 30 min, después se lavaron dos veces con solución amortiguadora MBSS, luego, se adicionaron 50 uL de solución amortiguadora MBSS a los pozos. La captación de glucosa se detectó con fluorómetro junto con la detección del fondo con los pozos sin células en estos. Después de la lectura del fluorómetro, se adicionó un fijador (formalina, 50 uL) a 50 uL de MBSS en los pozos, luego, se adicionó 100 uL de DAPI 1 um a 100 uL de la mezcla formalina y MBSS. 6. Perfiles bioenergeticas de los miotubos : Los miotubos HSMM cultivados en pozos en un cartucho de ensayo Seahorse© se diferenciaron con medio de diferenciación de miocitos con suero equino al 2% durante 7 dias. Las células fueron transíectadas con cualquiera de los testigos siARN mezclados o siHsp siARN con los reactivos de transfección TKO a una concentración de 50 nM, siguiendo las instrucciones del proveedor como se describió anteriormente (Mirus Bio®). Después de 48 horas de la transfección, las células se sometieron a análisis bioenergético Seahorse® utilizando medicamentos para modular la energética celular, es decir, oligomicina, cianuro de carbonilo-M-clorofenil hidrazina (CCCP), y rotenona. La oligomicina inhibe la ATP sintasa mitocondrial (complejo V de la cadena ET) y permite el análisis de la capacidad glucolítica. El CCCP es un desacoplador que bombea protones de la membrana mitocondrial, induciendo de este modo el consumo máximo de oxígeno compensatorio, y permite el análisis de OCR no acoplada. La rotenona inhibe la NADH deshidrogenasa (complejo I de la cadena ET) y permite el análisis de la OCR no mitocondrial.
Para realizar el ensayo, cada pozo del cartucho de ensayo Seahorse© se lavó con 1 mL de medio de la corrida. 500 uL de medio de la corrida se adicionaron a cada pozo y la placa se colocó en un incubador a 37°C (libre de CO2). Los medicamentos para modular la actividad mitocondrial fueron preparados a una concentración de 10 X (10 uM), de modo que después de la adición al cartucho, la concentración final sería IX (1 mM). Oligomicina (50 uL), CCCP (55 uL) y rotenona (55 uL) se adicionaron a los puertos A, B y C del cartucho y el cartucho se colocó de nuevo en el incubador. Se abrió el asistente de ensayo Seahorse® y se establecieron los parámetros y tiempos de ciclo. A continuación, el ensayo Seahorse® se realizó usando el instrumento. Después del ensayo Seahorse®, las células se lisaron con 50 uL de NaOH 450 mM y después se neutralizaron con 5 uL de Tris pH 6.8. Los lisados de ADN fueron sometidos a análisis espectrofoto étrico a OD260 usando un lector de placas de ADN BioTek® Take3. Los datos se normalizaron con el contenido de ADN de las células.
B. Resultados 1 . Factores metabólicos y de estres inducen la expresión de Hep90b: El tratamiento agudo de iotubos con factores metabólicos y de estrés ha demostrado modular la expresión de H£r90b. Los mioblastos HSMM se diferenciaron en medio que contiene 2% de suero de caballo durante 7 dias, después se someten a diferentes condiciones de nutrientes durante 24 horas, incluyendo: glucosa normal (NG, glucosa 5 mM), alto contenido de glucosa (HG, glucosa 25 mM), NG + manitol (se utiliza manitol para equilibrar la presión osmótica), mezcla de ácido oleico y ácido linoleico (150 uM), pal itato (150 uM), y una combinación de estas diferentes condiciones. Los resultados mostraron que después de 24 horas, el alto contenido de glucosa no tuvo efectos significativos sobre la expresión del ARNm del Hsp90p,, a pesar de los efectos inducidos por el estrés osmótico. Con las condiciones normales de glucosa, la mezcla de lipidos suprimió la expresión del ARNm de HSP90p, mientras que elevó la expresión del ARNm de H3R90b en la condición con alto contenido de glucosa. El palmitato con NG suprimió la expresión del ARNm de H3R90b en comparación con el testigo de BSA. Estos datos indicaron que la expresión de HSP905 está regulada por diferentes factores metabólicos tales como lipidemia, lo que demuestra una relación con las respuestas del metabolismo oxidativo y de estrés. La expresión de Hsp90p fue inducida por tratamiento de miotubos con TNFa (Figura 5). 2. El silenciamiento de Hep90b en miotubos dio lugar a una mayor señalización de la insulina : Los miotubos HSMM fueron transíectados secuencialmente (1) con 3 siARNs diferentes dirigidos a HSP90AB1 durante 48 horas, (2) suero privado de nutrientes durante 3 horas, y (3) sometidos a la estimulación de diferentes concentraciones de insulina (0, 10, 100 nM). Los episodios de señalización corriente debajo de la estimulación de la insulina se evaluaron por análisis Western Blot para determinar los niveles del AKt, Erk, y GSK3p total y fosforilados. La cuantificación del análisis Western blot mostró que el silenciamiento de HSP90AB1 indujo una elevación significativa de la fosforilación estimulada por insulina de Akt, ERK, y GSK3. Akt se activa por la unión de fosfolípidos y la fosforilación del bucle de activación en Thr308 mediante PDK1 y por fosforilación dentro del carboxilo terminal en Ser473. MEK1 y MEK2 activan p44 y p42 a través de la fosforilación de los residuos del bucle de activación Thr202/Tyr204 y Thrl85/Tyrl87, respectivamente. GSK-3 es un elemento crítico corriente abajo de la vía de supervivencia celular P13K/Akt cuya actividad se puede inhibir por fosforilación mediada por Akt en Ser21 de GSK-3a y Ser9 de GSK~3p (Figura 6). 3. El silenciamíento de Hep90b en miotubos dio lugar a un incremento de la captación de glucosa estimulada por insulina : En consonancia con los episodios de señalización elevados inducidos por silenciamíento de Herqqb, la captación de glucosa inducida por la glucosa se midió en miotubos HSMM utilizando el análogo de la glucosa fluorescente 2-NBDG. Utilizando los métodos proporcionados anteriormente, las células fueron transfectadas secuencialmente con cualquier control o H£r90b siARN durante 48 horas, suero privado de nutrientes durante 4 horas, y se estimularon con diferentes concentraciones de insulina con presencia de 250 uM 2-NBDG durante 30 min. Las células se lavaron entonces con PBS y la fluorescencia se detectó usando un lector de placas. La fluorescencia de la célula refleja la cantidad de la glucosa tomada por las células. Los resultados demostraron que las células tratadas con siHsp90 , con expresión de HSP90p reducida, mostró mejora de forma significativa la captación de glucosa estimulada por insulina en comparación con las células tratadas con si-ARN mezclado, no específico, en las mismas condiciones. Estos datos demuestran que la inhibición o silenciamiento de Hsp90p en miotubos aumenta la captación de glucosa estimulada por insulina (Figura 7). 4. El silenciamiento de Hep90b en miotubos dio lugar a una mayor eficiencia mitocondrial : Los miotubos HSMM fueron transíectados con ARNsi del control o siHsp90 durante 48 horas como ya se describió, luego se somete a perfiles bioenergéticos Seahorse© (Analizador XF24) utilizando diferentes fármacos mitocondriales incluyendo oligomicina, CCCP, y rotenona; y se vigilan los cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) que refleja la capacidad oxidativa mitocondrial basal o máxima. Los resultados se normalizaron por el contenido de ADN.
