JP2015520170A - 熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０−βを調節することによる代謝症候群の治療方法 - Google Patents

熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）９０−βを調節することによる代謝症候群の治療方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＨＳＰ９０β阻害剤による代謝症候群の治療方法を提供する。本発明は、ＨＳＰ９０、特に、ＨＳＰ９０βの発現および活性レベルを用いた代謝症候群の診断および監視の方法を提供する。【選択図】 図１

Description

本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＨＳＰ９０β阻害剤による代謝症候群の治療方法を提供する。本発明は、ＨＳＰ９０、特に、ＨＳＰ９０βの発現および活性レベルを用いた代謝症候群の診断および監視の方法を提供する。
血糖値が食後に上昇すると、インスリンが分泌され、末梢組織（骨格筋および脂肪）の細胞を、血液からエネルギー源としてグルコースを活発に取り込むように刺激する。調節を欠いたインスリン分泌または作用の結果としてのグルコース恒常性の喪失は、一般に、糖尿病などの代謝障害をもたらし、これは肥満症と同時に惹起され得るか、または肥満症によってさらに増悪され得る。これらの病態は致命的である場合が多いので、血液からの十分なグルコースクリアランスを回復させるための戦略が要される。
糖尿病は膵臓に広範な損傷を引き起こす任意の病態（例えば、膵炎、腫瘍、コルチコステロイドまたはペンタミジンなどのある種の薬物の投与、鉄過多（すなわち、ヘモクロマトーシス）、後天性または遺伝性内分泌障害、および外科的摘出）に続発することがあるが、最も多い形態の糖尿病は一般に、インスリンシグナル伝達系の主要な障害に起因する。２つの主要なタイプの糖尿病、すなわち、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られる）および２型糖尿病（インスリン非依存性または非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られる）が存在し、それらの病理機序が異なるにも関わらず、共通の長期合併症を有する。
１型糖尿病は、原発糖尿病の全症例のおよそ１０％を占め、膵臓のインスリン産生β細胞の広範な破壊を特徴とする臓器特異的自己免疫疾患である。結果的なインスリン産生の減少は不可逆的にグルコース代謝の調節解除をもたらす。この病態に罹患している患者にはインスリンの投与が著しい利益をもたらすが、インスリンの短い血清半減期が正常血糖の維持の主な障害となる。代替の処置は膵島移植であるが、この戦略に伴ってきた成功は限られたものである。
２型糖尿病は、集団のより大きな割合に影響を及ぼし、インスリン分泌の調節解除および／またはインスリンに対する末梢組織の応答低下、すなわち、インスリン抵抗性を特徴とする。２型糖尿病の病因は依然として明らかになっていないが、疫学的研究によれば、この形態の糖尿病は、複数の遺伝子欠陥または多形の集合体から起こり、それぞれはその固有の素因的リスクに寄与し、太りすぎ、食事、運動不足、薬物、および過剰なアルコール摂取を含む環境因子により変化を受けることが示唆されている。２型糖尿病の管理には様々な治療的処置が利用できるが、それらには様々な消耗性の副作用が伴う。従って、２型糖尿病に罹患している、または罹患するリスクがあると診断された患者は、減量、食事の変更、運動、および適度なアルコール摂取を含む、より健康的なライフスタイルを採用するように進められる場合が多い。しかしながら、このようなライフタイルの変更では、糖尿病により引き起こされた血管および臓器の損傷を逆転させるには十分でない。
一態様において、本発明は、対象において代謝症候群を治療する方法であって、前記対象にＨＳＰ９０モジュレーターを投与し、それにより、前記対象において代謝症候群を治療することを含む方法を提供する。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０モジュレーターは、ＨＳＰ９０阻害剤である。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０βの阻害剤である。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０βの特異的阻害剤である。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０αの阻害剤である。
一実施形態では、前記代謝症候群は、２型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、１型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン抵抗性を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン欠乏症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、肥満症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、高インスリン血症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、耐糖能異常（ＩＧＴ）を含む。
一実施形態では、代謝症候群を有する対象は下記徴候：
ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの３つ以上を示す。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、核酸阻害剤を含む。一実施形態では、前記核酸阻害剤は、アンチセンス核酸分子を含む。一実施形態では、前記核酸阻害剤は、二本鎖核酸分子を含む。一実施形態では、前記核酸阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される二本鎖ＲＮＡを含む。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、抗体を含む。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０阻害剤は、小分子を含む。一実施形態では、前記小分子は、ロニダミンまたはその類似体、セラストロールまたはその類似体、ゲデュニンまたはその類似体、およびクメルマイシンまたはその類似体からなる群から選択される。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、対象において血糖値を正常化することを含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、対象においてＨｂ１Ａｃレベルを正常化することを含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、循環不良に関連する糖尿病の少なくとも１つの合併症の予防を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、２型糖尿病の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、１型糖尿病の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、インスリン抵抗性の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、インスリン欠乏症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、高インスリン血症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、耐糖能異常（ＩＧＴ）の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、肥満症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、
ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの少なくとも１つの改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の高い血圧の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、１００ｍｇ／ｄＬ以上の高い空腹時血糖の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、大きな腹囲の改善を含み、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、ＨＤＬコレステロールを増加させることによる低ＨＤＬコレステロールの改善を含み、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、１５０ｍｇ／ｄＬ以上の高いトリグリセリドの改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、脂肪肝の改善を含む。
一実施形態では、代謝症候群を治療することは、脂肪沈着の調節を含む。
別の態様おいて、本発明は、対象において代謝症候群を診断する方法であって、
ａ）前記対象由来のサンプルにおいてＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを決定すること；および
ｂ）前記対象由来のサンプルにおけるＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを対照サンプルと比較し、対照サンプルと比較した場合の対象サンプルにおけるＨＳＰ９０βの発現または活性の増強が、前記対象における代謝障害の指標となること
を含む方法を提供する。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０β発現のレベルは、ＨＳＰ９０βタンパク質またはＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子の発現レベルを含む。
一実施形態では、本方法は、代謝障害に関して対象を治療することをさらに含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、２型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、１型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン抵抗性型を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン欠乏症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、肥満症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、高インスリン血症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、耐糖能異常（ＩＧＴ）を含む。
一実施形態では、代謝症候群を有する対象は下記徴候：
ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの１つ以上をさらに示す。
さらに別の態様では、本発明は、対象において代謝症候群を監視する方法であって、
ａ）前記対象から第１の時点および第２の時点でサンプルを得ること；
ｂ）第１の時点および第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを決定すること；および
ｃ）第１の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルと比較し、第１の時点と比較した第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルの変化が、前記対象における代謝症候群の変化の指標となること
を含む方法を提供する。
一実施形態では、前記ＨＳＰ９０β発現のレベルは、ＨＳＰ９０βタンパク質またはＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子の発現レベルを含む。
一実施形態では、ＨＳＰ９０β発現または活性の増大が、代謝症候群の増悪の指標となる。一実施形態では、ＨＳＰ９０β発現または活性の低下が、代謝症候群の改善の指標となる。
一実施形態では、前記代謝症候群は、２型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、１型糖尿病を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン抵抗性型を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、インスリン欠乏症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、肥満症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、高インスリン血症を含む。
一実施形態では、前記代謝症候群は、耐糖能異常（ＩＧＴ）を含む。
一実施形態では、代謝症候群を有する対象は下記徴候：
ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの１つ以上をさらに示す。
他の実施形態を以下に示す。
図１は、糖尿病モデルを用いたインターロガトリープラットフォーム法において使用されるデルタ−デルタネットワークの概略図である。ＨＧは高血糖症であり；ＨＧＴ１は補酵素Ｑ１０処置を伴う高血糖症であり、ＮＧは正常血糖である。 図２は、本明細書で論じるインターロガトリープラットフォーム法によって作成された糖尿病細胞モデルと正常細胞モデルにおけるネットワークの概略図である。濃いノードは、この方法を用いて同定された、活性の５つの主要なハブを表す。 図２に四角で示したネットワークセクションの拡大図であり、本明細書で論じるプラットフォーム法糖尿病アウトプットから着目される、ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＨＳＰ９０β）と原因ノードの関連マップを示す。 図４は、デルタ−デルタネットワークにおけるタンパク質の因果関係を表すために用いた記号およびカラーコードの凡例を示す。 図５は、代謝因子および炎症に応答したＨｓｐ９０β発現ｍＲＮＡおよびタンパク質の誘導を示す。 図６は、筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンの結果を示し、インスリンにより刺激されるＡＫＴ、ＥＲＫ、およびＧＳＫ３βのリン酸化に有意な増大をもたらす。ｐＥＲＫに及ぼすノックダウンの影響は、スクランブルｓｉＲＮＡに比べた場合、有意であった。 図７は、筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンの結果を示し、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉスクランブル）に比べて、インスリンにより刺激されるグルコース取り込みに有意な増大をもたらす。 図８は、筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンの結果を示し、スクランブルｓｉＲＮＡに比べて、ＣＣＣＰにより誘導され脱共役に有意な増大をもたらす。Ｈｓｐ９０βがノックダウンされた筋管における基礎呼吸は、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉスクランブル）で処理された筋管よりもある程度高いことが見て取れる。 図９Ａおよび９Ｂは、Ｈｓｐ９０阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）による筋管の処理の影響を示す、（Ａ）ウエスタンブロット、および（Ｂ）定量分析を示し、非処理培養物に比べてリン−ＡＫＴのレベルを高めることが見て取れる。ｐＥＲＫまたはｐＧＳＫ３βにおける有意な変化は見られなかった。 図９Ａおよび９Ｂは、Ｈｓｐ９０阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）による筋管の処理の影響を示す、（Ａ）ウエスタンブロット、および（Ｂ）定量分析を示し、非処理培養物に比べてリン−ＡＫＴのレベルを高めることが見て取れる。ｐＥＲＫまたはｐＧＳＫ３βにおける有意な変化は見られなかった。 図１０は、骨格筋筋管の１μＭ、３μＭ、および１０μＭ Ｈｓｐ９０阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）による処理からの結果を示し、ミトコンドリア代謝におけるＣＣＣＰにより誘導される脱共役応答に有意な影響を示さなかった。 図１１Ａおよび１１Ｂは、（Ａ）代謝酵素遺伝子発現（ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）；グリコーゲンシンターゼ１（ＧＹＳ１）；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ−１）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１および２（ＡＣＣ１およびＡＣＣ２）；ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）；およびミトコンドリア脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３））；ならびに（Ｂ）骨格筋筋管におけるＵＣＰ３発現に及ぼす、筋管におけるＨｓｐ９０βノックダウンの影響を示す。 図１１Ａおよび１１Ｂは、（Ａ）代謝酵素遺伝子発現（ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）；グリコーゲンシンターゼ１（ＧＹＳ１）；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１（ＣＰＴ−１）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ１および２（ＡＣＣ１およびＡＣＣ２）；ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）；およびミトコンドリア脱共役タンパク質３（ＵＣＰ３））；ならびに（Ｂ）骨格筋筋管におけるＵＣＰ３発現に及ぼす、筋管におけるＨｓｐ９０βノックダウンの影響を示す。 図１２Ａ〜１２Ｄは、骨格筋筋管の解糖フラックスの、（Ａ）グルコースにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｂ）オリゴマイシンにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｃ）基礎ＯＣＲ；および（Ｄ）脱共役ＯＣＲに及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１２Ａ〜１２Ｄは、骨格筋筋管の解糖フラックスの、（Ａ）グルコースにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｂ）オリゴマイシンにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｃ）基礎ＯＣＲ；および（Ｄ）脱共役ＯＣＲに及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１２Ａ〜１２Ｄは、骨格筋筋管の解糖フラックスの、（Ａ）グルコースにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｂ）オリゴマイシンにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｃ）基礎ＯＣＲ；および（Ｄ）脱共役ＯＣＲに及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１２Ａ〜１２Ｄは、骨格筋筋管の解糖フラックスの、（Ａ）グルコースにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｂ）オリゴマイシンにより誘導されるＥＣＡＲ；（Ｃ）基礎ＯＣＲ；および（Ｄ）脱共役ＯＣＲに及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、（Ａ）ウエスタンブロットで、および（Ｂ）定量的に示されるような、筋管の炎症性インスリン抵抗性モデルにおける、総Ｅｒｋレベルに対するリン酸化Ｅｒｋレベルの比に及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、（Ａ）ウエスタンブロットで、および（Ｂ）定量的に示されるような、筋管の炎症性インスリン抵抗性モデルにおける、総Ｅｒｋレベルに対するリン酸化Ｅｒｋレベルの比に及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１４は、骨格筋筋管において正常グルコース条件下、パルミチン酸塩により誘導されるＯＣＲにおける相対的ＯＣＲ／ＤＮＡ比に及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの影響を示す。 図１５は、ヒトＨＳＰ９０ＡＡ１遺伝子（配列番号７）およびＨＳＰ９０αタンパク質（配列番号８）の配列を示す。 図１５−１の続き。 図１６は、ヒトＨＳＰ９０ＡＢ遺伝子（配列番号９）およびＨＳＰ９０βタンパク質（配列番号１０）の配列を示す。 図１６−１の続き。 図１７は、ＨＳＰ９０ＡＡ１遺伝子（配列番号７）とヒトＨＳＰ９０ＡＢ遺伝子（配列番号９）；およびヒトＨＳＰ９０αタンパク質（配列番号８）とヒトＨＳＰ９０βタンパク質（配列番号１０）の配列のアラインメントを示す。 図１７−１の続き。 図１７−２の続き。 図１７−３の続き。 図１７−４の続き。
糖尿病および代謝症候の病態生理学を駆動する示差的分子シグネチャーを表すためにディスカバリープラットフォームテクノロジーを使用した。Ｈｓｐ９０βは、このディスカバリープラットフォームテクノロジーによって、ヒト原発性ｉｎ ｖｉｔｒｏ糖尿病モデルにおいて有意に変調され、かつ、脂質代謝、プロテアソーム機能、エンドソーム輸送、およびＲＮＡスプライシングに関わる複数の機構に関連する重要なノードと同定された。
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、クライエントタンパク質の大規模なセットを安定化する分子シャペロンである。脊椎動物は、サイトゾルＨＳＰ９０の２つのアイソフォーム、ＨＳＰ９０α（遺伝子ＨＳＰ９０ＡＡ１）およびＨＳＰ９０β（遺伝子ＨＳＰ９０ＡＢ１）を有する。脊椎動物では、ＨＳＰ９０アイソフォームは一般に、アミノ酸配列レベルで約８５％の同一性を有する。ヒトでは、ＨＳＰ９０αアミノ酸配列は、ＨＳＰ９０β アミノ酸配列と８６％の同一性、９３％の類似性を有する。両タンパク質とも、ＡＴＰ結合ドメインを含む。ＨＳＰ９０βは、ほとんどの細胞において構成的に高レベルで発現し、一般にＨＳＰ９０αよりも豊富に存在する。ＨＳＰ９０α発現はストレス誘導性であり、このタンパク質は多くの癌細胞で過剰発現される。ＨＳＰ９０アイソフォームのクライエントタンパク質は重複が大きいが、ＨＳＰ９０αは、熱ショック後に多くのシグナル伝達タンパク質、例えば、ｃ−Ｓｒｃ、Ａ−ｒａｆへのシャペロン機能を担う。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析では、類似していて広範囲の冗長機能が示唆されるが、ＨＳＰ９０ノックアウトマウスの表現型は著しく異なる。Ｈｓｐ９０βノックアウトマウスは早期胚性致死を示す。対照的に、Ｈｓｐ９０α欠損マウスで確認された唯一の欠陥は、成体の雄で見られ、精子形成不全を呈する。Ｈｓｐ９０βの場合、胚性期９日に、胚が胎盤を発達させることができないために致死が見られ、移植の失敗および２４時間以内の死に至る。これらの突然変異体はＨｓｐ９０αを発現するものの、やはり成功を見ず、この重要な達成段階でＨｓｐ９０αはＨＳＰ９０βを補償することができないことを示唆する。Ｈｓｐ９０βとは対照的に、雄および雌のＨｓｐ９０αノックアウトマウスは生存能があり、雄マウスが不妊であることを除けば、表現型上正常な成体となる。これらの結果は、この２つのＨＳＰ９０アイソフォームは、マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏで異なる役割を果たすことを示す。
初代ヒト骨格筋細胞（ＨＳＭＭ）および肝細胞腫（ＨｅｐＧ２）細胞による種々の機能アッセイを用い、出願者らは、ＲＮＡｉを介したＨＳＰ９０βのノックダウンが基礎ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比を約５０％低下させたことを実証している。この比率の低下は、ＨＳＭＭ細胞とＨｅｐＧ２細胞の両方で、ＯＣＲの低下とＥＣＡＲの上昇によるものであったが、このことはＨＳＰ９０βが酸化的呼吸および解糖を調節することを示す。さらに、ＨＳＭＭ細胞におけるＨＳＰ９０βノックダウンは、グルコースにより誘導されるＥＣＡＲを高め、ＨＳＰ９０βの低下により誘導される解糖増加を示す。
さらに、出願者らは、初代ヒト骨格筋細胞で、ＨＳＰ９０βのノックダウンがインスリンにより刺激されるグルコース取り込みの増加を誘導したことを実証したが、このことはＨＳＰ９０βが骨格筋のグルコース代謝とインスリン作用に関与していることを示す。さらに、筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンがｐＥＲＫの有意な下流誘導をもたらし、ｐＡＫＴおよびｐＧＳＫ３βへの影響はあまり大きくないという出願者らによる所見は、インスリンシグナル伝達の機能分岐と、Ｈｓｐ９０βが選択的機構に関与することを示唆する。さらなる実験で、出願者らは、ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０βの両方を阻害する汎ＨＳＰ９０小分子阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）は、インスリンシグナル伝達および生体エネルギー論にＨＳＰ９０β単独のノックダウンの場合ほど顕著な影響を及ぼさなかったことを示した。従って、特異的ＨＳＰ９０β阻害は、汎ＨＳＰ９０阻害アプローチよりも有効であることが分かった。
要約すると、ノックダウンＨＳＰ９０βは、出願者らにより、生体エネルギー論およびミトコンドリア基質代謝に有意な影響を持つことが見出された。特に、本明細書に記載の研究から、細胞代謝の重要なレギュレーターおよび骨格筋細胞における酸化的呼吸と解糖の間の分子スイッチとしてＨＳＰ９０βが浮上した。従って、ＨＳＰ９０βは、糖尿病の実行性のある治療標的である。
定義
