JP5582783B2 - 細胞保護剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
Heat shock proteins as emerging therapeutic targets, Br. J. Pharmacol., 2005; 146: p. 769-780 分子シャペロンによる細胞機能制御、132頁、2001年 Inhibitors of the HSP90 molecular chaperon: current status, Adv Cancer Res., 2006; 95:p. 323-348
[1](1)被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、(2)被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および(3)被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、細胞保護剤のスクリーニング方法;
[1a](1)被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、(2)被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および(3)被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング方法;
[1b]被験物質に対して以下の工程(1)〜(4)を実施する、細胞保護剤のスクリーニング方法:(1)被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、(2)被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、(3)被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程、および(4)Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程;
[2]工程(1)が、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[2a]工程(1)が、(i)被験物質非存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量を測定し、比較する工程を含むものである、上記[2]記載のスクリーニング方法;
[2b]被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下で得られた固相化イミダゾチアジン誘導体へのHsp90の結合量が少ない場合に、該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有すると判断する、上記[2a]に記載のスクリーニング方法;
[2c]工程(1)が、(i)被験物質非存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量とを測定し、比較する工程を含むものである、上記[2]記載のスクリーニング方法;
[2d]被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下で得られた固相化Hsp90へのラベル化イミダゾチアジンの結合量が少ない場合に、該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有すると判断する、上記[2c]に記載のスクリーニング方法;
[3]工程(2)が、被験物質のHsp90/HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程を含むものである、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[3a]被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下での分離したHSF-1の蛋白質量が多い場合に、該被験物質はHsp90/HSF-1複合体に対する分離活性(すなわち、ヒートショック蛋白質発現誘導活性)を有すると判断する、上記[3]記載のスクリーニング方法;
[4]工程(3)が、Hsp90とクライアント蛋白質との結合に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[5]工程(2)がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程である、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[5a]工程(3)がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[5b]工程(2)がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程であり、かつ工程(3)がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[5c]ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞がヒト正常間接軟骨細胞であり、ヒートショック蛋白質がHsp70であり、該細胞を被験物質およびIL−1βとともに培養したときにHsp70の蛋白質量を増加させる被験物質を、ヒートショック蛋白質発現誘導活性を有する被験物質であると判断する、上記[5]または[5b]記載のスクリーニング方法;
[6]工程(2)のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される1種以上である、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[7]工程(3)のHsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Akt及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、上記[1]記載のスクリーニング方法。
[8]工程(3)が、(i)被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、上記[1]または[2]記載のスクリーニング方法;
[8a]工程(3)が、Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定することを含み、(i)被験物質非存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、上記[1]または[2]載のスクリーニング方法。
[8b]被験物質非存在下および被験物質存在下で測定される蛋白質量の間に実質的な差異がない場合、該被験物質はクライアント蛋白質の分解誘導活性を有さないと判断する、上記[8]記載のスクリーニング方法;
[9]Hsp90クライアント蛋白質量が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により測定される、上記[8]記載のスクリーニング方法;
[10]細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患または皮膚疾患の予防・治療剤である、上記[1]記載のスクリーニング方法;