Los resultados demostraron que tanto en condiciones básales como no acopladas, los miotubos con silenciamiento de H3R90b presentaron mejor respiración oxidativa. Esto demuestra que el silenciamiento de Hbr90b induce profundos cambios metabólleos sobre las mitocondrias en los miotubos, lo que indica una función para Hsp90p en la regulación de las funciones mitocondriales a través de su actividad chaperona, probablemente por la orientación de la incorporación de diferentes proteínas mitocondriales. La cuantificación del área bajo la curva (AUC) tanto para OCR basal como no acoplada en miotubos, ya sea con los siARNs testigo o los de siHSP90ABl del estudio de perfilaje bioenergético, reveló aumento significativo de la OCR basal y no acoplada en células con silenciamiento del Hsp90p, demostrando así una mayor eficiencia mitocondrial (Figura 8) tras el silenciamiento de la expresión de H3r90b. 5. La inhibición de HSP90 por el inhibidor de molécula pequeña (CCT018159) aumenta la fosforilación de AKT r pero no de ERK y GSK3/.3; Los miotubos fueron tratados con un inhibidor de molécula pequeña de HSP90 (CCT018159) después se sometió a la estimulación de insulina. El inhibidor de molécula pequeña de HSP90 (CCT018159) inhibe tanto HSP90a y HSP90p. El efecto del inhibidor de molécula pequeña en la señalización de la insulina se evaluó mediante la medición de la fosforilación estimulada por insulina de las dianas corriente abajo Akt, ERK, y Q.8K3b por Western blot. Los resultados demostraron que la mayor concentración de CCT018159, específicamente 10 mM, mejora de forma significativa la fosforilación de Akt estimulada por insulina, lo que indica que la inhibición de HSP90 embargo, no se observó cambio en el nivel de pERK o pGSK3b (Figuras 9A y 9B).
Se observó un efecto diferencial de los inhibidores de molécula pequeña de Hsp90 sobre la bioenergética celular en comparación con la del silenciamiento específico de Hsp90 . El perfil bioenergét ico de los miotubos después del tratamiento con CCT018159 a diferentes concentraciones mostró un perfil diferente del observado con células con silenciamiento del Hsp90p. No se observó cambio en la OCR basal, y todavía la OCR no acoplada realmente estaba disminuida en una forma dependiente de la concentración, donde el CCT018159 10 uM indujo una mayor supresión de la OCR inducida por CCCP. Este perfil diferente indica que el aumento de OCR en el estado basal y no acoplado es específico de Hsp90p, mientras que CCT018159 inhibe tanto HSP90a como Hsp90 bloqueando los bolsillos de unión al ATP. A una concentración inferior de CCT018159 (1 mM), se observó un aumento en la OCR no acoplada en los miotubos tratados (Figura 10).
C. Conclusiones: En resumen, Hsp90p regula la señalización de insulina, la captación de glucosa, y el metabolismo de sustrato en miotubos del músculo esqueletico. La inducción de la Hsp90B mARN y proteína en respuesta a la hiperlipidemia, la hiperglucemia y las señales proinflamatorias demuestra una función de la proteína en la fisiopatologia de la diabetes. El silenciamiento de Hsp90p en miotubos resultó en un aumento significativo en la captación de glucosa demostrando su función en la regulación de la glucosa. El silenciamiento de Hsp90p en los miotubos también resultó en un aumento mayor en la fosforilación de ERK y asi como un aumento en la fosforilación de AKT y GSK3f¿, demostrando una bifurcación funcional de la señalización de la insulina y que indica que Hsp90P está implicada en un mecanismo selectivo. El silenciamiento de Hsp90p tiene un efecto significativo en la bioenergética y el metabolismo de sustrato mitocondrial. El inhibidor de HSP90 CCT018159, que inhibe tanto HSP90a y Hsp90 , tuvo un efecto menos profundo en la señalización de la insulina y la bioenergética, lo que indica que la inhibición específica de Hsp90p es más eficaz que un abordaje de pan-inhibición de Hsp90.
Ejemplo 3 - Regulación del ARNm de HSP90P de la expresión de las enzimas metahólicas en miotubos de músculo esqueletico Los mioblastos se cultivaron y diferenciaron en miotubos y se trataron con siARNs esencialmente como ya se describió. La expresión del ARNm de una serie de enzimas metabólicas implicadas en diversas vías metahólicas se ensayó por rtPCR utilizando métodos rutinarios. Las enzimas incluyen las que participan en la glucólisis (HK2, LDH, GYS1), la oxidación de lípidos (CPT1, UCP3), el transporte de ácidos grasos (CD36), y la síntesis de ácidos grasos (ACC1 y ACC2), la lipólisis (HSL). La expresión de ARNm en las células tratadas con el siARN de H3R90b se normalizó a la expresión del gen en las células tratadas con el siARN mezclado. Los resultados se muestran en la Figura 11A. Se encontró que los niveles de expresión de mARN de HK2, LDH, GYS1, CPTl y UCP3 aumentaron tras el silenciamiento de la expresión de HSP90P, mientras que se encontró que los niveles de expresión de CD36 y HSL disminuyeron tras el silenciamiento de la expresión de H3R90b. También se observó una tendencia a la disminución de la expresión de ACC2, que participa en la síntesis de ácidos grasos. Se encontró que los niveles de proteína UCP3 aumentó sustancialmente tras el silenciamiento de HSP90 (Figura 11B). El nivel de la expresión de la proteina UPC3 en el músculo esquelético suele ser bajo en los diabéticos, pero su expresión es inducida por el ejercicio. Sin estar limitado a algún mecanismo, se sugiere que· el silenciamiento de la expresión de HSP90 podría estar ejerciendo un efecto benéfico en el tratamiento del síndrome metabólico por la modulación de las proteínas, tales como UCP3.
