WO2009084653A1 - 細胞保護剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2009084653A1
WO2009084653A1 PCT/JP2008/073778 JP2008073778W WO2009084653A1 WO 2009084653 A1 WO2009084653 A1 WO 2009084653A1 JP 2008073778 W JP2008073778 W JP 2008073778W WO 2009084653 A1 WO2009084653 A1 WO 2009084653A1
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hsp90
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PCT/JP2008/073778
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Haruhide Kimura
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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Definitions

  • the present invention relates to a screening method and kit for a cytoprotective agent useful in various diseases such as heart disease and neurological disease, and a cytoprotective agent obtained by such a screening method.
  • heat shock proteins When cells undergo stress such as heat shock, a group of proteins called heat shock proteins (heat shock proteins, Hsp) are induced. Hsp plays a role in returning intracellular proteins denatured by various stresses such as heat shock stress and oxidative stress to a normal state.
  • Hsp90 heat shock protein 90
  • client proteins substrate proteins
  • Glucocorticoid receptor Akt
  • cycline dependent kinase 4 a protein that influences the function of Hsp90.
  • Hsp90 forms a complex with a heat shock transcription factor (heat shock factor-1, HSF-1), and negatively regulates the heat shock reaction by keeping HSF-1 in a monomer inactive state.
  • HSF-1 heat shock transcription factor-1
  • HSF-1 heat shock factor-1
  • Hsp90 inhibitors can be expected to be used as cytoprotective agents that exert cytoprotective activity by inducing the expression of heat shock proteins such as Hsp70 (for example, , Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 3).
  • Inhibitors of Hsp90 can induce the expression of heat shock proteins such as Hsp70 that have cytoprotective effects through the activation of HSF-1.
  • Hsp90 inhibitors are heat shock protein-inducing compounds and are considered to be prophylactic / therapeutic agents for the above diseases.
  • Hsp90 inhibitors such as geldanamycin are insufficient as cytoprotective agents because they cause degradation of Hsp90 client protein and have cytotoxicity.
  • Hsp90 binding activity As a screening method for searching for an Hsp90 inhibitor that can be used as a cytoprotective agent, there is a method of measuring the binding property (hereinafter referred to as “Hsp90 binding activity”) between a test substance and Hsp90. However, only by measuring the Hsp90 binding activity, it is not possible to confirm whether or not the test substance causes degradation of the Hsp90 client protein and exhibits cytotoxicity.
  • An object of the present invention is to provide a screening method for a cytoprotective agent, a screening kit, and the like.
  • the present inventors include (1) a step of measuring the binding property between a test substance and Hsp90, (2) a step of measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance, and (3) Hsp90 client proteolysis of the test substance. It has been found that an excellent cytoprotective agent can be obtained by a screening method including a step of measuring induction activity.
  • an excellent cytoprotective agent can be obtained by setting the above step (2) as a step of measuring the separation activity of the test substance against the Hsp90 / HSF-1 complex. .
  • the present invention has been completed based on these findings. That is, the present invention [1] (1) Measuring the binding property of the test substance to Hsp90, (2) Measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance, and (3) Hsp90 client proteolysis inducing activity of the test substance A method for screening a cytoprotective agent, comprising a step of measuring; [1a] (1) Measuring the binding property of the test substance to Hsp90, (2) Measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance, and (3) Hsp90 client proteolysis inducing activity of the test substance A method for screening for a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity and does not exhibit Hsp90 client proteolysis promoting activity, comprising a step of measuring; [1b] A screening method for a cytoprotective agent, wherein the following steps (1) to (4) are performed on the test substance: (1) a step of measuring the binding property between the test substance
  • a screening method which comprises a step of measuring and comparing the amount of binding with [2b]
  • the test substance is a combination of Hsp90 and the imidazothiazine derivative.
  • the screening method according to [2] above which comprises a step of measuring and comparing the binding amount of a thiazine derivative; [2d] When the amount of labeled imidazothiazine bound to the immobilized Hsp90 obtained in the presence of the test substance is smaller than that in the absence of the test substance, the test substance is Hsp90 and an imidazothiazine derivative.
  • Step (3) is to measure and compare (i) the amount of Hsp90 client protein in the cell in the absence of the test substance and (ii) the amount of Hsp90 client protein in the cell in the presence of the test substance.
  • a screening method according to [1] or [2] above comprising: [8a]
  • the step (3) comprises measuring the Hsp90 client protein degradation-inducing activity of the test substance using a cell capable of expressing the Hsp90 client protein, and (i) in the cell in the absence of the test substance
  • the screening method according to [1] or [2] above which comprises measuring and comparing the amount of Hsp90 client protein and (ii) the amount of Hsp90 client protein in the cell in the presence of the test substance.
  • kits for screening a cytoprotective agent comprising (1) Hsp90, (2) a reagent for quantifying heat shock protein, (3) an imidazothiazine derivative, and (4) a reagent for quantifying Hsp90 client protein;
  • cytoprotective agents including (1) Hsp90, (2) a reagent for measuring heat shock protein expression inducing activity, (3) an imidazothiazine derivative, and (4) a reagent for quantifying Hsp90 client protein kit.
  • Hsp90 binding activity and induction of heat shock protein expression including (1) Hsp90, (2) reagent for quantifying heat shock protein, (3) imidazothiazine derivative, and (4) reagent for quantifying Hsp90 client protein
  • a kit for screening for a cytoprotective agent that exhibits activity and does not exhibit Hsp90 client proteolytic activity [13] (1) Hsp90 / HSF-1 complex, (2) Hsp90, (3) Hsp90 quantitative reagent, (4) imidazothiazine derivative, and (5) Hsp90 client protein quantitative reagent, [13a] (1) Hsp90 / HSF-1 complex, (2) Hsp90, (3) reagent for quantitative determination of Hsp90, (4) imidazothiazine derivative, and (5) Hsp90 client
  • a kit for screening for a cytoprotective agent which includes an Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, and does not exhibit an Hsp90 client proteolysis-promoting activity, including a protein quant
  • an excellent cytoprotective agent having properties as an Hsp90 inhibitor and having weak Hsp90 client protein degradation promoting activity and cytotoxicity or not exhibiting cytotoxicity is searched.
  • a screening method is provided.
  • the present invention also provides a screening kit for selecting the cytoprotective agent.
  • a “cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, and Hsp90's client proteolytic degradation activity is weak or does not show this activity” or “Hsp90 binding activity and Hsp90 / HSF” -1 complex-separating activity and a cytoprotective agent that exhibits weak or no Hsp90 client proteolytic activity can be easily obtained.
  • Such a cytoprotective agent does not cause degradation of the Hsp90 client protein, and thus has low cytotoxicity, and thus is useful as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases.
  • 3 is a graph showing the influence of a test substance (compound A) and a control compound (GA) on the binding between [ 3 H] -compound A and His2-hHsp90 ⁇ protein.
  • It is a western blot which shows the Hsp70 expression induction activity of a test substance (compound A) and a control compound (GA) in the presence of IL-1 ⁇ stimulation.
  • the present invention includes (1) a step of measuring the binding property between a test substance and Hsp90, (2) a step of measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance, and (3) an Hsp90 client proteolytic activity of the test substance.
  • step (1) the binding between the test substance and Hsp90 is measured for the purpose of selecting test substances having Hsp90 binding activity.
  • Examples of the step (1) include a step including a step of measuring the inhibitory activity of a test substance on the binding property between Hsp90 and an imidazothiazine derivative.
  • the inhibitory activity of the test substance on the binding between Hsp90 and the imidazothiazine derivative is, for example, (i) the amount of binding between the immobilized imidazothiazine derivative and Hsp90 in the absence of the test substance, and (ii) in the presence of the test substance.
  • the amount of bound imidazothiazine derivative in Hsp90 and the amount of Hsp90 can be measured and compared.
  • the binding amount of the immobilized Hsp90 and the labeled imidazothiazine derivative in the absence of the test substance and (ii) the binding amount of the immobilized Hsp90 and the labeled imidazothiazine derivative in the presence of the test substance. It can also be measured by measuring and comparing.
  • Hsp90 means heat shock protein 90 and is not particularly limited as long as it has a binding property to an imidazothiazine derivative described later.
  • the Hsp90 of the present invention also includes a salt of the Hsp90 protein, a modified Hsp90 protein, an Hsp90 protein partially modified with an amino acid sequence so that it can be bound to a carrier, and a solid-phased Hsp90 protein bound to a carrier.
  • the carrier for binding to the Hsp90 protein include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass. Hsp90 and the carrier can be bound according to a known method.
  • Hsp90 various animals, particularly those derived from humans, can be used.
  • human Hsp90 human Hsp90 ⁇ (GENBANK Accession No. P07900) and human Hsp90 ⁇ (GENBANK Accession No. P08238) are preferable, and human Hsp90 ⁇ having a histidine tag added to the N-terminus (for example, His-hHsp90 ⁇ , His2-hHsp90 ⁇ , etc.) Is preferred.
  • His-hHsp90 ⁇ can be prepared, for example, according to the method described in International Publication No. WO2004 / 069999, pages 57 to 58 [Example 2 (2)].
  • the region encoding Hsp90 ⁇ contained in a human skeletal muscle complementary DNA (cDNA) library is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • the amplified human Hsp90 ⁇ region is inserted into the cloning site of the plasmid vector to construct a His-hHsp90 ⁇ expression vector.
  • the transformant is cultured to induce the expression of His-hHsp90 ⁇ protein.
  • the recovered Escherichia coli cells were suspended in a buffer (20 ⁇ mM Tris-HCl (pH 7.9) / 500 ⁇ mM NaCl / 5 ⁇ mM Imidazole) and subjected to ultrasonic disruption. Centrifuge and collect the supernatant. From this supernatant, a His-hHsp90 ⁇ protein is obtained using a nickel column.
  • the imidazothiazine derivative is not particularly limited as long as it is a compound having an imidazothiazine skeleton and has a binding property to Hsp90.
  • the imidazothiazine derivatives of the present invention also include imidazothiazine derivatives whose ends are modified so that they can be bound to a carrier, solid-phased imidazothiazine derivatives bound to a carrier, and labeled imidazothiazine derivatives.
  • the carrier for binding to the imidazothiazine derivative include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the imidazothiazine derivative and the carrier can be bound according to a known method.
  • the labeling of the imidazothiazine derivative can be performed using, for example, a radioisotope, a fluorescent dye, or a luminescent substance.
  • Examples of the imidazothiazine derivative include the following compound (I) or a salt thereof.
  • R 1 represents — (S) n —R 2 or —NR 3 R 4 , n represents an integer of 0 to 2, R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group or a substituted group.
  • R 3 and R 4 may be the same or different from each other, a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group, an optionally substituted heterocyclic group, or a nitrogen to which they are bonded;
  • a nitrogen-containing heterocyclic ring formed together with an atom R 5 is a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group, a cyano group, an acyl group, an optionally esterified or amidated carboxyl group or a substituted
  • a heterocyclic group that may be R 6 represents a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group, a cyano group, an acyl group, an optionally esterified or amidated carboxyl group or an optionally substituted heterocyclic group;
  • 7 is an optionally substituted hydroxyl group
  • R 8 and R 9 are each a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group (R 5 and R 6 , R 5 and R 8 or R 8 and R 9 are Each may be taken together to form an optionally substituted
  • R 1 represents — (S) n —R 2 or —NR 3 R 4 , n represents an integer of 0 to 2, R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group or a substituted group.
  • An optionally substituted heterocyclic group, R 3 and R 4 are the same or different and each represents a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group, an optionally substituted heterocyclic group or a nitrogen to which they are bonded; The nitrogen-containing heterocyclic ring formed with an atom is shown.
  • alkyl group examples include C 1-20 alkyl groups (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert-pentyl, 1- Methylbutyl, 2-methylbutyl, 1,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2, 2-trimethylpropyl, 1-ethylbut
  • Isononadeshiru can be mentioned, preferably a C 1-10 alkyl group (e.g., methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec- butyl, tert- butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, hexyl, isohexyl, 2-ethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, heptyl, isoheptyl, 1-methylhexyl, 1-ethylpentyl, 3-ethyl Pentyl, 1-propylbutyl, octyl, isooctyl, 2-propylpentyl, nonyl, isononyl, 1-isobutyl-3-methylbutyl, decyl, isodecyl, etc.).
  • alkenyl group includes a C 2-20 alkenyl group (for example, vinyl, allyl, isopropenyl, 1-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 1,3-butadienyl, 1-methyl-1 -Propenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1,3-pentadienyl, 2 , 4-pentadienyl, 1,4-pentadienyl, 1-methyl-1-butenyl, 2-methyl-1-butenyl, 3-methyl-1-butenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl , 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl , 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl,
  • alkynyl group examples include C 2-20 alkynyl groups (eg, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 1- Pentynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-3-butynyl, 2-methyl-3-butynyl, 1-hexynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl, 1-heptynyl, 2-heptynyl, 3-heptynyl, 4-heptynyl, 5-heptynyl, 6-heptynyl, 2-octynyl, 3-octynyl, 4-octynyl, 5-octynyl, 6-
  • a C 2-8 alkenyl groups eg ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 2-pentynyl, 4-pentynyl, 2-hexynyl, 5-hexynyl, 2-heptynyl, 6-heptynyl, 2 -Octynyl, 7-octynyl, etc.
  • aryl groups include C 6-10 aryl groups (eg phenyl, o-tolyl, m-tolyl, p-tolyl, 2-, 3- or 4-biphenyl, 1- or 2-naphthyl, anthryl , Phenanthryl, etc.), preferably phenyl, p-tolyl, 2-, 3- or 4-biphenyl, 1- or 2-naphthyl and the like.
  • aralkyl group examples include C 7-10 aralkyl groups (eg, benzyl, 1-phenethyl, 2-phenethyl, 1-methyl-2-phenethyl, 1-methyl-1-phenethyl, 1,1-dimethyl-2 -Phenethyl, 1-phenylpropyl, 2-phenylpropyl, 3-phenylpropyl, 1-methyl-2-phenylpropyl, 2-methyl-2-phenylpropyl, 1-phenylbutyl, 2-phenylbutyl, 3-phenylbutyl 4-phenylbutyl, 1-phenylpentyl, 2-phenylpentyl, 3-phenylpentyl, 4-phenylpentyl, 5-phenylpentyl, 3-methyl-3-phenylbutyl, 1,1-dimethyl-3-phenylpropyl 2,2-dimethyl-3-phenylpropyl, 1,1-dimethyl-4-phenylbutyl,
  • cycloalkyl group examples include C 3-8 cycloalkyl groups (eg, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, etc.). These may be further condensed with an aryl group such as a phenyl group, and examples thereof include indanyl, benzocyclohexyl, benzocycloheptyl, and benzocyclooctyl. Of these, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, indanyl, benzocycloheptyl and the like are preferable.
  • this cycloalkyl group is bridged via a linear atomic chain having 1 or 2 carbon atoms, and bicyclo [2.2.1] heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl, bicyclo [3.2.1] octyl, Bicyclo [3.3.1] nonyl, bicyclo [3.2.2] nonyl and the like (preferably cyclohexyl having a bridge through a linear chain of 1 or 2 carbon atoms, more preferably bicyclo [2.2.1] ] Or a bridged cyclic hydrocarbon residue of heptyl etc.).
  • an adamantyl group may be formed.
  • cycloalkenyl group examples include C 3-8 cycloalkenyl groups (for example, 2-cyclopropenyl, 2-cyclobutenyl, 2-cyclopentenyl, 3-cyclopentenyl, 2-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, 2- And cycloheptenyl, 3-cycloheptenyl, 4-cycloheptenyl, 2-cyclooctenyl, 3-cyclooctenyl, 4-cyclooctenyl, which may be further condensed with an aryl group such as a phenyl group, such as indenyl, benzocyclohexenyl, benzo Examples thereof include cycloheptenyl, benzocyclooctenyl, etc. Among them, 2-cyclohexenyl, 2-cycloheptenyl, cyclooctyl, indenyl and the like are preferable.
  • Examples of the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 include (1) a nitro group, (2) an oxo group, and (3) a halogen atom (for example, fluorine, chlorine, bromine, iodine).
  • lower alkyl group” of the “optionally substituted lower alkyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 for example, methyl, ethyl, n-propyl, C 1-4 alkyl groups such as isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl and the like can be mentioned.
  • Examples of the substituent that the “lower alkyl group” may have include (1) a nitro group, (2) an oxo group, (3) a halogen atom (for example, fluorine, chlorine, bromine, etc.), (4 ) Cyano group, (5) methylene group, (6) lower alkyl group (for example, C 1-4 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl), (7) Lower alkenyl groups (eg vinyl, allyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl C 2-5 alkenyl group), (8) lower alkynyl groups such as (ethynyl, propargyl, 2-butynyl, C 2-5 alkynyl groups such as
  • N, N-disubstituted carbamoyl group, cyclic aminocarbamoyl group for example, N-pyrrolidylcarbonyl, N-imidazolylcarbonyl, N-piperidylcarbonyl, N-piperazylcarbonyl, N-methyl-N′-piperazylcarbonyl) , N-morpholylcarbonyl, etc.
  • an optionally substituted hydroxyl group for example, the above-mentioned lower alkyl group, lower alkenyl group, cycloalkyl group, aryl group, aralkyl group, esterified or amidated
  • a hydroxyl group optionally substituted by an optionally substituted carboxyl group, an alkylsulfanylthiocarbonyloxy group (for example, methyls Fanylthiocarbonyloxy, ethylsulfanylthiocarbonyloxy, tert-butoxysulfanylthiocarbonyl
  • lower alkenyl group of the “optionally substituted lower alkenyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2
  • vinyl, allyl, iso C 2-5 alkenyl groups such as propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl and the like can be mentioned.
  • substituent that the “lower alkenyl group” may have include “an optionally substituted lower alkyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2. The same number and the same as the substituents which may have.
  • lower alkynyl group of the “optionally substituted lower alkynyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 , for example, ethynyl, propargyl, 2-butynyl, C 2-5 alkynyl groups such as lower alkynyl groups such as 2-pentynyl.
  • substituent that the “lower alkynyl group” may have, “an optionally substituted lower alkyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. The same number and the same as the substituents which may have.
  • aryl group of the “optionally substituted aryl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 for example, phenyl, 2-, 3- or 4- C 2-12 aryl groups such as tolyl, 1- or 2-naphthyl, 2-, 3- or 4-biphenyl.
  • substituents that the “aryl group” may have include “an optionally substituted lower alkyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2. The same number and the same thing as the substituent which may have are mentioned.
  • aralkyl group” of the “optionally substituted aralkyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 for example, benzyl, 2-phenethyl, 3-phenylpropyl, etc. , C 7-13 aralkyl groups such as 1- or 2-naphthylmethyl, 2-, 3- or 4-biphenylmethyl.
  • substituent that the “aralkyl group” may have, “an optionally substituted lower alkyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. The same number and the same thing as the substituent which may have are mentioned.
  • cycloalkyl group” of the “optionally substituted cycloalkyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, C 3-8 cycloalkyl groups such as cycloheptyl and cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, bicyclo [2.2.2] octyl, bicyclo [3.2.1] octyl, bicyclo [3.3.1] nonyl, bicyclo [3.2 .2] Nonyl and adamantyl.
  • Examples of the “lower haloalkyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2-fluoroethyl, 2,2-difluoro.
  • the “optionally esterified or amidated carboxyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 includes a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, an alkenyloxycarbonyl group, an aryl Examples thereof include an oxycarbonyl group, an aralkyloxycarbonyl group, a carbamoyl group, an N-monosubstituted carbamoyl group, and an N, N-disubstituted carbamoyl group.
  • alkoxycarbonyl group examples include C 2-18 alkoxycarbonyl groups such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, hexyloxycarbonyl, dodecyloxycarbonyl, hexadecyloxycarbonyl and the like.
  • the “alkoxycarbonyl group” may have a substituent, and as the substituent, the “substituted hydrocarbon” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. The same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group may have” may be mentioned.
  • alkenyloxycarbonyl group examples include C 2-18 alkenyloxycarbonyl groups such as allyloxycarbonyl, octa-2,6-dienyloxycarbonyl, dodeca-2,6,10-trienyloxycarbonyl, etc. Is mentioned.
  • the “alkenyloxycarbonyl group” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group which may be present” may have.
  • aryloxycarbonyl group examples include phenoxycarbonyl, 1-naphthoxycarbonyl, 2-naphthoxycarbonyl and the like.
  • the “aryloxycarbonyl group” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group which may be present” may have.
  • aralkyloxycarbonyl group examples include aralkyloxycarbonyl groups such as benzyloxycarbonyl, phenethyloxycarbonyl, 3-phenylpropoxycarbonyl and the like.
  • the “aralkyloxycarbonyl group” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group which may be present” may have.
  • substituent of the “N-monosubstituted carbamoyl group” examples include lower alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, etc.), lower alkenyl (eg, vinyl, allyl) (allyl), isopropenyl, propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, etc.), cycloalkyl (eg, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl etc.), aryl (eg, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl), aralkyl ( Examples, benzyl, phenethyl, etc.), heterocyclic groups (for example, the same as “optionally substituted heterocyclic group” as a substituent
  • the lower alkyl, lower alkenyl, cycloalkyl, aryl, aralkyl and heterocyclic group may have a substituent, and examples of the substituent include the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2.
  • substituents which the "lower alkyl group which may be substituted" as a substituent of "may have are mentioned.
  • the substituent of the “N, N-disubstituted carbamoyl group” means a carbamoyl group having two substituents on the nitrogen atom, and the same substituents as those in the above-mentioned “N-monosubstituted carbamoyl group” Can be mentioned.
  • two substituents may form a cyclic amino group together with a nitrogen atom.
  • examples of the cyclic aminocarbamoyl include N-pyrrolidylcarbonyl, N-imidazolylcarbonyl, N-piperidyl. Examples include carbonyl, N-piperazylcarbonyl, N-methyl-N′-piperazylcarbonyl, N-morpholylcarbonyl and the like.
  • acyl group as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 , a hydrogen atom or a substituent that the aforementioned “N-monosubstituted carbamoyl group” has one on a nitrogen atom And carbonyl bonded to each other, for example, a lower alkanoyl group such as formyl group, acetyl and propionyl, or an aroyl group such as benzoyl and naphthoyl.
  • an optionally substituted lower alkyl group optionally substituted A good lower alkenyl group, an optionally substituted lower alkynyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted aralkyl group, an optionally substituted cycloalkyl group, esterified or amidated A carboxyl group, an optionally substituted alkylsulfanylthiocarbonyl group, an optionally substituted aralkylsulfanylthiocarbonyl group, an optionally substituted alkylsulfonyl group, an optionally substituted arylsulfonyl group, a substituted Optional N-imidazolylthiocarbonyl, optionally substituted N-morpholylthiocarboro Le, like the hydroxyl-protecting group can be mentioned.
  • Examples thereof include the same as “group” and “optionally substituted cycloalkyl group”.
  • the “esterified or amidated carboxyl group” is an esterified or amidated carboxyl group as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above.
  • excluding the carboxyl group from is mentioned.
  • Examples of the “optionally substituted alkylsulfanylthiocarbonyl group” include methylsulfanylthiocarbonyl, ethylsulfanylthiocarbonyl, tert-butoxysulfanylthiocarbonyl and the like, and the “optionally substituted aralkylsulfanylthiocarbonyl”.
  • carbonyl group examples include benzylsulfanylthiocarbonyloxy and the like, and the “optionally substituted alkylsulfonyl group” includes methylsulfonyl, ethylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl and the like.
  • alkylsulfonyl group examples include methylsulfonyl, ethylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl and the like.
  • arylsulfonyl group which may be substituted examples include benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, m-toluenesulfonyl, o-toluenesulfonyl and the like.
  • substituents which may be possessed by the “optionally substituted N-imidazolylthiocarbonyl” and the “optionally substituted N-morpholylthiocarbonyl” include the “substituted” represented by the aforementioned R 2. The same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted” as the substituent of "optional hydrocarbon” may have are mentioned.
  • hydroxyl protecting group include 2-tetrahydropyranyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, tert-butyldiphenylsilyl and the like.
  • Examples of the “optionally substituted sulfanyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include a sulfanyl group, methylsulfanyl, ethylsulfanyl, isopropylsulfanyl, tert-butyl. Examples thereof include alkylsulfanyl groups such as sulfanyl, arylsulfanyl groups such as phenylsulfanyl, and aralkylsulfanyl groups such as benzylsulfanyl.
  • the “substituent optionally substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2 may be used.
  • the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group may have” may be mentioned.
  • Examples of the “optionally substituted alkylsulfinyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include methylsulfinyl, ethylsulfinyl, isopropylsulfinyl and the like.
  • Examples of the substituent that the “optionally substituted alkylsulfinyl group” may have include “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group that may be present” may have.
  • Examples of the “optionally substituted arylsulfinyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include benzenesulfinyl, toluenesulfinyl and the like.
  • Examples of the substituent that the “optionally substituted arylsulfinyl group” may have include “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group that may be present” may have.
  • Examples of the “optionally substituted alkylsulfonyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include methylsulfonyl, ethylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl and the like. It is done.
  • Examples of the substituent that the “optionally substituted alkylsulfonyl group” may have include the “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group that may be present” may have.
  • Examples of the “optionally substituted arylsulfonyl group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include benzenesulfonyl, toluenesulfonyl, naphthylsulfonyl and the like.