[10a]細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、皮膚疾患または代謝性疾患の予防・治療剤である、上記[1]記載のスクリーニング方法;[11]さらに工程(4)として、(4)Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程、を含む上記[1]記載のスクリーニング方法。
[12](1)Hsp90、(2)ヒートショック蛋白質の定量用試薬、(3)イミダゾチアジン誘導体、および(4)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット;
[12a](1)Hsp90、(2)ヒートショック蛋白質発現誘導活性の測定用試薬、(3)イミダゾチアジン誘導体、および(4)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
[12b](1)Hsp90、(2)ヒートショック蛋白質の定量用試薬、(3)イミダゾチアジン誘導体、および(4)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キット;
[13](1)Hsp90/HSF-1複合体、(2)Hsp90、(3)Hsp90の定量用試薬、(4)イミダゾチアジン誘導体、および(5)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット;[13a](1)Hsp90/HSF-1複合体、(2)Hsp90、(3)Hsp90の定量用試薬、(4)イミダゾチアジン誘導体、および(5)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キット;
[14]Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を含む、上記[11]または[12]記載のスクリーニング用キット;
[15]Hsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Akt及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、上記[11]または[12]記載のスクリーニング用キット;
[16](2)のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される1種以上である、上記[11]記載のスクリーニング用キット;
[17]上記[1]記載の方法、または[11]若しくは[12]のいずれかに記載のキットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質;
[18]上記[17]記載の物質を含有してなる細胞保護剤;
[19]上記[17]記載の物質を含有してなる医薬;および
[20]心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患または皮膚疾患の予防・治療剤である上記[19]記載の医薬;
に関する。
本発明は、(1)被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、(2)被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および(3)被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程、を含む細胞保護剤のスクリーニング方法を提供する。被験物質に対して上記の工程(1)〜(3)を実施することにより、優れた細胞保護剤を選抜することができる。
R10とR11が一緒になって形成してもよい含窒素複素環とは、すなわち、式
本発明は、上記スクリーニング方法のために好適に用いることができるスクリーニング用キット、特に、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キットを提供する。
本発明は、上記のスクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない物質を提供する。該物質とは、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、抗体、核酸、ワクチン、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などである。該物質は、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物または合成化合物の塩であってもよい。該物質は、そのままで細胞保護剤あるいは医薬として使用することができる。また、該物質と他の成分との混合物を、細胞保護剤あるいは医薬として使用することができる。
本発明は、上記スクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質を含有してなる細胞保護剤、および該細胞保護剤を含有してなる医薬を提供する。
1.被験物質の調製
以下(i)〜(v)の反応を行い、被験物質としてイミダゾチアジン誘導体(化合物名:N-[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-8-[(4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル)スルファニル]-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド 、以下「化合物A」という)を合成した。
2-アミノ-3,3-ジクロロアクリロニトリル(31.9 g, 0.233 mol、純正化学社製)をジエチルエーテル(300 ml、以下エーテルと略すことがある。)に溶解し、室温で撹拌しながらp-トルエンスルホニルイソシアネート(36.0 ml, 0.233 mol、純度98%、東京化成社製)を滴下後、室温で14時間撹拌した。生成した沈澱物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥して標題化合物の淡黄色の粉末を得た。
1H NMR (CDCl3-DMSO-d6=9:1):δ 2.44 (3H, s), 7.34 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.90 (2H, d, J= 8.2 Hz), 8.19 (1H, brs), 10.2 (1H, br).
元素分析値:C11H9N3O3SCl2として
計算値(%): C, 39.54; H, 2.71; N, 12.57; S, 9.60; Cl, 21.22.
実測値(%): C, 39.62; H, 2.48; N, 12.66; S, 9.63; Cl, 21.00.
1H NMR (DMSO-d6): δ 1.18 (3H, t, J= 7.1 Hz), 2.33 (3H, s), 2.63 (2H, t, J= 7.1 Hz), 3.30 (1H, s), 3.32 (2H, t, J= 7.1 Hz), 4.07 (2H, q, J= 7.1 Hz), 7.28 (2H, d, J= 8.1 Hz), 7.74 (2H, d, J= 8.1 Hz), 8.75 (1H, brd, J= 2 Hz), 9.61 (1H, brs).
元素分析値: C21H27N3O7S3として
計算値(%): C, 47.62; H, 5.14; N, 7.93; S, 18.16.
実測値(%): C, 47.51; H, 4.84; N, 8.19; S, 18.12.
