CN104812898B - 通过调节热休克蛋白质(HSP)90‑β治疗代谢综合征的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用HSP90抑制剂，特别是HSP90β抑制剂，治疗代谢综合征的方法。本发明提供使用HSP90(特别是HSP90p)的表达和活性水平诊断和监测代谢综合征的方法。

Description

通过调节热休克蛋白质(HSP)90-β治疗代谢综合征的方法

优先权信息

本申请要求于2012年5月25日提交的美国临时申请第61/652023号的优先权，该临时申请的全部内容通过引用的方式结合至本文。

序列表

本申请包含一份以ASCII形式通过EFS-Web提交的序列表，该序列表的全部内容通过引用的方式结合至本文。所述ASCII拷贝产生于2013年5月14日，命名为SeqLst.txt，大小为22,186字节。

背景技术

随着餐后血糖水平的升高，胰岛素被分泌出来并刺激外周组织(骨骼肌和脂肪)的细胞以主动地从血液中摄取葡萄糖作为能量源。作为失调的胰岛素分泌或作用的结果的葡萄糖内环境平衡的丧失通常导致代谢疾病，如糖尿病，其可能被肥胖症共激发或进一步恶化。由于这些情况通常是致命的，需要从血流恢复足够的葡萄糖清除的策略。

尽管糖尿病可能是继发于引起胰脏重度损伤的任何情况(如，胰腺炎、肿瘤、施用某些药物如皮质类固醇或喷他脒、铁过剩(即，血色沉着症)、获得性或遗传性内分泌病和手术切除)发生，但最常见形式的糖尿病通常产生自胰岛素信号传导系统的原发性紊乱。有两种主要类型的糖尿病，即1型糖尿病(也被称为是胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))和2型糖尿病(也被称为是胰岛素非依赖性或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM))，它们共有长期并发症，尽管它们有不同的致病机理。

1型糖尿病，其占据了原发性糖尿病全部案例的大约10％，是一种器官特异性自免疫疾病，特征是胰腺的胰岛素产生β细胞的广泛破坏。随之发生的胰岛素产生的减少不可避免地导致葡萄糖代谢的失调。虽然施用胰岛素为患有该病症的患者提供了显著益处，但胰岛素的短血清半衰期是维持正常血糖的主要障碍。一种可选的治疗是胰岛移植，但是该策略的成功率有限。

2型糖尿病，其影响更大比例的人群，特征是胰岛素分泌的失调和/或外周组织对胰岛素的反应降低，即胰岛素抵抗。虽然2型糖尿病的发病机理仍然不清楚，但流行病学研究表明该一形式的糖尿病产生自多种遗传缺陷或多态性的集合，每一种造成其本身的倾向性风险并由环境因素(包括超重的体重、饮食、不运动、药物和过量的饮酒)改变。尽管多种治疗方式可用于治疗2型糖尿病，它们与多种使人衰弱的副作用相关。因此，被诊断为患有2型糖尿病或具有2型糖尿病风险的患者通常被建议采取更健康的生活方式，包括减轻体重、改变饮食、锻炼以及适度的酒精摄入。但是，这样的生活方式改变不足以逆转由糖尿病引起的血管和器官损伤。

发明内容

在一个方面，本发明提供一种治疗受试者的代谢综合征的方法，包括对受试者施用HSP90调节剂，从而治疗所述受试者的代谢综合征。

在一种实施方式中，所述HSP90调节剂是HSP90抑制剂。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂是HSP90β的抑制剂。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂是HSP90β的特异性抑制剂。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂是HSP90α的抑制剂。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括2型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括1型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素抵抗。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素不足。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括肥胖症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括高胰岛素血症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括葡萄糖耐量降低(IGT)。

在一种实施方式中，患有代谢综合征的受试者表现出以下征兆中的三种或更多种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中对于男性，大的腰围是40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL；以及

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂包括核酸抑制剂。在一种实施方式中，所述核酸抑制剂包括反义核酸分子。在一种实施方式中，所述核酸抑制剂包括双链核酸分子。在一种实施方式中，所述核酸抑制剂包括选自siRNA、shRNA和dicer底物siRNA(DsiRNA)的双链RNA。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂包括抗体。

在一种实施方式中，所述HSP90抑制剂包括小分子。在一种实施方式中，所述小分子选自氯尼达明或其类似物、南蛇藤醇或其类似物、葛杜宁或其类似物以及香豆霉素或其类似物。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括使受试者的血糖水平正常化。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括使受试者的Hb1Ac水平正常化。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括预防与不良循环相关的至少一种糖尿病并发症。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解2型糖尿病的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解1型糖尿病的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解胰岛素抵抗的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解胰岛素不足的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解高胰岛素血症的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解葡萄糖耐量降低(IGT)的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解肥胖症的至少一种征兆或症状。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解以下的至少一种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中对于男性，大的腰围是指40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL；以及

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解等于或高于130/85mmHg的升高的血压。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解等于或高于100mg/dL的提高的空腹血糖。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解大的腰围，其中，对于男性，大的腰围是指40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括通过提高HDL胆固醇而缓解低HDL胆固醇，其中，低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL。

在一种实施方式中，治疗所述代谢综合征包括缓解等于或高于150mg/dL的提高的甘油三酯。

在一种实施方式中，治疗代谢综合征包括缓解脂肪肝。

在一种实施方式中，治疗代谢综合征包括调节脂肪积贮。

在另一方面，本发明提供一种诊断受试者的代谢综合征的方法，包括：

a)测定来自所述受试者的样品中HSP90β的表达或活性水平；以及

b)将来自所述受试者的样品中HSP90β的表达或活性水平与对照样品比较，其中，与对照样品相比，所述受试者的样品中提高的HSP90β表达或活性指示所述受试者的代谢障碍。

在一种实施方式中，HSP90β的表达水平包括HSP90β蛋白质或HSP90AB1基因的表达水平。

在一种实施方式中，所述方法进一步包括治疗所述受试者的代谢障碍。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括2型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括1型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素抵抗。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素不足。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括肥胖症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括高胰岛素血症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括葡萄糖耐量降低(IGT)。

在一种实施方式中，患有代谢综合征的受试者进一步表现出以下征兆中的一种或多种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中对于男性，大的腰围是指40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL；以及

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

在又另一方面，本发明提供一种监测受试者的代谢综合征的方法，包括：

a)在第一时间点和第二时间点从所述受试者获得样本；

b)测定在第一时间点和第二时间点的HSP90β的表达或活性水平；和

c)将第一时间点的HSP90β的表达或活性水平与和第二时间点的HSP90β的表达或活性水平进行比较，其中，相对于第一时间点，第二个时间点的HSP90β的表达或活性水平的变化指示所述受试者中代谢综合征的变化。

在一种实施方式中，所述HSP90β的表达水平包括HSP90β蛋白质或HSP90AB1基因的表达水平。

在一种实施方式中，HSP90β表达或活性的提高指示代谢综合征的恶化。在一种实施方式中，HSP90β表达或活性的降低指示代谢综合征的改善。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括2型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括1型糖尿病。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素抵抗。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括胰岛素不足。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括肥胖症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括高胰岛素血症。

在一种实施方式中，所述代谢综合征包括葡萄糖耐量降低(IGT)。

在一种实施方式中，患有代谢综合征的受试者进一步表现出以下征兆中的一种或多种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中对于男性，大的腰围是指40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL；以及

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

其它实施方式在下面提供。

附图简要说明

图1是用于采用糖尿病模型的探询式平台方法中的Δ-Δ网络的示意图。HG是高血糖；HGT1是具有辅酶Q10处理的高血糖；和NG是正常血糖。

图2是由本文中讨论的探询式平台方法生成的糖尿病对正常细胞模型中的网络的示意图。

图3是图2中由方框指明的网络段的放大形式，显示HSP90AB1(HSP90β)的相关性图谱和来自本文中讨论的平台方法糖尿病输出的目标因果节点。

图4提供用于描绘Δ-Δ网络中的因果蛋白质相关性的符号和颜色代码的图例。

图5显示响应于代谢因子和炎症的Hsp90β表达mRNA和蛋白质的诱导。

图6显示肌管中Hsp90β的敲减导致胰岛素刺激的AKT、ERK和GSK3β磷酸化显著增加的结果。敲减对于pERK的作用在与乱序siRNA相比时是显著的。

图7显示肌管中Hsp90β的敲减的结果，与乱序siRNA(si Scr)相比导致胰岛素刺激的葡萄糖摄取的显著增加。

图8显示肌管中Hsp90β的敲减的结果，与乱序siRNA相比导致CCCP诱导的解偶联的显著增加。其中Hsp90β被敲减的肌管中的基线呼吸观察到适度高于用乱序siRNA(si Scr)处理的肌管。

图9A和9B显示(A)western印迹和(B)定量分析，表明肌管用Hsp90抑制剂(CCT018159)处理的效果，其观察到与未处理的培养物相比提高的磷酸-AKT水平。未观察到pERK或pGSK3β的显著变化。

图10显示骨骼肌肌管用1μM、3μM和10μM的Hsp90抑制剂(CCT018159)处理的效果，该Hsp90抑制剂对线粒体代谢的CCCP诱导解偶联反应没有显著影响。

图11A和11B显示肌管中Hsp90β的敲减对骨骼肌肌管中(A)代谢酶基因表达(己糖激酶2(HK2)、乳酸脱氢酶(LDH)、糖原合成酶1(GYS1)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、乙酰CoA羧化酶1和2(ACC1和ACC2)、激素敏感性脂肪酶(HSL)和线粒体解偶联蛋白3(UCP3))和对(B)UCP3表达的作用。

图12A-12D以(A)葡萄糖诱导的ECAR、(B)寡霉素诱导的ECAR、(C)基线OCR和(D)解偶联OCR显示HSP90β的敲减在骨骼肌肌管中对糖酵解通量的影响。

图13A和13B显示HSP90β的敲减在肌管的炎性胰岛素抵抗模型中对磷酸化-Erk水平与总Erk水平的比率的影响，如(A)western印迹和(B)定量中所示的。

图14显示HSP90β敲减对骨骼肌肌管中正常葡萄糖条件下棕榈酸盐诱导的OCR中相对OCR/DNA比率的影响。

图15显示人HSP90AA1基因(SEQ ID NO:7)和HSP90α蛋白质(SEQ ID NO:8)的序列。

图16显示人HSP90AB基因(SEQ ID NO:9)和HSP90β蛋白质(SEQ ID NO:10)的序列。

图17显示HSP90AA1基因(SEQ ID NO:7)与人HSP90AB基因(SEQ ID NO:9)的序列比对及人HSP90α蛋白质(SEQ ID NO:8)与人HSP90β蛋白质(SEQ ID NO:10)的序列比对。

具体实施方式

一种发现平台技术被用于描述驱动糖尿病和代谢综合征的病理生理学的不同的分子印迹。通过该发现平台技术，HSP90β被鉴定为在人原发性糖尿病体外模型中被明显调节，并且与涉及脂代谢、蛋白酶体功能、胞内体运输以及RNA剪接的多种机制有关的关键节点。

热休克蛋白(HSP)是稳定一大组客户蛋白(client protein)的分子伴侣蛋白。脊椎动物有两种胞质HSP90的异形体，HSP90α(基因HSP90AA1)和HSP90β(基因HSP90AB1)。在脊椎动物中，所述HSP90α异形体在氨基酸序列水平上通常有大约85％一致性。在人类中，HSP90α氨基酸序列与HSP90β氨基酸序列有86％一致性且有93％相似性。两种蛋白质均包括ATP结合结构域。在大多数细胞中，HSP90β高水平地组成型表达，并通常比HSP90α更丰富。HSP90α表达是应激诱导的且该蛋白在很多癌细胞中过表达。所述HSP90异形体的客户蛋白大多是重叠的，但是，在热休克之后，HSP90α负责陪伴很多信号传导蛋白，如c-Src、A-raf。

尽管体外分析表明了相似的和大部分冗余的功能，HSP90敲除小鼠的表型显著不同。Hsp90β敲除小鼠表现出早期胚胎致死。相反，在Hsp90α缺陷小鼠中鉴定的唯一缺陷发生在成年雄鼠中，其表现出精子发生障碍。就Hsp90β来说，致死发生在胚胎第9天，这是由于胚胎不能发育胎盘，导致着床失败并在24小时内死亡。这些突变体表达Hsp90α，但仍然发生失败，说明在这一关键的发育步骤中，Hsp90α不能补偿HSP90β。与Hsp90β相反，雄性和雌性Hsp90α敲除小鼠都能够存活且直至成年都表型正常，除了雄性小鼠的不育。这些结果证明这两种HSP90异形体在小鼠体内起不同作用。

利用对原代人骨骼肌细胞(HSMM)和肝细胞癌(HepG2)细胞的各种功能性分析，本申请人已经证明RNAi介导的HSP90β敲减导致基线OCR/ECAR比率降低～50％。降低的比率是由于在HSMM和HepG2两种细胞中OCR降低和ECAR升高，显示了HSP90β调节氧化呼吸和糖酵解。此外，HSMM细胞中HSP90β敲减提高了葡萄糖诱导的ECAR，证明由减少的HSP90β诱导的增强糖酵解。

此外，申请人已经证明，在原代人骨骼肌细胞中，HSP90β的敲减诱导了胰岛素刺激的葡萄糖摄取的增加，显示HSP90β涉及骨骼肌葡萄糖代谢以及胰岛素作用。此外，申请人所观察到的肌管中HSP90β的敲减导致显著的下游pERK诱导以及对pAKT和pGSK3β的适度影响表明胰岛素信号传导的功能分支以及HSP90β参与选择性代谢。在进一步的实验中，申请人已经证明，一种抑制HSP90α和HSP90β两者的泛HSP90小分子抑制剂(CCT018159)比单独的HSP90β敲减对胰岛素信号传导和生物能量学具有较不显著的效应。因此，发现特异性HSP90β抑制比泛HSP90抑制途径更有效。

综上所述，申请人发现HSP90β的敲减对生物能量学和线粒体底物代谢具有显著作用。特别地，从本文中描述的研究中看出HSP90β为细胞代谢的关键调节子以及骨骼肌细胞中氧化呼吸和糖酵解之间的分子开关。因此，HSP90β是糖尿病中可行的治疗靶标。

定义：

如本文中所使用的，“HSP90抑制剂”是一种降低HSP90的表达或活性的治疗剂。HSP90抑制剂可以通过以下方式降低HSP90的活性：通过直接与HSP90相互作用，或者通过减少或防止HSP90/CDC37复合物的形成以使得HSP90的至少一种客户蛋白的表达和正常折叠被抑制。如本文中所使用的，“HSP90”抑制剂可以通过任何机制发挥作用，例如，通过在RNA或蛋白质水平上抑制HSP90的表达；例如通过抑制ATP结合或水解而抑制HSP90的活性；或者通过抑制HSP90与一种或多种其相互作用蛋白的相互作用；或者通过降低HSP90的稳定性。HSP90抑制剂能够抑制一种或多种HSP90异形体的活性。例如，HSP90α的抑制剂也可以抑制HSP90β。相似地，HSP90β的抑制剂也可以抑制HSP90α。在一种实施方式中，HSP90抑制剂可以特异地抑制特定的HSP90异形体，例如，特异地抑制HSP90β，即，主要地抑制HSP90β，而抑制HSP90α少得多。

HSP90抑制剂包括(i)小分子抑制剂，它们中的许多抑制多种HSP90异形体的活性，如，根赤壳菌素和格尔德霉素及其衍生物；(ii)可以靶定HSP90的一种或多种特定异形体的核酸抑制剂，如反义、siRNA、shRNA、dsiRNA等(参见例如本文提供的例子；Kuo等，2007,J.Immunol.178:600；Didelot等，2008,Cell.Death Diff.,15:859，每篇文献的全部内容通过引用的方式结合至本文)；和(iii)可以靶定HSP90的一种或多种特定异形体的抗体(Cortes-González等，2010,Cell Physiol.Biochem.26:657，其全部内容通过引用的方式结合至本文)。在本文中将详细讨论HSP90抑制剂的具体种类和例子。

如本文中所使用的，“特异于”特定的HSP90异形体(例如，特异于HSP90β)的HSP90抑制剂可以具有针对另一种HSP90异形体的明显较低的活性。但是，如本文中所使用的，特定HSP90异形体的“特异性”抑制剂在抑制所述特定HSP90异形体的活性或表达方面效力高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少75倍或至少100倍。例如，如果所述抑制剂是在抑制特定HSP90异形体方面效力高至少10倍的特异于HSP90β的siRNA，则1nM所述siRNA将减少HSP90β的表达至与10nM的所述siRNA减少HSP90α的表达相同的程度。可以实施相似的分析以比较抑制剂对HSP90异形体的活性的影响，例如，下游效应物的磷酸化的抑制水平、客户蛋白的折叠的抑制、无机磷酸盐产生的抑制等。在一些实施方式中，HSP90β异形体的特异性抑制剂抑制HSP90β的表达或活性至少50％，但是，在相同浓度下抑制HSP90α的表达或活性不到50％、40％、30％、20％、10％。在一些实施方式中，HSP90β异形体的特异性抑制剂抑制HSP90β的表达或活性至少60％，但是在相同浓度下抑制HSP90α的表达或活性不到50％、40％、30％、20％、10％。在一些实施方式中，HSP90β异形体的特异性抑制剂抑制HSP90β的表达或活性至少70％，但是在相同浓度下抑制HSP90α的表达或活性不到50％、40％、30％、20％、10％。在一些实施方式中，HSP90β异形体的特异性抑制剂抑制HSP90β的表达或活性至少80％，但是在相同浓度下抑制HSP90α的表达或活性不到50％、40％、30％、20％、10％。在一些实施方式中，HSP90β异形体的特异性抑制剂抑制HSP90β的表达或活性至少90％，但是在相同浓度下抑制HSP90α的表达或活性不到50％、40％、30％、20％、10％。