  • Examples of the substituent which the “optionally substituted arylsulfonyl group” may have include “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group that may be present” may have.
  • Examples of the “sulfonic acid group which may be esterified or amidated” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include, for example, a sulfonic acid group, methyl sulfonate, sulfonic acid Examples thereof include ethyl, sulfonic acid amide, N-methylsulfonic acid amide and the like.
  • the “optionally substituted amino group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 is an amino group mono- or di-substituted with an amino group, an alkyl group or an aralkyl group. Acylamino, alkoxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, aralkyloxycarbonylamino, alkylsulfonylamino, arylsulfonylamino and the like.
  • Examples of the “amino group mono- or di-substituted with an alkyl group or an aralkyl group” include methylamino, ethylamino, isopropylamino, dimethylamino, diethylamino, ethylmethylamino, benzylamino, benzylmethylamino and the like.
  • the “amino group mono- or di-substituted with an alkyl group or an aralkyl group” may have a substituent, and examples of the substituent include the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. The same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted" as a substituent of "may have are mentioned.
  • acylamino examples include formylamino, acetylamino, propionylamino, butyrylamino, isobutyrylamino, valerylamino, isovalerylamino, pivaloylamino, benzoylamino, phenacylamino and the like.
  • the “acylamino” may have a substituent, and the substituent may be “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. Examples include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group” may have.
  • alkoxycarbonylamino examples include methoxycarbonylamino, ethoxycarbonylamino, tert-butoxycarbonylamino and the like.
  • the “alkoxycarbonylamino” may have a substituent, and as the substituent, the “substituted hydrocarbon” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2 may be used.
  • the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group may have” may be mentioned.
  • aryloxycarbonylamino examples include phenoxycarbonylamino, naphthyloxycarbonylamino and the like.
  • the “aryloxycarbonylamino” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group that may be present” may have.
  • aralkyloxycarbonylamino examples include benzyloxycarbonylamino, phenethyloxycarbonylamino and the like.
  • the “aralkyloxycarbonylamino” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. Examples thereof include the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group which may be present” may have.
  • alkylsulfonylamino examples include methylsulfonylamino, ethylsulfonylamino, isopropylsulfonylamino, butylsulfonylamino and the like.
  • the “alkylsulfonylamino” may have a substituent, and the substituent may be “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. The same number and the same as the substituents which the “lower alkyl group may have” may be mentioned.
  • arylsulfonylamino examples include benzenesulfonylamino, naphthylsulfonylamino and the like.
  • the “arylsulfonylamino” may have a substituent, and the substituent is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • R 2 the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group may have” may be mentioned.
  • the “optionally substituted heterocyclic group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 for example, an aliphatic monocyclic nitrogen-containing heterocyclic group, an aromatic single group Examples thereof include cyclic nitrogen-containing heterocyclic groups, condensed nitrogen-containing heterocyclic groups, oxygen-containing monocyclic or condensed heterocyclic groups, sulfur-containing monocyclic or condensed heterocyclic groups, and the like.
  • Examples of the “aliphatic monocyclic nitrogen-containing heterocyclic group” include aziridinyl, azetidinyl, pyrrolidinyl, imidazolidinyl, pyrazolidinyl, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, piperidyl, piperazyl, pyrazinyl, morpholyl, thiomorpholyl Oxazinyl, thiazinyl, azepinyl, diazepinyl, oxazepinyl, thiazepinyl and the like.
  • the “aliphatic monocyclic nitrogen-containing heterocyclic group” may have a substituent, and examples of the substituent include the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. The same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted" may have may be mentioned.
  • Examples of the “aromatic monocyclic nitrogen-containing heterocyclic group” include pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, triazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, triazinyl and the like. It is done.
  • the “aromatic monocyclic nitrogen-containing heterocyclic group” may have a substituent, and examples of the substituent include the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. The same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted" may have may be mentioned.
  • Examples of the “condensed nitrogen-containing heterocyclic group” include benzopyrrolidinyl, benzimidazolidinyl, benzopyrazolidinyl, benzoxazolidinyl, benzoisoxazolidinyl, benzothiazolidinyl, benzoisothiazo Lydinyl, benzopiperidyl, benzopiperazyl, benzopyrazinyl, benzomorpholyl, benzothiomorpholyl, benzoxazinyl, benzothiazinyl, benzoazepinyl, benzodiazepinyl, benzoxazepinyl, benzothiazepinyl, indolyl, isoindolyl, 1H-indazolyl , Benzimidazolyl, benzoxazolyl, benzoisoxazolyl, benzothiazolyl, benzoisothiazolyl, 1H-benzotriazolyl, benzoxiazolyl, be
  • the “condensed nitrogen-containing heterocyclic group” may have a substituent, and as the substituent, “substitution” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • substitution as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • substitution as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • substitution as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • the same number and the same as the substituents that the “lower alkyl group optionally having” may have are exemplified.
  • oxygen monocyclic or condensed heterocyclic group examples include oxiranyl, oxetanyl, oxolanyl, dioxolanyl, furyl, pyranyl, tetrahydropyranyl, dioxanyl, benzofuranyl, isobenzofuranyl, benzopyranyl, isobenzopyranyl, benzodi Oxanyl, 7-oxabicyclo [2.2.1] heptyl), 9-oxabicyclo [3.3.1] nonyl and the like.
  • the “oxygen-containing monocyclic or condensed heterocyclic group” may have a substituent, and the substituent includes a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2.
  • the same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted" may have may be mentioned.
  • Examples of the “sulfur-containing monocyclic or condensed heterocyclic group” include thienyl, thioxolanyl, tetrahydrothiopyranyl, dithianyl, benzothienyl and the like.
  • the “sulfur-containing monocyclic or condensed heterocyclic group” may have a substituent, and examples of the substituent include the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by the above R 2. The same number and the same thing as the substituent which the "lower alkyl group which may be substituted" may have may be mentioned.
  • alkylenedioxy group as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 include methylenedioxy, ethylenedioxy and the like.
  • the “optionally substituted cycloalkenyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 is a C 3-8 cycloalkenyl group (for example, 2-cyclopropenyl, 2-cyclobutenyl). 2-cyclopentenyl, 2-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, 2-cycloheptenyl, 3-cycloheptenyl, 2-cyclooctenyl, 4-cyclooctenyl and the like.
  • hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 3 and R 4 examples include the hydrocarbon as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above. The same thing is mentioned.
  • a C 1-6 alkyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like can be mentioned.
  • the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 3 and R 4 is the same number as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2. , And the like.
  • the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 3 and R 4 is the “optionally substituted hydrocarbon group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. The same thing as “a good heterocyclic group” is mentioned.
  • nitrogen-containing heterocycle as "optionally substituted nitrogen-containing heterocycle represented by R 3 and R 4 together with the nitrogen atom to which they are bonded” include oxygen atoms in addition to carbon atoms 1 to 4 heteroatoms selected from sulfur atoms, nitrogen atoms, etc., may be contained in 3- to 8-membered monocyclic heterocycles or bicyclic or tricyclic fused rings having condensed ring structures
  • heterocyclic groups include 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycles.
  • Particularly preferred examples include azepinyl, piperidyl, piperazyl, N-methylpiperazyl, pyrrolidyl, morpholyl, and the like.
  • R 1 is preferably —SR 2 (R 2 represents a hydrogen atom, an optionally substituted hydrocarbon group or an optionally substituted heterocyclic group), and in particular, R 2 may be substituted. Those that are good hydrocarbon groups are preferred.
  • R 2 may be an optionally substituted alkyl group (optionally substituted C 1-8 alkyl group), an optionally substituted alkenyl group (optionally substituted C 2 ⁇ 8 alkenyl group), optionally substituted aralkyl group (optionally substituted C 7-10 aralkyl group), optionally substituted cycloalkyl group (optionally substituted C 3-8 cycloalkyl) The group) is preferred.
  • R 2 is more preferably a C 1-8 alkyl group which may be substituted, and particularly preferably a C 4-8 alkyl group which may be substituted with a halogen atom.
  • the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 5 is the same as the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above. Things.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 A cycloalkenyl group etc. are mentioned.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, and a C 3-8 cycloalkenyl group are preferable.
  • a C 1-6 alkyl group is preferable, and methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, hexyl, isohexyl, 2-ethylbutyl, 1,1 -Dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylpentyl and 3,3-dimethylpentyl are preferred.
  • Examples of the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 5 include the same number and the same as the substituents of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Things.
  • Examples of the “acyl group” represented by R 5 include the same “acyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 .
  • the “optionally esterified or amidated carboxyl group” represented by R 5 refers to the “esterified or amide group” as a substituent of the above “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2. And the same as “optionally converted carboxyl group”.
  • C 2-18 alkoxycarbonyl groups such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, hexyloxycarbonyl, dodecyloxycarbonyl, hexadecyloxycarbonyl and the like are preferable.
  • Examples of the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 5 include the same as the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 2 described above.
  • the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 6 is the same as the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Things.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like can be mentioned.
  • a C 1-6 alkyl group, a phenyl group, a benzyl group and the like are preferable.
  • Examples of the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 6 include the same number and the same as the substituents of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Things.
  • Examples of the “acyl group” represented by R 6 include the same “acyl group” as a substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 .
  • R 6 refers to the “esterified or amide group” as a substituent of the above “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2. And the same as “optionally converted carboxyl group”.
  • the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 6 is the “optionally substituted heterocyclic group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above. Examples thereof are the same as the “ring group”.
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 5 and R 6 may contain 1 to 3 atoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc. in addition to a carbon atom.
  • an unsaturated 5- to 8-membered monocyclic carbocycle or heterocycle, or a bicyclic fused carbocycle or heterocycle containing these is exemplified.
  • Examples include cycloalkyl (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.), cycloalkenyl (eg, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, cycloheptenyl, etc.), aromatic hydrocarbon rings (eg, phenyl, naphthyl, etc.), Oxygen rings (eg, furyl, oxolanyl, tetrahydropyranyl, oxepinyl, benzofuranyl, benzopyranyl, etc.), nitrogen-containing rings (eg, pyrrolidyl, piperidyl, pyridyl, azepinyl, indolyl, quinolinyl, benzoazepinyl, etc.), sulfur-containing rings (eg, thienyl, Tetrahydrothiopyranyl, benzothienyl, etc.),
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 5 and R 6 may have a substituent, and as the substituent, the “optionally substituted” represented by R 2 above may be used.
  • R 2 the substituent represented by R 2 above
  • the same number and the same as the substituent of “hydrocarbon group” can be mentioned.
  • R 5 is preferably an optionally substituted hydrocarbon group, a cyano group, an acyl group, an optionally esterified or amidated carboxyl group or an optionally substituted heterocyclic group, and particularly preferably substituted.
  • Preferred hydrocarbon groups are preferred. Among them, C 1-12 alkyl group, C 2-12 alkenyl group, C 2-12 alkynyl group, C 6-10 aryl group, C 7-10 aralkyl group, C 3-8 cycloalkyl group, C 3-8 A cycloalkenyl group and the like are preferable.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, and a C 3-8 cycloalkenyl group are preferable.
  • a C 1-6 hydrocarbon group especially a C 1-6 alkyl group is preferable, and methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, hexyl Isohexyl, 2-ethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, and 3,3-dimethylbutyl are preferred.
  • R 6 is preferably an optionally substituted hydrocarbon group.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like are preferable.
  • C 1-6 hydrocarbon groups especially C 1-6 alkyl groups (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, hexyl, isohexyl 2-ethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, etc., particularly methyl, ethyl) and the like are preferable.
  • C 1-6 alkyl groups methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, 2-methylbutyl, hexyl, isohexyl 2-ethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,
  • preferred examples include compounds in which R 5 and R 6 together form an optionally substituted benzene ring or an optionally substituted cyclohexene ring.
  • Examples of the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 7 include an optionally substituted hydrocarbon group, an optionally substituted alkylsulfonyl group, and an optionally substituted arylsulfonyl. Group, an alkylcarbonyl group which may be substituted, an arylcarbonyl group which may be substituted, and the like. Of the “optionally substituted hydroxyl groups” represented by R 7 , a hydroxyl group is preferable.
  • the “hydrocarbon group” of the optionally substituted hydrocarbon group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 7 includes a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group. C 6-10 aryl group, C 7-10 aralkyl group and the like. Of these, a C 1-6 alkyl group, a benzyl group and the like are preferable.
  • the substituent of the optionally substituted hydrocarbon group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” is the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 above. The same number and the same thing are mentioned.
  • Examples of the optionally substituted alkylsulfonyl group and optionally substituted arylsulfonyl group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 7 are, for example, optionally substituted.
  • Examples thereof include a C 1-4 alkylsulfonyl group, an optionally substituted benzenesulfonyl group, and the like.
  • a methanesulfonyl group, a trifluoromethanesulfonyl group, a benzenesulfonyl group, a toluenesulfonyl group and the like are preferable.
  • optionally substituted alkylcarbonyl group or optionally substituted arylcarbonyl group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 7 , for example, optionally substituted C 1 -4 alkylcarbonyl group, an optionally substituted benzoyl group, and the like.
  • optionally substituted C 1 -4 alkylcarbonyl group for example, optionally substituted C 1 -4 alkylcarbonyl group, an optionally substituted benzoyl group, and the like.
  • an acetyl group, a propionyl group, a benzoyl group, and the like are preferable.
  • Examples of the substituent of the arylcarbonyl group which may be substituted include the same number and the same as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above.
  • the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 8 and R 9 includes the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like can be mentioned.
  • a C 1-6 alkyl group, a phenyl group, a benzyl group and the like are preferable.
  • the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 8 and R 9 is the same number as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2. And the like.
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 5 and R 8 may contain 1 to 3 atoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc. in addition to a carbon atom.
  • an unsaturated 5- to 8-membered monocyclic carbocycle or heterocycle, or a bicyclic fused carbocycle or heterocycle containing these is exemplified.
  • Examples include cycloalkyl (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.), cycloalkenyl (eg, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, cycloheptenyl, etc.), aromatic hydrocarbon rings (eg, phenyl, naphthyl, etc.), Oxygen rings (eg, furyl, oxolanyl, tetrahydropyranyl, oxepinyl, benzofuranyl, benzopyranyl, etc.), nitrogen-containing rings (eg, pyrrolidyl, piperidyl, pyridyl, azepinyl, indolyl, quinolinyl, benzoazepinyl, etc.), sulfur-containing rings (eg, thienyl, Tetrahydrothiopyranyl, benzothienyl, etc.),
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 5 and R 8 may have a substituent, and as the substituent, the “optionally substituted” represented by R 2 above may be used.
  • R 2 the substituent represented by R 2 above
  • the same number and the same as the substituent of “hydrocarbon group” can be mentioned.
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 8 and R 9 may contain 1 to 3 atoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, etc. in addition to a carbon atom.
  • an unsaturated 5- to 8-membered monocyclic carbocycle or heterocycle, or a bicyclic fused carbocycle or heterocycle containing these is exemplified.
  • Examples include cycloalkyl (eg, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, etc.), cycloalkenyl (eg, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, cycloheptenyl, etc.), aromatic hydrocarbon rings (eg, phenyl, naphthyl, etc.), Oxygen rings (eg, furyl, oxolanyl, tetrahydropyranyl, oxepinyl, benzofuranyl, benzopyranyl, etc.), nitrogen-containing rings (eg, pyrrolidyl, piperidyl, pyridyl, azepinyl, indolyl, quinolinyl, benzoazepinyl, etc.), sulfur-containing rings (eg, thienyl, Tetrahydrothiopyranyl, benzothienyl, etc.).
  • the cyclic hydrocarbon or heterocyclic ring formed by combining R 8 and R 9 may have a substituent, and as the substituent, the “optionally substituted” represented by R 2 above may be used.
  • R 2 the substituent represented by R 2 above
  • the same number and the same as the substituent of “hydrocarbon group” can be mentioned.
  • R 8 and R 9 are preferably an optionally substituted hydrocarbon group.
  • a C 1-8 alkyl group, a C 2-8 alkenyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like are preferable.
  • a C 1-6 alkyl group, a phenyl group, a benzyl group and the like are preferable.
  • R 10 represents a hydrogen atom, —ZR 15 or —P (O) R 16 R 17 .
  • the hydrocarbon group of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 15 in —ZR 15 is the hydrocarbon as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above.
  • the thing similar to group is mentioned.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 A cycloalkenyl group etc. are mentioned.
  • a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group and the like are preferable.
  • Examples of the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 15 include the same number and the same as the substituents of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Things. Among them, an optionally substituted C 1-4 alkyl group, an optionally substituted C 2-4 alkenyl group, a halogen atom such as fluorine, chlorine, bromine, C 1-4 alkoxy group, C 1-4 A haloalkyl group, a carboxyl group, a carboxamide group and the like can be mentioned.
  • substituents include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a vinyl group, fluorine, chlorine, bromine, a methoxy group, and an ethoxy group. Can be mentioned.
  • the “optionally substituted heterocyclic group” represented by R 15 of —ZR 15 is “substituted” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2.
  • an optionally substituted thienyl group, an optionally substituted quinolyl group, an optionally substituted benzooxadiazolyl group, an optionally substituted pyridyl group, and an optionally substituted benzothiadiazo are a ryl group, an optionally substituted benzothienyl group, an optionally substituted oxazolidinyl group, an optionally substituted benzodioxanyl group, an optionally substituted dibenzofuranyl group, and a morpholyl group, Particularly preferred examples include an optionally substituted thienyl group, an optionally substituted benzothiadiazolyl group, and an optionally substituted pyridyl group.
  • Z represents —SO 2 —, —SO—, —CONR 18 SO 2 — (R 18 is C 1-6 alkyl), —CONR 19 — (R 19 is C 1-6 alkyl) or —CO—.
  • Examples of C 1-6 alkyl represented by R 18 and R 19 include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl and the like.
  • the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 16 and R 17 is the same as the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 A cycloalkenyl group etc. are mentioned.
  • a C 1-6 alkyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like are preferable.
  • methyl, ethyl, phenyl, benzyl and the like are preferable.
  • the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 16 and R 17 is the same as the substituent of the above “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Numbers and similar ones.
  • Examples of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 16 and R 17 include an optionally substituted hydrocarbon group.
  • the “hydrocarbon group” of the optionally substituted hydrocarbon group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 16 and R 17 includes a C 1-8 alkyl group, C 2 -8 alkenyl group, C 6-10 aryl group, C 7-10 aralkyl group and the like. Of these, a C 1-6 alkyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group and the like are preferable. In particular, methyl, ethyl, propyl, butyl, phenyl, benzyl and the like are preferable.
  • the substituent of the optionally substituted hydrocarbon group as the substituent of the “optionally substituted hydroxyl group” is the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 above. The same number and the same thing are mentioned.
  • the “optionally substituted hydroxyl group” represented by R 16 and R 17 is preferably a hydroxyl group substituted with a C 1-6 alkyl group, a C 6-10 aryl group or the like.
  • the “optionally substituted amino group” represented by R 16 and R 17 is the “optionally substituted amino group” as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon” represented by R 2 described above.
  • the same thing as "a good amino group” is mentioned.
  • methyl, ethyl, phenyl, benzyl and the like can be mentioned.
  • R 16 and R 17 are preferably a C 1-6 alkyl group, a C 6-10 aryl group, a hydroxyl group substituted with a C 1-6 alkyl group, a hydroxyl group substituted with a C 6-10 aryl group, and the like.
  • Preferred are methyl, ethyl, phenyl, benzyl, a hydroxyl group substituted with methyl, a hydroxyl group substituted with ethyl, a hydroxyl group substituted with phenyl, and the like.
  • R 10 is preferably —ZR 15 (Z and R 15 are as defined above). Among them, those in which Z is —SO 2 — or —CO—, and R 15 is an optionally substituted aryl group, an optionally substituted aralkyl group, or an optionally substituted heterocyclic group. preferable. In particular, Z is —SO 2 — or —CO—, and R 15 is an optionally substituted C 6-10 aryl group, an optionally substituted C 7-10 aralkyl group, or optionally substituted. What is a heterocyclic group is preferable.
  • Z is —SO 2 —
  • R 15 is a phenyl group optionally substituted with a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a vinyl group, fluorine, chlorine, bromine, methoxy group, ethoxy group, or the like.
  • Benzyl, thienyl, benzothiadiazolyl, or Z is —CO—
  • R 15 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, vinyl, fluorine, chlorine, bromine, methoxy, ethoxy
  • a pyridyl group which may be substituted with a group or the like is preferable.
  • R 11 represents a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group.
  • the hydrocarbon group of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 11 is the same as the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 . Things.
  • a C 1-6 alkyl group, a C 2-6 alkenyl group, a C 7-10 aralkyl group and the like can be mentioned. Of these, a C 1-6 alkyl group, a benzyl group and the like are preferable, and a C 1-4 alkyl group and the like are particularly preferable.
  • the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 11 the same number and the same as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 above. Things.
  • R 11 is preferably a hydrogen atom.
  • the nitrogen-containing heterocyclic ring that R 10 and R 11 may form together is,
  • the partial structure represented by [Wherein the ring B represents a 5- to 8-membered ring which may be substituted] is a 5- to 8-membered nitrogen-containing heterocyclic ring represented by More specifically, the formula [Wherein R 17 represents the same meaning as described above, and rings B 1 to B 12 each represents a nitrogen-containing heterocyclic ring which may further have a substituent].
  • the substituent that the B 1 ring to B 12 ring may have is the same as the substituent that the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 15 may have. Means things.
  • the nitrogen-containing heterocyclic ring that R 10 and R 11 may form together is represented by the formula Wherein, B 2 rings and B 3 rings further have a substituent group indicates a nitrogen-containing heterocyclic ring which may] 6 or 7-membered nitrogen-containing heterocyclic ring represented by is preferable.
  • the hydrocarbon group of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 12 and R 13 is the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2 described above.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 A cycloalkenyl group etc. are mentioned.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, and a C 7-10 aralkyl group are preferable.
  • the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 12 and R 13 is the same number as the substituent of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 2. And the like.
  • Examples of the optionally substituted nitrogen-containing heterocycle represented by R 12 and R 13 together with the nitrogen atom to which they are bonded include the above-mentioned “R 3 and R 4 are bonded to each other. And the same as the nitrogen-containing heterocycle of “optionally substituted nitrogen-containing heterocycle represented together with the nitrogen atom”.
  • Particularly preferred examples include piperidyl, piperazil, N-methylpiperazyl, pyrrolidyl, morpholyl and the like.
  • R 12 includes a hydrogen atom, a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, and a C 3-8 cycloalkyl group.
  • C 3-8 cycloalkenyl group and the like are preferable.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, and a C 7-10 aralkyl group are preferable.
  • R 13 is preferably a hydrogen atom.
  • the hydrocarbon group of the “optionally substituted hydrocarbon group” represented by R 14 is the same as the hydrocarbon group as the “optionally substituted hydrocarbon group” of R 2 described above. Things.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 6-10 aryl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 A cycloalkenyl group etc. are mentioned.
  • a C 1-4 alkyl group and a C 7-10 aralkyl group are preferable.
  • R 14 is preferably an optionally substituted hydrocarbon group.
  • a C 1-12 alkyl group, a C 2-12 alkenyl group, a C 2-12 alkynyl group, a C 7-10 aralkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 3-8 cycloalkenyl group and the like are preferable.
  • a C 1-6 alkyl group and a C 7-10 aralkyl group are preferable. Is preferred, especially Above all Is preferred. Is preferred, especially Is preferred.
  • Compound (I) includes compounds of the formula [Wherein each symbol is as defined above] [Compound (I ′)] is preferably used. Among them, R 1 is -SR 2 ,
  • R 2 is an optionally substituted C 1-8 alkyl group, C 2-8 alkenyl group, C 7-10 aralkyl group or C 3-8 cycloalkyl group (preferably substituted with a halogen atom). May be a C 4-8 alkyl group),
  • R 5 is an optionally substituted C 1-12 alkyl group, C 2-12 alkenyl group, C 2-12 alkynyl group, C 6-10 aryl group, C 7-10 aralkyl group, C 3-8.
  • a cycloalkyl group or a C 3-8 cycloalkenyl group (preferably a C 1-12 alkyl group),
  • R 6 is an optionally substituted C 1-8 alkyl group, C 2-8 alkenyl group, C 6-10 aryl group or C 7-10 aralkyl group (preferably a C 1-6 alkyl group),
  • R 10 is —SO 2 —R 15 ,
  • R 15 is each optionally substituted C 6-10 aryl group, C 7-10 aralkyl group or 5- to 6-membered heterocyclic group (preferably substituted with a C 1-6 aryl group and / or a halogen atom, respectively)
  • Optionally substituted phenyl group, benzyl group, thienyl group or benzothiadiazolyl group) and
  • a compound in which R 11 is a hydrogen atom is preferably used.
  • the salt of the compound (I) is preferably a pharmacologically acceptable salt.
  • a salt with an inorganic base a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, basic or acidic Examples include salts with amino acids.
  • the salt with an inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; and aluminum salt and ammonium salt.
  • salt with an organic base examples include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine and the like.
  • salt with inorganic acid examples include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Suitable examples of salts with organic acids include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p -Salts with toluenesulfonic acid and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like
  • salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid and glutamic acid, for example. It is done.
  • Compound (I) may be a hydrate or a non-hydrate.