Ejemplo 4 - Regulación de HSPSOfJ del flujo glicolitieo en miotubos del músculo esquelético Los mioblastos se cultivaron y diferenciaron en miotubos esencialmente como ya se describió, sometidos a crecimiento bajo condiciones normoglucémicas e hiperglucé icas. Las células sometidas a condiciones de hiperglucemia se cultivaron y diferenciaron en glucosa 5 mM, y se cultivan en glucosa 11 mM antes de la transfección con siARN. Las células cultivadas bajo condiciones tanto normoglucémicas como hiperglucémicas fueron transíectadas con siARN de HSP90p o un siARN testigo mezclado. Las células fueron entonces sometidas a análisis Seahorse© como se describe anteriormente para analizar el flujo glucolítico, con las células hiperglucémicas siendo ensayadas en glucosa 11 mM.
Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, el silenciamiento de H3R90b aumentó ECAR inducida por glucosa y ECAR inducida por oligomicina en ambas condiciones normoglucémieas e hiperglucémicas. Sin embargo, aunque el silenciamiento de H3R90b aumentó la OCR basal y la OCR no acoplada en condiciones normoglucémieas, no se observó ningún cambio en la OCR basal ni en la OCR no acoplada en condiciones hiperglucémicas (Figuras 12C y 12D). Estos resultados demuestran que Hsp90ABl regula la respiración mitocondrial y la glucólisis en condiciones diferentes. Sin desear estar ligado a algún mecanismo, estos resultados sugieren que los niveles reducidos de proteina Hsp90ABl puede elevar el metabolismo del sustrato global, mejorando con ello el metabolismo sistémico in vivo.
Ejemplo 5 - Regulación de HSP9O de los niveles de pERK en un Modelo inflamatorio de resistencia a la insulina en miotubos del músculo esquelético Los mioblastos se cultivaron y diferenciaron en miotubos esencialmente como ya se describió, se sometieron a crecimiento en condiciones normoglucémieas e hiperglucémicas. Las células sometidas a condiciones hiperglucémicas se cultivaron y diferenciaron en glucosa 5 mM, y se cultivan en glucosa 11 mM durante 24 horas antes de la transfección con siARN y/o el tratamiento con TNF-a. Las células cultivadas en condiciones normoglucémicas, condiciones de hiperglucémicas, o condiciones de hiperglucemia en presencia de TNF-a fueron transíectadas con siARN de H.¾R90b o un siARN testigo mezclado. Las células cultivadas en condiciones hiperglucémicas fueron cultivadas en presencia de glucosa 11 rriM de y/o TNF-a, en consecuencia. Las células fueron expuestas a concentraciones crecientes de insulina (0, 10, 100 nM) durante 5_ min antes de la cosecha y del análisis por Western blot. En resumen, las células fueron cosechadas en solución amortiguadora RIPA que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa. Las células se U saron usando una jeringa y aguja. Las concentraciones totales de proteína se determinaron para cada una de las muestras. Cantidades equivalentes de proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se sondearon con anticuerpos disponibles en el comercio para la detección de ERK total y fosforílada (Figura 13A). La cantidad total de ERK y ERK fosforílada se determinó cuantitativamente utilizando un analizador Phosphorimager y se calcularon las proporciones de ERK fosforílada a ERK total (Figura 13B).
Como se muestra en las Figuras 13A y 13B, en condiciones normoglucémicas, los niveles básales de la fosforilación de ERK y la señalización de insulina, determinadas por la fosforilación de ERK, se incrementa por el silenciamiento de la expresión de HSP903. Se observó aumento en la fosforilación de ERK estimulada por insulina en los miotubos del músculo esquelético NG con el silenciamiento de Hsp90ABl. Aunque el HG por si solo no suprime la señalización de insulina y la fosforilación de ERK, las condiciones HG en presencia de TNFa suprimieron fuertemente la fosforilación de ERK estimulada por insulina en presencia de HSP90p. Sin embargo, bajo las mismas condiciones HG y TNFa, el silenciamiento de HspSOABl rescató la fosforilación de ERK suprimida por TNFa, indicando que el silenciamiento de Hsp90ABl rescató la resistencia a la insulina inducida por TNFa en las condiciones HG.
Ejemplo 6 - Regulación de HSP90(S del metabolismo de lipidos en miotubos del músculo esquelético Habiendo demostrado los efectos del silenciamiento de HSP90b en presencia y ausencia de TNF-a sobre la señalización de la insulina en el músculo esquelético, se analizaron los efectos de HSP90p y TNF-a en el metabolismo lipídico. En resumen, los miocitos se cultivaron y diferenciaron en condiciones normales y glucémicas prácticamente como se describe anteriormente y se trataron con H3R90b o siARN mezclado. El metabolismo de lípidos se analizó utilizando un ensayo Seahorse® para OCR esencialmente como ya se describió. Como se muestra en la Figura 14, en presencia de HXR90b, el TNF-a disminuye el metabolismo lipídico. Sin embargo, el silenciamiento de H3R90b aumenta la OCR en condiciones normoglucémicas en los miotubos del músculo en ausencia y presencia de TNF-a. Estos resultados demuestran que H5R90b regula el metabolismo de lipidos, tal como se mide por el ensayo Seahorse®. Aunque el TNF-a disminuye el metabolismo de lipidos en presencia de H3R90b, el silenciamiento de H3R90b vuelve a establecer el metabolismo de los lipidos en presencia de la disminución inducida por TNF-a en el metabolismo lipídico.
Ejemplo 7 - Tratamiento del Síndrome Metabólico utilizando un inhibidor de HSP90 Diversos modelos animales genéticos e inducidos de síndromes metabólicos tales como diabetes tipo 1 y tipo 2, resistencia a la insulina, e hiperlipidemia, están bien caracterizados en la téenica. Dichos animales se utilizan para demostrar el efecto de los inhibidores de HSP90, por ejemplo, los inhibidores de H3R90b, en el tratamiento de síndrome metabólico, incluyendo la diabetes. Los modelos de diabetes tipo 1 incluyen, más no se limitan a, los ratones NOD y ratas y ratones con diabetes inducida por estreptozotocina (modelos de diabetes tipo 1). Los modelos genéticos e inducidos de la diabetes tipo 2 incluyen, pero no se limitan a, modelos de ratones ob/b deficientes de leptina, ratones db/db deficientes de receptores de leptina, y de ratones y rata alimentados con alto contenido de grasa. En cada uno de los modelos, se conoce bien la línea de tiempo para el desarrollo de las características específicas de la enfermedad. Los inhibidores de HSP90 pueden administrarse antes o después de la aparición de los síntomas de la diabetes para demostrar la eficacia de los inhibidores de HSP90, en particular los inhibidores de HSP90 en el tratamiento de la diabetes, trastorno metabólico y/o uno o más síntomas de trastorno metabólico.