确定HSP90抑制剂的特异性和活性的测定方法是在本领域技术人员的能力之内。特定的测定方法可以取决于使用的抑制剂，例如，活性的抑制剂或表达的抑制剂。测定HSP90α和HSP90β活性的试剂盒是商业可获得的(例如，BPS Bioscience,San Diego,CA)。测定HSP90α和HSP90β活性的方法也是本领域已知的(见，如，Kim等，J.Biomol.Screening2004；9:375-38；和Howes等，Anal.Biochem.2006；350:202-213；这两篇文献的全部内容通过引用的方式结合至本文)。

例如，可以在一种用于ATP酶活性的测定中确定Hsp90活性的抑制，如在MethodsMol Med,2003,85:149中描述的Malachite Green测定法。简言之，将分析缓冲液(100mMTris-HCl，pH 7.4，20mM KCl，6mM MgCl₂)中的Hsp90蛋白质(如Hsp90α和Hsp90β蛋白质)与96孔板中的以下物质混合：单独的ATP(阴性对照)、ATP和格尔德霉素(阳性对照)、ATP和不同浓度的测试化合物、或单独的测试化合物(另一阴性对照)。为检测由ATP水解产生的无机磷酸盐，随后将Malachite Green试剂加入至所述反应中。将所述混合物在37℃下孵育4小时，并在孵育结束时，将柠檬酸钠缓冲液(34％w/v柠檬酸钠)加入至所述反应中。使用ELISA阅读仪以620nm的吸光度读取所述板。比较针对Hsp90α和Hsp90β的活性以确定所述抑制剂的特异性(如果有的话)。这样的测定允许直接比较针对每一种HSP90异形体的抑制剂活性。

可选地，可以在竞争结合测定中确定Hsp90活性的抑制。已知格尔德霉素与Hsp90α或Hsp90β的ATP结合位点相互作用，并可以容易地被其它Hsp90抑制剂替代。通过荧光或非荧光方式标记格尔德霉素有助于确定所述替代。使用荧光标记的格尔德霉素的一种示例性竞争结合测定在Yin等，Int J Cancer.2010Mar 1；126(5):1216-25中描述(通过引用的方式结合至本文)。简言之，FITC-格尔德霉素探针首先用TCEP在室温下还原3个小时，之后将所述溶液等分并储存在-80℃直到使用。在存在分析缓冲液的情况下将重组人Hsp90α或Hsp90β和还原的FITC-格尔德霉素在96孔微板中室温下孵育3h，所述分析缓冲液包含20mMHEPES(pH 7.4)、50mM KCl、5mM MgCl₂、20mMNa₂MoO₄、2mM DTT、0.1mg/mL BGG和0.1％(v/v)CHAPS。作为阴性对照，预孵育中不包括Hsp90蛋白。在这一预孵育之后，测试化合物(作为竞争者)随后加入溶剂中至终浓度为0.2nM至10μM(终体积100μL)。作为阳性对照，非标记的格尔德霉素被用作竞争者。作为阴性对照，既不加入测试化合物也不加入非标记的格尔德霉素。将所述反应在室温下孵育16h，然后在Analyst读板仪上测量荧光，激发＝485nm，发射＝535nm。高对照和低对照分别不包含化合物或Hsp90。使用GraphPad Prism将数据拟合至四参数曲线并产生IC₅₀值。使用如在Machida等，Cancer Sci 2005；96:911–17(31)中描述的改良的Cheng-Prusoff方程式将IC₅₀值转化成抑制常数(Ki)。可以比较针对Hsp90α和Hsp90β的活性以确定所述抑制剂的特异性(如果有的话)。

可选地，HSP90活性可以在表达仅存在单一HSP90异形体的细胞(如，仅表达Hsp90α或Hsp90β的酵母、秀丽隐杆线虫或哺乳动物细胞)中测定。对HSP90的两种异形体的客户蛋白的折叠和/或稳定性的抑制进行分析以确定所述抑制剂的相对活性。如本文中所使用的，HSP90的“核酸”抑制剂是任何核酸基抑制剂，所述抑制剂通过与来自HSP90AA1和/或HSP90AB1基因的RNA转录物的至少一部分杂交导致Hsp90α或Hsp90β表达的减少，从而引起HSP90表达的减少。核酸抑制剂包括，例如，单链核酸分子(如，反义核酸)和双链核酸(如siRNA、shRNA、dsiRNA)(见，如，美国专利公开第20070104688号)。如本文中所使用的，双链核酸分子被设计成在至少12个、优选地至少15个核苷酸上是双链的。双链核酸分子可以是被设计成与其自身杂交的单核酸链，如shRNA。应当理解的是，HSP90的核酸抑制剂可以作为分离的核酸施用。可选地，核酸抑制剂可以作为表达构建体施用以在细胞中产生抑制剂。在一些实施方式中，所述核酸抑制剂包括一个或多个化学修饰以改善所述核酸抑制剂的活性和/或稳定性。这样的修饰是本领域公知的。将使用的特定修饰将取决于，例如，核酸抑制剂的类型。

如本文中所使用的，“抗体”是包括至少一个与特定靶抗原结合的互补决定区的蛋白质。抗体通常包括至少一个免疫球蛋白可变区，例如，提供免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白可变结构域序列。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段(如，单链抗体、Fab、F(ab')2、Fd、Fv和dAb片段)以及完整抗体，例如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型的完整免疫球蛋白(以及它们的亚型)。免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。在一种实施方式中，所述抗体是糖基化的。例如，抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、修饰的抗体、嵌合抗体、重构抗体、人源化抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、单链Fv、二聚化可变区(V区)片段(双特异抗体)、二硫键稳定的V区片段(dsFv)、亲和体(affibody)、抗体模拟物及保持与有效负载的特异性结合的一个或多个分离的互补决定区(CDR)。如本文中所使用的，“分离的”CDR是不存在于自然发生抗体的环境中的CDR。所述抗体可以是任意免疫球蛋白类型，如，IgG、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在一种实施方式中，所述抗体可以是人抗体。

如本文中所使用的，“小分子”抑制剂是分子量小于1000Da、优选地小于750Da或优选地小于500Da的抑制剂分子。在一些实施方式中，小分子不包括核酸分子。在一些实施方式中，小分子不包括长度多于三个氨基酸的肽。

如本文中所使用的，为简便的缘故，HSP90(例如，Hsp90α和/或Hsp90β)的表达或活性的改变或调整(即，增加或减少)被理解为包括所述基因和/或蛋白质的表达或活性的改变。在一种实施方式中，表达或活性减少了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。

如在本文中所使用的，可以例如通过检测HSP90(如，HSP90α和/或HSP90β)的ATP水解活性的变化、通过检测特定HSP90的客户蛋白的折叠的变化来检测HSP90“活性”的变化。ATP水解的检测方法是本领域公知的。客户蛋白的折叠可以例如通过以下方式评估：通过测定样品中存在的客户蛋白的量，或者当客户蛋白是具有酶促活性(如，激酶活性)的信号传导蛋白时，通过测定样品中客户蛋白的活性。测定HSP90α和HSP90β活性的试剂盒也是商业可购得的(例如，从BPS Bioscience)。

如在本文中所使用的，患有“代谢综合征”的受试者意思是指具有以下一种或多种状况的受试者：2型糖尿病、胰岛素抵抗、胰岛素不足、肥胖症、高胰岛素血症或葡萄糖耐量降低(IGT)；或者是具有以下代谢综合征征兆中的三种或更多种的受试者：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中对于男性，大的腰围是指40英寸或更大，而对于女性，大的腰围是指35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低LDH胆固醇对于男性是低于40mg/dL，且低于50mg/dL；以及

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

诊断所示的状况以及检测代谢综合征的指示征兆的方法是本领域中常规的。在一些实施方式中，代谢综合征进一步包括1型糖尿病。在一些实施方式中，代谢综合征不包括1型糖尿病。相关的疾病和征兆包括：高尿酸血症、发展为非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的脂肪肝(特别是在并发肥胖症中)、多囊卵巢综合症(在女性中)以及黑棘皮病。在一些实施方式中，本发明包括治疗这些相关疾病或征兆中的一种或多种。在一些实施方式中，本发明不包括治疗这些相关疾病或征兆中的一种或多种。

如在本文中所使用的，“糖尿病”意思是指1型糖尿病或2型糖尿病，或1型糖尿病和2型糖尿病两者。在一些实施方式中，糖尿病包括前驱糖尿病。在一些实施方式中，糖尿病不包括前驱糖尿病。

如在本文中所使用的，“胰岛素抵抗”和“胰岛素不敏感性”可以互换使用，并且指的是其中胰岛素的量在降低血糖方面比正常受试者中的效果差的情况，从而导致非由于胰岛素缺乏产生的高于正常范围的血糖升高。不被机制所限制，这些情况通常与经由胰岛素受体的信号传导的降低相关。典型地，肌肉和脂肪细胞中的胰岛素抵抗分别降低了葡萄糖摄取及作为糖原和甘油三酯的存储。肝细胞中的胰岛素抵抗导致糖原合成减少以及不能抑制葡萄糖生成和释放至血液中。

胰岛素抵抗通常与“胰岛素不足”一起存在于同一受试者中，其也导致非由于胰岛素缺乏产生的高于正常范围的血糖升高。胰岛素不足是其中胰岛素存在于身体中并由身体产生的与胰岛素作用缺失有关的情况。它与其中由于缺少胰岛细胞而不产生胰岛素的1型糖尿病不同。

出于确定受试者是否患有代谢综合征的目的，区分受试者是否患有胰岛素抵抗、胰岛素不足或两者并不重要。

如在本文中所使用的，可以使用任何临床相关定义来限定“肥胖症”。例如，在成年人中，体重指数(BMI，kg/m²)经常被用作超重和肥胖的量度，其中超重被定义为BMI 25-29.9kg/m²，肥胖被定义为BMI等于或大于30kg/m²，而病态肥胖被定义为BMI超过40kg/m²。在成年人中，肥胖还可以如通过腰围测量的中心脂肪过多(central adiposity)来定义，其中凸起的腰围被定义为在男性中等于或大于102cm和在女性中等于或大于88cm。肥胖症的治疗不需要将BMI或腰围降低至正常水平。相反，治疗优选地包括减小超过对于受试者而言正常值上限的过度BMI值或过度腰围的至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少7％、至少10％、至少15％、至少20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。例如，腰围是100cm的女性的过度腰围是12cm(100cm-88cm)。减小过量值的20％将是减小2.4cm。

“高胰岛素血症”被定义为其中空腹或餐后的血清或血浆胰岛素浓度升至没有胰岛素抵抗的正常的瘦个体的血清或血浆胰岛素浓度以上(即，空腹血糖试验中>100mg/dl，或者口服葡萄糖耐量试验中>140mg/dl)的其中患有胰岛素抵抗的受试者(血糖正常或不正常)的情况，还具有腰臀比<1.0(对于男性)或者<0.8(对于女性)。

术语“葡萄糖耐量降低(IGT)”或“前驱糖尿病”被用于描述当给予葡萄糖耐量试验时，血糖水平落在正常和高血糖之间的人。这样的人发生糖尿病的风险更高，尽管他们并不被认为是患有糖尿病。例如，葡萄糖耐量降低指的是其中病患的空腹血糖浓度或空腹血清葡萄糖浓度高于110mg/dl并小于126mg/dl(7.00mmol/L)的情况，或者餐后两小时血糖或血清葡萄糖浓度大于140mg/dl(7.78mmol/L)并小于200mg/dl(11.11mmol/L)的情况。逐渐增多的证据表明前驱糖尿病情况可能是发生心血管疾病的风险因子(Diabetes Care 26:2910-2914,2003)。前驱糖尿病，也称为是葡萄糖耐量降低或空腹血糖异常，是发生2型糖尿病、心血管疾病和死亡的主要风险因子。在开发通过有效治疗前驱糖尿病来阻止2型糖尿病发生的治疗干预中已经给予了很多关注(Pharmacotherapy,24:362-71,2004)。

“高血糖症”(高血糖)的情况是其中血糖水平过高的情况。典型地，当血糖水平升至180mg/dl以上时发生高血糖症。高血糖症的症状包括频繁排尿、过度口渴以及经过一个更长的时间跨度后体重减轻。

“低血糖症”(低血糖)的情况是其中血糖水平过低的情况。典型地，当血糖水平降至70mg/dl以下时发生低血糖症。低血糖症的症状包括情绪化、肢端(特别是手和臂)麻木、混乱、颤抖或眩晕。由于这种情况在胰岛素的量多于可利用的葡萄糖的量时发生，因此有时它被称为胰岛素反应。

如在本文中所使用的，“HbA1c水平”被理解可以使用为从HbA1c测试中测定的血红蛋白A1c(HbA1c)水平，其评估了之前两个和三个月期间的平均血糖水平。没有糖尿病的人的HbA1c值通常在4％和6％的范围内。前驱糖尿病以HbA1c水平5.7％至6.5％为特征，其中Hb1Ac水平高于6.5％是糖尿病的指示。对于HbA1c中每1％的增加，血液葡萄糖水平增加大约30mg/dL，且由于持续升高的血糖导致的并发症的风险增加。优选地，根据本发明治疗的患者的HbA1c值减低至小于9％、小于7％、小于6％以及最优选地至大约5％。因此，被治疗的患者的过量HbA1c水平(即，超过5.7％的HbA1c水平)相对于治疗前的该水平优选降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

如本文中所使用的，术语“受试者”指人或非人动物，包括兽类受试者。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、小鼠、兔子、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在优选的实施方式中，所述受试者是人，且可以指患者。

如在本文中所使用的，术语“治疗”、“疗法”或“处理”优选地指获得有益的或期望的临床结果的行动，包括但不限于，减轻或缓解疾病或状况的一种或多种征兆或症状，减轻疾病的程度、疾病的稳定状态(即，不恶化)、缓和或改善疾病状态。如在本文中所使用的，治疗可以包括以下一种或多种：减少胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性、减轻胰岛素不足、改善或正常化HbA1c水平、改善或正常化血糖水平、减少体重、减小腰围、正常化或降低HDL水平、正常化或降低甘油三酯水平以及缓解糖尿病的至少一种或多种征兆或症状。治疗不需要是能治愈的。治疗结果不需要定量测定的。但是，在一些实施方式中，可以通过估量相对于正常范围端点值的百分改善来定量治疗结果。例如，通过一些量度(如，体量/BMI、腰围、甘油三酯水平)的过量和其它量度的不足(如，HDL胆固醇的不足或胰岛素反应)来表征代谢综合征。腰围为100cm的女性腰围过量了12cm(100cm-88cm，最大的正常腰围)。过量腰围减小20％将是过量腰围减小了2.4cm。相似的计算可用于其它值。HDL为30mg/dl的男性会有20mg/dl的不足(对于男性，正常值为至少50mg/dl)。相对于25mg/dl增加5mg/dl将为认为是将HLD的不足减少了25％。

如在本文中所使用的，“降低葡萄糖水平”意思是将升高的葡萄糖水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多以实现正常化的葡萄糖水平，即，葡萄糖水平不高于150mg/dl。期望的是，葡萄糖水平降至正常血糖水平，即，150-60mg/dl、140-70mg/dl、130-70mg/dl、125-80mg/dl，和优选地120-80mg/dl。可以通过增加任何一种与从血液中清除葡萄糖相关的生物活性来获得葡萄糖水平的这种降低。因此，具有降低葡萄糖水平的能力的试剂可以增加胰岛素产生、分泌或作用。例如，可以通过增加外周组织对葡萄糖的摄取和/或通过减少肝葡萄糖产生来增加胰岛素作用。可选地，本发明的试剂可以减少肠的碳水化合物吸收，改变葡萄糖转运子活性(例如，通过增加GLUT4表达、内在活性或易位)，增加胰岛素敏感组织的量(例如，通过增加肌肉细胞或脂肪细胞分化)，或改变脂肪或肌肉细胞中的基因转录(例如，改变表达代谢途径基因的脂肪细胞的因子分泌)。期望的是，本发明的试剂增加了与葡萄糖清除相关的多于一种的活性。

“降低脂质水平”意思是将过量的脂质水平降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多以达到正常的脂质水平，即，不超过150mg/dl。

“改变胰岛素信号传导途径以使得葡萄糖水平降低”的意思是改变(通过增加或减少)参与胰岛素信号传导的任何一种活性以使得总体结果是葡萄糖从血浆清除的增加。例如，改变胰岛素信号传导途径从而引起胰岛素产生、分泌或作用的增加，外周组织对葡萄糖吸收的增加，肝葡萄糖产生的减少或肠对碳水化合物吸收的减少。

“治疗有效量”是足以治疗受试者中疾病的量。治疗有效量可以在一次或多次施用中给予。

如在本文中所使用的，“诊断”等等指基于观察、检验或环境对受试者状况的临床的或其它的评估，以基于疾病、紊乱或状况的至少一种指示(如征兆或症状)的存在鉴定患有所述疾病、紊乱或状况的受试者。典型地，使用本发明的方法进行诊断包括与本文提供的方法结合对受试者中所述疾病、紊乱或状况的多种指示的观察。诊断方法提供了疾病是否存在的指示。单一的诊断测试通常不提供被测试的受试者的疾病状态的明确结论。