上記(ii)で合成した3-[[(5Z)-5-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-2-オキソイミダゾリジン-4-イリデン](スルファニル)メチルスルファニル]プロパン酸エチル(40 g, 純度約50%、約43 mmol)をTHF(600 ml)に溶解し、3-クロロ-2-ブタノン(9.1 ml, 86 mmol)およびトリエチルアミン(35.8 ml, 0.258 mol)を加えて室温で1.5時間撹拌後、8時間加熱還流した。反応液を濃縮後、残渣を酢酸エチル(600 ml)で希釈し、2%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、0.1N塩酸、水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮乾固して標題化合物を含む褐色油状物を得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.27 (3H, t, J= 7.2 Hz), 1.79 (3H, brq, J= 0.8 Hz), 2.26 (3H, brq, J= 0.8 Hz), 2.42 (3H, s), 2.70 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.20 (2H, t, J= 7.5 Hz), 4.17 (2H, q, J= 7.2 Hz), 7.29 (2H, d, J= 8.3 Hz), 7.84 (2H, d, J= 8.3 Hz), 9.61 (1H, br).
元素分析値:C20H23N3O5S3 として
計算値(%): C, 49.88; H, 4.81; N, 8.72; S, 19.97.
実測値(%): C, 49.78; H, 5.03; N, 8.68; S, 20.00.
上記(iii)で合成した3-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]プロパン酸エチル(5.00 g, 10.4 mmol)をTHF(50 ml)およびメタノール(50 ml)に溶解し、水酸化カリウム(2.74 g, 41.5 mmol)を加えて室温で45分間撹拌した。反応液に1N塩酸(42 ml)を加えて混和し、室温で30分間撹拌した。生成した沈澱物を濾取し、50%メタノール水で洗浄後、乾燥して標題化合物の赤色粉末を得た。
1H NMR (CDCl3-DMSO-d6=9:1): δ 1.81 (3H, s), 2.42 (3H, d, J= 0.5 Hz), 2.45 (3H, s), 7.35 (2H, d, J= 8.1 Hz), 7.88 (2H, d, J= 8.3 Hz), 12.82 (2H, br).
元素分析値:C15H15N3O3S3 として
計算値(%): C, 47.22; H, 3.96; N, 11.01; S, 25.22.
実測値(%): C, 47.20; H, 3.90; N, 10.73; S, 25.19.
反応試薬として、メタンスルホン酸 4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチルエステルを合成した。まず、4,4,5,5,5-ペンタフルオロ-1-ペンタノール(1.00 g, 5.61 mmol)のテトラヒドロフラン(20.0 ml)溶液に、メタンスルホニル クロリド(0.652 ml, 8.42 mmol)とトリエチルアミン(1.57 ml, 11.2 mmol)を氷冷下順次加えた。反応混合物を室温で3時間かき混ぜた後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を油状物として得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3031, 2946, 912, 743 cm-1.
1H-NMR (CDCl3):δ 1.98-2.35 (4H, m), 3.05 (3H, s), 4.32 (2H, t, J=5.6 Hz).
上記(iv)で得られたN-[(1Z)-8-メルカプト-5,6-ジメチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド(29.8 g, 78.1 mmol)と炭酸カリウム(16.2 g, 0.117 mol)のN,N-ジメチルホルムアミド(400 ml)の懸濁液に、上記(v-1)で得られたメタンスルホン酸 4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル エステル(24.0 g, 93.7 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(100 ml)溶液を加えた。反応混合物を80℃で2時間加熱した後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去して化合物Aを暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点190-192℃の暗赤色結晶として化合物Aを得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3208, 2934, 1753, 1663, 1624, 1566, 1497 cm-1.
1H-NMR (CDCl3):δ 1.79 (3H, d, J=1.0 Hz), 1.90-2.22 (4H, m), 2.27 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.42 (3H, s), 3.01 (2H, t, J=6.8 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.62 (1H, bs).
元素分析値: C20H20N3O3S3F5として
計算値(%): C, 44.35; H, 3.72; N, 7.76; S, 17.76.
実測値(%): C, 44.32; H, 3.69; N, 7.44; S, 17.67.