本明細書で使用する場合、「ＨＳＰ９０阻害剤」とは、ＨＳＰ９０の発現または活性を低下させる治療薬である。ＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０と直接相互作用するか、またはＨＳＰ９０／ＣＤＣ３７複合体の形成を減らすもしくは妨げることによりＨＳＰ９０活性を低下させることができ、その結果、ＨＳＰ９０の少なくとも１つのクライエントタンパク質の発現および適正な折りたたみが阻害される。本明細書で使用する場合、「ＨＳＰ９０」阻害剤は、例えば、ＨＳＰ９０の発現をＲＮＡもしくはタンパク質レベルで阻害すること；例えばＡＴＰの結合もしくは加水分解を阻害することによりＨＳＰ９０の活性を阻害すること；またはＨＳＰ９０の、その相互作用タンパク質の１以上との相互作用を阻害すること；またはＨＳＰ９０の安定性を低下させることによるなどのいずれの機構によって作用してもよい。ＨＳＰ９０阻害剤は、１以上のＨＳＰ９０アイソフォームの活性を阻害することができる。例えば、ＨＳＰ９０αの阻害剤はまた、ＨＳＰ９０βを阻害することもできる。同様に、ＨＳＰ９０βの阻害剤はまた、ＨＳＰ９０αを阻害することもできる。一実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤は、特定のＨＳＰ９０アイソフォームの阻害に特異的、例えば、ＨＳＰ９０βの阻害に特異的とすることができる、すなわち、主としてＨＳＰ９０βを阻害し、しかもＨＳＰ９０αの阻害をはるかに低くすることができる。
ＨＳＰ９０阻害剤としては、（ｉ）小分子阻害剤（その多くがＨＳＰ９０の複数のアイソフォームの活性を阻害する）、例えば、ラディシコールおよびゲルダナマイシンならびにそれらの誘導体；（ｉｉ）ＨＳＰ９０の１以上の特異的アイソフォームを標的とすることができる核酸阻害剤、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡなど（例えば、本明細書に示される例；Kuo et al., 2007, J. Immunol. 178:600; Didelot et al., 2008, Cell. Death Diff., 15:859を参照、これらそれぞれの全内容は参照により本明細書の一部とされる）；ならびに（ｉｉｉ）ＨＳＰ９０の１以上の特異的アイソフォームを標的とすることができる抗体（全内容が参照により本明細書の一部とされるCortes-Gonzalez et al., 2010, Cell Physiol. Biochem. 26:657参照）。ＨＳＰ９０阻害剤の特定のクラスおよび例は本明細書で詳述する。
本明細書で使用する場合、特定のＨＳＰ９０アイソフォームに「特異的」、例えば、ＨＳＰ９０βに特異的なＨＳＰ９０阻害剤は、別のＨＳＰアイソフォームに対して有意に低い活性を持ち得る。しかしながら、本明細書で使用する場合、特定のＨＳＰ９０アイソフォームの「特異的」阻害剤は、特異的ＨＳＰ９０アイソフォームの活性または発現の阻害において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、または少なくとも１００倍有効性が高い。例えば、阻害剤が、特定のＨＳＰ９０アイソフォームの阻害において少なくとも１０倍有効性が高いＨＳＰ９０β特異的ｓｉＲＮＡである場合、１ｎＭのｓｉＲＮＡは、１０ｎＭの該ｓｉＲＮＡがＨＳＰ９０αの発現を低下させるのと同程度に、ＨＳＰ９０βの発現を低下させる。ＨＳＰ９０アイソフォームの活性に及ぼす阻害剤の影響、例えば、下流エフェクターのリン酸化の阻害、クライエントタンパク質の折りたたみの阻害、無機リン酸産生の阻害などのレベルを比較するために同様の解析を行うこともできる。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０βアイソフォームの特異的阻害剤は、ＨＳＰ９０βの発現または活性を少なくとも５０％阻害するが、同じ濃度で、ＨＳＰ９０αの発現または活性は５０％、４０％、３０％、２０％、１０％も阻害しない。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０βアイソフォームの特異的阻害剤は、ＨＳＰ９０βの発現または活性を少なくとも６０％阻害するが、同じ濃度で、ＨＳＰ９０αの発現または活性は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％も阻害しない。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０βアイソフォームの特異的阻害剤は、ＨＳＰ９０βの発現または活性を少なくとも７０％阻害するが、同じ濃度で、ＨＳＰ９０αの発現または活性は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％も阻害しない。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０βアイソフォームの特異的阻害剤は、ＨＳＰ９０βの発現または活性を少なくとも８０％阻害するが、同じ濃度で、ＨＳＰ９０αの発現または活性は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％も阻害しない。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０βアイソフォームの特異的阻害剤は、ＨＳＰ９０βの発現または活性を少なくとも９０％阻害するが、同じ濃度で、ＨＳＰ９０αの発現または活性を５０％、４０％、３０％、２０％、１０％も阻害しない。
ＨＳＰ９０阻害剤の特異性および活性を決定するためのアッセイ方法は、当業者の能力の範囲内である。具体的なアッセイ方法は、例えば活性の阻害剤または発現の阻害剤など、用いる阻害剤によって異なり得る。ＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０β活性をアッセイするためのキットは市販されている（例えば、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）。ＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０βの活性をアッセイするための方法もまた当技術分野で公知である（例えば、Kim et al., J. Biomol. Screening 2004; 9: 375-381;およびHowes et al., Anal. Biochem. 2006; 350:202-213参照、両方の全内容は参照により本明細書の一部とされる）。
例えば、Ｈｓｐ９０活性の阻害は、ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ、例えば、Methods Mol Med, 2003, 85:149に記載のようなマラカイトグリーンアッセイで決定することができる。簡単に述べれば、Ｈｓｐ９０タンパク質（例えば、Ｈｓｐ９０αおよびＨｓｐ９０βタンパク質）を９６ウェルプレートにて、アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、ＡＴＰ単独（陰性対照）、ＡＴＰおよびゲルダナマイシン（陽性対照）、ＡＴＰおよび種々の濃度の試験化合物、または試験化合物単独（別の陰性対照）と混合する。ＡＴＰの加水分解によって産生される無機リン酸を検出するために、次に、マラカイトグリーン試薬をこの反応物に加える。これらの混合物を３７℃で４時間インキュベートし、インキュベーションの終了時にクエン酸ナトリウムバッファー（３４％ｗ／ｖクエン酸ナトリウム）を反応物に加える。このプレートを６２０ｎｍの吸光度を用いてＥＬＩＳＡリーダーにより読み取る。ＨＳＰ９０αおよびＨｓｐ９０βに対する活性を比較して、存在する場合には、阻害剤の特異性を決定することができる。このようなアッセイにより、ＨＳＰ９０アイソフォームのそれぞれに対する阻害剤活性の直接的な比較が可能となる。
あるいは、Ｈｓｐ９０活性の阻害は、競合的結合アッセイで決定することができる。ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０αまたはＨｓｐ９０βのＡＴＰ結合部位と相互作用し、他のＨｓｐ９０阻害剤により容易に置換され得ることが知られている。この置換の決定は、ゲルダナマイシンを蛍光標識または非蛍光的標識することによって容易となる。蛍光標識ゲルダナマイシンを用いる例示的競合的結合アッセイは、Yin, et al., Int J Cancer. 2010 Mar 1;126(5):1216-25（参照により本明細書の一部とされる）に記載されている。簡単に述べれば、まず、ＦＩＴＣ−ゲルダナマイシンプローブを室温にて３時間、ＴＣＥＰで還元し、その後、この溶液をアリコートに分け、使用するまで−８０℃で保存する。組換えヒトＨｓｐ９０αまたはＨｓｐ９０βと還元ＦＩＴＣ−ゲルダナマイシンを９６ウェルマイクロプレート中、室温で３時間、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＧＧ、および０．１％（ｖ／ｖ）ＣＨＡＰＳを含有するアッセイバッファーの存在下でインキュベートする。陰性対照としては、プレインキュベーションにＨｓｐ９０タンパク質は含まれない。このプレインキュベーションの後、次に、溶媒中の試験化合物（競合因子として）を０．２ｎＭ〜１０μＭの終濃度まで加える（終容量１００μＬ）。陽性対照としては、非標識ゲルダナマイシンを競合因子として用いる。陰性対照としては、試験化合物も非標識ゲルダナマイシンも加えない。この反応物を室温で１６時間インキュベートした後、蛍光をＡｎａｌｙｓｔプレートリーダー、励起＝４８５ｎｍ、発光＝５３５ｎｍで測定する。高対照および低対照はそれぞれ、化合物不含またはＨｓｐ９０不含とした。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて４パラメーター曲線に当てはめ、ＩＣ５０値を求める。ＩＣ５０値を、例えばMachida, et al., Cancer Sci 2005;96:911-17 (31)に記載されているような修正Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式を用いて阻害定数（Ｋｉ）に変換する。ＨＳＰ９０αに対する活性とＨｓｐ９０βに対する活性を比較し、存在する場合には、阻害剤の特異性を決定することができる。
あるいは、ＨＳＰ９０活性は、単一のＨＳＰ９０アイソフォームのみを発現する細胞（例えば、ＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βのみを発現する、酵母、Ｃ．エレガンス(C.elegans)、または哺乳類細胞）においてアッセイすることもできる。ＨＳＰ９０の両アイソフォームのクライエントタンパク質の阻害の折りたたみおよび／または安定性をアッセイして、これらの阻害剤の相対的活性を決定する。本明細書で使用する場合、ＨＳＰ９０の「核酸」阻害剤は、ＨＳＰ９０ＡＡ１および／またはＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子からのＲＮＡ転写産物の少なくとも一部とハイブリダイズしてＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βの発現に低下をもたらすことにより、ＨＳＰ９０の発現に低下を生じる核酸に基づく任意の阻害剤である。核酸阻害剤としては、例えば、一本鎖核酸分子、例えば、アンチセンス核酸、および二本鎖核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ（例えば、米国特許公報第２００７０１０４６８８号参照）が含まれる。本明細書で使用する場合、二本鎖核酸分子は、少なくとも１２、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドを超える二本鎖となるように設計される。二本鎖核酸分子は、自身とハイブリダイズするように設計された単一の核酸鎖、例えばｓｈＲＮＡであり得る。ＨＳＰ９０の核酸阻害剤は単離された核酸として投与することができると理解される。あるいは、核酸阻害剤は、細胞内で阻害剤を生産するための発現構築物として投与することもできる。特定の実施形態では、核酸阻害剤は、核酸阻害剤の活性および／または安定性を改善するために１以上の化学修飾を含む。このような修飾は当技術分野で周知である。使用されるべき具体的修飾は、例えば、核酸阻害剤のタイプによって異なる。
本明細書で使用する場合、「抗体」は、特定の標的抗原と結合する少なくとも１つの相補性決定領域を含むタンパク質である。抗体は多くの場合、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域、例えば、免疫グロブリン可変ドメイン配列または免疫グロブリン可変ドメイン配列を呈するアミノ酸配列を含む。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）、および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域と２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、およびｄＡｂフラグメント）ならびに完全抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型の完全免疫グロブリン（ならびにそれらのサブタイプ）を包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態では、抗体はグリコシル化されている。例えば、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、修飾抗体、キメラ抗体、再構成抗体(reshaped antibody)、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ、二量体化可変領域（Ｖ領域）フラグメント（ダイアボディー）、ジスルフィド安定化Ｖ領域フラグメント（ｄｓＦｖ）、アフィボディ、抗体ミメティクス、およびペイロードとの特異的結合を保持する１以上の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得る。本明細書で使用する場合、「単離された」ＣＤＲは、天然に存在する抗体の範囲内でないＣＤＲである。抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥなど、いずれの免疫グロブリン種でもよい。一実施形態では、抗体は、ヒト抗体であり得る。
本明細書で使用する場合、「小分子」阻害剤は、１０００Ｄａ未満、好ましくは７５０Ｄａ未満、または好ましくは５００Ｄａ未満の分子量を有する阻害剤分子である。特定の実施形態では、小分子は、核酸分子を含まない。特定の実施形態では、小分子は、３アミノ酸長よりも長いペプチドを含まない。
本明細書で使用する場合、簡単にするために、発現または活性の変化または変調、すなわち、ＨＳＰ９０、例えば、ＨＳＰ９０αおよび／またはＨＳＰ９０β発現または活性の増大または低下は、遺伝子および／またはタンパク質の発現または活性における変化を含むと理解される。一実施形態では、発現または活性は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低減される。
本明細書で使用する場合、ＨＳＰ９０「活性」の変化は、例えば、ＨＳＰ９０、例えば、ＨＳＰ９０αおよび／またはＨＳＰ９０βのＡＴＰ加水分解活性の変化を検出すること、特定のＨＳＰ９０のクライエントタンパク質の折りたたみの変化を検出することによって検出することができる。ＡＴＰ加水分解の検出のための方法は、当技術分野で周知である。クライエントタンパク質の折りたたみは、例えば、サンプル中に存在するクライエントタンパク質の量を決定すること、またはそのクライエントタンパク質が、酵素活性、例えばキナーゼ活性を有するシグナル伝達タンパク質である場合には、サンプル中のクライエントタンパク質の活性を決定することによって評価することができる。ＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０β活性をアッセイするためのキットは市販されてもいる（例えば、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）。
本明細書で使用する場合、「代謝症候群」に罹患している対象は、下記病態：２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン欠乏症、肥満症、高インスリン血症、もしくは耐糖能異常（ＩＧＴ）のうちの１以上を有する；または代謝症候群の下記徴候：
ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの３つ以上を有する対象を意味するものとする。
代謝症候群の適応病態を診断するため、また適応徴候を検出するための方法は、当技術分野で慣例である。特定の実施形態では、代謝症候群は、１型糖尿病をさらに含む。特定の実施形態では、代謝症候群は、１型糖尿病を含まない。関連疾患および徴候としては、高尿酸血症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）へと進行する脂肪肝（特に、併発肥満症）、多嚢胞性卵巣症候群（女性）、および黒色皮膚腫が含まれる。特定の実施形態では、本発明は、これらの関連疾患または徴候のうち１以上の治療を含む。特定の実施形態では、本発明は、これらの関連疾患または徴候のうち１以上の治療を含まない。
本明細書で使用する場合、「糖尿病」は、１型糖尿病もしくは２型糖尿病のいずれか、または１型および２型糖尿病の両方を意味するものとする。特定の実施形態では、糖尿病は、前糖尿病を含む。特定の実施形態では、糖尿病は、前糖尿病を含まない。
本明細書で使用する場合、「インスリン抵抗性」および「インスリン非感受性」は、互換的に使用することができ、そのインスリン量が正常対象の場合よりも血糖を下げる効果が低く、結果として正常範囲を超える血糖上昇に至る、すなわち、インスリンの不在によるものではない病態を意味する。特定の機序に縛られるものではないが、この病態は一般に、インスリン受容体を介するシグナル伝達の低下に関連する。一般に、筋肉および脂肪細胞におけるインスリン抵抗性はグルコース取り込みを減らし、それぞれグリコーゲンおよびトリグリセリドを貯蓄する。肝臓細胞におけるインスリン抵抗性は、グリコーゲン合成の低下、ならびにグルコース産生および血中放出の不全をもたらす。
インスリン抵抗性は同じ対象に「インスリン欠乏症」とともに存在する場合が多く、これもまたインスリンの不在によらない正常範囲を超える血糖上昇をもたらす。インスリン欠乏症は、インスリンが存在し、身体で産生されるが、インスリン作用の欠如に関連する病態である。これは、膵島細胞の欠如によってインスリンが産生されない１型糖尿病とは明瞭に異なる。
対象が代謝症候群を有するかどうかを決定する目的では、対象がインスリン抵抗性、インスリン欠乏症、またはその両方に罹患しているかどうかを識別することは重要でない。
本明細書で使用する場合、「肥満症」は、臨床上適切ないずれかの定義を用いて定義することができる。例えば、成人では、体格指数（ＢＭＩ、ｋｇ／ｍ２）が太りすぎおよび肥満症の尺度として使用される場合が多く、太りすぎはＢＭＩが２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２、肥満症はＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２以上と定義され、病的肥満症ＢＭＩが４０ｋｇ／ｍ２を超えると定義される。肥満症はまた、成人においては、腹囲によって測定される中心性肥満により定義することもでき、この場合、増大した腹囲は、男性では１０２ｃｍ以上、女性では８８ｃｍ以上と定義される。肥満症の治療は、ＢＭＩまたは腹囲の正常レベルへの低下を必ずしも必要としない。その代わりに、治療は、好ましくは、対象の正常上限を超える超過ＢＭＩ値または超過腹囲の少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも７％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより大きい低減を含む。例えば、腹囲１００ｃｍの女性は、１２ｃｍ（１００ｃｍ−８８ｃｍ）の超過腹囲を有する。超過の２０％の低下は２．４ｃｍ減となる。
「高インスリン血症」は、対象がインスリン抵抗性を有し、正常血糖を有するまたは有さず、空腹時または食後血清または血漿インスリン濃度が、インスリン抵抗性を有さない正常な痩せ型個体の場合より高くなり（すなわち、空腹時血漿グルコース検査で＞１００ｍｇ／ｄｌ、または経口ブドウ糖負荷試験で＞１４０ｍｇ／ｄｌ）、さらに腹囲／腰囲比＜１．０（男性）または＜０．８（女性）を有する状態と定義される。
用語「耐糖能異常」（ＩＧＴ）または「前糖尿病」は、糖負荷試験を行った場合に血糖値が正常と高血糖の間に入る人を表すために用いる。このような人は、糖尿病を有すると見なされないが、糖尿病を発症するリスクが高い。例えば、耐糖能異常は、患者が１１０ｍｇ／ｄｌを超え１２６ｍｇ／ｄｌ（７．００ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の空腹時血中グルコース濃度もしくは空腹時血清グルコース濃度、または１４０ｍｇ／ｄｌ（７．７８ｍｍｏｌ／Ｌ）を超え、２００ｍｇ／ｄｌ（１１．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）の食後２時間血中グルコース濃度もしくは血清グルコース濃度を有する状態を意味する。山のような証拠が、前糖尿病状態は心血管疾患を発症するリスク因子であり得ることを示唆している(Diabetes Care 26:2910-2914, 2003)。前糖尿病は、耐糖能異常または空腹時血糖障害とも呼ばれ、２型真性糖尿病、心血管疾患の発症および死亡の主要なリスク因子である。前糖尿病状態を効果的に治療することにより２型糖尿病の発症を予防する、開発中の治療介入大きな関心が寄せられている(Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004)。
「高血糖症」（高い血中糖）の状態とは、血糖値が高すぎる状態である。一般に、高血糖症は、血糖値が１８０ｍｇ／ｄｌを超えて上昇する場合に起こる。高血糖の症状には、頻尿、過度の口渇および、長いタイムスパンで見た体重減少が含まれる。
「低血糖症」（低い血中糖）の状態とは、血糖値が低すぎる状態である。一般に、低血糖症は、血糖値が７０ｍｇ／ｄｌを下回る場合に起こる。低血糖症の症状には、不機嫌、四肢（特に、手および腕）のしびれ、錯乱、震えまたは目眩が含まれる。この状態は利用可能なグルコースの量を超える過剰なインスリンが存在する場合に起こるので、インスリン反応と呼ばれる場合もある。
本明細書で使用する場合、「ＨｂＡ１ｃレベル」は、過去２〜３か月間の平均血糖値を評価するＨｂＡ１ｃ検査から決定されたヘモグロビンＡｌｃ（ＨｂＡｌｃ）レベルと理解され、これが使用され得る。糖尿病を有さない人は一般に、４％〜６％の間の範囲のＨｂＡｌｃ値を有する。前糖尿病は５．７％〜６．５％のＨｂＡ１ｃレベルを特徴とし、６．５％を超えるＨｂ１Ａｃレベルは糖尿病の指標となる。ＨｂＡｌｃが１％上昇するごとに、血糖値はおよそ３０ｍｇ／ｄＬ上昇し、持続的な血糖上昇による合併症のリスクが高まる。好ましくは、本発明に従って治療される患者のＨｂＡｌｃ値は、９％未満、７％未満、６％未満、最も好ましくは５％前後に低減される。よって、治療される患者の過度なＨｂＡｌｃレベル（すなわち、５．７％を超えるＨｂ１Ａｃレベル）は、好ましくは、治療前のレベルに比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えて低減される。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト、および獣医学的対象を含む非ヒト動物を意味する。用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、患者と呼ばれることもある。
本明細書で使用する場合、用語「治療(treat, treating, or treatment)」とは、好ましくは、限定されるものではないが、疾患または病態の１以上の徴候または症状の緩和または改善、疾病程度の軽減、疾病の安定状態（すなわち、増悪しない）、疾病状態の改善または軽減を含む、有益または望ましい臨床結果を得るための行為を意味する。本明細書で使用する場合、治療は、インスリン抵抗性の軽減、インスリン感受性の増強、インスリン欠乏症の低減、ＨｂＡｃ１レベルの改善または正常化、血糖値の改善または正常化、体重低減、腹囲の低減、ＨＤＬレベルの正常化または低減、トリグリセリドレベルの正常化または低減、および糖尿病の少なくとも１つの徴候または症状の改善のうちの１以上を含み得る。治療は、治癒である必要はない。治療転帰は、定量的に決定される必要はない。しかしながら、特定の実施形態では、治療転帰は、ある範囲の終点における、正常値に対しての改善率％を考慮することによって定量することができる。例えば、代謝症候群は、いくつかの尺度（例えば、体重／ＢＭＩ、腹囲、トリグリセリドレベル）の超過および他の尺度の不足（例えば、ＨＤＬコレステロールまたはインスリン応答の不足）によって特徴付けられる。腹囲１００ｃｍの女性は１２ｃｍの超過腹囲を持つことになる（１００ｃｍ−８８ｃｍ、最大正常腹囲）。超過腹囲の２０％の低減は、超過腹囲の２．４ｃｍ減となる。他の値についても同様の計算を行うことができる。ＨＤＬが３０ｍｇ／ｄｌの男性は、２０ｍｇ／ｄｌの不足を持つことになる（男性の正常値は少なくとも５０ｍｇ／ｄｌである）。５ｍｇ／ｄｌから２５ｍｇ／ｄｌへの増加は、ＨＬＤの不足を２５％軽減すると考えられる。
本明細書で使用する場合、「グルコースレベルの低減」とは、正常グルコースレベル、すなわち、１５０ｍｇ／ｄｌ以下のグルコースレベルを達成するために、上昇したグルコースレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて低減することを意味する。望ましくは、グルコースレベルは、正常血糖レベル、すなわち、１５０〜６０ｍｇ／ｄＬの間、１４０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１３０〜７０ｍｇ／ｄＬの間、１２５〜８０ｍｇ／ｄＬの間、好ましくは、１２０〜８０ｍｇ／ｄＬの間に低減される。このようなグルコースレベルの低減は、血液からのグルコースクリアランスに関連する生体活性のいずれか１つを増大させることによって得ることできる。よって、グルコースレベルを低減する能力を有する薬剤は、インスリン産生、分泌、または作用を増大させ得る。インスリン作用は、例えば、末梢組織によるグルコース取り込みを増大させること、および／または肝臓のグルコース産生を低下させることによって増大させることができる。あるいは、本発明の薬剤は、腸からの炭水化物吸収を低下させるか、グルコース輸送体活性を変化させるか（例えば、ＧＬＵＴ４発現、内在活性、もしくは移動を増大させることによる）、インスリン感受性組織の量を増大させるか（例えば、筋肉細胞もしくは脂肪細胞分化を増大させることによる）、または脂肪細胞もしくは筋肉細胞における遺伝子転写を変化させる（例えば、代謝経路遺伝子の脂肪細胞発現からの因子の分泌を変化させる）ことができる。望ましくは、本発明の薬剤は、グルコースクリアランスに関連する２以上の活性を増大させる。
「脂質レベルの低減」とは、正常脂質レベル、すなわち、１５０ｍｇ／ｄｌ以下を達成するために、超過脂質レベルを少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて低減することを意味する。