如在本文中所使用的，“监测”被理解为在第一时间点和之后的第二时间点评估受试者中疾病的至少一种征兆或症状，比较所述状况的征兆或症状的严重性，和确定所述状况随时间变得更重或减轻。

术语“给药”、“给予”或“施用”包括向受试者系统或者受试者身体中或受试者身体上的特定区域递送药物组合物或试剂的任何方法。在一些实施方式中，所述试剂经肠或肠胃外给药。在本发明的一些实施方式中，试剂静脉内、肌肉内、皮下、皮内、鼻内、口服、经皮或黏膜给药。在优选的实施方式中，试剂静脉内给药。在一些实施方式中，所述制剂是局部给药或系统给药。可以通过协同工作的多个人施用试剂。施用试剂包括，例如，为受试者开具待施用的试剂的处方和/或直接地或通过另一人提供接受特定试剂的指导，或者通过自身递送，如，通过口服递送、皮下递送、经由中央静脉导管(central line)静脉内递送等；或者通过经培训的专业人员递送，如静脉内递送、肌肉内递送等。

如在本文中所使用的术语“样品”指的是分离自受试者的相似流体、细胞或组织的集合。术语“样品”包括来自受试者的任何体液(如，尿液、血清、血液流体、淋巴液、妇科液体、囊液、腹水、眼内液和通过支气管灌洗和/或腹膜清洗收集的流体)、腹水、组织样品(如，肿瘤样品)或细胞。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊髓液、粪便、唾液和细胞提取物。在具体实施方式中，所述样品是尿液或血清。在另一实施方式中，所述样品不包括腹水或不是腹水样品。在一种实施方式中，所述样品包括细胞。在另一实施方式中，所述样品不包括细胞。

如在本文中所使用的，术语“对照样品”指的是临床相关的对比样品，包括，例如，来自不患代谢综合征的健康受试者的样品，或者来自治疗的较早阶段的较早时间点(例如，治疗前)的受试者的样品。对照样品可以是由试剂盒提供的纯化样品、蛋白质和/或核酸。这样的对照样品可以是稀释的，例如，系列稀释以允许定量测量测试样品中的分析物。对照样品可以包括源自一个或多个受试者的样品。对照样品还可以是在较早时间点制备的来自被评估的受试者的样品。例如，所述对照样品可以是在代谢综合征发作之前、在疾病的早期阶段、或者在实施治疗或部分治疗之前取自被评估的受试者的样品。所述对照样品也可以是来自动物模型的样品，或者来自源于代谢综合征的动物模型的组织或细胞系的样品。例如，基于任何合适的统计方法(例如，包括平均值、中值或最常见值的集中趋势测量)来确定由一级测量值组成的对照样品中HSP90(如，Hsp90α和/或Hsp90β)活性或表达的水平。

术语“对照水平”指的是受试者或受试者样品中代谢障碍的征兆的公认水平或预定水平。以下水平被认为是正常水平：

-低于或等于120/80mmHG的血压。

-低于或等于100mg/dl的空腹血糖。

-腰围，男性小于40英寸(102cm)，女性小于35英寸(88cm)。

-HDL，女性至少50mg/dl，男性至少40mg/dl。

-低于或等于150mg/dl的甘油三酯。

-小于或等于5.7％的HbA1c。

-低于或等于140mg/dl的口服葡萄糖耐量试验。

如在本文中所使用的，术语“获得”应当理解为指制造、购买或以其它途径拥有。

如在本文中所使用的，“测定”、“检测”等被理解为指为鉴定样品中的特定分析物(例如，样品中的HSP90(如，HSP90α和/或HSP90β)表达或活性水平)而实施的分析。样品中检测的分析物或活性的量可以是零或低于所述分析或方法的检测水平。

术语“调节”或“调整”指水平的上调(即，激活或刺激)、下调(即，抑制或阻止)或两者(结合地或分别地)。“调节剂”是进行调节的化合物或分子，且可以是如，激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激剂、抑制剂或抑制物。

在本文中使用的术语“表达”指从DNA产生多肽的过程。所述过程包括基因转录成mRNA以及该mRNA翻译成多肽。取决于使用该词语的上下文，“表达”可以指RNA或蛋白质或二者的产生。

术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”指在细胞中由该基因编码的mRNA、以及前mRNA新生转录物、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解产物的水平，或蛋白质的水平。

如在本文中所使用的，“活性水平”被理解为如通过定量、半定量或定性分析确定的蛋白活性，通常酶活性的量。通常，通过监测使用产生可容易检测的产物(如有色产物、荧光产物或放射性产物)的底物在分析中产生的产物的量来确定活性，。进行的特定分析取决于，例如，将测量的活性。

除非另有明确的相反指示，冠词“一个”、“一种”和“该”在本文中用于表示一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))的所述冠词的语法对象。例如，“一要素”表示一个要素或多于一个要素。

术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”，并且与短语“包括但不限于”互换使用。

除非文中另有其它明确表示，术语“或”在本文中用于表示短语“和/或”，并与短语“和/或”互换使用。

术语“例如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”，并与短语“例如但不限于”互换使用。

除非在文中清楚陈述或明显示出，如在本文中所使用的，术语“大约”被理解为在本领域正常公差范围内，例如，平均值的2个标准差的范围内。大约可以被理解为规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％之内。除非上下文中另有清楚说明，本文提供的所有数值可以由术语大约修饰。

本文中的任何变量定义中的化学基团列表的描述包括作为任何单一基团或列出基团的组合的该变量的定义。本文中变量或方面的实施方式的描述包括作为任何单一实施方式或与任何其它实施方式及其部分组合的该实施方式。

本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种结合。

本文提供的范围被理解为所述范围内的所有值的简略表达方式。例如，1-50的范围被理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字组合或亚范围。

现在将详细参考本发明的优选实施方式。虽然本发明将结合优选实施方式描述，应当理解，这并不意味将本发明限制于那些优选的实施方式中。相反，意在覆盖可以包括在如所附的权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的替代方式、改变和等同形式。

I、代谢综合征

代谢综合征(综合征X)是一起发生并增加了冠状动脉疾病、中风和2型糖尿病的风险的一组风险因子的名称(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0004546/)。代谢综合征在美国变得越来越常见。研究人员不确定所述综合征是否由于单一起因，但是所述综合征的所有风险都与肥胖有关。如在本文中所使用的，代谢综合征被理解为包括胰岛素抵抗、胰岛素不足、前驱糖尿病、2型糖尿病和肥胖症。满足以下诊断标准的受试者也被认为患有代谢综合征。在本发明的一些实施方式中，代谢综合征也可以包括1型糖尿病。在其它实施方式中，代谢综合征不包括1型糖尿病。

代谢综合征的两个最重要风险因子是身体中部和上部周围的超重(中心肥胖)和胰岛素抵抗(其中身体不能有效利用胰岛素)。胰岛素控制身体中糖的量。在身体不产生足够胰岛素和/或身体对产生的胰岛素的水平不响应的受试者中，血糖和脂肪水平升高。代谢综合征的其它风险因子包括老化、遗传因素、激素变化和久坐的生活方式。患有代谢综合征的人通常遭受过度的血液结块和低水平的系统炎症中的一种或两种，这两种都可能加重所述状况。

美国心脏病协会和国家心肺和血液研究所认为代谢综合征存在于具有三种或更多种以下征兆的受试者中：

●等于或高于130/85mmHg的血压

●等于或高于100mg/dL的空腹血糖(葡萄糖)

●大的腰围(围绕腰的长度)：

○男性-40英寸或更大

○女性-35英寸或更大

●低HDL胆固醇

○男性-低于40mg/dL

○女性-低于50mg/dL

●等于或高于150mg/dL的甘油三酯

治疗包括推荐的生活方式变化或医药以帮助降低血压、LDL胆固醇和血糖，如降低体重、增加锻炼。也可以使用合适的药物调节血压和胆固醇。

除了具有发生心血管疾病和2型糖尿病的增加的长期风险之外，代谢综合征的并发症还包括动脉粥样硬化、心脏病发作、肾病、非酒精性脂肪肝、周围动脉疾病和中风，以及通常与糖尿病相关的并发症。

A、糖尿病、胰岛素抵抗和胰岛素不足

糖尿病(Diabetes mellitus)(DM)，通常简称为糖尿病(diabetes)，是其中人具有高血糖的一组代谢疾病，高血糖或是由于身体未产生足够的胰岛素，或是由于细胞对产生的胰岛素没有反应。这种高血糖产生多尿(频繁排尿)、烦渴(口渴增加)和多食(饥饿增加)的典型症状。

2型糖尿病产生于胰岛素抵抗，其为细胞不能适当地使用胰岛素的情况，有时结合绝对的胰岛素缺乏。身体组织对胰岛素的缺陷反应被认为是至少部分地涉及胰岛素受体。但是，具体缺陷并未知晓。

在2型糖尿病的早期阶段，主要的异常是胰岛素敏感性降低。在这个阶段，可以通过改善胰岛素敏感性或减少肝脏的葡萄糖产生的多种措施和药物来逆转高血糖症。前驱糖尿病表示人的血糖水平高于正常值但未高至诊断为2型糖尿病时发生的一种状况。

2型糖尿病在胰岛素抵抗的情况下是由于β细胞的胰岛素产生不足。胰岛素抵抗(是细胞不能对正常水平的胰岛素做出充分的反应)主要发生在肌肉、肝脏和脂肪组织中。在肝脏中，胰岛素通常抑制葡萄糖释放。但是在胰岛素抵抗的情况下，肝脏向血液中不适当地释放葡萄糖。胰岛素抵抗与β细胞功能失调的比例在个体中不同，其中一些人主要具有胰岛素抵抗而在胰岛素分泌中仅有少量缺陷，而其他人具有轻微的胰岛素抵抗而主要是胰岛素分泌的缺乏。

与2型糖尿病和胰岛素抵抗相关的其它潜在重要的机制包括：脂肪细胞中增加的脂质分解、对肠促胰岛素的抗性和肠促胰岛素缺乏、血液中高的胰高血糖素水平、肾的盐水保留增加以及中枢神经系统的不适当的代谢调节。但是，并非所有具有胰岛素抵抗的人都发生糖尿病，因为还需要胰腺β细胞的胰岛素分泌的减损。

1型糖尿病产生于身体不能生产胰岛素，并且目前需要注射胰岛素治疗。1型糖尿病的特征是胰腺中朗格汉斯氏岛的胰岛素产生贝塔细胞的丧失，导致胰岛素不足。当发作时，大部分受影响的人是其它方面健康的并有健康的体重。对胰岛素的敏感性和反应性通常是正常的，特别是在早期。但是，特别地在后期，可能发生胰岛素抵抗。

B、糖尿病、胰岛素抵抗和胰岛素不足的继发病理

由糖尿病(1型和2型)、胰岛素抵抗和胰岛素不足产生的异常葡萄糖调节与继发病理相关，这其中的许多都是源自不良循环。这样的继发病理包括黄斑变性、周围神经病、溃疡和延迟伤口愈合以及降低的肾功能。已经表明，将葡萄糖水平和HblAc水平维持在正常范围内降低了这些继发病理的发生。应当理解，血糖、胰岛素和Hb1Ac水平的正常化将通过限制原发病理(如代谢综合征)而减少继发病理的发生。在一些实施方式中，HSP90抑制剂，特别是HSP90β抑制剂和HSP90β特异性抑制剂，不用于治疗与糖尿病和代谢综合征相关的继发病理。在一些实施方式中，HSP90抑制剂，特别是HSP90β抑制剂和HSP90β特异性抑制剂，用于治疗与糖尿病和代谢综合征相关的继发病理。

II.施用剂量和方式

给药的技术和剂量根据化合物的类型(如，化学化合物、抗体或核酸)而变化，并且是本领域技术人员公知的或容易确定的。

本发明的治疗化合物可以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起以单位剂量的形式给药。给药可以是肠胃外的、静脉内的、皮下的、口服的、局部的或本部分的。可以由协同工作的多个人施用试剂。施用试剂包括，例如，为受试者开具待施用的试剂的处方和/或直接地或通过另一人提供接受特定试剂的指导，或者通过自递送，如，通过口服递送、皮下递送、经由中央静脉导管静脉内递送等；或者通过经培训的专业人员递送，如静脉内递送、肌肉内递送、瘤内递送等。

所述组合物可以是用于口服施用的丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放的片剂的形式；或是用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体；或是用于局部给药的聚合物或其它持续释放的媒介。

本领域公知的用于制备制剂的方法可以在例如“Remington:The Science andPractice of Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)”中找到。用于肠胃外给药的制剂可以，例如，包含赋形剂、灭菌水、盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(如，生物可降解的纳米颗粒、固态脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制所述化合物的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。制剂中化合物的浓度根据多种因素变化，包括，待施用药物的剂量以及给药途径。

化合物可以任选地作为药学上可接受的盐施用，如在制药工业中通常使用的非毒性酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的例子包括有机酸如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、安息香酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等等；聚合酸如丹宁酸、羧甲基纤维素等等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等等。金属络合物包括锌、铁等等。

用于口服使用的制剂包括含有与非毒性的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘剂(如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅石、氢化植物油或滑石)。用于口服使用的制剂还可以以可咀嚼片剂、或硬明胶胶囊(其中，活性成分与惰性固体稀释剂混合)、或软明胶胶囊(其中，活性成分与水或油介质混合)提供。

施用所述化合物的剂量和时机取决于多种临床因素，包括受试者的总体健康情况和疾病(如，糖尿病、代谢综合征)症状的严重性。

III、核酸治疗剂

核酸治疗剂是本领域公知的。核酸治疗剂包括与细胞中的靶序列互补的单链核酸和双链核酸(即，互补区的长度为至少15个核苷酸的核酸治疗剂)。核酸治疗剂可以递送至培养物中的细胞，例如，通过将所述核酸单独或与促使所述核酸摄取至细胞中的制剂一起添加至培养基中。可以通过任何施用途径将核酸治疗剂递送至受试者的细胞(即，体内)中。特定的制剂将取决于施用途径。

如在本文中所使用的，除非另有其它说明，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，如本领域技术人员所理解的，术语“互补”指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多聚核苷酸在特定条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多聚核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。这样的条件可以是，例如，严格条件，其中所述严格条件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃进行12-16小时，然后清洗。可以使用其它条件，如在有机体内可以遇到的生理相关条件。技术人员能够根据杂交的核苷酸的最终应用确定最适于测试两条序列的互补性的条件集合。

当第一核苷酸序列的核苷酸与第二核苷酸序列的核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整个长度上存在碱基配对时，对于各序列来说序列可以是“完全互补的”。但是，在本文中当第一序列被称为与第二序列“基本互补”时，这两条序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可以形成一个或多个但通常不超过4、3或2个错配碱基对，而同时保持在与它们最终应用最相关的条件下杂交的能力。但是，当两个核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端(如在双链核酸治疗剂中所常见的)时，这样的突出端在确定互补性时不应当被认为是错配。例如，包括长度为21个核苷酸的寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一寡核苷酸的dsRNA(其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列)出于本文所描述目的可以被称为是“完全互补的”。

在满足与其杂交能力相关的上述要求的限度内，如在本文中所使用的“互补的”序列还可以包括非沃森-克里克碱基对和/或由非天然的和修饰的核苷酸形成的碱基对或完全由其形成。这样的非沃森-克里克碱基对包括但不限于，G:U摆动或Hoogstein碱基配对。

如将从其所使用的环境所理解的，本文中的术语“互补的”、“完全互补的”和“基本上互补的”可以用于dsRNA的有义链和反义链之间、或dsRNA和靶序列的反义核酸或反义链之间的碱基配对。

如在本文中所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本互补的”多核苷酸指与目标mRNA(即，编码HSP90，特别是HSP90β的mRNA)的连续部分(包括5’UTR、开放阅读框(ORF)或3’UTR)基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码HSP90，特别是HSP90β的非中断部分基本上互补，则该多核苷酸与HSP90，特别是HSP90β的mRNA的至少一部分互补。

涉及反义核酸、化学修饰和治疗用途的专利提供在例如涉及化学修饰的含RNA治疗化合物的美国专利No.5,898,031及与使用这些化合物作为治疗剂的方法相关的美国专利No.6,107,094中。美国专利No.7,432,250涉及通过施用单链的化学修饰RNA样化合物治疗患者的方法；和美国专利No.7,432,249涉及包含单链的化学修饰RNA样化合物的药物组合物。美国专利No.7,629,321涉及使用具有多个RNA核苷和至少一个化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。本段中所列的各专利通过引用并入本文。

治疗性核酸可以包括天然的(即，A、G、U、C或T)或修饰的(7-脱氮杂鸟苷、肌苷等)碱基。另外，核苷酸中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的连接接合，只要它不干扰杂交。因此，抑制性核酸可以是其中组成碱基通过磷酸二酯键以外的肽键接合的肽核酸。抑制性核酸可以通过使用已知方法将RNA转化成cDNA来制备(参见，例如，Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology Wiley 1999)。抑制性核酸也可以是cRNA(参见，例如，Park等,(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun.325(4):1346-52)。

治疗性核酸可以从合成方法如亚磷酰胺方法、H-膦酸酯方法和亚磷酸三酯(phosphite trimester)方法产生。抑制性核酸也可以通过PCR方法产生。这类方法产生与mRNA互补的cDNA和cRNA序列。治疗性核酸的合成方法不是本发明的限制因素。

核酸治疗剂通常包括一个或多个化学修饰以提高其稳定性及调节其药代动力学和药效学特性。例如，核苷酸上的修饰可以包括，但不限于LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基及其组合。