  • the compound (I) used in the present invention can have one asymmetric carbon in the skeleton, two kinds of optical isomers may exist, and each of these isomers and mixtures thereof are also included in the present invention. include.
  • the substituent has an asymmetric carbon or unsaturated bond, a stereoisomer and a geometric isomer are also produced, and each of these isomers and a mixture thereof are also included in the present invention.
  • Compound (I) has a sulfur atom in its structure, and these may be oxidized according to a conventional method using an oxidizing agent (eg, hydrogen peroxide or m-chloroperbenzoic acid). Sulfonated compounds are also included in the present invention.
  • Compound (I) may have an amide, imide, amidino, guanidino or ureido group in its structure or as a substituent, but these may have a resonance structure in which the double bond is isomerized.
  • Resonant structural compounds are also included in the present invention.
  • Compound (I) can be produced by the method described in WO 02/92606 or a method analogous thereto.
  • an imidazothiazine derivative that can be used in the step (1), 5-[[((1Z) -5,6-dimethyl-3-yl], which is introduced with a carboxyl group at the end so as to be capable of binding to a carrier, is used.
  • An example is pentanoic acid. This compound can be produced by the method described in Example 21-10 of WO 02/92606 or a method analogous thereto.
  • step (1) (i) the binding amount of the immobilized imidazothiazine derivative and Hsp90 in the absence of the test substance, and (ii) the binding of the immobilized imidazothiazine derivative and Hsp90 in the presence of the test substance.
  • An example of measuring and comparing amounts is described below.
  • Hsp90 and various concentrations of test substance are mixed in an appropriate buffer and allowed to react for a certain period of time.
  • a complex of the test substance and Hsp90 is formed.
  • a solid phase imidazothiazine derivative is added to the mixed solution, and the mixture is allowed to react for a certain period of time.
  • Hsp90 not forming a complex with the test substance binds to the immobilized imidazothiazine derivative.
  • the immobilized imidazothiazine derivative is washed with a buffer solution to remove Hsp90 not bound to the imidazothiazine derivative.
  • the immobilized imidazothiazine derivative and the buffer solution are mixed and then heat-treated to elute Hsp90 bound to the imidazothiazine derivative into the buffer solution. Even in the absence of the test substance, the same operation as above is performed to obtain an eluate.
  • Hsp90 bound to the imidazothiazine derivative is detected as a band.
  • the Hsp90 bands (Hsp90 protein mass) obtained in the absence of the test substance and in the presence of the test substance are compared.
  • the amount of Hsp90 protein obtained in the presence of the test substance is less than that in the absence of the test substance, the test substance has an inhibitory activity on the binding between Hsp90 and the imidazothiazine derivative, that is, has an Hsp90 binding activity. It can be judged.
  • step (1) (i) the amount of bound Hsp90 and labeled imidazothiazine derivative in the absence of the test substance, (ii) the solid phase Hsp90 and labeled imidazo in the presence of the test substance
  • step (1) An example in which the binding amount of a thiazine derivative is measured and compared is described below.
  • an imidazothiazine derivative is labeled using tritium as a radioisotope to obtain a labeled imidazothiazine derivative.
  • solid-phase Hsp90 bound to beads containing a scintillator, labeled imidazothiazine derivative and various concentrations of a test substance are mixed and allowed to react for a certain period of time.
  • the test substance has a binding property to Hsp90
  • the test substance binds to the immobilized Hsp90.
  • the labeled imidazothiazine derivative binds to the immobilized Hsp90 not bound to the test substance.
  • the radioactivity of the labeled imidazothiazine derivative bound to the immobilized Hsp90 is measured using a scintillator counter, and the radioactivity obtained in the absence of the test substance and in the presence of the test substance are compared. If the radioactivity in the presence of the test substance is less than that in the absence of the test substance, it can be determined that the test substance has an inhibitory activity on the binding between Hsp90 and the imidazothiazine derivative, that is, has an Hsp90 binding activity. .
  • the step (1) of the present invention there may be mentioned one including a step of measuring the binding amount of the immobilized Hsp90 and the test substance by surface plasmon resonance measurement.
  • a test substance dissolved in an appropriate buffer solution is allowed to flow on the chip surface.
  • a test substance having Hsp90 binding activity is selected by measuring a change in surface plasmon.
  • An excellent cytoprotective agent can be obtained by selecting a test substance having Hsp90 binding activity in step (1) and subjecting the test substance to steps (2) and (3).
  • step (2) the heat shock protein expression-inducing activity of the test substance is measured for the purpose of selecting test substances having heat-shock protein expression-inducing activity.
  • Heat shock protein expression-inducing activity can be measured using heat shock protein or mRNA that encodes heat shock protein as an indicator, using cells having the ability to express heat shock protein or a cell extract system.
  • a preferred example of the step (2) includes a step of measuring the heat shock protein expression inducing activity of a test substance using cells having the ability to express heat shock protein.
  • the heat shock protein in step (2) is, for example, one or more selected from Hsp40, Hsp70, and Hsp90.
  • step (2) an example in which the heat shock protein expression inducing activity of a test substance is measured using cells having the ability to express heat shock protein is described below.
  • human normal articular chondrocytes capable of expressing Hsp70 are used as the cells capable of expressing the heat shock protein.
  • the protein in the gel is adsorbed onto a nitrocellulose membrane, and the amount of Hsp70 protein is measured by Western blotting using anti-Hsp70 antibody as the primary antibody and Horseradish® peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody as the secondary antibody. To do.
  • test substance that increases the amount of Hsp70 protein in normal human articular chondrocytes in the presence of IL-1 ⁇ stimulation has heat shock protein expression-inducing activity.
  • Non-patent Document 1 a compound having an activity of separating the Hsp90 / HSF-1 complex induces the expression of a heat shock protein. Therefore, the heat shock protein expression inducing activity of the test substance in the step (2) can be measured by measuring the separation activity of the test substance with respect to the Hsp90 / HSF-1 complex.
  • HSF-1 means heat shock transcription factor (heat shock factor-1) and is not particularly limited as long as it forms a complex with Hsp90.
  • HSF-1 various animals, particularly those derived from humans, can be used.
  • human HSF-1 for example, human HSF-1 (GenBank accession No. NP_005517) can be used.
  • the HSF-1 of the present invention also includes a salt of HSF-1 protein and a modified HSF-1 protein.
  • step (2) An example of measuring the separation activity for the Hsp90 / HSF-1 complex as step (2) is described below.
  • human normal articular chondrocytes are lysed with a buffer containing a protease inhibitor, the lysate is centrifuged, and the resulting supernatant is used as a lysate containing an Hsp90 / HSF-1 complex.
  • a test substance or a buffer solution is added to the lysate diluted with an appropriate buffer and allowed to react for a certain period of time.
  • Hsp90 and HSF-1 are dissociated.
  • an anti-Hsp90 antibody or a control antibody is added to the reaction solution, and an immunoprecipitation reaction is performed.
  • Hsp90 / HSF-1 complex When the Hsp90 / HSF-1 complex is present in the reaction system, an anti-Hsp90 antibody / Hsp90 / HSF-1 complex is formed. When Hsp90 dissociated from HSF-1 is present in the reaction system, an anti-Hsp90 antibody / Hsp90 complex is formed.
  • protein A / G agarose is added and allowed to react for a certain period of time to adsorb the antibody to protein A / G agarose.
  • the protein A / G agarose is then recovered by centrifugation, washed with buffer, mixed with sample buffer and heat treated for 5 minutes. Since the protein bound to protein A / G agarose is eluted, the eluate is subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis.
  • the protein in the gel is adsorbed on a nitrocellulose membrane, and anti-HSF-1 antibody or anti-Hsp90 antibody is used as the primary antibody, and Western blotting using Horseradish peroxidase-labeled anti-IgG antibody as the secondary antibody is performed.
  • Hsp90 and HSF-1 proteins are detected as bands. Compare the protein bands (protein mass) detected in the absence of the test substance and in the presence of the test substance. When the amount of HSF-1 protein in the presence of the test substance is less than that in the absence of the test substance, the test substance has a separating activity against the Hsp90 / HSF-1 complex, that is, has a heat shock protein expression inducing activity. It can be judged.
  • An excellent cytoprotective agent can be obtained by selecting a test substance having a heat shock protein expression-inducing activity in step (2) and further subjecting the test substance to steps (1) and (3).
  • step (3) the Hsp90 client protein degradation-inducing activity of the test substance is measured for the purpose of selecting test substances having the activity of inducing Hsp90 client protein degradation.
  • the Hsp90 client protein degradation-inducing activity can be measured using a cell having the ability to express a client protein or a cell extract system.
  • a cell having the ability to express a client protein or a cell extract system for example, (i) the amount of Hsp90 client protein in the cell in the absence of the test substance and (ii) the amount of Hsp90 client protein in the cell in the presence of the test substance are measured, The process of comparing is mentioned.
  • the Hsp90 client protein is not particularly limited as long as it is a protein that has a property of forming a complex with Hsp90 for stable presence in cells or normal function.
  • Glucocorticoidticreceptor Akt and cycline dependent kinase 4
  • Glucocorticoid receptor include those derived from various animals, particularly humans, such as human Glucocorticoid receptor (GENBANK Accession No. AAB20466).
  • Akt is a kind of serine / threonine kinase (EC 2.7.11.1). Examples of Akt include those derived from various animals, particularly humans, for example, human Akt (GENBANK Accession No. NP_001014432).
  • Cyclin-dependent kinase 4 is a kinase that is activated by forming a complex with cyclin D.
  • cycline-dependent kinase-4 include those derived from various animals, particularly humans, such as human cycline-dependent kinase-4 (GENBANK Accession No. NP000066).
  • Hsp90 client protein examples include EGF-R (epidermal growth factor receptor), IGF1R (insulin-like growth factor I receptor), and RIP (receptor-interacting protein).
  • the mass of Hsp90 client protein can be measured, for example, by Western blotting using an antibody against Hsp90 client protein.
  • human normal articular chondrocytes are suspended in a medium, seeded in a multiwell plate, and cultured for a certain period of time. This cultured cell is used as a cell capable of expressing the Hsp90 client protein.
  • a test substance is added to the culture medium, and the cells are cultured for a certain time. After completion of the culture, the cells are washed once with a buffer solution, a cell lysis buffer solution is added, cell residues are separated from the plate using a cell scraper, and the cell lysis buffer solution is recovered.
  • the collected cell lysis buffer is mixed with a sample buffer, heat-treated, and then subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis using a multigel (Daiichi Chemical Co., Ltd.).
  • the protein in the gel is adsorbed on a nitrocellulose membrane, and the client protein is detected as a band by Western blotting.
  • the client protein is Glucocorticoid receptor, Akt and cycline dependent kinase 4
  • the antibody against each protein is used as a primary antibody in Western blotting.
  • a secondary antibody a Horseradish peroxidase-labeled anti-IgG antibody is used.
  • An excellent cytoprotective agent can be obtained by selecting a test substance that does not show Hsp90 client proteolysis-inducing activity in step (3) and further subjecting the test substance to steps (1) and (2).
  • step (2) is a step of measuring the heat shock protein expression inducing activity of a test substance using cells having the ability to express heat shock protein
  • step (3) is the ability to express Hsp90 client protein.
  • the step of measuring the Hsp90 client proteolysis-inducing activity of a test substance using a cell having the above is preferable.
  • the cytoprotective agent screening method of the present invention may be a method of performing the following steps (1) to (4) on a test substance.
  • Step (4) is a step of selecting test substances that show Hsp90 binding activity and heat shock protein expression induction activity and do not show Hsp90 client proteolytic activity based on the measurement results of steps (1) to (3). is there.
  • an excellent cytoprotective agent that is weakly cytotoxic or does not show cytotoxicity that is, “Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, Hsp90 client proteolysis Cytoprotective agent with weak facilitating activity or not exhibiting such activity "or” cell exhibiting Hsp90 binding activity and Hsp90 / HSF-1 complex separation activity, and Hsp90 client proteolytic facilitating activity is weak or does not exhibit this activity
  • a protective agent "can be obtained.
  • the cytoprotective agent is, for example, heart disease (eg, cardiomyopathy, heart failure, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), neurological disease (eg, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, triplet repeat disease, prion disease, muscle atrophic side measures) Sclerosis cerebellar degeneration, retinitis pigmentosa, etc., brain disease (eg, cerebral infarction, etc.), central nervous system infection (eg, HIV encephalitis, bacterial meningitis, etc.), traumatic disease (eg, spinal cord injury, brain) Injuries, etc.), dislocation diseases (eg, multiple sclerosis, etc.), bone / joint diseases (eg, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, etc.), kidney diseases (eg, ischemic acute renal failure, hemolytic uremic toxin) Syndrome, acute tubular necrosis, hydronephrosis, glomerulonephritis, diabetic ne
  • the present invention is a screening kit that can be suitably used for the above screening method, particularly for screening a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, and does not exhibit Hsp90 client protein degradation promoting activity.
  • a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, and does not exhibit Hsp90 client protein degradation promoting activity.
  • An example of a screening kit includes (1) Hsp90, (2) a reagent for measuring heat shock protein expression inducing activity, (3) an imidazothiazine derivative, and (4) a reagent for quantifying Hsp90 client protein.
  • Hsp90 may be immobilized.
  • the heat shock protein is not particularly limited, but is preferably at least one selected from Hsp40, Hsp70 and Hsp90.
  • the reagent for measuring heat shock protein expression inducing activity includes, for example, a heat shock protein or a reagent for quantifying or detecting mRNA encoding the heat shock protein.
  • an antibody against the heat shock protein examples include reagents contained in Eliza kits, mRNA measurement reagents, reagents for reporter assays using HeatHshock elements, and the like.
  • the imidazothiazine derivative may be solid-phased.
  • the Hsp90 client protein is not particularly limited, but is preferably at least one selected from Glucocorticoid receptor, Akt and cycline dependent kinase 4.
  • an antibody against Hsp90 client protein is preferable.
  • the screening method is a method using cells having protein expression ability
  • the screening kit further comprises (5) cells capable of expressing heat shock proteins, and (6) ability to express Hsp90 client proteins. Preferably it contains cells.
  • the screening kit of the present invention is (1) Hsp90 / HSF-1 complex, (2) Hsp90, (3) reagent for quantifying Hsp90, (4) imidazothiazine derivative, and (5 ) Reagent for quantification of Hsp90 client protein.
  • a reagent for quantifying Hsp90 an antibody against Hsp90 is preferable.
  • the screening kit preferably further includes (6) cells having expression ability of Hsp90 client protein.
  • the present invention provides a substance that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity and does not exhibit Hsp90 client protein degradation promoting activity, which is obtained using the screening method or screening kit described above.
  • the substance include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, antibodies, nucleic acids, vaccines, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like.
  • the substance may be a salt of a peptide, protein, non-peptidic compound or synthetic compound.
  • the substance can be used as it is as a cytoprotective agent or a medicine.
  • the mixture of this substance and another component can be used as a cytoprotective agent or a pharmaceutical.
  • Examples of substances obtained using the screening method or screening kit of the present invention include the imidazothiazine derivatives of the above formula (I).
  • Examples of the imidazothiazine derivatives include N-[(1Z) -5,6-dimethyl-3-oxo-8-[(4,4,5,5,5-pentafluoropentyl) sulfanyl] -2, 3-dihydro-1H-imidazo [5,1-c] [1,4] thiazine-1-ylidene] -4-methylbenzenesulfonamide).
  • the step (1) of the screening method of the present invention includes a step of measuring the inhibitory activity of a test substance on the binding between Hsp90 and an imidazothiazine derivative. ) Or a salt thereof is excluded from the “substance obtained using the screening method or screening kit of the present invention” used in the screening method.
  • the present invention provides a cytoprotective agent comprising a substance that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, but does not exhibit Hsp90 client proteolysis inducing activity, obtained using the screening method or screening kit. And a medicament comprising the cytoprotective agent.
  • cytoprotective agents and medicaments are useful as prophylactic / therapeutic agents for various diseases, particularly diseases involving organ damage and inflammation.
  • Diseases include, for example, heart diseases (eg, cardiomyopathy, heart failure, angina pectoris, myocardial infarction), neurological diseases (eg, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, triplet repeat disease, prion disease, amyotrophic side sclerosis) Cerebellar degeneration, retinitis pigmentosa, etc., brain disease (eg, cerebral infarction, etc.), central nervous system infection (eg, HIV encephalitis, bacterial meningitis, etc.), traumatic disease (eg, spinal cord injury, brain injury, etc.) ), Dislocation disease (eg, multiple sclerosis, etc.), bone / joint disease (eg, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, etc.), renal disease (eg, ischemic acute renal failure, hemolytic uremic syndrome) ,
  • heart diseases
  • the above-mentioned cytoprotective agent and medicament are made into a pharmaceutical composition by a known method, and are used in various dosage forms as a prophylactic / therapeutic agent for the above diseases orally or parenterally to mammals (eg, humans, monkeys, etc.).
  • the above compound is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier and orally administered as a tablet, pill, granule, capsule, syrup, emulsion, suspension or the like, or an injection, suppository It is administered parenterally intravenously, subcutaneously and intramuscularly as an agent or a sublingual tablet. Further, it may be administered sublingually, subcutaneously or intramuscularly as a sustained release preparation such as a sublingual tablet or a microcapsule.
  • various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants, solvents, solubilizers, suspending agents. , Tonicity agents, buffering agents, soothing agents and the like. Further, if necessary, preparation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.
  • Active ingredient contained in the pharmaceutical composition (substance obtained by using the above screening method or screening kit, which exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity but does not exhibit Hsp90 client proteolytic activity)
  • the dose varies depending on the degree of symptoms; age, sex, body weight of administration subject; timing of administration, interval, nature of pharmaceutical preparation, preparation, type; type of active ingredient, etc., and is not particularly limited.
  • the active ingredient is usually administered to an adult at a dose of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. do it.
  • reaction mixture was stirred at room temperature for 12 hours and further stirred at 80 ° C. for 7 hours.
  • the reaction mixture was concentrated to dryness, 2N hydrochloric acid (340 ml) and methanol (100 ml) were added to the residue and mixed.
  • the resulting precipitate was collected by filtration, washed with 50% aqueous methanol and ethanol, and dried. An orange-brown powder of the title compound was obtained.
  • Compound A was dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF) and diluted with an appropriate buffer according to the purpose, and used in the measurement method described in the examples.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • geldanamycin (([18S- (4E, 5Z, 8R *, 9R *, 10E, 12R *, 13S *, 14R *, 16S *)]]-9- [(aminocarbonyl) oxy] -13-hydroxy- 8,14,19-trimetoxy-4,10,12,16-tetramethyl-2-azabicyclo [16.3.1.] docosa- 4,6,10,18,21-
  • GA geldanamycin
  • the imidazothiazine derivative (compound B) was immobilized by the following method. First, Compound B was dissolved in 85% N, N-dimethylformamide (DMF) to 100 mM. Next, 20 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochroride (EDC) and 1 ml of AF-aminotoyopearl 650 (manufactured by Tosoh Corporation) are added to 2 ml of the above solution, and the pH is adjusted.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochroride
  • AF-aminotoyopearl 650 manufactured by Tosoh Corporation
  • AF-aminotoyopearl 650 carrier was washed with 85% DMF, 570 ⁇ l of 0.2 M sodium acetate and 285 ⁇ l of glacial acetic acid were added to this, and kept at 0 ° C. for 30 minutes, and then 285 ⁇ l of Glacial acetic acid was added and held at 25 ° C. for an additional 30 minutes.
  • solid-phased compound B a solid-phased imidazothiazine derivative
  • step (1) of the screening method of the present invention (i) the amount of bound imidazothiazine derivative and Hsp90 in the absence of the test substance, and (ii) the immobilization in the presence of the test substance
  • the amount of binding between the imidazothiazine derivative and Hsp90 was measured and compared, as follows.
  • His-hHsp90 ⁇ purified human Hsp90 ⁇ protein (His-hHsp90 ⁇ ) in which a histidine tag was added to the N-terminus using Escherichia coli was used. His-hHsp90 ⁇ was prepared as follows.
  • a region encoding Hsp90 ⁇ was amplified by a polymerase chain reaction (PCR) method from a human skeletal muscle complementary DNA (cDNA) library (Clontech).
  • PCR polymerase chain reaction
  • cDNA human skeletal muscle complementary DNA
  • SEQ ID NO: 1 a sense strand matching the N-terminus of human Hsp90 ⁇ containing a BamHI cleavage site on the 5 ′ end side
  • a C of human Hsp90 ⁇ containing a SalI cleavage site on the 5 ′ end side was used.
  • the amplified human Hsp90 ⁇ was cleaved with BamHI and SalI and then inserted between the BamHI and SalI cleavage sites of pET28b (Novagen) to obtain pET28b-hHsp90 ⁇ .
  • the hHsp90 ⁇ cDNA sequence in the obtained plasmid was confirmed using a DNA sequencing system (Applied Biosystems).
  • PET28b-hHsp90 ⁇ was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen), inoculated into LB medium supplemented with ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. This was transferred to a medium having the same composition to 1%, cultured at 37 ° C. for about 2.5 hours, and 1 ⁇ mM isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside (IPTG) was added thereto. The cells were cultured at 4 ° C. for 4 hours to induce the expression of His-hHsp90 ⁇ protein. After completion of the culture, E.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • coli was recovered, and 10 ⁇ ml of 0.1% NP40 buffer (20 ⁇ mM Tris-HCl (pH 7.9) / 500 ⁇ mM NaCl / 5 ⁇ mM Imidazole per 10 ml of cells obtained from 100 ⁇ m culture broth was used. ) was added and sonicated. The cell disruption liquid was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was recovered. The supernatant was applied to a nickel column to obtain a His-hHsp90 ⁇ protein.
  • 0.1% NP40 buffer (20 ⁇ mM Tris-HCl (pH 7.9) / 500 ⁇ mM NaCl / 5 ⁇ mM Imidazole per 10 ml of cells obtained from 100 ⁇ m culture broth was used.
  • the cell disruption liquid was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was recovered. The supernatant was applied to a nickel column to obtain a His-hHsp90 ⁇ protein.
  • the immobilized compound B was washed 5 times with 0.2 ml of Binding Buffer, and the His-hHsp90 ⁇ not bound to the immobilized compound B was washed and removed.
  • the solid phase compound B is mixed with the sample buffer (Tris-SDS-ME Sample Buffer; manufactured by Daiichi Chemicals) in equal amounts and heat treated at 95 ° C for 5 minutes to bind to the solid phase compound B.
  • SDS polyacrylamide electrophoresis was performed using Multigel (Daiichi Chemical Co., Ltd.). After completion of the electrophoresis, the polyacrylamide gel was stained with silver to detect His-hHsp90 ⁇ bound to the immobilized compound B.
  • test substance Hsp90 inhibitor having Hsp90 binding activity
  • step (1) of the screening method of the present invention (i) the binding amount of the immobilized Hsp90 and the labeled imidazothiazine derivative in the absence of the test substance, and (ii) the solid phase in the presence of the test substance
  • a step of measuring and comparing the phase-bound Hsp90 and the binding amount of the labeled imidazothiazine derivative was performed.
  • Hsp90 purified human Hsp90 ⁇ protein (His2-hHsp90 ⁇ ) having an N-terminal histidine tag was used using E. coli. His2-hHsp90 ⁇ was prepared as follows. First, the hHsp90 ⁇ gene was excised from pET28b-hHsp90 ⁇ using the BamHI cleavage site and Bpu1102I cleavage site, and inserted between the BamHI cleavage site and Bpu1102I cleavage site of pET15b (Novagen) to obtain pET15b-hHsp90 ⁇ .
  • Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) transformed with pET15b-hHsp90 ⁇ was cultured in M-9 medium supplemented with ampicillin and 1 mM isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside (IPTG) was added and cultured at 37 ° C. for 4 hours to induce the expression of His2-hHsp90 ⁇ protein. After completion of the culture, Escherichia coli was recovered, and a buffer (50 mM mM Tris-HCl (pH 8.0) / 5 mM mM EDTA / 0.5 mM mM APMSF) was added and ultrasonically disrupted.
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • the cell disruption solution was centrifuged at 39800 ⁇ G for 30 minutes, and the supernatant was recovered. This was treated with 60% saturated ammonium sulfate at 4 ° C. for 15 hours to precipitate proteins, and then centrifuged at 30,100 ⁇ g ⁇ g for 30 minutes. The obtained precipitate was suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM mMimidazole), and this was applied to a nickel column to obtain a His2-hHsp90 ⁇ protein. The resulting His2-hHsp90 ⁇ was used after further purification by HPLC using a DEAE-5PW column.
  • Tritium labeled compound A (hereinafter referred to as “[ 3 H] -compound A”) was used as a labeled imidazothiazine derivative.
  • Various concentrations of the test substance (compound A) and 40 nM tritium-labeled compound A were added to the plate containing the immobilized Hsp90 and allowed to stand at room temperature for 6 hours, and then bound to the His2-hHsp90 ⁇ protein [ 3
  • the radioactivity of H] -compound A was measured using a microplate scintillator counter (TopCount NXT; manufactured by Packard).
  • the total binding amount of [ 3 H] -compound A is determined by reacting Ysi (2-5 ⁇ m) copper his-tag SPA beads not immobilized with His2-hHsp90 ⁇ protein with 40 nM [ 3 H] -compound A. Was subtracted as non-specific binding activity.