「インスリンシグナル伝達経路を変化させてグルコースレベルを低下させる」とは、インスリンシグナル伝達に関与する活性のいずれか１つを変化させ（増大または低下させることによる）て、全体的な結果が血漿からのグルコースクリアランスの増大をもたらすようにすることを意味する。例えば、インスリンシグナル伝達経路を変化させて、それにより、インスリン産生、分泌、もしくは作用の増大、末梢組織によるグルコース取り込みの増大、肝臓のグルコース産生の低減、または腸からの炭水化物吸収の低減を引き起こすことが挙げられる。
「治療上有効な量」は、対象において疾患を治療するために十分な量である。治療上有効な量は、１回以上の投与で投与することができる。
「診断する」などは、本明細書で使用する場合、疾患、障害、または病態の徴候または症状などの少なくとも１つの指標の存在に基づいて疾患、障害、または症状を有する対象を特定するための観察、検査または状況に基づく、対象の状態の臨床的またはその他の評価を意味する。一般に、本発明の方法を用いた診断は、本明細書に提供される方法とともに、疾患、障害、または病態の複数の指標に関する対象の観察を含む。診断方法は、疾患が存在する、または存在しないという指標を提供する。一般に、１つだけの診断試験では、治療する対象の疾病状態に関する明確な結論は得られない。
本明細書で使用する場合、「監視する」とは、第１の時点およびその後の第２の時点において対象における疾患の少なくとも１つの徴候または症状を評価し、その病態の１または複数の徴候または症状の重篤度を比較し、その病態が経時的に重篤度を増したか減じたかを決定することと理解される。
用語「投与する(administer, administering or administration)」には、対象の全身に、または対象内または対象上の特定の領域に医薬組成物または薬剤を送達するいずれの方法も含む。特定の実施形態では、薬剤は、経腸投与または非経口投与される。本発明の特定の実施形態では、薬剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、経口、経皮、または粘膜投与される。特定の好ましい実施形態では、薬剤は、静脈投与される。特定の実施形態では、薬剤は、局所または全身投与される。薬剤の投与は、連携して働く複数の人によって遂行することができる。薬剤の投与は、例えば、対象に投与される薬剤を処方すること、および／または自己送達、例えば、経口送達、皮下送達、中心経路を介した静脈送達などによるか、または訓練を受けた専門家による送達、例えば、静脈内送達、筋肉内送達などにより特定の薬剤を摂取するための指示を直接または他者を介して提供することを含む。
用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、対象から単離された類似の流体、細胞、または組織の集合体を意味する。用語「サンプル」には、任意の体液（例えば、尿、血清、血液、リンパ液、婦人科学的流体、嚢胞液、腹水、眼液、ならびに気管支洗浄液および／または腹膜洗浄液により回収される流体）、腹水、組織サンプル（例えば、腫瘍サンプル）または対象由来細胞が含まれる。その他の対象サンプルとしては、涙液、血清、脳脊髄液、糞便、痰、および細胞抽出液が含まれる。特定の実施形態では、サンプルは尿または血清である。別の実施形態では、サンプルは腹水を含まないか、または腹水サンプルではない。一実施形態では、サンプルは細胞を含む。別の実施形態では、サンプルは細胞を含まない。
用語「対照サンプル」は、本明細書で使用する場合、例えば、代謝症候群に罹患していない健常対象由来のサンプル、または早い時点の、例えば治療前、治療の早期段階の対象由来のサンプルを含む、臨床上適切な任意の比較サンプルを意味する。対照サンプルは、キットとともに提供される精製されたサンプル、タンパク質、および／または核酸であり得る。このような対照サンプルは、試験サンプル中のアナライトの定量的測定を可能とするために、例えば、希釈系として希釈することができる。対照サンプルは、１以上の対象に由来するサンプルを含んでよい。対照サンプルはまた、評価する対象から早い時点で作製したサンプルであってもよい。例えば、対照サンプルは、代謝症候群の発症前、疾患の早期段階、または治療もしくは治療の一部を投与する前に、評価する対象から採取したサンプルであり得る。対照サンプルはまた、動物モデル由来のサンプル、または代謝症候群の動物モデルに由来する組織もしくは細胞株であってもよい。一群の測定値からなる対照サンプル中のＨＳＰ９０、例えば、ＨＳＰ９０αおよび／またはＨＳＰ９０β活性または発現のレベルは、例えば、平均値、中央値、または最頻値を含む中心傾向の尺度などの適当な統計学的尺度基づいて決定することができる。
用語「対照レベル」は、対象または対象サンプルにおける代謝障害の徴候の受け入れられているまたは所定のレベルを意味する。下記レベルが正常レベルとみなされる：
１２０／８０ｍｍＨｇ以下の血圧；
１００ｍｇ／ｄＬ以下の空腹時血糖；
男性では４０インチ（１０２ｃｍ）未満、女性では３５インチ（８８ｃｍ）未満の腹囲；
女性では少なくとも５０ｍｇ／ｄＬ、男性では少なくとも４０ｍｇ／ｄＬのＨＤＬ；
１５０ｍｇ／ｄｌ以下のトリグリセリド；
５．７％以下のＨｂＡ１ｃ；
１４０ｍｇ／ｄｌ以下の経口ブドウ糖負荷試験。
本明細書で使用する場合、用語「得る」とは、製造する、購入する、またはそうでなければ取得することを意味すると理解される。
本明細書で使用する場合、「検出する」、「検出」などは、サンプル中の特定のアナライト、例えば、サンプル中のＨＳＰ９０、例えば、ＨＳＰ９０αおよび／またはＨＳＰ９０βの発現または活性レベルを同定するために行われるアッセイを意味すると理解される。サンプルにおいて検出されるアナライトまたは活性の量は、存在しない場合も、またはそのアッセイもしくは方法の検出レベルを下回る場合をもあり得る。
用語「調節する」または「調節」は、レベルのアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）、ダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）、またはこの２つの組合せまたは単独を意味する。「モジュレーター」は、調節を行う化合物または分子であり、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、アクチベーター、スティミュレーター、サプレッサー、またはインヒビターであり得る。
用語「発現」は、ポリペプチドがＤＮＡから産生されるプロセスを意味して本明細書で使用される。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびこのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。使用される文脈に応じて、「発現」は、ＲＮＡ、またはタンパク質、またはその両方の産生を意味し得る。
用語「遺伝子の発現のレベル」または「遺伝子発現レベル」は、ｍＲＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡ新生転写産物、転写産物プロセシング中間体、成熟ｍＲＮＡおよび分解産物のレベル、または細胞内の遺伝子によりコードされているタンパク質のレベルを意味する。
本明細書で使用する場合、「活性のレベル」は、定量的、半定量的、または定性的アッセイで決定されるタンパク質活性、一般には、酵素活性の量と理解される。活性は一般に、容易に検出可能な産物、例えば、有色産物、蛍光産物、または放射性産物を生成する基質を用いたアッセイにおいて、生成される産物の量を監視することによって決定される。実施される特定のアッセイは、例えば、測定する活性によって異なる。
冠詞「１つの(a, an)」および「その(the)」は、反対のことが明示されていない限り、その冠詞の、１または１を超える（すなわち、少なくとも１つの）文法的目的語を意味して本明細書で使用される。例として、「１つの要素(an element)」は、１つの要素または１を超える要素を意味する。
用語「含む」は、「限定されるものではないが、含む」という句を意味して本明細書で使用され、この句と互換的に使用される。
用語「または」は、そうではないことが明示されない限り、用語「および／または」を意味して本明細書で使用され、それと互換的に使用される。
用語「など」は、「限定されるものではないが〜など」を意味して本明細書で使用され、それと互換的に使用される。
具体的には述べられていないか、または文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する場合、用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差内と理解される。約は、示された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％内と理解することができる。文脈からそうではないことが明らかでない限り、本明細書に示される全ての数値は、約という用語によって修飾することができる。
本明細書における変数のいずれの定義においても、化学基の一覧の列挙は、任意の単一の基または列挙されている基の組合せとしての変数を含む。本明細書における変数または態様に関する具体例の列挙は、任意の単一の具体例または他の任意の具体例もしくはその一部と組合せとしての具体例を含む。
本明細書に提供されるいずれの組成物または方法も、本明細書に提供される他の組成物および方法のいずれか１以上と組み合わせることができる。
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からのいずれの数字、数字の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
以下、本発明の好ましい実施形態を詳細に挙げる。本発明を好ましい実施形態に関して記載するが、本発明をそれらの好ましい実施形態に限定することは意図されないと理解される。対照的に、代替、改変、および等価物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれ得るので、包含されることが意図される。
Ｉ．代謝症候群
代謝症候群（Ｘ症候群）は、冠動脈疾患、卒中、および２型糖尿病と併発し、これらのリスクを高める一群のリスク因子の名称である(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0004546/)。代謝症候群は、米国でますます多くなってきている。研究者はこの症候群がただ１つの原因によるものかどうか確証を持っていないが、この症候群のリスクの全てが肥満症に関連している。本明細書で使用する場合、代謝症候群は、インスリン抵抗性、インスリン欠乏症、前糖尿病、２型糖尿病、および肥満症を含むと理解される。以下の診断基準を満たす対象も、代謝症候群を有すると理解される。本発明のいくつかの実施形態では、代謝症候群はまた、１型糖尿病も含み得る。他の実施形態では、代謝症候群は、１型糖尿病を含まない。
代謝症候群の最も重要な２つのリスク因子は、身体の中央部および上部周辺の太りすぎ（中心性肥満）、および身体がインスリンを効果的に使用できないインスリン抵抗性である。インスリンは体内の糖の量を制御する。身体が十分なインスリンを産生しない、および／または身体が産生されるインスリンのレベルに応答しない対象では、血糖および脂肪レベルが上昇する。代謝症候群のその他のリスク因子としては、加齢、遺伝的因子、ホルモン変化、および座りがちなライフスタイルが含まれる。代謝症候群を有する人は、過度な血液凝固および低い全身炎症レベルの一方または両方を患っている場合が多く、両方とも病態を増悪させ得る。
米国心臓協会(American Heart Association)および米国国立心臓・肺・血液研究所(National Heart, Lung, and Blood Institute)は、代謝症候群は下記徴候：
・１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧
・１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖（グルコース）
・大きな腹囲（ウエスト周囲の長さ）：
男性−４０インチ以上
女性−３５インチ以上
・低ＨＤＬコレステロール：
男性−４０ｍｇ／ｄＬ未満
女性−５０ｍｇ／ｄＬ未満
・１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
のうちの３つ以上を有する対象に存在するとみなしている。
治療は、血圧、ＬＤＬコレステロール、および血糖の低減、例えば、体重減少、運動増加を助けるための、推奨されるライフスタイルの変更または薬剤を含む。血圧およびコレステロールはまた、適当な薬物を用いて調節することもできる。
心血管疾患および２型糖尿病を発症する高い長期リスクを有することに加え、代謝症候群の合併症は、アテローム性動脈硬化症、心臓発作、腎臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、末梢動脈疾患、および卒中、ならびに糖尿病に一般に伴う合併症をさらに含む。
Ａ．糖尿病、インスリン抵抗性、およびインスリン欠乏症
真性糖尿病（ＤＭ）(単に糖尿病と呼ばれることが多い）は、体が十分なインスリンを産生しないか、または産生されるインスリンに細胞が応答しないかのいずれかのために、その人が高血糖を有する、一群の代謝疾患である。この高血糖は、多尿（頻尿）、多飲症（口渇の増大）および多食症（空腹の増大）の古典的症状を生じる。
２型糖尿病は、細胞がインスリンを適切に使用することができず、絶対的インスリン欠乏を合併することもある病態であるインスリン抵抗性から生じる。インスリンに対する身体組織の反応性の欠陥は、少なくとも一部には、インスリン受容体を含むと考えられている。しかしながら、具体的な欠陥は分かっていない。
初期段階の２型糖尿病では、主要な異常はインスリン感受性の低下である。この段階では、高血糖症は、インスリン感受性を改善するか、または肝臓によるグルコース産生を低減する様々な手段および投薬によって逆転させることができる。前糖尿病は、その人の血糖値が正常よりも高いが、２型糖尿病と診断されるほど高くはない場合に起こる病態を示す。
２型糖尿病は、インスリン抵抗性の状況下でβ細胞からの不十分なインスリン産生によるものである。細胞が正常レベルのインスリンに適切に応答することができないインスリン抵抗性は、主として筋肉、肝臓および脂肪組織内で起こる。肝臓では、インスリンは通常、グルコース放出を抑制する。しかしながら、インスリン抵抗性の状況下では、肝臓は血中に不適切にグルコースを放出する。β細胞の不全に対するインスリン抵抗性の割合は個体間で異なり、主要にインスリン抵抗性を有するがインスリン分泌には軽微な欠陥しか持たない個体もあれば、インスリン抵抗性はわずかであり、主要にはインスリン分泌が欠如している個体もある。
２型糖尿病およびインスリン抵抗性に関連する他の可能性のある重要な機構としては、脂肪細胞内での脂質の分解、インクレチンに対する抵抗性およびインクレチンの欠如、血中の高グルカゴンレベル、腎臓による塩および水の保持の増加、ならびに中枢神経系による代謝の不適切な調節が含まれる。しかしながら、膵臓β細胞によるインスリン分泌の障害も必要とされるので、インスリン抵抗性を有する全ての人が糖尿病を発症するわけではない。
１型糖尿病は、身体のインスリン産生不全から起こり、現在のところ、注射可能なインスリンによる治療を必要とする。１型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の欠如を特徴とし、インスリン欠乏症をもたらす。ほとんどの罹患者はそれ以外の点では健康であり、発症が見られた時には健常な体重である。インスリンに対する感受性および反応性は通常、特に初期段階では正常である。しかしながら、特に後期段階では、インスリン抵抗性が見られ得る。
Ｂ．糖尿病、インスリン抵抗性、およびインスリン欠乏症の続発病状
１型および２型両方の糖尿病、インスリン抵抗性、およびインスリン欠乏症から生じる異常なグルコース調節は続発病状に関連し、それらの多くは循環不良に起因する。このような続発病状には、黄斑変性、末梢神経障害、潰瘍および創傷治癒の低下、ならびに腎機能の低下が含まれる。グルコースレベルおよび／またはＨｂＡｃ１レベルを正常範囲内に維持することは、これらの続発病状の発生を低下させることが示唆されている。血糖、インスリン、およびＨｂ１Ａｃレベルの正常化は、原発病状、例えば代謝症候群を限定することによって続発病状の発生を低下させると理解される。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＨＳＰ９０β阻害剤およびＨＳＰ９０β特異的阻害剤は、糖尿病および代謝症候群に関連する続発病状の治療に使用されない。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＨＳＰ９０β阻害剤およびＨＳＰ９０β特異的阻害剤は、糖尿病および代謝症候群に関連する続発病状の治療に使用される。
ＩＩ．用量および投与方法
投与の技術および用量は、化合物のタイプ（例えば、化学化合物、抗体、または核酸）によって異なり、当業者に周知であるか、または容易に決定される。
本発明の治療化合物は、単位投与形において薬学上許容される希釈剤、担体、または賦形剤とともに投与してよい。投与は、非経口、静脈内、皮下、経口、局所、または局部であり得る。薬剤の投与は、連携して働く複数の人によって遂行することができる。薬剤の投与は、例えば、対象に投与される薬剤を処方すること、および／または自己送達、例えば、経口送達、皮下送達、中心経路を介した静脈送達などによるか、または訓練を受けた専門家による送達、例えば、静脈内送達、筋肉内送達、腫瘍内送達などにより特定の薬剤を摂取するための指示を直接または他者を介して提供することを含む。
本組成物は、経口投与には丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、もしくは徐放性錠剤；または静脈内、皮下、もしくは非経口投与には液体；または局所投与にはポリマーもしくはその他の徐放性ビヒクルの形態であり得る。
製剤を作製するために当技術分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見出される。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、無菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有し得る。化合物の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用してよい。化合物の生体分布を制御するために、ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用してよい。他の可能性のある有用な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入系、およびリポソームが含まれる。製剤中の化合物濃度は、投与する薬物の用量および投与経路を含む複数の因子によって異なる。
本化合物は、所望により、製薬工業で慣用される無毒な酸付加塩または金属錯体などの薬学上許容される塩として投与してもよい。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が含まれる。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが含まれる。
経口使用のための製剤としては、無毒な薬学上許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または増量剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、流動促進剤、および粘着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油、またはタルク）であり得る。経口使用のための製剤はまた、咀嚼錠として、または有効成分が不活性固体希釈剤と混合されているゼラチン硬カプセル剤として、または有効成分が水または油性媒体と混合されているゼラチン軟カプセル剤として提供してもよい。
化合物を投与する用量および時機は、対象の健康状態および疾患、例えば糖尿病、代謝症候群の症状の重篤度を含む様々な臨床因子によって異なる。
ＩＩＩ．核酸治療薬
核酸治療薬は当技術分野で周知である。核酸治療薬としては、細胞内の標的配列と相補的な一本鎖および二本鎖（すなわち、少なくとも１５ヌクレオチド長の相補的領域を有する核酸治療薬）両方の核酸を含む。核酸治療薬は、例えば、核酸を単独でまたは細胞への核酸取り込みを促進するための薬剤とともに培養培地に加えることにより、培養細胞に送達することができる。核酸治療薬は、任意の投与経路によって対象の、すなわちｉｎ ｖｉｖｏの細胞に送達することができる。具体的な製剤は投与経路によって異なる。
本明細書で使用する場合、特に断りのない限り、用語「相補的」は、当業者に理解されているように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連付けて述べるために用いられる場合に、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成できることを意味する。このような条件は例えばストリンジェント条件であり得、ここで、ストリンジェント条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、その後、洗浄を含み得る。生物体内で遭遇し得るような生理学的に適切な条件などの他の条件も適用可能である。当業者ならば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件セットを決定することができよう。
配列は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の全長にわたって第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列のヌクレオチドとの塩基対合が存在する場合、それぞれに関して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、本明細書では、第１の配列は、第２の配列に対して「実質的に相補的」と言われる場合、これら２配列は完全に相補的であり得、またはこれら２配列は、それらの最終的な適用に最も適切な条件下でのハイブリダイズ能を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１以上の、しかしながら一般に、４、３または２以下の、ミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に、二本鎖核酸治療薬で一般的なように、１以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチと見なされるべきでない。例えば、２１ ヌクレオチド長のあるオリゴヌクレオチドと２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ（この場合、長い方のオリゴヌクレオチドは、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む）は、本明細書における記載の目的では、やはり「完全に相補的」と言える。
「相補的」配列は、本明細書で使用する場合、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン−クリック型塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでもよく、あるいはそれらの塩基対から完全に形成されてもよい。このような非ワトソン−クリック型塩基対としては、限定されるものではないが、Ｇ：Ｕゆらぎ(Wobble)またはフーグスティーン(Hoogstein)型塩基対形成が含まれる。
本明細書において用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらが用いられている文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス核酸もしくはアンチセンス鎖と標的配列の間の塩基のミスマッチに関して使用され得る。
本明細書で使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む、対象ｍＲＮＡ（例えば、ＨＳＰ９０、特にＨＳＰ９０βをコードする）ｍＲＮＡの連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＨＳＰ９０、特にＨＳＰ９０βをコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的であれば、ＨＳＰ９０β ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
アンチセンス核酸、化学修飾、および治療的使用に対する特許は、例えば、化学的に修飾されたＲＮＡ含有治療化合物に関する米国特許第５，８９８，０３１号、およびこれらの化合物を治療薬として使用する方法に関する米国特許第６，１０７，０９４号に与えられている。一本鎖化学修飾ＲＮＡ様化合物を投与することにより患者を治療する方法に関する米国特許第７，４３２，２５０号；および一本鎖化学修飾ＲＮＡ様化合物を含有する医薬組成物に関する米国特許第７，４３２，２４９号。米国特許第７，６２９，３２１号は、複数のＲＮＡヌクレオシドと少なくとも１つの化学修飾を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて標的ｍＲＮＡを切断する方法に関する。本段落に列挙した特許はそれぞれ、参照により本明細書の一部とされる。
治療核酸は、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、またはＴ）または修飾（７−デアザグアノシン、イノシンなど）塩基を含み得る。さらに、ヌクレオチド内の塩基は、ハイブリダイゼーションに干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結されていてもよい。従って、阻害核酸は、構成塩基がホスホジエステル結合でないペプチド結合によって連結されているペプチド核酸であり得る。阻害核酸は、既知の方法（例えば、Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology Wiley 1999参照）を用いてＲＮＡからｃＤＮＡへ変換することによって作製し得る。阻害核酸はまたｃＲＮＡであってもよい（例えば、Park et. al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 325(4):1346-52参照）。
治療核酸は、ホスホラミダイト法、Ｈ−ホスホン酸法、およびホスファイトトリメステル(phosphite trimester）法などの合成法から作製することができる。阻害核酸はまた、ＰＣＲ法によって作製することもできる。このような方法は、ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ配列を生成する。治療核酸の合成方法は、本発明の限定条件でない。