対照化合物として、既知のHsp90阻害薬であるゲルダナマイシン(([18S- (4E,5Z,8R*,9R*,10E,12R*,13S*,14R*,16S*)]-9-[(aminocarbonyl)oxy]-13-hydroxy- 8,14,19-trimetoxy-4,10,12,16-tetramethyl-2-azabicyclo[16.3.1.]docosa- 4,6,10,18,21- pentan- 3,20,22trion)を使用した。ゲルダナマイシン(以下「GA」という)は、Sigma社製「商品名:Geldanamycin from Streptomyces hygroscopicus」を使用した。
実施例1において使用するため、固相化イミダゾチアジン誘導体を調製した。
以下(i)〜(iv)の反応を行い、末端にカルボキシル基を導入したイミダゾチアジン誘導体(化合物名:5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸、以下「化合物B」という)を合成した。
参考例1の(iv)で得られたN-[(1Z)-8-メルカプト-5,6-ジメチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド(500 mg, 1.31 mmol)と炭酸カリウム(272 mg, 1.97 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(5.00 ml)の懸濁液に、5-ブロモ吉草酸 エチルエステル(0.259ml, 1.57 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド(5.00 ml)溶液を加えた。反応混合物を80℃で30分間加熱した後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を合成した。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点162-164℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3221, 2980, 2936, 1732, 1663, 1564 cm-1.1H-NMR (CDCl3):δ 1.27 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.67-1.82 (4H, m), 1.79 (3H, d, J=1.0 Hz), 2.26 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28-2.38 (2H, m), 2.42 (3H, s), 2.88-2.98 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=7.2 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.85 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.61 (1H, bs).
元素分析値: C22H27N3O5S3として
計算値(%): C, 51.85; H, 5.34; N, 8.24; S, 18.87.
実測値(%): C, 51.68; H, 5.29; N, 8.16; S, 18.42.
上記(i)で得られた5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチル(1.34 g, 2.63 mmol)とギ酸アンモニウム(1.75 g, 26.3 mmol)のエタノール(26.0 ml)の懸濁液を80℃で17時間加熱した後、水を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル(10:1, v/v)で溶出して題記化合物を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点92.0-94.0℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3405, 3283, 3115, 2978, 2936, 1723, 1634, 1665, 1537 cm-1.
1H-NMR (CDCl3):δ 1.26 (3H, d, J=6.9 Hz), 1.70-1.84 (4H, m), 1.74 (3H, s), 2.26 (3H, s), 2.32-2.40 (2H, m), 2.88-2.98 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=6.9 Hz), 7.51 (2H, bs).
元素分析値: C15H21N3O3S2として
計算値(%): C, 49.92; H, 5.87; N, 11.64; S, 17.77.
実測値(%): C, 49.94; H, 5.79; N, 11.41; S, 17.72.
水素化ナトリウム(230 mg, 5.74 mmol)(60%油性)のテトラヒドロフラン(10.0 ml)の懸濁液に、上記(ii)で得られた5-[(1-アミノ-5,6-ジメチル-3-オキソ-3H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル)チオ]ペンタン酸エチル(1.02 g, 2.87 mmol)のテトラヒドロフラン(5.00 ml)溶液を加え、氷冷下5分間かき混ぜた。これに4-(トリフルオロメチル)ベンゼンスルホニル クロリド(1.40 g, 5.74 mmol)のテトラヒドロフラン(5.00 ml)溶液を加え、さらに室温で1時間かき混ぜた。反応混合物に1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点146-148℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3235, 2984, 2936, 1759, 1738, 1663, 1620, 1559 cm-1.
1H-NMR (CDCl3):δ 1.26 (3H, d, J=7.2 Hz), 1.70-1.78 (4H, m), 1.80 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28 (3H, d, J=0.9 Hz), 2.31-2.38 (2H, m), 2.94-3.00 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=7.2 Hz), 7.77 (2H, d, J=8.7 Hz), 8.11 (2H, d, J=9.0 Hz), 9.61 (1H, bs).
元素分析値: C22H24N3O5S3F3として
計算値(%): C, 46.88; H, 4.29; N, 7.46; S, 17.07.