  • test substance Hsp90 inhibitor having the binding property to Hsp90 can be selected by this step.
  • a step of measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance was carried out using cells capable of expressing the heat shock protein.
  • Hsp70 was used as the heat shock protein.
  • test substance Hsp70 expression-inducing activity After replacing the medium with a new Dulbecco's modified Eagle medium / Ham F12 medium 1: 1 mixed medium, the test substance and 10 ng / ml IL-1 ⁇ (Genzyme Techne) ) And was cultured for 2 days at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • the cells are washed once with a phosphate buffer (Phosphate-Buffered Salline, PBS), and 100 ⁇ l of cell lysis buffer [10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ⁇ 2Na, 1 mM EGTA, 0.5 mM (p-aminophenyl) methanesulfonyl fluoride hydrochloride, 200 ⁇ M Sodium ⁇ -glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10 ⁇ g / ml Aprotinin, 10 ⁇ g / ml Leupeptin, 1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P40, 0.1% SDS and 1 mM o-Vanadate] were added, and the cell debris was separated from the plate using a cell scraper, and the cell lysis buffer was
  • the protein in the gel was adsorbed on a nitrocellulose membrane (Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech) using a horizon blot (ATTO), and anti-Hsp70 antibody (Transduction) was used as the primary antibody.
  • Laboratories or anti- ⁇ -Actin antibody (Sigma) was used to measure the amount of each protein by Western blotting using a Horseradish® peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Kirkegaard® & Perry® Laboratoies) as a secondary antibody. .
  • ⁇ -Actin was used for the purpose of verifying the adsorption process of proteins on nitrocellulose membrane.
  • the substance having the heat shock protein expression inducing activity can be selected by measuring the heat shock protein expression inducing activity of the test substance in this step.
  • step (2) a step of measuring the separation activity of the test substance against the Hsp90 / HSF-1 complex was performed.
  • a test substance having an activity of separating the Hsp90 / HSF-1 complex is expected to have a heat shock protein expression inducing activity.
  • Hsp90 / HSF-1 complex Human normal articular chondrocytes (manufactured by Clonetics) were washed with PBS, and then a RIPA buffer containing a protease inhibitor (Complete; Boeringer Mannheim) (50 mM Tris- HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid), and this was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 10 minutes, and then the supernatant was Hsp90 / HSF-1 Used as lysate containing complex.
  • a protease inhibitor Complete; Boeringer Mannheim
  • the beads are collected by centrifugation, washed 7 times with RIPA buffer, and mixed with an equal volume of sample buffer (Tris-SDS-ME Sample Buffer; manufactured by Daiichi Chemical) at 95 ° C for 5 minutes. After heat-treating for minutes, it was subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis using Multigel (Daiichi Chemical Co., Ltd.).
  • the protein in the gel is adsorbed on a nitrocellulose membrane (Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech) using horizon blot (ATTO), and anti-HSF-1 antibody as the primary antibody (Manufactured by StressGen) or anti-Hsp90 antibody (manufactured by Transduction Laboratories) as a secondary antibody, Horseradish® peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Cell Signaling® Technology) or Horseradish® peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (manufactured by Kirkegaard® & Perry® Laboratoies) ) was used to measure the amount of each protein.
  • step (3) of the screening method of the present invention a step of measuring the Hsp90 client protein degradation-inducing activity of a test substance using cells having the ability to express Hsp90 client protein was performed.
  • test substance was added to the culture solution, and the cells were further cultured at 37% at 5% CO 2 for about 18 hours. After culturing, the cells are washed once with a phosphate buffer (Phosphate-Buffered Salline, PBS) and 200 ⁇ l of cell lysis buffer [10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ⁇ 2Na, 1 mM EGTA, 0.5 mM (p-aminophenyl) methanesulfonyl fluoride hydrochloride, 200 ⁇ M Sodium ⁇ -glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10 ⁇ g / ml Aprotinin, 10 ⁇ g / ml Leupeptin, 1% Triton
  • the protein in the gel is adsorbed on a nitrocellulose membrane (Hybond-ECL; Amersham Pharmacia Biotech) using horizon blot (ATTO), and the proteins of various client proteins by Western blot. The amount was analyzed.
  • anti-Glucocorticoid receptor antibody manufactured by Santa Cruz
  • anti-Akt antibody Cell Signaling Technology
  • anti-Cyclin dependent kinase 4 antibody Calbiochem
  • anti- ⁇ -Actin antibody Sigma
  • Horseradish® peroxidase labeled anti-rabbit IgG antibody manufactured by Cell Signaling Technology
  • Horseradish® peroxidase labeled anti-mouse IgG antibody manufactured by Kirkegaard® & Perry® Laboratoies
  • control substance GA decreased the amount of intracellular protein of Glucocorticoid receptor, Akt, Cyclin-dependent kinase 4 at a concentration of 10 nM or more.
  • the effect was particularly remarkable in Glucocorticoid-receptor and Akt (FIG. 5).
  • Compound A is considered to have a degradation inducing activity of the client protein of 1/1000 or less compared to GA.
  • test substance which does not show Hsp90 client proteolysis-inducing activity or has weak activity can be selected by this step.
  • human normal articular chondrocytes were suspended in a growth medium for articular chondrocytes at 4 ⁇ 10 4 cells / ml, seeded in a 96-well plate, and cultured for 1 day at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • the medium was replaced with Dulbecco's modified Eagle medium / Ham F12 medium 1: 1 mixed medium, the test substance and 10 ng / ml IL-1 ⁇ were added, and this was further cultured for 1 day at 37 ° C with 5% CO 2 . did.
  • 110 ⁇ M nitric oxide generating reagent ( ⁇ )-(E) -4-Ethyl-2-[(E) -hydroxyimino] -5-nitro-3-hexenamide (NOR3; manufactured by Dojindo Co., Ltd.) was added and cultured for 1 day to induce cell death. After completion of the culture, cell viability was measured using 3- (4,5-dimethylthiazole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazorium bromide (MTT; manufactured by Dojindo Co., Ltd.). As a result, Compound A exhibited a dose-dependent inhibitory effect on cell death induced by NO, whereas GA decreased the cell viability (FIG. 6). Compound A was confirmed to have excellent cytoprotective activity.
  • human normal articular chondrocytes were suspended in an articular chondrocyte growth medium at 5 ⁇ 10 4 cells / ml, seeded in a 96-well plate, and cultured for 1 day at 37 ° C. with 5% CO 2 .
  • the test substance was added to the culture solution, and the cells were further cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 for 2 days.
  • the cell viability was determined as (2- (2-Methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt (WST-8
  • WST-8 2- (2-Methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt
  • WST-8 monosodium salt
  • Compound A did not affect the cell viability at a concentration of 10 ⁇ M or less, but GA significantly attenuated the cell viability at a concentration of 30 nM or more.
  • FIG. 7 The cytotoxicity of Compound A is considered to be 1/300 or less of GA.
  • Compound A is an excellent cytoprotective agent with low cytotoxicity.
  • the compound A is “a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression inducing activity, and does not exhibit Hsp90 client proteolytic activity” or It has been confirmed that it has properties as “a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and Hsp90 / HSF-1 complex separation activity and does not exhibit Hsp90 client proteolytic activity” and low cytotoxicity. .
  • cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression induction activity and does not exhibit Hsp90 client protein degradation promoting activity” or “Hsp90 binding activity and Hsp90 / HSF-1 complex separation activity” It was shown that a cytoprotective agent which does not show the Hsp90 client proteolytic activity was obtained.
  • the screening method of the present invention can be used for searching for an excellent cytoprotective agent.
  • the present invention is useful as a cytoprotective agent that exhibits Hsp90 binding activity and heat shock protein expression-inducing activity but does not exhibit Hsp90 client proteolytic activity, and a method and kit for screening such cytoprotective agents. It is.

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Abstract

本発明は、細胞保護剤のスクリーニング方法、スクリーニング用キットを提供する。具体的には、以下の工程を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング方法を提供する：工程(1)：被験物質とHsp90との結合性を測定する工程；工程(2)：ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて、被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、又は被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程；および工程(3)：Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて、被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程。　(1)Hsp90、(2)ヒートショック蛋白質発現誘導活性の測定用試薬、(3)イミダゾチアジン誘導体、および(4)Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。

Description

細胞保護剤のスクリーニング方法
　本発明は、心疾患、神経疾患などの種々の疾患において有用な細胞保護剤のスクリーニング方法、キット、およびそのようなスクリーニング方法により得られる細胞保護剤に関する。
　細胞が熱ショックのようなストレスを受けると、熱ショック蛋白質（ヒートショックプロテイン、Hsp）と呼ばれる一群の蛋白質が誘導される。Hspは熱ショックストレスや酸化ストレスなどのさまざまなストレスで変性した細胞内の蛋白質を、正常な状態に戻す役割を果たしている。
　熱ショック蛋白質の一種であるHsp90（heat shock protein 90）は、生体内でさまざまな基質蛋白質（クライアント蛋白質）と結合し、その機能を調節している。Hsp90のクライアント蛋白質としては、例えば、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ、cycline dependent kinase 4等が公知である（例えば、非特許文献１参照）。
　Hsp90は、熱ショック転写因子（ヒートショックファクター－１、HSF-1）と複合体を形成し、HSF-1を単量体の不活性状態に保つことで、熱ショック反応を負に制御している（例えば、非特許文献２参照）。
　Hsp90と結合しその活性を阻害する物質（Hsp90阻害剤）は、Hsp70を始めとする熱ショック蛋白質の発現を誘導することにより、細胞保護活性を発揮する細胞保護剤としての用途が期待できる（例えば、特許文献１、非特許文献１および３参照）。Hsp90の阻害剤はHSF-1の活性化を介してHsp70などの細胞保護作用を有する熱ショック蛋白質の発現を誘導することができる。
　心疾患、神経疾患や炎症性疾患などの種々の疾患では、酸化ストレスなどによる細胞や組織の障害が問題となっており、細胞保護剤はこれらの疾患の予防・治療薬として有望と考えられる。Hsp70を始めとする熱ショック蛋白質は、紫外線照射や活性酸素などのさまざまな要因で惹起した細胞死を抑制し、心疾患、神経変性疾患や、糖尿病などの疾患モデル動物等で治療効果を示す。従って、Hsp90阻害剤は熱ショック蛋白質誘導化合物であり、上記の疾患の予防・治療薬になりうると考えられる。しかしながらゲルダナマイシン等のHsp90阻害剤は、Hsp90のクライアント蛋白質の分解を引き起こし、細胞傷害性を有するので、細胞保護剤としては不十分であった。
　細胞保護剤として利用可能なHsp90阻害剤を探索するためのスクリーニング方法としては、被験物質とHsp90との結合性（以下「Hsp90結合活性」）を測定する方法がある。しかしながら、Hsp90結合活性を測定するのみでは、被験物質がHsp90のクライアント蛋白質の分解を引き起こし、細胞傷害性を示すか否かを確認することはできない。
　上記事情により、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性および細胞傷害性が弱く、細胞保護剤として有用なHsp90阻害剤を探索するためのスクリーニング方法が求められていた。
Heat shock proteins as emerging therapeutic targets, Br. J. Pharmacol., 2005; 146: p. 769-780 分子シャペロンによる細胞機能制御、132頁、2001年 Inhibitors of the HSP90 molecular chaperon: current status, Adv Cancer Res., 2006; 95:p. 323-348 国際公開番号ＷＯ２００４／０６９９９９
　本発明の課題は、細胞保護剤のスクリーニング方法、スクリーニング用キットなどを提供することにある。
　本発明者らは、（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含むスクリーニング法により、優れた細胞保護剤が得られることを見出した。
　また、本発明者らは、上記工程（２）を、被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程とすることによっても、優れた細胞保護剤が得られることを見出した。
　本発明は、これらの知見に基づき完成された。すなわち本発明は、
［１］（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、細胞保護剤のスクリーニング方法；
［１ａ］（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング方法；
［１ｂ］被験物質に対して以下の工程（１）～（４）を実施する、細胞保護剤のスクリーニング方法：（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程、および（４）Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程；
［２］工程（１）が、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［２ａ］工程（１）が、（i）被験物質非存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量を測定し、比較する工程を含むものである、上記［２］記載のスクリーニング方法；
［２ｂ］被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下で得られた固相化イミダゾチアジン誘導体へのHsp90の結合量が少ない場合に、該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有すると判断する、上記［２ａ］に記載のスクリーニング方法；
［２ｃ］工程（１）が、（i）被験物質非存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量とを測定し、比較する工程を含むものである、上記［２］記載のスクリーニング方法；
［２ｄ］被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下で得られた固相化Hsp90へのラベル化イミダゾチアジンの結合量が少ない場合に、該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有すると判断する、上記［２ｃ］に記載のスクリーニング方法；
［３］工程（２）が、被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程を含むものである、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［３ａ］被験物質の非存在下よりも被験物質の存在下での分離したHSF-1の蛋白質量が多い場合に、該被験物質はHsp90/HSF-1複合体に対する分離活性（すなわち、ヒートショック蛋白質発現誘導活性）を有すると判断する、上記［３］記載のスクリーニング方法；
［４］工程（３）が、Hsp90とクライアント蛋白質との結合に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［５］工程（２）がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程である、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［５ａ］工程（３）がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［５ｂ］工程（２）がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程であり、かつ工程（３）がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［５ｃ］ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞がヒト正常間接軟骨細胞であり、ヒートショック蛋白質がHsp70であり、該細胞を被験物質およびＩＬ－１βとともに培養したときにHsp70の蛋白質量を増加させる被験物質を、ヒートショック蛋白質発現誘導活性を有する被験物質であると判断する、上記［５］または［５ｂ］記載のスクリーニング方法；
［６］工程（２）のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上である、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［７］工程（3）のHsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、上記［１］記載のスクリーニング方法。
［８］工程（３）が、（i）被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、上記［１］または[２]記載のスクリーニング方法；
[８ａ]工程（３）が、Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定することを含み、（i）被験物質非存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、上記［１］または［２］載のスクリーニング方法。
［８ｂ］被験物質非存在下および被験物質存在下で測定される蛋白質量の間に実質的な差異がない場合、該被験物質はクライアント蛋白質の分解誘導活性を有さないと判断する、上記［８］記載のスクリーニング方法；
［９］Hsp90クライアント蛋白質量が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により測定される、上記［８］記載のスクリーニング方法；
［１０］細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患または皮膚疾患の予防・治療剤である、上記［１］記載のスクリーニング方法；
［１０ａ］細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、皮膚疾患または代謝性疾患の予防・治療剤である、上記［１］記載のスクリーニング方法；［１１］さらに工程（４）として、（４）Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程、を含む上記［１］記載のスクリーニング方法。
［１２］（1）Hsp90、（２）ヒートショック蛋白質の定量用試薬、（３）イミダゾチアジン誘導体、および（４）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット；
[１２ａ]（1）Hsp90、（２）ヒートショック蛋白質発現誘導活性の測定用試薬、（３）イミダゾチアジン誘導体、および（４）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
［１２ｂ］（1）Hsp90、（２）ヒートショック蛋白質の定量用試薬、（３）イミダゾチアジン誘導体、および（４）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キット；
［１３］（１）Hsp90／HSF-1複合体、（２）Hsp90、（３）Hsp90の定量用試薬、（４）イミダゾチアジン誘導体、および（５）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット；［１３ａ］（１）Hsp90／HSF-1複合体、（２）Hsp90、（３）Hsp90の定量用試薬、（４）イミダゾチアジン誘導体、および（５）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キット；
［１４］Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を含む、上記［１１］または［１２］記載のスクリーニング用キット；
［１５］Hsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、上記［１１］または［１２］記載のスクリーニング用キット；
［１６］（２）のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上である、上記［１１］記載のスクリーニング用キット；
［１７］上記［１］記載の方法、または［１１］若しくは［１２］のいずれかに記載のキットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質；
［１８］上記［１７］記載の物質を含有してなる細胞保護剤；
［１９］上記［１７］記載の物質を含有してなる医薬；および
［２０］心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患または皮膚疾患の予防・治療剤である上記［１９］記載の医薬；
に関する。
　実施例に示す通り、本発明により、Hsp90阻害剤としての性質を有し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性および細胞傷害性が弱いか又は細胞傷害性を示さない、優れた細胞保護剤を探索するためのスクリーニング方法が提供される。また、本発明により、上記細胞保護剤を選抜するためのスクリーニング用キットも提供される。
　本発明のスクリーニング方法により、「Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性が弱いか又は該活性を示さない細胞保護剤」或いは「Hsp90結合活性及びHsp90／HSF-1複合体分離活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性が弱いか又は該活性を示さない細胞保護剤」を容易に得ることができる。このような細胞保護剤は、Hsp90のクライアント蛋白質の分解を引き起こさず、よって細胞傷害性が低いので、各種の疾患の予防・治療薬として有用である。
化合物Ｂ固定化担体とHis-hHsp90αの結合に及ぼす、被験物質（化合物Ａ（Compound A））と対照化合物（GA）の影響を示したSDS-PAGE電気泳動図である。 [3H]-化合物ＡとHis2-hHsp90α蛋白質の結合に及ぼす、被験物質（化合物Ａ）と対照化合物（GA）の影響を示すグラフである。 IL-1βの刺激存在下における、被験物質（化合物Ａ）と対照化合物（GA）のHsp70発現誘導活性を示すウエスタンブロットである。 免疫沈降実験により、被験物質（化合物Ａ）がHsp90/HSF-1複合体を分離させることを示すウエスタンブロットである。 被験物質（化合物Ａ）と対照化合物（GA）のHsp90クライアント蛋白質分解活性を比較した結果を示すウエスタンブロットである。 被験物質（化合物Ａ）と対照化合物（GA）の細胞保護活性を示すグラフである。 被験物質（化合物Ａ）と対照化合物（GA）の細胞傷害性を示すグラフである。
〔細胞保護剤のスクリーニング方法〕
　本発明は、（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程、を含む細胞保護剤のスクリーニング方法を提供する。被験物質に対して上記の工程（１）～（３）を実施することにより、優れた細胞保護剤を選抜することができる。
　工程（１）では、Hsp90結合活性を有する被験物質の選抜を目的として、被験物質とHsp90との結合性を測定する。
　工程（１）としては、例えば、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものが挙げられる。Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合に対する被験物質の阻害活性は、例えば、（i）被験物質非存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量を測定し、比較することにより測定することができる。また、（i）被験物質非存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量とを測定し、比較することによっても測定できる。
　Hsp90は、熱ショック蛋白質９０（heat shock protein 90）を意味し、後述するイミダゾチアジン誘導体との結合性を有するものであれば特に限定されない。本発明のHsp90には、Hsp90蛋白質の塩、修飾されたHsp90蛋白質、担体と結合可能となるようにアミノ酸配列の一部が修飾されたHsp90蛋白質、担体と結合させた固相化Hsp90蛋白質も含まれる。Hsp90蛋白質と結合させるための担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。Hsp90と担体との結合は、公知の方法に従って行うことができる。
　Hsp90としては、各種動物、特にヒト由来のものが使用できる。ヒトHsp90としては、ヒトHsp90α（GENBANK Accession No. P07900）、ヒトHsp90β（GENBANK Accession No. P08238）が好ましく、特にN末端にヒスチジンタグを付加したヒトHsp90α(例えば、His-hHsp90α、His2-hHsp90αなど)が好ましい。His-hHsp90αは、例えば、国際公開番号ＷＯ２００４／０６９９９９号公報　５７～５８頁〔実施例２（２）〕記載の方法に準じ、以下のようにして調製することができる。
　まず、ヒトの骨格筋の相補的DNA（cDNA）ライブラリーに含まれるHsp90αをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により増幅する。増幅されたヒトHsp90α領域をプラスミドベクターのクローニングサイトに挿入し、His-hHsp90α発現ベクターを構築する。該発現ベクターを大腸菌に形質転換した後、形質転換体を培養し、His-hHsp90α蛋白質の発現を誘導する。培養終了後、回収した大腸菌の菌体をバッファー(20 mM Tris-HCl(pH7.9)/500 mM NaCl/5 mM Imidazole)に懸濁して超音波破砕し、得られた菌体破砕液を、遠心分離し、その上清を回収する。この上清より、ニッケルカラムを用いてHis-hHsp90α蛋白質を得る。
　イミダゾチアジン誘導体は、イミダゾチアジン骨格を持つ化合物であって、Hsp90との結合性を有するものであれば特に限定されない。本発明のイミダゾチアジン誘導体には、担体と結合可能となるように末端が修飾されたイミダゾチアジン誘導体、担体と結合させた固相化イミダゾチアジン誘導体、ラベル化イミダゾチアジン誘導体も含まれる。イミダゾチアジン誘導体と結合させるための担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。イミダゾチアジン誘導体と担体との結合は、公知の方法に従って行うことができる。
　イミダゾチアジン誘導体のラベル化は、例えば、放射性同位元素、蛍光色素、発光物質を用いて行うことができる。
