CN104822378A - 作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法 - Google Patents

作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104822378A
CN104822378A CN201380060932.9A CN201380060932A CN104822378A CN 104822378 A CN104822378 A CN 104822378A CN 201380060932 A CN201380060932 A CN 201380060932A CN 104822378 A CN104822378 A CN 104822378A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cmpf
experimenter
level
methods
impaired glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380060932.9A
Other languages
English (en)
Inventor
M·惠勒
K·普伦蒂塞
戴菲寒
R·雷特纳卡兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Toronto
Original Assignee
University of Toronto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Toronto filed Critical University of Toronto
Publication of CN104822378A publication Critical patent/CN104822378A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/429—Thiazoles condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/43—Compounds containing 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula, e.g. penicillins, penems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/56—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D307/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/507—Pancreatic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法。羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)被证实是葡萄糖稳态受损和/或特征在于β-细胞功能障碍的病况的生物标志物。将受试者中的CMPF的测试水平与对照水平相比较鉴定出患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者。还提供了引起葡萄糖稳态受损或β-细胞功能障碍的方法和对影响β-细胞活性的化合物进行筛选的方法。还提供了通过降低受试者中CMPF的生理水平来治疗β-细胞功能障碍的方法以及OAT调节剂用于治疗β-细胞功能障碍的用途。

Description

作为糖尿病的生物标志物的CMPF和相关方法
相关申请
本申请要求2012年9月21日提交的美国临时专利申请号61/703,867和2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/787,718的优先权，这两件美国临时专利申请的内容在此以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及糖尿病的领域，并且更确切地说，涉及作为患有葡萄糖稳态受损和/或糖尿病或有患葡萄糖稳态受损和/或糖尿病风险的受试者的生物标志物的3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)。
背景技术
日益上升的肥胖率、愈加久坐的生活方式以及人口老龄化持续驱使2型糖尿病(T2D)患病率的显著增加。在世界范围内估计有26000万人患T2D，数百万人患有糖尿病前期，所述糖尿病前期是一种使个体有更高的患T2D风险的葡萄糖耐量受损(IGT)的病况，并且每年有另外700万人被新诊断出。虽然肥胖和胰岛素抵抗促成T2D的发生，但是导致疾病发生的最终是β细胞不能响应于变化的代谢需求。
重要的是，另一种形式的糖尿病，即妊娠期糖尿病(GDM)的出现也日益增多。目前3％-14％的孕妇患有GDM并且GDM是没有先前糖尿病病史的女性在妊娠晚期期间在存在严重的胰岛素抵抗时表现出IGT的一种病况。这种严重的获得性胰岛素抵抗对β细胞代偿能力施加了显著的生理应激，与在T2D中所观测到的相似，其中适当的适应会产生正常的葡萄糖耐量(NGT)，这表示未来T2D的风险低，而不足的β细胞代偿作用导致GDM，这表明非常高的未来患T2D的风险(在5年内约20％-50％)。
当前对T2D的诊断测试依靠对血糖水平的直接测量和间接测量。对糖化血红蛋白(HbA1c)的测量间接地指示了在先前2-3个月内平均的血糖水平，其中>6.5％的糖化血红蛋白则表示平均血糖高并且因此表示T2D。更直接的方法包括随机或空腹血糖测试、或口服葡萄糖耐量测试(OGTT)，如在GDM诊断中所使用，其直接测量在摄入后的设定的一段时间内从血液中清除葡萄糖的能力。
仍需要用于鉴定和/或监测患有葡萄糖稳态受损和/或糖尿病的受试者的新的并且改进的方法。
发明内容
在本公开的一个方面，CMPF已经被鉴定为葡萄糖稳态受损和/或糖尿病的生物标志物。在一个实施方案中，CMPF是II型糖尿病的生物标志物。CMPF还已经被鉴定为特征在于葡萄糖稳态受损的病况的生物标志物，所述病况诸如但不限于妊娠期糖尿病和葡萄糖耐量受损。CMPF还已被证实在患有II型糖尿病的受试者体内相对于正常对照增加。高水平的CMPF还已被证实在体外和体内会损伤β-细胞功能并且阻止葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
在一个实施方案中，提供了一种鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法，所述方法包括：
(a)测定来自受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的测试水平与对照水平比较，其中CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
在一个实施方案中，所述对照水平代表没有葡萄糖稳态受损的受试者的CMPF水平并且相对于对照增加的CMPF的测试水平则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。在一个实施方案中，所述对照水平代表患有葡萄糖稳态受损的受试者的CMPF水平并且相对于对照相似或更大的CMPF的测试水平则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。任选地，所述方法进一步包括对被鉴定为患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者进行治疗。举例来说，在一个实施方案中，用CMPF抑制剂对被鉴定为患有葡萄糖稳态受损的受试者进行治疗。在一个实施方案中，用胰岛素对所述受试者进行治疗。在一个实施方案中，用二甲双胍(metformin)、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、磺酰脲(sulfonylurea)或胰岛素增敏剂对所述受试者进行治疗。在一些实施方案中，对受试者进行治疗包括向所述受试者施用适用于治疗葡萄糖稳态受损的药剂，如CMPF抑制剂、胰岛素、二甲双胍、GLP-1受体激动剂、GLP-1类似物、磺酰脲或胰岛素增敏剂等。
在另一个实施方案中，提供了一种监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法，所述方法包括：
(a)测定来自所述受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的测试水平与来自所述受试者在更早的时间点的CMPF水平相比较，其中CMPF水平增加则表示所述受试者的葡萄糖稳态受损更严重，或CMPF水平降低则表示所述受试者的葡萄糖稳态得到改善。
在一个实施方案中，本文所述的用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法包括在测定CMPF的测试水平之前获得或提供来自所述受试者的样品。在一个实施方案中，患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者患有特征在于β-细胞功能障碍的病况或有患所述病况的风险。在一个实施方案中，特征在于β-细胞功能障碍的病况是葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。任选地，测定所述样品中CMPF的测试水平的步骤包括检测所述样品中的CMPF。举例来说，在一个实施方案中，使用质谱法、光谱法或免疫组织化学来检测所述样品中的CMPF。在一个实施方案中，如在酶联免疫吸附测定中，使用对CMPF具有特异性的抗体来检测CMPF。在一个实施方案中，使用气相色谱/质谱法(GC-MS)或液相色谱/质谱法(LC-MS)来检测CMPF。
在另一个实施方案中，提供了一种在一个或多个β-细胞中引起β-细胞功能障碍的方法，所述方法包括使所述一个或多个β-细胞与CMPF接触。任选地，所述β-细胞在体内、体外或离体。在一个实施方案中，使β-细胞与CMPF接触引起了胰岛素分泌受损。在一个实施方案中，所述方法包括使所述细胞与大于20μM、50μM、100μM、150μM、200μM、300μM或500μM的浓度的CMPF接触。任选地，所述β-细胞在受试者体内并且所述方法包括向所述受试者施用CMPF。在一个实施方案中，所述受试者是动物，如小鼠或大鼠。任选地，本文所述的引起β-细胞功能障碍的方法可用于产生β-细胞功能障碍的体外或体内模型。在一些实施方案中，这些模型可用于筛选测试药剂以鉴定可用于治疗与葡萄糖稳态受损或β-细胞功能障碍相关的病况的候选者。
在一个实施方案中，提供了一种对影响β-细胞活性的药剂进行筛选的方法，所述方法包括：
(a)提供一个或多个β-细胞，其中所述β-细胞的活性已通过使所述β-细胞与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)接触而降低；
(b)使所述β-细胞与测试药剂接触；以及
(c)确定所述测试药剂对所述β-细胞活性的作用。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括如果所述测试药剂对所述β-细胞活性的作用高于阈值水平，那么将所述测试药剂鉴定为有效的。在一个实施方案中，所述活性是胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是胰岛素胞吐。在一个实施方案中，所述活性是葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。在一个实施方案中，所述活性是脂肪酸或氨基酸刺激的胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是如由肠促胰岛素激素所调节的胰岛素分泌。在一个实施方案中，所述活性是控制胰岛素生物合成和/或分泌(胞吐)的基因、胰岛素调节基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译。在一个实施方案中，所述活性是一种或多种直接地或间接地影响胰岛素转录、胰岛素翻译、胰岛素生物合成和/或分泌(胞吐)的基因、胰岛素调节基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译。在一个实施方案中，所述一种或多种基因选自SLC2A1、SLC2A2、GCK、Kir6.2、ABCC8、CACNA1D、CACNA1A、CACNA1H、KCNB1、SNAP25、STX1A、VAMP2、SYN1A、PDX1、MAFA、NKX6.1、INS(小鼠中为INS1或INS2)、PCSK1、PCSK2以及CPE。在一个实施方案中，所述活性是β-细胞群扩增或β-细胞损失。任选地，将影响β-细胞活性的测试药剂鉴定为可用于治疗特征在于β-细胞功能障碍的病况的候选者。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗有需要的受试者的β-细胞功能障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂。在一个实施方案中，还提供了CMPF抑制剂用于治疗有需要的受试者的β-细胞功能障碍的用途。在一个实施方案中，还提供了一种CMPF抑制剂，用于治疗有需要的受试者的β-细胞功能障碍。还提供了CMPF抑制剂在制备用于治疗β-细胞功能障碍的药物的用途。任选地，所述受试者患有或疑似患有葡萄糖稳态受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂。
在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使血液中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使胰岛细胞中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂使诸如β-细胞的胰岛素产生型细胞中CMPF的生理浓度降低。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT调节剂。在一个实施方案中，所述OAT调节剂是OAT1、OAT3和/或OAT4的抑制剂。OAT特异性抑制剂的实例包括但不限于丙磺舒(probenecid)、对氨基马尿酸盐(PAH)、普伐他汀(pravastatin)、新生霉素(novobiocin)、磺吡酮(sulfinpyrazone)、以及苄青霉素(benzylpenicillin)/青霉素G(Penicillin G，PCG)、西司他丁(cilastatin)以及KW-3902。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂是非特异性OAT抑制剂，如丙磺舒。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂对OAT1具有特异性，如PAH。在一个实施方案中，所述OAT抑制剂对OAT3具有特异性，如PCG或普伐他汀。
根据以下详细说明，本发明的其它特征和优势将变得显而易见。然而，应当了解的是，虽然详细说明和具体实施例表明了本发明的优选的实施方案，但是所述详细说明和所述具体实施例仅是以说明的方式给出的，这是因为根据这一详细说明，落入本发明的精神和范围内的各种变化方案和改动方案对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
图1：A)示出了基于代谢组谱分析相比于NGT患者血浆在GDM患者血浆中显著变化的生物分子的变化倍数的直方图。相比于NGT，在GDM中CMPF是最高程度上调的，增加到5.69倍。B)对独特的群组进行两次独立的代谢组学筛选的结果，所述结果显示与NGT患者相比，在GDM患者中CMPF的增加倍数相似。第一轮以黑色示出，第二轮以白色示出，两轮的平均值以灰色示出。与对应的NGT群体相比，GDM值均显著升高，*P<0.01。
图2示出了ELISA结果，所述ELISA结果显示相比于NGT患者，在妊娠期间获得的GDM患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高；相比于NGT患者，在产后获得的IGT患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高；以及相比于NGT对照，在混合性别的群体中T2D患者的血浆样品中CMPF的水平显著升高。GDM-妊娠患者(N＝24)的CMPF血浆浓度是NGT-妊娠对照(N＝24)的约10倍，p<0.001。在产后一年时取自相同孕妇的血浆样品显示患有GDM并且在产后进而产生IGT的女性(N＝5)的血浆CMPF与在妊娠期间和产后均维持NGT的女性(N＝5)相比增加到13倍。来自T2D的混合性别群体(N＝6)的血浆样品显示与NGT对照群体(N＝6)相比，血浆CMPF增加到约10倍。在所有情况下，P<0.05，并且样品在年龄、种族、性别以及妊娠前BMI的方面是匹配的。对于妊娠期样品和产后样品来说，患者在糖尿病家族史方面也是匹配的。
图3示出了CMPF显著损伤MIN6细胞和完整的原代人和鼠胰岛中的GSIS。A)使用媒介物(0CMPF，黑色)或200μM的CMPF(白色)对MIN6细胞进行处理，证实了CMPF处理在4小时的预孵育之后显著地损伤GSIS和KCl刺激的胰岛素分泌(n＝4)。使用媒介物(0CMPF，黑色)、20μM的CMPF(灰色)、或200μM的CMPF(白色)对原代人(B)胰岛和原代鼠(C)胰岛进行处理证实了与媒介物对照和20μM CMPF对照相比，200μM的CMPF在24小时预孵育之后损伤人胰岛和鼠胰岛这两者中的GSIS(对于人胰岛，n＝5，并且对于鼠胰岛，n＝4)。LG＝2.8mM的葡萄糖，HG＝16.7mM的葡萄糖，KCl＝16.7mM的葡萄糖+30mM的KCl。*p<0.05。
图4示出了CMPF处理虽然抑制GSIS但是不诱导体外处理的细胞发生细胞凋亡或坏死。A)使用0μM(EtOH媒介物对照)、20μM或200μM的CMPF将MIN6细胞处理4小时，之后加入膜联蛋白V和碘化丙锭荧光染料，并且使用赫斯特染料(Hoechst dye)进行复染色。仅在阳性对照，即接受5mM H2O2处理3小时的MIN6中观测到膜联蛋白V和碘化丙锭染色。B)将原代CD1胰岛分散并且用媒介物对照(0CMPF，黑色)、20μM的CMPF(灰色)或200μM的CMPF(白色)处理48小时，然后使用膜联蛋白V、碘化丙锭以及赫斯特染料染色。通过Arrayscan VTI HCS读数器对双重阳性染色的定量进行评估。