実測値(%): C, 46.86; H, 4.17; N, 7.62; S, 17.16.
上記(iii)で得られた5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチル(1.05 g, 1.86 mmol)のエタノール(10.0 ml)及びテトラヒドロフラン(10.0 ml)溶液に、1N水酸化ナトリウム水溶液(5.59 ml)を加えた。反応混合物を室温で1時間かき混ぜた後、溶媒を減圧下に留去した。残渣に1N塩酸を加えて、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥(MgSO4)後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物(747 mg, 75%)を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点191-193℃の暗赤色結晶として化合物Bを得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν: 3700-2400, 3125, 2928, 1725, 1663, 1599, 1557 cm-1.
1H-NMR (CDCl3):δ 1.70-1.83 (4H, m), 1.80 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.37-2.45 (2H, m), 2.94-3.02 (2H, m), 7.77 (2H, d, J=8.1 Hz), 8.11 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.69 (1H, bs).
元素分析値: C20H20N3O5S3F3として
計算値(%): C, 44.85; H, 3.76; N, 7.85; S, 17.96.
実測値(%): C, 44.39; H, 4.04; N, 7.83; S, 17.66.
イミダゾチアジン誘導体(化合物B)の固相化を以下の方法により行った。まず、化合物Bを100 mMとなるように85%のN,N-dimethylformamide (DMF)に溶解した。次いで2 mlの上記溶解液に、20 mgの1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochroride (EDC)と1 mlのAF-アミノトーヨーパール650(東ソー社製)を添加し、pHを5.0に調整した後、室温で一日攪拌して化合物B のカルボキシル基とAF-アミノトーヨーパール650のアミノ基を反応させた。反応終了後、AF-アミノトーヨーパール650担体を85% DMFで洗浄し、これに570 μlの0.2 M sodium acetateと285 μlのglacial acetic acidを添加して0℃に30分間保持した後、285μlのglacial acetic acidを添加して25℃でさらに30分間保持した。この担体を水と0.1 N NaClで繰り返し洗浄した後、Binding Bufferで平衡化したものを、固相化イミダゾチアジン誘導体(以下「固相化化合物B」という)として、実施例において使用した。
Hsp90として、大腸菌を用いてN末端にヒスチジンタグを付加した精製ヒトHsp90α蛋白質(His-hHsp90α) を使用した。His-hHsp90αは以下のようにして調製した。
固相化イミダゾチアジン誘導体として、参考例2で調製した固相化化合物Bを使用した。まず、10μgの His-hHsp90αと種々の濃度の被験物質を、0.2 mlの0.5% DMFを含有するBinding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 % glycerol, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1 mM DTT)中で30分間反応させた。次に、10μlの固相化化合物Bを添加し、攪拌しながら室温で40分間保持して、His-hHsp90αを固相化化合物Bに結合させた。反応終了後、0.2 mlのBinding Bufferで固相化化合物Bを5回洗浄して、固相化化合物Bに結合していないHis-hHsp90αを洗浄除去した。次いで固相化化合物Bをサンプル用緩衝液(Tris-SDS-ME Sample Buffer;第一化学薬品製)と等量ずつ混合して、95℃で5分間熱処理することで固相化化合物Bに結合したHis-hHsp90αを溶出した後、マルチゲル(第一化学薬品社製)を用いて、SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルを銀染色して固相化化合物Bに結合したHis-hHsp90αを検出した。
被験物質である化合物Aは、His-hHsp90α蛋白質と固相化化合物Bの結合量を用量依存的に減少させた。一方、対照化合物GAは、50μM以下の濃度では影響を及ぼさなかった(図1)。従って、化合物Aは、固相化化合物Bと同じ部位でHis-hHsp90αに強く結合すると考えられるが、当該結合部位へのGAの親和性は低いと考えられる。
Hsp90として、大腸菌を用いて、N末端にヒスチジンタグを付加した精製ヒトHsp90α蛋白質(His2-hHsp90α)を使用した。His2-hHsp90αは、以下のようにして調製した。まず、pET28b-hHsp90αよりBamHI切断部位とBpu1102I切断部位を利用してhHsp90α遺伝子を切り出し、これをpET15b(Novagen社)のBamHI切断部位とBpu1102I切断部位の間に挿入し、pET15b-hHsp90αを得た。
ラベル化イミダゾチアジン誘導体としてトリチウムラベルした化合物A(以下「[3H]-化合物A」という)を使用した。種々の濃度の被験物質(化合物A)と40 nMのトリチウムラベルした化合物Aを、固相化Hsp90を含む上記プレートに添加し、室温で6時間放置した後、His2-hHsp90α蛋白質に結合した[3H]-化合物Aの放射活性をマイクロプレートシンチレーターカウンター(TopCount NXT; Packard社製)を用いて測定した。