核酸治療薬は一般に、それらの安定性を高めるため、またそれらの薬物動態特性および薬力学的特性を調整するために１以上の化学修飾を含む。例えば、ヌクレオチドに対する修飾としては、限定されるものではないが、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、およびそれらの組合せを含み得る。
核酸治療薬はさらに、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾は、（センス鎖を含む核酸治療薬では）センス鎖またはアンチセンス鎖またはその両方の、鎖のどの位置において、どのヌクレオチドに存在してもよい。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在してもよく；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含んでもよい。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても異なっていてもよく、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに比べてシフトを持っていてもよい。
他の修飾としては、リボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ）ならびにデオキシリボ核酸（すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）中に見られる標準的な塩基、糖および／またはリン酸骨格化学構造の変異体である修飾塩基（または修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド）の組み込みを含む。例えば、Ｇｍ（２’−メトキシグアニル酸）、Ａｍ（２’−メトキシアデニル酸）、Ｃｆ（２’−フルオロシチジル酸）、Ｕｆ（２’−フルオロウリジル酸）、Ａｒ（リボアデニル酸）がこの範囲内に含まれる。アプタマーはまた、シトシン、または５−メチルシトシン、４−アセチルシトシン、３−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、２−チオシトシン、５−ハロシトシン（例えば、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、および５−ヨードシトシン）、５−プロピニルシトシン、６−アゾシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、フェノキサジンシチジン、フェノチアジンシチジン、カルバゾールシチジンまたはピリドインドールシチジンを含む任意のシトシン関連塩基も含み得る。アプタマーはさらに、グアニン、または６−メチルグアニン、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、６−プロピルグアニン、８−ハログアニン（例えば、８−フルオログアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、および８−ヨードグアニン）、８−アミノグアニン、８−スルフヒドリルグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、７−メチルグアニン、８−アザグアニン、７−デアザグアニンまたは３−デアザグアニンを含む任意のグアニン関連塩基も含み得る。アプタマーはなおさらに、アデニン、または６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、８−ハロアデニン（例えば、８−フルオロアデニン、８−ブロモアデニン、８−クロロアデニン、および８−ヨードアデニン）、８−アミノアデニン、８−スルフヒドリルアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、７−メチルアデニン、２−ハロアデニン（例えば、２−フルオロアデニン、２−ブロモアデニン、２−クロロアデニン、および２−ヨードアデニン）、２−アミノアデニン、８−アザアデニン、７−デアザアデニンまたは３−デアザアデニンを含む任意のアデニン関連塩基も含み得る。また、ウラシル、または５−ハロウラシル（例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、１−メチルシュードウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾウラシル、または４−チオウラシルを含む任意のウラシル関連塩基も含まれる。
当技術分野で公知の他の修飾塩基変異体の例としては、限定されるものではないが、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウリジン、２’−メトキシシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、ｂ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、ｂ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレオニン、ウリジン(urdine)−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−ｂ−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、およびワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンが含まれる。
また、米国特許第３，６８７，８０８号、同第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、および同第５，６８１，９４１号に記載されている修飾核酸塩基も含まれ、これらはそれぞれ参照によりその全内容が本明細書の一部とされる。当技術分野で公知の修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド糖骨格変異体の例としては、限定されるものではないが、例えば、Ｆ、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｏ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｏ（Ｃ２−１０アルキニル）、Ｓ（Ｃ１−１０アルキル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルケニル）、Ｓ（Ｃ２−１０アルキニル）、ＮＨ（Ｃ１−１０アルキル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルケニル）、ＮＨ（Ｃ２−１０アルキニル）、およびＯ−アルキル−Ｏ−アルキルなどの２’リボシル置換基を有するものが含まれる。望ましい２’リボシル置換基としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−−ＣＨ２-ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−置換基はアラビノ（上）位またはリボ（下）位にあってよい。
Ａ．一本鎖核酸治療薬
アンチセンス核酸治療薬は、一本鎖核酸治療薬であり、一般に約１６〜３０ヌクレオチド長であり、培養系または生物体内いずれかの標的細胞中の標的核酸配列に相補的である。
別の態様では、本薬剤は、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に相補的である。アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡと塩基対を形成して翻訳機構を物理的に妨害することによって翻訳を化学量論的に阻害する、Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355参照。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡに相補的な約１５〜３０ヌクレオチドを持ち得る。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡに相補的な少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える連続するヌクレオチドの配列を持ち得る。
アンチセンス核酸、化学修飾、および治療的使用に対する特許は、例えば、化学修飾ＲＮＡ含有治療化合物に関する米国特許第５，８９８，０３１号、およびこれらの化合物を治療薬として使用する方法に関する米国特許第６，１０７，０９４号に与えられている。一本鎖化学修飾ＲＮＡ様化合物を投与することにより患者を治療する方法に関する米国特許第７，４３２，２５０号；および一本鎖化学修飾ＲＮＡ様化合物を含有する医薬組成物に関する米国特許第７，４３２，２４９号。米国特許第７，６２９，３２１号は、複数のＲＮＡヌクレオシドと少なくとも１つの化学修飾を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて標的ｍＲＮＡを切断する方法に関する。本段落に列挙した各特許の全内容は、参照により本明細書の一部とされる。
Ｂ．二本鎖核酸治療薬
本発明の核酸治療薬はまた、二本鎖核酸治療薬も含む。本明細書で互換的に使用される「ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、「ｄｓＲＮＡ剤」、「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｉＲＮＡ剤」とも呼ばれ、逆平行で、かつ以下に定義されるように実質的に相補的な２本の核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書に記載されるように、一方または両方の鎖は、１以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。さらに、本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉ剤は、ｄｓｉＲＮＡも含み得る（例えば、参照により本明細書の一部とされる米国特許公報第２００７０１０４６８８号参照）。一般に、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでよく；ＲＮＡｉ剤は複数のヌクレオチドに実質的修飾を含んでよい。このような修飾は、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型の分子で使用される場合、このような修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲の目的で、「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
この二重鎖構造を形成する２本の鎖は、１本のより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはその２本の鎖は、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大きい分子の部分である、従って、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間を中断されないヌクレオチド鎖によって接続されている場合、接続しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端の間を中断されないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合的に接続されている場合、接続している構造は「リンカー」と呼ばれる。これらのＲＮＡ鎖は同数または異数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡのうち最短の鎖のヌクレオチドから二重鎖に存在するオーバーハングを差し引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。用語「ｓｉＲＮＡ」もまた、上記のようなＲＮＡｉ剤を意味して本明細書で使用される。
多くの実施形態において、二重鎖領域は１５〜３０ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二重鎖領域は１７〜２３ヌクレオチド対の長さ、１７〜２５ヌクレオチド対の長さ、２３〜２７ヌクレオチド対の長さ、１９〜２１ヌクレオチド対の長さ、または２１〜２３ヌクレオチド対の長さである。
特定の実施形態では、各鎖は１５〜３０ヌクレオチドを有する。
本発明の方法で使用されるＲＮＡｉ剤としては、例えば、２０１１年１１月１８日出願の米国仮出願第６１／５６１，７１０号、２０１０年９月１５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５１５９７号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０７３８０９（これらのそれぞれの全内容は参照により本発明の一部とされる）に開示されているような化学修飾を有する薬剤が含まれる。用語「アンチセンス鎖」は、標的配列（例えば、ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡ）に実質的に相補的な領域を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖を意味する。本明細書で使用する場合、用語「トランスチレチンをコードするｍＲＮＡの部分に相補的な領域」とは、ＴＴＲ ｍＲＮＡ配列の部分に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチは末端領域で最も許容され、存在する場合、一般に末端の１または複数の領域、例えば、５’末端および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド内にある。
用語「センス鎖」は、本明細書で使用する場合、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を意味する。
ＩＶ．診断および治療抗体
本発明の診断方法および治療方法は両方とも、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む抗体の使用を含み得る。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用する場合、特定のエピトープと免疫反応し得る一種類の抗原結合部位だけを含む抗体分子の集団を意味する。本発明で使用するための抗体としては、ＨＳＰ９０と結合する抗体、好ましくは、ＨＳＰ９０β特異的な抗体が含まれる。抗体は、商業ソースから入手可能であるか、または公知の方法を用いて生産することができる。
ポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質を免疫原として用いて好適な対象を免疫することによって作製することができる。免疫対象の抗体力価は、固定化ポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるなど、標準的な技術によって経時的に監視することができる。免疫誘導後の適当な時点で、例えば、特異的抗体力価が最高になった際に、抗体産生細胞を対象から得、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72参照）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985参照）またはトリオーマ技術などの標準的技術によってモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するために使用することができる。ハイブリドーマを生産するための技術は周知である（一般に、Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994参照）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清を目的のポリペプチドと結合する抗体に関してスクリーニングすることによって検出される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）を目的のポリペプチドでスクリーニングすることにより、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体を同定し単離することもできる。ファージディスプレーライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰファージディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーを作製しスクリーニングする際の使用に特に従いやすい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０２８０９号；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734に見出すことができる。
また、目的タンパク質と特異的に結合する組換え抗体も本発明の方法で使用可能である。好ましい実施形態では、組換え抗体は、目的タンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合する。組換え抗体としては、限定されるものではないが、ヒトおよび非ヒトの両方の部分を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体、一本鎖抗体および多重特異性抗体が含まれる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、ネズミｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号参照、参照によりそれらの全内容は本明細書の一部とされる）。一本鎖抗体は、１つの抗原結合部位を有し、単一のポリペプチドからなる。一本鎖抗体は、当技術分野で公知の技術により、例えば、Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第４，９４６，７７８号（参照によりその全内容が本明細書の一部とされる）；Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105;およびHuston et al., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88に記載されている方法を用いて作製することができる。多重特異性抗体は、異なる抗原と特異的に結合する少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体分子である。このような分子は、当技術分野で公知の技術によって、例えば、Ｓｅｇａｌ，米国特許第４，６７６，９８０号（その開示は参照によりその全内容が本明細書の一部とされる）；Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026および米国特許第６，１２１，４２４号に記載されている方法を用いて作製することができる。
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号参照、参照によりその全内容が本明細書の一部とされる）。ヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０２６７１号；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214;米国特許第５，２２５，５３９号; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534;およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いて作製することができる。
より詳しくは、ヒト化抗体は、例えば、内因性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて製造することができる。このトランスジェニックマウスを、常法にて、選択された抗原、例えば、本発明のマーカーに相当するポリペプチドの全部または一部で免疫する。この抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスによって担持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞分化時に再構成し、次いで、クラス転換および体細胞突然変異を受ける。よって、このような技術を用い、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概観については、Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体の生産するための本技術およびこのような抗体を生産するためのプロトコールに関する詳細な考察については、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照。さらに、上記のものと類似の技術を用い、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することを保証し得る会社もある。
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイデッド・セレクション(guided selection)」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。このアプローチでは、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするために、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、ネズミ抗体を用いる(Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903)。
本発明の抗体は、生産後に（例えば、対象の血液または血清から）または合成後に単離し、周知の技術によってさらに精製することができる。例えば、ＩｇＧ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製することができる。本発明のタンパク質に特異的な抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、選択または（例えば、部分的精製）または精製することができる。例えば、組換え発現され精製された（または部分的に精製された）本発明のタンパク質を本明細書に記載されるように生産し、例えばクロマトグラフィーカラムなどの固相支持体に共有結合的または非共有結合的に結合させる。次に、このカラムを用いて、多数の異なるエピトープに対する抗体を含有するサンプルから本発明のタンパク質に特異的な抗体をアフィニティー精製し、それにより、実質的に精製された抗体組成物、すなわち、夾雑抗体を実質的に含まないものを生成する。実質的に精製された抗体組成物とは、本文脈において、その抗体サンプルが本発明の所望のタンパク質のエピトープ以外のエピトープに対する夾雑抗体をせいぜい３０％（乾重による）しか含まないこと、好ましくは、サンプルのせいぜい２０％、さらにより好ましくは、せいぜい１０％、最も好ましくは、せいぜい５％（乾重による）が夾雑抗体であることを意味する。精製抗体組成物とは、その組成物中の抗体の少なくとも９９％が本発明の所望のタンパク質に対するものでさることを意味する。
タンパク質に対する抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によってタンパク質を単離するために使用することができる。さらに、このような抗体は、マーカーの発現レベルおよび発現パターンを評価する目的で、マーカータンパク質、例えば、ＨＳＰ９０β、またはそのフラグメント（例えば、細胞溶解液または細胞上清中）を検出するために使用することもできる。これらの抗体はまた、例えば、与えられた治療計画の有効性を決定するための臨床試験手順の一環として、組織または体液（例えば、疾病状態または毒性状態に関連する体液）中のタンパク質レベルを監視するために診断的に使用することもできる。検出は、検出可能な物質に結合させた本発明の抗体を含む抗体誘導体の使用によって容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例としては、ルミノールが含まれ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
抗体はまた、代謝症候群および／または糖尿病を治療する上で治療薬として使用することもできる。
Ｖ．ＨＳＰ９０の小分子阻害剤
ＨＳＰ９０の小分子阻害剤としては、限定されるものではないが、ゲルダナマイシン（ＧＭ）類似体（例えば、
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 が含まれる。
それらの作用機序にもよるが、例えば、ゲルダナマイシンなどのいくつかの小分子阻害剤は、好ましくは、Ｎ末端ＡＴＰ結合ドメインにおいてＡＴＰの結合および／または加水分解に干渉することによってＨＳＰ９０を阻害する（参照により本明細書の一部とされるSausville, et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43: 199-231参照）。例えば、ノボビオシンなどの他のＨＳＰ９０阻害剤は、Ｃ末端ＡＴＰ結合ドメインにおいてＡＴＰの結合および／または加水分解に干渉することによってＨＳＰ９０を阻害する（参照により本明細書の一部とされるMarcu, et al., J Biol Chem 2000; 275: 37181-37186）。全てではないがＨＳＰ９０阻害剤は、Ｈｓｐ９０タンパク質のいずれかのＡＴＰ結合部位と相互作用することによってＨＳＰ９０に作用する。このようなＨＳＰ９０阻害剤の例としては、ＫＵ１７４、クメルマイシンＡ１、セラストロール、ゲデュニン、Ｈ２−ガメンダゾール、およびガメンダゾールが含まれる（参照により本明細書の一部とされるMatts, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692およびTash, et al., Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152参照）。これらの阻害剤のうち、例えば、セラストロールは、Ｈｓｐ９０とキナーゼコシャペロンＣｄｃ３７の間の相互作用を乱してＨｓｐ９０を効果的に無力にする（参照により本明細書の一部とされるMatts, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 19 (2011) 684-692参照）。