图5示出了CMPF处理降低了总胰岛素含量和与胰岛素生物合成和葡萄糖感应相关的基因的表达。使用媒介物对照(0CMPF)、20μM(20CMPF)、或200μM(200CMPF)CMPF将鼠胰岛处理24小时，并且对总胰岛素含量和mRNA表达进行评估。与媒介物对照相比，200μM的CMPF显著地降低了总胰岛素含量(A)和胰岛素mRNA(B)。胰岛素mRNA的表达减少可能是因为包括Pdx-1、MafA以及HNF4a在内的胰岛素转录因子的表达减少(C)。胰岛素加工酶PCSK1、PCSK2以及CpE的表达减少(D)表示CMPF还可以损伤翻译后的胰岛素加工。最终，CMPF引起β细胞葡萄糖转运蛋白GLUT2和对于葡萄糖代谢来说关键的限速酶GCK的表达减少(E)，这或许损伤了葡萄糖感应和代谢。在所有情况下，n＝4，*P<0.05。
图6示出了腹膜内注射CMPF使得血浆水平升高并且在腹膜内注射3天后进行的OGTT显示在接受CMPF处理的小鼠中胰岛素分泌受损以及葡萄糖耐量受损。对CD1小鼠腹膜内注射媒介物对照(黑色)或CMPF(白色)。A)在腹膜内注射后的10分钟、30分钟、60分钟、120分钟以及360分钟时获得血浆样品，并且对CMPF进行测定。接受CMPF注射的小鼠的血浆CMPF的水平显著地升高(p<0.05)持续最多2小时，但在注射后的6小时之时不显著升高(每组n＝4)。在腹膜内注射的3天过程期间，监测小鼠的体重(B)、随机进食血糖(C)以及血浆胰岛素(C)。这些参数中的任一个均不存在差异。在连续3天的CMPF注射之后，使小鼠禁食14小时，并且进行OGTT。接受CMPF处理的小鼠与接受媒介物注射的对照相比具有显著受损的胰岛素分泌(D)和受损的葡萄糖耐量(C)(每组n＝10，p<0.05)。
图7示出了取自接受CMPF腹膜内注射3天的小鼠的胰岛显示GSIS受损，总胰岛素含量减少以及胰岛素mRNA减少。A)在接受CMPF注射的小鼠(处理，白色)与媒介物对照(对照，黑色)之间在胰岛尺寸方面不存在显著性差异。这些胰岛确实表现出GSIS受损(B)、总胰岛素含量减少(C)以及胰岛素mRNA减少(D)，与对分离的原代胰岛进行体外处理相一致。N＝5，*P<0.05。
图8示出了CMPF可以引起胰岛素抵抗并且在腹膜内注射7天后进行的OGTT显示在接受CMPF处理的小鼠中胰岛素分泌受损以及葡萄糖耐量受损。对CD1小鼠腹膜内注射媒介物对照(黑色)或CMPF(白色)。在腹膜内注射的7天过程期间，监测小鼠的体重(A)以及随机进食血糖(B)和血浆胰岛素(C)。体重或血糖不存在差异，然而，接受CMPF处理的小鼠在注射的第4-7天具有显著升高的血浆胰岛素水平，这表示CMPF促使胰岛素抵抗。在第8天，在14小时禁食之后，在即将进行OGTT之前出现较低体重。在连续7天的CMPF注射之后，使小鼠禁食14小时，并且进行OGTT。接受CMPF处理的小鼠与对照相比具有显著受损的葡萄糖耐量(D)，这对应于显著受损的胰岛素分泌(E)。在OGTT后立即从小鼠分离的胰岛显示相对于对照，在接受CMPF注射的小鼠中，在低葡萄糖下胰岛素的分泌显著增加以及在高葡萄糖下胰岛素的分泌显著减少(F)。(每组n＝8，p<0.05)。
图9示出了3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的结构和分子式。CMPF在健康的个体体内以20μM的浓度内源性地存在，而在尿毒症个体体内以超过200μM的浓度内源性地存在。
图10示出了在24小时处理之后，CMPF损伤β细胞的功能。接受200μM的CMPF处理24小时的CD1小鼠胰岛与接受媒介物处理的对照相比具有显著受损的葡萄糖刺激的胰岛素分泌和KCl刺激的胰岛素分泌。
图11示出了OAT1和OAT3在CMPF转运入肾脏中起作用，而OAT4负责向肾管腔内的分泌。OAT1和OAT3充当交换因子，将CMPF从血浆吸收到肾脏的近端小管细胞中并且将二羧酸释放到血液中。协同转运蛋白NaDC3通过将二羧酸和钠离子这两者转运到细胞中来补充细胞中的二羧酸。一旦CMPF处在小管细胞中，它就由OAT4排泄到肾管腔中与氯离子进行交换。
图12示出了丙磺舒在体内阻断OAT转运蛋白的功能。图(A)改写自Costigan等,1996并且示出了在单独施用5mg/kg时，CMPF从血浆中被清除(淡灰色)。在将CMPF与150mg/kg丙磺舒共同施用时，它的清除率随时间推移显著降低。图(B)示出了对小鼠每天两次注射150mg/kg的丙磺舒抑制了OAT转运蛋白的功能，如通过显著降低的血浆尿酸浓度所证实。
图13示出了OAT转运蛋白和协同转运蛋白在胰岛细胞中表达。在图(A)中，OAT1、OAT3以及NaDC3在小鼠胰岛中以与其它胰岛基因相当的水平表达。图(B)示出了OAT3和NaDC3主要在胰岛素产生型细胞中表达，而OAT1和OAT4主要在非胰岛素产生型人胰岛细胞中表达。C)OAT1、OAT3以及NaDC3在人胰岛中的表达由蛋白质印迹法(Western blotting)确认。使用人近端小管细胞系HK-2作为阳性对照。
图14示出了抑制OAT转运蛋白阻断了CMPF对β细胞功能的抑制作用。图(A)示出了在分离的小鼠胰岛中使用1mM丙磺舒对胰岛进行预处理，之后使用200μM的CMPF处理24小时保持了胰岛素的分泌。图(B)示出了在分离的小鼠胰岛中使用300μM的OAT3特异性阻断剂PCG对胰岛进行预处理，之后使用200μM的CMPF处理24小时保持了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
图15示出了丙磺舒在体内对葡萄糖耐量没有影响。接受3天的150mg/kg丙磺舒每天两次注射的小鼠在(A)体重或(B)血糖方面没有差异。图(C)示出了在第4天进行OGTT并且在媒介物对照与接受丙磺舒注射的小鼠之间葡萄糖耐量未显示出差异。
图16示出了在注射CMPF 7天之后，基于高胰岛素-正常血糖钳夹，小鼠具有降低的葡萄糖利用。A)图示了注射和手术的时间线的示意图。与媒介物对照相比，接受7天的CMPF注射的小鼠的B)葡萄糖输注率、(C)葡萄糖出现率和(D)葡萄糖消失率以及(E)糖酵解率(每组N＝4)。后期/基础的糖酵解率无差异，表明CMPF没有诱发胰岛素抵抗，而是降低了葡萄糖出现率和葡萄糖消失率。**P<0.01，***P<0.001。值是平均值±SEM。
图17示出了CMPF由β-细胞代谢以增加ROS并且改变胰岛素的生物合成。A)被处理24小时的胰岛基质中的胰岛素原(每组n＝4)。B)在急速添加媒介物对照或200μM的CMPF之后的线粒体膜电位(MMP)(每组N＝3)。C)在被处理4小时和被处理24小时的小鼠胰岛中的ROS水平以及代表性的图像(N＝来自4只小鼠/组的10-15个胰岛/小鼠)。D)抗氧化基因Cat和(e)Ucp2的表达(每组n＝4)。F)在接受500μM的NAC处理的被处理24小时的胰岛中的ROS积聚(n＝来自4只小鼠/组的10个胰岛/小鼠)。接受500μM的NAC共同处理的被处理24小时的胰岛的G)GSIS和(h)总胰岛素含量(每组n＝4)。示出了(i)GSK3β的Ser9磷酸化、(j)AKT的Ser473磷酸化的蛋白质印迹(每组n＝3)。K)示出了在使用CMPF和NAC处理的情况下FOXO1和(l)PDX1的核易位的免疫荧光染色(n＝3-6)。在使用CMPF和NAC处理的情况下基于免疫荧光染色(m)FOXO1和(n)PDX1的核百分比的定量。O)示出了PDX1和FOXO1的蛋白质丰度的蛋白质印迹。值是平均值+/-SEM。学生t检验(Student's t-test)(a、c-j、m-o)、单因素ANOVA(b)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图18示出了CMPF引起胰岛素生物合成基因的表达减少并且改变代谢基因的表达。A)在被24小时处理的胰岛中胰岛素、胰岛素加工酶、胰岛素转录因子以及葡萄糖感应基因的表达(每组N＝5-6)。B)在与对照或200μM的CMPF一起孵育24小时之后的MMP以及荧光的变化(每组N＝4)。C)在被处理24小时的小鼠胰岛中通过微阵列基于生物功能对显著变化的基因进行的分类(N＝3，P<0.05)。值是平均值+/-SEM。学生t检验(a、c)、单因素ANOVA(b)。*P<0.05，**P<0.01。
图19示出了CMPF经由有机阴离子转运蛋白3进入β-细胞。A)对显示OAT转运蛋白和β-细胞基因表达的人胰岛的微阵列分析(n＝3)。通过(b)RT-PCR、(c)蛋白质印迹、以及(d)使用胰岛素进行的免疫荧光染色对人胰岛中的OAT表达的验证(n＝3-5)。人肾脏样品来自于HK2人近端小管细胞系。接受OAT抑制剂(e)丙磺舒、(f)苄青霉素(PCG)以及(g)对氨基马尿酸盐(PAH)共同处理的鼠胰岛的GSIS(每组n＝4)。h)接受CMPF和PCG共同处理的鼠胰岛的总胰岛素含量(n＝4)。值是平均值+/-SEM。学生t检验(a、e-h)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图20示出了使CMPF与无脂肪酸的BSA缀合对受CMPF损伤的葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有影响。使CMPF与无脂肪酸的BSA缀合6小时，之后添加胰岛(绿色条柱和蓝色条柱)。使用用于缀合油酸酯的相同的方案。黑色条柱和白色条柱表示在未进行预先缀合的情况下在培养基中添加CMPF连同0.1％的BSA。N＝3。*P<0.05。
具体实施方式
在本发明说明内容的一个方面，3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)已被证实是一种可用于鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的生物标志物。如在实施例1中所阐述，发现与具有正常的葡萄糖耐量的受试者相比，呋喃脂肪酸CMPF的水平在患有妊娠期糖尿病(GDM)的受试者中升高。还发现在GDM后在产后1年内患葡萄糖耐量受损的女性与在同一时间段内维持正常的葡萄糖耐量的女性相比具有显著升高的CMPF水平。在本公开的另一个方面，高的生理学上相关水平的CMPF已经被证实在体外会损伤胰岛素分泌。此外，注射CMPF已经被证实在体内会损伤β-细胞功能并且阻止葡萄糖刺激的胰岛素分泌。CMPF因此损伤了葡萄糖利用，如通过葡萄糖耐量测试所测量，并且与葡萄糖稳态受损和特征在于β-细胞功能障碍的病况的发病有关，所述病况如GDM、胰岛素分泌受损、葡萄糖不耐症以及II型糖尿病。诸如丙磺舒之类的CMPF抑制剂的使用已经被证实会消除CMPF对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。值得注意的是，丙磺舒的施用还已经被证实会升高体内的循环CMPF水平而不改变葡萄糖耐量。降低血液和/或胰岛细胞中CMPF的生理水平的CMPF抑制剂因此预期可用于治疗如患有葡萄糖稳态受损的受试者的β-细胞功能障碍。
本发明的说明内容因此提供了用于鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法以及用于监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法。任选地，患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者患有β-细胞功能障碍或特征在于β-细胞功能障碍的病况。任选地，本文所述的方法可用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损而未患β-细胞功能障碍的受试者。
还提供了用于通过使一个或多个细胞与CMPF接触来引起β-细胞功能障碍的方法。用于引起β-细胞功能障碍的方法可用于产生葡萄糖稳态受损和特征在于β-细胞功能障碍的病况的体外模型或体内模型。本公开还提供了对影响β-细胞活性的化合物进行筛选的方法。还提供了用于治疗β-细胞功能障碍或特征在于β-细胞功能障碍的病况的方法，所述方法包括向受试者施用CMPF抑制剂；或CMPF抑制剂用于治疗β-细胞功能障碍或特征在于β-细胞功能障碍的病况的用途。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂并且使用所述OAT激活剂进行治疗有助于降低血液中CMPF的水平。任选地，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂，如丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)或苄青霉素(PCG)、或其组合。在一个实施方案中，使用OAT抑制剂进行治疗有助于降低胰岛细胞中CMPF的水平。
定义
如本文所用的“葡萄糖稳态受损”指的是其中受试者不能维持血液中正常的葡萄糖水平的一种短暂的或持续的病况。葡萄糖稳态受损的实例包括但不限于胰岛素分泌受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。任选地，患有葡萄糖稳态受损的受试者还患有β-细胞功能障碍。
如本文所用的术语“β-细胞功能障碍”指的是其中β-细胞的活力或生理活性受损的一种病况。在一个实施方案中，β-细胞功能障碍指的是β细胞不能分泌足够的生物活性胰岛素以维持血液和组织中葡萄糖、脂肪酸以及其它营养物质的正常水平。在一个实施方案中，β-细胞功能障碍指的是β-细胞的胰岛素分泌被不适当地增大，其促使胰岛素抵抗的发生。β-细胞功能障碍任选地是体外、离体或体内一个或多个细胞的病况。β-细胞功能障碍的实例包括但不限于胰岛素分泌受损、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。
如本文所用的术语“受试者”指的是动物界中具有β-细胞的任何成员，所述β-细胞储存并且释放胰岛素以控制血液中葡萄糖的水平。在一个实施方案中，所述受试者是人。在一个实施方案中，所述受试者患有或疑似患有特征在于β-细胞功能障碍的病况。在一个实施方案中，所述受试者是动物，如大鼠或小鼠。
术语“样品”指的是来自受试者的可以测定CMPF的任何流体或其它样品。举例来说，在一个实施方案中，所述样品是血液或血液衍生物，如血清或血浆。任选地，所述样品是呈EDTA(钠盐、K2盐或K3盐)或肝素形式的血浆。在一个实施方案中，所述样品是尿或汗液。在一个实施方案中，测定来自受试者的测试样品中CMPF的水平。任选地，所述测试样品可以是冷冻的样品或存档的样品。
如本文所用的术语“对照水平”指的是来自已知患有特定的病况或未患特定的病况的受试者或一组受试者的样品中CMPF的水平。所述对照可以变化，这取决于正被监测、评估或鉴定的物质。举例来说，在一个实施方案中，CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。在一个实施方案中，CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有特征在于β-细胞功能障碍的病况或有患特征在于β-细胞功能障碍的病况的风险。所述对照还可以是值的预定的标准、平均或参考范围。任选地，术语“对照水平”包括在更早的时间点测定的来自受试者的测试样品中CMPF的水平。在一个实施方案中，对照是年龄或性别匹配的对照。在一些实施方案中，对照水平表示受试者未患葡萄糖稳态受损，任选地约20μM。在一些实施方案中，对照水平表示受试者患有葡萄糖稳态受损，任选地约50μM、100μM、150μM或200μM。在一些实施方案中，大于对照水平的CMPF水平表示受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
如本文所用的“药剂”指的是具有确定的或未确定的组成的分子、化合物或物质，包括但不限于有机或无机分子、多肽、抗体、多糖或其它生物分子或者由诸如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织之类的生物材料制成的提取物。任选地，所述药剂是处在诸如组合的小分子阵列或展示文库之类的阵列中的分子、化合物或物质。在一个实施方案中，所述药剂是有机化合物，如丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)或苄青霉素(PCG)。
如本文所用的“β-细胞的活性”指的是β-细胞影响对营养物质的感应或胰岛素的合成、储存或释放的尺寸、活力或生理活性方面的任何变化。β-细胞的活性的实例包括但不限于葡萄糖刺激的胰岛素分泌、胰岛素基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译、β-细胞数目的变化或β-细胞群的扩增、损耗或扩增失败。任选地，本文所述的方法包括确定测试药剂对一个或多个β-细胞的单一活性或两种或更多种活性的作用。
如本文所用的术语“葡萄糖耐量受损”指的是特点在于与胰岛素抵抗有关的高血糖症的糖尿病前期状态的一种病况。术语“胰岛素抵抗”指的是其中胰岛素在降低血糖水平方面变得不太有效的一种生理病况。术语“妊娠期糖尿病”指的是其中先前未被诊断出2型糖尿病的女性在妊娠期期间表现出高的血糖水平的一种病况。如本文所用的术语“糖尿病前期”指的是其中受试者表现出空腹血糖受损和/或葡萄糖耐量受损而尚未发展成糖尿病或2型糖尿病的一种病况。如本文所用的术语“2型糖尿病”也被称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，是特征在于在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏的背景下出现高血糖的一种代谢病症。任选地，2型糖尿病指的是受试者的空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/l(126mg/dl)。用于鉴定患有葡萄糖稳态受损、糖尿病、β-细胞功能障碍和/或相关病况的受试者的合适标准参见于Standardsof Medical Care in Diabetes-2012Diabetes Care(糖尿病的医疗护理标准-2012年糖尿病护理),第35卷,增刊1,2012年1月中，该文献在此以引用的方式并入本文。