　イミダゾチアジン誘導体の例としては、以下の化合物（I）またはその塩が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 〔式中、Ｒ1は、－(Ｓ)n－Ｒ2または－ＮＲ3Ｒ4を、ｎは０～２の整数を、Ｒ2は水素原子、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を、Ｒ3およびＲ4は同一または異なって水素原子、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい複素環基またはそれらが結合している窒素原子と一緒に形成する含窒素複素環を、Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭化水素基、シアノ基、アシル基、エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基または置換されていてもよい複素環基を、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 を、Ｒ6は、水素原子、置換されていてもよい炭化水素基、シアノ基、アシル基、エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基または置換されていてもよい複素環基を、Ｒ7は置換されていてもよい水酸基を、Ｒ8およびＲ9はそれぞれ水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を（Ｒ5とＲ6、Ｒ5とＲ8またはＲ8とＲ9はそれぞれ一緒になって置換されていてもよい環状炭化水素または複素環を形成してもよい）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 を、Ｒ10は、水素原子、－ＺＲ15（Ｚは－ＳＯ2－、－ＳＯ－、－ＣＯＮＲ18ＳＯ2－（Ｒ18はＣ1-6アルキルを示す）、－ＣＯＮＲ19－（Ｒ19はＣ1-6アルキルを示す）または－ＣＯ－を、Ｒ15は、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を示す）または－Ｐ(Ｏ)Ｒ16Ｒ17（Ｒ16およびＲ17はそれぞれ置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい水酸基または置換されていてもよいアミノ基を示す）を、Ｒ11は水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を（Ｒ10とＲ11は一緒になって置換されていてもよい含窒素複素環を形成してもよい）、Ｒ12およびＲ13はそれぞれ水素原子または置換されていてもよい炭化水素基、あるいはそれらが結合している窒素原子と一緒になって含窒素複素環を、Ｒ14は、水素原子、置換されていてもよい炭化水素基または－ＺＲ15（ＺおよびＲ15は、前記と同意義を示す）を示す。但し、Ｒ5が水素原子、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を示すとき、Ｒ14は置換されていてもよい炭化水素基または－ＺＲ15（Ｚ、Ｒ15は、前記と同意義を示す）を示す。〕
　上記式において、Ｒ1は、－(Ｓ)n－Ｒ2または－ＮＲ3Ｒ4を、ｎは０～２の整数を、Ｒ2は水素原子、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を、Ｒ3およびＲ4は同一または異なって水素原子、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい複素環基またはそれらが結合している窒素原子と一緒に形成する含窒素複素環を示す。
　Ｒ2で表される置換されていてもよい炭化水素基の「炭化水素基」としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、などが挙げられる。
　該「アルキル基」の例としては、Ｃ1-20アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、1,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、ヘプチル、イソヘプチル、1-メチルヘキシル、2-メチルヘキシル、3-メチルヘキシル、4-メチルヘキシル、1-エチルペンチル、2-エチルペンチル、3-エチルペンチル、1-プロピルブチル、1,1-ジメチルペンチル、1,2-ジメチルペンチル、1,3-ジメチルペンチル、1,4-ジメチルペンチル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、2,4-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチル、3,4-ジメチルペンチル、4,4-ジメチルペンチル、1,1,2-トリメチルブチル、1,1,3-トリメチルブチル、1,2,2-トリメチルブチル、1,2,3-トリメチルブチル、1,3,3-トリメチルブチル、2,2,3-トリメチルブチル、2,3,3-トリメチルブチル、1-エチル-1-メチルブチル、1-エチル-2-メチルブチル、1-エチル-3-メチルブチル、2-エチル-1-メチルブチル、2-エチル-2-メチルブチル、2-エチル-3-メチルブチル、オクチル、イソオクチル、1-メチルヘプチル、2-メチルヘプチル、3-メチルヘプチル、4-メチルヘプチル、５-メチルヘプチル、1-エチルヘキシル、2-エチルヘキシル、3-エチルヘキシル、4-エチルヘキシル、1-プロピルペンチル、2-プロピルペンチル、1,1-ジメチルヘキシル、2,2-ジメチルヘキシル、3,3-ジメチルヘキシル、4,4-ジメチルヘキシル、５,５-ジメチルヘキシル、3-エチル-3-メチルペンチル、1,1-ジエチルブチル、2,2-ジエチルブチル、1,1,2,2-テトラメチルブチル、1,1,3,3-テトラメチルブチル、2,2,3,3-テトラメチルブチル、1,1-ジメチル-2-エチルブチル、ノニル、イソノニル、1-イソブチル-3-メチルブチル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシルなど）が挙げられ、好ましくはＣ1-10アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ヘキシル、イソヘキシル、2-エチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、ヘプチル、イソヘプチル、1-メチルヘキシル、1-エチルペンチル、3-エチルペンチル、1-プロピルブチル、オクチル、イソオクチル、2-プロピルペンチル、ノニル、イソノニル、1-イソブチル-3-メチルブチル、デシル、イソデシルなど）が挙げられる。
　該「アルケニル基」としては、Ｃ2-20アルケニル基（例えばビニル、アリル、イソプロペニル、1-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1,3-ブタジエニル、1-メチル-1-プロペニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-1-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1,3-ペンタジエニル、2,4-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-メチル-1-ブテニル、2-メチル-1-ブテニル、3-メチル-1-ブテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-メチル-3-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1-エチル-1-プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、５-ヘキセニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニル、1,5-ヘキサジエニル、2,4-ヘキサジエニル、2,5-ヘキサジエニル、1-メチル-1-ペンテニル、2-メチル-1-ペンテニル、3-メチル-1-ペンテニル、4-メチル-1-ペンテニル、1-メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、1-メチル-3-ペンテニル、2-メチル-3-ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、2-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1-エチル-1-ブテニル、2-エチル-1-ブテニル、1-エチル-2-ブテニル、2-エチル-2-ブテニル、1-エチル-3-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1-ヘプテニル、2-ヘプテニル、3-ヘプテニル、4-ヘプテニル、5-ヘプテニル、6-ヘプテニル、1,3-ヘプタジエニル、1,4-ヘプタジエニル、1,5-ヘプタジエニル、1,6-ヘプタジエニル、2,4-ヘプタジエニル、2,5-ヘプタジエニル、2,6-ヘプタジエニル、3,5-ヘプタジエニル、3,6-ヘプタジエニル、4,6-ヘプタジエニル、1-メチル-1-ヘキセニル、1-メチル-2-ヘキセニル、1-メチル-3-ヘキセニル、1-メチル-4-ヘキセニル、1-メチル-５-ヘキセニル、2-メチル-1-ヘキセニル、2-メチル-2-ヘキセニル、2-メチル-3-ヘキセニル、2-メチル-4-ヘキセニル、2-メチル-５-ヘキセニル、3-メチル-1-ヘキセニル、3-メチル-2-ヘキセニル、3-メチル-3-ヘキセニル、3-メチル-4-ヘキセニル、3-メチル-５-ヘキセニル、4-メチル-1-ヘキセニル、4-メチル-2-ヘキセニル、4-メチル-3-ヘキセニル、4-メチル-4-ヘキセニル、4-メチル-５-ヘキセニル、5-メチル-1-ヘキセニル、5-メチル-2-ヘキセニル、5-メチル-3-ヘキセニル、5-メチル-4-ヘキセニル、5-メチル-５-ヘキセニル、1-メチル-2,4-ヘキサジエニル、2-メチル-2,4-ヘキサジエニル、3-メチル-2,4-ヘキサジエニル、4-メチル-2,4-ヘキサジエニル、5-メチル-2,4-ヘキサジエニル、5-メチル-2,5-ヘキサジエニル、1-エチル-1-ペンテニル、2-エチル-1-ペンテニル、3-エチル-1-ペンテニル、1-エチル-2-ペンテニル、2-エチル-2-ペンテニル、3-エチル-2-ペンテニル、1-エチル-3-ペンテニル、2-エチル-3-ペンテニル、3-エチル-3-ペンテニル、1-エチル-4-ペンテニル、2-エチル-4-ペンテニル、3-エチル-4-ペンテニル、1-プロピル-1-ブテニル、1-プロピル-2-ブテニル、1-プロピル-3-ブテニル、2-オクテニル、3-オクテニル、4-オクテニル、5-オクテニル、6-オクテニル、7-オクテニル、1-メチル-2-ヘプテニル、1-メチル-3-ヘプテニル、1-メチル-4-ヘプテニル、1-メチル-5-ヘプテニル、1-メチル-6-ヘプテニル、6-メチル-2-ヘプテニル、6-メチル-3-ヘプテニル、6-メチル-4-ヘプテニル、6-メチル-5-ヘプテニル、6-メチル-6-ヘプテニル、6-メチル-3,5-ヘプタジエニル、6-メチル-2,5-ヘプタジエニル、4-エチル-2-ヘキセニル、4-エチル-3-ヘキセニル、2-ノネニル、8-ノネニル、7-メチル-1-オクテニル、7-メチル-2-オクテニル、7-メチル-3-オクテニル、7-メチル-4-オクテニル、7-メチル-5-オクテニル、7-メチル-6-オクテニル、7-メチル-7-オクテニル、1-エチル-2-ヘプテニル、1-エチル-3-ヘプテニル、1-エチル-4-ヘプテニル、1-エチル-5-ヘプテニル、1-エチル-6-ヘプテニル、5-エチル-2-ヘプテニル、5-エチル-3-ヘプテニル、5-エチル-4-ヘプテニル、5-エチル-5-ヘプテニル、5-エチル-6-ヘプテニル、2-デセニル、9-デセニル、8-メチル-2-ノネニル、8-メチル-3-ノネニル、8-メチル-4-ノネニル、8-メチル-5-ノネニル、8-メチル-6-ノネニル、8-メチル-7-ノネニル、8-メチル-8-ノネニル、3,7-ジメチル-2,6-オクタジエニル、2-ウンデセニル、10-ウンデセニル、9-メチル-2-デセニル、9-メチル-8-デセニル、9-メチル-9-デセニル、2-ドデセニル、11-ドデセニル、10-メチル-2-ウンデセニル、10-メチル-9-ウンデセニル、10-メチル-10-ウンデセニル、2-トリデセニル、12-トリデセニル、11-メチル-2-ドデセニル、11-メチル-10-ドデセニル、11-メチル-11-ドデセニル、2-テトラデセニル、13-テトラデセニル、12-メチル-2-トリデセニル、12-メチル-11-トリデセニル、12-メチル-12-トリデセニル、2-ペンタデセニル、14-ペンタデセニル、13-メチル-2-テトラデセニル、13-メチル-12-テトラデセニル、13-メチル-13-テトラデセニル、3,7,11-トリメチル-2,6,10-ドデカトリエニル、2-ヘキサデセニル、15-ヘキサデセニル、14-メチル-2-ペンタデセニル、14-メチル-13-ペンタデセニル、14-メチル-14-ペンタデセニル、2-ヘプタデセニル、16-ヘプタデセニル、15-メチル-2-ヘキサデセニル、15-メチル-14-ヘキサデセニル、15-メチル-15-ヘキサデセニル、2-オクタデセニル、17-オクタデセニル、9,12-オクタデカジエニル、9,12,15-オクタデカトリエニル、9,11,13-オクタデカトリエニル、16-メチル-2-ヘプタデセニル、16-メチル-15-ヘプタデセニル、16-メチル-16-ヘプタデセニル、2-ノナデセニル、18-ノナデセニル、17-メチル-2-オクタデセニル、17-メチル-16-オクタデセニル、17-メチル-17-オクタデセニル、2-エイコセニル、19-エイコセニル、5,8,11,14-イコサテトラエニル、18-メチル-2-ノナデセニル、18-メチル-17-ノナデセニル、18-メチル-18-ノナデセニル、3,7,11,15-テトラメチル-2,6,10,14-ドデカテトラエニルなど）が挙げられ、好ましくはＣ2-10アルケニル基（例えばビニル、アリル、イソプロペニル、2-メチル-1-プロペニル、3-ブテニル、4-ペンテニル、3-メチル-2-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、5-ヘキセニル、4-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、6-ヘプテニル、5-メチル-2-ヘキセニル、5-メチル-3-ヘキセニル、5-メチル-4-ヘキセニル、5-メチル-５-ヘキセニル、5-メチル-2,4-ヘキサジエニル、7-オクテニル、6-メチル-2-ヘプテニル、6-メチル-3-ヘプテニル、6-メチル-4-ヘプテニル、6-メチル-5-ヘプテニル、6-メチル-6-ヘプテニル、8-ノネニル、9-デセニル、3,7-ジメチル-2,6-オクタジエニルなど）が挙げられる。
　該「アルキニル基」の例としては、Ｃ2-20アルキニル基（例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-メチル-2-プロピニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、1-メチル-3-ブチニル、2-メチル-3-ブチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、５-ヘキシニル、1-ヘプチニル、2-ヘプチニル、3-ヘプチニル、4-ヘプチニル、５-ヘプチニル、6-ヘプチニル、2-オクチニル、3-オクチニル、4-オクチニル、５-オクチニル、6-オクチニル、7-オクチニル、2-ノニニル、8-ノニニル、2-デシニル、9-デシニル、2-ウンデシニル、10-ウンデシニル、2-ドデシニル、11-ドデシニル、2-トリデシニル、12-トリデシニル、2-テトラデシニル、13-テトラデシニル、2-ペンタデシニル、14-ペンタデシニル、2-ヘキサデシニル、15-ヘキサデシニル、2-ヘプタデシニル、16-ヘプタデシニル、2-オクタデシニル、17-オクタデシニル、2-ノナデシニル、18-ノナデシニル、2-エイコシニル、19-エイコシニルなど）が挙げられ、好ましくはＣ2-8アルケニル基（例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、2-ブチニル、3-ブチニル、2-ペンチニル、4-ペンチニル、2-ヘキシニル、５-ヘキシニル、2-ヘプチニル、6-ヘプチニル、2-オクチニル、7-オクチニルなど）が挙げられる。
　該「アリール基」の例としては、Ｃ6-10アリール基（例えばフェニル、o-トリル、m-トリル、p-トリル、2-、3-または4-ビフェニル、1-または2-ナフチル、アントリル、フェナントリルなど）が挙げられ、好ましくはフェニル、p-トリル、2-、3-または4-ビフェニル、1-または2-ナフチルなどが挙げられる。
　該「アラルキル基」の例としてはＣ7-10アラルキル基（例えばベンジル、1-フェネチル、2-フェネチル、1-メチル-2-フェネチル、1-メチル-1-フェネチル、1,1-ジメチル-2-フェネチル、1-フェニルプロピル、2-フェニルプロピル、3-フェニルプロピル、1-メチル-2-フェニルプロピル、2-メチル-2-フェニルプロピル、1-フェニルブチル、2-フェニルブチル、3-フェニルブチル、4-フェニルブチル、1-フェニルペンチル、2-フェニルペンチル、3-フェニルペンチル、4-フェニルペンチル、5-フェニルペンチル、3-メチル-3-フェニルブチル、1,1-ジメチル-3-フェニルプロピル、2,2-ジメチル-3-フェニルプロピル、1,1-ジメチル-4-フェニルブチル、2,2-ジメチル-4-フェニルブチル、3,3-ジメチル-4-フェニルブチル、4-メチル-4-フェニルペンチル、1-メチル-5-フェニルペンチル、2-メチル-5-フェニルペンチル、3-メチル-5-フェニルペンチル、4-メチル-5-フェニルペンチル、1-ナフチルメチル、2-ナフチルメチル、1-ナフチルエチル、2-ナフチルエチル、2-ビフェニルメチル、3-ビフェニルメチル、4-ビフェニルメチル、1-アントリルメチル、2-アントリルメチル、9-アントリルメチル、フェナントリルメチルなど）が挙げられ、好ましくはベンジル、2-フェネチル、2-フェニルプロピル、3-フェニルプロピル、2-メチル-2-フェニルプロピル、4-フェニルブチル、1-ナフチルメチル、2-ナフチルメチル、1-ナフチルエチル、2-ナフチルエチル、2-ビフェニルメチル、3-ビフェニルメチル、4-ビフェニルメチルなどが挙げられる。
　該「シクロアルキル基」の例としてはＣ3-8シクロアルキル基（例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）が挙げられる。これらはさらにフェニル基などのアリール基が縮合していてもよく、例えばインダニル、ベンゾシクロヘキシル、ベンゾシクロヘプチル、ベンゾシクロオクチルなどが挙げられる。なかでも、好ましくはシクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、インダニル、ベンゾシクロヘプチルなどが挙げられる。
　また、このシクロアルキル基は、炭素数１または２の直鎖状の原子鎖を介して架橋し、ビシクロ［2.2.1］ヘプチル、ビシクロ［2.2.2］オクチル、ビシクロ［3.2.1］オクチル、ビシクロ［3.3.1］ノニル、ビシクロ［3.2.2］ノニルなど（好ましくは、炭素数１または２の直鎖状の原子鎖を介した架橋を有するシクロヘキシルなど、さらに好ましくは、ビシクロ［2.2.1］ヘプチルなど）の架橋環式炭化水素残基を形成していてもよい。また、アダマンチル基を形成していてもよい。
　該「シクロアルケニル基」の例としてはＣ3-8シクロアルケニル基（例えば2-シクロプロペニル、2-シクロブテニル、2-シクロペンテニル、3-シクロペンテニル、2-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、2-シクロヘプテニル、3-シクロヘプテニル、4-シクロヘプテニル、2-シクロオクテニル、3-シクロオクテニル、4-シクロオクテニルが挙げられる。これらはさらにフェニル基などのアリール基が縮合していてもよく、例えばインデニル、ベンゾシクロヘキセニル、ベンゾシクロヘプテニル、ベンゾシクロオクテニルなどが挙げられる。なかでも好ましくは2-シクロヘキセニル、2-シクロヘプテニル、シクロオクチル、インデニルなどが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、例えば(1)ニトロ基、(2)オキソ基、(3)ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、(4)シアノ基、(5)メチレン基、(6)置換されていてもよい低級アルキル基、(7)置換されていてもよい低級アルケニル基、(8)置換されていてもよい低級アルキニル基、(9)置換されていてもよいアリール基、(10)置換されていてもよいアラルキル基、(11)置換されていてもよいシクロアルキル基、(12)低級ハロアルキル基、(13)エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基、(14)チオカルバモイル基、(15)アシル基、(16)アミジル基、(17)置換されていてもよい水酸基、(18)置換されていてもよいスルファニル基、(19)置換されていてもよいアルキルスルフィニル基、(20)置換されていてもよいアリールスルフィニル基、(21)置換されていてもよいアルキルスルホニル基、(22)置換されていてもよいアリールスルホニル基、(23)エステル化もしくはアミド化されていてもよいスルホン酸基、(24)置換されていてもよいアミノ基、(25)ニトロ基で置換されていてもよいグアニジル基、(26)置換されていてもよい複素環基、(27)アルキレンジオキシ基、(28) イミノ基、(29)置換されていてもよいシクロアルケニル基等が挙げられ、これらの中から選択される１～６個の置換基を置換可能な位置に有してもよい。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の「低級アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルなどのＣ1-4アルキル基が挙げられる。
　該「低級アルキル基」の有していてもよい置換基としては、例えば、(1)ニトロ基、(2)オキソ基、(3)ハロゲン原子（例えば、フッ素、塩素、臭素等）、(4)シアノ基、(5)メチレン基、(6)低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルなどのＣ1-4アルキル基）、(7)低級アルケニル基（例えば、ビニル、アリル(allyl)、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1-ペンテニル、2-ペンテニルなどのＣ2-5アルケニル基）、(8)低級アルキニル基（エチニル、プロパルギル、2-ブチニル、2-ペンチニルなどのＣ2-5アルキニル基）、(9)アリール基（例えば、フェニル、2-、3-または4-トリル、1-または2-ナフチル、2-、3-または4-ビフェニルなどのＣ2-12アリール基）、(10)アラルキル基（例えば、ベンジル、2-フェネチル、3-フェニルプロピル、1-または2-ナフチルメチル、2-、3-または4-ビフェニルメチルなどのＣ7-13アラルキル基）、(11)シクロアルキル基（例えば、シクロプルピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどのＣ3-8シクロアルキル基）、(12)エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基（例えば、カルボキシル基、Ｃ2-18アルコキシカルボニル基（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル、ドデシルオキシカルボニル、ヘキサデシルオキシカルボニルなど）、Ｃ2-18アルケニルオキシカルボニル基（例えば、アリル(allyl)オキシカルボニル、オクタ-2,6-ジエニルオキシカルボニル、ドデカ-2,6,10-トリエニルオキシカルボニルなど）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェノキシカルボニル、１－ナフトキシカルボニル、２－ナフトキシカルボニルなど）、アラルキルオキシカルボニル基（例えば、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル、3-フェニルプロポキシカルボニルなど）、カルバモイル基、前記の低級アルキル基、低級アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基および複素環基（後述するＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」同様のものなど）でＮ－モノ置換されたカルバモイル基、前記の低級アルキル基、低級アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基および複素環基（後述するＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のものなど）でＮ，Ｎ－ジ置換されたカルバモイル基、環状アミノカルバモイル基（例えば、Ｎ-ピロリジルカルボニル、Ｎ-イミダゾリルカルボニル、Ｎ-ピペリジルカルボニル、Ｎ-ピペラジルカルボニル、Ｎ-メチル-Ｎ'-ピペラジルカルボニル、Ｎ-モルホリルカルボニルなど））、(13)置換されていてもよい水酸基（例えば、前記の低級アルキル基、低級アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基で置換されていてもよい水酸基、アルキルスルファニルチオカルボニルオキシ基（例えば、メチルスルファニルチオカルボニルオキシ、エチルスルファニルチオカルボニルオキシ、tert-ブトキシスルファニルチオカルボニルオキシなど）、アラルキルスルファニルチオカルボニルオキシ基（例えば、ベンジルスルファニルチオカルボニルオキシなど）、N-イミダゾリルチオカルボニルオキシ基、N-モルホリルチオカルボニルオキシ基など）、(14)置換されていてもよいスルファニル基（例えば、スルファニル、アルキルスルファニル基（例えば、メチルスルファニル、エチルスルファニル、イソプロピルスルファニル、tert-ブチルスルファニルなど）、アリールスルファニル基（例えば、フェニルスルファニルなど）、アラルキルスルファニル基（例えば、ベンジルスルファニルなど）など）、(15)アルキルスルホニル基（例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニルなど）、(16)アリールスルホニル基（例えば、ベンゼンスルフィニル、トルエンスルフィニルなど）、(17)置換されていてもよいアミノ基（例えば、アミノ基、アルキル基またはアラルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基（例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ、ベンジルメチルアミノなど）、アシルアミノ（例えば、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、ブチリルアミノ、イソブチリルアミノ、バレリルアミノ、イソバレリルアミノ、ピバロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、フェナシルアミノなど）、アルコキシカルボニルアミノ（例えば、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、tert-ブトキシカルボニルアミノなど）、アリールオキシカルボニルアミノ（例えば、フェノキシカルボニルアミノ、ナフチルオキシカルボニルアミノ等）、アラルキルオキシカルボニルアミノ（例えば、ベンジルオキシカルボニルアミノ、フェネチルオキシカルボニルアミノなど）、アルキルスルホニルアミノ（例えば、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、イソプロピルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ等）、アリールスルホニルアミノ（例えばベンゼンスルホニルアミノ、ナフチルスルホニルアミノなど）など）、(18)アルキレンジオキシ基（例えば、メチレンジオキシ、エチレンジオキシなど）、(19)イミノ基などが挙げられ、これらの中から選択される１～４個の置換基を置換可能な位置に有してもよい。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルケニル基」の「低級アルケニル基」としては、例えば、ビニル、アリル(allyl)、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1-ペンテニル、2-ペンテニルなどのＣ2-5アルケニル基が挙げられる。該「低級アルケニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキニル基」の「低級アルキニル基」としては、例えば、エチニル、プロパルギル、2-ブチニル、2-ペンチニルなどの低級アルキニル基などのＣ2-5アルキニル基が挙げられる。該「低級アルキニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアリール基」の「アリール基」としては、例えば、フェニル、2-、3-または4-トリル、1-または2-ナフチル、2-、3-または4-ビフェニルなどのＣ2-12アリール基が挙げられる。該「アリール基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアラルキル基」の「アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、2-フェネチル、3-フェニルプロピル、1-または2-ナフチルメチル、2-、3-または4-ビフェニルメチルなどのＣ7-13アラルキル基が挙げられる。該「アラルキル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいシクロアルキル基」の「シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプルピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどのＣ3-8シクロアルキル基、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[2.2.2]オクチル、ビシクロ[3.2.1]オクチル、ビシクロ[3.3.1]ノニル、ビシクロ[3.2.2]ノニルおよびアダマンチルが挙げられる。該「シクロアルキル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「低級ハロアルキル基」としては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、2-フルオロエチル、2,2-ジフルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、1,1,2,2-テトラフルオロエチル、1,1,2,2,2-ペンタフルオロエチル、3-フルオロプロピル、3,3-ジフルオロプロピル、3,3,3-トリフルオロプロピル、2,2,3,3,3-ペンタフルオロプロピル、4-フルオロブチル、4,4-ジフルオロブチル、4,4,4-トリフルオロブチル、3,3,4,4,4-ペンタフルオロブチル、5-フルオロペンチル、5,5-ジフルオロペンチル、5,5,5-トリフルオロペンチル、4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル、クロロメチル、ジクロロメチル、ブロモメチルなどの１～６個のハロゲン基で置換された低級アルキル基等が挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」としては、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アルケニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、カルバモイル基、Ｎ－モノ置換カルバモイル基、Ｎ，Ｎ－ジ置換カルバモイル基が挙げられる。
　「アルコキシカルボニル基」としては、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル、ドデシルオキシカルボニル、ヘキサデシルオキシカルボニルなどのＣ2-18アルコキシカルボニル基が挙げられる。該「アルコキシカルボニル基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アルケニルオキシカルボニル基」としては、例えばアリル(allyl)オキシカルボニル、オクタ-2,6-ジエニルオキシカルボニル、ドデカ-2,6,10-トリエニルオキシカルボニルなどのＣ2-18アルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。該「アルケニルオキシカルボニル基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アリールオキシカルボニル基」としては、例えばフェノキシカルボニル、１－ナフトキシカルボニル、２－ナフトキシカルボニル等が挙げられる。該「アリールオキシカルボニル基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アラルキルオキシカルボニル基」としては、例えばベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル、3-フェニルプロポキシカルボニルなどのアラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。該「アラルキルオキシカルボニル基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「Ｎ－モノ置換カルバモイル基」の置換基としては、例えば低級アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert－ブチル、ペンチル、ヘキシル等）、低級アルケニル（例、ビニル、アリル(allyl)、イソプロペニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等）、シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等）、アリール（例、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル）、アラルキル（例、ベンジル、フェネチル等）、複素環基（例えば後述するＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のもの等）等が挙げられる。該低級アルキル、低級アルケニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、複素環基は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「Ｎ，Ｎ－ジ置換カルバモイル基」の置換基とは、窒素原子上に２個の置換基を有するカルバモイル基を意味し、上記した「Ｎ－モノ置換カルバモイル」における置換基と同様のものが挙げられる。また、２個の置換基が窒素原子と一緒になって環状アミノを形成する場合もあり、この様な場合の環状アミノカルバモイルとしては、例えばＮ-ピロリジルカルボニル、Ｎ-イミダゾリルカルボニル、Ｎ-ピペリジルカルボニル、Ｎ-ピペラジルカルボニル、Ｎ-メチル-Ｎ'-ピペラジルカルボニル、Ｎ-モルホリルカルボニルなどが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「アシル基」としては、水素原子または前記の「Ｎ－モノ置換カルバモイル基」が窒素原子上に１個有する置換基とカルボニルとが結合したものが挙げられ、例えばホルミル基、アセチル、プロピオニルなどの低級アルカノイル基、またはベンゾイル、ナフトイルなどのアロイル基等が挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい水酸基」の置換基としては、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよい低級アルケニル基、置換されていてもよい低級アルキニル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、エステル化もしくはアミド化されたカルボキシル基、置換されていてもよいアルキルスルファニルチオカルボニル基、置換されていてもよいアラルキルスルファニルチオカルボニル基、置換されていてもよいアルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基、置換されていてもよいN-イミダゾリルチオカルボニル、置換されていてもよいN-モルホリルチオカルボニル、水酸基の保護基等が挙げられる。該「置換されていてもよい低級アルキル基」、「置換されていてもよい低級アルケニル基」、「置換されていてもよい低級アルキニル基」、「置換されていてもよいアリール基」、「置換されていてもよいアラルキル基」、「置換されていてもよいシクロアルキル基」としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」、「置換されていてもよい低級アルケニル基」、「置換されていてもよい低級アルキニル基」、「置換されていてもよいアリール基」、「置換されていてもよいアラルキル基」、「置換されていてもよいシクロアルキル基」と同様のものが挙げられる。該「エステル化もしくはアミド化されたカルボキシル基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としてのエステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」からカルボキシル基を除いたものが挙げられる。該「置換されていてもよいアルキルスルファニルチオカルボニル基」としては、例えばメチルスルファニルチオカルボニル、エチルスルファニルチオカルボニル、tert-ブトキシスルファニルチオカルボニル等があげられ、該「置換されていてもよいアラルキルスルファニルチオカルボニル基」としては、ベンジルスルファニルチオカルボニルオキシ等が挙げられ、該「置換されていてもよいアルキルスルホニル基」としては、メチルスルホニル、エチルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル等が挙げられ、該「置換されていてもよいアリールスルホニル基」としては、ベンゼンスルホニル、ｐ－トルエンスルホニル、ｍ－トルエンスルホニル、ｏ－トルエンスルホニル等が挙げられる。該「置換されていてもよいアルキルスルファニルチオカルボニル基」、「置換されていてもよいアラルキルスルファニルチオカルボニル基」、「置換されていてもよいアルキルスルホニル基」、「置換されていてもよいアリールスルホニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。「置換されていてもよいN-イミダゾリルチオカルボニル」、「置換されていてもよいN-モルホリルチオカルボニル」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。該「水酸基の保護基」としては、例えば２－テトラヒドロピラニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、tert-ブチルジフェニルシリル等が挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいスルファニル基」としては、例えば、スルファニル基、メチルスルファニル、エチルスルファニル、イソプロピルスルファニル、tert-ブチルスルファニル等のアルキルスルファニル基、フェニルスルファニル等のアリールスルファニル基、ベンジルスルファニル等のアラルキルスルファニル基等が挙げられる。該「置換されていてもよいスルファニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアルキルスルフィニル基」としては、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、イソプロピルスルフィニル等が挙げられる。該「置換されていてもよいアルキルスルフィニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアリールスルフィニル基」としては、例えば、ベンゼンスルフィニル、トルエンスルフィニル等が挙げられる。該「置換されていてもよいアリールスルフィニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアルキルスルホニル基」としては、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル等が挙げられる。該「置換されていてもよいアルキルスルホニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアリールスルホニル基」としては、例えば、ベンゼンスルホニル、トルエンスルホニル、ナフチルスルホニル等が挙げられる。該「置換されていてもよいアリールスルホニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「エステル化もしくアミド化されてもよいスルホン酸基」としては、例えば、スルホン酸基、スルホン酸メチル、スルホン酸エチル、スルホン酸アミド、N-メチルスルホン酸アミド等が挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアミノ基」としては、アミノ基、アルキル基またはアラルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、アシルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノあるいはアリールスルホニルアミノ等が挙げられる。