例えば、ゲルダナマイシンおよびＮＶＰ−ＨＳ９９０などの多くの既知のＨＳＰ９０阻害剤は、ＨＳＰ９０αアイソフォームとＨＳＰ９０β アイソフォームの両方を阻害する。他の阻害剤は、ＨＳＰ９０βに特異的なガメンダゾールおよびＨ２−ガメンダゾールのように、２つのアイソタイプのうち一方に向性を示す（Tash, et al., Biology of Reproduction 2008; 78, 1139-1152参照）。加えて、ＨＳＰ９０βは、ＨＳＰ９０αよりもラディシコールに感受性が高い（参照により本明細書の一部とされるMillson et al., FEBS J 2007; 274, 4453-4463参照）。さらに、ＨＳＰ９０βに特異的な新規な阻害剤を既知のＨＳＰ９０β阻害剤から選択することができ、あるいはガメンダゾールなどの既知の特異的阻害剤を改変することにより、または当業者ならば、ＨＳＰ９０βとＨＳＰ９０β特異的阻害剤、例えば、ガメンダゾール(gamendazol)、の共結晶学によって決定された結合ドメインに基づいて阻害剤を設計することにより開発することができる。
ＨＳＰ９０β特異的阻害剤である上述のガメンダゾールは、ロニダミンの類似体である。ロニダミン類似体は当技術分野で公知である。ロニダミン類似体のいくつかの限定されない例がＷＯ２００６／０２３７０４およびＷＯ２０１１／００５７５９（両方とも全内容が参照により本明細書の一部とされる）に記載されており、下式：
Figure 2015520170
 ［式中、Ｒ１は、カルボキシル、
Figure 2015520170
 、またはカルボン酸ヒドラジドであり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、アルコール、アルキル、アルコキシ、アラルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、またはカルボキシルであり；
ＸおよびＹは、互いに同じまたは異なり、ハロゲンまたは低級アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４は独立に、窒素または炭素である］
ならびにその薬学上許容される塩およびエステル、で表される。
このようなロニダミン類似体の例としては、
６−クロロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸メチルエステル；
６−フルオロ−１−（２，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−トリフルオロメトキシ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−プロピオン酸；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−イル］アクリル酸（ＴＨ２−１９２）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸（ＴＨ２−１７８）；
１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＴＨ２−１７９）；
３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−イル］−アクリル酸（ＪＷＳ１−１９０）；
１−（２−クロロ−４−フルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ２−２２）；および
１−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−クロロ−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸ヒドラジド（ＪＷＳ１−２８２）
が含まれる。
さらなるロニダミン類似体はＷＯ２００６／０１５２６３およびＷＯ２００６／０１５１９１、ならびにMok et al., Reproduction, 2011, 141, 571-580（それぞれ参照により本明細書の一部とされる）にさらに記載されている。このようなロニダミン類似体の例としては、ロニダミン(lonidamin)、アジュジン(Adjudin)（ＡＦ−２３６４）、ＡＦ２７８５、およびＣＤＢ−４０２２が含まれる。
クメルマイシンおよびクメルマイシンＡ１のいくつかの類似体が、ＷＯ２００１／８７３０９およびＷＯ２０１２／１６２０５４（両方とも参照により本明細書の一部とされる）に記載されている。なお、クメルマイシン(cumermycin)類似体は、下式：
Figure 2015520170
 で表され、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、およびＹ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、直鎖脂肪族、分岐脂肪族、環式脂肪族、複素環式脂肪族、置換脂肪族、非置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、複素芳香族、アミン、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、糖、糖模倣体、それらの誘導体、またはそれらの組合せから独立に選択される部分を含み、前記脂肪族基は、約０〜２０個の炭素もしくはヘテロ原子またはＯ、Ｎ、ＳもしくはＰの炭素鎖を有し；かつ
リンカーは、直鎖脂肪族、分岐脂肪族、環式脂肪族、複素環式脂肪族、置換脂肪族、非置換脂肪族、飽和脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、多環芳香族、置換芳香族、複素芳香族、アミン、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、脂肪族アミン、カルボニル、カルボキシル、アミド、エステル、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、糖、糖模倣体、それらの誘導体、またはそれらの組合せを含む。
クメルマイシン類似体の例は、下式：
Figure 2015520170
 で表され、式中、Ｘは、分子の２つの半分を接続する約１〜約５４原子を含むリンカーである。
セラストロールおよびゲンデュニン(gendunin)のいくつかの類似体がＷＯ２００７／１１７４６６（参照により本明細書の一部とされる）に記載されている。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０の小分子阻害剤は、ＨＳＰ９０βを阻害する。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０の小分子阻害剤は、ＨＳＰ９０βを特異的に阻害する。
ＶＩ．代謝症候群の診断方法
本発明はさらに、対象を、代謝症候群および／または糖尿病を有するまたは有するリスクがあると特定する方法であって、対象由来のサンプルにおけるマーカータンパク質および／または核酸の発現のレベルを検出することを含む方法を提供する。
生体サンプルにおいてマーカータンパク質または核酸、例えば、ＨＳＰ９０、特に、ＨＳＰ９０β、の有無を検出するための例示的方法は、試験対象から生体サンプル（例えば、組織サンプル）を得ること、およびその生体サンプルを、そのポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）を検出することができる化合物または薬剤と接触させることを含む。よって、本発明の検出方法は、例えば、代謝症候群の診断のためにｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏにおいて、生体サンプル中のｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。マーカータンパク質の検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が含まれる。ゲノムＤＮＡの検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＲＮＡの検出のためのｉｎ ｖｉｖｏ技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、マーカータンパク質の検出のためのｉｎ ｖｉｖｏ技術としては、該タンパク質またはそのフラグメントに対する標識抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、該抗体は放射性マーカーで標識することができ、対象におけるその存在および位置は標準的なイメージング技術によって検出することができる。
このような診断および予後アッセイの一般原理は、マーカーとプローブを含有し得るサンプルまたは反応混合物を、該マーカーとプローブを相互作用および結合させて、反応混合物において取り出すことができる、かつ／または検出することができる複合体を形成させるのに適当な条件下かつ十分な時間、調整することを含む。これらのアッセイは、様々な方法で行うことができる。
例えば、このようなアッセイを行うための１つの方法は、基板とも呼ばれる固相支持体にマーカーまたはプローブを固定すること、および反応の終了時に固相に固定された標的マーカー／プローブ複合体を検出することを含む。このような方法の一実施形態では、マーカーの存在および／または濃度に関してアッセイする対象由来のサンプルを担体または固相支持体に固定することができる。別の実施形態では、逆の状況が可能であり、プローブを固相に固定することができ、対象由来のサンプルをアッセイの非固定成分として反応させることができる。
アッセイ成分を固相に固定するために確立された方法は多数ある。これらには、限定されるものではないが、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを介して固定化されるマーカーまたはプローブ分子が含まれる。このようなビオチン化アッセイ成分は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から当技術分野で公知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ロックフォード、ＩＬ）を用いて調製し、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル内に固定化することができる。特定の実施形態では、アッセイ成分が固定化された表面を予め調製し、保存することができる。
このようなアッセイのための他の好適な担体または固相支持体は、マーカーまたはプローブが属す分子種と結合し得る任意の材料を含む。周知の支持体または担体としては、限定されるものではないが、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、およびマグネタイトが含まれる。
上述のアプローチを用いてアッセイを行うためには、非固定化成分を、第２の成分が固定された固相に加える。反応が完了した後、複合体を形成しなかった成分を、形成された複合体が固相上に固定化されたままとなるような条件下で除去することができる（例えば、洗浄することによる）。固相に固定されたマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書で概略を示したいくつかの方法で達成することができる。
好ましい実施形態では、プローブは、非固定アッセイ成分である場合、アッセイの検出および読み取りの目的で、本明細書で論じる、当業者に周知の検出可能な標識で直接または間接的に標識することができる。
また、例えば、蛍光エネルギー移動の技術（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら，米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら，米国特許第４，８６８，１０３号参照）を使用することにより、いずれの成分（マーカーまたはプローブ）もさらに操作または標識することなく、マーカー／プローブ複合体の形成を直接検出することも可能である。第１の「ドナー」分子上の蛍光団標識は、適当な波長の入射光で励起した際に、その放出蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子上の蛍光標識によって吸収されるように選択され、次に、第２の「アクセプター」分子は、吸収したエネルギーによって蛍光を発することができる。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は単に、トリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを用いてもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」の標識から識別できるように、異なる波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てている距離に関係するので、これらの分子間の空間的関係が評価できる。分子間で結合が起こる場合には、アッセイにおける「アクセプター」分子標識の蛍光放出が最大化されるべきである。ＦＲＥＴ結合事象は当技術分野で周知の標準的な蛍光測定検出手段によって（例えば、蛍光計を用いて）測定可能であることが好都合である。
別の実施形態では、プローブのマーカー認識能の決定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）（例えば、Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705参照）などの技術を用いることにより、いずれのアッセイ成分（プローブまたはマーカー）も標識することなく達成することができる。本明細書で使用する場合、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、相互作用物のいずれも標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検討するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。結合表面の質量変化（結合事象の指標）は、表面付近の光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）をもたらして検出可能なシグナルを発し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
あるいは、別の実施形態では、液相中の溶質としてマーカーおよびプローブを用いて、類似の診断および予後アッセイを行うことができる。このようなアッセイでは、複合体を形成したマーカーおよびプローブを、複合体を形成していない成分から、限定されるものではないが、示差的遠心分離、クロマトグラフィー、電気泳動おおび免疫沈降を含むいくつかの標準的な技術のいずれかによって分離する。示差的遠心分離では、マーカー／プローブ複合体は、複合体を形成していないアッセイ成分から、一連の遠心分離工程を介して、それらのサイズおよび密度の違いに基づく複合体の沈降平衡の違いによって分離することができる（例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7参照）。標準的なクロマトグラフィー技術もまた、複合体を形成した分子を、複合体を形成していないものから分離するために使用可能である。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づき、カラム形式で適当なゲル濾過樹脂の利用によって分子を分離し、例えば、相対的に大きい複合体を、相対的に小さい、複合体を形成してない成分から分離することができる。同様に、複合体を形成していない成分と比較した場合の、マーカー／プローブ複合体の電荷特性の相対的な違いを活用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用により、複合体を、複合体を形成していない成分から識別することもできる。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は当業者に周知である（例えば、Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525参照）。ゲル電気泳動もまた、複合体を形成したアッセイ成分を非結合成分から分離するために使用可能である（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999参照）。この技術では、タンパク質または核酸複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動過程での結合相互作用を維持するためには、非変性ゲルマトリックス材料および還元剤不在の条件が一般に好ましい。特定のアッセイおよびその成分に適当な条件は当業者に周知である。
特定の実施形態では、マーカーｍＲＮＡのレベルは、当技術分野で公知の方法を用い、生体サンプルにおいてｉｎ ｓｉｔｕ形式およびｉｎ ｖｉｔｒｏ形式の両方により決定することができる。用語「生体サンプル」は、対象から単離された組織、細胞、体液およびそれらの単離物、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。多くの発現検出法は単離されたＲＮＡを用いる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法では、細胞由来ＲＮＡを精製するために、ｍＲＮＡの単離に対して選択されないいずれのＲＮＡ単離技術を用いてもよい（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999参照）。さらに、例えば、シングルステップＲＮＡ単離法Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者に周知の技術を用い、多数の組織サンプルを容易に処理することができる。
単離されたｍＲＮＡは、限定されるものではないが、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、単離されたｍＲＮＡを、検出される遺伝子によりコードされているｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその一部、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、かつ、ストリンジェント条件下で本発明のマーカーをコードしているｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するための他の好適なプローブも本明細書に記載されている。ｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、問題のマーカーが発現されていることを示す。
ある形式では、ｍＲＮＡを固相表面に固定化し、例えば、単離したｍＲＮＡをアガロースゲルに流し、そのｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜へ移すことによってプローブと接触させる。別の形式では、プローブを固相表面に固定化し、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者ならば、既知のｍＲＮＡ検出法を、本発明のマーカーによりコードされているｍＲＮＡのレベルの検出に使用するために容易に適合させることができる。
サンプル中のｍＲＮＡマーカーのレベルを決定するための別の方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に示されている実験具体例）、リガーゼ連鎖反応(Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193)、自家持続配列複製(Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Ｑ−βレプリカーゼ(Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉら，米国特許第５，８５４，０３３号）または他の任意の核酸増幅法などの核酸増幅のプロセスと、その後の、当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数で存在する場合の核酸分子の検出に特に有用である。本明細書で使用する場合、増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）にアニールすることができ、かつ、間に短い領域を含み得る核酸分子対と定義される。一般に、増幅プライマーは約１０〜３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域を挟み込んでいる。適当な条件下、適当な試薬を用い、このようなプライマーは、プライマーによって挟み込まれたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
ｉｎ ｓｉｔｕ法では、ｍＲＮＡは、検出に先だって単離される必要はない。このような方法では、細胞または組織サンプルは、既知の組織学的方法を用いて調製／処理される。次いで、このサンプルを支持体、一般にスライドクグラスに固定化した後、マーカーをコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるプローブと接触させる。
マーカーの絶対的発現レベルに基づいた決定を行う代わりに、決定は、マーカーの正規化された発現レベルに基づいてもよい。発現レベルは、その発現を、マーカーではない遺伝子、例えば、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによりマーカーの絶対的発現レベルを補正することによって正規化される。正規化のための好適な遺伝子としては、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子が含まれる。この正規化により、あるサンプル、例えば、患者サンプルにおける発現レベルと別のサンプル、例えば、異なる供給源に由来する非疾患サンプルとの比較が可能である。
あるいは、発現レベルは、相対的発現レベルとして提供されてもよい。マーカーの相対的発現レベルを決定するためには、問題のサンプルの発現レベルを決定する前に、１０サンプル以上、好ましくは５０サンプル以上の正常細胞単離物と疾患細胞単離物でマーカーの発現レベルを決定する。数の多い方のサンプルでアッセイされた遺伝子のそれぞれの平均発現レベルを決定し、これをマーカーのベースライン発現レベルとして用いる。次に、試験サンプルに関して決定されたマーカーの発現レベル（絶対的発現レベル）を、そのマーカーに関して得られた平均発現値で割る。これにより相対的発現レベルが得られる。
好ましくは、ベースラインの決定において使用されるサンプルは、非疾患細胞由来のものである。細胞供給源の選択は、相対的発現レベルの使用に依存する。正常組織で見られた発現を平均発現スコアとして使用することは、アッセイされるマーカーが疾患特異的（正常細胞に対して）であるかどうかをバリデートする助けとなる。さらに、より多くのデータが蓄積されるので、平均発現値が修正でき、蓄積されたデータに基づく改善された相対的発現値が得られる。疾患細胞からの発現データは、疾病状態の重篤度を格付けするための手段を与える。
本発明の別の実施形態では、マーカータンパク質ＨＳＰ９０、好ましくは、ＨＳＰ９０βが検出される。本発明のマーカータンパク質を検出するための好ましい薬剤は、このようなタンパク質またはそのフラグメントと結合することができる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。完全抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用可能である。プローブまたは抗体に関して用語「標識された」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体とカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含するものとする。間接的標識の例としては、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体検出およびＤＮＡプローブのビオチンによる末端標識（結果としてこれは蛍光標識ストレプトアビジンで検出することができる）が含まれる。
細胞からのタンパク質は、当業者に周知の技術を用いて単離することができる。使用されるタンパク質単離法は、例えば、Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されているものなどであり得る。
サンプルが所与の抗体と結合するタンパク質を含有するかどうか決定するためには、様々な形式を使用することができる。このような形式の例としては、限定されるものではないが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット解析および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。当業者ならば、既知のタンパク質／抗体検出法を、細胞が本発明のマーカーを発現するかどうかを決定する上で使用するために容易に適合させることができる。
１つの形式では、発現したタンパク質を検出するために、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光技術などの方法で抗体、または抗体フラグメントもしくは誘導体を使用することができる。このような使用では、抗体またはタンパク質のいずれかを固相支持体に固定化することが一般に好ましい。好適な固相支持体または担体としては、抗原または抗体と結合することができるいずれの支持体も含まれる。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、およびマグネタイトが含まれる。
当業者ならば抗体または抗原を結合させるための多くの他の好適な担体を知っており、このような支持体を本発明とともに使用するために適合させることができる。例えば、疾患細胞から単離されたタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロースなどの固相支持体に固定化することができる。次に、この支持体を好適なバッファーで洗浄した後に、検出可能に標識された抗体で処理することができる。その後、この固相支持体をバッファーで２回洗浄して、結合していない検出可能に標識された抗体を除去することができる。次に、固相支持体上に結合している標識抗体の量を従来の手段によって検出することができる。
本発明はまた、生体サンプルにおいてマーカータンパク質または核酸の存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットは、対象が特定の疾患、例えば、糖尿病および／または代謝症候群に罹患しているかどうか、または前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを決定するために使用することができる。例えば、キットは、生体サンプル中のマーカータンパク質または核酸を検出することができる標識化合物または薬剤と、そのサンプル中のタンパク質またはｍＲＮＡの量を決定するための手段（例えば、タンパク質もしくはそのフラグメントと結合する抗体、またはそのタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡと結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含む。キットはまた、そのキットを用いて得られた結果を解釈するための説明書も含み得る。
抗体に基づくキットの場合、キットは、例えば、（１）マーカータンパク質と結合する第１の抗体（例えば、固相支持体に結合されている）；および所望により、（２）前記タンパク質または第１の抗体のいずれかと結合し、かつ、検出可能な標識とコンジュゲートされている第２の異なる抗体を含み得る。
オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、キットは、例えば、（１）マーカータンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または（２）マーカー核酸分子を増幅するために有用なプライマー対を含み得る。このキットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含み得る。このキットはさらに、検出可能な標識を検出するために必要な成分（例えば、酵素または基質）を含み得る。このキットはまた、アッセイして試験サンプルと比較することができる１つの対照サンプルまたは一連の対照サンプルも含み得る。キットの各成分は個々の容器内に封入することができ、様々な容器を全て、そのキットを用いて行ったアッセイの結果を解釈するための説明書とともに単一のパッケージ内に入れることができる。
本明細書に提供される方法において、ＨＳＰ９０、具体的には、ＨＳＰ９０βの調節レベルは、本明細書に示されているものなどの代謝症候群の１以上の指標とともに診断指標として使用され得る。
反復診断アッセイが、対象の疾病状態を監視するために使用可能である。
ＶＩＩ．代謝症候群の治療
本明細書で実証されるように、ＨＳＰ９０発現または活性、具体的には、ＨＳＰ９０β発現または活性の阻害は、グルコース取り込み、インスリンシグナル伝達、および脂質代謝を改善する。本発明は、ＨＳＰ９０阻害剤、好ましくは、ＨＳＰ９０β阻害剤、より好ましくは、本明細書で提供されるようなＨＳＰ９０β阻害剤を投与して代謝症候群の少なくとも１つの徴候または症状を改善することを含む、代謝症候群に罹患している対象の治療方法を提供する。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０阻害剤、好ましくは、ＨＳＰ９０β特異的阻害剤は、代謝症候群の治療のための少なくとも１つの付加的薬剤が対象に投与される場合の対象に投与することができる。本明細書で使用する場合、これらの薬剤はいずれかの順序で逐次、または同時に投与することができる。複数の薬剤の対象への投与は、それらの薬剤の共処方または同時投与計画を必要としない。
ＨＳＰ９０β阻害剤を用いて代謝症候群の治療方法は、代謝症候群の治療のための既知の方法および薬剤と組み合わせることができる。現在、多くの薬剤および治療計画が代謝症候群および糖尿病の治療のために利用可能である。治療のために選択される具体的薬剤は、具体的症状および疾病状態の重篤度によって異なる。例えば、特定の実施形態では、ＨＳＰ９０β阻害剤は、単独または肥満手術、および／もしくは身体活動の増加と組み合わせた食事および／または行動改善、例えば、カロリー制限とともに投与することができる。特定の実施形態では、ＨＳＰ９０β阻害剤は、２型糖尿病の治療用薬剤、例えば、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ、Ｇｌｕｍｅｔｚａその他）、グリタゾン、例えば、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、サキサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ）、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ）、またはインスリンとともに投与することができる。
ＶＩＩＩ．代謝症候群の動物モデル
１型および２型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症などの代謝症候群の、いくつかの遺伝的および誘発動物モデルは、当技術分野でよく特徴付けられている。このような動物は、糖尿病の治療におけるＨＳＰ９０阻害剤、例えば、ＨＳＰ９０β阻害剤の効果を実証するために使用可能である。１型糖尿病のモデルとしては、限定されるものではないが、ＮＯＤマウスおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットおよびマウス（１型糖尿病モデル）が含まれる。２型糖尿病の遺伝的および誘発モデルとしては、限定されるものではないが、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウス、レプチン受容体欠損ｄｂ／ｄｂマウス、および高脂肪食飼育マウスまたはラットモデルが含まれる。これらの各モデルでは、具体的疾患特徴の発生のタイムラインが周知である。ＨＳＰ９０阻害剤は、これらの動物モデルにおける糖尿病の予防または治療においてＨＳＰ９０阻害剤、特にＨＳＰ９０β阻害剤の有効性を実証するために、糖尿病の症状が出現する前または後に投与することができる。
選択される具体的動物モデルおよび介入の時機、例えば、代謝症候群の出現の前か後かに応じて、動物モデルは、代謝症候群の予防、治療、診断、および監視に対する、本明細書で提供される方法の有効性を実証するために使用することができる。
ＩＸ．キット
本発明はまた、疾病状態、例えば、代謝症候群を診断するための組成物およびキットを提供する。これらのキットは、下記：ＨＳＰ９０βと特異的に結合する検出可能な抗体およびＨＳＰ９０β抗体と特異的に結合する１以上の検出可能な抗体、染色用の対象組織サンプルを取得および／または調製するための試薬、ならびに使用説明書、のうちの１以上を含む。
本発明のキットは、所望により、本発明の方法を実施するために有用な付加的成分を含んでもよい。例として、本キットは、相補的核酸をアニーリングするために、または抗体をそれが特異的に結合するタンパク質と結合させるために好適な流体（例えば、ＳＳＣバッファー、ＴＢＳＴ）、１以上のサンプルコンパートメント、本発明の方法の性能を記した説明書類、および組織特異的対象／標準を含み得る。
本発明はまた、代謝障害の治療のためのキットも提供する。本キットは、少なくとも１つのＨＰＳ９０阻害剤、好ましくは、ＨＳＰ９０β特異的阻害剤、ならびに必要に応じて、使用および投与用デバイスに関する１以上の説明書を含む。
実施例１−糖尿病の病因論における重要な活性ノードとしてＨＳＰＡＢ１（ＨＳＰ９０β）を同定するためのプラットフォームテクノロジーの使用
この実施例では、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７６１５に詳細に記載されているプラットフォームテクノロジーを、特注糖尿病モデルから得られたデータを統合するため、および糖尿病の病因を駆動する新規なタンパク質／経路を同定するために用いた。この解析の結果得られた関係マップにより、糖尿病の病因論における重要な活性ノードとしてＨＳＰＡＢ１（ＨＳＰ９０β）が同定された。よって、ＨＳＰＡＢ１（ＨＳＰ９０β）は、重要な糖尿病治療標的、ならびに糖尿病に関連する診断／予後マーカーである。
５種類の初代ヒト細胞株、すなわち、脂肪細胞、筋管、肝細胞、大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）、および近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこれらの疾患関連細胞が経験している環境を模擬する５種類の条件のうち１つに曝した。具体的には、これら５つの細胞株のそれぞれを下記条件：高血糖条件、高脂血条件、高インスリン血条件、低酸素条件および乳酸暴露のそれぞれに個々に曝した。高血糖条件は、２２ｍＭグルコースを含有する培地で細胞を培養することによって誘導した。高脂血条件は、０．１５ｍＭパルミチン酸ナトリウムを含有する培地で細胞を培養することによって誘導した。高インスリン血条件は、１０００ｎＭインスリンを含有する培地で細胞を培養することによって誘導した。低酸素条件は、５％ＣＯ２、２％Ｏ２および９３％窒素を含有する工業ガス混合物を満たしたモジュラーインキュベーターチャンバー（ＭＩＣ−１０１、Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ Ｉｎｃ．デルマー、ＣＡ）に細胞を入れることによって誘導した。また、各細胞株を０または１２．５ｍＭ乳酸でも処理した。
さらに、２つの異なる細胞対、すなわち、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）（細胞系１）とヒト腎臓２（ＨＫ２）細胞（細胞系２）；または肝臓細胞（細胞系１）と脂肪細胞（細胞系２）の間のクロストーク実験を行い、対の細胞を共培養した。この共培養アプローチは細胞外セクレトーム（ＥＣＳ）実験と呼ばれる。まず、第１の細胞系（例えば、ＨＡＳＭＣ）をトランスウェル型増殖チャンバーのウェルのインサートに播種した。より良い統計分析を可能とするために６ウェルプレートを使用した。インサート内に第１の細胞系を播種した後、これらのインサートを独立した６ウェルプレートに入れた。第２の細胞系（例えば、ＨＫ２）をプライマリトレイに播種した。第１の細胞系を含有するインサートトレイおよび第２の細胞系を含有するプライマリトレイを３７℃で一晩インキュベートした。これらの細胞系のそれぞれを特定の細胞特異的培地で増殖させた（あるいは、これらの細胞系のそれぞれは、両細胞種の増殖を補助するように適合された培地で増殖させることもできる）。翌日、所定の処理を培地交換により行った。具体的には、第１の細胞系を含有するインサートを、第２の細胞系を含有するプライマリトレイ中に入れた。次に、このトレイを所定の時間、例えば、２４時間または４８時間インキュベートした。同じ条件で２反復のウェルを設定し、２Ｄ分析に十分な材料を得るために細胞をプールした。培地（１ｍｌアリコート）、インサートからの細胞およびプライマリトレイのウェルからの細胞を別のサンプルとして採取した。より良い統計的検定力を得るために実験は３反復で行った。
クロストーク実験は、「メディアスワップ(media swap)」実験によって行った。具体的には、第１の細胞系ＨＡＳＭＣからの培養済み培地または「セクレトーム」を摂動(perturbation)またはコンディショニング２４時間または４８時間に回収し、次に、第２の細胞系である脂肪細胞に加えて２４〜４８時間置いた。その後、第２の細胞系からの最終の培養済み培地または「セクレトーム」を回収した。全ての最終セクレトームにプロテオミクス分析を行った。
上述の細胞を含む細胞モデル（これらの細胞は上記の各条件に曝されている）に、補酵素Ｑ１０で処理することにより細胞を「環境摂動」に曝すことによって、さらに「問いかけを行った(interrogated)」。具体的には、細胞を０、５０μＭ、または１００μＭの補酵素Ｑ１０で処理した。
各細胞株、条件および補酵素Ｑ１０処理の細胞サンプルを、処理２４時間および４８時間後を含む処理後の種々の時点で回収した。特定の細胞に関して、特定の条件下の培地サンプルも回収し、分析した。
各細胞株、各条件、および各「環境摂動」、すなわち、補酵素Ｑ１０処理で、詳細な説明おいて上記した技術を用いて回収した細胞および培地サンプルに関して、定量的プロテオミクスによる全細胞タンパク質発現の変化のプロファイリング(iProfiling)を行った。
次に、上記に挙げた各細胞株、各条件、および各摂動で収集したプロテオミクスデータ、ならびに各細胞株、各条件、および各摂動で収集した生体エネルギープロファイリングデータを、ＲＥＦＳ（商標）システムによって処理した。摂動（ＣｏＱ１０）に曝された１つの特定の条件（例えば、高血糖）の全ての細胞株から得られたデータの組合せから、コンポジット摂動ネットワークを作成した。摂動のない（ＣｏＱ１０を含まない）同じ１つの特定の条件（例えば、高血糖）の全ての細胞株から得られたデータの組合せから、コンポジット非摂動ネットワークを作成した。同様に、摂動（ＣｏＱ１０）に曝された第２の、対照条件（例えば、正常血糖）の全ての細胞株から得られたデータの組合せから、コンポジット摂動ネットワークを作成した。摂動のない（ＣｏＱ１０を含まない）同じ第２の、対照条件（例えば、正常血糖）の全ての細胞株から得られたデータの組合せから、コンポジット非摂動ネットワークを作成した。
詳細な説明において上記で詳細に記載したように、ＲＥＦＳ（商標）を用いてシミュレーションネットワークを作成するために、上記のコンセンサスコンポジットネットワークにおける各ノードをシミュレートした（１０倍増加または低下させることによる）。
このシミュレーションネットワークの親ノードと子ノードを結ぶ各エッジの曲線下面積および変化倍率を、Ｒプログラミング言語を用いて特注プログラムにより抽出した（なお、Ｒプログラミング言語は、統計計算および図示のためのオープンソースソフトウエア環境である）。
シミュレーションコンポジットネットワークからデルタネットワークを作成した。補酵素Ｑ１０に応答した糖尿病疾病状態と正常状態のディファレンシャルネットワークを（デルタ−デルタネットワーク）作成するため、図１に示されるように、ＰＥＲＬプログラミング言語を用いた特注プログラムにより、何段階かの比較を行った。
具体的には、図１に示されるように、処理Ｔ１は補酵素Ｑ１０処理を表し、ＮＧおよびＨＧは、条件としての正常および高血糖を表す。ＮＧ∩ＨＧデルタネットワークにおけるＮＧからのユニークなエッジを、ＨＧ∩ＨＧＴ１デルタネットワークにおけるＨＧＴ１のユニークなエッジと比較した。ＮＧとＨＧＴ１の共通部分のエッジは、Ｔ１によりＮＧに回復されるＨＧエッジである。Ｔ１によりＮＧに回復されるＨＧエッジをＮＧ∩ＨＧデルタネットワークに重畳した（図２に濃い丸で示す）。
具体的には、正常血糖（ＮＧ）条件のシミュレーションコンポジットマップと高血糖（ＨＧ）条件のシミュレーションコンポジットマップを、特注ＰＥＲＬプログラムを用いて比較して、正常血糖条件のユニークなエッジを作成した。補酵素Ｑ１０処理無しの高血糖条件（ＨＧ）のシミュレーションコンポジットマップと補酵素Ｑ１０処理有りの高血糖条件（ＨＧＴ１）のシミュレーションマップを、特注ＰＥＲＬプログラムを用いて比較して、補酵素Ｑ１０処理有りの高血糖条件（ＨＧＴ１）のユニークなエッジを作成した。正常血糖条件（ＮＧ）由来のユニークなエッジと補酵素Ｑ１０処理有りの高血糖条件（ＨＧＴ１）由来のユニークなエッジの共通部分のエッジを、ＰＥＲＬプログラムを用いて識別した。これらのエッジは、補酵素Ｑ１０の処理により高血糖条件から正常血糖条件へ回復される因子／ネットワークを表す。補酵素Ｑ１０処理により正常に回復される高血糖エッジのデルタ−デルタネットワークを正常血糖∩高血糖デルタネットワークに重畳した。
ＰＥＲＬプログラムおよびＲプログラムからのアウトプットをオープンソースプログラムであるＣｙｔｏｓｃａｐｅにインプットし、補酵素Ｑ１０処理デルタ−デルタネットワークにより正常条件に回復した高血糖エッジと、正常血糖と高血糖症のデルタネットワークとの間の重畳ネットワークのビジュアル表示を作成した。重畳ネットワークを表すＣｙｔｐｓｃａｐｅプログラムからのアウトプットを図２に示す。図２の濃い丸は、補酵素Ｑ１０の処理により高血糖条件から正常血糖へ回復したエッジで識別される。図２の薄い丸は、ユニークな正常血糖(normal hypercemia)エッジで識別される。図２に示される四角の中のサブネットワークを図３に拡大して示す。ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＨＳＰ９０β）は、どれが補酵素Ｑ１０の処理により高血糖条件から正常血糖条件に回復したエッジであるかを識別したマーカーの１つである（図３参照）。
図３は、インターロガティブ・バイオロジー（登録商標）糖尿病アウトプットからのＨＳＰ９０ＡＢ１（ＨＳＰ９０β）の関連マップと注目する原因ノードを表す。図４は、疾患および正常細胞モデルにおけるタンパク質の因果関係を表すためにディファレンシャルネットワークマップで用いた記号およびカラーコードの一覧を示す。ＨＳＰ９０ＡＢ１（ＨＳＰ９０β）は、この重畳デルタ−デルタネットワークで、糖尿病の潜在的治療因子、薬物標的およびバイオと識別された。
実施例２−細胞基質代謝およびインスリンシグナル伝達のＨＳＰ９０β調節
Ａ．材料および方法：
１．ヒト筋芽細胞の筋管への分化：
ヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）をＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手し、販売者が推奨する増殖培地で培養した。コンフルエント培養を分化培地（ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、ピルビン酸塩およびＨＥＰＥＳ）に置換し、細胞を７〜１０日間分化させた。
２．Ｈｓｐ９０βのｓｉＲＮＡ／ＨＳＰ９０の阻害：
ＩＤＴ（登録商標）から市販されているｔｒｉｆｅｃｔａ ｓｉＲＮＡをＨｓｐ９０βの特異的ノックダウンに用いた。対照として、全ての実験でスクランブルｓｉＲＮＡを含めた。ＩＤＴ（登録商標）により提供された３種類のｓｉＲＮＡ全てを、Ｍｉｒｕｓ（登録商標）ＴＫＯ（登録商標）トランスフェクション試薬を用いてそれぞれトランスフェクトした。Ｈｓｐ９０βノックダウンは、ヒトＨｓｐ９０βタンパク質およびｍＲＮＡに特異的な市販の抗体およびプライマープローブを用いてウエスタンブロット法およびｑＰＣＲにより確認した。ＨＳＰ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。
３．ｓｉＨｓｐ９０β配列情報：
Ｈ１：
二重鎖配列
5’-rArGrG rCrCrG rArCrA rArGrA rArUrG rArUrA rArGrG rCrAG T-3’（配列番号１）
5’-rArCrU rGrCrC rUrUrA rUrCrA rUrUrC rUrUrG rUrCrG rGrCrC rUrCrA-3’（配列番号２）
Ｈ２：
二重鎖配列
5’-rCrArA rCrGrA rUrGrA rUrGrA rArCrA rGrUrA rUrGrC rUrUG G-3’（配列番号３）
5’-rCrCrA rArGrC rArUrA rCrUrG rUrUrC rArUrC rArUrC rGrUrU rGrUrG-3’（配列番号４）
Ｈ３：
二重鎖配列
5’-rCrGrU rUrGrC rUrCrA rCrUrA rUrUrA rCrGrU rArUrA rArUC C-3’（配列番号５）
5’-rGrGrA rUrUrA rUrArC rGrUrA rArUrA rGrUrG rArGrC rArArC rGrUrA-3’（配列番号６）
４．インスリンシグナル伝達実験：
前週に１２ウェルプレートに播種したヒトＨＳＭＭ筋管細胞を用いた。培地を吸引し、Ｈｓｐ９０ノックダウンのため適当な希釈率のＮＣおよびＨ３ ｓｉＲＮＡを含む新鮮培地を、プレートのウェル中の終濃度が１００ｎＭとなるように加えた。これらの細胞のトランスフェクションにはＭｉｒｕｓ ＴＫＯトランスフェクション試薬を用いた。次に、このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
培地を吸引し、細胞をまずＰＢＳで、次いで０．１％ＢＳＡ含有増殖培地で洗い流した。次に、細胞を適当な阻害剤を含有する０．１％分化培地中、３７℃で２〜３時間、血清飢餓に曝し、その後、５分間インスリン刺激を行った（０、１０、および１００ｎＭインスリン）。
次に、これらのウェルをＰＢＳで１回洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡバッファー１００μｌ中に採取した。プレートを氷上に置き、セルスクレーパーを用い、細胞をプレートから掻き取った。これらのライゼートを１．５ｍｌエッペンドルフ管に回収し、シリンジとニードルを使用することによりホモジナイズした。次に、これらのライゼートを４℃にて１０分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離した。ライゼートは、その後の使用のために−２０℃で保存することができる。
タンパク質含量をＢＣＡアッセイにより評価し、次節に記載するようなゲル電気泳動およびウエスタンブロット法のためにサンプルを調製した。総タンパク質１０μｇをロードするために必要な総容量を算出した。
これらのサンプルをビス−トリスまたはトリス−グリシン−ＳＤＳゲルにロードした。タンパク質を、慣例のウェットまたはドライ転写法を用いてＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に移した。次に、これらの膜を、ブロッキングバッファーを用いて少なくとも１時間ブロッキングした。その後、これらの膜を切断した後、インキュベーション用のブロッキングバッファーに希釈した適当な一次抗体に曝した。ｐＡＫＴ（ｐ−Ａｋｔ、Ｓ４７３）、ｐＥＲＫ（ｐ−Ｅｒｋ、ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、およびｐＧＳＫ３β（ホスホ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）に対する一次抗体をＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｉｎｃ．（登録商標）から入手した。また、他の抗体も商業ソースから入手した。膜をシェーカーに置き、冷蔵庫（４℃）で一晩インキュベートした。
タンパク質の可視化およびウエスタンブロットの定量は次のように行った。膜を１×ＰＢＳ−Ｔを用いて３回洗浄した（各１０分）。適当なＨＲＰコンジュゲート二次抗体をブロッキングバッファーで希釈し（１：１０，０００）、膜のそれぞれに加えた。膜を少なくとも１時間、シェーカーにて室温でインキュベートした。これらの膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した（各１０分）。最終洗浄の後、これらの膜をタンパク質の検出までＰＢＳ−Ｔ中で維持した。
膜の各細片を清浄な平坦表面に並べた。化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＰＩＣＯまたはＤＵＲＡ）を各膜に加え、５分間インキュベートした。次に、これらの膜をＢＩＯＲＡＤ（登録商標）化学発光イメージャーを用いた可視化のために、清浄なプラスチックシートに置いた。ＢＩＯＲＡＤ（登録商標）ソフトウエアを用いてバンドを定量した。
５．インスリンにより刺激されるグルコース取り込み：
ＨＳＭＭ筋芽細胞（２０，０００細胞／ウェル）を、試験前に７日間、９６ウェルプレート中、２％ウマ血清で分化させた。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有する２００μｌのＭＢＳＳバッファーで２回洗浄した後、１００μｌ ＭＢＳＳ ０．１％ＢＳＡで４時間、血清飢餓に曝した。また、いくつかのウェルは２５μＭ ＬＹ化合物で２０分間前処理した。インスリン刺激の開始時に、ＭＢＳＳ ０．１％ＢＳＡバッファー中２倍濃度の試薬１００μｌを１００μｌの飢餓培地に加えて、実験用の１倍濃度とした。２倍濃度試薬は、インスリン（０、２０ｎＭ、および２００ｎＭ）；２ＮＢＤＧ（５００μＭ）である。細胞をインスリンおよび２ＮＢＤＧで３０分間処理した後、ＭＢＳＳバッファーで２回洗浄し、次いで５０μｌのＭＢＳＳバッファーをウェルに加えた。グルコース取り込みは蛍光計で検出し、それらに細胞を含まないウェルでのバックグラウンド検出を伴った。蛍光計の読み取り後、固定液（ホルマリン、５０μｌ）を、ウェル中の５０μｌ ＭＢＳＳに加え、次いで１００μｌの１μＭ ＤＡＰＩを、ホルマリンとＭＢＳＳの混合物１００μｌに加えた。
６．筋管の生体エネルギープロファイリング：
Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイカートリッジ内のウェルで培養したＨＳＭＭ筋管を、２％ウマ血清筋細胞分化培地で７日間分化させた。細胞を陰性対照スクランブルｓｉＲＮＡまたはｓｉＨｓｐ ｓｉＲＮＡのいずれかで、上記のような販売者の説明書に従い（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（登録商標））、濃度５０ｎＭのＴＫＯトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。４８時間のトランスフェクション後、細胞エネルギー論を調節するための薬物、すなわち、オリゴマイシン、カルボニルシアニド−Ｍ−クロロフェニルヒドラジン（ＣＣＣＰ）、およびロテノンを用いて、細胞にＳｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）生体エネルギー分析を行った。オリゴマイシンは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ（ＥＴ鎖の複合体Ｖ）を阻害し、解糖能の分析を可能とする。ＣＣＣＰは、ミトコンドリア膜からプロトンをくみ出し、それにより、最大補償酸素消費を誘導する脱共役剤であり、脱共役ＯＣＲの分析を可能とする。ロテノンは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＥＴ鎖の複合体Ｉ）を阻害し、非ミトコンドリアＯＣＲの分析を可能とする。
アッセイを実施するために、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイカートリッジの各ウェルを１ｍｌのランニングバッファーで洗浄した。各ウェルに５００μｌのランニング媒体を加え、そのプレートを３７℃（ＣＯ２不含）のインキュベーターに入れた。ミトコンドリア活性を調節するための薬剤は、カートリッジに添加した後に終濃度が１倍（１μＭ）となるように１０倍（１０μＭ）濃度で調製した。オリゴマイシン（５０μｌ）、ＣＣＣＰ（５５μｌ）およびロテノン（５５μｌ）をカートリッジのポートＡ、Ｂ、およびＣに添加し、カートリッジをインキュベーターに戻した。Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイウィザードを開き、サイクルパラメーターおよび時間を設定した。次に、この装置を用いてＳｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイを実施した。Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイの後、細胞を５０μｌの４５０ｍＭ ＮａＯＨで溶解させ、次いで５μのトリス６．８で中和した。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｔａｋｅ３ ＤＮＡプレートリーダーを用い、ＤＮＡライゼートに対してＯＤ２６０での分光光度測定分析を行った。データをこれらの細胞のＤＮＡ含量で正規化した。
Ｂ．結果
１．代謝因子およびストレス因子がＨｓｐ９０βの発現を誘導する：
代謝因子およびストレス因子による筋管の急性処置は、Ｈｓｐ９０βの発現を調節することが示された。ＨＳＭＭ筋芽細胞を、２％ウマ血清を含有する培地で７日間分化させた後、正常グルコース（ＮＧ５ｍＭグルコース）、高グルコース（ＨＧ２５ｍＭ）、ＮＧ＋マンニトール（マンニトールは浸透圧の平衡化のために使用）、オレイン酸とリノール酸の混合物（１５０μＭ）、パルミチン酸塩（１５０μＭ）、およびこれらの種々の条件の組合せを含む、種々の栄養条件に２４時間曝した。結果は、２４時間後、高グルコースは、浸透圧ストレスにより誘導される影響があるものの、Ｈｓｐ９０β ｍＲＮＡの発現には有意な影響を持たないことを示した。正常グルコース条件では、脂質混合物はＨＳＰ９０β ｍＲＮＡの発現を抑制したが、脂質混合物は、高グルコース条件ではＨＳＰ９０β ｍＲＮＡの発現を上昇させた。パルミチン酸塩とＮＧは、ＢＳＡ対照に比べて、ＨＳＰ９０β ｍＲＮＡの発現を抑制した。これらのデータはＨＳＰ９０β発現が脂血症などの種々の代謝因子により調節されることを示し、酸化的代謝およびストレス応答との関係を実証した。Ｈｓｐ９０β発現は、筋管をＴＮＦαで処理した際に誘導された（図５）。