核酸治疗剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间连接修饰可以在链的任何位置处发生于(在包括有义链的核酸治疗剂中的)有义链或反义链或两者的任何核苷酸上。例如，核苷酸间连接修饰可以发生于有义链或反义链的每一核苷酸上；各核苷酸间连接修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或者有义链或反义链可以交替模式包含两种核苷酸间连接修饰。有义链上的核苷酸间连接修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，且有义链上核苷酸间连接修饰的交替模式可以具有相对于反义链上核苷酸间连接修饰的交替模式的位移。

其它修饰包括作为核糖核酸(即，A、C、G和U)和脱氧核糖核酸(即，A、C、G和T)中发生的标准碱基、糖和/或磷酸酯骨架化学结构的变异的修饰碱基(或修饰核苷或修饰核苷酸)的引入。该范围中包括，例如，Gm(2'-甲氧基鸟嘌呤核苷酸)、Am(2'-甲氧基腺嘌呤核苷酸)、Cf(2'-氟胞嘧啶核苷酸)、Uf(2'-氟尿嘧啶核苷酸)、Ar(核糖腺嘌呤核苷酸)。适体也可以包括胞嘧啶或任何胞嘧啶相关碱基，包括5-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-卤代胞嘧啶(例如，5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶和5-碘胞嘧啶)、5-丙炔基胞嘧啶、6-氮胞嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、N4,N4-桥亚乙基胞嘧啶、吩噁嗪胞苷、吩噻嗪胞苷、咔唑胞苷或吡啶吲哚(pyridoindole)胞苷。适体也可以包括鸟嘌呤或任何鸟嘌呤相关碱基，包括6-甲基鸟嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、6-丙基鸟嘌呤、8-卤代鸟嘌呤(例如，8-氟鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤和8-碘鸟嘌呤)、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤或3-去氮杂鸟嘌呤。适体还可以进一步包括腺嘌呤或任何腺嘌呤相关碱基，包括6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、8-卤代腺嘌呤(例如，8-氟腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-氯腺嘌呤和8-碘腺嘌呤)、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-卤代腺嘌呤(例如，2-氟腺嘌呤、2-溴腺嘌呤、2-氯腺嘌呤和2-碘腺嘌呤)、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤或3-去氮杂腺嘌呤。还包括尿嘧啶或任何尿嘧啶相关碱基，包括5-卤代尿嘧啶(例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶)、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氮尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。

本领域已知的其它修饰碱基变体的实例包括，但不限于，例如4-乙酰基胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2'-甲氧基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷(thioridine)、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、b-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、b-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-b-D-核糖呋喃基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-b-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)N-甲基-氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-羟乙酸甲基酯、尿苷-5-羟乙酸(v)、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-b-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷和怀丁苷(wybutosine)、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷。

还包括美国专利No.3,687,808、3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941(其各通过引用全文并入本文)中描述的修饰的核碱基。本领域中已知的修饰的核苷和核苷酸糖骨架变体的实例包括，但不限于具有例如2’核糖基取代基如F、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂、CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、OCH₂CH₂OCH₃、O(CH₂)₂ON(CH₃)₂、OCH₂OCH₂N(CH₃)₂、O(C_1-10烷基)、O(C_2-10烯基)、O(C_2-10炔基)、S(C_1-10烷基)、S(C_2-10烯基)、S(C_2-10炔基)、NH(C_1-10烷基)、NH(C_2-10烯基)、NH(C_2-10炔基)和O-烷基-O-烷基的那些。所需的2’核糖基取代基包括2'-甲氧基(2'-OCH₃)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂)、2'-O-烯丙基(2'-CH₂-CH＝CH₂)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH₂-CH＝CH₂)、2'-氨基(2'-NH₂)和2'-氟(2'-F)。2’-取代基可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位

A.单链核酸治疗剂

反义核酸治疗性试剂是单链核酸治疗剂，通常长度约16-30个核苷酸，并与靶细胞中(培养物中或有机体中)的靶核酸序列互补。

在另一个方面中，试剂是单链反义RNA分子。反义RNA分子与靶mRNA内的序列互补。反义RNA可以通过与mRNA的碱基配对和物理阻碍翻译机制以化学计量方式抑制翻译，参见Dias,N.等,(2002)Mol Cancer Ther 1:347-355。反义RNA分子可以具有与靶mRNA互补的约15-30个核苷酸。例如，反义RNA分子可以具有与靶mRNA互补的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列。

涉及反义核酸、化学修饰和治疗使用的专利提供于例如涉及化学修饰的含RNA治疗化合物的美国专利No.5,898,031及与使用这些化合物作为治疗剂的方法相关的美国专利No.6,107,094中。美国专利No.7,432,250涉及通过施用单链的化学修饰RNA样化合物治疗患者的方法；和美国专利No.7,432,249涉及包含单链的化学修饰RNA样化合物的药物组合物。美国专利No.7,629,321涉及使用具有多个RNA核苷和至少一个化学修饰的单链寡核苷酸切割靶mRNA的方法。本段中所列的各专利的全部内容通过引用并入。B.双链核酸治疗剂

本发明的核酸治疗性试剂也包括双链核酸治疗剂。如本文中可互换使用的，“RNAi剂”、“双链RNAi剂”、双链RNA(dsRNA)分子(也称为“dsRNA剂”、“dsRNA”、“siRNA”、“iRNA剂”)是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两个反平行的和如以下定义的基本上互补的核酸链的双链体结构。如本文中使用的，RNAi剂也可以包括dsiRNA(参见，例如美国专利公开20070104688，通过引用并入本文)。一般地，各链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中描述的，各链或两条链也可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如本说明书中使用的，“RNAi剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可以在多个核苷酸处包括重大的修饰。这类修饰可以包括本文中公开的或本领域中已知的所有类型的修饰。如siRNA型分子中使用的，任何这类修饰为本说明书和权利要求的目的被“RNAi剂”涵盖。

形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或它们可以是单独的RNA分子。在两条链是一个较大分子的部分且因此通过形成双链体结构的一条链的3’端和相应另一条链的5’端之间的非间断核苷酸链连接的情况中，连接RNA链称为“发夹环”。在两条链通过形成双链体结构的一条链的3’端和相应另一条链的5’端之间的非间断核苷酸链以外的方式共价连接的情况中，连接结构称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸减去双链体中存在的任何突出端的数目。除了双链体结构，RNAi剂可以包含一个或多个核苷酸突出端。术语“siRNA”也在本文中用于指如上所述的RNAi剂。

在许多实施方式中，双链体区域长度是15-30个核苷酸对。在一些实施方式中，双链体区域长度是17-23个核苷酸对、长度是17-25个核苷酸对、长度是23-27个核苷酸对、长度是19-21个核苷酸对或长度是21-23个核苷酸对。

在某些实施方式中，各链具有15-30个核苷酸。

用于本发明的方法中的RNAi剂包括如例如2011年11月18日提交的美国临时申请No.61/561,710、2010年9月15日提交的国际申请No.PCT/US2011/051597和PCT公开WO2009/073809(其各自的全部内容通过引用并入本文)中公开的具有化学修饰的试剂。术语“反义链”是指包括与靶序列(例如，人TTR mRNA)基本上互补的区域的双链RNAi剂的链。如本文中使用的，术语“与编码运甲状腺素蛋白的mRNA的部分互补的区域”是指反义链上与TTR mRNA序列的部分基本上互补的区域。在其中互补性区域不与靶序列完全互补的情况中，错配在末端区域中是最耐受的且(如果存在)一般在一个或多个末端区域中，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3或2个核苷酸内。

如本文中使用的术语“有义链”是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的dsRNA的链。

IV.诊断和治疗性抗体

本发明的诊断和治疗方法可以包括抗体(包括多克隆和单克隆抗体)的使用。如本文中使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指仅包含一个种类的能够与特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的抗体分子的群体。用于本发明中的抗体包括结合HSP90的抗体，优选为HSP90β特异性的抗体。抗体可以从商业来源获得或使用已知方法产生。

多克隆抗体可以通过用本发明的蛋白质作为免疫原免疫适宜的受试者而制备。免疫的受试者中的抗体滴度可以通过标准技术如使用固定的多肽通过酶联免疫吸附分析(ELISA)随时间监测。在免疫后的适当时间，例如当特异性抗体滴度最高时，产生抗体的细胞可以从受试者获得并用于通过标准技术制备单克隆抗体(mAb)，如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等,1983,Immunol.Today 4:72)、EBV-杂交瘤技术(参见Cole等,pp.77-96In MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,1985)或三源杂交瘤技术。用于产生杂交瘤的技术是公知的(一般地参见Current Protocols in Immunology,Coligan等编辑,John Wiley&Sons,New York,1994)。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养上清液中的结合目标多肽的抗体(例如，使用标准ELISA分析)进行检测。

作为制备单克隆抗体分泌杂交瘤的替代方式，针对本发明的蛋白质的单克隆抗体可以通过用目标多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)来鉴别和分离。用于生成和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，PharmaciaRecombinant Phage Antibody System,Catalog No.27-9400-01和Stratagene SurfZAPPhage Display Kit,Catalog No.240612)。另外，特别适合用于生成和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以发现于例如美国专利No.5,223,409；PCT公开No.WO 92/18619；PCT公开No.WO 91/17271；PCT公开No.WO 92/20791；PCT公开No.WO 92/15679；PCT公开No.WO 93/01288；PCT公开No.WO 92/01047；PCT公开No.WO 92/09690；PCT公开No.WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85；Huse等(1989)Science 246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J.12:725-734中。

特异性结合目标蛋白质的重组抗体也可以用于本发明的方法中。在优选的实施方式中，重组抗体特异性地结合目标蛋白质或其片段。重组抗体包括，但不限于嵌合和人源化单克隆抗体(包括人或非人部分两者)、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子，如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(参见，例如Cabilly等,美国专利No.4,816,567和Boss等,美国专利No.4,816,397，其通过引用全文并入本文中)。单链抗体具有抗原结合位点且由单一多肽组成。它们可以通过本领域中已知的技术产生，例如使用Ladner等，美国专利No.4,946,778(其通过引用全文并入本文中)；Bird等,(1988)Science 242:423-426；Whitlow等,(1991)Methods in Enzymology 2:1-9；Whitlow等,(1991)Methods in Enzymology 2:97-105和Huston等,(1991)Methods inEnzymology Molecular Design and Modeling:Concepts and Applications 203:46-88中描述的方法。多特异性抗体是具有至少两个特异性结合不同抗原的抗原结合位点的抗体分子。这类分子可以通过本领域中已知的技术产生，例如使用Segal,美国专利No.4,676,980(其公开内容通过引用全文并入本文中)；Holliger等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Whitlow等,(1994)Protein Eng.7:1017-1026和美国专利No.6,121,424中描述的方法。

人源化抗体是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的来自非人物种的抗体分子(参见，例如Queen,美国专利No.5,585,089，其通过引用全文并入本文中)。人源化单克隆抗体可以通过本领域中已知的重组DNA技术产生，例如使用PCT公开No.WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开No.WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240:1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature 314:446-449和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等(1986)Bio/Techniques 4:214；美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239:1534和Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060中描述的方法。

更特别地，人源化抗体可以例如使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠产生。转基因小鼠以正常方式用选择的抗原(例如，对应于本发明的标志物的多肽的全部或一部分)免疫。针对抗原的单克隆抗体可以使用常规杂交瘤技术获得。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中重排，且随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能产生治疗有用的IgG、IgA和IgE抗体。对于用于产生人抗体的这一技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13:65-93。对于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这一技术及用于产生这类抗体的方案的详细讨论，参见例如，美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016和美国专利5,545,806。另外，公司可以使用类似于以上描述的技术参与提供针对选择的抗原的人抗体。

识别选择的表位的完全人抗体可以使用称为“定向选择(guided selection)”的技术产生。在这种方式中，选择的非人单克隆抗体，例如鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等,1994,Bio/technology 12:899-903)。

本发明的抗体可以在产生后分离(例如，从受试者的血液或血清分离)或合成后分离和通过公知的技术进一步纯化。例如，IgG抗体可以使用蛋白A色谱纯化。对于本发明的蛋白质特异性的抗体可以通过例如亲和色谱进行选择或例如部分地纯化或纯化。例如，重组表达和纯化的(或部分纯化的)本发明蛋白质如本文中所述地产生，并共价或非共价地与固体支持物(如，例如，色谱柱)偶联。柱然后可以用于从包含针对大量的不同表位的抗体的样品中亲和纯化对于本发明的蛋白质特异性的抗体，从而生成基本上纯化的抗体组合物，即基本上不含污染抗体的组合物。基本上纯化的抗体组合物在这种情况中意思是抗体样品包含最多仅30％(以干重计)的针对所需的本发明蛋白质的表位以外的表位的污染抗体，且优选地最多20％，还更优选最多10％和最优选最多5％(以干重计)的样品是污染抗体。纯化的抗体组合物意思是组合物中至少99％的抗体针对所需的本发明蛋白质。

针对蛋白质的抗体可用于通过标准技术如亲和色谱或免疫沉淀分离蛋白质。此外，这种抗体可用于检测标志物蛋白质(例如，HSP90β)或其片段(例如，在细胞裂解产物或细胞上清液中)以评价标志物的水平和表达模式。抗体也可以例如作为临床检验程序的部分诊断地用于监测组织或体液中(例如，在疾病状态或毒性状态相关的体液中)的蛋白质水平，以例如测定给定治疗方案的效力。检测可以通过使用包含与可检测物质偶联的本发明抗体的抗体衍生物促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；和合适的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

抗体也可以用作治疗代谢综合征和/或糖尿病的治疗剂。

V.HSP90的小分子抑制剂

HSP90的小分子抑制剂包括，但不限于格尔德霉素(GM)类似物(例如，IPI-493IPI-50417-AAG(坦螺旋霉素)和17-DMAG(阿螺旋霉素)马克霉素类似物(例如，BC-274雷公藤红素(南蛇藤醇)根赤壳菌素类似物(例如，KF-55823和KF-58333BIIB-021BIIB-028,PU-H64PU-H71PU-DZ8PU-HZ151PU-DZ13SNX-2112SNX-5422SNX-2321SNX-7081SNX-8891,SNX-0723SAR-567530,ABI-287,ABI-328,AT-13387NSC-113497PF-3823863PF-4470296EC-102,EC-154,ARQ-250-RP,VER-50589VER-51047VER-82576VER-82160KW-2478BHI-001,AUY-922EMD-614684EMD-683671,XL-888KOS-2484,KOS-2539,CUDC-305MPC-3100CH-5164840NXD-30001NVP-HSP990SST-0201CL 1SST-0115AA1SST-0221AA1SST-0223AA1新生霉素(C-末端Hsp90i),herbinmycin A,ganetespibCCT018059,KU32KU135,KU174A4A4二聚体香豆霉素,葛杜宁,gamendazole或H2-gamendazole

取决于其作用机制，一些小分子抑制剂优选通过干扰N-末端ATP-结合结构域处ATP的结合和/或水解抑制HSP90，例如格尔德霉素(参见Sausville 等,Annu RevPharmacol Toxicol 2003；43:199-231,其通过引用并入本文)。其它HSP90抑制剂通过干扰C-末端ATP-结合结构域处ATP的结合和/或水解抑制HSP90，例如新生霉素(参见Marcu等,JBiol Chem 2000；275:37181-37186,其通过引用并入本文)。不是所有HSP90抑制剂通过干扰Hsp90蛋白质的任一末端处的ATP-结合位点而作用于HSP90。那些HSP90抑制剂的实例包括KU174、香豆霉素A1、南蛇藤醇、葛杜宁、H2-gamendazole和gamendazole(参见Matts等,Bioorganic&Medicinal Chemistry 19(2011)684–692和Tash等,Biology ofReproduction 2008；78,1139-1152,其通过引用并入本文)。在这些抑制剂中，例如，南蛇藤醇破坏Hsp90和激酶共-伴侣蛋白Cdc37之间的相互作用以有效地使Hsp90失能(参见Matts等,Bioorganic&Medicinal Chemistry 19(2011)684–692,其通过引用并入本文)。

许多已知的HSP 90抑制剂抑制HSP90α和HSP90β异形体，例如格尔德霉素和NVP-HS990。其它抑制剂显示对两种同型之一的偏好，如gamendazole和H2-gamendazole，其对于HSP90β是特异性的(参见Tash等,Biology of Reproduction 2008；78,1139-1152)。另外，HSP90β对于根赤壳菌素比HSP90α是更敏感的(参见Millson等,FEBS J 2007；274,4453-4463，其通过引用并入本文)。另外，对于HSP90β特异性的新抑制剂可以选自已知的HSP90β抑制剂或由本领域技术人员通过改变已知的特异性抑制剂如gamendazole或通过基于结合结构域(通过HSP90β和HSP90β特异性抑制剂例如gamendazole的共晶体学确定的)设计抑制剂来开发。

上述gamendazole，一种HSP90β特异性抑制剂，是氯尼达明的类似物。氯尼达明类似物是本领域中已知的。氯尼达明类似物的一些非限制性的实例描述于WO2006/023704和WO2011/005759(这两者的全部内容通过引用并入本文)中并通过下式表示：

其中R₁是羧基、或羧酸酰肼；

其中R₂是氢、卤素、醇、烷基、烷氧基、芳烷基、环烷基、卤代烷基、卤代烷氧基、氨基或羧基；

其中X和Y彼此相同或不同且是卤素或低级烷基；

其中Z₁、Z₂、Z₃和Z₄独立地是氮或碳；

及其药学上可接受的盐和酯。

这些氯尼达明类似物的实例包括，

6-氯-1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羧酸酰肼；

1-(2,4-二氯苄基)-6-氟-1H-吲唑-3-羧酸甲酯；

6-氟-1-(2,4-二氯苄基)-1H-吲唑-3-羧酸肼；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-氟-1H-吲唑-3-基]-丙烯酸；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-氯-1H-吲唑-3-基]-丙烯酸；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-三氟甲氧基-1H-吲唑-3-基]丙烯酸；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-氯-1H-吲唑-3-基]-丙酸；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-甲基-1H-吲唑-3-基]丙烯酸(TH 2-192)；

1-(2,4-二氯苄基)-6-甲基-1H-吲唑-3-羧酸(TH 2-178)；

1-(2,4-二氯苄基)-6-甲基-1H-吲唑-3-羧酸酰肼(TH 2-179)；

3-[1-(2,4-二氯苄基)-6-氯-1H-吲唑-3-基]-丙烯酸(JWS 1-190)；

1-(2-氯-4-氟苄基)-6-氯-1H-吲唑-3-羧酸酰肼(JWS 2-22)；和

1-(2,4-二氟苄基)-6-氯-1H-吲唑-3-羧酸酰肼(JWS 1-282)。

另外的氯尼达明类似物进一步描述于WO2006/015263和WO2006/015191中以及在Mok等,Reproduction,2011,141,571-580中(其各自通过引用并入本文)。这样的氯尼达明类似物的实例包括氯尼达明、Adjudin(AF-2364)、AF2785和CDB-4022。

香豆霉素和香豆霉素A1的一些类似物描述于WO2001/87309和WO2012/162054中(这两者通过引用并入本文)。其中香豆霉素类似物通过下式表示：

其中：

R¹、R²、X¹、X²、Y¹和Y²包括独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、直链脂族、支链脂族、环状脂族、杂环脂族、取代的脂族、未取代的脂族、饱和的脂族、未饱和的脂族、芳族、多环芳族、取代的芳族、杂芳族、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、糖、糖模拟物、其衍生物或它们的组合的部分、具有约0-20个碳或者杂原子或者O、N、S或P的碳链的脂族基团；且

接头包括直链脂族、支链脂族、环状脂族、杂环脂族、取代的脂族、未取代的脂族、饱和的脂族、未饱和的脂族、芳族、多环芳族、取代的芳族、杂芳族、胺、伯胺、仲胺、叔胺、脂族胺、羰基、羧基、酰胺、酯、氨基酸、肽、多肽、糖、糖模拟物、其衍生物或它们的组合。

香豆霉素类似物的实例通过下式表示：

其中X是连接分子的两半的含约1至约54个原子的接头。

南蛇藤醇和葛杜宁的一些类似物描述于WO2007/117466(其通过引用并入本文)中。在某些实施方式中，HSP90的小分子抑制剂抑制HSP90β。在某些实施方式中，HSP90的小分子抑制剂特异性地抑制HSP90β。

VI.代谢综合征的诊断方法

本发明进一步提供确定受试者为患有代谢综合征和/或糖尿病或具有患代谢综合征和/或糖尿病的风险的方法，包括检测来自受试者的样品中标志物蛋白质和/或核酸的表达水平。

用于检测生物样品中标志物蛋白质或核酸(例如，HSP90，特别地HSP90β)的存在或不存在的示例性方法包括从测试受试者获得生物样品(例如，组织样品)并使生物样品与能够检测多肽或核酸(例如，mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂接触。本发明的检测方法因此可用于例如体外以及体内检测生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA以用于代谢综合征的诊断。例如，用于检测mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测标志物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测基因组DNA的体外技术包括DNA印迹杂交。用于检测mRNA的体内技术包括聚合酶链反应(PCR)、RNA印迹杂交和原位杂交。此外，用于检测标志物蛋白质的体内技术包括将针对蛋白质或其片段的标记抗体引入受试者中。例如，抗体可以用其在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术检测的放射活性标志物进行标记。

这样的诊断和预后分析的一般原理包括在适宜的条件下和足够的时间内制备可以包含标志物和探针的样品或反应混合物以允许标志物和探针相互作用和结合，因此形成可以移除和/或在反应混合物中检测的复合物。这些分析可以按多种方式进行。

例如，进行这种分析的一种方法包括将标志物或探针锚定到固相支持物(也称为基质)上并在反应结束时检测锚定在固相上的靶标志物/探针复合物。在这种方法的一个实施方式中，待测定标志物的存在和/或浓度的受试者的样品可以锚定到载体或固相支持物上。在另一个实施方式中，相反的情况是可能的，其中探针可以锚定到固相上且来自受试者的样品可以被允许作为该分析的未锚定成分进行反应。

具有多种用于锚定分析成分到固相上的确立的方法。它们包括，但不限于通过生物素和抗生蛋白链菌素的偶联固定的标志物或探针分子。这样的生物素化分析成分可以使用本领域中已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals,Rockford,IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备，并固定在抗生蛋白链菌素包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。在某些实施方式中，具有固定的分析成分的表面可以预先制备并储存。

用于这类分析的其它合适的载体或固相支持物包括能够结合标志物或探针所属的分子种类的任何物质。公知的支持物或载体包括，但不限于玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和变性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。

为了用上述方式进行分析，未固定的成分添加到第二成分锚定于其上的固相上。在反应完成后，未复合的成分可以在使得所形成的任何复合物保持固定在固相上的条件下除去(例如，通过洗涤)。锚定于固相的标志物/探针复合物的检测可以在本文中概述的多种方法中实现。

在优选的实施方式中，探针在作为未锚定的分析成分时可以用本文中讨论的和本领域技术人员公知的可检测标记为检测和分析读数的目的直接地或间接地进行标记。

也可能直接检测标志物/探针形成而不需要任一成分(标志物或探针)的进一步操作或标记，例如通过利用荧光能量转移技术(参见，例如，Lakowicz等,美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos等,美国专利No.4,868,103)。第一、“供体”分子上的荧光团标记被选择以使得在用适宜波长的入射光激发时，其发射的荧光能量被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，第二“受体”分子随后能够由于吸收的能量而发荧光。可选地，“供体”蛋白质分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，以使得“受体”分子标记可以与“供体”的标记区分开。因为标记之间的能量转移效率与分隔分子的距离相关，所以可以评估分子之间的空间关系。在其中结合发生于分子之间的情况中，分析中“受体”分子标记的荧光发射应当是最大的。FRET结合事件可以通过本领域中公知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)方便地测量。

在另一个实施方式中，探针识别标志物的能力的测定可以通过使用如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术在无需标记任一分析成分(探针或标志物)的情况下进行(参见，例如Sjolander,S.和Urbaniczky,C.,1991,Anal.Chem.63:2338-2345及Szabo等,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705)。如本文中使用的，“BIA”或“表面等离子体共振”是用于实时地研究生物特异性相互作用而不标记任何相互作用物的技术(例如，BIAcore)。结合表面处质量的变化(结合事件的指示)导致靠近表面的光折射率的改变(表面等离子体共振(SPR)的光学现象)，从而产生可用作生物分子之间实时反应的指示的可检测信号。

或者，在另一个实施方式中，类似的诊断和预后分析可以用作为液相中的溶质的标志物和探针进行。在这种分析中，复合的标志物和探针通过多种标准技术中的任一种与未复合的成分分离，包括但不限于：差速离心、色谱、电泳和免疫沉淀。在差速离心中，标志物/探针复合物可以基于复合物的不同的尺寸和密度由于其不同沉降平衡通过一系列的离心步骤与未复合的分析成分分离(参见，例如Rivas,G.和Minton,A.P.,1993,TrendsBiochem Sci.18(8):284-7)。标准色谱技术也可以用于分离复合的分子与未复合的分子。例如，凝胶过滤色谱基于大小且通过利用柱形式的适宜凝胶过滤树脂分离分子，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合成分分离。类似地，与未复合成分相比标志物/探针复合物的相对差异电荷性质可以用于区分复合物与未复合的成分，例如通过利用离子交换色谱树脂。这类树脂和色谱技术对于本领域技术人员是公知的(参见，例如Heegaard,N.H.,1998,J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.和Tweed,S.A.J Chromatogr BBiomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2):499-525)。凝胶电泳也可以用于分离复合的分析成分与未结合的成分(参见，例如Ausubel等编辑,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。在这一技术中，例如，蛋白质或核酸复合物基于尺寸或电荷分离。为了在电泳过程中维持结合相互作用，在不存在还原剂的情况下的非变性凝胶基质材料和条件通常是优选的。对于特定分析及其成分的适宜条件是本领域技术人员公知的。

在特定实施方式中，标志物mRNA的水平可以通过原位和体外形式使用本领域中已知的方法在生物样品中测定。术语“生物样品”意在包括从受试者分离的组织、细胞、生物流体及其分离物，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，非针对mRNA的分离选择的任何RNA分离技术可以用于从细胞纯化RNA(参见，例如Ausubel等编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York 1987-1999)。另外，大量的组织样品可以容易地使用本领域技术人员中公知的技术加工，例如Chomczynski的单步骤RNA分离方法(1989,美国专利No.4,843,155)。

分离的mRNA可以用于杂交或扩增分析中，其包括，但不限于DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种优选的诊断方法包括使分离的mRNA与核酸分子(探针)(其可以与由所检测的基因编码的mRNA杂交)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，如长度为至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸且足以在严格条件下与编码本发明的标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明的诊断分析中的其它合适的探针在本文中描述。mRNA与探针的杂交表明所讨论的标志物正在表达。

在一种方式中，mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上分析分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜如硝基纤维素膜上。在替代的方式中，探针固定在固体表面上且mRNA与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地采用已知的mRNA检测方法以用于检测由本发明的标志物编码的mRNA的水平。

用于测定样品中mRNA标志物的水平的可选方法涉及核酸扩增的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利No.4,683,202中给出的实验实施方式)、连接酶链式反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193)、自持式序列复制(Guatelli等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等,1988,Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi等,美国专利No.5,854,033)或任何其它核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。这些检测方案特别可用于检测核酸分子，如果这类分子以非常低的数量存在。如本文中使用的，扩增引物定义为是可以对基因的5’或3’区域退火(分别正和负链，反之亦然)且包含其间的短区域的一对核酸分子。一般地，扩增引物长度为约10-30个核酸并侧邻长度约50-200个核苷酸的区域。在适宜的条件下和使用适宜的试剂，这类引物允许扩增包含引物侧邻的核苷酸序列的核酸分子。

对于原位方法，mRNA不需要在检测前分离。在这类方法中，细胞或组织样品使用已知的组织学方法制备/处理。样品然后固定在支持物(通常玻璃载玻片)上，且然后与可以与编码标志物的mRNA杂交的探针接触。

作为基于标志物的绝对表达水平进行测定的替代方式，测定可以基于标志物的标准化表达水平。表达水平通过将标志物的表达与非标志物的基因(例如，组成型表达的管家基因)的表达比较而校正标志物的绝对表达水平进行标准化。用于标准化的合适基因包括管家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。这种标准化允许一个样品(例如，患者样品)与另一个样品(例如，不同来源的非疾病样品)中表达水平的比较。

或者，表达水平可以提供为相对表达水平。为确定标志物的相对表达水平，标志物的表达水平在测定所讨论样品的表达水平之前对于10个或更多个正常相对疾病细胞分离物的样品测定，优选50个或更多个样品。测定了在大量样品中分析的各基因的平均表达水平，且这用作标志物的基线表达水平。对于测试样品测定的标志物的表达水平(绝对表达水平)然后除以对于该标志物获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。

优选地，用于基线测定的样品来自非疾病细胞。细胞源的选择取决于相对表达水平的使用。使用正常组织中发现的表达作为平均表达评分有助于验证所分析的标志物是否是疾病特异性的(相对于正常细胞)。另外，随着更多的数据被累积，平均表达值可以被修正，从而提供基于累积的数据的改善的相对表达值。来自疾病细胞的表达数据提供用于对疾病状态的严重性分级的平均值。

在本发明的另一实施方式中，检测标志物蛋白质HSP90，优选HSP90β。用于检测本发明的标志物蛋白质的优选试剂是能够结合这种蛋白质或其片段的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选是单克隆的。可以使用完整抗体或其片段或衍生物(例如，Fab或F(ab')₂)。用于探针或抗体的术语“标记的”意在包括通过将可检测物质偶联(即，物理连接)于探针或抗体的探针或抗体的直接标记以及通过与直接标记的另一试剂的反应性的探针或抗体的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和DNA探针用生物素的末端标记以使得其可以用荧光标记的抗生蛋白链菌素检测。

来自细胞的蛋白质可以使用本领域技术人员公知的技术分离。采用的蛋白质分离方法可以例如是如Harlow和Lane中描述的那些(Harlow和Lane,1988,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork)。

多种形式可以用于确定样品是否含有结合给定抗体的蛋白质。这类形式的实例包括，但不限于酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)。技术人员可以容易地采用已知的蛋白质/抗体检测方法用于确定细胞是否表达本发明的标志物。

在一种形式中，抗体或者抗体片段或衍生物可以用于如蛋白质印迹或免疫荧光技术的方法中以检测表达的蛋白质。在这类应用中，一般优选的是固定抗体或蛋白质在固体支持物上。合适的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和变性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。

本领域技术人员知道许多其它的用于结合抗体或抗原的合适载体，并能够采用这类支持物用于本发明中。例如，从疾病细胞分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行并固定到固相支持物如硝基纤维素上。支持物然后可以用合适的缓冲液洗涤，随后用可检测地标记的抗体处理。固相支持物然后可以再次用缓冲液洗涤以除去未结合的可检测地标记的抗体。固体支持物上结合的标记抗体的量然后可以通过常规方式检测。

本发明还包括用于检测生物样品中标志物蛋白质或核酸的存在的试剂盒。这样的试剂盒可以用于确定受试者是否患有特定疾病(例如，糖尿病和/或代谢综合征)或处于发生特定疾病的风险中。例如，试剂盒可以包含能够检测生物样品中的标志物蛋白质或核酸的标记化合物或试剂和用于测定样品中蛋白质或mRNA的量的手段(例如，结合蛋白质或其片段的抗体，或者结合编码蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒也可以包括用于解释使用试剂盒获得的结果的说明书。

对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含例如：(1)结合标志物蛋白质的第一抗体(例如，连接于固体支持物上)；和任选地，(2)结合蛋白质或第一抗体且与可检测的标记缀合的不同的第二抗体。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包含例如：(1)与编码标志物蛋白质的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测地标记的寡核苷酸，或(2)可用于扩增标志物核酸分子的一对引物。试剂盒也可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包含检测可检测标记必要的成分(例如，酶或底物)。试剂盒也可以包含可以进行分析和与测试样品对比的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各成分可以装入单独容器内且各种容器全部可以与用于解释使用试剂盒进行分析的结果的说明书一起在单一包装内。

在本文中提供的方法中，HSP90(特别是HSP90β)的调节的水平可以与一种或多种代谢综合征的指示剂(如本文中提供的那些)结合用作诊断指示剂。

重复的诊断分析可以用于监测受试者的疾病状态。

VII.代谢综合征的治疗

如本文中证明的，HSP90表达或活性(特别是HSP90β表达或活性)的抑制改善葡萄糖摄取、胰岛素信号传导和脂质代谢。本发明提供治疗患有代谢综合征的受试者的方法，包括施用HSP90的抑制剂，优选HSP90β抑制剂，更优选HSP90β抑制剂如本文中提供的那些，以缓解代谢综合征的至少一种征兆或症状。在某些实施方式中，HSP90的抑制剂，优选HSP90β特异性抑制剂，可以施用于受试者，其中用于治疗代谢综合征的至少一种另外的试剂施用于受试者。如本文中使用的，试剂可以按任一顺序依次地施用或同时地施用。多种试剂施用于受试者不需要试剂的共配制或相同的施用方案。

使用HSP90β抑制剂治疗代谢综合征的方法可以与用于治疗代谢综合征的已知方法和试剂结合。许多试剂和方案当前可用于治疗代谢综合征和糖尿病。选择用于治疗的特定试剂取决于受试者、特定的症状和疾病状态的严重性。例如，在某些实施方式中，HSP90β抑制剂可以与饮食和/或行为修正(例如，热限制)相结合单独地或与肥胖手术(bariatricsurgery)和/或与增加的体力活动组合施用。在某些实施方式中，HSP90β抑制剂可以与用于治疗2型糖尿病的药剂(例如，二甲双胍(Glucophage,Glumetza及其它)、格列酮类如匹格列酮(Actos)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta,Glynase)、格列美脲(Amaryl)、阿卡波糖(Precose)、二甲双胍(Glucophage)、西他列汀(Sitagliptin)(Januvia)、沙格列汀(Onglyza)、瑞格列奈(Prandin)、那格列奈(Starlix)、艾塞那肽(Byetta)、利拉鲁肽(Victoza)或胰岛素)一起施用。

VIII.代谢综合征的动物模型

代谢综合征如1型和2型糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症的多种遗传和诱导动物模型是本领域中良好表征的。这类动物可用于证明HSP90抑制剂(例如，HSP90β抑制剂)治疗糖尿病的效果。1型糖尿病的模型包括，但不限于NOD小鼠及链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和小鼠(1型糖尿病的模型)。2型糖尿病的遗传和诱导模型包括，但不限于瘦蛋白缺陷的ob/ob小鼠、瘦蛋白受体缺陷的db/db小鼠和高脂饮食的小鼠或大鼠模型。在各种模型中，特定疾病特征发生的时间表是公知的。HSP90抑制剂可以在糖尿病的症状出现之前和之后施用以证明HSP90抑制剂(特别是HSP90β抑制剂)在这些动物模型中预防或治疗糖尿病的效力。

取决于所选择的特定动物模型和干预的时间(例如，代谢综合征出现之前和之后)，动物模型可以用于证明本文中提供的方法用于预防、治疗、诊断和监测代谢综合征的效力。

IX.试剂盒

本发明还提供用于诊断疾病状态(例如，代谢综合征)的组合物和试剂盒。

这些试剂盒包括以下的一种或多种：特异性结合HSP90β的可检测的抗体及特异性结合HSP90β抗体的可检测抗体、用于获得和/或制备用于染色的受试者组织样品的试剂和使用说明中的一种或多种。

本发明的试剂盒可以任选地包含可用于执行本发明的方法的另外的成分。举例来说，试剂盒可以包含适合于退火互补核酸或适合于将抗体与其所特异性结合的蛋白质结合的流体(例如，SSC缓冲液，TBST)、一个或多个样品隔室、描述本发明方法的性能的指导材料和组织特异性的对照/标准品。

本发明还提供用于治疗代谢障碍的试剂盒。试剂盒包括至少一种HPS90抑制剂，优选HSP90β特异性的抑制剂，及使用说明和施用装置(如所需要的)中的一种或多种。

实施例

实施例1–采用平台技术鉴别作为糖尿病病因学中的重要活性节点的HSPAB1(HSP90β)

在这一实施例中，国际专利申请No.PCT/US2012/027615中详细描述的平台技术用于整合从定制糖尿病模型获得的数据和鉴别驱动糖尿病的病理发生的新蛋白质/途径。从这一分析获得的关系图谱已经鉴别HSPAB1(HSP90β)为糖尿病病因学中的重要活性节点。因此，HSPAB1(HSP90β)是重要的糖尿病治疗靶标以及与糖尿病相关的诊断/预后标志物。

五种原代人细胞系，即脂肪细胞、肌管、肝细胞、主动脉平滑肌细胞(HASMC)和近端肾小管细胞(HK2)经受模拟这些疾病相关细胞在体内经历的环境的五种条件之一。具体地，这五种细胞系各自单独地暴露于各以下条件：高血糖条件、高脂血条件、高胰岛素血条件、低氧条件和乳酸暴露。高血糖条件通过在含有22mM葡萄糖的培养基中培养细胞来诱导。高脂血条件通过在含有0.15mM棕榈酸钠的培养基中培养细胞来诱导。高胰岛素血条件通过在含有1000nM胰岛素的培养基中培养细胞来诱导。低氧条件通过将细胞置于用含有5％CO₂、2％O₂和93％氮气的工业气体混合物注满的Modular Incubator Chamber(MIC-101,Billups-Rothenberg Inc.Del Mar,CA)中来诱导。各细胞系也用0或12.5mM的乳酸进行处理。

另外，进行了两个不同细胞对，人主动脉平滑肌细胞(HASMC)(细胞系统1)和人肾2(HK2)细胞(细胞系统2)或者肝细胞(细胞系统1)和脂肪细胞(细胞系统2)，之间的交互试验，其中配对的细胞进行共培养。这一共培养方式称为细胞外分泌组(ECS)试验。第一细胞系统(例如，HASMC)首先接种于transwell型生长室的孔的插入物中。六孔板用于使得能够进行更好的统计分析。在插入物中用第一细胞系统接种时，插入物置于独立的6孔板中。第二细胞系统(例如，HK2)接种在主盘(primary tray)上。包含第一细胞系统的插入盘和包含第二细胞系统的主盘在37℃下孵育过夜。各细胞系统在特定的细胞特异性培养基中生长(其中可选地，各细胞系统可以在适应于支持两种细胞类型的生长的培养基中生长)。在第二天，预定的处理通过培养基交换给予。具体地，包含第一细胞系统的插入物放置于包含第二细胞系统的主盘中。该盘然后孵育预定的时间段，例如24小时或48小时。用相同的条件设置重复孔，且细胞汇合以产生足够的材料用于2D分析。培养基(1ml等份)、来自插入物的细胞和来自主盘的孔的细胞作为单独的样品收获。该试验一式三份地进行以提供更好的统计学分析能力。

交互试验也通过“培养基交换”试验进行。具体地，经培养的培养基或来自第一细胞系统(HASMC)的“分泌组”在扰动或条件化后的24小时或48小时后收集，且然后添加到第二细胞系统(脂肪细胞)中24-48小时。然后收集最终的经培养的培养基或来自第二细胞系统的“分泌组”。所有的最终分泌组进行蛋白质组分析。

包含上述细胞的细胞模型(其中细胞暴露于以上描述的各条件)另外地通过用辅酶Q10处理而使细胞暴露于“环境扰动”进行“探询”。具体地，细胞用0、50μM或100μM的辅酶Q10处理。

各细胞系、条件和辅酶Q10处理的细胞样品在处理后的各个时间收集，包括处理的24小时和48小时后。对于特定细胞和在特定条件下，培养基样品也进行收集和分析。

通过定量蛋白质组学对总细胞蛋白质表达改变的iProfiling分析使用以上详细说明中描述的技术对于在各条件下和具有各“环境扰动”(即，辅酶Q10处理)的各细胞系收集的细胞和培养基样品进行。

然后对于在各条件下和具有各扰动的以上所列各细胞系收集的蛋白质组学数据及对于在各条件下和具有各扰动的各细胞系收集的生物能量学谱分析数据通过REFS^TM系统处理。复合扰动网络从自暴露于扰动(CoQ10)的一种特定条件(例如，高血糖)的所有细胞系获得的组合数据生成。复合未扰动网络从自没有扰动(没有CoQ10)的一种相同的特定条件(例如，高血糖)的所有细胞系获得的组合数据生成。类似地，复合扰动网络从自暴露于扰动(CoQ10)的第二种对照条件(例如，正常血糖)的所有细胞系获得的组合数据生成。复合未扰动网络从自没有扰动(没有CoQ10)的第二种相同的对照条件(例如，正常血糖)的所有细胞系获得的组合数据生成。

如上所述的一致复合网络中的各节点(通过增加或减少10倍)模拟以使用REFS^TM生成模拟网络，如在以上详细说明中具体描述的。

曲线下面积和连接模拟网络中的父节点和子节点的各边缘的倍数改变使用R编程语言通过定制的程序提取，其中R编程语言是用于统计计算和作图的开放源软件环境。

Δ网络从模拟的复合网络生成。为生成响应于辅酶Q10的糖尿病疾病状态对正常状态的差异网络(Δ-Δ网络)，比较的步骤如图1中所示的使用PERL编程语言通过定制程序进行。

具体地，如图1中所示，处理T1是指辅酶Q10处理且NG和HG是作为状态的指正常和高血糖。NG∩HGΔ网络中来自NG的独特边缘与HG∩HGT1Δ网络中HGT1的独特边缘比较。NG和HGT1的交集中的边缘是利用T1恢复为NG的HG边缘。利用T1恢复为NG的HG边缘重叠在NG∩HGΔ网络上(图2中较深色的圆圈所示)。

具体地，正常血糖(NG)状态的模拟复合图谱和高血糖(HG)状态的模拟复合图谱使用定制PERL程序进行比较以生成正常血糖状态的独特边缘。没有辅酶Q10处理的高血糖状态(HG)的模拟复合图谱和具有辅酶Q10处理的高血糖状态(HGT1)的模拟图谱使用定制PERL程序进行比较以生成具有辅酶Q10处理的高血糖状态(HGT1)的独特边缘。正常血糖状态(NG)的独特边缘与具有辅酶Q10处理的高血糖状态(HGT1)的独特边缘的交集中的边缘使用PERL程序确定。这些边缘代表通过辅酶Q10处理从高血糖状态恢复为正常血糖的因素/网络。利用辅酶Q10处理恢复到正常的高血糖边缘的Δ-Δ网络重叠在正常血糖∩高血糖Δ网络上。

来自PERL和R程序的输出被输入到Cytoscape(一种开放源程序)中以生成在Δ-Δ网络与正常血糖对高血糖Δ网络中用辅酶Q10处理恢复到正常状态的高血糖边缘之间的重叠网络的可视化表示。代表重叠网络的Cytoscape程序的输出显示于图2中。图2中的较深色圆圈是通过辅酶Q10处理从高血糖状态恢复到正常血糖状态的确定的边缘。图2中较浅色的圆圈是确定的独特正常血糖(hypercemia)边缘。图2中所示的框中的子网络进行放大并表示于图3中。HSP90AB1(HSP90β)是作为通过辅酶Q10处理从高血糖状态恢复到正常血糖状态的边缘的所鉴别标志物之一(参见图3)。

图3代表来自Interrogative糖尿病输出的HSP90AB1(HSP90β)和目标因果节点的相关性图谱。图4代表用于差异网络图谱中以描绘疾病和正常细胞模型中蛋白质的因果相关性的符号和颜色代码的列表。HSP90AB1(HSP90β)在这一重叠的Δ-Δ网络中确定为糖尿病的潜在治疗因子、药物靶标和生物标志物。

实施例2–细胞底物代谢和胰岛素信号传导的HSP90β调节

A.材料和方法：

1.人成肌细胞分化成肌管：

人骨骼肌成肌细胞(HSMM)从PromoCell取得并在由销售商推荐的生长培养基中培养。汇合的培养物用分化培养基(DMEM、2％马血清、丙酸酸盐和HEPES)替换并且允许细胞分化7-10天。

2.Hsp90β的siRNA/HSP90的抑制：:

来自的商业可得的三联体(trifecta)siRNA用于Hsp90β的特异性敲减。作为对照，乱序siRNA包括在所有试验中。提供的所有三种siRNA使用转染试剂单独地转染。Hsp90β敲减通过蛋白质印迹和使用商业可得的对于人Hsp90β蛋白质和mRNA特异性的抗体和引物探针的qPCR进行确认。HSP90抑制剂CCT018159从Tocris Bioscience获得。

3.siHsp90β序列信息：

H1:

双链体序列

5'-rArGrG rCrCrG rArCrA rArGrA rArUrG rArUrA rArGrG rCrAG T-3'(SEQ IDNO:1)

5'-rArCrU rGrCrC rUrUrA rUrCrA rUrUrC rUrUrG rUrCrG rGrCrC rUrCrA-3'(SEQ ID NO:2)

H2:

双链体序列

5'-rCrArA rCrGrA rUrGrA rUrGrA rArCrA rGrUrA rUrGrC rUrUG G-3'(SEQ IDNO:3)

5'-rCrCrA rArGrC rArUrA rCrUrG rUrUrC rArUrC rArUrC rGrUrU rGrUrG-3'(SEQ ID NO:4)

H3:

双链体序列

5'-rCrGrU rUrGrC rUrCrA rCrUrA rUrUrA rCrGrU rArUrA rArUC C-3'(SEQ IDNO:5)

5'-rGrGrA rUrUrA rUrArC rGrUrA rArUrA rGrUrG rArGrC rArArC rGrUrA-3'(SEQ ID NO:6)

4.胰岛素信号传导试验：

使用前一周接种于12孔板中的人HSMM肌管细胞。吸出培养基并添加具有适当稀释的NC和用于Hsp90敲减的H3siRNA的新鲜培养基，以使得该板的孔中的最终浓度是100nM。Mirus TKO转染试剂用于转染细胞。板然后在37℃下孵育过夜。

吸出培养基且细胞洗涤两次—首先用温PBS和其次用含生长培养基的0.1％BSA。细胞然后在含适宜抑制剂的0.1％分化培养基中在37℃下血清饥饿2-3小时，接着胰岛素刺激5分钟(0、10和100nM胰岛素)。

孔然后用PBS洗涤一次，并收获到含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的100μlRIPA缓冲液中。板置于冰上，并使用细胞刮棒从板刮取细胞。溶解产物收集在1.5ml Eppendorf管中并通过使用注射器和针头均质化。溶解产物然后在4℃下以14,000RPM离心10分钟。溶解产物储存在-20℃下以备将来使用。

蛋白质含量通过BCA分析进行评估，且样品制备用于凝胶电泳和蛋白质印迹，如后续章节中描述的。计算加载10μg的总蛋白质所需的总体积。

样品加载到bis-tris或tris-甘氨酸-SDS凝胶上。蛋白质使用常规湿式或干式转移方法转移到PVDF或硝基纤维素膜上。膜然后使用封闭缓冲液封闭至少一小时。膜然后在暴露于在封闭缓冲液中稀释的适宜初级抗体进行孵育之前进行切割。pAKT(p-Akt,S473)、pERK(p-Erk,磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204))和pGSK3β(磷酸-GSK-3β(Ser9))的初级抗体从Cell Signaling获得。其它抗体也从商业来源获得。膜置于振摇器中并在冰箱(4℃)中孵育过夜。

蛋白质的可视化和蛋白质印迹的定量如下进行。膜使用1X PBS-T洗涤三次(每次10分钟)。适宜的HRP偶联二级抗体在封闭缓冲液中稀释(1:10,000)并添加到各膜。膜在振摇器中室温下孵育至少一小时。膜用PBS-T洗涤三次(每次10分钟)。在最终洗涤后，膜保持在PBS-T中直到蛋白质的检测。

获取各膜的条带排列在清洁平面中。化学发光底物(PICO或DURA)添加到各膜上并孵育5分钟。膜然后置于清洁塑料片中用于使用化学发光成像仪可视化。条带使用软件定量。

5.胰岛素刺激的葡萄糖摄取：

HSMM成肌细胞(20000细胞/孔)在试验前用2％马血清在96孔板中分化7天。细胞用含0.1％BSA的200ul MBSS缓冲液洗涤两次，且然后用100 ul MBSS 0.1％BSA血清饥饿4小时。一些孔也用25uM LY化合物预处理20分钟。在胰岛素刺激开始时，MBSS 0.1％BSA缓冲液中的100ul 2x试剂添加到100ul饥饿培养基中以得到用于试验的1x浓度。2x试剂是：胰岛素(0、20nM和200nM)；2NBDG(500uM)。细胞用胰岛素和2NBDG处理30min，然后用MBSS缓冲液洗涤两次，然后将50ul MBSS缓冲液添加到孔中。葡萄糖摄取用荧光计与其中没有细胞的孔的背景检测一起进行检测。在荧光计读数后，固定剂(福尔马林，50ul)添加到孔的50ul MBSS中，然后100ul的1uM DAPI添加到100ul福尔马林和MBSS混合物中。

6.肌管的生物能量学谱分析：

在分析盒的孔中培养的HSMM肌管用2％马血清肌细胞分化培养基分化7天。细胞如上所述按照销售商的指示(Mirus)用50nM浓度的TKO转染试剂用阴性对照乱序siRNA或siHsp siRNA转染。在转染48小时后，细胞使用调节细胞能量学的药物(即寡霉素、羰基氰化物-M-氯苯基肼(CCCP)和鱼藤酮)进行生物能量学分析。寡霉素抑制线粒体ATP合成酶(ET链的复合物V)并允许分析糖解能力。CCCP是泵送质子到线粒体膜外(从而诱导最大补偿耗氧量)并允许分析解偶联OCR的解偶联剂。鱼藤酮抑制NADH脱氢酶(ET链的复合物I)并允许分析非线粒体OCR。

为进行该分析，分析盒的各孔用1ml分析培养基(running media)洗涤。500ul的运行培养基添加到各孔且板置于37℃(无CO₂)培养箱中。调节线粒体活性的药物以10X(10uM)浓度制备，以使得在添加到盒中后，最终浓度是1X(1μM)。寡霉素(50ul)、CCCP(55ul)和鱼藤酮(55ul)添加到盒的端口A、B和C，且盒放回到培养箱中。分析范例是开放的，并设定循环参数和次数。分析然后使用仪器进行。在分析后，细胞用50ulr 450mM NaOH裂解且然后用5ul Tris 6.8中和。DNA溶解产物使用Take3DNA读板器在OD₂₆₀下进行分光光度分析。数据用细胞的DNA含量标准化。

B.结果

1.代谢和应激因子诱导Hsp90β的表达：

代谢和应激因子对肌管的急性处理显示为调节Hsp90β的表达。HSMM成肌细胞在含2％马血清的培养基中分化7天，然后经受不同的营养条件24小时，包括：正常葡萄糖(NG，5mM葡萄糖)、高葡萄糖(HG，25mM)、NG+甘露醇(甘露醇用于平衡渗透压)、油酸和亚油酸的混合物(150uM)、棕榈酸盐(150uM)及这些不同条件的组合。结果表明24小时后，高葡萄糖对Hsp90βmRNA表达不具有明显影响，尽管具有渗透压诱导的影响。利用正常葡萄糖条件，脂质混合物抑制HSP90βmRNA表达，而其在高葡萄糖条件下提高HSP90βmRNA的表达。与BSA对照相比，棕榈酸盐与NG一起抑制HSP90βmRNA表达。这些数据表明HSP90β表达通过不同代谢因子如脂血调节，表明与氧化代谢和应激反应的关系。Hsp90β表达在肌管用TNFα处理时诱导(图5)。

2.肌管中Hsp90β的敲减导致提高的胰岛素信号传导：

HSMM肌管顺序地(1)用靶向HSP90AB1的3种不同的siRNA转染3小时，(2)血清饥饿3小时，和(3)经受不同浓度的胰岛素(0、10、100nM)的刺激。胰岛素刺激下游的信号传导事件通过蛋白质印迹针对总的和磷酸化的Akt、Erk和GSK3β的水平进行评估。蛋白质印迹的定量表明HSP90AB1敲减诱导胰岛素刺激的Akt、Erk和GSK3β磷酸化的明显提高。Akt通过磷脂结合和PDK1导致的Thr308处的活化环磷酸化及通过Ser473处羧基末端内的磷酸化激活。MEK1和MEK2分别通过活化环残基Thr202/Tyr204和Thr185/Tyr187的磷酸化激活p44和p42。GSK-3是PI3K/Akt细胞存活途径(其活性可以被GSK-3α的Ser21和GSK-3β的Ser9处Akt介导的磷酸化抑制)的关键下游元件(图6)。

3.肌管中Hsp90β的敲减导致增加的胰岛素刺激的葡萄糖摄取：

与Hsp90β敲减诱导的提高的信号传导事件一致，葡萄糖诱导的葡萄糖摄取使用荧光的葡萄糖类似物2-NBDG在HSMM肌管中测量。使用以上提供的方法，细胞顺序地用对照或Hsp90βsiRNA转染48小时，血清饥饿4小时，并在250uM 2-NBDG存在下用不同浓度的胰岛素刺激30分钟。细胞然后用PBS洗涤，且荧光使用读板器检测。细胞的荧光反映细胞摄取的葡萄糖的量。结果表明siHsp90β处理的细胞(具有降低的HSP90β表达)在与相同条件下用非特异性乱序siRNA处理的细胞相比时显示显著增强的胰岛素刺激的葡萄糖摄取。这些数据证明肌管中Hsp90β的抑制或敲减增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取(图7)。

4.肌管中Hsp90β的敲减导致提高的线粒体效率：

HSMM肌管如上所述用对照或siHsp90β的siRNA转染48小时，然后使用不同的线粒体药物(包括寡霉素、CCCP和鱼藤酮)进行生物能量学谱分析(XF24Analyzer)；并监测反映基线或最大线粒体氧化能力的耗氧率(OCR)的变化。结果通过DNA含量标准化。

结果证明，在基线和解偶联的条件中，HSP90β敲减的肌管显示增强的氧化呼吸。这证明Hsp90β敲减诱导肌管中线粒体的明显代谢改变，表明Hsp90β经其伴侣蛋白活性在调节线粒体功能中的作用，很可能通过靶向于不同线粒体蛋白质的并入。利用对照或siHSP90AB1siRNA的生物能量学谱研究，肌管中基线和解偶联OCR的曲线下面积(AUC)的定量揭示Hsp90β敲减细胞中显著提高的基线和解偶联OCR，从而证明在Hsp90β表达敲减时提高的线粒体效率(图8)。

5.小分子抑制剂(CCT018159)的HSP90抑制增加AKT的磷酸化，但不增加ERK和GSK3β的磷酸化：

肌管用HSP90的小分子抑制剂(CCT018159)处理，然后进行胰岛素刺激。HSP90的小分子抑制剂(CCT018159)抑制HSP90α和HSP90β两者。小分子抑制剂对胰岛素信号传导的作用通过用蛋白质印迹测量胰岛素刺激的下游靶标Akt、ERK和GSK3β的磷酸化进行评价。结果证明较高浓度的CCT018159(特别是10uM)显著增强胰岛素刺激的Akt的磷酸化，表明HSP90抑制增强肌管中的胰岛素敏感性。但是，未观察到pERK或pGSK3β水平的变化(图9)。

与Hsp90β特异性敲减的效应相比，观察到Hsp90小分子抑制剂对细胞生物能量学的差异效应。在用不同浓度的CCT018159处理后肌管的生物能量学特征显示与对于Hsp90β敲减细胞观察到的不同的特征。没有观察到基线OCR的变化，然而解偶联OCR实际上以浓度依赖性的方式降低，其中10uMCCT018159诱导更大的CCCP诱导OCR的抑制。这种不同的特征表明基线和解偶联状态中增加的OCR是Hsp90β特异性的，而CCT018159通过阻断其ATP结合袋抑制Hsp90α和Hsp90β两者。在CCT018159的较低浓度(1μM)下，增加的解偶联OCR在处理的肌管中观察到(图10)。

C.结论：

总之，Hsp90β调节骨骼肌肌管中的胰岛素信号传导、葡萄糖摄取和底物代谢。Hsp90βmRNA和蛋白质响应于高脂血、高血糖和促炎性信号的诱导证明该蛋白质在糖尿病的病理生理学中的作用。Hsp90β在肌管中的敲减导致葡萄糖摄取的显著增加，证明其在葡萄糖调节中的作用。Hsp90β在肌管中的敲减也导致ERK磷酸化的大的提高以及AKT和GSK3β磷酸化的增加，证明胰岛素信号传导的功能性分支并表明Hsp90β牵涉于选择性机制中。Hsp90β敲减对于生物能量学和线粒体底物代谢具有显著影响。HSP90抑制剂CCT018159(其抑制Hsp90α和Hsp90β两者)对胰岛素信号传导和生物能量学具有较不显著的影响，表明Hsp90β特异性抑制比全Hsp90抑制方式更有效。

实施例3–骨骼肌肌管中代谢酶表达的HSP90β调节

成肌细胞基本上如上所述进行培养和分化成肌管并用siRNA处理。参与各种代谢途径的一系列代谢酶的mRNA表达使用常规方法通过rtPCR进行分析。该酶包括参与糖酵解(HK2、LDH、GYS1)、脂质氧化(CPT1、UCP3)、脂肪酸转运(CD36)和脂肪酸合成(ACC1和ACC2)、脂解(HSL)的那些。用HSP90βsiRNA处理的细胞中的mRNA表达针对用乱序siRNA处理的细胞中该基因的表达标准化。结果显示于图11A中。HK2、LDH、GYS1、CPT1和UCP3的mRNA表达水平发现在HSP90β表达敲减时提高，而CD36和HSL的表达水平发现在HSP90β表达敲减时降低。也观察到参与脂肪酸合成的ACC2表达降低的趋势。UCP3蛋白质水平发现在HSP90敲减时显著提高(图11B)。骨骼肌中的UCP3蛋白质表达水平通常在糖尿病中是低的，但其表达通过运动诱导。非受机理的限制，表明HSP90β表达的敲减可以通过蛋白质如UCP3的调节在代谢综合征的治疗中发挥有益的作用。

实施例4–骨骼肌肌管中糖酵解流的HSP90β调节

成肌细胞基本上如上所述培养和分化成肌管，在正常血糖和高血糖条件下经历生长。经历高血糖条件的细胞在5mM葡萄糖中生长和分化，并在用siRNA转染之前在11mM葡萄糖中培养。在正常血糖和高血糖条件下生长的细胞用HSP90βsiRNA或乱序对照siRNA转染。细胞然后如上所述进行分析以分析糖酵解流，使高血糖细胞在11mM葡萄糖中分析。

如图12A和12B中所示的，HSP90β的敲减在正常血糖和高血糖条件下提高葡萄糖诱导的ECAR和寡霉素诱导的ECAR。但是，虽然HSP90β的敲减在正常血糖条件下提高基线OCR和解偶联OCR，在高血糖条件下未观察到基线OCR或解偶联OCR的变化(图12C和12D)。这些结果证明Hsp90AB1在不同条件下调节线粒体呼吸和糖酵解。不希望受限于机理，这些结果表明降低的Hsp90AB1蛋白质水平可以提高总体底物代谢，从而在体内改善系统代谢。

实施例5–骨骼肌肌管的炎性胰岛素抵抗模型中pERK水平的HSP90β调节

成肌细胞基本上如上所述培养和分化成肌管，在正常血糖和高血糖条件下经历生长。经历高血糖条件的细胞在5mM葡萄糖中生长和分化，并在用siRNA转染和/或用TNF-α处理之前在11mM葡萄糖中培养24小时。在正常血糖、高血糖条件或存在TNF-α的高血糖条件下生长的细胞用HSP90βsiRNA或乱序对照siRNA转染。相应地，在高血糖条件下生长的细胞然后在11mM葡萄糖和/或TNF-α存在下培养。细胞暴露于提高浓度的胰岛素(0、10、100nM)5分钟，之后收获并通过蛋白质印迹分析。简言之，细胞收获到含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中。细胞使用注射器和针头裂解。对于各样品测定总蛋白质浓度。等同量的蛋白质通过SDS-PAGE解析。蛋白质转移到硝基纤维素上并用商业可得的用于检测总的和磷酸化的ERK的抗体探测(图13A)。总ERK和磷酸化ERK的量使用磷成像仪定量地测定，并且计算磷酸化ERK与总ERK的比率(图13B)。

如图13A和图13B中所示的，在正常血糖条件下，ERK磷酸化和胰岛素信号传导(如通过ERK磷酸化测定的)两者的基线水平通过HSP90β表达的敲减提高。NG骨骼肌肌管中增加的胰岛素刺激的ERK磷酸化利用Hsp90AB1敲减观察到。虽然HG单独不抑制胰岛素信号传导和ERK磷酸化，但TNFα存在下的HG条件强烈地抑制HSP90β存在条件下的胰岛素刺激的ERK磷酸化。但是，在相同的HG和TNFα条件下，Hsp90AB1敲减救援被TNFα抑制的ERK磷酸化，表明Hsp90AB1敲减在HG条件中救援TNFα诱导的胰岛素抵抗。

实施例6–骨骼肌肌管中脂质代谢的HSP90β调节

尽管已证明在骨骼肌中HSP90β敲减在TNF-α存在和不存在条件下对胰岛素信号传导的作用，还分析了HSP90β和TNF-α对脂质代谢的作用。简言之，肌细胞基本上如上所述在正常和血糖条件下培养和分化，并用HSP90β或乱序siRNA处理。脂质代谢基本上如上所述使用OCR分析进行分析。如图14中所示，在HSP90β存在下，TNF-α降低脂质代谢。但是，在TNF-α存在和不存在的条件下，HSP90β的敲减提高肌管中正常血糖条件下的OCR。这些结果证明HSP90β调节脂质代谢，如通过分析测量的。虽然TNF-α在HSP90β存在下降低脂质代谢，但HSP90β的敲减在TNF-α诱导的脂质代谢降低的存在下重新建立脂质代谢。

实施例7–代谢综合征使用HSP90抑制剂的治疗

代谢综合征如1型和2型糖尿病、胰岛素抵抗和高脂血症的多种遗传和诱导动物模型在本领域中良好表征。这类动物用于证明HSP90抑制剂(例如，HSP90β抑制剂)治疗代谢综合征(包括糖尿病)的效果。1型糖尿病的模型包括，但不限于NOD小鼠及链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠和小鼠(1型糖尿病的模型)。2型糖尿病的遗传和诱导模型包括，但不限于瘦蛋白缺陷的ob/ob小鼠、瘦蛋白受体缺陷的db/db小鼠和高脂饮食的小鼠或大鼠模型。在各种模型中，特定疾病特征发生的时间表是公知的。HSP90抑制剂可以在糖尿病的症状出现之前和之后施用以证明HSP90抑制剂(特别是HSP90β抑制剂)在糖尿病、代谢障碍和/或代谢障碍的一种或多种征兆的治疗中的效力。

具有或没有代谢综合征的遗传易感性的动物在适宜条件下饲养以诱导所需的疾病状态。动物分成至少两个组，处理组和对照组。处理的动物用一个或多个剂量的HSP90抑制剂(例如，靶向于HSP90的siRNA、靶向于HSP90的抗体或HSP90的小分子抑制剂)处理。优选地，小分子、siRNA和抗体特异性地靶向于HSP90α或HSP90β。动物通过多种已知方法中的任一种监测代谢综合征的发生。例如，基线胰岛素分泌、葡萄糖水平、Hb1Ac水平、炎性标志物水平、胆固醇和甘油三酯水平、体重、脂肪积贮包括肝中的脂肪积贮、血压、尿排出量和尿糖水平及其它相关标志物可以进行监测或测量。标志物在禁食一段时间(例如，禁食过夜)后或者响应于葡萄糖攻击或其它代谢攻击而进行分析。以预定的间隔或在试验结束时，动物处死以评价脂肪积贮、肾状态和代谢综合征的其它适宜指示。

处理组的结果与对照(未处理或溶剂处理)组的结果进行比较。HSP90β的抑制剂在各种评估方法中证明缓解代谢综合征。

实施例8–HSP90β作为代谢综合征治疗的肝靶标的验证

肝在血糖的调节中发挥重要作用。在健康的受试者中，胰岛素促进肝的葡萄糖摄取以转化成糖原，从而降低血糖水平。在代谢综合征中，肝对胰岛素没有反应，或者是由于对胰岛素的不敏感性或者是由于胰岛素产生不足或者由于两者，从而导致血液中升高的葡萄糖水平(其是毒性的)。

肝细胞(例如，THLE-2细胞)使用类似于以上对于胰岛素信号传导和葡萄糖摄取的分析所给出的那些方法进行分析。简言之，细胞用HSP90抑制剂，优选HSP90β抑制剂处理，并例如分析胰岛素信号传导(例如通过分析AKT、ERK和GSK3β的磷酸化)；葡萄糖摄取，糖原合成；生物能量学；参与糖异生或脂质/胆固醇代谢的基因的基因表达(例如，通过qPCR)。炎症和内质网(ER)应激的标志物也可以进行评价。

用HSP90抑制剂，特别地HSP90β抑制剂处理的肝细胞发现与未用该抑制剂处理的细胞相比具有更好的胰岛素信号传导、葡萄糖摄取和/或脂质代谢。用抑制剂处理的肝细胞也发现具有较少的ER应激和/或较低的炎性标志物表达。

实施例9–HSP90β作为代谢综合征治疗的脂肪靶标的验证

类似于肝细胞，脂肪组织响应于胰岛素而从血液摄取葡萄糖，从而将糖转化成脂肪。脂肪细胞使用以上对于肌细胞和肝细胞的分析给出的方法评价胰岛素反应性和葡萄糖摄取。类似地，炎症和ER应激也可以在细胞中评价。

用HSP90抑制剂，特别是HSP90β抑制剂，处理的脂肪细胞发现与未用该抑制剂处理的细胞相比具有更好的胰岛素信号传导、葡萄糖摄取和/或脂质代谢。用抑制剂处理的脂肪细胞也发现具有较少的ER应激和/或较低的炎性标志物表达。

实施例10–HSP90抑制剂的特异性的分类

多种HSP90抑制剂是可得的，如本文中提供的那些，其中许多已经进行或将进行用于治疗各种疾病或病症(最常见癌症)的临床试验。取决于抑制剂对HSP90转录物、蛋白质或HSP90结合蛋白的特定作用机制或结合位点，抑制剂可以抑制一种或多种HSP90异形体(例如，HSP90α或HSP90β)的活性。例如，作用于HSP90的ATP结合位点的抑制剂很低可能具有针对HSP90α和HSP90β两者的抑制剂活性。此外，可以选择抑制HSP90与特定结合伴体的相互作用的试剂(参见，例如，Tsaytler等,2009,Cell Stress Chap.14:629)。类似地，基于HSP90的特定核酸或氨基酸序列，核酸基的或抗体基的抑制剂可以设计为特异性抑制HSP90α或HSP90β的表达或活性。或者，核酸基的或抗体基的抑制剂可以设计为特异性抑制HSP90α或HSP90β或两者的表达或活性。HSP90α和HSP90β核酸和氨基酸序列的比对提供在图17中。本领域技术人员可以容易地审查该比对以设计核酸抑制剂或鉴别可以是交叉反应性的或对于HSP90的单一异形体特异性的HSP90α和HSP90β上的表位。

确定试剂是否是HSP90α、HSP90β或两者的表达或活性的抑制剂的方法完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，抑制至少一种HSP90的表达的核酸和抗体抑制剂可以在细胞培养系统中测试特异性。例如，表达HSP90α和HSP90β两者的细胞与系列浓度的核酸或抗体及适宜的对照(例如，乱序核酸，非-免疫IgG)接触适宜的时间长度。细胞和/或培养基在需要时收获。常规核酸(例如，RT-PCR、RNA印迹)和蛋白质(例如，ELISA、蛋白质印迹)检测方法用于与适宜的对照相比测定HSP90α和HSP90β的表达水平。HSP90抑制剂的特异性可以容易地测定。

进行ATP结合和水解测定的竞争分析和方法本领域中公知且可用于确定试剂是否是HSP90α、HSP90β或两者的抑制剂，即，试剂是否可以抑制一种或两种异形体的ATP结合或水解。

酵母仅含有单一拷贝的HSP90。不表达HSP90的酵母菌株可以用HSP90α或HSP90β转化，且可以监测使客户蛋白折叠的能力。类似地，仅表达单一HSP90异形体的哺乳动物细胞系(例如，源自HSP90α敲除小鼠)或用抑制一种HSP90异形体的表达的siRNA处理的细胞可以用于区分针对一种或两种HSP90异形体的试剂的活性。

商业可得的试剂盒也可以用于针对HSP90α和HSP90β的抑制剂(BPS Bioscience)进行抑制剂区分。

实施例11–在饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖模型中用于HSP90β敲减的概念验证的反义寡核苷酸(ASO)的评估

示例性的动物研究模型在以下提供以进一步验证HSP90β作为预防和/或治疗代谢综合征、肥胖症、胰岛素抵抗和/或2型糖尿病的治疗靶标。

1.目的和基本原理

本研究的目标是

1.鉴定和表征用于在适宜的体内模型中有效敲减HSP90β的表达的反义寡核苷酸(ASO)。

2.证明体内HSP90β敲减导致具有治疗益处的功能性生理反应。

所希望的结果是利用HSP90β的敲减防止肥胖表型和糖尿病表型。

概念验证(PoC)研究在饮食诱导的肥胖症(DIO)和胰岛素抵抗(IR)小鼠模型中完成。

该研究以两部分完成：

1.通过各种组织中HSP90β表达的分析鉴定在体内模型中显著敲减HSP90β表达的一种或多种ASO。

2.向经历饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗的小鼠施用ASO以证明HSP90β表达的抑制预防、减弱或延迟体重增加的开始和代谢综合征的发生。