如本文所用的术语“抗体”意图包括单克隆抗体、多克隆抗体以及嵌合抗体。所述抗体可以来自于重组来源和/或在转基因动物中产生。如本文所用的术语“抗体片段”意图包括而不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双特异抗体、以及其多聚体、多特异性抗体片段和结构域抗体。可以使用常规技术使抗体片段化。举例来说，F(ab')2片段可以通过使用胃蛋白酶对抗体进行处理而产生。可以对所得的F(ab')2片段进行处理以还原二硫桥键而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以引起Fab片段形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双特异抗体、双特异性抗体片段以及其它片段还可以通过重组技术来合成。
CMPF的抗体可商购自生命科学先进技术公司(Life Sciences AdvancedTechnology Inc.)(佛罗里达州的圣彼得堡(St.Petersburg,FL))或诺威特生物科技公司(Noventein Biosciences)(马萨诸塞州的剑桥市(Cambridge,Mass.))。然而，本领域技术人员将了解的是，可以产生对CMPF或对与CMPF代谢或降解相关的生物标志物具有特异性的其它抗体。为了产生单克隆抗体，可以从利用目标抗原(例如CMPF)免疫接种的动物收集抗体产生细胞(淋巴细胞)并且通过标准的体细胞融合程序使这些细胞与骨髓瘤细胞融合，从而使得这些细胞永生化并且产生杂交瘤细胞。这些技术(例如最初由Kohler和Milstein(Nature 256:495-497(1975)研发的杂交瘤技术)以及其它技术是本领域公知的，所述其他技术如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,Immunol.Today 4:72(1983))、产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等,Methods Enzymol,121:140-67(1986))、以及对组合抗体文库进行筛选(Huse等,Science 246:1275(1989))。可以免疫化学方式针对与目标抗原发生特异性反应的抗体的产生来筛选杂交瘤细胞，并且可以分离单克隆抗体。
如本文所用的术语“CMPF抑制剂”包括螯合或降低血液或血浆中CMPF的生理浓度和/或降低胰岛细胞中CMPF的生理浓度的任何药剂。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂提高了CMPF从血浆中的清除率。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT激活剂。在一个实施方案中，所述OAT激活剂提高了CMPF从血浆中的清除率。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂降低胰腺β-细胞中CMPF的生理浓度。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂抑制在胰岛细胞中表达的有机阴离子转运蛋白(OAT)的活性。在一个实施方案中，所述CMPF抑制剂是OAT抑制剂。
如本文所用的“OAT抑制剂”指的是抑制有机阴离子转运蛋白(OAT)的表达或活性的任何药剂。在一个实施方案中，OAT抑制剂抑制OAT1(也被称为SLC22A6)、OAT3(也被称为SLC22A8)和/或OAT4(也被称为SLC22A11)的表达或活性。OAT抑制剂的实例包括但不限于丙磺舒、苄青霉素(PCG)以及对氨基马尿酸盐(PAH)。
如本文所用的“OAT激活剂”指的是提高有机阴离子转运蛋白(OAT)的表达或活性的任何药剂。在一个实施方案中，所述OAT激活剂对OAT4(也被称为SLC22A11)具有特异性。
如本文所用的并且如本领域所充分了解的“治疗(treating或treatment)”意指用于获得有益的或所需的结果的方法，所述结果包括临床结果。有益的或所需的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病况；降低疾病的程度；使疾病的状态稳定(即不恶化)(例如维持足够的胰岛素和/或生理学上正常的血糖水平)；预防疾病传播；延迟或减缓疾病进展；改善或缓和疾病状态；减少疾病复发；以及缓解(无论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测出的或是不可检出的。“治疗”还可以意指使存活期与在未接受治疗的情况下预期的存活期相比得到延长。如本文所用的“治疗”还包括预防性治疗。在一个实施方案中，治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的CMPF抑制剂并且任选地由单次施用组成，或可选地包括一系列施用。在一个实施方案中，“治疗”包括改善具有葡萄糖稳态受损的受试者中的β-细胞功能。
如本文所用的短语“有效量”或“治疗有效量”意指在为实现所需的结果所必需的剂量和时间段下有效的量。举例来说，在治疗葡萄糖稳态受损的背景下，有效量是与在未施用化合物的情况下所获得的反应相比[有助于改善β-细胞功能或有助于使胰岛素和/或葡萄糖的水平稳定在生理学上正常的浓度]的量。有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别以及体重之类的因素而变化。将对应于这种量的给定化合物的量将随各种因素而变化，所述因素如给定的药物或化合物、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、所治疗的受试者或宿主的特征等，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。
在一个实施方案中，诸如本文所述的CMPF抑制剂之类的化合物被制备或配制用于向有需要的受试者施用，如本领域已知的那样。用于选择和制备合适的制剂的常规程序和成分描述于例如Remington's PharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)(2003年-第20版)和1999年出版的The UnitedStates Pharmacopeia:The National Formulary(《美国药典：国家处方集》)(USP24NF19)中。
鉴定或监测β-细胞功能障碍的方法
在一个实施方案中，提供了一种鉴定患有葡萄糖稳态受损或有产生葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
a)测定来自受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的测试水平与对照水平比较，其中CMPF的测试水平相对于对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
还提供了一种监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法，所述方法包括：
(a)测定来自所述受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的测试水平与来自所述受试者在更早的时间点的CMPF水平相比较，其中CMPF水平增加则表示所述受试者的葡萄糖稳态受损更严重，并且CMPF水平降低则表示所述受试者的葡萄糖稳态得到改善。
在一个实施方案中，本文所述的用于鉴定或监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法可用于鉴定或监测患有β-细胞功能障碍或有患β-细胞功能障碍风险的受试者。任选地，本文所述的方法包括获得或提供来自所述受试者的样品。举例来说，在一个实施方案中，所述样品是血液样品、血浆样品、血清样品或尿样品或者可以用于分析CMPF水平的另一种生物样品。
在一个实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定或监测其中对血糖水平的调节受损的病况。特征在于葡萄糖稳态受损的病况的实例包括但不限于β-细胞功能障碍、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病(GDM)、胰岛素抵抗或2型糖尿病。在一个实施方案中，受试者中CMPF水平的量值反映了所述受试者中对血糖水平的调节受损的严重程度。在一个实施方案中，受试者中CMPF水平的量值反映了所述受试者中β-细胞功能障碍的严重程度。
本领域技术人员将了解的是，在来自受试者的测试样品中所观测到的CMPF的水平与对照水平之间的差异或相似可以被用于鉴定或监测患有或疑似患有葡萄糖稳态受损的受试者。
举例来说，如果正在对妊娠期糖尿病(GDM)进行鉴定或监测，那么所述对照可以来自于已知未患GDM的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有GDM或患GDM的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有GDM的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有GDM或患GDM的风险增加。
在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患葡萄糖耐量受损的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患葡萄糖耐量受损的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有葡萄糖耐量受损的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患葡萄糖耐量受损的风险增加。
在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患糖尿病前期的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有糖尿病前期或患糖尿病前期的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有糖尿病前期的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有葡萄糖耐量受损或患糖尿病前期的风险增加。
在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患胰岛素抵抗的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有胰岛素抵抗或患胰岛素抵抗的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有胰岛素抵抗的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有胰岛素抵抗或患胰岛素抵抗的风险增加。
在一个实施方案中，所述对照来自于已知未患2型糖尿病的受试者或一组受试者，并且相对于所述对照，测试受试者的CMPF的水平更高则表示所述测试受试者患有2型糖尿病或患2型糖尿病的风险增加。任选地，所述对照可以来自于已知患有2型糖尿病的受试者或一组受试者，并且测试受试者的CMPF的水平相对于所述对照相似则表示所述测试受试者患有2型糖尿病或患2型糖尿病的风险增加。
在一个实施方案中，所述对照水平代表具有正常的葡萄糖耐量的受试者中的CMPF水平，并且相对于所述对照水平，测试样品中CMPF的水平增加则表示葡萄糖耐量受损。
未患葡萄糖稳态受损的受试者的血浆中CMPF的水平一般在约10μM至30μM的范围内，通常是约20μM。在一个实施方案中，测试受试者的血浆CMPF水平显著地高于约20μM则表示葡萄糖稳态受损。在一个实施方案中，血浆中大于50μM、100μM、150μM、200μM、300μM或500μM的CMPF的水平表示葡萄糖稳态受损。在一个实施方案中，受试者中的CMPF水平的量值表示受试者中葡萄糖稳态受损的严重程度。
在一个实施方案中，测定样品中CMPF的测试水平的步骤包括检测样品中的CMPF。在一个实施方案中，测定CMPF的测试水平的步骤包括检测或测定样品中代表CMPF水平的CMPF代谢物或分析物的水平。举例来说，在一个实施方案中，本文所述的方法包括检测或测定产生CMPF的一种或多种前体分子或CMPF代谢或降解的副产物的水平。在一个实施方案中，本文所述的方法包括检测或测定由于CMPF的血浆水平增加而具有改变的丰度的诸如甲状腺素(甲状腺激素)之类的一种或多种白蛋白结合型蛋白质/代谢物/肽的水平。CMPF是高白蛋白结合型并且可以竞争过其它白蛋白结合型蛋白质。(Lim等,Metabolism(1993),42(11)；1468)。因此，血液中升高水平的CMPF可以引起诸如甲状腺素之类的其它白蛋白结合型蛋白质被置换，从而增加它们在血液中的游离(非白蛋白结合型)水平。
任选地，本文所述的方法包括在检测CMPF之前对样品进行处理。举例来说，在一个实施方案中，对样品进行处理以从样品中去除可能会干扰CMPF检测的成分和/或分离或纯化样品中的CMPF。在一个实施方案中，可以使用色谱法对样品进行处理。在一个实施方案中，对样品进行处理以在检测样品中的CMPF之前去除高丰度的蛋白质诸如白蛋白。
本领域技术人员已知用于检测CMPF的不同的方法可用于本文所述的方法的目的。举例来说，在一个实施方案中，使用质谱法(MS)，任选地气相色谱/质谱法(GC-MS)或液相色谱/质谱法(LC-MS)来检测CMPF。在一个实施方案中，检测CMPF的步骤包括使用高效液相色谱法(HPLC)或核磁共振(NMR)光谱法。
在一个实施方案中，免疫组织化学方法可用于检测CMPF。举例来说，CMPF容易使用特异性结合CMPF的抗体来检测。在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)对CMPF进行检测。对有助于检测的抗体进行标记的任何方法均将是有用的(例如放射性标记的肽、酶或荧光标记的肽)。可用于检测CMPF的其它测定可以包括但不限于：放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”测定、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定以及免疫电泳测定。
引起β-细胞功能障碍的方法
在本公开的一个方面，高于正常水平的CMPF已经被证实会引起β-细胞功能障碍。因此，在一个实施方案中，提供了一种在一个或多个β-细胞中引起β-细胞功能障碍的方法，所述方法包括使一个或多个β-细胞与CMPF接触。任选地，所述β-细胞是胰岛细胞。在一个实施方案中，所述β-细胞在体外、体内或离体。本文所述的用于引起β-细胞功能障碍的方法可用于产生特征在于β-细胞功能障碍的病况(如糖尿病)的体外、体内或离体模型。
在一个实施方案中，使β-细胞与超生理浓度的CMPF接触将引起β-细胞功能障碍。举例来说，在一个实施方案中，使β-细胞与大于50μM、100μM、150μM、200μM、300μM或500μM的浓度的CMPF接触。本领域技术人员将了解的是，CMPF的浓度越大，在β-细胞中所引起的功能障碍就越大。
在一个实施方案中，所述β-细胞在体外并且使所述β-细胞与CMPF接触引起了胰岛素分泌受损。或者，所述β-细胞在体内，如在β-细胞功能障碍的动物模型中。在一个实施方案中，所述β-细胞在受试者体内，并且所述方法包括向所述受试者施用CMPF。在一个实施方案中，所述受试者是具有储存和释放胰岛素的β-细胞的动物，如小鼠或大鼠。
本领域技术人员将了解的是，施用合适剂量的CMPF以在体外或在受试者体内引起所需水平的β-细胞功能障碍。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用至少5mg/kg的CMPF。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用至少7mg/kg、至少10mg/kg或至少20mg/kg。任选地，CMPF可以口服、通过注射或通过任何其它手段来施用以使得血液中CMPF的水平增加。举例来说，CMPF可以通过腹膜内注射、静脉内注射、皮下注射或肌内注射以及经由经口灌胃或经由富含CMPF或前体脂肪酸的饮食来施用。在一个实施方案中，提供了一种可用于向受试者施用的组合物，所述组合物包含CMPF和一种或多种药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，使一个或多个β-细胞与CMPF接触引起了特征在于β-细胞功能障碍的病况，所述病况选自葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。本领域技术人员将了解的是，使用本文所述的方法在体外、离体或体内引起β-细胞功能障碍可以被用于产生β-细胞功能障碍的模型。在一个实施方案中，本文所述的方法包括使用已被施用CMPF的β-细胞或受试者作为特征在于β-细胞功能障碍的病况的动物模型。
筛选化合物的方法
在一个方面，提供了一种对影响β-细胞活性的药剂进行筛选的方法。如本文所述，可以使用CMPF产生β-细胞功能障碍的模型。恢复或改善具有高于生理学上正常水平的CMPF的细胞中的β-细胞功能的药剂因此是用于治疗特征在于β-细胞功能障碍的病况的候选者。在一个实施方案中，提供了一种筛选方法，所述方法包括：
(a)提供一个或多个β-细胞，其中所述β-细胞的活性已通过使所述β-细胞与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)接触而降低；
(b)使所述β-细胞与测试药剂接触；以及
(c)确定所述测试药剂对所述β-细胞活性的作用。