　「アルキル基またはアラルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基」としては、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノ、ベンジルアミノ、ベンジルメチルアミノ等が挙げられる。該「アルキル基またはアラルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アシルアミノ」としては、例えばホルミルアミノ、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、ブチリルアミノ、イソブチリルアミノ、バレリルアミノ、イソバレリルアミノ、ピバロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、フェナシルアミノ等が挙げられる。該「アシルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アルコキシカルボニルアミノ」としては、例えばメトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、tert-ブトキシカルボニルアミノ等が挙げられる。該「アルコキシカルボニルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アリールオキシカルボニルアミノ」としては、例えばフェノキシカルボニルアミノ、ナフチルオキシカルボニルアミノ等が挙げられる。該「アリールオキシカルボニルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アラルキルオキシカルボニルアミノ」としては、例えばベンジルオキシカルボニルアミノ、フェネチルオキシカルボニルアミノ等が挙げられる。該「アラルキルオキシカルボニルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アルキルスルホニルアミノ」としては、例えばメチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、イソプロピルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ等が挙げられる。該「アルキルスルホニルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「アリールスルホニルアミノ」としては、例えばベンゼンスルホニルアミノ、ナフチルスルホニルアミノ等が挙げられる。該「アリールスルホニルアミノ」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、脂肪族単環式含窒素複素環基、芳香族単環式含窒素複素環基、縮合含窒素複素環基、含酸素単環式あるいは縮合複素環基、含硫黄単環式あるいは縮合複素環基等が挙げられる。
　「脂肪族単環式含窒素複素環基」としては、例えばアジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、ピペリジル、ピペラジル、ピラジニル、モルホリル、チオモルホリル、オキサジニル、チアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル等が挙げられる。該「脂肪族単環式含窒素複素環基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「芳香族単環式含窒素複素環基」としては、例えばピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル等が挙げられる。該「芳香族単環式含窒素複素環基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「縮合含窒素複素環基」としては、例えばベンゾピロリジニル、ベンゾイミダゾリジニル、ベンゾピラゾリジニル、ベンゾオキサゾリジニル、ベンゾイソキサゾリジニル、ベンゾチアゾリジニル、ベンゾイソチアゾリジニル、ベンゾピペリジル、ベンゾピペラジル、ベンゾピラジニル、ベンゾモルホリル、ベンゾチオモルホリル、ベンゾオキサジニル、ベンゾチアジニル、ベンゾアゼピニル、ベンゾジアゼピニル、ベンゾオキサゼピニル、ベンゾチアゼピニル、インドリル、イソインドリル、1H-インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、1H-ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、キノリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、フェノキサジニル、フェノチアジニル、フェナジニル、インドリジニル、ピロロピリダジニル、ピロロピリミジニル、ピロロピラジニル、ピロロピリジル、イミダゾピリダジニル、イミダゾピリミジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリジル、チエノピリダジニル、チエノピリミジニル、チエノピラジニル、チエノピリジル、チアゾロピリダジニル、チアゾロピリミジニル、チアゾロピラジニル、チアゾロピリジル、ピリダゾピリダジニル、ピリダゾピリミジニル、ピリダゾピラジニル、ピリダゾピリジル、トリアゾロピリジル等が挙げられる。該「縮合含窒素複素環基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「含酸素単環式あるいは縮合複素環基」としては、例えばオキシラニル、オキセタニル、オキソラニル、ジオキソラニル、フリル、ピラニル、テトラヒドロピラニル、ジオキサニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾピラニル、イソベンゾピラニル、ベンゾジオキサニル、７－オキサビシクロ[2.2.1]ヘプチル) 、９－オキサビシクロ[3.3.1]ノニル等が挙げられる。該「含酸素単環式あるいは縮合複素環基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　「含硫黄単環式あるいは縮合複素環基」としては、例えばチエニル、チオキソラニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、ベンゾチエニル等が挙げられる。該「含硫黄単環式あるいは縮合複素環基」は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「アルキレンジオキシ基」としては、例えば、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ等が挙げられる。
　Ｒ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいシクロアルケニル基」としてはＣ3-8シクロアルケニル基（例えば2-シクロプロペニル、2-シクロブテニル、2-シクロペンテニル、2-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、2-シクロヘプテニル、3-シクロヘプテニル、2-シクロオクテニル、4-シクロオクテニルなど）が挙げられる。該「シクロアルケニル基」の有していてもよい置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい低級アルキル基」の有していてもよい置換基と同様な数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ2で表される「置換されていてもよい複素環基」としては、前記のＲ2で表される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ3、Ｒ4で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。
　Ｒ3、Ｒ4で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様な数、同様なものが挙げられる。
　Ｒ3、Ｒ4で示される「置換されていてもよい複素環基」は、前記のＲ2で表される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のものが挙げられる。
　「Ｒ3、Ｒ4がともにそれらが結合している窒素原子と一緒になって表す置換されていてもよい含窒素複素環」としての含窒素複素環の例としては、炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子、窒素原子等から選ばれたヘテロ原子が１～４個含まれても良い３～８員環の単環性複素環またはこれらに環構造の縮合した２環性または３環性縮合複素環基などが挙げられる。中でも好ましい例は５～７員環の含窒素複素環が挙げられる。特に好ましい例としては、アゼピニル、ピペリジル、ピペラジル、Ｎ-メチルピペラジル、ピロリジル、モルホリル、などが挙げられる。
　「Ｒ3、Ｒ4がともにそれらが結合している窒素原子と一緒になって表す置換されていてもよい含窒素複素環」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様な数、同様なものが挙げられる。
　Ｒ1としては、－ＳＲ2（Ｒ2は水素原子、置換されていてもよい炭化水素基または置換されていてもよい複素環基を示す）が好ましく、なかでもＲ2が置換されていてもよい炭化水素基であるものが好ましい。とりわけ－ＳＲ2において、Ｒ2が置換されていてもよいアルキル基（置換されていてもよいＣ1-8アルキル基）、置換されていてもよいアルケニル基（置換されていてもよいＣ2-8アルケニル基）、置換されていてもよいアラルキル基（置換されていてもよいＣ7-10アラルキル基）、置換されていてもよいシクロアルキル基（置換されていてもよいＣ3-8シクロアルキル基）であるものが好ましい。特に－ＳＲ2において、Ｒ2が置換されていてもよいＣ1-8アルキル基であるものがより好ましく、とりわけハロゲン原子で置換されていてもよいＣ4-8アルキル基であるものが好ましい。
　Ｒ5で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基が好ましい。とりわけ、Ｃ1-6アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ヘキシル、イソヘキシル、2-エチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルペンチル、3,3-ジメチルペンチルが好ましい。
　Ｒ5で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ5で示される「アシル基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としての「アシル基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ5で示される「エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としての「エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」と同様のものが挙げられる。なかでもメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニル、ドデシルオキシカルボニル、ヘキサデシルオキシカルボニルなどのＣ2-18アルコキシカルボニル基が好ましい。
　Ｒ5で示される「置換されていてもよい複素環基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい複素環基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ6で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、フェニル基、ベンジル基等が好ましい。
　Ｒ6で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ6で示される「アシル基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としての「アシル基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ6で示される「エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」とは、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としての「エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ6で示される「置換されていてもよい複素環基」とは、前記のＲ2で表される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のものが挙げられる。
　Ｒ5とＲ6とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環としては、炭素原子以外に窒素原子、酸素原子、硫黄原子等から選ばれた原子を１～３個含んでもよい、飽和または不飽和の、５～８員環の単環式炭素環または複素環、あるいはこれらを含む２環式縮合炭素環または複素環などが挙げられる。例えば、シクロアルキル（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）、シクロアルケニル（例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニルなど）、芳香族炭化水素環（例えば、フェニル、ナフチルなど）、含酸素環（例えば、フリル、オキソラニル、テトラヒドロピラニル、オキセピニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニルなど）、含窒素環（例えば、ピロリジル、ピペリジル、ピリジル、アゼピニル、インドリル、キノリニル、ベンゾアゼピニルなど）、含硫黄環（例えばチエニル、テトラヒドロチオピラニル、ベンゾチエニルなど）などが挙げられ、中でもシクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、フェニルなどが特に好ましい。Ｒ5とＲ6とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ5としては、置換されていてもよい炭化水素基、シアノ基、アシル基、エステル化もしくはアミド化されていてもよいカルボキシル基または置換されていてもよい複素環基が好ましく、特に置換されていてもよい炭化水素基が好ましい。なかでも、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が好ましい。とりわけ、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基が好ましい。特に、Ｃ1-6炭化水素基、とりわけ、Ｃ1-6アルキル基が好ましく、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ヘキシル、イソヘキシル、2-エチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチルが好ましい。
　Ｒ6としては、置換されていてもよい炭化水素基が好ましい。なかでも、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が好ましい。特に、Ｃ1-6炭化水素基、とりわけ、Ｃ1-6アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ヘキシル、イソヘキシル、2-エチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル等、特にメチル、エチル）等が好ましい。
　また、Ｒ5とＲ6とが一緒になって置換されていてもよいベンゼン環、置換されていてもよいシクロヘキセン環を形成する化合物も好ましい例として挙げられる。
　Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としては、例えば、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよいアルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基、置換されていてもよいアルキルカルボニル基、置換されていてもよいアリールカルボニル基等が挙げられる。Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」のなかでも、水酸基が好ましい。
　Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよい炭化水素基の「炭化水素基」としては、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、ベンジル基等が好ましい。「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよい炭化水素基の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよいアルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基の例としては、例えば置換されていてもよいＣ1-4アルキルスルホニル基、置換されていてもよいベンゼンスルホニル基等が挙げられ、なかでもメタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基等が好ましい。
　Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよいアルキルカルボニル基、置換されていてもよいアリールカルボニル基としては、例えば置換されていてもよいＣ1-4アルキルカルボニル基、置換されていてもよいベンゾイル基等が挙げられ、なかでもアセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等が好ましい。
　Ｒ7で示される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよいアルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基、置換されていてもよいアルキルカルボニル基および置換されていてもよいアリールカルボニル基の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ8およびＲ9で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、フェニル基、ベンジル基等が好ましい。
　Ｒ8およびＲ9で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ5とＲ8とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環としては、炭素原子以外に窒素原子、酸素原子、硫黄原子等から選ばれた原子を１～３個含んでもよい、飽和または不飽和の、５～８員環の単環式炭素環または複素環、あるいはこれらを含む２環式縮合炭素環または複素環などが挙げられる。例えば、シクロアルキル（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）、シクロアルケニル（例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニルなど）、芳香族炭化水素環（例えば、フェニル、ナフチルなど）、含酸素環（例えば、フリル、オキソラニル、テトラヒドロピラニル、オキセピニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニルなど）、含窒素環（例えば、ピロリジル、ピペリジル、ピリジル、アゼピニル、インドリル、キノリニル、ベンゾアゼピニルなど）、含硫黄環（例えばチエニル、テトラヒドロチオピラニル、ベンゾチエニルなど）などが挙げられ、中でもシクロヘキセニル、フェニルなどが特に好ましい。Ｒ5とＲ8とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ8とＲ9とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環としては、炭素原子以外に窒素原子、酸素原子、硫黄原子等から選ばれた原子を１～３個含んでもよい、飽和または不飽和の、５～８員環の単環式炭素環または複素環、あるいはこれらを含む２環式縮合炭素環または複素環などが挙げられる。例えば、シクロアルキル（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど）、シクロアルケニル（例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニルなど）、芳香族炭化水素環（例えば、フェニル、ナフチルなど）、含酸素環（例えば、フリル、オキソラニル、テトラヒドロピラニル、オキセピニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニルなど）、含窒素環（例えば、ピロリジル、ピペリジル、ピリジル、アゼピニル、インドリル、キノリニル、ベンゾアゼピニルなど）、含硫黄環（例えばチエニル、テトラヒドロチオピラニル、ベンゾチエニルなど）などが挙げられる。Ｒ8とＲ9とが一緒になって形成する環状炭化水素または複素環は置換基を有していてもよく、その置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ8およびＲ9としては、置換されていてもよい炭化水素基が好ましい。なかでも、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が好ましい。とりわけ、Ｃ1-6アルキル基、フェニル基、ベンジル基等が好ましい。
　Ｒ10は、水素原子、－ＺＲ15または－Ｐ（Ｏ）Ｒ16Ｒ17を示す。
　－ＺＲ15のＲ15で表される「置換されていてもよい炭化水素基」の炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基等が好ましい。
　Ｒ15で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。なかでも、置換されていてもよいＣ1-4アルキル基、置換されていてもよいＣ2-4アルケニル基、フッ素、塩素、臭素などのハロゲン原子、Ｃ1-4アルコキシ基、Ｃ1-4ハロアルキル基、カルボキシル基、カルボキサミド基などが挙げられ、特に好ましい置換基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ビニル基、フッ素、塩素、臭素、メトキシ基、エトキシ基などが挙げられる。
　－ＺＲ15のＲ15で表される「置換されていてもよい複素環基」とは、前記のＲ2で表される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよい複素環基」と同様のものが挙げられる。なかでも置換されていてもよいチエニル基、置換されていてもよいキノリル基、置換されていてもよいベンゾオキサジアゾリル基、置換されていてもよいピリジル基、置換されていてもよいベンゾチアジアゾリル基、置換されていてもよいベンゾチエニル基、置換されていてもよいオキサゾリジニル基、置換されていてもよいベンゾジオキサニル基、置換されていてもよいジベンゾフラニル基、モルホリル基が好ましく、特に置換されていてもよいチエニル基、置換されていてもよいベンゾチアジアゾリル基、置換されていてもよいピリジル基が好ましい例として挙げられる。
　Ｚは－ＳＯ2－、－ＳＯ－、－ＣＯＮＲ18ＳＯ2－（Ｒ18はＣ1-6アルキル）、－ＣＯＮＲ19－（Ｒ19はＣ1-6アルキル）または－ＣＯ－を示す。Ｒ18およびＲ19で表されるＣ1-6アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよい炭化水素基」としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が好ましい。特に、メチル、エチル、フェニル、ベンジルなどが好ましい。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよい水酸基」としては、例えば、置換されていてもよい炭化水素基が挙げられる。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよい炭化水素基の「炭化水素基」としては、Ｃ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基等が好ましい。特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、フェニル、ベンジル等が好ましい。「置換されていてもよい水酸基」の置換基としての置換されていてもよい炭化水素基の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよい水酸基」としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-10アリール基等で置換された水酸基が好ましい。
　Ｒ16およびＲ17で表される「置換されていてもよいアミノ基」としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素」の置換基としての「置換されていてもよいアミノ基」と同様のものが挙げられる。好ましくは、メチル、エチル、フェニル、ベンジル等が挙げられる。
　Ｒ16およびＲ17としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ1-6アルキル基で置換された水酸基、Ｃ6-10アリール基で置換された水酸基等が好ましく、特にメチル、エチル、フェニル、ベンジル、メチルで置換された水酸基、エチルで置換された水酸基、フェニルで置換された水酸基等が好ましい。
　Ｒ10としては－ＺＲ15（ＺおよびＲ15は前記と同意義を示す）が好ましい。なかでも、Ｚが－ＳＯ2－または－ＣＯ－であり、Ｒ15が置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよい複素環基であるものが好ましい。とりわけ、Ｚが－ＳＯ2－または－ＣＯ－であり、Ｒ15が置換されていてもよいＣ6-10アリール基、置換されていてもよいＣ7-10アラルキル基、置換されていてもよい複素環基であるものが好ましい。特に、Ｚが－ＳＯ2－であり、Ｒ15がメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ビニル基、フッ素、塩素、臭素、メトキシ基、エトキシ基などで置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、チエニル基、ベンゾチアジアゾリル基、またはＺが－ＣＯ－であり、Ｒ15がメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ビニル基、フッ素、塩素、臭素、メトキシ基、エトキシ基などで置換されていてもよいピリジル基等が好ましい。
　Ｒ11は、水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を示す。Ｒ11で表される「置換されていてもよい炭化水素基」の炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ7-10アラルキル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-6アルキル基、ベンジル基等が好ましく、特にＣ1-4アルキル基等が好ましい。Ｒ11で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ11としては、水素原子が好ましい。
　Ｒ10とＲ11が一緒になって形成してもよい含窒素複素環とは、すなわち、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表される部分構造が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 〔式中、Ｂ環は置換されていてもよい５～８員環を示す〕で表される５～８員の含窒素複素環であるものを意味する。より具体的には、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 〔式中、Ｒ17は前記と同意義を、Ｂ1環～Ｂ12環はさらに置換基を有していてもよい含窒素複素環を示す〕で表される環を意味する。なお、Ｂ1環～Ｂ12環が有していてもよい置換基とは、前記のＲ15で示される「置換されていてもよい炭化水素基」が有していてもよい置換基と同様のものを意味する。
　Ｒ10とＲ11が一緒になって形成してもよい含窒素複素環としては、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 〔式中、Ｂ2環およびＢ3環はさらに置換基を有していてもよい含窒素複素環を示す〕で表される６または７員の含窒素複素環が好ましい。
　Ｒ12およびＲ13で表される「置換されていてもよい炭化水素基」の炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ7-10アラルキル基が好ましい。Ｒ12およびＲ13で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。
　Ｒ12およびＲ13がともにそれらが結合している窒素原子と一緒になって示す置換されていてもよい含窒素複素環の例としては前記の「Ｒ3、Ｒ4がともにそれらが結合している窒素原子と一緒になって表す置換されていてもよい含窒素複素環」の含窒素複素環と同様のものが挙げられる。特に好ましい例としては、ピペリジル、ピペラジル、Ｎ-メチルピペラジル、ピロリジル、モルホリルなどが挙げられる。
　「Ｒ12、Ｒ13がともにそれらが結合している窒素原子と一緒になって表す置換されていてもよい含窒素複素環」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様な数、同様なものが挙げられる。
　Ｒ12としては、水素原子、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が好ましい。とりわけ、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ7-10アラルキル基が好ましい。
　Ｒ13としては、水素原子が好ましい。
　Ｒ14で表される「置換されていてもよい炭化水素基」の炭化水素基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」としての炭化水素基と同様のものが挙げられる。好ましくは、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が挙げられる。なかでも、Ｃ1-4アルキル基、Ｃ7-10アラルキル基が好ましい。Ｒ14で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基としては、前記のＲ2で示される「置換されていてもよい炭化水素基」の置換基と同様の数、同様のものが挙げられる。Ｒ14で表される－ＺＲ15は、Ｒ10で表される－ＺＲ15と同様のものが挙げられる。
　Ｒ14としては、置換されていてもよい炭化水素基が好ましい。なかでも、Ｃ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ3-8シクロアルケニル基等が好ましく、とりわけ、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ7-10アラルキル基が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 が好ましく、なかでも
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 とりわけ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 が好ましく、なかでも
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 が好ましい。
　化合物（I）としては、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 〔式中、各記号は前記と同意義を示す〕で表される化合物〔化合物（I’）〕が好ましく用いられる。なかでも、Ｒ1が、－ＳＲ2、
　Ｒ2が、それぞれ置換されていてもよいＣ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ7-10アラルキル基またはＣ3-8シクロアルキル基（好ましくは、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ4-8アルキル基）、
　Ｒ5が、それぞれ置換されていてもよいＣ1-12アルキル基、Ｃ2-12アルケニル基、Ｃ2-12アルキニル基、Ｃ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基またはＣ3-8シクロアルケニル基（好ましくはＣ1-12アルキル基）、
　Ｒ6が、それぞれ置換されていてもよいＣ1-8アルキル基、Ｃ2-8アルケニル基、Ｃ6-10アリール基またはＣ7-10アラルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）、
　Ｒ10が、－ＳＯ2－Ｒ15、
　Ｒ15が、それぞれ置換されていてもよいＣ6-10アリール基、Ｃ7-10アラルキル基または５～６員複素環基（好ましくは、Ｃ1-6アリール基および／またはハロゲン原子でそれぞれ置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、チエニル基またはベンゾチアジアゾリル基）、および
　Ｒ11が、水素原子である化合物が好ましく用いられる。
　上記化合物（Ｉ）の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
　無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
　有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
　無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。
　有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
　塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
　化合物（I）は、水和物であってもよく、非水和物であってもよい。また、本発明で用いられる化合物（I）は、骨格中に１つの不斉炭素を持ちうるため２種の光学異性体が存在し得るが、それらの各異性体、およびそれらの混合物も本発明に含まれる。またその置換基に不斉炭素、不飽和結合を有する場合も同様に立体異性体、幾何異性体を生ずるが、それらの各異性体、およびそれらの混合物も本発明に含まれる。
　化合物（I）は、その構造中に硫黄原子を有し、これらは酸化剤（例、過酸化水素またはm-クロロ過安息香酸など）を用いて常法に従い酸化されていてもよく、スルホキシド、スルホン化された化合物も本発明に含まれる。化合物（I）は、その構造中または置換基にアミド、イミド、アミジノ、グアニジノあるいはウレイド基を有することがあるが、これらはその２重結合が異性化した共鳴構造をとる場合があるが、これら共鳴構造化合物も本発明に含まれる。
　化合物（I）は、WO 02/92606号公報に記載の方法またはこれに準じた方法により製造できる。工程（1）において使用可能なイミダゾチアジン誘導体の例としては、担体と結合可能となるように末端にカルボキシル基が導入された、5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸が挙げられる。当該化合物は、WO 02/92606号公報の実施例21-10記載の方法またはこれに準じた方法により製造できる。
　工程（1）として、（i）被験物質非存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量を測定し、比較する場合の例を以下に記載する。
　まず、適当な緩衝液中で、Hsp90と種々の濃度の被験物質とを混合し、一定時間反応させる。被験物質がHsp90との結合性を有する場合には、被験物質とHsp90の複合体が形成される。次いで当該混合液に固相化イミダゾチアジン誘導体を添加し、一定時間反応させる。この反応においては、被験物質との複合体を形成していないHsp90が固相化イミダゾチアジン誘導体と結合する。反応終了後、緩衝液で固相化イミダゾチアジン誘導体を洗浄し、イミダゾチアジン誘導体と結合していないHsp90を除去する。洗浄後の固相化イミダゾチアジン誘導体と緩衝液を混合した後、熱処理して、イミダゾチアジン誘導体に結合したHsp90を緩衝液中に溶出する。被験物質非存在下でも上記と同様の操作を行い、溶出液を得る。
　次いで、溶出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動終了後にゲルを染色すると、イミダゾチアジン誘導体に結合したHsp90がバンドとして検出される。被験物質非存在下および被験物質存在下で得られたHsp90のバンド（Hsp90の蛋白質量）を比較する。被験物質非存在時よりも被験物質存在時で得られたHsp90の蛋白質量が少ない場合、当該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有する、すなわち、Hsp90結合活性を有する、と判断できる。
　次に、工程（1）として、（i）被験物質非存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量とを測定し、比較する場合の例を以下に記載する。