Los animales con o sin predisposiciones genéticas al síndrome metabólico son criados en condiciones apropiadas para inducir el estado de la enfermedad deseado. Los animales se dividen en al menos dos grupos, tratado y testigo. Los animales tratados se tratan con una o más dosis de los inhibidores de HSP90, por ejemplo, siARNs dirigidos aa HHSSPP9900,, anticuerpos dirigidos a HSP90, o inhibidores de moléculas pequeñas de HSP90. Preferentemente, las moléculas pequeñas, los siARN y los anticuerpos están dirigidos específicamente a HSP9Go¡ o H3R90b. Los animales se vigilan para determinar el desarrollo del síndrome metabólico por alguno de los métodos conocidos. Por ejemplo, la secreción basal de insulina, los niveles de glucosa, los niveles de HblAc, los niveles de los marcadores inflamatorios, niveles de colesterol y triglicéridos, el peso, la depositación de grasa incluyendo la depositación de grasa en el hígado, la presión arterial, la producción de orina y los niveles de glucosa en la orina, y otros marcadores pertinentes pueden ser vigilados o medidos. Los marcadores se analizaron después de un periodo de ayuno, por ejemplo, ayuno durante la noche, o en respuesta al desafío de glucosa u otro desafío metabólico. En intervalos predeterminados, o al final del experimento, los animales se sometieron a eutanasia para evaluar la depositación de grasa, el estado del riñón, y otros indicadores adecuados de síndrome metabólico.
El resultado del(los) grupo(s) de tratamiento se comparó con el resultado del grupo testigo (no tratado o tratado con vehículo). Se demostró que los inhibidores de la H3R90b aminoran el síndrome metabólico en diversos métodos de evaluación.
Ejemplo 8 ~ Validación de HSP90P como una diana hepática para el tratamiento del síndrome metabólico El hígado juega un papel esencial en la regulación de la glucosa en sangre. En un individuo sano, la insulina favorece la captación de glucosa por el hígado para su conversión en glucógeno, reduciendo los niveles de glucosa en sangre. En el síndrome metabólico, el hígado no responde a la insulina, ya sea debido a la insensibilidad a la insulina o producción insuficiente de insulina, o ambos, dando como resultado niveles elevados de glucosa en la sangre, lo cual es tóxico.
Las células hepáticas (por ejemplo, las células THLE-2) se analizan utilizando métodos similares a los expuestos anteriormente para el análisis de la señalización de la insulina y la captación de glucosa. En resumen, las células se tratan con inhibidores de HSP90, preferentemente inhibidores de HSP90(¾, y se analiza la señalización de insulina, por ejemplo, mediante el análisis de la fosforilación de ?KT, ERK y GSK3P; la captación de glucosa, la síntesis de glucógeno; bioenergética; la expresión de genes implicados en la gluconeogénesis o el metabolismo de lípidos/colesterol, por ejemplo, por qPCR. Los marcadores de la inflamación y el estrés del retículo endoplasmático (ER) también se pueden evaluar.
Se encuentra que las células hepáticas tratadas con inhibidores de HSP90, en particular inhibidores de H5R90b, tienen una mejor señalización de la insulina, captación de glucosa, y/o metabolismo de los lipidos, en comparación con las células no tratadas con los inhibidores. También se encuentra que las células hepáticas tratadas con los inhibidores tienen menos estrés del ER y/o una menor expresión de marcadores inflamatorios.
Ejemplo 9 - Validación de HSP90P como diana de tejido adiposo para el tratamiento del síndrome metabólico Al igual que las células hepáticas, el tejido adiposo toma la glucosa de la sangre en respuesta a la insulina, convirtiendo el azúcar en grasa. Las células de grasa se evalúan para determinar la sensibilidad a la insulina y la captación de glucosa utilizando los métodos expuestos anteriormente para el análisis de las células musculares y las células hepáticas. Del mismo modo, también se puede evaluar la inflamación y el estrés ER en las células.
Se encontró que las células adiposas tratadas con inhibidores de HSP90, en particular los inhibidores de HSP90 , tienen una mejor señalización de insulina, captación de glucosa, y/o metabolismo de los lípidos, en comparación con las células no tratadas con los inhibidores. También se encontró que las células adiposas tratadas con los inhibidores tienen menos estrés ER y/o una menor expresión de los marcadores inflamatorios.
Ejemplo 10 - Clasificación de la especificidad de un inhibidor de HSP90 Está disponible una variedad de inhibidores de HSP90, tales como los proporcionados en la presente, muchos de los cuales han sido sometidos o serán sometidos a ensayos clínicos para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades o estados, más comúnmente cáncer. Dependiendo del mecanismo de acción específico o sitio de unión del inhibidor en el transcrito de HSP90, proteína, o proteína de unión a HSP90, el inhibidor puede inhibir la actividad de una o más de las isoformas de HSP90, por ejemplo, HSP90cx o HbR90b. Por ejemplo, los inhibidores que actúan en el sitio de unión al ATP de HSP90 probablemente tengan actividad inhibidora HSP90 y H3R90b. Además, se pueden seleccionar agentes que inhiban la interacción de HSP90 con un ligando de unión especifico (véase, por ejemplo, Tsaytler et al, 2009, Cell Stress Cap.14: 629). Del mismo modo, con base en la secuencia de ácido nucleico o amino ácido específica de la HSP90, los inhibidores a base de ácido nucleico o a base de anticuerpos pueden ser diseñados para inhibir específicamente la expresión o actividad de HSP90a o HSP90p. Alternativamente, se pueden diseñar los inhibidores a base de ácido nucleico o a base de anticuerpos pueden específicamente para la expresión o actividad de HSP90o¡ o HSP90p. Los alineamientos de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos de HSP90OÍ y HSP90p se proporcionan en la Figura 17. Un experto en la téenica puede revisar fácilmente los alineamientos para diseñar inhibidores de ácido nucleico o para identificar epítopos en HSP90a y H3R90b que pudieran tener reactividad cruzada o específicos para una sola isoforma de HSP90.
Los métodos para determinar si un agente es un inhibidor de la expresión o actividad de HSP90a, H3R90b, o ambos están muy dentro de la habilidad de los expertos en la técnica. Por ejemplo, los inhibidores ácidos nucleicos y anticuerpos que inhiben la expresión de al menos un HSP90 pueden ser analizados para determinar la especificidad en un sistema de cultivo celular. Por ejemplo, las células que expresan HSP90a y H3R90b se ponen en contacto con una serie de concentraciones de ácido nucleico o anticuerpo, y los testigos apropiados (por ejemplo, ácido nucleico mezclado, IgG no inmune) durante una cantidad apropiada de tiempo. Las células y/o medios se cosechan, según corresponda. Los métodos de detección rutinarios del ácido nucleico (por ejemplo, RT-PCR, Northern blot) y proteínas (por ejemplo, ELISA, Western blot) se utilizan para determinar el nivel de expresión de HSP90a y HSP90P en comparación con un testigo adecuado. Se puede determinar fácilmente la especificidad del inhibidor de HSP90.
Los ensayos de competición y .los métodos para llevar a cabo los ensayos de unión e hidrólisis del ATP son bien conocidos en la téenica y pueden ser utilizados para determinar si un agente es un inhibidor de HSP90OÍ, HSP90 , o de ambos, es decir, si el agente puede inhibir la unión de o la hidrólisis ATP en una o ambas isoformas.
La levadura contiene sólo una sola copia de HSP90. Las cepas de levadura que no expresan HSP90 pueden transformarse con HSP90a o HSP90P y la se puede vigilar la capacidad para doblar las proteínas cliente. Del mismo modo, las líneas celulares de mamífero que expresan sólo una isoforma de HSP90, por ejemplo, derivada de ratones con silenciamiento de HSP90a, o células tratadas con siARN para inhibir la expresión de una isoforma de HSP90, se pueden utilizar para distinguir la actividad de un agente contra una o ambas isoformas de HSP90.
Los kit disponibles en el comercio también pueden ser utilizados para distinguir entre los inhibidores de HSP90a y HSP90b (BPS Bioscience).
Ejemplo 11 - Evaluación de los oligonucleótidos antisentido (ASO) para la prueba del concepto silenciamiento (knockout) de HSP90p en un Modelo de obesidad inducido por la dieta de resistencia a la insulina Un modelo de estudio en animales ejemplar se proporciona a continuación para validar más el HSP90 como diana terapéutica para la prevención y/o tratamiento del síndrome metabólico, obesidad, resistencia a la insulina y/o diabetes tipo 2. 2. Objetivo y j ustificación Los objetivos del estudio son 1. Identificar y caracterizar los oligonucleótidos antisentido (ASO) para el silenciamiento eficiente de la expresión de H3R90b en modelos in vivo apropiados. 2. Demostrar que el silenciamiento de H£R90b in vivo da lugar a una respuesta fisiológica funcional con beneficios terapéuticos.
El resultado deseado es la prevención del fenotipo obeso y el fenotipo diabético con silenciamiento de H3R90b.
Los estudios Prueba de concepto (PoC) se llevaron a cabo en modelos de ratones de obesidad inducida por la dieta (DIO) y de resistencia a la insulina (RI).
El estudio se lleva a cabo en dos partes: 1. Identificación de uno o más ASO que silencian significativamente la expresión de H3R90b en el modelo in vivo mediante el análisis de expresión de H3R90b en diversos tejidos. 2. La administración dedos) ASO(s) a ratones sometidos a obesidad inducida por la dieta y de resistencia a la insulina para demostrar que la inhibición de la expresión de H3R90b previene, disminuye o retrasa el inicio de aumento de peso y el desarrollo de un síndrome metabólico.
Se entiende que los modelos experimentales que se proporcionan a continuación se pueden modificar fácilmente para valorar otros ácidos nucleicos terapéuticos (siARN, dsiARN, shARN), terapéuticos basados en anticuerpos, y terapéuticos basados en moléculas pequeñas. Además, el estudio puede ser modificado para incluir el uso de otros modelos de diabetes y trastornos metabólicos (tales como los proporcionados anteriormente). Como se discute a continuación, en función de los resultados específicos obtenidos, el tiempo y los intervalos dosificación pueden ser modificados con base en los análisis preliminares de eficacia y toxicidad. Tales modificaciones están dentro de la capacidad de los expertos en la téenica. 2. Importancia El silencia iento de la expresión de H3R90b, retrasa, disminuye o previene el aumento de peso como resultado de una dieta con alto contenido de grasa y la resistencia a la insulina inducida por la dieta, demostrando la utilidad de HSP90p como diana para el tratamiento y manejo de uno o más de los siguientes: obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2 y síndrome etabólico, incluso uno o más de las siguientes: presión arterial elevada, niveles de lípidos elevados, adiposidad central, HDL bajo, y glucosa elevada en ayuno y/o durante una prueba de tolerancia a la glucosa. 3. Enfoque Experimental Parte_ I: Silenciamiento mediado por ASO de HSP90p e in vivo (estudio de escalamiento de la dosis) Selección de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido se preparan y analizan in vítro para identificar los ASO eficaces en la inhibición específica de la expresión de HSP90p. Uno o más ASO identificados en los ensayos in vitro preliminares se usan para estudios in vivo posteriores.
Análisis de la eficacia y toxicidad. Un total de 6 grupos de ratones, que contenían 5 ratones por grupo, se mantuvieron con dieta Chow normal. Los ratones de la Cohorte 1, incluyendo dos grupos de 5 ratones cada uno, recibieron una inyección intraperitoneal de una dosis normal de ASO (30-40 mg/kg) o una dosis alta de ASO (100— 150 mg/kg) dos veces a la semana durante 2 semanas. El tratamiento de la Cohorte 2 y de la Cohorte 3 se inició después de la evaluación de la eficacia y la toxicidad de la cohorte anterior (Cohorte 1 para Cohorte 2 y Cohorte 2 para Cohorte 3). Posteriormente para cada cohorte, el tiempo de tratamiento se eleva por dos semanas (Cohorte 1, 2 semanas; Cohorte 2, 4 semanas; Cohorte 3, 6 semanas). Se toman las siguientes decisiones con base en los resultados obtenidos en la cohorte previa: Sin eficacia Sin toxicidad: Los metodos de tratamiento para la Parte 1 de la Cohorte se repiten con la dosis de tratamiento elevada 10 veces. Además, el tiempo de tratamiento se extendió por 2 semanas.
- Eficacia - Sin toxicidad: El tratamiento en la Parte 2 como se expone a continuación se inicia inmediatamente para este ASO. Además, los métodos de tratamiento de la Parte 1 se repitieron con un calendario de dosificación de cuatro semanas en lugar de un calendario de dosificación de 2 semanas como con la Cohorte 1, con la dosificación para el tratamiento elevada 50 veces con el fin de determinar el umbral tóxico.
- Eficacia - Toxicidad: El tratamiento de la Parte 1 se repite con la dosificación del tratamiento disminuida 10 veces y se utiliza el mismo tiempo de tratamiento.
Sin eficacia - Toxicidad: Este ASO no debe ser considerado para otro estudio.
Para cada cohorte y en todos los grupos, se midió el peso corporal, el nivel de glucosa y el nivel de insulina en plasma antes de cada inyección y antes del sacrificio. Además, se mide el nivel en plasma de ASO usando un kit disponible en el comercio, por ejemplo, el OliGreen© ssADN Quantitation Assay y el kit de Invitrogen®. Después de 2 semanas, los ratones se sacrifican e inmediatamente se hace una punción cardiaca con una aguja (0.5-1 mL) para recuperar la sangre. A continuación, se realizan las necropsias. Los tejidos seleccionados se recolectaron, se pesaron y se congelaron antes de su almacenamiento a -80°C hasta su uso (con excepción de los tejidos adiposos y el hígado).