任选地，所述β-细胞在体内、体外或离体。在一个实施方案中，所述β-细胞是胰岛细胞。在一个实施方案中，如果所述测试药剂对活性的作用高于阈值水平，那么将所述测试药剂鉴定为有效的。举例来说，在一个实施方案中，如果测试药剂使β-细胞的活性——与在通过使所述β-细胞与CMPF接触而使它们的活性降低之前所述细胞的活性相比——恢复至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，那么可以将所述测试药剂鉴定为有效的。在一个实施方案中，所述活性是改善胰岛素的储存或分泌或对调节血液中葡萄糖的β-细胞的任何活性。举例来说，在一个实施方案中，所述活性是β-细胞的尺寸或活力，如通过检测β-细胞群扩增或β-细胞损失所确定。在一个实施方案中，所述活性是胰岛素胞吐。在一个实施方案中，所述活性是葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。还可以通过检测胰岛素基因或胰岛素转录因子基因、葡萄糖感应基因或胰岛素加工基因的转录或翻译来确定β-细胞的活性。在一个实施方案中，所述方法包括测定一种或多种胰岛素基因或胰岛素转录因子基因或一种或多种葡萄糖感应基因或一种或多种胰岛素加工基因的表达。在一个实施方案中，所述胰岛素基因或胰岛素转录因子基因是INS、PDX1、MAFA或NKX6.1。在一个实施方案中，所述葡萄糖感应基因是GLUT2、GLUT1或GCK。在一个实施方案中，所述胰岛素加工基因是PCSK1、PCSK2或CPE。在一个实施方案中，所述基因选自SLC2A1、SLC2A2、GCK、Kir6.2、ABCC8、CACNA1D、CACNA1A、CACNA1H、KCNB1、SNAP25、STX1A、VAMP2、SYN1A、PDX1、MAFA、NKX6.1、INS(在小鼠中为INS1或INS2)、PCSK1、PCSK2以及CPE。任选地，本文所述的基因是人基因或它们的非人对应物。
本领域技术人员将了解的是，可以使用许多不同的测定来测定β-细胞的活性。举例来说，可以通过RT-PCR、定量RT-PCR、微阵列或通过本领域已知的其它测定来测定相关基因的表达。
在一个实施方案中，本文所述的筛选方法可用于鉴定影响β-细胞群扩增的化合物并且通过Brdu和/或Ki67测定来测定β-细胞的活性。在另一个实施方案中，本文所述的方法可用于鉴定影响β-细胞损失的化合物并且通过膜联蛋白5-碘化丙锭染色、台盼蓝染色或胱天蛋白酶3活性测定/染色来测定β-细胞损失。
使用CMPF抑制剂治疗β-细胞功能障碍
如本文所述，高于正常水平的CMPF已经被证实与β-细胞功能障碍相关。降低具有升高水平的CMPF和/或患有特征在于β-细胞功能障碍的病况的受试者体内循环的CMPF的水平因此预期对β-细胞活性具有有益的作用。此外，降低诸如β-细胞之类的胰岛细胞中CMPF的水平预期对β-细胞活性具有有益的作用。如实施例2中所示，OAT转运蛋白在胰岛细胞中表达并且抑制OAT阻断CMPF对β-细胞功能的抑制作用。抑制患有特征在于β-细胞功能障碍的病况的受试者中OAT转运蛋白功能因此预期对β-细胞活性具有有益的作用。
此外，如实施例2中所示，注射CMPF在体内损伤β-细胞功能并且阻止葡萄糖刺激的胰岛素分泌。诸如丙磺舒之类的CMPF抑制剂的使用消除了CMPF对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响。值得注意的是，丙磺舒的施用还已经被证实会升高体内的循环CMPF水平而不改变葡萄糖耐量。虽然丙磺舒升高血液CMPF水平，但它被认为阻止CMPF进入β细胞并且因此保护β细胞免受CMPF的影响。降低血液和/或胰岛细胞中CMPF的生理水平的CMPF抑制剂因此预期可用于治疗β-细胞功能障碍，如在患有葡萄糖稳态受损的受试者中的β-细胞功能障碍。类似地，OAT抑制剂和/或特异性OAT抑制剂，如对OAT3具有特异性的PCG，预期可用于治疗β-细胞功能障碍。
因此，在一个方面，提供了一种用于通过降低受试者中CMPF的生理水平来治疗特征在于β-细胞功能障碍的病况的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂。在一个实施方案中，所述方法包括降低受试者的胰岛细胞中CMPF的生理水平。任选地，所述受试者患有或疑似患有葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。
在一个实施方案中，还提供了3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂用于治疗有需要的受试者中β-细胞功能障碍的用途。在一些实施方案中，所述CMPF抑制剂降低受试者中CMPF的生理水平，如在血液中循环的CMPF的水平和/或胰岛细胞中CMPF的水平。任选地，所述受试者患有或疑似患有葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。
在一个方面，提供了一种用于治疗特征在于β-细胞功能障碍的病况的方法，所述方法是通过调节受试者中CMPF与一种或多种有机阴离子转运蛋白(OAT)的相互作用来实现。举例来说，在一个实施方案中，施用或使用OAT特异性抑制剂，如丙磺舒或青霉素G(PCG)有助于降低胰岛细胞中CMPF的生理水平。在一个实施方案中，施用或使用OAT特异性激活剂有助于降低血液中CMPF的生理水平。在一个实施方案中，OAT特异性激活剂是OAT4的激活剂。
用于鉴定或监测β-细胞功能障碍的试剂盒
在一个实施方案中，提供了预先包装的试剂盒，所述试剂盒包含为进行本文所述的任一方法所必需的一些或所有试剂。任选地，所述试剂盒可以包括一种或多种对照样品。在一些实施方案中，已知所述对照样品含有特定水平的CMPF，如约20μM、约50μM、约100μM、约150μM或约200μM。在其它实施方案中，所述试剂盒包括已知不含CMPF的阴性对照。在另一个实施方案中，已知所述对照样品含有一定水平的CMPF或对应于葡萄糖稳态受损或特征在于葡萄糖稳态受损或β-细胞功能障碍的特定病况。在一些实施方案中，所述试剂盒包括至少一种对CMPF具有选择性的抗体。在一些实施方案中，所述试剂盒将包括用于实施本文所述的方法的详细说明书。
上述公开内容总体上描述了本申请。可以通过参考以下具体实施例获得更完全的了解。这些实施例仅是出于说明的目的而被描述的并且并不意图限制本申请的范围。如情形所建议或使得有利，形式上的变化以及等同方案的替代被涵盖在内。尽管已经在本文使用特定的术语，但这些术语意图具有描述性的意义而并不用于限制的目的。
以下非限制性实施例用于说明本申请：
实施例1：CMPF是葡萄糖稳态受损的生物标志物
材料与方法
从处在妊娠中期(第二个的妊娠期三个月)的晚期或者妊娠晚期(第三个的妊娠期三个月)的早期的女性采集血浆样品。首先在妊娠的24周与28周之间使用葡萄糖负荷测试(glucose challenge test，GCT)，继而使用3小时100g葡萄糖口服葡萄糖耐量测试(OGTT)对葡萄糖耐量进行测试。基于这些测试的结果，将女性分成以下4组：妊娠期糖尿病(GDM)组、妊娠期葡萄糖耐量受损(GIGT)组、GCT异常但OGTT葡萄糖耐量正常(abGCTNGT)组、以及GCT正常且OGTT正常(NGT)组。在空腹后，在OGTT开始之前获得用于分析的血浆样品。
使用选择反应监测质谱法(SRM-MS)与气相色谱法(GC)或液相色谱法(LC)的组合对空腹血浆样品进行测试来分离分析物以将GDM患者与NGT患者的代谢组进行定量比较。所述代谢组表示生物细胞、组织、器官或生物体中的所有代谢物的集合，这些代谢物是代谢的副产物并且包括但不限于碳水化合物、氨基酸以及FFA。响应于刺激，如进食、运动以及在诸如GDM或T2D之类的病理生理病况中，这些分子的相对丰度非常快速地发生变化。对来自每一组的十二个血浆样品进行研究并且在每一个样品中对342种指定的生化物质进行定量。使用低q值(<0.1)来确定结果的置信度。
结果
在所研究的342种代谢物中，有52种在GDM群体与NGT群体之间发生显著变化(P<0.05)。基于生物学分类对代谢物进行的分组揭示与NGT患者相比，患有GDM的患者具有显著增加的游离脂肪酸(FFA)水平，这表示对替代性(非葡萄糖)能源的依赖增加(图1a)。与NGT样品相比，在GDM样品中，在筛选中发生最显著变化的代谢物，即3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)显著升高(5.69倍)。对第二群组的样品进行的独立的筛选重复这一结果(图1b)。使用对人CMPF具有特异性的ELISA试剂盒，在48个人血浆样品(24个NGT样品和24个GDM样品)中进一步证实了这一研究结果(图2)。重要的是，CMPF被证实在5名在GDM后在产后一年内产生IGT的女性中，与5名在这两个时间段期间均维持NGT的女性相比甚至更显著地升高，以及在T2D患者的混合性别群体中，与NGT匹配对照相比甚至更显著地升高(图2)。这强烈地表明CMPF涉及T2D以及GDM的发生。此外，CMPF的水平因此可用于在具有差不多正常的葡萄糖水平的受试者中预测葡萄糖稳态受损和2型糖尿病。
由于β细胞衰竭是GDM和T2D这两者的主要的潜在原因，因此在体外和体内这两方面对增加的CMPF对β细胞功能的影响进行研究。使用生理浓度的CMPF(20μM和200μM，如分别在我们的NGT-妊娠期样品和GDM-妊娠期样品中所观测到(图2))，以及使用媒介物对照(EtOH)，在永生化的鼠β细胞系(MIN6)以及原代分离的人胰岛和鼠胰岛中，对CMPF对葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)和响应于使用促分泌素KCl进行的直接去极化的胰岛素分泌的影响进行研究(图3A)。与20μM和媒介物对照相比，使用200μM的CMPF将单层MIN6细胞预处理4小时显著地损伤了GSIS，而使用200μM的CMPF进行的相同的处理在人胰岛和鼠胰岛这两者中在24小时之后均引起等同的损伤(图3B、图3C)。因此，高的生理学上相关水平的CMPF损伤GSIS。
随后，对在使用CMPF进行处理之后所观测到的GSIS受损的潜在机制进行研究。为了确定CMPF是否是通过诱导β细胞发生细胞凋亡来抑制GSIS，在被媒介物(EtOH)、20μM或200μM的CMPF处理4小时的MIN6细胞中进行膜联蛋白V和碘化丙锭染色以分别寻找细胞凋亡和坏死。在任一所述CMPF处理条件下均未观测到显著的染色，尽管用200μM的CMPF处理4小时引起了GSIS显著减少。使用被5mM的H2O2处理3小时的MIN6细胞作为阳性对照(图4)。CMPF并不是通过诱导β细胞发生细胞凋亡或坏死来损伤GSIS。
在不存在细胞凋亡和坏死的情况下，CMPF必然是通过引起β细胞功能障碍来损伤GSIS。首先，对CMPF处理对胰岛素生物合成的影响进行研究以确定是否有胰岛素可供用于在刺激后被释放。用媒介物对照、20μM以及200μM的CMPF将MIN6、鼠胰岛和人胰岛处理4小时(MIN6)或24小时(胰岛)，并且测量总胰岛素含量。在所有情况下，与媒介物对照相比，通过使用200μM的CMPF进行处理使总胰岛素含量显著降低(使用鼠胰岛作为代表，图5A)。在总DNA未发生变化的情况下观测到总胰岛素含量降低，这证实了CMPF并未诱导细胞凋亡。更低的总胰岛素含量可能是由于从胰岛素原向成熟胰岛素的胰岛素加工有缺陷或胰岛素转录不足。为了确定CMPF降低总胰岛素含量的机制，对从被媒介物对照或200μM的CMPF处理24小时的鼠胰岛分离的RNA进行定量PCR(qPCR)。观测到胰岛素mRNA(图5B)以及胰岛素转录因子PDX1、MAFA和HNF4a(图5C)显著减少，这表明CMPF损伤胰岛素转录。此外，观测到胰岛素加工酶CpE的mRNA水平显著更低，并且PCSK1和PCSK2的水平趋向于更低(图5D)。总之，这些结果表明CMPF通过抑制胰岛素转录和翻译后加工来引起β细胞功能障碍。
所观测到的β细胞特异性转录因子PDX1的显著减少提示对于对接受CMPF处理的胰岛中关键的葡萄糖感应基因表达的可能抑制作用进行研究。PDX-1已被报道对于β细胞葡萄糖转运蛋白GLUT2以及限速的葡萄糖加工酶葡萄糖激酶(GCK)的转录来说是必要的。再次使用qPCR来确定与接受媒介物处理的对照相比，用200μM的CMPF对鼠胰岛处理24小时显著地减少GLUT2的表达并且引起GCK的表达趋向于更低(图5E)。CMPF因此可以通过降低GLUT2表达、阻止β细胞摄取并且随后代谢葡萄糖以刺激胰岛素分泌来损伤GSIS。
关于CMPF起作用以损伤β细胞功能的发现，联同GDM患者、IGT患者以及T2D患者的血浆CMPF浓度显著升高一起，表明CMPF可能在GDM和T2D的发生中起致病作用。为了研究CMPF对葡萄糖稳态的影响，(图8C)。血浆胰岛素水平显著增加连同血糖水平无差异一起表明，与对照相比，CMPF在接受处理的小鼠中诱发胰岛素抵抗。在三天的腹膜内注射之后，在14小时禁食之后，接受了CMPF注射的小鼠具有显著更高的血糖水平和显著更低的血浆胰岛素水平(图6C、图6D)，而在七天的腹膜内注射之后，小鼠具有显著更高的血糖水平和血浆胰岛素水平这两者，再次表明胰岛素抵抗表型(图8D)。在三天的腹膜内注射之后，在OGTT期间，与媒介物对照组相比，CMPF注射组在灌胃后的10分钟、20分钟以及30分钟时具有显著受损的胰岛素分泌，并且在120分钟时具有显著更高的胰岛素分泌(图6D)。胰岛素分泌的这种损伤对应于在灌胃后30分钟、60分钟以及120分钟时显著更高的血糖。与接受媒介物注射的对照相比，在七天的腹膜内CMPF处理之后，小鼠在灌胃后20分钟、30分钟、60分钟以及120分钟时具有显著更高的血糖(图8D)，并且这对应于在灌胃后10分钟、30分钟以及60分钟时显著受损的胰岛素分泌(图8E)。因此，在体内血浆CMPF浓度升高引起β细胞功能受损并且阻止GSIS，从而导致葡萄糖不耐症。慢性升高的CMPF水平还可能诱发胰岛素抵抗。总之，这些结果表明CMPF在GDM和T2D的发病中可能起致病作用。
为了评估CMPF的体内施用直接对β细胞的影响，在OGTT后立即从接受了3天腹膜内注射和7天腹膜内注射的小鼠分离胰岛。在任何一种情况下，在接受CMPF注射的小鼠与接受媒介物对照注射的小鼠之间胰岛尺寸均不存在显著性差异，进一步证实了CMPF并不诱导β细胞发生细胞凋亡(图7A，使用接受3天注射的情况作为代表)。然而，来自接受CMPF处理的小鼠的胰岛确实具有显著减少的GSIS(图7B)和更低的总胰岛素含量(图7C，使用接受3天注射的情况作为代表)，从而确认了在OGTT期间所观测到的胰岛素分泌减少。有趣的是，与接受媒介物注射的对照相比，从接受了7天CMPF注射的小鼠分离的胰岛在低的葡萄糖刺激下具有显著升高的胰岛素分泌，从而证实了在14小时禁食后在体内所观测到的显著更高的基础血浆胰岛素水平(图8F)。总胰岛素含量降低对应于更低的胰岛素mRNA水平(图7D，使用接受3天注射的情况作为代表)，这与本文所述的体外研究相一致。
与NGT对照相比，在患有GDM、IGT的女性以及T2D患者的混合群体的血浆中CMPF的水平显著升高，表示这种化合物在糖尿病的发生中可能起重要作用。这得到了在永生化的β细胞系(MIN6)以及分离的原代人胰岛和鼠胰岛中的体外数据的支持，所述体外数据证实在孵育24小时之后，在糖尿病患者血浆中所观测到的浓度的CMPF损伤GSIS。对GSIS的这种损伤并不是因为β细胞发生细胞凋亡或坏死，而可能是由对胰岛素生物合成(转录和翻译后加工)的损伤以及葡萄糖感应、摄取以及代谢的能力降低所引起。在小鼠中进行的急速体内研究证实CMPF损伤胰岛素分泌并且引起葡萄糖不耐症。对这些胰岛进行的离体评价证实在胰岛尺寸方面不存在差异(表示不存在细胞凋亡)，但GSIS的能力显著降低。总而言之，这表明CMPF可能是与GDM和T2D相关的β细胞衰竭的潜在原因。
在患有GDM的女性和患有T2D的患者的血浆中CMPF水平显著升高的这一事实表示CMPF可用作一种早期的生物标志物以通过简单的血液测试来预测GDM或T2D而无需使用GCT或OGTT，所述GCT或OGTT是费时的并且使患者非常不愉快。这对于诊断GDM来说将是特别有用的，这是因为不能使用HbA1c测试。如果CMPF在病因上涉及于T2D的发生，那么预期其水平在高的HbA1c读数之前就会升高，从而允许在患者暴露于较长时间高血糖之前进行医学干预。
在糖尿病患者中所观测到的生理学上相关的水平(200μM)下，CMPF在相对短的一段时间(3天的腹膜内注射)内损伤GSIS并且引起葡萄糖不耐症，这表明CMPF对β细胞有直接影响。从腹膜内CMPF注射的第四天开始观测到胰岛素抵抗的胰腺外影响，这表明CMPF起作用以直接损伤β细胞功能以及增加外周组织中的胰岛素抵抗。因此，抑制患有GDM或T2D的糖尿病前期患者和糖尿病患者中的CMPF活性可以改善β细胞功能并且改善外周胰岛素敏感性，并且从而是一种对GDM和/或T2D可行的治疗。
实施例2：抑制CMPF以治疗β-细胞功能障碍
如实施例1和图10中所示，在妊娠期糖尿病患者和2型糖尿病患者的血浆中所观测到的浓度下，CMPF损伤β细胞功能和全身的葡萄糖稳态。CMPF最初被鉴定为一种潜在的尿毒症毒素，大部分有关CMPF所进行的研究集中在鉴定它与肾脏的相互作用。最新的研究已鉴定出两种有机阴离子转运蛋白，即OAT1(SLC22A6)和OAT3(SLC22A8)，它们负责将CMPF从血浆转运到基侧外侧膜的近端小管细胞中；以及第三种有机阴离子转运蛋白OAT4(SLC22A11)，它负责CMPF在尿中的排泄(Deguchi等,2005)(图11)。OAT充当有机阴离子交换因子，将一个阴离子分子转运到细胞中并且同时将一个内源性二羧酸从细胞中转运出来(Sekine等,2006)。内源性二羧酸在细胞内的存在因此对于OAT功能来说是关键的，因而它们连同二羧酸钠协同转运蛋白NaDC3(SLC13A3)一起表达，该NaDC3的功能在于将二羧酸转运回细胞中(图11)。
CMPF对GSIS的影响
使用OAT特异性抑制剂丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)以及苄青霉素(PCG)进行的研究已经证实通过阻断OAT1和OAT3这两者，CMPF的分泌在体内可以被完全抑制(Deguchi等,2005)。丙磺舒是OAT的竞争性抑制剂并且通过优先地结合所述转运蛋白，阻止CMPF和其它OAT配体与转运蛋白结合来起作用。在痛风的治疗中，丙磺舒通过阻止尿酸与OAT4(OAT1和OAT3的同源物，位于近端小管细胞的管腔侧上)结合来阻止尿酸从尿中被重新摄取到近端小管中，从而限制回到血液供应的尿酸的量并且因此消除痛风(Mason,1954)。当联同抗生素一起给予时，丙磺舒通过阻止所述抗生素经由OAT1被摄取到肾脏中来延长抗生素在血流中的循环(Butler,2005)。丙磺舒的施用会引起CMPF的清除率降低，从而导致CMPF在血浆中积聚(Costigan等,1996)(图12A)。在接受丙磺舒处理的小鼠的血浆中尿酸水平显著更低，这表示尿酸经由OAT转运蛋白的重新摄取受损，进一步支持了对OAT转运蛋白活性的阻断(图12B)。在使用选择性抑制OAT3的浓度的PCG的情况下，已经证实65％-75％的CMPF分泌被阻止，这表示所述OAT3是肾脏中主要的CMPF转运蛋白(Deguchi等,2005)。