２．筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンはインスリンシグナル伝達の増強をもたらした：
ＨＳＭＭ筋管を順次、（１）ＨＳＰ９０ＡＢ１を標的とする３種類の異なるｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、（２）３時間血清飢餓に曝し、（３）種々の濃度のインスリン（０、１０、１００ｎＭ）の刺激を施した。インスリン刺激の下流のシグナル伝達事象を、全体の、また、リン酸化された、Ａｋｔ、Ｅｒｋ、およびＧＳＫ３βのレベルに関するウエスタンブロット法により評価した。ウエスタンブロットの定量は、ＨＳＰ９０ＡＢ１のノックダウンが、インスリンにより刺激されるＡｋｔ、ＥＲＫ、およびＧＳＫ３βのリン酸化の有意な上昇を誘導したことを示した。Ａｋｔは、リン脂質の結合およびＰＤＫ１によるＴｈｒ３０８での活性化ループのリン酸化によって、ならびにカルボキシ末端内のＳｅｒ４７３でのリン酸化によって活性化される。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、活性化ループ残基Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４およびＴｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７それぞれのリン酸化を介してｐ４４およびｐ４２を活性化する。ＧＳＫ−３は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞生存経路の重要な下流エレメントであり、その活性はＡｋｔにより媒介される、ＧＳＫ−３αのＳｅｒ２１およびＧＳＫ−３βのＳｅｒ９のリン酸化によって阻害され得る（図６）。
３．筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンはインスリンにより刺激されるグルコース取り込みの増強をもたらした：
Ｈｓｐ９０βノックダウンにより誘導されたシグナル伝達事象の上昇に一致して、グルコースにより誘導されるグルコース取り込みを、蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧを用いてＨＳＭＭ筋管で測定した。上記で示した方法を用い、細胞を順次、対照またはＨｓｐ９０β ｓｉＲＮＡのいずれかで４８時間トランスフェクトし、４時間血清飢餓に曝し、２５０μＭ ２−ＮＢＤＧの存在下で種々の濃度のインスリンで３０分間刺激した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、プレートリーダーを用いて蛍光を検出した。細胞の蛍光は、脂肪によって取り込まれたグルコースの量を反映する。これらの結果は、ＨＳＰ９０β発現の低下を伴うｓｉＨｓｐ９０β処理細胞は、同じ条件下、非特異的ｓｉスクランブルで処理された細胞に比べた場合、インスリンにより刺激されるグルコース取り込みの有意な増強を示すことを実証した。これらのデータは、筋管におけるＨｓｐ９０βの阻害またはノックダウンがインスリンにより刺激されるグルコース取り込みを増強することを実証する（図７）。
４．筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンはミトコンドリア効率の上昇をもたらした：
ＨＳＭＭ筋管を、対照またはｓｉＨｓｐ９０βのいずれかのｓｉＲＮＡで上記のように４８時間トランスフェクトした後、オリゴマイシン、ＣＣＣＰ、およびロテノンを含む種々のミトコンドリア薬剤を用いて、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）生体エネルギープロファイリング（ＸＦ２４ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を行い；基礎または最大ミトコンドリア酸化能を反映する酸素消費率（ＯＣＲ）の変化を監視した。結果をＤＮＡ含量によって正規化した。
これらの結果は、基礎条件および脱共役条件の両方で、ＨＳＰ９０βノックダウン筋管は酸化的呼吸の増大を示すことを実証した。このことは、Ｈｓｐ９０βノックダウンが筋管のミトコンドリアに顕著な代謝変化を誘導することを実証し、おそらくは種々のミトコンドリアタンパク質の組み込みを標的とすることによって、そのシャペロン活性を介したミトコンドリア機能の調節におけるＨｓｐ９０βの役割を示している。生体エネルギープロファイリング研究から、対照またはｓｉＨＳＰ９０ＡＢ１ ｓｉＲＮＡのいずれかを用いた場合の筋管における基礎および脱共役両方のＯＣＲの曲線下面積（ＡＵＣ）を定量したところ、Ｈｓｐ９０βノックダウン細胞における基礎および脱共役ＯＣＲの有意な増大が明らかとなり、それにより、Ｈｓｐ９０β発現のノックダウン時のミトコンドリア効率の上が実証される（図８）。
５．小分子阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）によるＨＳＰ９０阻害はＡＫＴのリン酸化を増大したが、ＥＲＫおよびＧＳＫ３βのリン酸化は増大しなかった：
筋管をＨＳＰ９０の小分子阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）で処理した後、インスリン刺激を行った。ＨＳＰ９０の小分子阻害剤（ＣＣＴ０１８１５９）は、ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０βの両方を阻害する。インスリンシグナル伝達に及ぼすこの小分子阻害剤の影響は、下流標的Ａｋｔ、ＥＲＫ、およびＧＳＫ３βの、インスリンにより刺激されるリン酸化をウエスタンブロットによって測定することにより評価した。これらの結果は、高濃度、具体的には１０μＭのＣＣＴ０１８１５９がインスリンにより刺激されるＡｋｔのリン酸化を有意に高めたことを実証し、ＨＳＰ９０阻害が筋管におけるインスリン感受性を高めたことを示す。しかしながら、ｐＥＲＫまたはｐＧＳＫ３βのレベルには全く変化が見られなかった（図９）。
細胞生体エネルギー論に対するＨｓｐ９０小分子阻害剤では、Ｈｓｐ９０β特異的ノックダウンの場合とは異なる影響が見られた。種々の濃度のＣＣＴ０１８１５９で処理した後の筋管の生体エネルギープロファイルは、Ｈｓｐ９０βノックダウン細胞で見られたものとは異なるプロファイルを示した。基礎ＯＣＲに見られた変化は無いが、なお、脱共役ＯＣＲは実際に濃度依存的に低下し、１０μＭのＣＣＴ０１８１５９は、ＣＣＣＰにより誘導されるＯＣＲの、より大きな抑制を誘導した。この異なるプロファイルは、基礎状態および脱共役状態の両方におけるＯＣＲの上昇はＨｓｐ９０β特異的であるが、ＣＣＴ０１８１５９は、それらのＡＴＰ結合ポケットを遮断することにより、Ｈｓｐ９０αとＨｓｐ９０βの両方を阻害することを示す。より低濃度のＣＣＴ０１８１５９（１μＭ）では、処理筋管において、脱共役ＯＣＲの上昇が見られた（図１０）。
Ｃ．結論：
要約すると、Ｈｓｐ９０βは、骨格筋筋管においてインスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、および基質代謝を調節する。高脂血症、高血糖症および炎症誘発の合図に応答したＨｓｐ９０β ｍＲＮＡおよびタンパク質の誘導は、糖尿病の病態生理におけるこのタンパク質を示している。筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンは、グルコース取り込みの有意な増加をもたらし、グルコース調節におけるその役割が実証される。筋管におけるＨｓｐ９０βのノックダウンはまた、ＥＲＫのリン酸化の大きな増加、ならびにＡＫＴおよびＧＳＫ３βのリン酸化の増加ももたらし、これはインスリンシグナル伝達の機能的分岐を実証するものであり、Ｈｓｐ９０βが選択機構に関与することを示している。Ｈｓｐ９０βノックダウンは、生体エネルギー論およびミトコンドリア基質代謝に顕著な影響を有する。Ｈｓｐ９０αとＨｓｐ９０βの両方を阻害するＨＳＰ９０阻害剤ＣＣＴ０１８１５９は、インスリンシグナル伝達および生体エネルギー論にあまり顕著な影響を示さなかったが、これはＨｓｐ９０β特異的阻害のほうが、汎Ｈｓｐ９０阻害アプローチよりも有効であることを示す。
実施例３−骨格筋筋管における代謝酵素発現のＨＳＰ９０β調節
筋芽細胞を培養し、筋管へ分化させ、本質的に上記のようにｓｉＲＮＡで処理した。種々の代謝経路に関与する一連の代謝酵素のｍＲＮＡ発現を、常法を用いてｒｔＰＣＲによりアッセイした。酵素には、解糖に関与するもの（ＨＫ２、ＬＤＨ、ＧＹＳ１）、脂質酸化に関与するもの（ＣＰＴ１、ＵＣＰ３）、脂肪酸輸送に関与するもの（ＣＤ３６）、および脂肪酸合成に関与するもの（ＡＣＣ１およびＡＣＣ２）、脂肪分解に関与するもの（ＨＳＬ）を含んだ。ＨＳＰ９０β ｓｉＲＮＡで処理した細胞におけるｍＲＮＡ発現を、スクランブルｓｉＲＮＡで処理した細胞における遺伝子の発現に対して正規化した。これらの結果を図１１Ａに示す。ＨＫ２、ＬＤＨ、ＧＹＳ１、ＣＰＴ１およびＵＣＰ３のｍＲＮＡ発現 レベルは、ＨＳＰ９０β発現のノックダウンの際に増大することが分かり、一方、ＣＤ３６およびＨＳＬの発現レベルは、ＨＳＰ９０β発現のノックダウンの際に低下することが分かった。また、脂肪酸合成に関与するＡＣＣ２の発現の低下傾向も見られた。ＵＣＰ３タンパク質レベルは、ＨＳＰ９０のノックダウンの際に実質的に増大することが分かった（図１１Ｂ）。骨格筋におけるＵＰＣ３タンパク質発現レベルは、糖尿病患者では一般に低いが、運動によりその発現が誘導される。特定の機序に縛られるものではないが、ＨＳＰ９０β発現のノックダウンは、ＵＣＰ３などのタンパク質の調節により、代謝症候群の治療に有益な効果を発揮する可能性があることが示唆される。
実施例４−骨格筋筋管における解糖フラックスのＨＳＰ９０β調節
本質的に上記のように筋芽細胞を培養し、筋管へ分化させ、正常血糖条件および高血糖条件下で増殖させた。高血糖条件に曝した細胞を５ｍＭグルコース中で増殖および分化させ、１１ｍＭグルコース中で培養した後、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。正常血糖条件下および高血糖条件下の両方で増殖させた細胞をＨＳＰ９０β ｓｉＲＮＡまたはスクランブル対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。次に、これらの細胞に上記のようにＳｅａｒｈｏｒｓｅ（登録商標）分析を行って解糖フラックスを分析した（なお、高血糖細胞は１１ｍＭグルコース中でアッセイした）。
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、ＨＳＰ９０βのノックダウンは、正常血糖条件下および高血糖条件下の両方で、グルコースにより誘導されるＥＣＡＲおよびオリゴマイシンにより誘導されるＥＣＡＲを増加させた。しかしながら、ＨＳＰ９０βのノックダウンは正常血糖条件下で基礎ＯＣＲおよび脱共役ＯＣＲを上昇させたが、高血糖条件下では基礎ＯＣＲまたは脱共役ＯＣＲの変化は見られなかった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。これらの結果は、ミトコンドリア呼吸と解糖の両方を調節することを実証する。特定の機序に縛られることを意図するものではないが、これらの結果は、Ｈｓｐ９０ＡＢ１タンパク質レベルの低下が全体的な基質代謝を上昇させ、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて全身の代謝を高め得ることを示唆する。
実施例５−骨格筋筋管の炎症性インスリン抵抗性モデルにおけるｐＥＲＫレベルのＨＳＰ９０β調節
本質的に上記のように筋芽細胞を培養し、筋管に分化させ、正常血糖条件下および高血糖条件下で増殖させた。高血糖条件に曝した細胞を５ｍＭグルコース中で増殖および分化させ、１１ｍＭグルコース中で２４時間培養した後にｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、かつ／またはＴＮＦ−αで処理した。正常血糖条件下、高血糖条件下、またはＴＮＦ−αの存在下での高血糖条件下で増殖させた細胞をＨＳＰ９０β ｓｉＲＮＡまたはスクランブル対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。次に、高血糖条件下で増殖させた細胞を１１ｍＭグルコースおよび／または相応のＴＮＦ−αの存在下で培養した。細胞を漸増濃度のインスリン（０、１０、１００ｎＭ）に５分間曝した後、採取し、ウエスタンブロットにより分析した。簡単に述べれば、細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡバッファーを採取した。シリンジとニードルを用いて細胞を溶解させた。各サンプルについて総タンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、総ＥＲＫおよびリン酸化ＥＲＫの両方の検出のために市販の抗体でプローブした（図１３Ａ）。総ＥＲＫおよびリン酸化ＥＲＫの量を、ホスフォイメージャーを用いて定量的に決定し、総ＥＲＫに対するリン酸化ＥＲＫの比を計算した（図１３Ｂ）。
図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、正常血糖条件下、ＥＲＫリン酸化およびＥＲＫリン酸化により決定されるインスリンシグナル伝達の両基礎レベルは、ＨＳＰ９０β発現のノックダウンによって上昇される。ＮＧ骨格筋筋管における、インスリンにより刺激されるＥＲＫリン酸化の増大がＨｓｐ９０ＡＢ１ノックダウンで見られる。ＨＧ単独ではインスリンシグナル伝達およびＥＲＫのリン酸化を抑制しなかったが、ＴＮＦαの存在下でのＨＧ条件は、ＨＳＰ９０βの存在下でのインスリンにより刺激されるＥＲＫリン酸化を強く抑制した。しかしながら、同じＨＧおよびＴＮＦα条件下で、Ｈｓｐ９０ＡＢ１ノックダウンは、ＴＮＦαにより抑制されるＥＲＫリン酸化を救済し、このことは、Ｈｓｐ９０ＡＢ１ノックダウンが、ＨＧ条件においてＴＮＦαにより誘導されるインスリン抵抗性を救済したことを示す。
実施例６−骨格筋筋管における脂質代謝のＨＳＰ９０β調節
骨格筋におけるインスリンシグナル伝達に及ぼす、ＴＮＦ−αの存在下および不在下の両方でのＨＳＰ９０βノックダウンの影響が実証されたので、脂質代謝に及ぼすＨＳＰ９０βおよびＴＮＦ−αの影響を分析した。簡単に述べれば、筋細胞を、本質的に上記のように正常血糖条件下および高血糖条件下で培養および分化させ、ＨＳＰ９０βまたはスクランブルｓｉＲＮＡで処理した。本質的に上記のようにＯＣＲ Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイを用いて脂質代謝を分析した。図１４に示されるように、ＨＳＰ９０βの存在下で、ＴＮＦ−αは脂質代謝を低下させる。しかしながら、ＨＳＰ９０βのノックダウンは、ＴＮＦ−αの不在下および存在下の両方で、筋肉筋管において正常血糖条件下でＯＣＲを上昇させる。これらの結果は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）アッセイによって測定した場合、ＨＳＰ９０βが脂質代謝を調節することを実証する。ＴＮＦ−αはＨＳＰ９０βの存在下で脂質代謝を低下させるが、ＨＳＰ９０βのノックダウンは、ＴＮＦ−αにより誘導される脂質代謝低下の存在下で脂質代謝を再確立する(re-estabilshes)。
実施例７−ＨＳＰ９０阻害剤を用いた代謝症候群の治療
１型および２型糖尿病、インスリン抵抗性、ならびに高脂血症などの代謝症候群のいくつかの遺伝的および誘発動物モデルが、当技術分野で十分に特徴付けられている。このような動物は、糖尿病を含む代謝症候群の治療におけるＨＳＰ９０阻害剤、例えばＨＳＰ９０β阻害剤の効果を実証するために使用される。１型糖尿病のモデルとしては、限定されるものではないが、ＮＯＤマウスおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットおよびマウス（１型糖尿病モデル）が含まれる。２型糖尿病の遺伝的および誘発モデルとしては、限定されるものではないが、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウス、レプチン受容体欠損ｄｂ／ｄｂマウス、および高脂肪食飼育マウスまたはラットモデルが含まれる。これらの各モデルでは、具体的疾患特徴の発生のタイムラインが周知である。ＨＳＰ９０阻害剤は、糖尿病、代謝障害、および／または代謝障害の１以上の徴候の治療においてＨＳＰ９０阻害剤、特にＨＳＰ９０β阻害剤の有効性を実証するために、糖尿病の徴候が出現する前または後に投与することができる。
代謝症候群に対する遺伝的素因を持つまたは持たない動物を、所望の疾病状態を誘発させるのに適当な条件下で飼育する。これらの動物を処置群と対照群の少なくとも２群に分ける。処置群の動物は、１用量以上のＨＳＰ９０阻害剤、例えば、ＨＳＰ９０に標的化されたｓｉＲＮＡ、ＨＳＰ９０に標的化された抗体、またはＨＳＰ９０の小分子阻害剤で処置する。好ましくは、小分子、ｓｉＲＮＡ、および抗体はＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βに特異的に標的化される。動物を、いくつかの既知の方法のいずれかによって代謝症候群の発症に関して監視する。例えば、基礎インスリン分泌、グルコースレベル、Ｈｂ１Ａｃレベル、炎症性マーカーレベル、コレステロールおよびトリグリセリドレベル、体重、肝臓における脂肪沈着を含む脂肪沈着、血圧、尿量および尿糖値、ならびに他の関連のマーカーを監視または測定することができる。一定期間の絶食、例えば、一晩の絶食後の、またはグルコース負荷もしくは他の代謝負荷に応答したマーカーを分析する。所定の間隔で、または試験の終了時に、動物を安楽死させ、脂肪沈着、腎臓の状態、および代謝症候群他の適当な指標を評価する。
処置群の転帰を対照（非処置またはビヒクル処置）群の転帰と比較する。ＨＳＰ９０βの阻害剤は、様々な評価方法で代謝症候群を改善することが実証される。
実施例８−代謝症候群の治療の肝臓標的としてのＨＳＰ９０βのバリデーション
肝臓は血糖の調節に不可欠な役割を果たしている。健康な対象では、インスリンが、グリコーゲンへの変換を目的とする肝臓によるグルコース取り込みを促進して、血糖値を引き下げる。代謝症候群では、肝臓は、インスリンに不感受性であるかまたはインスリン生産が不十分であるかのいずれか、または両方のために、インスリンに応答せず、血中のグルコースレベルが高くなり、これが有毒である。
肝細胞（例えば、ＴＨＬＥ−２細胞）は、インスリンシグナル伝達およびグルコース取り込みの分析に関して上記で示されたものと同様の方法を用いて分析される。簡単に述べれば、細胞をＨＳＰ９０阻害剤、好ましくは、ＨＳＰ９０β阻害剤で処理し、例えば、ＡＫＴ、ＥＲＫ、およびＧＳＫ３βのリン酸化；グルコース取り込み、グリコーゲン合成；生体エネルギー論；例えばｑＰＣＲによる、糖新生または脂質／コレステロール代謝に関与する遺伝子の遺伝子発現の分析により、インスリンシグナル伝達に関してアッセイする。また、炎症のマーカーおよび小胞体（ＥＲ）ストレスを評価することもできる。
ＨＳＰ９０阻害剤、特にＨＳＰ９０β阻害剤で処理した肝細胞は、これらの阻害剤で処理していない細胞に比べて、より良好なインスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、および／または脂質代謝を有することが分かる。これらの阻害剤で処理された肝細胞はまた、低いＥＲストレスおよび／または炎症性マーカーの低い発現を有することが分かる。
実施例９−代謝症候群の治療のための脂肪標的としてのＨＳＰ９０βのバリデーション
肝細胞と同様に、脂肪組織もインスリンに応答して血液からグルコースを取り込み、糖を脂肪に変換する。脂肪細胞のインスリン反応性およびグルコース取り込みは、筋肉細胞および肝臓細胞の分析に関して上記で示した方法を用いて評価される。同様に、炎症およびＥＲストレスもこれらの細胞で評価することができる。
ＨＳＰ９０阻害剤、特に、ＨＳＰ９０β阻害剤で処理した脂肪細胞は、これらの阻害剤で処理していない細胞に比べて、より良好なインスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、および／または脂質代謝を有することが分かる。これらの阻害剤で処理された脂肪細胞はまた、低いＥＲストレスおよび／または炎症性マーカーの低い発現を有することが分かる。
実施例１０−ＨＳＰ９０阻害剤の特異性の分類
本明細書で提供されているものなどのいくつかのＨＳＰ９０阻害剤が利用でき、その多くは、様々な疾患または病態、最も一般的には癌の治療に使用するために、臨床試験を受けているか、または受ける予定である。具体的作用機序、またはＨＳＰ９０転写産物、タンパク質、もしくはＨＳＰ９０結合タンパク質上の阻害剤の結合部位に応じて、その阻害剤は、１以上のＨＳＰ９０アイソフォーム、例えば、ＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βの活性を阻害し得る。例えば、ＨＳＰ９０のＡＴＰ結合部位に作用する阻害剤は、ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０βの両方に対して阻害活性を有する可能性がある。さらに、ＨＳＰ９０と特異的結合相手との相互作用を阻害する薬剤を選択することもできる（例えば、Tsaytler et al., 2009, Cell Stress Chap. 14:629参照）。同様に、ＨＳＰ９０の特定の核酸配列またはアミノ酸配列に基づいて、核酸に基づくまたは抗体に基づく阻害剤を、ＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βの発現または活性を特異的に阻害するように設計することもできる。あるいは、核酸に基づくまたは抗体に基づく阻害剤を、ＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βの両方の発現または活性を特異的に阻害するように設計することもできる。ＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０β核酸配列およびアミノ酸配列のアラインメントを図１７に示す。当業者ならば、これらのアラインメントを吟味して、核酸阻害剤を設計するか、またはＨＳＰ９０の単一のアイソフォームに交差反応性もしくは特異性があり得るＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０β上のエピトープを同定することが容易にできる。
ある薬剤がＨＳＰ９０α、ＨＳＰ９０β、または両方の発現または活性の阻害剤であるかどうかを決定するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、少なくとも１つのＨＳＰ９０の発現を阻害する核酸阻害剤および抗体阻害剤は、細胞培養系で特異性を試験することができる。例えば、ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０βの両方を発現する細胞を一連の濃度の核酸または抗体および適当な対照（例えば、スクランブル核酸、非免疫ＩｇＧ）と、適当な時間接触させる。必要に応じて細胞および／または培地を採取する。慣例の核酸検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット）およびタンパク質検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット）を用い、適当な対照と比較してＨＳＰ９０αおよびＨＳＰ９０βの発現レベルを決定する。ＨＳＰ９０阻害剤の特異性は容易に決定することができる。
ＡＴＰ結合および加水分解アッセイを行うための競合アッセイおよび方法は当技術分野で周知であり、ある薬剤がＨＳＰ９０α、ＨＳＰ９０β、または両方の阻害剤であるかどうか、すなわち、その薬剤が一方または両方のアイソフォームにおいてＡＴＰ結合または加水分解を阻害し得るかどうかを決定するために使用することができる。
酵母は、１コピーのＨＳＰ９０しか含まない。ＨＳＰ９０を発現しない酵母株をＨＳＰ９０αまたはＨＳＰ９０βのいずれかで形質転換することができ、クライエントタンパク質を折りたたむ能力を監視することができる。同様に、単一のＨＳＰ９０アイソフォームのみを発現する哺乳類細胞株、例えば、ＨＳＰ９０αノックアウトマウスに由来するもの、または１つのＨＳＰ９０アイソフォームの発現を阻害するようにｓｉＲＮＡで処理した細胞を、一方または両方のＨＳＰ９０アイソフォームに対する薬剤の活性を識別するために使用することもできる。
また、ＨＳＰ９０αとＨＳＰ９０βの阻害剤に関して、阻害剤間を識別するために市販のキットを使用することもできる（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
実施例１１−食事誘発性のインスリン抵抗性肥満モデルにおけるＨＳＰ９０βのノックダウンの概念実証のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の評価
代謝症候群、肥満症、インスリン抵抗性、および／または２型糖尿病の予防および／または治療における治療標的としてのＨＳＰ９０βをさらにバリデートするための例示的動物試験モデルを以下に示す。
１．目的および原理
本試験の目的は、
１．適当なｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてＨＳＰ９０βの発現を効率的にノックダウンするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を同定および特性評価すること
２．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＳＰ９０βのノックダウンが、治療利益を伴って、機能的な生理応答をもたらすことを実証すること
である。
所望の転帰は、ＨＳＰ９０βのノックダウンによる肥満表現型および糖尿病表現型の回避である。
概念実証（ＰｏＣ）試験は、食事誘発性肥満（ＤＩＯ）およびインスリン抵抗性（ＩＲ）マウスモデルで行う。
試験は２部で行う。
１．様々な組織におけるＨＳＰ９０β発現の分析による、ｉｎ ｖｉｖｏモデルでＨＳＰ９０β発現を有意にノックダウンする１以上のＡＳＯの同定。
２．ＨＳＰ９０β発現の阻害が体重増の開始および代謝症候群の発症を予防、軽減、または遅延することを実証するための、食事誘発性肥満およびインスリン抵抗性を受けているマウスに対する１または複数のＡＳＯの投与。
以下に提供する実験方法は、他の核酸治療薬（ｓｉＲＮＡ、ｄｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、抗体に基づく治療薬、および小分子に基づく治療薬をアッセイするために容易に改変することができると理解される。さらに、この試験は、糖尿病および代謝障害の他のモデル（上記に示したものなど）の使用を含むように改変することもできる。以下に述べるように、得られる特定の結果に応じて、時間および用量範囲は、有効性および毒性の予備的分析に基づいて改変することができる。このような改変は十分当業者の能力の範囲内である。
２．有意性