被験物質である化合物Aは、[3H]-化合物AとHis2-hHsp90α蛋白質との結合量を用量依存的に減少させたが、GAは100μM以下の濃度では30%以下の弱い阻害活性しか示さなかった (図2)。従って、Hsp90の化合物A結合部位に対するGAの親和性は低いと考えられる。
ヒト正常関節軟骨細胞(Clonetics社製)を関節軟骨細胞用増殖培地(CGM、Clonetics社製)中で単層培養により増殖させた後に、2.2x104個/mlとなるようにダルベッコ改変イーグル培地/ハムF12培地 1:1混合培地に懸濁し、12穴プレート(旭テクノグラス社製)に3 ml/wellずつ播種して、5%CO2、37℃で1日培養した。
培地を新しいダルベッコ改変イーグル培地/ハムF12培地 1:1混合培地に交換した後、被験物質と10 ng/mlのIL-1β(Genzyme Techne社製)を加え、これを5% CO2、37℃で2日間培養した。培養終了後、リン酸緩衝液(Phosphate-Buffered Salline、PBS)で1回洗浄し、100μlの細胞溶解用緩衝液〔10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH7.4, 150 mM NaCl,1 mM EDTA・2Na,1 mM EGTA、0.5 mM (p-aminophenyl)methanesulfonyl fluoride hydrochloride,200 μM Sodium β-glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10μg/ml Aprotinin, 10μg/ml Leupeptin,1 % Triton X-100, 0.5% Nonidet P40,0.1% SDS および 1 mM o-Vanadate〕を添加して、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、この細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液は、サンプル用緩衝液(Tris-SDS-ME Sample Buffer;第一化学薬品製)と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後、マルチゲル(第一化学薬品社製)を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
被験物質である化合物A、および対照化合物GAは、ともにIL-1βの刺激存在下でHsp70蛋白質量を明確に増加させた(図3)。両者のHsp70発現誘導活性は、ほぼ同等と考えられる。
ヒト正常関節軟骨細胞(Clonetics社製)をPBSで洗浄後、蛋白質分解酵素阻害剤(Complete; Boeringer Mannheim)を含有するRIPA 緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid)で溶解し、これを16,000 × gで10分間遠心分離した後、その上清をHsp90/HSF-1複合体を含有するライセートとして使用した。
次に2 mg/mlとなるように希釈した上記ライセート0.6 mlに、1μMの化合物A又はバッファーを添加して30分間反応させた。これに、30μgの抗Hsp90抗体(SPA-840; StressGen社製)、又はコントロール抗体(シグマ社製)を添加して30分間反応させた後、50μlのプロテインA/Gアガロース(サンタクルズ社製)を添加して、さらに4℃で3時間攪拌しながら反応させて抗体をプロテインA/Gアガロースに吸着させた。次に遠心分離によってビーズを回収し、RIPA緩衝液で7回洗浄した後、サンプル用緩衝液(Tris-SDS-ME Sample Buffer;第一化学薬品製)と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後に、マルチゲル(第一化学薬品社製)を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
免疫沈降時にコントロール抗体を用いた場合、ライセートからはHsp90蛋白質は回収できず、HSF-1も検出されなかった(図4、lane 1)。一方で、免疫沈降時に抗Hsp90抗体を用いるとライセートよりHsp90が回収され、これに伴ってHSF-1が共沈してきた(図4、lane 2)。以上の結果より、本実験系においてライセートからHsp90/HSF-1複合体を回収できることがわかる。次に、抗Hsp90抗体を用いてHsp90/HSF-1複合体を回収する際に、化合物Aを共存させると、ライセートよりHsp90は回収されるもののHSF-1の共沈が認められなくなった(図4、lane 3)。以上の結果より、化合物AがHsp90/HSF-1複合体を分離させることがわかる。
本工程によりHsp90/HSF-1複合体に対する分離活性を有する被験物質の選抜が可能であることが示された。
ヒト正常関節軟骨細胞を0.5x105個/mlとなるように関節軟骨細胞用増殖培地に懸濁し、6穴プレート(ファルコン社製)に2 ml/wellずつ播種して、5% CO2、37℃で1日培養した。培地をダルベッコ改変イーグル培地/ハムF12培地 1:1混合培地に交換し、これを5% CO2、37℃でさらに1日培養した。
培養液に被験物質を添加して、細胞を5% CO2、37℃でさらに約18時間培養した。培養終了後、リン酸緩衝液(Phosphate-Buffered Salline、PBS)で1回洗浄し、200μlの細胞溶解用緩衝液〔10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH7.4, 150 mM NaCl,1 mM EDTA・2Na,1 mM EGTA、0.5 mM (p-aminophenyl)methanesulfonyl fluoride hydrochloride,200 μM Sodium β-glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10μg/ml Aprotinin, 10μg/ml Leupeptin,1 % Triton X-100, 0.5% Nonidet P40,0.1% SDS および 1 mM o-Vanadate〕を添加して、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、この細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液は、サンプル用緩衝液(Tris-SDS-ME Sample Buffer;第一化学薬品製)と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後、マルチゲル(第一化学薬品社製)を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