肾脏中的OAT转运蛋白
OAT转运蛋白的表达在T2D的啮齿动物模型的肾脏中显著降低(Mishra等,2004)。在T2D的db/db小鼠模型中，通过微阵列所测定，OAT3转运蛋白和OAT1转运蛋白这两者具有显著降低的表达(Mishra等,2004；More等,2012)。这一研究结果表明在GDM患者和T2D患者的血浆中CMPF的水平可能由于它的转运蛋白在肾脏中的表达下调、从而限制它被分泌到尿中的能力而升高。这种假设符合在肾衰竭和尿毒症期间所观测到的血浆CMPF水平升高。在这些生理病况下，OAT1、OAT3、OAT4以及NaDC3均已被报道在肾脏中具有显著减少的表达(Deguchi等,2005)。
阻断OAT转运蛋白功能引起了小鼠中血浆CMPF浓度增加
本发明的说明内容提供了意想不到的在OAT1、OAT3、NaDC3或OAT4与糖尿病之间的联系。葡萄糖耐量正常(NGT)的小鼠胰岛和人胰岛的微阵列数据证实相对于已知在胰岛中表达的其它蛋白质，OAT1、OAT3以及NaDC3强表达(使用小鼠胰岛作为代表，图13A)。不存在OAT4的小鼠等效物。这一表达谱进一步得到了对纯化的人β细胞、小鼠胰岛以及源自于小鼠和大鼠的β细胞系进行的转录组分析的支持，所述分析均证实了OAT1、OAT3以及NaDC3的相对强的表达(Kutlu等,2009)。有关这些转运蛋白在胰岛中表达的这一研究结果在人胰岛中使用免疫荧光染色和蛋白质印迹进一步证实，如图13B、图13C中所示。有趣的是，主要的CMPF转运蛋白OAT3和协同转运蛋白NaDC3在表达胰岛素的(β)细胞中显示出最强的染色，而OAT1和OAT4在非胰岛素阳性细胞(推测为α细胞、δ细胞以及ε细胞)中显示出更强的染色(图13B)。通过蛋白质印迹，在人胰岛和人近端小管细胞系HK-2中发现对应于OAT1、OAT3、OAT4以及NaDC3的强条带。对T2D胰岛的转录组进行探究的研究证实与健康对照相比，OAT1和OAT3在T2D胰岛中的表达显著增加(Dominguez等,2011)。因此有可能的是，在T2D中，胰腺β细胞中增强的OAT1和OAT3表达使CMPF向β细胞中的转运增加，从而导致CMPF介导的β细胞功能障碍。
OAT转运蛋白在胰岛细胞中表达。
为了确定OAT转运蛋白是否负责将CMPF转运到β细胞中，在添加CMPF之前将CD1小鼠胰岛用1mM丙磺舒预处理以确保通道被阻断并且CMPF从细胞中完全排除。1mM丙磺舒的剂量是基于以下先前的证据来选择的：这一浓度足以抑制从β细胞的阴离子转运而对葡萄糖刺激的胰岛素分泌没有任何所观测到的影响(Arkhammar等,1989)。将胰岛用1mM丙磺舒预处理3小时，之后添加200μM的CMPF。在24小时之后，通过GSIS对细胞进行评估。与媒介物对照相比，单独使用200μM的CMPF进行处理使得GSIS在高葡萄糖刺激和KCl刺激这两种条件下均显著减少，这与先前的研究结果一致，而使用1mM丙磺舒处理27小时对GSIS没有影响。使用1mM丙磺舒联同200μM的CMPF一起(CMPF+P)对胰岛进行处理完全消除了CMPF对胰岛的影响(图14A)。接受CMPF+P处理的胰岛表现出与接受媒介物处理的对照相当的高葡萄糖刺激和KCl刺激的胰岛素分泌。因此，丙磺舒抑制CMPF的作用。使用OAT3特异性抑制剂PCG获得相似的结果。再次将胰岛用300μM的PCG预处理3小时，之后使用200μM的CMPF处理24小时(图14B)。单独的CMPF能够显著地抑制在高葡萄糖刺激下的胰岛素分泌，而300μM的PCG没有显著的影响。使用300μM的PCG和200μM的CMPF进行的处理抑制了CMPF的作用，从而产生对照水平的胰岛素分泌。
抑制OAT阻断CMPF对β细胞功能的抑制作用
虽然丙磺舒的施用升高循环CMPF水平，但这并未改变葡萄糖耐量，表明CMPF在体内经由OAT改变β细胞功能。每天两次对小鼠腹膜内注射150mg/kg的丙磺舒，持续3天，如先前所述(Baudoux等,2012)。在体重或空腹血糖方面没有观测到差异(图15A、图15B)。在第4天，进行2g/kg的OGTT并且葡萄糖耐量方面未显示出显著性差异(图15C)。由于单独使用CMPF处理3天能够诱发葡萄糖不耐症，因此看来丙磺舒阻断了CMPF对β细胞的活性。
实施例3：表征CMPF对β细胞功能的影响。
妊娠期糖尿病(GDM)是一种对母亲和儿童存在严重的健康影响的病况，由β细胞不能适应增加的代谢需求所引起。GDM以及非常高的向2型糖尿病(T2D)的进展率的原因仍是未知的。如实施例1中所示，在患有GDM、T2D以及糖尿病前期的人的血浆中，呋喃脂肪酸代谢物CMPF显著升高。在小鼠中，糖尿病患者水平的CMPF诱发葡萄糖不耐症、葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损以及葡萄糖的利用降低。在此，本申请的发明人证实CMPF经由新颖转运机制进入β-细胞中以被代谢，从而导致线粒体功能受损、氧化应激、关键的β-细胞转录因子PDX1和FOXO1失调、以及最终的胰岛素生物合成减少。重要的是，CMPF诱导的β细胞功能障碍可以通过特异性阻断它的转运或经由抗氧化剂治疗来阻止。
      材料与方法
高胰岛素-正常血糖钳夹
在用CMPF或媒介物腹膜内注射7天之后，如先前所述(Liu等,2012)进行高胰岛素-正常血糖钳夹。在注射方案的第3天进行内部和外部套管插入术。
基因表达
使用Qiagen RNeasy Plus小型试剂盒(德国的希尔登(Hilden,Germany))从被媒介物或CMPF处理24小时的胰岛中提取总RNA。如先前所述(Basford等,2012)，在大学健康网络微阵列中心(University Health Networkmicroarray center)(加拿大的多伦多(Toronto,Canada))使用Affymetrix小鼠4302.0基因芯片进行微阵列分析。显著性变化被限定为P<0.05。微阵列数据在公开时将可在NCBI GEO数据库上获得。人胰岛微阵列数据可以见于GEO40709处。如先前所述(Basford等,2012)进行从总RNA进行的逆转录和定量实时PCR(qPCR)分析。使用Primer3软件(NCBI)设计引物。针对β肌动蛋白的mRNA将数据归一化。
分离的胰岛中的ROS积聚和胰岛尺寸
如先前所述(Lee等,2009)，分别使用mitoSOX红(mitoSOX red)和2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(CM-H2-DCFDA)(Molecular Probes，加拿大的英杰公司(Invitrogen,Canada))测定分离的被媒介物对照或200μM的CMPF处理4小时或24小时的胰岛中的超氧化物和H2O2的水平。使用明视场图像来测定胰岛尺寸。
线粒体膜电位(MMP)
将分散的分离的胰岛用媒介物对照或200μM的CMPF处理24小时，之后加入于2.8mM葡萄糖成像缓冲液中的罗丹明(rhodamine)123(25μg/ml，10分钟)。添加5mM NaN3以使MMP完全去极化(Diao等,2008)。
蛋白质印迹
将接受了CMPF处理的小鼠胰岛和对照小鼠胰岛在含有蛋白酶抑制剂混合液(加拿大安大略省密西沙加的罗氏公司(Roche,Mississauga,ON,Canada))的RIPA缓冲液(美国马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号转导公司(CellSignaling,Danvers,MA,USA))中裂解。使裂解产物以12,000rpm离心并且将上清液上样到4-15％的SDS-PAGE梯度凝胶(加拿大安大略省密西沙加的伯乐公司(BioRad,Mississauga,ON,Canada))上并且使用Turbo印迹装置(伯乐公司)转移到PVDF膜上。将膜用相应的抗体进行探测，并且使用Kodak成像器4000pro(美国纽约州罗彻斯特的锐珂公司(Carestream,Rochester,NY,USA))成像。
免疫荧光染色
使用免疫荧光确定了FOXO1和PDX1在分散的CD1小鼠胰岛细胞中的细胞定位。使用免疫荧光还确定了有机阴离子转运蛋白(OAT)在分散的人胰岛细胞中的存在。如先前所述(Diao等,2008)进行染色。使用共聚焦显微镜(Quorum Wave FX转盘式；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham ML,USA))和Volocity软件(珀金埃尔默公司)获取图像。
      结果
CMPF降低全身的葡萄糖利用
如实施例1中所示，升高的血浆CMPF导致葡萄糖不耐症和胰岛素分泌受损。有趣的是，尽管GSIS有缺陷，但七天的CMPF处理与进食状态下的高胰岛素血症和高胰高血糖素血症有关。尽管胰岛素水平升高，但通过胰岛素耐量测试(ipITT)在接受CMPF处理的小鼠与接受媒介物处理的小鼠之间未观测到胰岛素敏感性存在显著性差异。为了更充分地研究整体的葡萄糖稳态，进行高胰岛素-正常血糖钳夹。如图16中所示，虽然葡萄糖输注率显著降低(图16b)，但总体糖酵解率表明对胰岛素的响应不存在差异(钳夹后/基础)(图16e)。因此，葡萄糖输注的差异是由于在基础时葡萄糖的出现率显著更低(图16c)，以及在钳夹后胰岛素的出现率显著降低(图16d)。7天的CMPF处理并未诱发胰岛素抵抗，但降低了全身的葡萄糖利用。
CMPF被代谢以增加ROS
总胰岛素含量更低可能是由于由过度刺激和/或有缺陷的胰岛素产生所引起的β-细胞耗竭。为了确定CMPF减少胰岛素含量的机制，我们测量了在处理24小时后基质中的胰岛素。总胰岛素的积聚不存在差异(数据未示)，然而，与对照相比，接受CMPF处理的胰岛的基质中存在显著更多的胰岛素原，这与在T2D患者中所观测到的胰岛素原:胰岛素比率发生改变(Kamoda等,2006)相一致(图17a)。胰岛素加工受损先前已与线粒体蛋白解偶联蛋白2(UCP2)的水平升高有关(Kashemsant和Chan,2006)。电子传递链的底物过量引起ROS形成，所述ROS能够诱导UCP2表达。首先为了确定CMPF是否由β-细胞代谢，我们对接受CMPF急速处理的小鼠胰岛中线粒体膜电位(MMP)的变化进行测量。CMPF引起瞬时的膜超极化，这与经由β-氧化所产生的质子动力增加相一致(图17b)。这对应于在处理4小时和24小时之后，接受CMPF处理的胰岛中的ROS增加到对照的2倍(图17c)。在CMPF处理24小时之后包括Ucp2和过氧化氢酶(Cat)在内的抗氧化基因表达增加，表明细胞针对氧化应激在进行抵偿(图17d、图17e)(Robson-Doucette等,2011)。通过用抗氧化剂N-乙酰基-半胱氨酸(NAC)进行共同处理抑制了由CMPF处理所引起的ROS产生增加(图17f)。重要的是，在接受CMPF处理的胰岛中，用NAC进行的共同处理使胰岛素分泌和胰岛素含量恢复到接近对照水平(图17g、图17h)。因此，由CMPF代谢所引起的氧化应激使GSIS和胰岛素加工受损，并且可经由减少ROS产生而逆转。
CMPF损伤胰岛素生物合成
升高的ROS已被证实经由AKT和GSK3β活性的改变(Kawamori等,2006；Boucher等,2006；Kawamori等,2003)来调节胰岛素转录(Poitout和Robertson,2008；Robertson,2004)。为了确定CMPF减少胰岛素生物合成的机制，我们对它对这些关键的调节因子的影响进行研究。在正常条件下，AKT和GSK3β具有互逆的活性。活性的pAKT使GSK3β磷酸化并且失活，从而防止下游靶标磷酸化(Humphrey等,2010)。然而，在氧化应激的条件下，AKT不具活性(Kawamori等,2006)。与对照相比，在CMPF处理24小时之后，AKT和GSK3β这两者的磷酸化显著受损(图17i、图17j)，这表示AKT活性降低并且GSK3β活性增加。为了确定这些变化对胰岛素转录是否有影响，使用免疫荧光染色对两种关键的胰岛素转录因子，即PDX1和FOXO1的定位进行研究。FOXO1通常由于被AKT磷酸化而被隔离在胞质中(Kitamura等,2005)。在接受CMPF处理的胰岛中，FOXO1易位到核中(图17k、图17m)，这反映了AKT活性降低(Kawamori等,2007)。相反，直接被GSK3β磷酸化的PDX1(Boucher等,2008)被隔离在核的外部，这与GSK3β活性增加相一致(图17l、图17n)。这些转录因子的绝对水平并没有显著的差异，这表示定位发生改变并不是由于蛋白质丰度发生变化(图17o)。通过使用抗氧化剂NAC进行处理阻止了FOXO1和PDX1这两者的易位，这表示氧化应激促使有缺陷的胰岛素生物合成(图17k-n)。这些转录因子的活性发生改变进一步由包括Ins1、转录因子Pdx1和Mafa、胰岛素原加工酶CpE、Pc1和Pc2、以及葡萄糖转运蛋白Glut2在内的关键的靶基因的mRNA水平降低所确认(Boucher等,2006；Kaneto等,2008)(图18a)。
CMPF改变葡萄糖代谢
鉴于CMPF在体内在进食状态期间引起高胰岛素血症，并且在体外在非刺激条件下增大胰岛的胰岛素分泌，我们合理地认为，葡萄糖感应和/或胰岛素分泌中必然存在不能仅仅由对胰岛素产生的影响来解释的缺陷。与FFA代谢相关的ROS升高已被证实在非刺激性葡萄糖浓度下刺激胰岛素分泌(Robson-Doucette等,2011；Saddeh等,2012；Joseph等,2004)。当与接受媒介物处理的对照相比时，被200μM的CMPF处理24小时的分散的小鼠胰岛在亚刺激性葡萄糖浓度下显示出显著更大的MMP超极化，并且在高葡萄糖条件下显示出显著降低的MMP超极化，这与ROS升高相一致(图17b)。这些数据表明CMPF代谢引起过度的质子动力，从而导致在低葡萄糖条件下胰岛素分泌增加，并且还损伤葡萄糖代谢并且因而损伤GSIS。为了确认线粒体功能的变化，通过微阵列对被CMPF处理24小时的胰岛进行分析。总体而言，在CMPF处理后，6.2％的转录物进行有显著差异的表达。当基于生物过程进行整理时，最大差异表达的群集包括涉及代谢的基因(38％)(图17c)。具体而言，观测到与脂肪氧化相关的基因显著上调，这表明从葡萄糖氧化驱动的代谢‘转变’成脂肪氧化(Elks等,1993)。这种转变能够降低β-细胞感应和代谢葡萄糖的能力，限制它们对于GSIS的能力，从而可以解释CMPF对β-细胞的影响(Hue等,2009)。
CMPF经由OAT3进入β-细胞
包括CMPF在内的二元尿呋喃酸通常被分泌到尿中(Deguchi等,2005)，并且已知CMPF在尿毒症患者的血浆中由于负责它们的清除的有机阴离子转运蛋白(OAT)丧失而升高(Sassa等,2000)。OAT3(Slc22a8)和OAT1(Slc22a6)将CMPF转运到肾近端小管细胞中并且需要协同转运蛋白NaDC3来起作用(Deguchi等,2004)。在人中，OAT4(Slc22a11)是将CMPF从近端小管移到肾管腔中的外排转运蛋白(Deguchi等,2005)。我们因此研究CMPF是否也经由这些转运蛋白进入β-细胞。对人胰岛进行的微阵列分析证实所有四种转录物都在与β-细胞KATP通道Kcnj11相当的水平上表达(图19a)。这进一步通过RT-PCR(用对应于这些转运蛋白中的每一种的条带)以及通过免疫印迹所证实(图19b、图19c)。为了确定蛋白质定位，我们在分散的人胰岛细胞中进行免疫荧光染色(图19d)。在胰岛素阳性的β-细胞中，OAT3和NaDC3显示出强染色。OAT1和OAT4主要在胰岛素阴性细胞中表达。与胰高血糖素的共染色揭示OAT4也不在胰高血糖素阳性细胞中表达。因此，OAT转运蛋白在胰岛中表达，OAT3和NaDC3在胰岛素阳性细胞中强表达。
为了确定OAT是否负责将CMPF转运到β-细胞中，我们利用了OAT功能的抑制剂。丙磺舒是一种非特异性OAT阻断剂(Miyamoto等,2012)。用1mM丙磺舒将胰岛处理24小时使接受CMPF处理的胰岛的胰岛素分泌恢复到对照水平(图19e)。为了确定哪种OAT主要负责将CMPF转运到β-细胞中，我们使用300μM的苄青霉素(PCG)(一种OAT3特异性抑制剂)或50μM的对氨基马尿酸盐(PAH)(一种OAT1特异性抑制剂)(Deguchi等,2005)对胰岛进行处理。与OAT3是主要的CMPF转运蛋白的先前报道(Deguchi等,2005)相一致，PCG能够使接受CMPF处理的胰岛的胰岛素分泌和胰岛素含量恢复到对照水平(图19f、图19h)。然而，用PAH进行的处理对分泌没有影响(图19g)。因此，CMPF经由OAT3被转运到β-细胞中，并且阻断这种转运蛋白阻止CMPF损伤GSIS和胰岛素生物合成。
      讨论
GDM和T2D这两者的潜在原因在于β-细胞不能响应变化的代谢需求；即，胰岛素抵抗增加(Buchanan,2001；Kahn 2003；Prenki和Nolan,2006)。在此，我们证实了在患有GDM、T2D以及葡萄糖耐量受损的患者中所观测到的浓度下、在从GDM转变成T2D期间，呋喃脂肪酸代谢物CMPF损伤胰腺β-细胞功能，这与在这期间β-细胞功能进行性下降(Retnakaran等,2010)相一致。使用CMPF进行的处理再现了糖尿病的许多关键的特征，包括基础高胰岛素血症(Wijendran等,1999)以及GSIS受损和全身葡萄糖利用降低(Kuhl,1991；Bowes,1996)。在体外，我们证实了CMPF代谢经由损伤线粒体功能和葡萄糖代谢以及诱导氧化应激而引起β-细胞功能障碍。ROS水平升高改变了关键激酶AKT和GSK3β的活性，从而改变转录活性，并且最终减少胰岛素转录和翻译后加工。因此，升高的血浆CMPF可能在与GDM、T2D以及从GDM向T2D进展相关的β-细胞功能障碍中起重要的致病作用。
CMPF的影响可以通过两种独特的方法来解除：阻断CMPF进入到β-细胞中以及减少ROS积聚。在此，我们首次证实CMPF经由OAT3转运蛋白进入β-细胞，所述OAT3转运蛋白先前仅是在肾近端小管细胞的基侧外侧膜上被功能性地表征(Deguchi等,2005)，并且据报道，在肝脏和脑中具有低水平的表达(Sweet等,2002；Deguchi等,2006)。我们证实了CMPF转运可以使用通常的处方药丙磺舒和苄青霉素来阻断，丙磺舒和苄青霉素分别非特异性地抑制和特异性地抑制OAT3转运蛋白。有趣的是，我们证实了虽然人β-细胞表达内流转运蛋白OAT3，但不存在外排转运蛋白OAT4。因此，在糖尿病期间，当血浆CMPF可能由于肾脏中OAT活性发生改变而升高时，推测其可以进入β-细胞，但不离开，从而促进它的代谢和相关的影响。因此，经由阻断OAT转运蛋白来阻止CMPF流入，或增加CMPF从β-细胞的外排是未来对预防β-细胞衰竭进行研究的有吸引力的途径。