ＨＳＰ９０β発現のノックダウンは、高脂肪食の結果としての体重増および食事誘発性インスリン抵抗性を遅延、軽減、または予防し、肥満症、インスリン抵抗性、２型糖尿病、および代謝症候群（血圧上昇、脂質レベルの上昇、中心性肥満、低ＨＤＬ、ならびに空腹時および／または糖負荷試験の際のグルコース上昇のうち１以上を含む）のうち１以上の治療または管理の標的としてのＨＳＰ９０βの有用性を実証する。
３．実験アプローチ
パートＩ：ＡＳＯを介したＨＳＰ９０βのノックダウンおよびｉｎ ｖｉｖｏ（用量漸増試験）
オリゴヌクレオチドの選択。 ＨＳＰ９０β発現の特異的阻害に有効なＡＳＯを同定するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する。予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで同定された１以上のＡＳＯをその後のｉｎ ｖｉｖｏ試験に用いる。
有効性および毒性の分析。 １群当たり５匹を含む６群全てのマウスを標準的な固形飼料で維持する。各５匹の２群を含むコホート１のマウスに、通常用量のＡＳＯ（３０〜４０ｍｇ／ｋｇ）または高用量のＡＳＯ（１００〜１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を週に２回、２週間施す。コホート２およびコホート３の処置は、すぐ前のコホート（コホート２の場合にはコホート１、コホート３の場合にはコホート２）の有効性および毒性の評価後に開始する。その後、各コホートについて、処置期間を２週間延ばす（コホート１は２週間；コホート２は４週間；コホート３は６週間）。前のコホートで得られた結果に基づいて次の判断を下す。
・有効性無し−毒性無し：コホートパート１の処置方法を、処置用量を１０倍に増して繰り返す。加えて、処置期間を２週間延ばす。
・有効性有り−毒性無し：このＡＳＯに関しては、以下に示すパート２の処置をすぐに開始する。加えて、毒性閾値を決定するために処置用量を５０倍に増し、コホート１のように２週間の投与計画ではなく４週間の投与計画で、パート１の処置方法を繰り返す。
・有効性有り−毒性有り：処置用量を１０倍に増してパート１の処置を繰り返し、同じ処置期間を用いる。
・有効性無し−毒性有り：このＡＳＯはさらなる試験対象とは見なされない。
各コホートについて、全ての群で、毎回の注射前および屠殺前に体重、グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルを測定する。さらに、ＡＳＯの血漿レベルも、市販のキット、例えば、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）ｓｓＤＮＡ定量アッセイおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）からのキットを用いて測定する。２週間後、マウスを屠殺し、すぐに針を用いて心臓穿刺（０．５〜１ｍＬ）を行い、血液を回収する。その後、剖検を行う。選択された組織を回収し、秤量し、急速冷凍した後、使用まで−８０℃で保存する（脂肪組織および肝臓を除く）。
下記のサンプルおよび組織を順次、回収する。
・血漿調製物用の血液
・肝臓（急速冷凍、パラフィン包理用固定液）
・骨格筋（急速冷凍）、後肢筋および背筋（別のバイアルに保存）を含む
・脂肪組織（急速冷凍およびパラフィン包理用に固定）、白色脂肪組織（性腺周囲および鼠径部）および褐色脂肪組織（別のバイアルに保存）を含む
・膵臓（急速冷凍）
・腎臓（急速冷凍）
ＨＳＰ９０βのノックダウン効率は、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット法、および／または免疫組織化学を用いて標的の発現レベルを測定することにより決定する。さらに、血漿インスリン、レプチン、アディポネクチン、ＴＮＦα、ＰＡＩ−１、血清アミロイドＡ、およびＩＬ６の血漿レベルは、ＥＬＩＳＡを用いて測定する。最も効率の高いノックダウンを伴うＡＳＯを選択し、以下のパートＩＩに示すその後の実験に使用する。
動物から回収した血漿および肝臓は、毒性の予備評価に使用する。ＬＤＨ放出アッセイを炎症マーカーに関するＥＬＩＳＡとともに行う。さらに、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）活性アッセイを血漿および肝臓ホモジネートで行う。肝臓のＧＳＨレベルを、肝機能の付加的な読み取りとして確認する。
パートＩＩ−高脂肪食誘発肥満およびインスリン抵抗性モデルに及ぼすＨＳＰ９０βノックダウンの代謝影響に関する概念実証試験
代謝影響に関する概念実証試験は、下記のパラメーター：体重、食後および空腹時血糖値、食物摂取、水分摂取、身体組成、Ｏ２消費、ＣＯ２生産、糖負荷試験（ＧＴＴ）、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）、ピルビン酸負荷試験（ＰＴＴ）、および随意活動の分析を含む。
６０％ｋｃａｌ％脂肪の高脂肪食（ＨＦＤ）下の８週齢、雄、痩せ型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、実験により予め決定された用量のＨＳＰ９０β ＡＳＯ、対照ＡＳＯ、または生理食塩水で１週間に２回、腹腔内注射（ＩＰ）により処置する。別々の痩せ型対照群に生理食塩水または対照ＡＳＯのいずれかを施し、標準的な低脂肪固形飼料（低脂肪標準食（ＬＦＤ）１０％ｋｃａｌ％脂肪）で維持する。処置群を以下に示す。
・ＬＦＤ生理食塩水処置（２１匹）
・ＬＦＤ対照ＡＳＯ処置（２１匹）
・ＨＦＤ生理食塩水処置（２１匹）
・ＨＦＤ対照ＡＳＯ処置（２１匹）
・ＨＦＤ ＨＳＰ９０β ＡＳＯ処置（２１匹）
２１匹の各群を各７匹のマウスの３コホートに分ける。マウスを４週間、６週間、および８週間の期間、処置および評価する。後のコホートには２週間の遅れがあり、すなわち、コホート２は、コホート１の処置の開始の２週間後にＡＳＯ処置およびＨＦＤ処置を開始する。このように、コホート２の処置は、コホート１で好結果が見られた際に、６週間の処置ではなく４週間の処置に変更することができる。コホート１が予想された結果を示さない場合には、コホート２は６週間の処置を受ける。さらに、各コホート（４週間、６週間および８週間）について、ＧＴＴ試験およびＩＴＴ試験で有効性が示された場合には、ＰＴＴに順応させるためにそれらの処置を１週間延長する（４週間は５週間とし、６週間は７週間とし、８週間は９週間とする）。
処置の開始からＩＰ注射の１週間前まで、１週間に２回、体重および食後血糖を監視する。
コホート１（４週間 ＡＳＯ処置）では、ＡＳＯ処置の開始後１７日目と２４日目にＧＴＴおよびＩＴＴを行う。ＧＴＴおよびＩＴＴから陽性結果が見られれば、３１日目にＰＴＴを行う。４週間（または５週間）のＡＳＯおよび対照処置後に、コホート１のマウスを安楽死させ、さらなる分析のために組織サンプルおよび血液サンプルを回収する。
コホート２（６週間 ＡＳＯ処置）では、ＡＳＯ処置の開始後３１日目と３８日目にＧＴＴおよびＩＴＴを行う。ＧＴＴおよびＩＴＴから陽性結果が見られれば、４５日目にＰＴＴを行う。６週目または７週目の処置の後、コホート２のマウスを安楽死させ、さらなる分析のために組織サンプルおよび血液サンプルを回収する。
コホート３（８週間 ＡＳＯ処置）では、ＡＳＯ処置の開始後４５日目と５２日目にＧＴＴおよびＩＴＴを行う。ＧＴＴおよびＩＴＴから陽性結果が見られれば、５９日目にＰＴＴを行う。８週目または９週目の処置の後、コホート３のマウスを安楽死させ、さらなる分析のために組織サンプルおよび血液サンプルを回収する。
回収した組織を、遺伝子発現および標的サイレンシングに関してｑＰＣＲ、ウエスタンブロット法、および／またはＩＨＣにより分析する。また、インスリンシグナル伝達経路における他の遺伝子およびタンパク質の発現も分析することができる。各時点で回収した血液を処理して血漿を得、ＴＧ、ＦＦＡ、総コレステロール、インスリン、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、アディポネクチン、ＴＮＦα、およびＰＡＩ−１を含む種々の生化学分析を行う。
１０匹のさらなるコホートを下記の計画で処置する。
・ＨＦＤ対照ＡＳＯ処置（５匹）
・ＨＦＤ ＨＳＰ９０β ＡＳＯ処置（５匹）
５４日目から５７日目のＶＯ２、ＶＣＯ２、ＲＱ（呼吸商）および熱発生を測定することにより食物摂取、水分摂取、随意活性および呼吸を評価するために、マウスを、包括的実験動物監視システム(Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System)（ＣＬＡＭＳ）を用いた代謝ケージでの監視下に置く。同じ週の５１日目に二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）により身体組成を決定する。このコホートに種々のＡＳＯを１週間に２回、８週間注射する。
材料および方法
動物
全ての比較には、同じ性（雄）、年齢および遺伝的背景のマウスを使用する。雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バーハーバー、ＭＥ）から入手し、当初は、２２℃、１２：１２時間の昼夜周期で、１ケージ当たり４〜５匹を飼育する。化合物による処置前の１週間、マウスを現地動物施設で順化させる。
８週例のはじめに、試験段階（パートＩまたはパートＩＩ）に応じて、マウスに高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓカタログ番号：Ｄ１２４９２；６０ｋｃａｌ％脂肪、２０ｋｃａｌ％タンパク質、および２０ｋｃａｌ％炭水化物）または標準低脂肪食（１０％ｋｃａｌ％脂肪）を与える。マウスにＡＳＯまたは生理食塩水を１週間に２回注射する。毎回の注射前に、体重、グルコースレベルおよび血漿インスリンレベルを測定する。
腹腔内糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）
６時間の絶食の後に糖負荷試験（ＧＴＴ）を行う。初期空腹時血糖値を決定した後、用量２．０ｇ／ｋｇ体重（２ｇ／ｋｇ体重）での２０％デキストロース溶液腹腔内（ｉｐ）注射を行う。グルコース注射から１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、および１８０分後に尾静脈から、市販のグルコースモニター、例えば、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｋ（登録商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅグルコメーター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて血糖値を測定する。ＧＴＴ時の曲線下面積（ＡＵＣ）を、市販のソフトウエアプログラム、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて計算する。種々の群のＧＴＴ試験は並行して実施する。尾静脈グルコース測定の各時点では、約４０μＬの尾静脈血を採取し、以降の、グルコース注射後０、１５、および３０分の時点に関する、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡを用いたインスリンレベルアッセイのために血漿を調製する。
腹腔内インスリン負荷試験（ＩＰＩＴＴ）
インスリン負荷試験（ＩＴＴ）は１時間の絶食後に行う。初期血糖値を決定した後、ヒトインスリン（１〜２Ｕ／ｋｇ；Ｈｕｍｕｌｉｎ Ｒ；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、インディアナポリス、ＩＮ）の注射（ｉｐ）を行う。血糖値は、上記のように、尾静脈から、インスリン注射後１５、３０、６０、９０、および１２０分の時点で測定する。インスリン注射量は、高脂肪食下のマウスにおける肝臓インスリン抵抗性の誘導によるインスリン応答によって実験的に決定される。
腹腔内ピルビン酸負荷試験（ＩＰＰＴＴ）
ピルビン酸負荷試験は６時間の絶食後に施与する。初期血糖値を決定した後、生理食塩水に溶かしたピルビン酸塩（２ｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）の注射（ｉｐ）を行う。血糖値は、上記のように、尾静脈から、ピルビン酸注射後１５、３０、６０、９０、および１２０分の時点で測定する。試験時の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する。
二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）
種々の処置群の身体組成は、製造者が推奨する手順に従い、ＬＵＮＡＲ ＰＩＸＩｍｕｓ（登録商標）マウスデンシトメーターを用いてスキャンする二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）により決定する。除脂肪体重、脂肪体重、全身体組織重、骨密度、および骨塩量を記録および分析する。
包括的実験動物監視システム（ＣＬＡＭＳ）
ＣＬＡＭＳ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コロンバス、ＯＨ、ＵＳＡ）代謝監視ケージを用いて、水平および垂直活動、摂食および給水、酸素消費、およびＣＯ２生産を同時に監視する。ＡＳＯ注射マウスおよび対照マウスを個々にＣＬＡＭＳケージに入れ、１〜２日間ケージに順化させた後、４日間にわたって監視する。絶食状態と給餌状態の両方で種々のパラメーターを記録する。食物および水の消費は累積データとして直接測定する。１時間毎のファイルは、各パラメーター、すなわち、酸素消費量、ｍｌ／ｋｇ／時（ＶＯ２）、二酸化炭素生産量、ｍｌ／ｋｇ／時（ＶＣＯ２）、呼吸商、熱（ｋｃａｌ／時）、累積食物（ｇ）、累積給水（ｇ）、ＸＹ総活動（全水平ビーム切断回数）、ＸＹ歩行活動（最低３つの異なる、連続的水平ビームの切断回数）、およびＺ活動（全垂直ビーム切断回数）に関する全測定値を表示する。データは、３０秒のサンプリング期間記録される。ＣＬＡＭＳデータは、除脂肪体重を用いて正規化することにより分析する。
組織の回収
各プロトコールの終了時には、翌週にマウスを安楽死させ、組織を回収し、急速冷凍による保存の前に秤量し、その後、−８０℃で保存するか、または標準的な方法を用い、パラフィン包理用にホルマリンで固定する。心臓穿刺により血液を回収し、血漿を調製する。
下記のサンプルおよび組織を回収する。
・肝臓（急速冷凍、パラフィン包理用固定液）
・骨格筋（急速冷凍）、後肢筋および背筋（別のバイアルに保存）を含む
・脂肪組織（急速冷凍およびパラフィン包理用に固定）、白色脂肪組織（性腺周囲および鼠径部）および褐色脂肪組織（別のバイアルに保存）を含む
・膵臓（急速冷凍）
・腎臓（急速冷凍）
均等論
当業者ならば、本明細書に記載されている具体的実施形態および方法の多くの均等物を認識し、または慣例の実験のみを用いて確認することができるであろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
参照による引用
本出願に引用されている各参照文献、特許、特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋ番号は、各参照文献が本明細書の一部とされることが個々に示されている場合と同様に、参照により本明細書の一部とされる。

Claims (51)

  1. 対象において代謝症候群を治療する方法であって、前記対象にＨＳＰ９０モジュレーターを投与し、それにより、前記対象において代謝症候群を治療することを含む、方法。
  2. 前記ＨＳＰ９０モジュレーターがＨＳＰ９０阻害剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０βの阻害剤である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０βの特異的阻害剤である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記ＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０αの阻害剤である、請求項２または３に記載の方法。
  6. 前記代謝症候群が２型糖尿病を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記代謝症候群が１型糖尿病を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記代謝症候群がインスリン抵抗性を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記代謝症候群がインスリン欠乏症を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記代謝症候群が肥満症を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記代謝症候群が高インスリン血症を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記代謝症候群が耐糖能異常（ＩＧＴ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  13. 代謝症候群を有する対象が下記徴候：
    ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
    ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
    ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
    ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
    ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
    のうちの３つ以上を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＨＳＰ９０阻害剤が核酸阻害剤を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記核酸阻害剤がアンチセンス核酸分子を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記核酸阻害剤が二本鎖核酸分子を含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記核酸阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される二本鎖ＲＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＨＳＰ９０阻害剤が抗体を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＨＳＰ９０阻害剤が小分子を含む、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記小分子が、ロニダミンまたはその類似体、セラストロールまたはその類似体、ゲデュニンまたはその類似体、およびクメルマイシンまたはその類似体からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 代謝症候群を治療することが対象において血糖値を正常化することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 代謝症候群を治療することが対象においてＨｂ１Ａｃレベルを正常化することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 代謝症候群を治療することが、循環不良に関連する糖尿病の少なくとも１つの合併症の予防を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 代謝症候群を治療することが２型糖尿病の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  25. 代謝症候群を治療することが１型糖尿病の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  26. 代謝症候群を治療することがインスリン抵抗性の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  27. 代謝症候群を治療することがインスリン欠乏症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  28. 代謝症候群を治療することが高インスリン血症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  29. 代謝症候群を治療することが耐糖能異常（ＩＧＴ）の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  30. 代謝症候群を治療することが肥満症の少なくとも１つの徴候または症状の改善を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  31. 代謝症候群を治療することが、
    ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
    ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
    ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
    ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
    ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
    のうちの少なくとも１つの改善を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 代謝症候群を治療することが１３０／８５ｍｍＨｇ以上の高い血圧の改善を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 代謝症候群を治療することが１００ｍｇ／ｄＬ以上の高い空腹時血糖の改善を含む、請求項３１に記載の方法。
  34. 代謝症候群を治療することが大きな腹囲の改善を含み、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である、請求項３１に記載の方法。
  35. 代謝症候群を治療することがＨＤＬコレステロールを増加させることによる低ＨＤＬコレステロールの改善を含み、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い、請求項３１に記載の方法。
  36. 代謝症候群を治療することが１５０ｍｇ／ｄＬ以上の高いトリグリセリドの改善を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 代謝症候群を治療することが脂肪肝の改善を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 代謝症候群を治療することが脂肪沈着の調節を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 対象において代謝症候群を診断する方法であって、
    ａ）前記対象由来のサンプルにおいてＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを決定すること；および
    ｂ）前記対象由来のサンプルにおけるＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを対照サンプルと比較し、対照サンプルと比較した場合の対象サンプルにおけるＨＳＰ９０βの発現または活性の増強が、前記対象における代謝障害の指標となること
    を含む、方法。
  40. 対象において代謝症候群を監視する方法であって、
    ａ）前記対象から第１の時点および第２の時点でサンプルを得ること；
    ｂ）第１の時点および第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを決定すること；および
    ｃ）第１の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルを第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルと比較し、第１の時点と比較した第２の時点のＨＳＰ９０β発現または活性のレベルの変化が、前記対象における代謝症候群の変化の指標となること
    を含む、方法。
  41. 前記ＨＳＰ９０β発現のレベルがＨＳＰ９０βタンパク質またはＨＳＰ９０ＡＢ１遺伝子の発現レベルを含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. ＨＳＰ９０β発現または活性の増大が代謝症候群の増悪の指標となる、請求項４０に記載の方法。
  43. ＨＳＰ９０β発現または活性の低下が代謝症候群の改善の指標となる、請求項４０に記載の方法。
  44. 前記代謝症候群が２型糖尿病を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記代謝症候群が１型糖尿病を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記代謝症候群がインスリン抵抗性型を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記代謝症候群がインスリン欠乏症を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記代謝症候群が肥満症を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記代謝症候群が高インスリン血症を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記代謝症候群が耐糖能異常（ＩＧＴ）を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  51. 代謝症候群を有する対象が下記徴候：
    ａ）１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧；
    ｂ）１００ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖；
    ｃ）大きな腹囲、ここで、大きな腹囲は、男性では４０インチ以上、女性では３５インチ以上である；
    ｄ）低ＨＤＬコレステロール、ここで、低ＬＤＨコレステロールは、男性では４０ｍｇ／ｄＬより低く、５０ｍｇ／ｄＬより低い；
    ｅ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド
    のうちの１つ以上をさらに示す、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
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