　まず、放射性同位元素としてトリチウムを用いてイミダゾチアジン誘導体をラベルし、ラベル化イミダゾチアジン誘導体を得る。適当な緩衝液中で、シンチレーターを含有するビーズに結合させた固相化Hsp90と、ラベル化イミダゾチアジン誘導体および種々の濃度の被験物質とを混合し、一定時間反応させる。被験物質がHsp90との結合性を有する場合には、被験物質は固相化Hsp90に結合する。一方、被験物質と結合していない固相化Hsp90にはラベル化イミダゾチアジン誘導体が結合する。反応終了後、固相化Hsp90に結合したラベル化イミダゾチアジン誘導体の放射活性を、シンチレーターカウンターを用いて測定し、被験物質非存在下および被験物質存在下で得られた放射活性を比較する。被験物質非存在時よりも被験物質存在時での放射活性が少ない場合、当該被験物質はHsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する阻害活性を有する、すなわち、Hsp90結合活性を有する、と判断できる。
　上記の方法の他、本発明の工程（１）としては、表面プラズモン共鳴測定により、固相化Hsp90と被験物質の結合量を測定する工程を含むものが挙げられる。具体的には、例えば、表面プラズモンセンサー（ビアコア社製 ビアコア3 0 0 0等） のセンサーチップ表面に、Hsp90を固定化後、チップ表面に適当な緩衝液に溶解した被験物質を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、Hsp90結合活性を有する被験物質を選抜する。
　工程（１）においてHsp90結合活性を有する被験物質を選抜し、該被験物質を更に工程（２）および（３）に供することにより、優れた細胞保護剤を得ることができる。
　工程（２）では、ヒートショック蛋白質の発現誘導活性を有する被験物質の選抜を目的として、被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する。
　ヒートショック蛋白質の発現誘導活性の測定は、ヒートショック蛋白質またはヒートショック蛋白質をコードするｍＲＮＡを指標として、ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞あるいは、細胞抽出物の系を用いて測定することができる。工程（２）の好ましい例としては、ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程が挙げられる。工程（２）におけるヒートショック蛋白質とは、例えば、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上である。
　工程（２）として、ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する場合の例を以下に記載する。
　ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞としてはHsp70の発現能を有するヒト正常関節軟骨細胞を使用する。まず、増殖培地中で単層培養により増殖させた後に、多穴プレートに播種してさらに培養する。被験物質およびIL-1βを加え、一定時間培養する。培養終了後、緩衝液でプレートを洗浄し、次いで細胞溶解用緩衝液を添加する。セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、細胞溶解用緩衝液を回収する。回収した細胞溶解用緩衝液を、サンプル用緩衝液と混合して95℃で5分間熱処理した後、SDSポリアクリルアミド電気泳動を行う。泳動終了後、ゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜に吸着させ、1次抗体として抗Hsp70抗体を、2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗マウスIgG抗体を用いたウエスタンブロット法によって、Hsp70の蛋白質量を測定する。
　IL-1βの刺激存在下でヒト正常関節軟骨細胞中のHsp70の蛋白質量を増加させる被験物質は、ヒートショック蛋白質発現誘導活性を有すると判断することができる。
　ところで、Hsp90／HSF-1複合体を分離する活性を有する化合物は、ヒートショック蛋白質の発現を誘導することが知られている（非特許文献１）。従って、工程（２）における被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性は、被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定することにより測定できる。
　HSF-1は、熱ショック転写因子（heat shock factor-1）を意味し、Hsp90と複合体を形成するものであれば特に限定されない。
　HSF-1としては、各種動物、特にヒト由来のものが使用できる。ヒトHSF-1としては、例えば、ヒトHSF-1（GenBank accession No. NP_005517）が使用できる。また、本発明のHSF-1には、HSF-1蛋白質の塩、修飾されたHSF-1蛋白質も含まれる。
　工程（２）としてHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する場合の例を以下に記載する。
　まず、ヒト正常関節軟骨細胞を、蛋白質分解酵素阻害剤を含有する緩衝液で溶解した後、溶解液を遠心分離し、得られた上清をHsp90/HSF-1複合体を含有するライセートとして使用する。適当な緩衝液で希釈した上記ライセートに、被験物質または緩衝液を添加して一定時間反応させる。被験物質がHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を有する場合は、Hsp90とHSF-1が解離する。次いで、反応液に抗Hsp90抗体またはコントロール抗体を添加し、免疫沈降反応を行う。反応系にHsp90／HSF-1複合体が存在する場合は、抗Hsp90抗体／Hsp90／HSF-1複合体が形成される。また、反応系にHSF-1と解離したHsp90が存在する場合は、抗Hsp90抗体／Hsp90複合体が形成される。
　次いで、プロテインA/Gアガロースを添加して一定時間反応させ、抗体をプロテインA/Gアガロースに吸着させる。次いで遠心分離によってプロテインA/Gアガロースを回収し、緩衝液で洗浄した後、サンプル用緩衝液と混合して5分間熱処理する。プロテインA/Gアガロースに結合した蛋白質が溶出されるので、溶出液をSDSポリアクリルアミド電気泳動に供する。
　泳動終了後、ゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜に吸着させ、1次抗体として抗HSF-1抗体又は抗Hsp90抗体を、2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗IgG抗体を用いたウエスタンブロット法を行い、Hsp90およびHSF-1の蛋白質をバンドとして検出する。　被験物質非存在下および被験物質存在下で検出される蛋白質のバンド（蛋白質量）を比較する。被験物質非存在時よりも被験物質存在時でのHSF-1の蛋白質量が少ない場合、被験物質はHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を有する、すなわち、ヒートショック蛋白質発現誘導活性を有する、と判断できる。
　工程（２）においてヒートショック蛋白質の発現誘導活性を有する被験物質を選抜し、該被験物質を更に工程（１）および（３）に供することにより、優れた細胞保護剤を得ることができる。
　工程（３）では、Hsp90クライアント蛋白質の分解誘導活性を有する被験物質の選抜を目的として、被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する。
　Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性の測定は、クライアント蛋白質の発現能を有する細胞あるいは、細胞抽出物の系を用いて測定することができる。工程（３）の好ましい例としては、例えば、（i）被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較する工程が挙げられる。
　Hsp90クライアント蛋白質は、細胞内での安定な存在や正常な機能のためにHsp90と複合体を形成する性質を有する蛋白質であれば特に限定されず、例えば、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上が挙げられる。Glucocorticoid receptor（グルココルチコイド レセプター）としては、各種動物、特にヒト由来のもの、例えば、ヒトGlucocorticoid receptor（GENBANK Accession No. AAB20466）が挙げられる。
　Ａｋｔは、セリン／スレオニンキナ－ゼの一種（EC 2.7.11.1）である。Ａｋｔとしては、各種動物、特にヒト由来のもの、例えば、ヒトＡｋｔ（GENBANK Accession No. NP_001014432）が挙げられる。
　cycline dependent kinase 4（サイクリン依存性キナーゼ４）は、サイクリンＤと複合体を形成することにより活性化されるキナーゼである。cycline dependent kinase 4としては、各種動物、特にヒト由来のもの、例えば、ヒトcycline dependent kinase 4（GENBANK Accession No. NP000066）が挙げられる。さらにHsp90クライアント蛋白質としては、EGF-R(epidermal growth factor receptor)、IGF1R（insulin-like growth factor I receptor）、RIP（receptor-interacting protein）などが挙げられる。
　Hsp90クライアント蛋白質量は例えば、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により測定することができる。
　工程（３）として（i）被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較する場合の例を以下に記載する。
　まず、ヒト正常関節軟骨細胞を培地に懸濁し、多穴プレートに播種して、一定時間培養する。この培養細胞を、Hsp90のクライアント蛋白質の発現能を有する細胞として使用する。次いで、培養液に被験物質を添加して、細胞を一定時間培養する。培養終了後、細胞を緩衝液で１回洗浄し、細胞溶解用緩衝液を添加して、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、この細胞溶解用緩衝液を回収する。回収した細胞溶解用緩衝液をサンプル用緩衝液と混合して熱処理した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に供する。
　泳動終了後、ゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜に吸着させて、ウエスタンブロット法でクライアント蛋白質をバンドとして検出する。クライアント蛋白質がGlucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4である場合は、ウエスタンブロット法では、それぞれの蛋白質に対する抗体を1次抗体として使用する。2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗IgG抗体を使用する。
　被験物質非存在下および被験物質存在下で検出される蛋白質のバンド（蛋白質量）を比較する。被験物質非存在下および被験物質存在下でのクライアント蛋白質の蛋白質量に実質的な差異がない場合、クライアント蛋白質の分解誘導活性を示さないと判断できる。一方、被験物質非存在時よりも被験物質存在時でのクライアント蛋白質の蛋白質量が少ない場合、被験物質はHsp90クライアント蛋白質の分解誘導活性を有すると判断できる。
　工程（３）においてHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない被験物質を選抜し、該被験物質を更に工程（１）および（２）に供することにより、優れた細胞保護剤を得ることができる。
　本発明においては、各工程を実施する順序は特に限定されない。また、２つあるいは３つの工程を同時に実施してもよい。また、工程（２）および（３）は、蛋白質の発現能を有する細胞を用いて実施することが好ましい。具体的には、工程（２）がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程であり、かつ工程（３）がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程であることが好ましい。
　また、本発明の細胞保護剤のスクリーニング方法は、被験物質に対して以下の工程（１）～（４）を実施する方法であってもよい。（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程、および（４）Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程；
　工程（１）～（３）の目的および実施の形態は上記と同様である。各工程を実施する順序は特に限定されない。また、工程（１）～（３）の２つあるいは３つの工程を同時に実施してもよい。工程（４）は、工程（１）～（３）の測定結果に基づいて、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程である。
　本発明のスクリーニング方法により、細胞傷害性が弱いか又は細胞傷害性を示さない、優れた細胞保護剤、すなはち、「Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性が弱いか又は該活性を示さない細胞保護剤」或いは「Hsp90結合活性及びHsp90／HSF-1複合体分離活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性が弱いか又は該活性を示さない細胞保護剤」を得ることができる。当該細胞保護剤は、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側策硬化症小脳変性、色素性網膜炎など）、脳疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱随疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形関節症、慢性関節リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植拒絶腎など）、肝疾患（例、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、皮膚疾患、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、癌性疾患（例、乳癌、精巣腫瘍、卵巣癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、代謝性疾患（例、糖尿病、高脂血症、動脈硬化など）または炎症性疾患（例、下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑など）の予防・治療剤として有用である。
〔細胞保護剤のスクリーニング用キット〕
　本発明は、上記スクリーニング方法のために好適に用いることができるスクリーニング用キット、特に、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤のスクリーニング用キットを提供する。
　スクリーニング用キットの一例は、（1）Hsp90、（２）ヒートショック蛋白質発現誘導活性の測定用試薬、（３）イミダゾチアジン誘導体、および（４）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含むものである。Hsp90は、固相化されていてもよい。ヒートショック蛋白質は特に限定されないが、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上であることが好ましい。ヒートショック蛋白質発現誘導活性の測定用試薬としては、例えば、ヒートショック蛋白質またはヒートショック蛋白質をコードするｍＲＮＡの、定量用または検出用試薬が挙げられ、具体的には例えば、ヒートショック蛋白質に対する抗体、エライザキットに含まれる試薬、mRNA測定試薬、Heat shock elementを用いたレポーターアッセイ用試薬などが挙げられる。イミダゾチアジン誘導体は、固相化されていてもよい。Hsp90クライアント蛋白質は特に限定されないが、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上であることが好ましい。また、Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬としては、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体が好ましい。スクリーニング方法が蛋白質の発現能を有する細胞を用いる方法である場合、当該スクリーニング用キットは、さらに、(５)ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞、および（６）Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を含むことが好ましい。
　また、本発明のスクリーニング用キットの別な例は、（１）Hsp90／HSF-1複合体、（２）Hsp90、（３）Hsp90の定量用試薬、（４）イミダゾチアジン誘導体、および（５）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬、を含むものである。Hsp90の定量用試薬としては、Hsp90に対する抗体が好ましい。スクリーニング方法が蛋白質の発現能を有する細胞を用いる方法である場合、当該スクリーニング用キットは、さらに（６）Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を含むことが好ましい。
〔スクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質〕
　本発明は、上記のスクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない物質を提供する。該物質とは、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、抗体、核酸、ワクチン、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などである。該物質は、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物または合成化合物の塩であってもよい。該物質は、そのままで細胞保護剤あるいは医薬として使用することができる。また、該物質と他の成分との混合物を、細胞保護剤あるいは医薬として使用することができる。
　本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質としては、前記式（Ｉ）のイミダゾチアジン誘導体が挙げられる。該イミダゾチアジン誘導体としては、例えば、N-[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-8-[(4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル)スルファニル]-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド）が挙げられる。
　なお、本発明のスクリーニング方法の工程（１）が、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものであり、当該イミダゾチアジン誘導体として前記式（Ｉ）の化合物またはその塩を使用する場合、スクリーニング方法において使用した当該イミダゾチアジン誘導体またはその塩自体は、「本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質」からは除かれる。
〔細胞保護剤および医薬〕
　本発明は、上記スクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質を含有してなる細胞保護剤、および該細胞保護剤を含有してなる医薬を提供する。
　上記細胞保護剤および医薬は、各種疾患、特に臓器傷害が関与する疾患および炎症の予防・治療剤として有用である。疾患とは、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側策硬化症小脳変性、色素性網膜炎など）、脳疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱随疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形関節症、慢性関節リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、移植拒絶腎など）、肝疾患（例、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、皮膚疾患、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、癌性疾患（例、乳癌、精巣腫瘍、卵巣癌、食道癌、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）、代謝性疾患（例、糖尿病、高脂血症、動脈硬化など）または炎症性疾患（例、下垂体膿瘍、甲状腺炎、腹膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、結節性紅斑など）などである。
　上記細胞保護剤および医薬は、公知の方法によって医薬組成物とし、種々の剤形で、上記疾患の予防・治療剤などとして、哺乳動物（例、ヒト、サル等）に経口的または非経口的に投与しうる。具体的には、上記化合物を、薬学的に許容される担体と混合し、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして経口投与、または、注射剤、坐剤または舌下錠などとして、静脈内、皮下および筋肉内などに非経口投与する。また、舌下錠、マイクロカプセル等の徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。
　上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
　上記医薬組成物に含まれる有効成分（上記スクリーニング方法、またはスクリーニング用キットを用いて得られる、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質）の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されない。例えば、当該医薬組成物を心不全などの治療に用いる場合は、通常、成人に対して一日につき該有効成分を、約0.1～100mg、好ましくは約1.0～50mg、より好ましくは約1.0～20mg投与すればよい。
　以下に、本発明のスクリーニング方法を更に詳しく説明する。
（参考例１）
１．被験物質の調製
　以下（ｉ）～（ｖ）の反応を行い、被験物質としてイミダゾチアジン誘導体（化合物名：N-[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-8-[(4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル)スルファニル]-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド 、以下「化合物Ａ」という）を合成した。
（ｉ）N-[(4Z)-5-(ジクロロメチレン)-2-オキソイミダゾリジン-4-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミドの合成：
　２-アミノ-３，３-ジクロロアクリロニトリル（31.9 g, 0.233 mol、純正化学社製）をジエチルエーテル（300 ml、以下エーテルと略すことがある。）に溶解し、室温で撹拌しながらp-トルエンスルホニルイソシアネート（36.0 ml,  0.233 mol、純度98％、東京化成社製）を滴下後、室温で14時間撹拌した。生成した沈澱物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥して標題化合物の淡黄色の粉末を得た。
1H NMR (CDCl3-DMSO-d6＝9：１)：δ 2.44 (3H, s), 7.34 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.90 (2H, d, J= 8.2 Hz), 8.19 (1H, brs), 10.2 (1H, br).
元素分析値：C11H9N3O3SCl2として
計算値（%）： C, 39.54; H, 2.71; N, 12.57; S, 9.60; Cl, 21.22.
実測値（%）： C, 39.62; H, 2.48; N, 12.66; S, 9.63; Cl, 21.00.
（ｉｉ）3-[[(5Z)-5-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-2-オキソイミダゾリジン-4-イリデン](スルファニル)メチルスルファニル]プロパン酸エチルの合成：　上記（ｉ）で合成したN-[(4Z)-5-(ジクロロメチレン)-2-オキソイミダゾリジン-4-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド（45.5 g, 0.136 mol）に炭酸カリウム（65.8 g, 0.476 mol）にN,N-ジメチルホルムアミド（450 ml、以下DMFと略すことがある。）を加え、室温で撹拌しながら3-メルカプトプロピオン酸エチル（35.9 ml, 0.272 mol）を約2時間かけて滴下した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、さらに80℃で7時間撹拌した。反応液を濃縮乾固後、残渣に2N塩酸（340 ml）およびメタノール（100 ml）を加えて混和し、生成した沈澱物を濾取し、50%メタノール水およびエタノールで洗浄後、乾燥して標題化合物の橙褐色の粉末を得た。
1H NMR (DMSO-d6)： δ 1.18 (3H, t, J= 7.1 Hz), 2.33 (3H, s), 2.63 (2H, t, J= 7.1 Hz), 3.30 (1H, s), 3.32 (2H, t, J= 7.1 Hz), 4.07 (2H, q, J= 7.1 Hz), 7.28 (2H, d, J= 8.1 Hz), 7.74 (2H, d, J= 8.1 Hz), 8.75 (1H, brd, J= 2 Hz), 9.61 (1H, brs).
元素分析値： C21H27N3O7S3として
計算値（%）： C, 47.62; H, 5.14; N, 7.93; S, 18.16.
実測値（%）： C, 47.51; H, 4.84; N, 8.19; S, 18.12.
（ｉｉｉ）3-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]プロパン酸エチルの合成：
　上記（ｉｉ）で合成した3-[[(5Z)-5-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-2-オキソイミダゾリジン-4-イリデン](スルファニル)メチルスルファニル]プロパン酸エチル（40 g, 純度約50％、約43 mmol）をTHF（600 ml）に溶解し、3-クロロ-2-ブタノン（9.1 ml, 86 mmol）およびトリエチルアミン（35.8 ml, 0.258 mol）を加えて室温で1.5時間撹拌後、8時間加熱還流した。反応液を濃縮後、残渣を酢酸エチル（600 ml）で希釈し、2%炭酸水素ナトリウム水溶液、水、0.1N塩酸、水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮乾固して標題化合物を含む褐色油状物を得た。
　上記の褐色油状物をトルエン（580 ml）および無水酢酸（11.4 ml）に溶解し、p-トルエンスルホン酸１水和物（8.98 g, 47 mmol）を加えて100℃で2時間加熱撹拌した。反応液を濃縮後、残渣を酢酸エチル（700 ml）で希釈し、水で四回および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下に溜去し、残渣にメタノールを加え、生成した沈澱物を濾取し、メタノールで洗浄後、乾燥して標題化合物の赤紫色粉末を得た。
1H NMR (CDCl3)： δ 1.27 (3H, t, J= 7.2 Hz), 1.79 (3H, brq, J= 0.8 Hz), 2.26 (3H, brq, J= 0.8 Hz), 2.42 (3H, s), 2.70 (2H, t, J= 7.5 Hz), 3.20 (2H, t, J= 7.5 Hz), 4.17 (2H, q, J= 7.2 Hz), 7.29 (2H, d, J= 8.3 Hz), 7.84 (2H, d, J= 8.3 Hz), 9.61 (1H, br).
元素分析値：C20H23N3O5S3 として
計算値（%）： C, 49.88; H, 4.81; N, 8.72; S, 19.97.
実測値（%）： C, 49.78; H, 5.03; N, 8.68; S, 20.00.
（ｉｖ）N-[(1Z)-8-メルカプト-5,6-ジメチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミドを以下の方法により合成した。
　上記（ｉｉｉ）で合成した3-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]プロパン酸エチル（5.00 g, 10.4 mmol）をTHF（50 ml）およびメタノール（50 ml）に溶解し、水酸化カリウム（2.74 g, 41.5 mmol）を加えて室温で４５分間撹拌した。反応液に１N塩酸（42 ml）を加えて混和し、室温で30分間撹拌した。生成した沈澱物を濾取し、50%メタノール水で洗浄後、乾燥して標題化合物の赤色粉末を得た。
1H NMR (CDCl3-DMSO-d6＝９：１)： δ 1.81 (3H, s), 2.42 (3H, d, J= 0.5 Hz), 2.45 (3H, s), 7.35 (2H, d, J= 8.1 Hz), 7.88 (2H, d, J= 8.3 Hz), 12.82 (2H, br).
元素分析値：C15H15N3O3S3 として
計算値（%）： C, 47.22; H, 3.96; N, 11.01; S, 25.22.
実測値（%）： C, 47.20; H, 3.90; N, 10.73; S, 25.19.
（ｖ）N-[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-8-[(4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル)スルファニル]-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド （化合物Ａ）の合成：
　v-1：
　反応試薬として、メタンスルホン酸 4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチルエステルを合成した。まず、4,4,5,5,5-ペンタフルオロ-1-ペンタノール（1.00 g, 5.61 mmol）のテトラヒドロフラン（20.0 ml）溶液に、メタンスルホニル クロリド（0.652 ml, 8.42 mmol）とトリエチルアミン（1.57 ml, 11.2 mmol）を氷冷下順次加えた。反応混合物を室温で3時間かき混ぜた後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を油状物として得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3031, 2946, 912, 743 cm-1.
1H-NMR (CDCl3)：δ 1.98-2.35 (4H, m), 3.05 (3H, s), 4.32 (2H, t, J=5.6 Hz).
　v-2：
　上記（ｉｖ）で得られたN-[(1Z)-8-メルカプト-5,6-ジメチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド（29.8 g, 78.1 mmol）と炭酸カリウム（16.2 g, 0.117 mol）のN,N-ジメチルホルムアミド（400 ml）の懸濁液に、上記（v-1）で得られたメタンスルホン酸 4,4,5,5,5-ペンタフルオロペンチル エステル（24.0 g, 93.7 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（100 ml）溶液を加えた。反応混合物を80℃で2時間加熱した後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去して化合物Ａを暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点190-192℃の暗赤色結晶として化合物Ａを得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3208, 2934, 1753, 1663, 1624, 1566, 1497 cm-1.
1H-NMR (CDCl3)：δ 1.79 (3H, d, J=1.0 Hz), 1.90-2.22 (4H, m), 2.27 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.42 (3H, s), 3.01 (2H, t, J=6.8 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.62 (1H, bs).
元素分析値: C20H20N3O3S3F5として
計算値（%）： C, 44.35; H, 3.72; N, 7.76; S, 17.76.
実測値（%）： C, 44.32; H, 3.69; N, 7.44; S, 17.67.
　化合物Ａを、N,N-dimethylformamide (DMF)に溶解した溶解液を目的に応じて適切な緩衝液等で希釈し、実施例記載の測定法に使用した。
２．対照化合物
　対照化合物として、既知のHsp90阻害薬であるゲルダナマイシン（([18S- (4E,5Z,8R*,9R*,10E,12R*,13S*,14R*,16S*)]-9-[(aminocarbonyl)oxy]-13-hydroxy- 8,14,19-trimetoxy-4,10,12,16-tetramethyl-2-azabicyclo[16.3.1.]docosa- 4,6,10,18,21- pentan- 3,20,22trion)を使用した。ゲルダナマイシン（以下「GA」という）は、Sigma社製「商品名：Geldanamycin from Streptomyces hygroscopicus」を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（参考例２）
　実施例1において使用するため、固相化イミダゾチアジン誘導体を調製した。
（１）イミダゾチアジン誘導体の調製
　以下(i)～(iv)の反応を行い、末端にカルボキシル基を導入したイミダゾチアジン誘導体（化合物名：5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸、以下「化合物Ｂ」という）を合成した。
（ｉ）5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチルの合成：
　参考例１の（ｉｖ）で得られたN-[(1Z)-8-メルカプト-5,6-ジメチル-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-1-イリデン]-4-メチルベンゼンスルホンアミド（500 mg, 1.31 mmol）と炭酸カリウム（272 mg, 1.97 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（5.00 ml）の懸濁液に、5-ブロモ吉草酸 エチルエステル（0.259ml, 1.57 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（5.00 ml）溶液を加えた。反応混合物を80℃で30分間加熱した後、1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を合成した。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点162-164℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3221, 2980, 2936, 1732, 1663, 1564 cm-1.1H-NMR (CDCl3)：δ 1.27 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.67-1.82 (4H, m), 1.79 (3H, d, J=1.0 Hz), 2.26 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28-2.38 (2H, m), 2.42 (3H, s), 2.88-2.98 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=7.2 Hz), 7.29 (2H, d, J=8.0 Hz), 7.85 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.61 (1H, bs).
元素分析値: C22H27N3O5S3として
計算値（%）： C, 51.85; H, 5.34; N, 8.24; S, 18.87.
実測値（%）： C, 51.68; H, 5.29; N, 8.16; S, 18.42.
（ｉｉ）5-[(1-アミノ-5,6-ジメチル-3-オキソ-3H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル)スルファニル]ペンタン酸エチルの合成：
　上記（ｉ）で得られた5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-1-[[(4-メチルフェニル)スルホニル]イミノ]-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチル（1.34 g, 2.63 mmol）とギ酸アンモニウム（1.75 g, 26.3 mmol）のエタノール（26.0 ml）の懸濁液を80℃で17時間加熱した後、水を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル（10:1, v/v）で溶出して題記化合物を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点92.0-94.0℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3405, 3283, 3115, 2978, 2936, 1723, 1634, 1665, 1537 cm-1.
1H-NMR (CDCl3)：δ 1.26 (3H, d, J=6.9 Hz), 1.70-1.84 (4H, m), 1.74 (3H, s), 2.26 (3H, s), 2.32-2.40 (2H, m), 2.88-2.98 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=6.9 Hz), 7.51 (2H, bs).