一旦处于β-细胞内部，CMPF就被代谢，从而引起葡萄糖利用受损和ROS产生增加。低水平的ROS产生会增强GSIS，从而有助于β-细胞响应于包括FFA在内的营养物质的急速增加(Robson-Doucette等,2011；Saadeh等,2012；Poitout和Robertson,2008)。然而，长期来看，由于抗氧化酶的表达相对于其它组织类型相对较低，因此β-细胞特别易受氧化应激影响(Robson-Doucette等,2011；Robertson,2004)。用抗氧化剂进行治疗已被提出作为一种用于治疗T2D的有前景的方法，并且已被证实在啮齿动物模型中减轻胰岛纤维化和细胞凋亡并且改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性(Lee等,2011)。我们使用抗氧化剂NAC进行预处理阻止了CMPF诱导β-细胞衰竭的研究结果表明抗氧化剂治疗还可以用于预防和/或治疗GDM。
虽然已经参考目前所认为的优选的实施例对本发明进行描述，但应当了解的是，本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明意图涵盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种改动方案和等同布置。
所有公开、专利以及专利申请以引用的方式整体并入本文，该引用的程度就如同每一件单独的公开、专利或专利申请均被明确地并且单独地表明以引用的方式整体并入本文一样。
参考文献
Arkhammar P.等,Glucose-stimulated efflux of FURA-2in pancreaticbeta-cells is prevented by probenecid(通过丙磺舒阻止在胰腺β-细胞中葡萄糖刺激的FURA-2外排),Biochemical and Biophysical ResearchCommunications.1989.159(1):第223-228页。
Basford,C.L.等,The functional and molecular characterisation of humanembryonic stem cell-derived insulin-positive cells compared with adultpancreatic beta cells(人胚胎干细胞衍生的胰岛素阳性细胞与成人胰腺β细胞相比的功能和分子表征),Diabetologia,2012.55(2):第358-71页。
Baudoux T.E.R.等,Probenecid prevents acute tubular necrosis in a mousemodel of aristolochic acid nephropathy(丙磺舒阻止小鼠马兜铃酸肾病模型的急性肾小管坏死),Kidney International.2012.82(10)。
Boucher,M.J.等,Phosphorylation marks IPF1/PDX1protein fordegradation by glycogen synthase kinase 3-dependent mechanisms(磷酸化标记IPF1/PDX1蛋白通过糖原合酶激酶3依赖性机制的降解),J Biol Chem,2006.281(10):第6395-403页。
Bowes,S.B.等,Measurement of glucose metabolism and insulin secretionduring normal pregnancy and pregnancy complicated by gestationaldiabetes(在正常妊娠期和并发妊娠期糖尿病的妊娠期期间葡萄糖代谢和胰岛素分泌的测量),Diabetologia,1996.39(8):第976-83页。
Buchanan,T.A.,Pancreatic B-cell defects in gestational diabetes:implications for the pathogenesis and prevention of type 2diabetes(妊娠期糖尿病中的胰腺B-细胞缺陷：2型糖尿病的发病和预防的启示),J ClinEndocrinol Metab,2001.86(3):第989-93页。
Butler,D.,Wartime tactic doubles power of scarce bird‐flu drug(战争策略使稀缺的禽流感药物的效力加倍),Nature,2005.438(7064):第6页。
Costigan,M.G.和W.E.Lindup,Plasma clearance in the rat of a furandicarboxylic acid which accumulates in uremia(在尿毒症中积聚的呋喃二羧酸在大鼠中的血浆清除),Kidney Int,1996.49(3):第634-8页。
Deguchi,T.等,Characterization of uremic toxin transport by organicanion transporters in the kidney(在肾脏中通过有机阴离子转运蛋白进行的尿毒症毒素转运的表征),Kidney Int,2004.65(1):第162-74页。
Deguchi T.等,Renal clearance of endogenous hippurate correlates withexpression levels of renal organic anion transporters in uremic rats(在尿毒症大鼠中内源性马尿酸盐的肾脏清除与肾脏有机阴离子转运蛋白的表达水平具有相关性),J Pharmacol Exp Ther,2005.314(2):第932-8页。
Deguchi,T.等,Differential contributions of rOat1(Slc22a6)and rOat3(Slc22a8)to the in vivo renal uptake of uremic toxins in rats(rOat1(Slc22a6)和rOat3(Slc22a8)对大鼠体内肾脏对尿毒症毒素的摄取的不同影响),PharmRes,2005.22(4):第619-27页。
Deguchi,T.等,Involvement of organic anion transporters in the efflux ofuremic toxins across the blood-brain barrier(有机阴离子转运蛋白涉及尿毒症毒素穿过血脑屏障的外排),J Neurochem,2006.96(4):第1051-9页。
Diao,J.等,UCP2is highly expressed in pancreatic alpha-cells andinfluences secretion and survival(UCP2在胰腺α-细胞中高表达并且影响分泌和存活),Proc Natl Acad Sci U S A,2008.105(33):第12057-62页。
Dominguez V.等,Class II phosphoinositide 3-kinase regulates exocytosisof insulin granules in pancreatic beta cells(II类磷酸肌醇3-激酶调节胰腺β细胞中胰岛素颗粒的胞吐),J Biol Chem,2011.286(6):第4216-25页。
Elks,M.L.,Chronic perifusion of rat islets with palmitate suppressesglucose-stimulated insulin release(使用棕榈酸盐对大鼠胰岛进行长期表面灌流抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放),Endocrinology,1993.133(1):第208-14页。
Everts等,Effects of a furan fatty acid and indoxyl sulfate on thyroidhormone uptake in cultured anterior pituitary cells(呋喃脂肪酸和硫酸吲哚酚对培养的垂体前叶细胞中甲状腺激素的摄取的影响),The AmericanPhysiological Society(1995)。
Hue,L.和H.Taegtmeyer,The Randle cycle revisited:a new head for anold hat(重新审视葡萄糖-脂肪酸循环：旧语新思),Am J Physiol EndocrinolMetab,2009.297(3):第E578-91页。
Humphrey,R.K.等,Glucose regulates steady-state levels of PDX1via thereciprocal actions of GSK3and AKT kinases(葡萄糖经由GSK3和AKT激酶的互逆作用调节PDX1的稳态水平),J Biol Chem,2010.285(5):第3406-16页。
Joseph,J.W.等,Free fatty acid-induced beta-cell defects are dependent onuncoupling protein 2expression(游离脂肪酸诱导的β-细胞缺陷依赖于解偶联蛋白2表达),J Biol Chem,2004.279(49):第51049-56页。
Kahn,S.E.,The relative contributions of insulin resistance and beta-celldysfunction to the pathophysiology of Type 2diabetes(胰岛素抵抗和β-细胞功能障碍对2型糖尿病的病理生理学的相对影响),Diabetologia,2003.46(1):第3-19页。
Kamoda,T.等,The serum levels of proinsulin and their relationship withIGFBP-1in obese children(肥胖儿童的胰岛素原的血清水平以及它们与IGFBP-1的关系),Diabetes Obes Metab,2006.8(2):第192-6页。
Kaneto,H.等,PDX-1and MafA play a crucial role in pancreatic beta-celldifferentiation and maintenance of mature beta-cell function(PDX-1和MafA在胰腺β-细胞分化和成熟β-细胞功能的维持中起关键性的作用),Endocr J,2008.55(2):第235-52页。
Kashemsant,N.和C.B.Chan,Impact of uncoupling protein-2overexpression on proinsulin processing(解偶联蛋白-2过表达对胰岛素原加工的影响),J Mol Endocrinol,2006.37(3):第517-26页。
Kawamori,D.等,Oxidative stress induces nucleo-cytoplasmictranslocation of pancreatic transcription factor PDX-1through activation ofc-Jun NH(2)-terminal kinase(氧化应激经由激活c-Jun NH(2)-末端激酶诱导胰腺转录因子PDX-1的核-胞质易位),Diabetes,2003.52(12):第2896-904页。
Kawamori,D.等,The forkhead transcription factor Foxo1bridges theJNK pathway and the transcription factor PDX-1through its intracellulartranslocation(叉头转录因子Foxo1经由它的细胞内易位跨接JNK通路和转录因子PDX-1),J Biol Chem,2006.281(2):第1091-8页。
Kitamura,Y.I.等,FoxO1protects against pancreatic beta cell failurethrough NeuroD and MafA induction(FoxO1经由NeuroD和MafA诱导防止胰腺β细胞衰竭),Cell Metab,2005.2(3):第153-63页。
Kuhl,C.,Insulin secretion and insulin resistance in pregnancy and GDM.Implications for diagnosis and management(妊娠期的胰岛素分泌和胰岛素抵抗与GDM：诊断和管理的启示),Diabetes,1991.40增刊2:第18-24页。
Kutlu B.等,Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell(胰腺β细胞的详细的转录组图谱),BMC Med Genomics,2009.2:第3页。
Lee,S.C.,C.A.Robson-Doucette以及M.B.Wheeler,Uncoupling protein2regulates reactive oxygen species formation in islets and influencessusceptibility to diabetogenic action of streptozotocin(解偶联蛋白2调节胰岛中活性氧簇的形成并且影响对链脲佐菌素的致糖尿病作用的敏感性),JEndocrinol,2009.203(1):第33-43页。
Lee,E.等,Antioxidant treatment may protect pancreatic beta cells throughthe attenuation of islet fibrosis in an animal model of type 2diabetes(在2型糖尿病动物模型中抗氧化剂处理可以经由减轻胰岛纤维化来保护胰腺β细胞),Biochem Biophys Res Commun,2011.414(2):第397-402页。
Lim CF,Stockigt JR,Curtis AJ,Wynne KN,Barlow JW以及Topliss DJ.A naturally occurring furan fatty acid enhances drug inhibition of thyroxinebinding in serum(天然存在的呋喃脂肪酸增强药物对血清中甲状腺素结合的抑制作用),Metabolism(1993).42(11)；1468-74。
Liu,Y.等,Adiponectin Corrects High-Fat Diet-Induced Disturbances inMuscle Metabolomic Profile and Whole-Body Glucose Homeostasis(脂联素纠正高脂肪饮食诱发的肌肉代谢组谱和全身葡萄糖稳态的紊乱),Diabetes,2012。
Mabuchi H和Nakahashi H.A major endogenous ligand substanceinvolved in renal failure(涉及肾衰竭的主要内源性配体物质),Nephron(1988).49(4)；277-80。
Mason,R.M.,Studies on the effect of probenecid(benemid)in gout(有关丙磺舒(羟苯磺丙胺)在痛风中的作用的研究),Ann Rheum Dis,1954.13(2):第120‐30页。
Mishra R.等,Adipose differentiation-related protein and regulators of lipidhomeostasis identified by gene expression profiling in the murine db/dbdiabetic kidney(在鼠db/db糖尿病性肾脏中通过基因表达谱分析所鉴定的脂肪分化相关蛋白和脂质稳态调节因子),Am J Physiol Renal Physiol,2004.286(5):第F913‐21页。
Miyamoto,Y.等,A uremic toxin,3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropionate induces cell damage toproximal tubular cells via the generation of a radical intermediate(尿毒症毒素3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸经由产生自由基中间体诱导对近端小管细胞的细胞损伤),Biochem Pharmacol,2012.84(9):第1207-14页。
More V.R.等,Severe diabetes and leptin resistance cause differentialhepatic and renal transporter expression in mice(在小鼠中严重的糖尿病和瘦素抵抗引起不同的肝脏和肾脏转运蛋白表达),Comp Hepatol,2012.11(1):第1页。
Poitout,V.和R.P.Robertson,Glucolipotoxicity:fuel excess and beta-celldysfunction(糖脂毒性：营养物过量和β-细胞功能障碍),Endocr Rev,2008.29(3):第351-66页。