可以理解，下面提供的试验方法可以容易地改进以分析其它核酸治疗剂(siRNA、dsiRNA、shRNA)、抗体基治疗剂和小分子基治疗剂。此外，该研究可以改进以包括使用其它糖尿病和代谢障碍的模型(如以上提供的那些)。如以下讨论的，取决于所获得的特定结果，时间和剂量范围可以基于效力和毒性的初步分析进行改进。这类改进完全在本领域技术人员的能力范围内。

2.重要性

HSP90β表达的敲减作为高脂饮食和饮食诱导的胰岛素抵抗的结果而延迟、减弱或预防体重增加，证明HSP90β用作治疗和管控肥胖症、胰岛素抵抗、2型糖尿病和代谢综合征中的一种或多种的靶标的用途，包括升高的血压、升高的脂质水平、中心脂肪过多、低HDL及在禁食时和/或在葡萄糖耐受试验期间升高的葡萄糖中的一种或多种。

3.实验方式

部分I：ASO介导的HSP90β敲减和体内(剂量上升研究)

寡核苷酸选择。反义寡核苷酸在体外制备和测试以鉴定在HSP90β表达的特异性抑制中有效的ASO。在初步体外分析中鉴定的一种或多种ASO用于后续体内研究。

效力和毒性的分析。总共6组小鼠(包含每组5只小鼠)以标准正常饮食饲养。组群1(包括每组5只小鼠的两组)中的小鼠一周两次接受正常剂量的ASO(30-40mg/kg)或高剂量的ASO(100-150mg/kg)的腹膜内注射，持续2周。组群2和组群3的处理在前一组群(对于组群2是组群1，和对于组群3是组群2)的效力和毒性评定后开始。对于各组群依次地，治疗时间增加两周(组群1，两周；组群2，4周；组群3，6周)。基于先前组群中获得的结果作出以下决策：

-无效力-无毒性：组群部分1的处理方法用提高10倍的处理剂量重复。另外，处理时间延长2周。

-效力-无毒性：以下给出的部分2中的处理对于这种ASO立即开始。

另外，部分1的治疗方法用四周的给药方案而不是用于组群1的2周给药方案重复，使得处理剂量提高50倍以确定毒性阈值。

-效力-毒性：部分1的处理用降低10倍的处理剂量重复，且使用相同的处理时间。

-无效力-毒性：这种ASO不考虑用于进一步的研究。

对于各组群和在所有组中，体重、葡萄糖水平和血浆胰岛素水平在每次注射前和在处死前测量。另外，ASO的血浆水平使用商业可得的试剂盒(例如，来自的ssDNA定量分析试剂盒)测量。2周后，小鼠处死且用针头(0.5-1mL)立即进行心脏穿刺以获取血液。然后进行尸检。收集选择的组织，称重，并在速冻后在-80℃下储存直到使用(脂肪组织和肝除外)。

以下样品和组织按顺序方式收集：

·用于血浆制备的血液。

·肝(速冻的，固定的用于石蜡包埋)。

·骨骼肌(速冻的)，包括储存在单独小瓶中的后肢肌和背肌。

·脂肪组织(速冻和固定的用于石蜡包埋)，包括储存在单独小瓶中的白脂肪组织(性腺周(perigonadal)和腹股沟)和棕脂肪组织。

·胰腺(速冻的)。

·肾(速冻的)。

HSP90β的敲减效率通过使用qPCR、蛋白质印迹和/或免疫组织化学测量靶标的表达水平来确定。另外，血浆胰岛素、瘦蛋白的血浆水平、脂联素、TNFα、PAI-1、血清淀粉样蛋白A和IL6使用ELISA测量。选择具有最有效敲减的ASO并用于以下部分II中提供的后续试验。

从动物收集的血浆和肝用于毒性的初步评估。进行LDH释放分析以及对于炎性标志物的ELISA。另外，在血浆和肝组织匀浆上进行丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性测定。肝中的GSH水平确定为肝功能的另外的示值。

部分II–HSP90β敲减对高脂饮食诱导的肥胖症和胰岛素抵抗模型的代谢效应的概 念验证研究

代谢效应的概念验证研究包括以下参数的分析：体重、进食和空腹血糖水平、食物摄入量、水摄入量、身体质量组成(body mass composition)、O₂消耗、CO₂产生、葡萄糖耐量试验(GTT)、胰岛素耐量试验(ITT)、丙酮酸耐量试验(PTT)和随意活动。

食用60％kcal％脂肪的高脂饮食(HFD)的八周龄雄性瘦C57BL/6小鼠用经验方式预定剂量的HSP90βASO、对照ASO或盐水一周两次通过腹膜内注射(IP)处理。单独的瘦对照组接受盐水或对照ASO，并用标准低脂正常饮食(低脂的标准饮食(LFD)10％kcal％脂肪)饲养。处理组显示如下：

·LFD盐水处理(21只小鼠)

·LFD对照ASO处理(21只小鼠)

·HFD盐水处理(21只小鼠)

·HFD对照ASO处理(21只小鼠)

·HFD HSP90βASO处理(21只小鼠)

21只小鼠的各组分成各具有7只小鼠的3个动物组群。小鼠处理并评估4周、6周和8周的时间。对于后一组群具有2周的延迟，即在组群1的处理开始后2周，组群2开始ASO和HFD处理。以这一方式，组群2处理可以在组群1中观察到令人鼓舞的结果时改变为4周处理而不是6周处理。如果组群1不显示预期的结果，组群2经受6周的处理。另外，对于各组群(4周、6周和8周)，在GTT和ITT研究中证明具有效力时，处理延长1周以适应于PTT(4周变成5周，6周变成7周，8周变成9周)。

体重和进食血糖从处理开始每周IP注射之前一周监测两次。

对于组群1(4周ASO处理)，GTT和ITT在开始ASO处理后的第17天和第24天进行。如果观察到GTT和ITT的阳性结果，则PTT在第31天进行。在ASO和对照处理的4周(或5周)后，处死组群1的小鼠，并收集组织和血液样品用于进一步分析。

对于组群2(6周ASO处理)，GTT和ITT在开始ASO处理后的第31天和第38天进行。如果观察到GTT和ITT的阳性结果，则PTT在第45天进行。在处理的第6周或第7周后处死组群2的小鼠，并收集组织和血液样品用于进一步分析。

对于组群3(8周ASO处理)，GTT和ITT在开始ASO处理后的第45天和第52天进行。如果观察到GTT和ITT的阳性结果，则PTT在第59天进行。在处理的第8周或第9周后处死组群3的小鼠，并收集组织和血液样品用于进一步分析。

收集的组织通过qPCR、蛋白质印迹和/或IHC分析基因表达和靶标沉默。胰岛素信号传导途径中其它基因和蛋白质的表达也可以进行分析。在各时间点收集的血液处理成血浆并进行不同的生物化学分析，包括：TG、FFA、总胆固醇、胰岛素、血清淀粉样蛋白A(SAA)、脂联素、TNFα和PAI-1。

10只动物的另一组群用以下方案处理：

·HFD对照ASO处理(5只小鼠)

·HFD HSP90βASO处理(5只小鼠)

小鼠利用综合实验室动物监测系统(Comprehensive Laboratory AnimalMonitoring System)(CLAMS)进行代谢笼中的监测以评价从第54天到第57天的食物摄入量、水摄入量、随意活动和呼吸(通过测量VO₂、VCO₂、RQ(呼吸商)和热量产生)。身体组成在第51天通过双能量X-射线吸收仪(DEXA)在同一周测定。这一组群用不同ASO一周注射两次，共8周。

材料和方法

动物

相同性别(雄性)、年龄和遗传背景的小鼠用于所有比较。雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)从Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)获得并在22℃下开始以12:12hr日夜周期每笼4-5只饲养。小鼠在用化合物处理前在本地动物机构驯养一周。

在8周龄开始，根据研究阶段(部分I或部分II)，小鼠用高脂饮食(Research DietsCat#:D12492；60kcal％脂肪、20kcal％蛋白质和20kcal％碳水化合物)或标准的低脂饮食(10％kcal％脂肪)饲养。小鼠用ASO或盐水一周两次注射。体重、葡萄糖水平和血浆胰岛素水平在每次注射前测量。

腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)

葡萄糖耐量试验(GTT)在禁食6小时后进行。测定初始空腹血糖水平，之后以2.0g/kg体重的剂量(2g/kg体重)腹膜内(ip)注射20％葡萄糖溶液。血糖水平使用商业可得的葡萄糖监控器例如Advantage血糖测量仪(RocheIndianapolis，IN)在葡萄糖注射后15、30、60、90、120、150和180分钟从尾静脉测量。在GTT期间的曲线下面积(AUC)使用商业可得的软件程序(例如，GraphPad Prism软件)计算。不同组的GTT试验平行地进行。在尾静脉葡萄糖测量的各时间点，收集～40μL的尾静脉血且制备血浆以使用ELISA/RIA对葡萄糖注射后的0、15的30min时间点进行后续胰岛素水平分析。

腹膜内胰岛素耐量试验(IPITT)

胰岛素耐量试验(ITT)在禁食1小时后进行。测定初始血糖水平，之后注射(ip)人胰岛素(1-2U/kg；Humulin R；Eli Lilly,Indianapolis,IN)。血糖水平在胰岛素注射后的15、30、60、90和120min如上所述从尾静脉测量。胰岛素注射量通过在食用高脂饮食的小鼠中由于肝胰岛素抵抗开始导致的胰岛素反应经验地确定。

腹膜内丙酮酸耐量试验(IPPTT)

丙酮酸攻击试验在禁食6小时后进行。测定初始血糖水平，之后注射(ip)溶解于盐水中的丙酮酸(2g/kg；Sigma,St.Louis,MO)。血糖水平在丙酮酸注射后的15、30、60、90和120min如上所述从尾静脉测量。计算试验期间的曲线下面积(AUC)。

双能量X-射线吸收法(DEXA)

不同处理组的身体质量组成按照制造商推荐的程序使用LUNAR小鼠光密度计通过双能量X-射线吸收法(DEXA)扫描进行测定。记录并分析瘦体重、脂肪体重、全身组织重量、骨密度和骨矿物质含量。

综合实验室动物监测系统(CLAMS)

CLAMS(Columbus Instruments,Columbus,OH,USA)代谢监测笼用于同时监测横向和纵向活动、进食和饮水、氧消耗及CO₂产生。ASO注射的和对照的小鼠单个地置于CLAMS笼中并在笼适应1-2天后监测4-天的时间。在禁食和进食条件下记录各种参数。食物和水消耗直接测量作为累积数据。按小时计的文件显示各参数的所有测量值：消耗的氧体积，ml/kg每小时(VO₂)、产生的二氧化碳体积，ml/kg每小时(VCO₂)、呼吸换气率、热量(kcal/h)、累积的食物(g)、累积的饮水(g)、XY总活动(计数的所有水平线中断)、XY步行活动(计数的最少三个不同的连续水平线中断)和Z活动(计数的所有纵向线中断)。数据在30-s采样期间记录。CLAMS数据通过用瘦体重标准化进行分析。

组织收集

在各方案结束时，小鼠在下一周处死，且收集组织和称重，之后使用标准方法在-80℃下储存或在福尔马林中固定用于石蜡包埋之前通过速冻保存。通过心脏穿刺收集血液并制备血浆。

收集以下样品和组织：

·肝(速冻的，固定的用于石蜡包埋)。

·骨骼肌(速冻的)，包括储存在单独小瓶中的后肢肌和背肌。

·脂肪组织(速冻和固定的用于石蜡包埋)，包括储存在单独小瓶中的白脂肪组织(性腺周和腹股沟)和棕脂肪组织。

·胰腺(速冻的)。

·肾(速冻的)。

等同

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规试验确定本文中描述的特定实施方式和方法的许多等同。这样的等同意在被以下权利要求的范围涵盖。

通过引用并入

本申请中引用的各参考文献、专利、专利申请和GenBank号在此通过引用并入，正如各参考文献注明单独地引入。

Claims (48)

1.HSP90β的特异性抑制剂在制备用于治疗受试者的代谢综合征的药物中的用途，其中所述HSP90β的特异性抑制剂不是H2-gamendazole，且其中所述代谢综合征为选自糖尿病、胰岛素抵抗、胰岛素不足、肥胖症、高胰岛素血症和葡萄糖耐量降低的障碍。

2.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征包括2型糖尿病。

3.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征包括1型糖尿病。

4.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是胰岛素抵抗。

5.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是胰岛素不足。

6.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是肥胖症。

7.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是高胰岛素血症。

8.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是葡萄糖耐量降低。

9.根据权利要求1的用途，其中所述代谢综合征是糖尿病。

10.根据权利要求1-9任一项的用途，其中患有代谢综合征的受试者表现出以下征兆中的三种或更多种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中大的腰围对于男性是40英寸或更大和对于女性是35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低HDL胆固醇对于男性是低于40mg/dL，和对于女性是低于50mg/dL；和

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

11.根据权利要求1-10任一项的用途，其中所述HSP90β的特异性抑制剂包括核酸抑制剂。

12.根据权利要求11的用途，其中所述核酸抑制剂包括反义核酸分子。

13.根据权利要求11的用途，其中所述核酸抑制剂包括双链核酸分子。

14.根据权利要求13的用途，其中所述核酸抑制剂包括选自siRNA、shRNA和dicer底物siRNA(DsiRNA)的双链RNA。

15.根据权利要求1-10任一项的用途，其中所述HSP90β的特异性抑制剂包括抗体。

16.根据权利要求1-10任一项的用途，其中所述HSP90β的特异性抑制剂包括小分子。

17.根据权利要求16的用途，其中所述小分子选自氯尼达明或其类似物、南蛇藤醇或其类似物、葛杜宁或其类似物及香豆霉素或其类似物。

18.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括使受试者的血糖水平正常化。

19.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括使受试者的Hb1Ac水平正常化。

20.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括防止与不良循环相关的至少一种糖尿病并发症。

21.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种2型糖尿病的征兆或症状。

22.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种1型糖尿病的征兆或症状。

23.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种胰岛素抵抗的征兆或症状。

24.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种胰岛素不足的征兆或症状。

25.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种高胰岛素血症的征兆或症状。

26.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种葡萄糖耐量降低的征兆或症状。

27.根据权利要求1-17任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解至少一种肥胖症的征兆或症状。

28.根据权利要求1-27任一项的用途，其中治疗所述代谢综合征包括缓解以下至少一种：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中大的腰围对于男性是40英寸或更大和对于女性是35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低HDL胆固醇对于男性是低于40mg/dL，和对于女性是低于50mg/dL；和

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。

29.根据权利要求28的用途，其中治疗所述代谢综合征缓解等于或高于130/85mmHg的升高的血压。

30.根据权利要求28的用途，其中治疗所述代谢综合征缓解等于或高于100mg/dL的升高的空腹血糖。

31.根据权利要求28的用途，其中治疗所述代谢综合征缓解大的腰围，其中大的腰围对于男性是40英寸或更大和对于女性是35英寸或更大。

32.根据权利要求28的用途，其中治疗所述代谢综合征通过提高HDL胆固醇来缓解低HDL胆固醇，其中低HDL胆固醇对于男性是低于40mg/dL，和对于女性是低于50mg/dL。

33.根据权利要求28的用途，其中治疗所述代谢综合征缓解等于或高于150mg/dL的升高的甘油三酯。

34.根据权利要求1-33任一项的用途，其中治疗代谢综合征包括缓解脂肪肝。

35.根据权利要求1-33任一项的用途，其中治疗代谢综合征包括调节脂肪积贮。

36.用于测定HSP90β表达或活性水平的试剂在制备用于监测受试者的代谢综合征的试剂盒中的用途，其中所述代谢综合征为选自糖尿病、胰岛素抵抗、胰岛素不足、肥胖症、高胰岛素血症和葡萄糖耐量降低的障碍，且其中所述监测包括：

a)在第一时间点和第二时间点从患有代谢综合征的受试者获得样品；

b)测定所述第一时间点和所述第二时间点的HSP90β表达或活性水平；和

c)比较所述第一时间点的HSP90β表达或活性水平与所述第二时间点的HSP90β表达或活性水平，其中所述第二时间点的HSP90β表达或活性水平相对于所述第一时间点的变化指示受试者的代谢综合征的变化。

37.权利要求36的用途，其中所述HSP90β表达水平包括HSP90β蛋白或HSP90AB1基因的表达水平。

38.权利要求36的用途，其中HSP90β表达或活性的提高指示所述代谢综合征的恶化。

39.权利要求36的用途，其中HSP90β表达或活性的降低指示所述代谢综合征的改善。

40.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征包括2型糖尿病。

41.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征包括1型糖尿病。

42.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是胰岛素抵抗。

43.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是胰岛素不足。

44.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是肥胖症。

45.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是高胰岛素血症。

46.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是葡萄糖耐量降低。

47.权利要求36-39任一项的用途，其中所述代谢综合征是糖尿病。

48.权利要求36-47任一项的用途，其中患有代谢综合征的所述受试者进一步表现出一种或多种以下征兆：

a)等于或高于130/85mmHg的血压；

b)等于或高于100mg/dL的空腹血糖；

c)大的腰围，其中大的腰围对于男性是40英寸或更大和对于女性是35英寸或更大；

d)低HDL胆固醇，其中低HDL胆固醇对于男性是低于40mg/dL，和对于女性是低于50mg/dL；和

e)等于或高于150mg/dL的甘油三酯。