Las siguientes muestras y tejidos se recolectaron en una manera secuencial.: • Sangre p>ara la preparación de plasma • Hígado (congelación instantánea, fijación para incitación en parafina) • Los músculos esqueléticos (congelación instantánea), incluidos los músculos de las extremidades posteriores y dorsales almacenados en diferentes viales. • tejidos adiposo (congelación instantánea y fijado para incrustación en parafina) , incluidos los tejidos adiposos blancos (perigonadal e inguinal) y tejido adiposo café almacenado en viales diferentes.
• Páncreas (congelación instantánea) • Riñón (congelación instantánea) La eficiencia del silenciamiento de HSP90P se determina midiendo el nivel de expresión de la diana utilizando qPCR, análisis Western Blot y/o inmunohistoquímica. Además, se mide el nivel de insulina en plasma, el nivel leptina en plasma, adiponectina, TNFa, PAI-1, amiloide A en suero e IL6 utilizando ELISA. El ASO con el silenciamiento más eficiente se selecciona y se utiliza para experimentos posteriores proporcionados a continuación en la Parte II.
El plasma y el hígado obtenidos de animales se utilizan para hacer una evaluación preliminar de la toxicidad. Se hacen los ensayos de liberación de LDH con ELISA para marcadores inflamatorios. Además, se llevan a cabo los ensayos de la actividad de alanina amino transferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), glutamato deshidrogenase (GLDH) en hornogenados de plasma e hígado. Los niveles de GSH en el hígado se averiguan como una lectura adicional de la función hepática .
Parte II - Estudio de Prueba de concepto sobre los efectos metabólicos del silenciamiento de H.3R90b en el modelo de obesidad inducida por la dieta con alto contenido de grasa y resistencia a la insulina Un estudio de prueba de concepto sobre los efectos metabólicos incluye el análisis de los siguientes parámetros: peso corporal, niveles de glucosa en sangre con alimentos y en ayuno, ingesta de alimentos, ingesta de agua, composición de la masa corporal, consumo de Oz, producción de CO2, prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), prueba de tolerancia a la insulina (ITT), prueba de tolerancia a piruvato (PTT), y actividad voluntaria.
Ratones C57BL/6 delgados, machos, de ocho semanas de nacidos, sometidos a una dieta con alto contenido de grasa (HFD) 60% de Kcal % grasa [sic] son tratados con dosis predeterminadas por métodos empíricos del ASO para HSP90 , el ASO testigo, o salina dos veces por semana a través de inyecciones intraperitoneales (IP). Grupos testigo delgados diferentes reciben salina o el ASO testigo, y se mantienen con una dieta Cho con bajo contenido de grasa, normal (dieta normal baja en grasa (LFD) 10% Kcal % grasa [sic]). Los grupos de tratamiento se muestran a continuación: * Tratamiento LFD salina (21 ratones) ¨ Tratamiento LFD ASO testigo (21 ratones) • Tratamiento HFD salina (21 ratones) * Tratamiento HFD ASO testigo (21 ratones) • Tratamiento HFD ASO para HSP90p (21 ratones) Cada uno de los grupos de 21 ratones se dividen en 3 cohortes de animales con 7 ratones cada uno. Los ratones son tratados y evaluados durante 4 semanas, 6 semanas y 8 semanas. Hay 2 semanas de retardo para los últimos cohortes, es decir, la Cohorte 2 inicia los tratamientos con ASO y HFD 2 semanas despues del inicio del tratamiento de la Cohorte 1. De esta manera, el tratamiento de la Cohorte 2 puede ser modificado a 4 semanas de tratamiento en lugar de 6 semanas de tratamiento luego de la observación de los resultados estimulantes en la Cohorte 1. Si la Cohorte 1 no muestra los resultados esperados, la Cohorte 2 se somete a tratamiento de 6 semanas. Además, para cada cohorte (4 semanas, 6 semanas y 8 semanas), luego de la demostración de la eficacia en los estudios de GTT e ITT, los tratamientos se extienden 1 semana para acomodar un PTT (4 semanas se convierten en 5 semanas, 6 semanas se convierten en 7 semanas, 8 semanas se convierten en 9 semanas).
El peso corporal y la glucosa en sangre con alimentos se vigilan dos veces a la semana antes de las inyecciones IP semanales desde el comienzo del tratamiento.
Para la Cohorte 1 (tratamiento ASO de 4 semanas), se hicieron los GTT e ITT en el día 17 y el día 24 después del inicio del tratamiento con ASO. Si se observan resultados positivos de GTT e ITT, el PTT se lleva a cabo en el día 31. Después de 4 semanas (o 5 semanas) de tratamiento con ASO y testigo, los ratones de la Cohorte 1 se sacrifican, y se recolectan muestras de tejidos y sangre para otro análisis.
Para la Cohorte 2 (tratamiento con ASO durante 6 semanas), se hacen el GTT e ITT en el día 31 y el día 38 después del inicio del tratamiento con ASO. Si se observan resultados positivos de GTT e ITT, el PTT se realiza en el día 45. Los ratones de la Cohorte 2 se sacrifican y se recolectan muestras de tejido y sangre para otro análisis después de la sexta semana o séptima semana de tratamiento.
Para la Cohorte 3 (tratamiento con ASO de 8 semanas), es hace GTT y ITT en el día 45 y el día 52 después del inicio del tratamiento con ASO. Si se observan resultados positivos de GTT e ITT, el PTT se lleva a cabo en el día 59. Los ratones de la Cohorte 3 se sacrifican y se recolectan muestras de tejido y sangre para otro análisis después de la octava o novena semana de tratamiento.
Los tejidos recolectados se analizan mediante qPCR, análisis Western Blot y/o IHC para determinar la expresión genica y el silenciamiento de la diana. También se puede analizar la expresión de otros genes y proteínas en las vías de señalización de la insulina. La sangre recolectada en cada punto temporal se procesa en plasma y se somete a diferentes análisis bioquímicos como pueden ser: TG, FFA, colesterol total, insulina, amiloi.de en suero A (SAA), adiponectina, TNFa, y PAI-1.
Una cohorte adicional de 10 animales se trató con los siguientes regímenes: • Tratamiento HFD ASO testigo (5 ratones) * Tratamiento HFD ASO para H3R90b (5 ratones) Los ratones se someten a vigilancia en jaulas metabólicas utilizando el Sistema de Vigilancia Extensa de los Animales de Laboratorio (CLAMS) para evaluar la ingesta de alimentos, ingesta de agua, actividad voluntaria y respiración midiendo V02, VCO2, RQ (cociente respiratorio) y la producción de calor, desde el 54 hasta el Día 57. Se determina la composición corporal la misma semana por absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA) el día 51. Esta cohorte es inyectada dos veces por semana con diferentes ASO durante 8 semanas.
Materiales y métodos.
Animales Los .ratones del mismo sexo (macho), edad y antecedente genético se utilizan para todas las comparaciones. Ratones C57BL/6J macho (de 7 semanas de nacidos) se obtienen de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se alojan al principio con 4-5 por jaula a 22°C en un ciclo de día-noche 12:12 h. Los ratones son aclimatados en la instalación local para animales durante una semana antes del tratamiento con los compuestos.
Comenzando a las 8 semanas de edad, los ratones son alimentados con una dieta con alto contenido de grasa (Research Diets Cat#: D 12492; 60 kcal% de grasa, 20 kcal% de proteína, y 20 kcai% de carbohidratos) o con una dieta normal con bajo contenido de grasa (10% kcal% grasa), dependiendo de la etapa del estudio (Partes I o II). Los ratones son inyectados con ASO o salina dos veces por semana. Antes de cada inyección se mide el peso corporal, nivel de glucosa y el nivel de insulina en plasma.
Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) Las pruebas de tolerancia a la glucosa (GTT) se realizan después de 6 h de ayuno. Se determinan los niveles de glucosa en sangre en ayuno inicial, seguido por intraperitoneal (ip) de inyección de solución de dextrosa al 20% a una dosis de 2.0 g/kg de peso corporal (2 g/kg de peso corporal). Los niveles de glucosa en sangre se miden de la vena de la cola a los 15, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 minutos después de .la inyección de glucosa utilizando un monitor de glucosa disponible en el mercado, por ejemplo, el glucómetro Accu-Chek © Advantage (Roche Diagnostics®, Indianapolis, IN). El área bajo la curva (AUC) durante las GTT se calcula utilizando un programa de software disponible en el comercio, por ejemplo, el software GraphPad Prism. Los experimentos de las GTT para los diferentes grupos se ejecutan en paralelo. En cada punto temporal de las mediciones de glucosa en la vena de la cola, 40 yL de sangre de la vena de la cola se recolecta y se prepara el plasma para los ensayos posteriores del nivel de insulina utilizando ELISA/RIA en los puntos temporales a los 0, 15, y 30 min después de las inyecciones de glucosa.
Prueba de tolerancia a la insulina intraperitoneal (IPITT) La prueba de tolerancia a la insulina (ITT) se realiza después de un ayuno de 1 hora. Se determinan los niveles iniciales de glucosa en sangre, seguido de la inyección (ip) de la insulina humana (1-2 U/kg; Humulin R; Eli Lilly, Indianapolis, IN). Los niveles de glucosa en sangre se miden de la vena de la cola como se describió anteriormente a los 15, 30, 60, 90, y 120 minutos después de la inyección de insulina. La cantidad para la inyección de insulina se determina por métodos empíricos por 1a respuesta a la insulina debida al inicio de la resistencia hepática a la insulina en los ratones sometidos a la dieta con alto contenido de grasa.
Prueba de tolerancia al piruvato intraperitoneal (IPPTT) La prueba de desafio de piruvato se administra después de 6 h de ayuno. Se determinan los niveles iniciales de glucosa en sangre, seguido por la inyección (ip) de piruvato disuelta en salina (2 g/kg; Sigma, St. Louis, MO). Los niveles de glucosa en sangre se miden a partir de la vena de la cola como se describió anteriormente a los 1.5, 30, 60, 90, y 120 min después de la inyección piruvato. Se calcula el área bajo la curva (AUC) durante la prueba.
Absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA) La composición de la masa corporal de los diferentes grupos de tratamiento se determina por barrido por absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA) usando un densitómetro para ratones LUNAR PLXImus© siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Se documentan y analizan la masa corporal magra, la masa corporal grasa, el peso total de los tejidos del cuerpo, la densidad ósea y el contenido óseo mineral.
Sistema extenso de vigilancia de los animales de laboratorio (CLAMS) Se utilizan jaulas para vigilancia metabólica CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH, EE.UU.) para vigilar simultáneamente la actividad horizontal y vertical, la alimentación y bebida, el consumo de oxigeno y la producción de CO2. Ratones inyectados con ASO y testigo se colocan individualmente en jaulas CLAMS y se vigilan durante un período de 4 días después de la aclimatación a las jaulas durante 1-2 dias. Se registran los distintos parámetros en condiciones de ayuno y con alimentos. Se mide el consumo de alimentos y agua directamente como datos acumulados. Los archivos por hora presentan todas las mediciones de cada parámetro: volumen de oxígeno consumido, mL/kg por hora (V02), volumen de dióxido de carbono producido, mL/kg por hora (VCO2), relación del intercambio respiratorio, calor (kcal/h), alimentación acumulada (g), bebida acumulada (g), actividad total XY (todos las interrupciones del haz horizontal en cuentas), la actividad ambulatoria XY (mínimo tres diferentes, interrupciones consecutivas del haz horizontal en cuentas), y la actividad Z (todas las interrupciones del haz vertical en cuentas). Los datos se registran durante el período de muestreo de 30 s. Los datos CLAMS se analizan normalizándolos con la masa corporal magra.
Recolección de los tejidos Al final de cada protocolo, los ratones se sacrificaron en la semana siguiente, y los tejidos se recolectan y se pesan antes de la conservación por congelación instantánea antes de su almacenamiento a -80°C o fijarlos en formalina para la incrustación en parafina utilizando métodos normalizados. Se recolecta la sangre por punción cardíaca y se prepara el plasma.
Se recolectan las siguientes muestras y tejidos: • Hígado (congelación instantánea, fijación para incrustación en parafina) • Los músculos esqueléticos (congelación instantánea), incluidos músculos de las extremidades posteriores y dorsales almacenados en diferentes viales. • tejidos adiposos (en congelación instantánea y fijados para incrustación en parafina), incluso los tejidos adiposos blancos (perigonadales e inguinales) y tejido adiposo café almacenado en diferentes viales.
• Páncreas (congelación instantánea) · Riñón (congelación instantánea) Equivalentes Los expertos en la téenica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades y métodos específicos descritos en la presente. Tales equivalentes se pretende que estén abarcadas por el alcance de las siguientes reivindicaciones.
Incorporación por referencia Cada referencia, patente, solicitud de patente, y el número de GenBank a los que se hace referencia en la presente solicitud se incorporan por este medio para referencia como si cada referencia fuera señalada como incorporada individualmente.

Claims (51)

REIVINDICACIONES
1. Un método de tratamiento de un síndrome metabólico en un individuo, que comprende administrar al individuo un modulador de HSP90, tratando de este modo el síndrome metabólico en el individuo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el modulador de HSP90 es un inhibidor de HSP90.
3. El método de la reivindicación 2, en donde el inhibidor de HSP90 es un inhibidor de H3R90b.
4. El método de la reivindicación 2, en donde el inhibidor de la HSP90 es un inhibidor específico de HSP90p.
5. El método de la rei indicación 2 o 3, en donde el inhibidor de la HSP90 es un inhibidor de HSP90a.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende diabetes tipo 2.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende diabetes tipo 1.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende resistencia a la insulina.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende la insuficiencia de insulina.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende la obesidad.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende hiperinsulinemia.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el síndrome metabólico comprende intolerancia a la glucosa (IGT).
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde un individuo con síndrome metabólico presenta tres o más de los siguientes signos: a) presión sanguínea igual o superior a 130/85 mmHg; b) glucosa en sangre en ayuno igual o superior a 100 mg/dL; c) ampliación de la circunferencia de la cintura en donde la ampliación de la circunferencia de cintura es 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d) colesterol HDL bajo en donde colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL en varones y por debajo de 50 mg/dL para mujeres; y e) triglicéridos igual o mayor de 150 mg/dL.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde el inhibidor de la HSP90 comprende un inhibidor de ácido nucleico.
15. El método de la reivindicación 14, en donde el inhibidor de ácido nucleico comprende una molécula de ácido nucleico antisentido.
16. El método de la reivindicación 14, en donde el inhibidor de ácido nucleico comprende una molécula de ácido nucleico de doble hebra.
17. El método de la reivindicación 16, en donde el inhibidor de ácido nucleico comprende un ARN bicatenario seleccionado del grupo que consiste en un siARN, un shARN, y un siARN sustrato de dicer (DsiARN) .
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde el inhibidor de la HSP90 comprende un anticuerpo.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde el inhibidor de la HSP90 comprende una molécula pequeña.
20. El método de la reivindicación 19, en donde la molécula pequeña se selecciona del grupo que consiste de lonidamina o un análogo de éste, celastrol o análogo de éste, Gedunin o un análogo de éste, y coumermicina o un análogo de éste.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la normalización de un nivel de glucosa en sangre en un individuo.
22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la normalización de un nivel HblAc en un individuo.
23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la prevención de al menos una complicación de la diabetes asociada con la mala circulación.
24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejoría de al menos un signo o síntoma de diabetes tipo 2.
25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejoría de al menos un signo o síntoma de la diabetes de tipo 1.
26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejoría de al menos un signo o síntoma de la resistencia a la insulina .
27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejoría de al menos un signo o síntoma de insuficiencia de insulina.
28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejoría de al menos un signo o síntoma de la hiperinsulinemia.
29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejoría de al menos un signo o síntoma de 1¿^ tolerancia alterada a la glucosa (IGT).
30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejoría de al menos un signo o síntoma de la obesidad.
31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejoría de al menos uno de lo siguiente: a) presión sanguínea igual o superior a 130/85 mmHg; b) glucosa en sangre en ayuno igual o superior a 100 mg/dL; c) ampliación de la circunferencia de la cintura en donde la ampliación de la circunferencia de cintura es 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d) colesterol HDL bajo en donde colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL en varones y por debajo de 50 mg/dL para mujeres; y e) triglicéridos igual o mayor de 150 mg/dL.
32. El método de la reivindicación 31, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejora de la presión arterial elevada igual o mayor que 130/85 m Hg.
33. El método de la reivindicación 31, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejoría de niveles elevados de glucosa en sangre en ayuno igual o superior a 100 mg/dL.
34. El método de la reivindicación 31, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejora de la ampliación de la circunferencia de la cintura en donde una ampliación de la circunferencia de la cintura es de 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres.
35. El método de la reivindicación 31, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la mejora de colesterol HDL bajo, aumentando el colesterol HDL en donde el colesterol LDH bajo es por debajo de a 40 mg/dL en los varones y menos de 50 mg/dL para mujeres.
36. El método de la reivindicación 31, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejora de niveles elevados de triglicéridos .igual o superior a 150 mg/dL.
37. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende mejora de hígada graso.
38. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el tratamiento del síndrome metabólico comprende la modulación de la depositación de grasa.
39. Un método de diagnóstico de un síndrome metabólico en un individuo que comprende: a) determinar un nivel de expresión o actividad de HSP90P en una muestra del individuo; y b) comparar el nivel de la expresión o actividad de HSP90P en la muestra del individuo con una muestra testigo, en donde la expresión o actividad aumentadas de HSP90P en la muestra del individuo en comparación con la muestra testigo es indicativo de un trastorno metabólico en el individuo.
40. Un procedimiento de onitórización de un síndrome metabólico en un individuo que comprende: a) obtener una muestra del individuo en un primer punto de tiempo y en un segundo punto de tiempo; b) determinar un nivel de expresión o actividad HSP90 en el primer punto de tiempo y el segundo punto de tiempo; y c) comparar el nivel de la expresión o actividad H3R90b en el primer punto de tiempo con el nivel de expresión o actividad de H3R90b en el segundo punto de tiempo, en donde un cambio en el nivel de la expresión o actividad de HXR90b en el segundo punto de tiempo con respecto al primer punto de tiempo es indicativo de un cambio en el síndrome metabólico en el individuo.
41. El método de la reivindicación 39 o 40, en donde el nivel de expresión de HXROOb comprende el nivel de expresión de la proteína HSP90p o el gen HSP90AB1.
42. El método de la reivindicación 40, en donde un aumento en la expresión o actividad de H3R90b es indicativo de empeoramiento del síndrome metabólico.
43. El método de la reivindicación 40, en donde una disminución en la expresión o actividad de HSP90P es indicativo de una mejora en el síndrome metabólico .
44. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende diabetes tipo 2.
45. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende diabetes tipo 1.
46. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende escriba resistenci; a la insulina.
47. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende la insuficiencia de insulina.
48. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende la obesidad.
49. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende hiperinsulinemia.
50. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, en donde el síndrome metabólico comprende intolerancia a la glucosa (IGT).
51. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 39 a 50, en donde el individuo con el síndrome metabólico presenta además uno o más de los siguientes signos: a) presión sanguínea igual o superior a 130/85 m Hg; b) glucosa en sangre en ayuno igual o mayor a 100 mg/dL; c) ampliación de la circunferencia de la cintura en donde la ampliación de la circunferencia de cintura es 40 pulgadas o más para varones y 35 pulgadas o más para mujeres; d) colesterol HDL bajo en donde colesterol HDL bajo es por debajo de 40 mg/dL en varones y por debajo de 50 mg/dL para mujeres; y e) triglicéridos igual o mayor de 150 mg/dL.
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