Niwa T,Aiuchi T,Nakaya K,Emoto Y,Miyazaki T以及Maeda K.Inhibition of mitochondrial respiration by furancarboxylic acid accululated inuremic serum in its albumin-bound and non-diabyzable form(在尿毒症血清中以白蛋白结合形式和非可透析形式积聚的呋喃羧酸对线粒体呼吸的抑制作用),Clin Nephrol(1993).39(2)；92-96。
Prentki,M.和C.J.Nolan,Islet beta cell failure in type 2diabetes(2型糖尿病中的胰岛β细胞衰竭),J Clin Invest,2006.116(7):第1802-12页。
Retnakaran,R.等,Beta-cell function declines within the first yearpostpartum in women with recent glucose intolerance in pregnancy(在妊娠期中患有近期葡萄糖不耐症的女性在产后第一年内β-细胞功能下降),Diabetes Care,2010.33(8):第1798-804页。
Robertson,R.P.,Chronic oxidative stress as a central mechanism forglucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes(长期氧化应激作为糖尿病中胰岛β细胞中葡萄糖毒性的中央机制),J Biol Chem,2004.279(41):第42351-4页。
Robson-Doucette,C.A.等,Beta-cell uncoupling protein 2regulatesreactive oxygen species production,which influences both insulin and glucagonsecretion(β-细胞解偶联蛋白2调节影响胰岛素和胰高血糖素这两者分泌的活性氧簇产生),Diabetes,2011.60(11):第2710-9页。
Saadeh,M.等,Reactive oxygen species stimulate insulin secretion in ratpancreatic islets:studies using mono-oleoyl-glycerol(活性氧簇刺激大鼠胰岛的胰岛素分泌：使用单油酰基甘油进行研究),PLoS One,2012.7(1):第e30200页。
Sassa T,Matsuno H,Niwa M,Kazawa O,Takeda N,Niwa T,Kumada T以及Uematsu T.Measurement of furancarboxylic acid,a candidate for uremictoxin,in human serum,hair,and sweat,and analysis of pharmacological actionsin vitro(对人血清、毛发以及汗液中的呋喃羧酸——一种尿毒症毒素候选者的测量以及体外药理作用的分析),Arch Toxicol(2000)。
Sato M,Koyama M,Miyazaki T以及Niwa T.Reduced renal clearance offurancarboxylic acid,a major albumin-bound organic acid,in undialyzeduremic patients(在未透析的尿毒症患者中一种主要的白蛋白结合型有机酸呋喃羧酸的肾脏清除率降低),Nephron(1996).74(2)；419-21。
Sekine,T.,H.Miyazaki以及H.Endou,Molecular physiology of renalorganic anion transporters(肾脏有机阴离子转运蛋白的分子生理学),Am JPhysiol Renal Physiol,2006.290(2):第F251-61页。
Sweet,D.H.等,Impaired organic anion transport in kidney and choroidplexus of organic anion transporter 3(Oat3(Slc22a8))knockout mice(有机阴离子转运蛋白3(Oat3(Slc22a8))基因敲除小鼠的肾脏和脉络丛中的有机阴离子转运受损),J Biol Chem,2002.277(30):第26934-43页。
Tsutsumi Y,Maruyama T,Takadate A,Goto M,Matsunaga H以及OtagiriM.Interaction between two dicarboxylate endogenous substances,bilirubin andan uremic toxin,3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furanpropanoic acid,onhuman serum albumin(两种二羧酸内源性物质，即胆红素和尿毒症毒素3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸与人血清白蛋白之间的相互作用),Pharmaceutical Research(1999).16(6)；916。
Wijendran,V.等,Maternal plasma phospholipid polyunsaturated fattyacids in pregnancy with and without gestational diabetes mellitus:relationswith maternal factors(在患有妊娠期糖尿病和未患妊娠期糖尿病的妊娠期中的母体血浆磷脂多不饱和脂肪酸：与母体因子的关系),Am J Clin Nutr,1999.70(1):第53-61页。

Claims (62)

1.一种鉴定患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损风险的受试者的方法，所述方法包括：
(a)测定来自受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的所述测试水平与对照水平比较，其中CMPF的所述测试水平相对于所述对照水平存在差异或相似则表示所述受试者患有葡萄糖稳态受损或有患葡萄糖稳态受损的风险。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)之前获得来自所述受试者的样品。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是妊娠期糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期或胰岛素抵抗。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是葡萄糖耐量受损并且所述对照水平：
i)代表未患葡萄糖耐量受损的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照增加则表示所述受试者患有葡萄糖耐量受损或有患葡萄糖耐量受损的风险；或
ii)代表患有葡萄糖耐量受损的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照相似或更大则表示所述受试者患有葡萄糖耐量受损或有患葡萄糖耐量受损的风险。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是糖尿病前期并且所述对照水平：
i)代表未患糖尿病前期的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照增加则表示所述受试者患有糖尿病前期或有患糖尿病前期的风险；或
ii)代表患有糖尿病前期的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照相似或更大则表示所述受试者患有糖尿病前期或有患糖尿病前期的风险。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是妊娠期糖尿病并且所述对照水平：
i)代表未患妊娠期糖尿病的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照增加则表示所述受试者患有妊娠期糖尿病或有患妊娠期糖尿病的风险；或
ii)代表患有妊娠期糖尿病的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照相似或更大则表示所述受试者患有妊娠期糖尿病或有患妊娠期糖尿病的风险。
7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是2型糖尿病并且所述对照水平：
i)代表未患II型糖尿病的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照增加则表示所述受试者患有2型糖尿病或有患2型糖尿病的风险；或
ii)代表患有II型糖尿病的受试者中的CMPF水平，并且CMPF的测试水平相对于所述对照相似或更大则表示所述受试者患有II型糖尿病或有患II型糖尿病的风险。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述对照水平代表具有正常的葡萄糖耐量的受试者中的CMPF水平。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述对照水平是预定的标准化的对照水平。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述对照水平是大于50μM、100μM、150μM或200μM的血浆CMPF水平。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中测定所述样品中CMPF的所述测试水平包括检测所述样品中的CMPF。
12.如权利要求11所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用质谱法(MS)，任选地气相色谱/质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS)。
13.如权利要求11所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用高效液相色谱法(HPLC)或核磁共振(NMR)光谱法。
14.如权利要求11所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用特异性结合CMPF的抗体。
15.如权利要求14所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)。
16.如权利要求11至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在检测CMPF之前处理所述样品。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品，任选地是血清或血浆。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述样品是汗液或尿。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
20.一种监测患有葡萄糖稳态受损的受试者的方法，所述方法包括：
(a)测定来自所述受试者的样品中3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)的测试水平；以及
(b)将CMPF的所述测试水平与来自所述受试者在更早的时间点的CMPF水平相比较，其中CMPF水平增加则表示所述受试者的葡萄糖稳态受损更严重，或CMPF水平降低则表示所述受试者的葡萄糖稳态得到改善。
21.如权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(a)之前获得来自所述受试者的样品。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述葡萄糖稳态受损是β-细胞功能障碍、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中测定所述样品中CMPF的所述测试水平包括检测所述样品中的CMPF。
24.如权利要求23所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用质谱法(MS)，任选地气相色谱/质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS)。
25.如权利要求23所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用高效液相色谱法(HPLC)或核磁共振(NMR)光谱法。
26.如权利要求23所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用特异性结合CMPF的抗体。
27.如权利要求26所述的方法，其中检测所述样品中的CMPF包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)。
28.如权利要求20至27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在检测CMPF之前处理所述样品。
29.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品，任选地是血清或血浆。
30.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其中所述样品是汗液或尿。
31.一种在一个或多个β-细胞中引起β-细胞功能障碍的方法，所述方法包括使所述一个或多个β-细胞与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述β-细胞是胰岛细胞。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述β-细胞在体外、体内或离体。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，所述方法包括使所述β-细胞与大于50μM、100μM、150μM或200μM的浓度的CMPF接触。
35.如权利要求31或32所述的方法，其中所述β-细胞在体外并且使所述β-细胞与CMPF接触引起胰岛素分泌受损。
36.如权利要求31所述的方法，其中所述β-细胞在受试者体内，并且所述方法包括向所述受试者施用CMPF。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述受试者是动物，如小鼠或大鼠。
38.如权利要求37所述的方法，所述方法包括向所述动物施用至少5mg/kg的CMPF。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使用所述动物作为特征在于β-细胞功能障碍的病况的动物模型。
40.如权利要求31至39中任一项所述的方法，其中所述β-细胞功能障碍包括葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、妊娠期糖尿病、胰岛素抵抗或2型糖尿病。
41.一种对影响β-细胞活性的药剂进行筛选的方法，所述方法包括：
(a)提供一个或多个β-细胞，其中所述β-细胞的活性已通过使所述β-细胞与3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)接触而降低；
(b)使所述β-细胞与测试药剂接触；以及
(c)确定所述测试药剂对所述β-细胞活性的作用。
42.如权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括如果所述测试药剂对所述β-细胞的活性的作用高于阈值水平，那么将所述测试药剂鉴定为有效的。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述活性是葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。
44.如权利要求41或42所述的方法，其中所述活性是直接地或间接地影响胰岛素转录、胰岛素翻译、胰岛素生物合成和/或分泌(胞吐)的一种或多种基因、胰岛素调节基因或葡萄糖感应基因的转录或翻译。
45.如权利要求44所述的方法，其中步骤(c)包括测定所述一种或多种基因的表达。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述基因选自SLC2A1、SLC2A2、GCK、Kir6.2、ABCC8、CACNA1D、CACNA1A、CACNA1H、KCNB1、SNAP25、STX1A、VAMP2、SYN1A、PDX1、MAFA、NKX6.1、INS(在小鼠中为INS1或INS2)、PCSK1、PCSK2以及CPE。
47.如权利要求44或45所述的方法，其中所述基因是GLUT2或GCK。
48.如权利要求41或42所述的方法，其中所述活性是β-细胞群扩增。
49.如权利要求48所述的方法，其中通过Brdu和/或Ki67测定或使用流式细胞术来测定β-细胞群扩增。
50.如权利要求41或42所述的方法，其中所述活性是β-细胞损失。
51.如权利要求50所述的方法，其中通过膜联蛋白5-碘化丙锭染色来测定β-细胞损失。
52.如权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述β-细胞是胰岛细胞。
53.如权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述β-细胞在体外、体内或离体。
54.如权利要求41至53中任一项所述的方法，其中影响所述β-细胞活性的所述测试药剂被鉴定为用于治疗特征在于葡萄糖稳态受损的病况的候选者，所述病况如β-细胞功能障碍、葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。