元素分析値: C15H21N3O3S2として
計算値（%）： C, 49.92; H, 5.87; N, 11.64; S, 17.77.
実測値（%）： C, 49.94; H, 5.79; N, 11.41; S, 17.72.
（ｉｉｉ）5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチルの合成：
　水素化ナトリウム（230 mg, 5.74 mmol）（60%油性）のテトラヒドロフラン（10.0 ml）の懸濁液に、上記（ｉｉ）で得られた5-[(1-アミノ-5,6-ジメチル-3-オキソ-3H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル)チオ]ペンタン酸エチル（1.02 g, 2.87 mmol）のテトラヒドロフラン（5.00 ml）溶液を加え、氷冷下5分間かき混ぜた。これに4-(トリフルオロメチル)ベンゼンスルホニル クロリド（1.40 g, 5.74 mmol）のテトラヒドロフラン（5.00 ml）溶液を加え、さらに室温で1時間かき混ぜた。反応混合物に1N塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点146-148℃の暗赤色結晶を得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3235, 2984, 2936, 1759, 1738, 1663, 1620, 1559 cm-1.
1H-NMR (CDCl3)：δ 1.26 (3H, d, J=7.2 Hz), 1.70-1.78 (4H, m), 1.80 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28 (3H, d, J=0.9 Hz), 2.31-2.38 (2H, m), 2.94-3.00 (2H, m), 4.14 (2H, q, J=7.2 Hz), 7.77 (2H, d, J=8.7 Hz), 8.11 (2H, d, J=9.0 Hz), 9.61 (1H, bs).
元素分析値: C22H24N3O5S3F3として
計算値（%）: C, 46.88; H, 4.29; N, 7.46; S, 17.07.
実測値（%）: C, 46.86; H, 4.17; N, 7.62; S, 17.16.
（ｉｖ）5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸（化合物Ｂ）の合成：
　上記（ｉｉｉ）で得られた5-[[(1Z)-5,6-ジメチル-3-オキソ-1-([[4-(トリフルオロメチル)フェニル]スルホニル]イミノ)-2,3-ジヒドロ-1H-イミダゾ[5,1-c][1,4]チアジン-8-イル]スルファニル]ペンタン酸エチル（1.05 g, 1.86 mmol）のエタノール（10.0 ml）及びテトラヒドロフラン（10.0 ml）溶液に、1N水酸化ナトリウム水溶液（5.59 ml）を加えた。反応混合物を室温で1時間かき混ぜた後、溶媒を減圧下に留去した。残渣に1N塩酸を加えて、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗、乾燥（MgSO4）後、溶媒を減圧下に留去して題記化合物（747 mg, 75%）を暗赤色結晶として得た。酢酸エチル-ジエチルエーテルから再結晶して融点191-193℃の暗赤色結晶として化合物Ｂを得た。
赤外吸収スペクトル(IR) (KBr) ν： 3700-2400, 3125, 2928, 1725, 1663, 1599, 1557 cm-1.
1H-NMR (CDCl3)：δ 1.70-1.83 (4H, m), 1.80 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.28 (3H, d, J=1.2 Hz), 2.37-2.45 (2H, m), 2.94-3.02 (2H, m), 7.77 (2H, d, J=8.1 Hz), 8.11 (2H, d, J=8.4 Hz), 9.69 (1H, bs).
元素分析値: C20H20N3O5S3F3として
計算値（%）: C, 44.85; H, 3.76; N, 7.85; S, 17.96.
実測値（%）: C, 44.39; H, 4.04; N, 7.83; S, 17.66.
（２）イミダゾチアジン誘導体の固相化
　イミダゾチアジン誘導体（化合物Ｂ）の固相化を以下の方法により行った。まず、化合物Ｂを100 mMとなるように85%のN,N-dimethylformamide (DMF)に溶解した。次いで2 mlの上記溶解液に、20 mgの1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochroride (EDC)と1 mlのAF-アミノトーヨーパール650（東ソー社製）を添加し、pHを5.0に調整した後、室温で一日攪拌して化合物Ｂ のカルボキシル基とAF-アミノトーヨーパール650のアミノ基を反応させた。反応終了後、AF-アミノトーヨーパール650担体を85% DMFで洗浄し、これに570 μlの0.2 M sodium acetateと285 μlのglacial acetic acidを添加して0℃に30分間保持した後、285μlのglacial acetic acidを添加して25℃でさらに30分間保持した。この担体を水と0.1 N NaClで繰り返し洗浄した後、Binding Bufferで平衡化したものを、固相化イミダゾチアジン誘導体（以下「固相化化合物Ｂ」という）として、実施例において使用した。
　本発明のスクリーニング方法の工程（１）の一態様として、(i)被験物質非存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化イミダゾチアジン誘導体とHsp90との結合量を測定し、比較する工程を以下のようにして実施した。
（１）His-hHsp90αの調製
　Hsp90として、大腸菌を用いてN末端にヒスチジンタグを付加した精製ヒトHsp90α蛋白質(His-hHsp90α) を使用した。His-hHsp90αは以下のようにして調製した。
　まず、ヒトの骨格筋の相補的DNA（cDNA）ライブラリー（Clontech社）よりHsp90αをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により増幅した。ヒトHsp90αのcDNA増幅には、5'末端側にBamHI切断部位を含むヒトHsp90αのN末端と一致するセンス鎖（配列番号：１）、および5'末端側にSalI切断部位を含むヒトHsp90αのC末端と一致するアンチセンス鎖（配列番号：２）を使用した。増幅したヒトHsp90αはBamHIおよびSalIで切断後、pET28b（Novagen社）のBamHI切断部位およびSalI切断部位の間に挿入して、pET28b-hHsp90αを得た。得られたプラスミド内のhHsp90αcDNA配列は、DNAシーケンス・システム（アプライド・バイオシステム社）を用いて確認した。
　pET28b-hHsp90αを大腸菌BL21(DE3)（Novagen社）に形質転換した後、アンピシリンを添加したLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。これを同じ組成の培地に1％となるように移した後37℃で約2.5時間培養し、１ mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を添加して37℃で4 時間培養し、His-hHsp90α蛋白質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し、100 mlの培養液から得られた菌体あたり10 mlの0.1 % NP40を含有するバッファー（20 mM Tris-HCl(pH7.9)/500 mM NaCl/5 mM Imidazole）を添加し、超音波破砕した。この菌体破砕液を、10000 rpmで15分間遠心分離し、その上清を回収した。該上清をニッケルカラムに供し、His-hHsp90α蛋白質を得た。
（２）被験物質とHsp90との結合性の測定方法
　固相化イミダゾチアジン誘導体として、参考例２で調製した固相化化合物Ｂを使用した。まず、10μgの His-hHsp90αと種々の濃度の被験物質を、0.2 mlの0.5% DMFを含有するBinding Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 % glycerol, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1 mM DTT)中で30分間反応させた。次に、10μlの固相化化合物Ｂを添加し、攪拌しながら室温で40分間保持して、His-hHsp90αを固相化化合物Ｂに結合させた。反応終了後、0.2 mlのBinding Bufferで固相化化合物Ｂを5回洗浄して、固相化化合物Ｂに結合していないHis-hHsp90αを洗浄除去した。次いで固相化化合物Ｂをサンプル用緩衝液（Tris-SDS-ME Sample Buffer；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して、95℃で5分間熱処理することで固相化化合物Ｂに結合したHis-hHsp90αを溶出した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いて、SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルを銀染色して固相化化合物Ｂに結合したHis-hHsp90αを検出した。
（３）測定結果
　被験物質である化合物Ａは、His-hHsp90α蛋白質と固相化化合物Ｂの結合量を用量依存的に減少させた。一方、対照化合物GAは、50μM以下の濃度では影響を及ぼさなかった(図１)。従って、化合物Ａは、固相化化合物Ｂと同じ部位でHis-hHsp90αに強く結合すると考えられるが、当該結合部位へのGAの親和性は低いと考えられる。
　本工程により、Hsp90結合活性を有する被験物質（Hsp90阻害剤）の選抜が可能であることが示された。
　本発明のスクリーニング方法の工程（１）の別な態様として、（i）被験物質非存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量と、(ii)被験物質存在下における固相化Hsp90とラベル化イミダゾチアジン誘導体の結合量とを測定し、比較する工程を実施した。
（１）固相化Hsp90蛋白質の調製
　Hsp90として、大腸菌を用いて、N末端にヒスチジンタグを付加した精製ヒトHsp90α蛋白質(His2-hHsp90α)を使用した。His2-hHsp90αは、以下のようにして調製した。まず、pET28b-hHsp90αよりBamHI切断部位とBpu1102I切断部位を利用してhHsp90α遺伝子を切り出し、これをpET15b（Novagen社）のBamHI切断部位とBpu1102I切断部位の間に挿入し、pET15b-hHsp90αを得た。
　pET15b-hHsp90αを形質転換した大腸菌BL21(DE3)（Novagen社）をアンピシリンを添加したM-9培地で培養し、これに１mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を添加して37℃で4 時間培養して、His2-hHsp90α蛋白質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し、バッファー（50 mM Tris-HCl(pH8.0)/5 mM EDTA/ 0.5 mM APMSF）を添加し、超音波破砕した。この菌体破砕液を、39800×Gで30分間遠心分離し、その上清を回収した。これを60%飽和硫酸アンモニウムで4℃で15時間処理して蛋白質を沈殿させたのち、30,100 x gで30分間遠心分離した。得られた沈殿をバッファー（20 mM Tris-HCl, pH8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole）に懸濁し、これをニッケルカラムに供し、His2-hHsp90α蛋白質を得た。得られたHis2-hHsp90αは、DEAE-5PWカラムを用いたHPLCでさらに精製して使用した。
　次に、62.5μgのYsi (2-5 μm)copper his-tag SPA beads(アマシャム、バイオサイエンス社製)と0.8μgのHis2-hHsp90α蛋白質を、0.025%のTween 20と100μMのDTTを含有する100μlの燐酸緩衝液（PBS）中で混合し、96-well ルミヌンクプレート（Nunc社製）内で4℃で一晩反応させた。以上により、ヒスチジンタグを介してHis2-hHsp90α蛋白質をYsi (2-5 μm)copper his-tag SPA beads に結合させた固相化Hsp90を調製した。
（２）被験物質とHsp90との結合性の測定方法
　ラベル化イミダゾチアジン誘導体としてトリチウムラベルした化合物Ａ（以下「[3H]-化合物Ａ」という）を使用した。種々の濃度の被験物質（化合物Ａ）と40 nMのトリチウムラベルした化合物Ａを、固相化Hsp90を含む上記プレートに添加し、室温で6時間放置した後、His2-hHsp90α蛋白質に結合した[3H]-化合物Ａの放射活性をマイクロプレートシンチレーターカウンター（TopCount NXT; Packard社製）を用いて測定した。
　[3H]-化合物Ａの総結合量は、His2-hHsp90α蛋白質を固定化していないYsi (2-5μm)copper his-tag SPA beadsと40 nM  [3H]-化合物Ａとを反応させた際の値を非特異的結合活性として差し引くことで算出した。
（３）測定結果
　被験物質である化合物Ａは、[3H]-化合物ＡとHis2-hHsp90α蛋白質との結合量を用量依存的に減少させたが、GAは100μM以下の濃度では30%以下の弱い阻害活性しか示さなかった (図２)。従って、Hsp90の化合物Ａ結合部位に対するGAの親和性は低いと考えられる。
　本工程により、Hsp90との結合性を有する被験物質（Hsp90阻害剤）の選抜が可能であることが示された。
　工程（２）の一態様として、ヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて、被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程を実施した。ヒートショック蛋白質としてはHsp70を使用した。
（１）Hsp70の発現能を有する細胞の調製
　ヒト正常関節軟骨細胞（Clonetics社製）を関節軟骨細胞用増殖培地（CGM、Clonetics社製）中で単層培養により増殖させた後に、2.2x104個/mlとなるようにダルベッコ改変イーグル培地／ハムF12培地 1：1混合培地に懸濁し、12穴プレート（旭テクノグラス社製）に3 ml/wellずつ播種して、5％CO2、37℃で１日培養した。
（２）被験物質のHsp70発現誘導活性の測定方法
　培地を新しいダルベッコ改変イーグル培地／ハムF12培地 1：1混合培地に交換した後、被験物質と10 ng/mlのIL-1β（Genzyme Techne社製）を加え、これを5％ CO2、37℃で2日間培養した。培養終了後、リン酸緩衝液（Phosphate-Buffered Salline、PBS）で１回洗浄し、100μlの細胞溶解用緩衝液〔10 mM Tris（hydroxymethyl）aminomethane, pH7.4, 150 mM NaCl，1 mM EDTA・2Na，1 mM EGTA、0.5 mM (p-aminophenyl)methanesulfonyl fluoride hydrochloride，200 μM Sodium β-glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10μg/ml Aprotinin, 10μg/ml Leupeptin，1 ％ Triton X-100, 0.5％ Nonidet P40，0.1％ SDS および 1 mM o-Vanadate〕を添加して、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、この細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液は、サンプル用緩衝液（Tris-SDS-ME Sample Buffer；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
　泳動終了後、ホライズブロット（ATTO社製）を用いてゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜（Hybond-ECL；アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）に吸着させ、1次抗体として抗Hsp70抗体（Transduction Laboratories社製）又は抗β-Actin抗体（Sigma社製）を、2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗マウスIgG抗体（Kirkegaard & Perry Laboratoies社製）を用いたウエスタンブロットによって、それぞれの蛋白質量を測定した。β-Actinは、蛋白質のニトロセルロース膜への吸着工程などを検証する目的で用いた。
（３）測定結果
　被験物質である化合物Ａ、および対照化合物GAは、ともにIL-1βの刺激存在下でHsp70蛋白質量を明確に増加させた(図３)。両者のHsp70発現誘導活性は、ほぼ同等と考えられる。
　本工程にて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定することにより、ヒートショック蛋白質発現誘導活性を有する物質の選抜が可能であることが示された。
　工程(２)の別な態様として、被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程を実施した。Hsp90／HSF-1複合体を分離する活性を有する被験物質はヒートショック蛋白質発現誘導活性を有することが期待される。
（１）Hsp90／HSF-1複合体の調製
　ヒト正常関節軟骨細胞（Clonetics社製）をPBSで洗浄後、蛋白質分解酵素阻害剤（Complete; Boeringer Mannheim）を含有するRIPA 緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid)で溶解し、これを16,000 × gで10分間遠心分離した後、その上清をHsp90/HSF-1複合体を含有するライセートとして使用した。
（２）Hsp90／HSF-1複合体に対する分離活性の測定方法
　次に2 mg/mlとなるように希釈した上記ライセート0.6 mlに、1μMの化合物Ａ又はバッファーを添加して30分間反応させた。これに、30μgの抗Hsp90抗体（SPA-840; StressGen社製）、又はコントロール抗体（シグマ社製）を添加して30分間反応させた後、50μlのプロテインA/Gアガロース(サンタクルズ社製)を添加して、さらに4℃で3時間攪拌しながら反応させて抗体をプロテインA/Gアガロースに吸着させた。次に遠心分離によってビーズを回収し、RIPA緩衝液で7回洗浄した後、サンプル用緩衝液（Tris-SDS-ME Sample Buffer；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後に、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
　泳動終了後、ホライズブロット（ATTO社製）を用いてゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜（Hybond-ECL；アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）に吸着させ、1次抗体として抗HSF-1抗体（StressGen社製）又は抗Hsp90抗体（Transduction Laboratories社製）を、2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗ウサギIgG抗体（Cell Signaling Technology社製）又はHorseradish peroxidase標識抗マウスIgG抗体（Kirkegaard & Perry Laboratoies社製）を用いたウエスタンブロットによって、それぞれの蛋白質量を測定した。
（３）測定結果
　免疫沈降時にコントロール抗体を用いた場合、ライセートからはHsp90蛋白質は回収できず、HSF-1も検出されなかった(図４、lane 1)。一方で、免疫沈降時に抗Hsp90抗体を用いるとライセートよりHsp90が回収され、これに伴ってHSF-1が共沈してきた(図４、lane 2)。以上の結果より、本実験系においてライセートからHsp90/HSF-1複合体を回収できることがわかる。次に、抗Hsp90抗体を用いてHsp90/HSF-1複合体を回収する際に、化合物Ａを共存させると、ライセートよりHsp90は回収されるもののHSF-1の共沈が認められなくなった(図４、lane 3)。以上の結果より、化合物ＡがHsp90/HSF-1複合体を分離させることがわかる。
本工程によりHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を有する被験物質の選抜が可能であることが示された。
　本発明のスクリーニング方法の工程（３）の一態様として、Hsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を実施した。
（１）Hsp90のクライアント蛋白質の発現能を有する細胞の調製
　ヒト正常関節軟骨細胞を0.5x105個/mlとなるように関節軟骨細胞用増殖培地に懸濁し、6穴プレート（ファルコン社製）に2 ml/wellずつ播種して、5％ CO2、37℃で１日培養した。培地をダルベッコ改変イーグル培地／ハムF12培地 1：1混合培地に交換し、これを5％ CO2、37℃でさらに１日培養した。
（２）被験物質のHsp90のクライアント蛋白質分解誘導活性の測定方法
　培養液に被験物質を添加して、細胞を5％ CO2、37℃でさらに約18時間培養した。培養終了後、リン酸緩衝液（Phosphate-Buffered Salline、PBS）で１回洗浄し、200μlの細胞溶解用緩衝液〔10 mM Tris（hydroxymethyl）aminomethane, pH7.4, 150 mM NaCl，1 mM EDTA・2Na，1 mM EGTA、0.5 mM (p-aminophenyl)methanesulfonyl fluoride hydrochloride，200 μM Sodium β-glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM Sodium diphosphate decahydrate, 10μg/ml Aprotinin, 10μg/ml Leupeptin，1 ％ Triton X-100, 0.5％ Nonidet P40，0.1％ SDS および 1 mM o-Vanadate〕を添加して、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離した後、この細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液は、サンプル用緩衝液（Tris-SDS-ME Sample Buffer；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して95℃で5分間熱処理した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いたSDSポリアクリルアミド電気泳動に付した。
　泳動終了後、ホライズブロット（ATTO社製）を用いてゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜（Hybond-ECL；アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）に吸着させて、ウエスタンブロットで各種クライアント蛋白質の蛋白質量を解析した。ウエスタンブロットには、1次抗体として抗Glucocorticoid receptor抗体（サンタクルズ社製）、抗Akt抗体（Cell Signaling Technology社製）、抗Cyclin dependent kinase 4抗体（Calbiochem社製）、又は抗β-Actin抗体（Sigma社製）を、2次抗体としてHorseradish peroxidase標識抗ウサギIgG抗体（Cell Signaling Technology社製）又はHorseradish peroxidase標識抗マウスIgG抗体（Kirkegaard & Perry Laboratoies社製）を用いた。β-Actinは、蛋白質のニトロセルロース膜への吸着工程などを検証する目的で用いた。
（３）測定結果
　被験物質である化合物Ａは、10μM以下の濃度では、Glucocorticoid receptor、Akt、Cyclin dependent kinase 4などのHsp90のクライアント蛋白質の細胞内蛋白質量に影響を及ぼさなかった。
　一方、対照物質GAは、10 nM以上の濃度で、Glucocorticoid receptor、Akt、Cyclin dependent kinase 4の細胞内蛋白質量を減少させた。その作用は特にGlucocorticoid receptorとAktにおいて顕著であった (図５)。化合物Ａは、GAと比較して、クライアント蛋白質の分解誘導活性が1/1000以下と考えられる。
　本工程によりHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない、あるいは該活性の弱い被験物質が選抜できることが示された。
〔細胞保護活性の検証〕
　以下の方法により、化合物ＡとGAの細胞保護活性を検証した。
　まず、ヒト正常関節軟骨細胞を4x104個/mlとなるように関節軟骨細胞用増殖培に懸濁し、96穴プレートに播種して、5％ CO2、37℃で１日培養した。培地をダルベッコ改変イーグル培地／ハムF12培地 1：1混合培地に交換した後、被験物質と10 ng/mlのIL-1βを添加して、これを5％ CO2、37℃でさらに１日培養した。次に、培養液に110 μM の一酸化窒素発生試薬(±)-(E)-4-Ethyl-2-[(E)-hydroxyimino]-5-nitro-3-hexenamide (NOR3; 同仁堂社製)を添加して１日培養することで細胞死を誘導した。培養終了後、細胞の生存率を3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazorium bromide(MTT；同仁堂社製) を用いて測定した。その結果、化合物ＡはNOで誘発した細胞死に対して用量依存的な抑制作用を示したが、GAは逆に細胞の生存率を低下させた(図６)。化合物Ａは優れた細胞保護活性を有することが確認された。
〔細胞傷害性の検証〕
　以下の方法により、化合物ＡとGAの細胞傷害性を検証した。
　まず、ヒト正常関節軟骨細胞を5x104個/mlとなるように関節軟骨細胞用増殖培に懸濁し、96穴プレートに播種して、5％ CO2、37℃で１日培養した。培養液に被験物質を添加して、5％ CO2、37℃でさらに２日間培養した。培養終了後、細胞の生存率を(2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt（WST-8；同仁堂社製） を用いて測定した。その結果、化合物Ａは10μM以下の濃度で細胞の生存率に影響を及ぼさなかったが、GAは30 nM以上の濃度で細胞の生存率を大幅に減弱させた(図７)。化合物Ａの細胞傷害性はGAの1/300以下と考えられる。
　以上により、化合物Ａは細胞傷害性の低い、優れた細胞保護剤であることが確認された。
〔スクリーニング結果〕
　工程（１）、（２）および（３）を実施することにより、化合物Ａが「Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」或いは「Hsp90結合活性及びHsp90／HSF-1複合体分離活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」としての性質を有すること、また、細胞傷害性が低いことが確認された。
　本発明のスクリーニング方法により、「Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」或いは「Hsp90結合活性及びHsp90／HSF-1複合体分離活性を示し、Hsp90のクライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤」が得られることが示された。本発明のスクリーニング方法は、優れた細胞保護剤の探索のために使用可能である。
　本発明は、Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示すが、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない細胞保護剤として、ならびにそのような細胞保護剤をスクリーニングするための方法およびキット等として有用である。

Claims (20)

  1. 　（１）被験物質とHsp90との結合性を測定する工程、（２）被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程、および（３）被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程を含む、細胞保護剤のスクリーニング方法。
  2. 　工程（１）が、Hsp90とイミダゾチアジン誘導体との結合性に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、請求項１記載のスクリーニング方法。
  3. 　工程（２）が、被験物質のHsp90／HSF-1複合体に対する分離活性を測定する工程を含むものである、請求項１記載のスクリーニング方法。
  4. 　工程（３）が、Hsp90とクライアント蛋白質との結合に対する被験物質の阻害活性を測定する工程を含むものである、請求項１記載のスクリーニング方法。
  5. 　工程（２）がヒートショック蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のヒートショック蛋白質発現誘導活性を測定する工程であり、かつ工程（３）がHsp90クライアント蛋白質の発現能を有する細胞を用いて被験物質のHsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を測定する工程である、請求項１記載のスクリーニング方法。
  6. 　工程（２）のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上である、請求項１記載のスクリーニング方法。
  7. 　工程（3）のHsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、請求項１記載のスクリーニング方法。
  8. 　工程（３）が、（i）被験物質非存在下における細胞内のHsp90クライアント蛋白質量と、(ii)被験物質存在下における該細胞内のHsp90クライアント蛋白質量とを測定し、比較することを含む、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
  9. 　Hsp90クライアント蛋白質量が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により測定される、請求項８記載のスクリーニング方法。
  10. 　細胞保護剤が、心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、または皮膚疾患の予防・治療剤である、請求項１記載のスクリーニング方法。
  11. さらに工程（４）として、（４）Hsp90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解促進活性を示さない被験物質を選抜する工程、を含む請求項１記載のスクリーニング方法。
  12. 　（1）Hsp90、（２）ヒートショック蛋白質の定量用試薬、（３）イミダゾチアジン誘導体、および（４）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
  13. 　（１）Hsp90／HSF-1複合体、（２）Hsp90、（３）Hsp90の定量用試薬、（４）イミダゾチアジン誘導体、および（５）Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬を含む、細胞保護剤のスクリーニング用キット。
  14. 　Hsp90クライアント蛋白質の定量用試薬が、Hsp90クライアント蛋白質に対する抗体を含む、請求１２または１３記載のスクリーニング用キット。
  15. 　Hsp90クライアント蛋白質が、Glucocorticoid receptor、Ａｋｔ及びcycline dependent kinase 4から選択される1種以上である、請求項１２または１３記載のスクリーニング用キット。
  16. 　（２）のヒートショック蛋白質が、Hsp40、Hsp70及びHsp90から選択される１種以上である、請求項１２記載のスクリーニング用キット。
  17. 　請求項１記載の方法、または請求項１２若しくは１３のいずれかに記載のキットを用いて得られる、Ｈｓｐ90結合活性及びヒートショック蛋白質発現誘導活性を示し、Hsp90クライアント蛋白質分解誘導活性を示さない物質。
  18. 　請求１７記載の物質を含有してなる細胞保護剤。
  19. 　請求項１７記載の物質を含有してなる医薬。
  20. 　心疾患、神経疾患、脳疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患または皮膚疾患の予防・治療剤である請求項１９記載の医薬。
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