被験物質である化合物Aは、10μM以下の濃度では、Glucocorticoid receptor、Akt、Cyclin dependent kinase 4などのHsp90のクライアント蛋白質の細胞内蛋白質量に影響を及ぼさなかった。
以下の方法により、化合物AとGAの細胞保護活性を検証した。
以下の方法により、化合物AとGAの細胞傷害性を検証した。
工程(1)、(2)および(3)を実施することにより、化合物Aが「Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」或いは「Hsp90結合活性及びHsp90/HSF-1複合体分離活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」としての性質を有すること、また、細胞傷害性が低いことが確認された。
Claims (16)
- (1)被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、(2)被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および(3)被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、細胞保護剤のスクリーニング方法。
- 工程(1)が、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(2)が、被験物質のHsp90/HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程を含むものである、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(3)が、Hsp90とクライアント蛋白質との結合に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(2)がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程であり、かつ工程(3)がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(2)のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される1種以上である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(3)のHsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Akt及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 工程(3)が、(i)被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、請求項1または2記載のスクリーニング方法。
- Hsp90クライアント蛋白質量が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により測定される、請求項8記載のスクリーニング方法。
- 細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、または皮膚疾患の予防・治療剤である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- さらに工程(4)として、(4)Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程、を含む請求項1記載のスクリーニング方法。
- (1)Hsp90、(2)ヒートショック蛋白質の定量用試薬、(3)イミダゾチアジン誘導体、および(4)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
- (1)Hsp90/HSF-1複合体、(2)Hsp90、(3)Hsp90の定量用試薬、(4)イミダゾチアジン誘導体、および(5)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
- Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を含む、請求12または13記載のスクリーニング用キット。
- Hsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Akt及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、請求項12または13記載のスクリーニング用キット。
- (2)のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される1種以上である、請求項12記載のスクリーニング用キット。
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JPN6013048145; M. Dolores Lopez-Maderuelo, Margarita Fernandez-Renart, CarmenMoratilla and Jaime Renart, Opposite e * |
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