55.一种治疗有需要的受试者中β-细胞功能障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述受试者患有或疑似患有葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述CMPF抑制剂是有机阴离子转运蛋白(OAT)1、OAT3和/或OAT4的调节剂。
58.如权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述CMPF抑制剂是丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)、苄青霉素(PCG)或其组合。
59.3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)抑制剂用于治疗有需要的受试者中β-细胞功能障碍的用途。
60.如权利要求59所述的用途，其中所述受试者患有或疑似患有葡萄糖耐量受损、糖尿病前期、胰岛素抵抗、妊娠期糖尿病或2型糖尿病。
61.如权利要求59或60所述的用途，其中所述CMPF抑制剂是有机阴离子转运蛋白(OAT)1、OAT3或OAT4的调节剂。
62.如权利要求59至61中任一项所述的用途，其中所述CMPF抑制剂是丙磺舒、对氨基马尿酸盐(PAH)、苄青霉素(PCG)或其组合。
CN201380060932.9A 2012-09-21 2013-09-20 作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法 Pending CN104822378A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261703867P 2012-09-21 2012-09-21
US61/703,867 2012-09-21
US201361787718P 2013-03-15 2013-03-15
US61/787,718 2013-03-15
PCT/CA2013/000798 WO2014043793A1 (en) 2012-09-21 2013-09-20 Cmpf as a biomarker for diabetes and associated methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104822378A true CN104822378A (zh) 2015-08-05

Family

ID=50340483

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380060932.9A Pending CN104822378A (zh) 2012-09-21 2013-09-20 作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9726659B2 (zh)
EP (1) EP2897614A4 (zh)
CN (1) CN104822378A (zh)
BR (1) BR112015006284A2 (zh)
CA (1) CA2885416A1 (zh)
IN (1) IN2015DN02868A (zh)
MX (1) MX2015003642A (zh)
WO (1) WO2014043793A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109765360A (zh) * 2018-12-12 2019-05-17 杭州博谱医药科技有限公司 Cmpf均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法
CN110007092A (zh) * 2019-04-08 2019-07-12 杭州博谱医药科技有限公司 一种胶乳微球-蛋白-cmpf偶联物及其制备方法以及测定血清中cmpf含量的试剂盒
CN110187123A (zh) * 2019-05-06 2019-08-30 天津医科大学总医院 一种糖尿病早期诊断生物标志物及其应用
CN114924011A (zh) * 2022-06-30 2022-08-19 重庆大学附属肿瘤医院 高效液相色谱串联质谱法检测血浆中cmpf含量的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2917483A1 (en) 2013-07-09 2015-01-15 Stemina Biomarker Discovery, Inc. Biomarkers of autism spectrum disorder
CN104678016B (zh) * 2015-02-11 2017-05-03 浙江中烟工业有限责任公司 一种采用高效液相色谱测定苯并芘在吸烟后大鼠肺部沉积量的方法
US20180028100A1 (en) * 2015-02-11 2018-02-01 Siemens Aktiengesellschaft System and non-invasive method for examining at least parts of blood fractions, and use of the system
WO2016145532A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 The Governing Council Of The University Of Toronto Cmpf for the treatment or prevention of hepatic steatosis
WO2018042072A1 (en) * 2016-09-02 2018-03-08 Afekta Technologies Oy Furan fatty acid biomarkers of nutritional status
EP4385508A1 (en) * 2022-12-16 2024-06-19 Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD) Furan fatty acids for enhancing muscle mass

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2227689B1 (en) 2007-11-02 2012-12-26 Metabolon, Inc. Biomarkers for fatty liver disease and methods using the same
WO2010045180A1 (en) 2008-10-13 2010-04-22 Metabolon, Inc. Biomarkers for inflammatory bowel disease and methods using the same
US8206591B2 (en) * 2008-10-16 2012-06-26 Fresenius Medical Care Holdings, Inc. Method of removing protein-bound deleterious substances during extracorporeal renal replacement treatment
US8980548B2 (en) 2010-05-19 2015-03-17 Metabolon, Inc. Methods and reagents for metabolomics and histology in a biological sample and a kit for the same
CA2807811A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Metabolon Inc. Biomarkers for prostate cancer and methods using the same
US20140303228A1 (en) 2011-10-18 2014-10-09 Metabolon, Inc. Biomarkers for Amyotrophic Lateral Sclerosis and Methods Using the Same
AU2012347557A1 (en) 2011-12-09 2014-07-03 Metabolon, Inc. Biomarkers for kidney cancer and methods using the same

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109765360A (zh) * 2018-12-12 2019-05-17 杭州博谱医药科技有限公司 Cmpf均相酶免疫检测试剂盒、制备方法及检测方法
CN110007092A (zh) * 2019-04-08 2019-07-12 杭州博谱医药科技有限公司 一种胶乳微球-蛋白-cmpf偶联物及其制备方法以及测定血清中cmpf含量的试剂盒
CN110187123A (zh) * 2019-05-06 2019-08-30 天津医科大学总医院 一种糖尿病早期诊断生物标志物及其应用
CN110187123B (zh) * 2019-05-06 2022-07-22 天津医科大学总医院 一种糖尿病早期诊断生物标志物及其应用
CN114924011A (zh) * 2022-06-30 2022-08-19 重庆大学附属肿瘤医院 高效液相色谱串联质谱法检测血浆中cmpf含量的方法
CN114924011B (zh) * 2022-06-30 2023-08-25 重庆大学附属肿瘤医院 高效液相色谱串联质谱法检测血浆中cmpf含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
IN2015DN02868A (zh) 2015-09-11
EP2897614A1 (en) 2015-07-29
US9726659B2 (en) 2017-08-08
US20150247839A1 (en) 2015-09-03
MX2015003642A (es) 2016-07-11
CA2885416A1 (en) 2014-03-27
WO2014043793A1 (en) 2014-03-27
BR112015006284A2 (pt) 2017-07-04
EP2897614A4 (en) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104822378A (zh) 作为糖尿病的生物标志物的cmpf和相关方法
Zhou et al. Gastric inhibitory polypeptide modulates adiposity and fat oxidation under diminished insulin action
Király et al. Swim training prevents hyperglycemia in ZDF rats: mechanisms involved in the partial maintenance of β-cell function
Dixit et al. Effects of CaMKII-mediated phosphorylation of ryanodine receptor type 2 on islet calcium handling, insulin secretion, and glucose tolerance
AU2013266086B2 (en) Methods of treating a metabolic syndrome by modulating heat shock protein (HSP) 90-beta
Liu et al. Roux-en-Y gastric bypass-induced improvement of glucose tolerance and insulin resistance in type 2 diabetic rats are mediated by glucagon-like peptide-1
Le Moli et al. Type 2 diabetic patients with Graves' disease have more frequent and severe Graves' orbitopathy
Morabito et al. Hyperleucinemia causes hippocampal retromer deficiency linking diabetes to Alzheimer's disease
Sun et al. Sitagliptin down-regulates retinol-binding protein 4 and reduces insulin resistance in gestational diabetes mellitus: a randomized and double-blind trial
Ferreira et al. Glucose homeostasis in two degrees of sepsis lethality induced by caecum ligation and puncture in mice
WO2014164404A1 (en) 2-aaa as a biomarker and therapeutic agent for diabetes
Lei et al. Selenium deficiency causes hypertension by increasing renal AT1 receptor expression via GPx1/H2O2/NF-κB pathway
Grizzanti et al. KATP channels are necessary for glucose-dependent increases in amyloid-β and Alzheimer’s disease–related pathology
Li et al. SIRT3-mediated mitochondrial autophagy in refeeding syndrome-related myocardial injury in sepsis rats
Zhang et al. Ketogenic diet alleviates β-cell dedifferentiation but aggravates hepatic lipid accumulation in db/db mice
WO2022104394A1 (en) Systems and methods for diagnostic assessment and treatment of insulin resistance and hyperglycemia
Sawano et al. Comprehensive efficacy of ipragliflozin on various conditioned type 2 diabetes compared with dipeptidyl peptidase-4 inhibitors and with both agents, based on a real-world multicenter trial
Lu et al. A bovine milk-derived peptide ameliorates pancreatic β-cell dedifferentiation through PI3K/Akt/FOXO1 signaling in type 2 diabetes
Ikizler Effects of glucose homeostasis on protein metabolism in patients with advanced chronic kidney disease
Kim et al. Whole genome expression profiling associates activation of unfolded protein response with impaired production and release of epinephrine after recurrent hypoglycemia
Kitamura et al. Sodium ferrous citrate and 5‐aminolevulinic acid improve type 2 diabetes by maintaining muscle and mitochondrial health
Hlaing et al. Purple rice bran improves hepatic insulin signaling via activation of akt and stabilization of igf in diabetic rats
Gotthardt The metabolic, neural, and behavioral outcomes of intermittent caloric deprivation in diet-induced obese mice
Racine et al. The high-fat diet and low-dose streptozotocin type-2 diabetes model induces hyperinsulinemia and insulin resistance in male but not female C57BL/6J mice
Antomagesh Cortisol regulates skeletal muscle glucose uptake during stress in zebrafish

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150805

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication