CN105214069A - 成纤维细胞生长因子21在急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可用于化学性和药物性引起的急性肝功能衰竭的早期诊断指标，以及酒精性脂肪肝病的诊断指标——成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)。急性肝功能衰竭的病程较快，迫切需要一个能够进行早期诊断的指标。本发明提供的FGF21诊断指标具有比目前现行的谷丙转氨酶和谷草转氨酶更加敏感的特点。同时本发明发现重组人FGF21能够保护肝组织受对乙酰氨基酚的损伤。综上所述，本发明具有良好的临床应用价值。

Description

成纤维细胞生长因子21在急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学特别是蛋白检测领域，尤其是具体涉及一种血清中的蛋白在诊断和治疗急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝中的作用。

背景技术

肝脏是人体内最大的代谢器官，是许多重要物质代谢、贮存，解毒、排泄代谢产物，维持水电解质平衡，调整激素代谢、免疫功能的中心站。肝脏在保护机体的同时，又易被各种毒物、药物以及化合物的代谢产物损伤。当肝脏发生病理改变时，还会导致全身代谢物、血液循环系统、消化系统、内分泌系统等改变，并影响到内源性小分子代谢物的转归。肝病的发生率一直占据各类疾病的前列。一项综合了48项调查，累积356357个样本的流行学调查结果表明，非酒精性脂肪肝的比例达到20.09％(17.95-22.31％)。同时，一项包含3543个样本的社区临床研究表明，脂肪性肝病的发生率为17.2％，其中酒精性脂肪肝，疑似酒精性脂肪肝，和非酒精性脂肪肝的发病率分别为0.4％，1.8％和15.0％。2008年肝癌的发病病例达402208例，占所有癌症的14.3％，肝癌死亡病例达372079例，占所有癌症的19.0％。肝癌的发病率达23.7/100000，在所有癌症类型中排名第三。肝癌以成为中国的一项主要的公共健康事件，其发生率和死亡率都在逐年增加。

近年来，随着临床用药种类的迅速增加及患者自行服药或随意加大药物剂量的概率增加，药物性急性肝损伤的发生率亦相应增加。急性肝功能衰竭是一种少见但是致死率相对较高的疾病。急性肝损伤或者急性肝功能衰竭的诱因有很多，包括(1)病毒性肝炎(甲、乙、丙等)；(2)化学物中毒：对乙酰氨基酚、甲基多巴、硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、氟烷、阿司匹林、四氯化碳、水杨酸、黄磷等，可能引起肝衰竭。(3)外科病症：肝衰竭可能在手术、创伤、休克等的病人中发生，常原先有肝硬化、阻塞性黄疸等肝功能障碍；在多器官功能障碍综合症中也可有肝衰竭。(4)其他：妊娠期(多在后3个月)、Wilson病等过程中也可发生肝衰竭。药物引发的急性肝功能衰竭是药物致死的表现和最主要的原因。同时，药物引发的急性肝功能衰竭也是很多药物停用的主要原因。药物引发的急性肝功能衰竭的发生率非常低，在西方国家，大概在十万分之十四。在所有的急性肝功能损伤中，其中由药物引发的占10-52％。

除了药物能够引起急性肝功能衰竭外，一些化学物质也能引发急性肝功能衰竭。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为″亲肝毒物″，例如三硝基甲苯、四氯化碳、砷、汞、二硝基酚、乙醛、有机磷等。这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，病变的过程与感染的剂量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变形、肝硬化和肝癌。四氯化碳、黄磷等可干扰脂蛋白的合成与转运。四氯化碳还能在体内代谢产生一种氧化能力很强的中间产物，导致生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的磷脂，改变细胞的结构与功能。

急性肝功能衰竭在不同的地区，其主要的诱因也不同。在西方国家，对乙酰氨基酚是最主要的肝衰竭的原因，而由其他正常剂量非对乙酰氨基酚药物所占的比例和由甲型肝炎病毒与乙型肝炎病毒的两者引起的比例大约持平。对乙酰氨基酚引发的死亡率在32％到50％之间。对乙酰氨基酚(醋氨酚)，具有抗热镇痛的作用，目前国内多种抗感冒药物的主要成分，包括：白加黑，泰诺，感冒灵胶囊，快克，速效伤风胶囊，银得菲，999感冒灵冲剂等等。在英国和美国，对乙酰氨基酚被认为是目前已知的一个能够引起急性肝功能衰竭的药物。在非洲和亚洲，急性肝功能衰竭的主要诱因是病毒性肝炎，而在欧洲和北美地区，药物毒性占据急性肝衰的主要诱因。在中国，药物引起的急性肝功能衰竭占94.8％。2007年，由中华医学会消化病学分会肝胆疾病协作组牵头，第四军医大学西京医院消化科等19家医院消化科参与开展的“全国多中心急性药物性肝损伤住院病历调查分析”研究。该研究采用国际RUCAM评分系统，对我国急性药物性肝损伤的发病状况、临床征象及引起发病的药物等进行了系统的分析。研究人员发现，我国急性药物性肝损伤发病呈逐年增加趋势，抗结核药物、中成药或中草药可能是急性药物性肝损伤的主要诱因。临床上多种药物能够引起急性肝功能衰竭，如：对乙酰氨基酚、曲格列酮(抗糖尿病药物)、抗结核病药物、海罗芬类麻醉药、抗生素、非甾醇类抗炎药物(溴芬酸)(苯噁丙酸)。

目前临床上对于药物或其他诱因引起的急性肝功能衰竭，其诊断的方法也不同。临床上对于急性肝功能的衰竭主要是通过临床症状来判断，如明显的不适，恶心，以及继发的黄疸症症状等，然而一旦确诊黄疸是由药物引发的急性肝功能衰竭导致的，病人距离其死亡就已经非常接近了。同时，仅仅通过身体的变化来判断是否是急性肝功能衰竭是不充分的，很容易与革兰氏阴性菌引起的败血症或者瘾君子混淆。现在Hy'srule被用于预测药物肝功能衰竭。即患者血液中谷丙转氨酶(以下简称ALT)的含量是正常范围上限的3倍以上，胆红素为正常范围上限的2倍以上。然而，这种诊断方法还需要进一步的研究。一方面ALT并不是在所有药物引起的急性肝功能衰竭中都是会上升的，如在罗格列酮引起的急性肝功能衰竭中，ALT并不会显著上升；其次ALT发生显著性变化时，已为发病中期或后期。因此，该检测方法在敏感程度和准确度方面都有待提高，常造成误诊或漏诊，尤其是在两种或两种以上肝损伤类型交叉出现时，该缺点尤为突出。此外，酒精性肝病早期诊断都比较困难，肝脏生物化学指标、影像学和组织病理学检查基本正常或轻微异常。综上所述，寻找用于急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝病的早期预测诊断指标是非常紧迫的一项任务。

酒精性肝损伤简称酒精肝，是遗传-环境-代谢应激相关性疾病。人体的肝脏除了解毒外，还能降解和代谢吸收酒精，如果过量饮酒，酒精对肝细胞的毒性通过肝脏的代谢，逐步造成对肝细胞的破坏，使肝细胞膜表面的脂质成分过度氧化，从而破坏了肝细胞膜，形成酒精性肝损伤。酒精性肝损伤早期可无任何症状，但此时肝脏内部组织已发生了病理改变。黄疸、肝肿大和压痛为酒精性肝炎病人的常见体征，有81％的病人出现肝肿大，77％的病人有黄疸，转氨酶中度增高。据统计，全世界约有1500万～2000万人酗酒，这些人中有10％～20％(150万～400万)有不同程度的酒精性肝损伤。山东大学附属齐鲁医院和泰山医学院附属医院的马立宪等联合调查研究了7295个山东常住人口样本，结果发现624个样本被诊断为酒精性脂肪肝，发病率达8.55％。同时，酒精性脂肪肝的发病率与年龄，性别职业，教育水平，家庭收入，婚姻状况等显著相关，酒精性脂肪肝在40-49岁，男性，高职位，低家庭收入，低受教育水平以及未婚人群中发病率显著升高。此外一次性饮酒过量，亦可能发生包括肝脏在内的多器官功能的衰竭。酒精性脂肪肝的常规诊断主要为AST(谷草转氨酶)，ALT，B超，CT等等。

成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)由209个氨基酸所组成，其中N末端含有一个由28个氨基酸残基组成的信号肽。人类FGF21基因坐落在19号染色体上，由3个外显子组成。FGF21主要在肝脏、脂肪和胰腺中表达，此外，在骨骼肌、胸腺及内皮细胞中也有所表达。近期的研究表明：FGF21具有内分泌因子的功能，参与机体物质代谢，维持机体内糖脂代谢的平衡。FGF21基因在肝脏中的表达主要受到禁食和饱腹信号的影响。在禁食状态下，通过激活过氧化物酶增殖体激活受体(PPARα)和胰高血糖素刺激蛋白激酶(PKA)的作用来上调FGF21基因的表达；而葡萄糖作为一种饱腹的信号作用，也会通过激活碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)的作用来诱导肝脏中FGF21基因的表达。在脂肪细胞中，PPARγ和ChREBP在调节FGF21基因的表达有着重要的作用。然而，就FGF21与化学性、药物性肝损伤以及酒精性肝病的研究而言，无论是动物还是临床方面，都知之甚少。

在肝损伤早期能够对肝损伤进行积极治疗防止疾病的恶化和蔓延，对肝脏疾病来说是十分重要的。因此，研究肝损伤更敏感、准确的标记物有重要的意义。F如血清检测ALT、AST检查作为各型肝病必查的指标一样，FGF21是否能够作为诊断急性肝功能衰竭和酒精性脂肪给的常用检查参数，对于这些疾病的预防和早期诊断具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供急性肝功能衰竭与FGF21之间存在密切相关性的证据。

为了达到上述目的，本发明模拟急性肝功能衰竭的病理机制，建立化学性和药物性诱发的急性肝损伤模型：化学性——四氯化碳(CCl₄)引起的急性肝损伤；药物性——对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝损伤。上述模型的建立方法如下：

1.四氯化碳(CCl₄)致急性肝功能衰竭模型：小鼠体重为20～25g，SPF环境饲养，将CCl₄溶于橄榄油，按10mL/kg经小鼠腹腔注射，一次给予0.125％CCl₄溶液，12h后处死，可建立小鼠肝损伤模型。

2.对乙酰氨基酚(APAP)致急性肝功能衰竭模型：小鼠体重为20～25g，SPF环境饲养，将对乙酰氨基酚溶于40℃无菌生理盐水，给小鼠500mg/kg一次性腹腔注射，24h后处死，可建立小鼠肝损伤模型。

为了提供二种急性肝功能衰竭与FGF21之间相关性的依据，本发明在建立小鼠急性肝功能衰竭模型时，对12h(CCl₄致急性肝功能衰竭模型)或24h(APAP致急性肝功能衰竭模型)内，小鼠血清中FGF21的浓度进行监测。同时，为客观评价FGF21在2种急性肝功能衰竭模型中的变化，本发明检测了不同时间点肝脏组织中FGF21蛋白mRNA的表达水平。

本发明的目的之一是提供一种新型的可用于且早于ALT和AST的急性肝功能衰竭的诊断指标。

为了达到上述目的，本发明评价FGF21作为急性肝功能衰竭早期诊断指标的优势，本发明比较了其与目前临床上用于急性肝功能衰竭的诊断指标在疾病发生进程中，血清和肝脏组织中发生显著性变化的时间点的先后。所述目前临床上诊断指标指ALT，AST。

本发明的另一个目的是提供FGF21在急性肝功能衰竭小鼠模型中具有肝脏保护的作用。

为了达到检测FGF21在急性肝损伤过程中是否具有肝脏保护作用，本发明在对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤模型建模的同时，进行FGF21蛋白给药，并观察不同时间点血清中，以及肝脏中ALT，AST和FGF21的含量或表达水平。同时，本发明通过肝组织切片，直观地观测了在建立急性肝功能衰竭后24h后小鼠肝脏组织的损伤情况。

本发明的另一个目的是提供酒精性脂肪肝与FGF21之间存在紧密型关系的依据。

为了达到上述目的，本发明考察了酒精性脂肪肝患者和正常人群血清中FGF21的水平。

本发明共检测了60例ALD患者(男29例/女31例)和50例(男26例/女24例)年龄、性别相匹配的正常人群血清中的FGF21的水平，并比较分析了模型组样本与对照组样本FGF21蛋白之间的差异。

结合本发明研究结果，建议：

1.将FGF21列入药物性和化学性急性肝功能衰竭的早期诊断指标。肝损伤诊断时，采用以下标准：血清中FGF21含量异常升高时，判断其肝脏功能可能发生损伤，并建议其做进一步的确诊。

2.将FGF21列入临床上酒精性脂肪肝ALD辅助诊断指标，采用以下标准：人血清中FGF21含量的正常值为167.9±15.6ng/L；如果血清中FGF21的含量达到或者超过475.5±47.5ng/L，表明其有ALD的可能，但不作为确诊的唯一依据。

3.将血清FGF21浓度作为长期酗酒，体质虚弱易感冒人群潜在肝损伤的常规诊断指标。

本发明的益处∶

1.本发明提供了将FGF21作为脂肪肝的辅助诊断指标的证据。在目前对于肝脏疾病发病率呈逐年上升趋势的大背景下，本发明有利于提供急性肝功能衰竭和酒精性脂肪肝的早期临床辅助性诊断指标。

2.本发明提供了FGF21与2种急性肝功能衰竭之间的相关性证据，即四氯化碳和对乙酰氨基酚引起的肝功能衰竭。在目前ALT作为急性肝功能衰竭诊断指标时具有反应滞后，且存在实用性争议的情况下，将FGF21作为急性肝功能衰竭的辅助诊断指标，对于急性肝功能衰竭的早期诊断具有重要的意义。

3.本发明提供的生物标记物相比于目前常用的肝损伤诊断指标，具有早期诊断和灵敏度高的优点。本发明符合临床上对于急性肝功能衰竭进行早期、特异性诊断的迫切需求，可提供急性肝功能衰竭的早期诊断和病程干预。

4.本发明提供了一种酒精性脂肪肝的预警指标，对于长期酗酒人群酒精性肝病的及早发现和预防具有重要的意义。

附图说明

图1注射生理盐水与四氯化碳(CCl₄)12h后小鼠肝脏HE染色对照。

图2四氯化碳(CCl₄)引起的小鼠急性肝功能衰竭模型中血清ALT，AST和FGF21的变化情况。

图3四氯化碳(CCl₄)引起的小鼠急性肝功能衰竭模型中肝脏FGF21基因表达的时间变化。

图4注射对乙酰氨基酚(APAP)后小鼠肝脏与正常小鼠肝脏HE染色对照。

图5对乙酰氨基酚(APAP)引起的肝损伤中FGF21、ALT、AST倍数变化情况。

图6注射对乙酰氨基酚(APAP)6h后相关组织FGF21的表达情况。

图7注射对乙酰氨基酚(APAP)后，各时间点肝脏组织FGF21的表达情况。

图8脂肪性肝病患者血清中循环FGF21水平变化情况。

图9脂肪性肝病患者血清FGF21水平与甘油三酯代谢之间的关系。

具体实施方式

实施例1FGF21用于评价四氯化碳(CCl₄)所致小鼠发生的急性肝功能衰竭

1.动物分组及药物处理安排

取8周龄C57BL/6j小鼠20只，分为A组和B组，每组10只。A组小鼠按照10mL/kg的剂量经腹腔一次性注射0.125％CCl₄溶液，B组经腹腔注射等剂量的生理盐水作为对照，分别在注射前(0h)及注射后4h、6h、8h从尾静脉收集其血液样品，12h处死。另取8周龄C57BL/6j小鼠25只，分为I、II、III、Ⅳ、V组，每组5只。每组小鼠按照上述剂量腹腔注射CCl₄溶液，I组小鼠在CCl₄注射前(0h)处死，II、III、Ⅳ、V组小鼠分别在注射后2h、4h、6h、8h处死。

2.动物组织样品收集

将小鼠用10％水合氯醛麻醉，心脏取血收集血样标本，分离血清，用于检测FGF21蛋白浓度变化以及谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性变化；小鼠血样收集后，依次打开腹腔和胸腔，用灭菌的PBS进行心脏灌流，除去血管及器官组织中的残留血液，然后分离肝脏，将肝脏切分成几部分，一部分固定于4％多聚甲醛，制作成石蜡切片，用于进行HE染色；剩余部分肝大叶和肝小叶冻存于液氮中，用于分离提取RNA样品。

3.主要研究内容的具体实验方法

(1)血清FGF21ELISA检测

收集的全血样品于3000×g离心机4℃离心15min，取小鼠血清，采用AntibodyandImmunoassayservices提供的mouseFGF21ELISA试剂，检测血清FGF21水平。其具体的检测步骤如下：

a)将标准品和稀释后的样品加入ELISA板中，每孔100μL后室温孵育1h

b)弃去液体后洗板，每次1min，共3次，最后一次弃去洗液

c)每孔加入100μL的1×检测抗体，室温孵育1h

d)弃去液体后洗板，每次1min，共3次，最后一次弃去洗液

e)加入100μL辣根过氧化酶，室温孵育30min

f)弃去液体后洗板，每次1min，共4次，最后一次弃去洗液

g)加入100μL底物后室温孵育15min

h)每孔加入100μL终止液终止反应

i)读数，于450nm的酶标仪下读出所得的值

j)绘制标准曲线，计算各个样品的浓度

(2)血清ALT和AST检测

a)取上述实验所收集的小鼠血清，采用北京科美生物科技有限公司的ALT、AST试剂盒，参考其试剂盒的说明书对迈瑞全自动生化仪进行参数设置。

b)取50ul血液样品或稀释后样品进行检测，采用灭菌生理盐水进行稀释，其稀释倍数在1∶1-1∶50的范围。

c)质控管理

d)定标管理：定标液管理：增加定标液(eg.H₂O，质控)；批号；浓度水平(正常)；有效期；标准浓度输入；设置样本位(S1，S2)

e)样品申请

f)定标结果查询

(3)肝脏组织固定、包埋和H&E染色：

①肝脏组织固定、包埋：

a)固定：4％甲醛8h

b)保存：75％乙醇过夜

c)脱水：依次按80％乙醇1h、95％乙醇1h、95％乙醇45min、100％乙醇30min、100％乙醇30min进行脱水

d)透明：二甲苯I、二甲苯II依次按顺序各放置15min

e)浸蜡：软蜡、硬蜡依次按顺序各放置1.5h

脱水后石蜡包埋后，采用石蜡切片机切成5μm厚度的组织肝脏切片，60℃烘烤半小时待用，采用如下方法进行H&E染色。

②H&E染色：

1)试液配置

0.25％-0.5％水溶性伊红染液：0.25-0.5g水溶性伊红Y放入蒸馏水100ml溶解。

苏木素：先将1g苏木精溶于10ml酒精中，另将20g钾明矾和200ml蒸馏水放入较大的优质三角烧瓶中加温并搅拌，待全部溶解后，再放入苏木精酒精溶液。混合后煮沸1-2分钟。然后改用小火加温，慢慢加入0.5g氧化汞，同时不停地搅拌使其充分氧化。当液体变为深紫蓝色时，即迅速将三角烧瓶移入冷水中使之尽速冷却，室温静置数小时至一夜。用前过滤，每100ml滤液内加入0.5-1ml冰醋酸，以增强其染色力，染色时间为3-15分钟。

2)染色步骤

a)脱蜡：二甲苯5min×2次

b)水化：100％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、ddH₂O按此顺序各放置5min

c)苏木素染色：将组织切片置于苏木素中3min后自来水下冲洗10min

d)1％盐酸酒精分化：组织切片分化3sec后置于自来水下冲洗10min

e)伊红染色：组织切片置于伊红溶液中1min后自来水冲去多余的伊红

f)脱水：70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、100％乙醇，按此顺序各放置5min

g)透明：将组织切片放于二甲苯中30min

h)封片：中性树脂封片

(4)肝脏组织QPCR检测FGF21mRNA

①将存于液氮的各组小鼠肝脏组织取出，用经高压灭菌的手术剪刀剪取20-30mg肝组织于干净的1.5mLEP管中，加1mLTrizol，使用电动匀浆器高速匀浆组织，匀浆完组织放于冰上静置5min。

②RNA抽取：各管中加入0.2mL氯仿，盖紧EP管，上下颠倒混匀15s，室温静置2-3min；将组织于低温超速离心机上4℃12000g离心15min；取出EP管，此时EP管分三层，取上层液相于另备EP管中。

③RNA沉淀：加0.5mL异丙醇，室温静置10min(异丙醇是上层液体积的0.6-1倍)，4℃12000g离心10min；弃上清，加1mL75％乙醇清洗沉淀。

④RNA溶解：4℃7500×g离心5min；弃上清，干燥RNA；根据RNA的量适当加入DEPC水溶解，备用。

⑤RNA浓度测定：将提取的RNA在紫外分光光度计中测定260OD值、260/280比值，RNA浓度(μg/μL)＝OD260×稀释倍数×40/1000。

⑥根据检测完的RNA浓度，以20μL的反应体系，每次逆转录20ng-5μg总RNA量。

⑦RNA变性：将1μLoligo(dT)12-18(500μg/mL)，1μL10mMdNTP混合物(dATP，dTTP，dCTP，dGTP均为10mM，pH中性)，RNA加入到无核酸酶的0.2mL离心管中，加入DEPC水至13μL，混合物在65℃下加热5min，迅速置于冰上冷却。

⑧RNA逆转录：向微量离心管中加入4μL5×第一链合成缓冲液，2μL0.1MDTT，将各成分离心混合，并在37℃下孵育2min；向体系中加入1μLM-MLV(逆转录酶)。

⑨将体系置于PCR仪上37℃50min，70℃15min完成逆转，保存于-20℃冰箱备用。

根据实验的设计要求，通过美国国立图书馆基因库查询，设计小鼠FGF21的基因序列和18sRNA(内参)mRNA表达扩增引物，序列如下所示：

mFGF21F：5’-CTGGGGGTCTACCAAGCATA-3’

R：5’-CACCCAGGATTTGAATGACC-3’

18sRNAF：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’.

R：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’

取上述所获得的逆转好的cDNA，采用SYBR-Green定量PCR法，根据下面的反应体系和进行QPCR扩增：

SYBR-GreenQPCR反应体系：

SYBR-GreenQPCR扩增条件：

同时做熔解曲线分析。

4.统计学分析

所有实验数据均输入GraphPadPrism5.0统计软件包进行统计分析，P＜0.05为差异有显著性。主要实验数据来自三次重复实验，以mean±SD表示，P＜0.05为差异有显著性。

5.案例结果

(1)腹腔注射0.125％CCl₄溶液导致了小鼠急性肝脏损伤

在本项目中，以0.125％CCl₄溶液腹腔注射，12h内小鼠未出现死亡，不过6个时间点组的小鼠均有不同程度的中毒现象，精神状态表现萎靡、蜷缩、喜卧，严重的会出现明显的行动迟缓状态。而注射生理盐水的对照组小鼠行动灵活，精神状态良好。通过对两组小鼠解剖后可见实验组小鼠肝脏均发生病变，肝脏颜色变浅、肿胀、肝脏表明出现弥散性的颗粒状小点，对照组小鼠肝脏光滑、色泽红润。对两组小鼠的肝脏进行HE染色后可以发现，CCl₄处理后，小鼠肝脏血管周围的细胞出现了大量的坏死或凋亡状况，细胞核开始固缩，形成了大面积的损伤，其黑色箭头所指粉色部分为肝脏损伤区域，如附图1A，B所示，其中附图1A为正常小鼠肝脏切片，附图1B为CCl₄处理12h后小鼠肝脏的组织切片。

(2)四氯化碳(CCl4)诱导肝损伤小鼠血清中ALT水平显著升高

在本项目中，从附图2A中可以看出，腹腔注射CCl₄2、4h的时间点ALT活性变化水平，与同时间点的对照组相比无显著性差异，可能说明此时肝脏出现了损伤，但是损伤程度不明显。但在6h时间点，小鼠腹腔注射CCl₄后，显著上调了ALT的活性，且随着时间点急剧升高，在12h还具有继续上升的趋势。由此从ALT活性变化的总体规律来看，ALT在经CCl₄腹腔注射后的前期无变化，而在达到某一特定时间点活性突然增加。

(3)四氯化碳(CCl₄)诱导肝损伤小鼠血清中AST水平显著升高

在本项目中，从附图2B可以看出注射CCl₄的实验组血清中AST的活性所呈现的趋势与其ALT的趋势十分相似。两组小鼠血清中的AST活性在2、4h时均没有显著性差异，而从6h时间点开始，注射CCl₄的实验组血清中AST的活性开始急剧升高，而对照组血清的AST仍然处于低表达水平。在6、8、12h注射CCl₄的实验组与对照组小鼠的血清中AST活性出现了显著性差异。

(4)四氯化碳(CCl₄)诱导肝损伤小鼠血清中FGF21分泌表达

在本项目中，申请人观察了CCl₄诱导的小鼠肝损伤对FGF21表达的影响，结果发现：在该化学性肝损伤模型中，FGF21蛋白的表达情况较对照组显著上升。ELISA结果显示，与注射生理盐水的对照组小鼠(B组)相比较，给予0.125％CCl₄溶液腹腔注射处理后的小鼠(A组)显著上调了血清中FGF21的水平，且随着时间的推移而急剧上升，在6h时达到了最高值，其后再缓慢下降，与对照组小鼠相比仍较高，FGF21水平在2、4、6、8、12h时差异都具有统计学意义，如附图2C所示。

(5)四氯化碳(CCl₄)诱导肝损伤小鼠血清中FGF21变化水平要比ALT、AST变化更灵敏

在本项目中，为了比较CCl₄诱导的小鼠肝损伤血清中FGF21的蛋白变化与ALT、AST活性变化的灵敏度，申请人以FGF21、ALT、AST基础水平为基数值，检测了三者在血清中的倍数变化状况。从附图2D可以看出，ALT、AST的活性在2、4、6h没有出现显著性变化，直至6h～12h时间段，ALT、AST的活性才开始出现明显上升，其中6h～8h时间段上升得尤为显著。然而FGF21从2h开始即发生稳定性上升，到6h时达到最大值，而后逐步下降。本实验结果显示，腹腔注射CCl₄造成的肝损伤小鼠血清中的ALT、AST活性在肝脏损伤发生的早期仍处于较低水平，因而无法准确得对肝脏的早期病变情况作出诊断。而血清中的FGF21在损伤出现的早期即发生显著性上升的，相对于血清中ALT、AST的活性变化具有更高的特异和灵敏度，为肝损伤的早期诊断提供了可行性。

(6)CCl₄处理后不同时间点，肝脏中FGF21mRNA的表达量显著上升

在本项目中，为了探究经CCl₄处理后肝脏FGF21在不同时间点的表达情况，申请者对注射CCl₄前(0h)及注射后2h、4h、6h、8h、12h处死的各组小鼠肝脏FGF21mRNA进行QPCR检测。附图3为注射CCl₄后不同时间点各组小鼠肝脏FGF21mRNA相对表达量的变化关系图，其相对值是以注射CCl₄前(0h)肝脏中FGF21mRNA的表达量为基准。从图中可以看出，注射CCl₄后0h～4h小鼠肝脏FGF21mRNA的表达量急剧上升，4h时达到峰值，而后4h～12h时间段又缓慢下降。说明腹腔注射CCl₄可引起小鼠肝脏中的FGF21mRNA的表达量发生显著性上升。

实施例2对乙酰氨基酚(APAP)所致急性肝功能衰竭小鼠模型中FGF21的水平变化

1.动物分组及药物处理安排

选取8周龄C57BL/6j小鼠30只，分为A组和B组，每组10只。A组小鼠按照500mg/kg的剂量经腹腔注射APAP溶液，B组给予等体积生理盐水作对照，C组小鼠按照500mg/kg的剂量经腹腔注射APAP溶液，并在注射APAP溶液1h后，给予1mg/kg剂量的重组人FGF21蛋白。三组老鼠分别在注射前(0h)及注射后4h、6h、8h、12h从尾静脉收集其血液样品，24h处死。另取8周龄C57BL/6j小鼠25只，分为I、II、III、Ⅳ、V组，每组5只。每组小鼠按照上述剂量腹腔注射APAP溶液，I组小鼠在APAP注射前(0h)处死，II、III、Ⅳ、V组小鼠分别在注射后4h、6h、8h、12h处死。

2.动物组织样品收集

将小鼠用10％水合氯醛麻醉，心脏取血收集血样标本，分离血清，用于检测FGF21蛋白浓度变化以及谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性变化；小鼠血样收集后，依次打开腹腔和胸腔，用灭菌的PBS进行心脏灌流，除去血管及器官组织中的残留血液，然后分离肝脏，将肝脏切分成几部分，一部分固定于4％多聚甲醛，制作成石蜡切片，用于进行HE染色；剩余部分肝大叶和肝小叶冻存于液氮中，用于分离提取RNA样品。同时摘取心脏，去除心肌下半部分心肌组织后，冻存于液氮；其它脏器组织：胰腺、肾、白色脂肪、褐色脂肪、骨骼肌等，全部冻存于液氮，提取RNA样品。

3.主要研究内容的具体实验方法

(1)血清FGF21ELISA检测

取上述所收集的小鼠血清，采用AntibodyandImmunoassayservices提供的mouseFGF21ELISA试剂盒，检测血清中FGF21浓度。

(2)血清ALT和AST检测

同实施例1

(3)肝脏组织固定、包埋和H&E染色：

同实施例1

(4)肝脏组织FGF21mRNA提取、浓度测定以及RT-PCR

同实施例1

4.统计学分析

所有实验数据均输入GraphPadPrism5.0统计软件包进行统计分析，P＜0.05为差异有显著性。主要实验数据来自三次重复实验，以mean±SD表示，P＜0.05为差异有显著性。

5.案例结果

(1)500mg/kg对乙酰氨基酚(APAP)对小鼠的肝脏损伤

在本实施例中，以500mg/kgAPAP溶液腹腔注射，24h内小鼠未出现死亡，对照组小鼠行动灵活，精神状态良好；而同时给予500mg/kgAPAP和1mg/kg重组人FGF21蛋白的小鼠，其精神状态介于两者之间，精神状态较好。此外，在实施过程中，A组小鼠在6个时间点均有不同程度的中毒现象，表现为精神萎靡、喜卧、蜷缩，严重的具有明显的行动迟缓的症状。剖检可见，对照组B组小鼠肝脏光滑、有弹性、色泽红润；其他各时间点小鼠肝脏均有不同程度的病变，试验组小鼠肝脏病变较明显，肝脏肿胀、片状出血、质软。同时对两组小鼠的肝脏进行HE染色后可以发现，APAP处理后，小鼠肝脏形成了大面积的损伤，其黑色箭头所指粉色部分为肝脏损伤区域，而生理盐水处理的对照组没有损伤状况，如附图4所示。

(2)APAP诱导肝损伤小鼠血清中FGF21变化水平要比ALT、AST变化更灵敏

在本项目中，为了比较APAP诱导的小鼠急性肝损伤血清中FGF21的蛋白变化与ALT、AST活性变化的灵敏度，申请人做了FGF21、ALT、AST三者在血清中的倍数变化图。如附图5所示，申请人依次分别检测了小鼠腹腔注射APAP前(0h)及注射后2h、4h、6h、8h、12h的血清中的FGF21表达水平和ALT、AST的活性水平，以0h的活性为基准，计算获得各时间点AST、ALT和FGF21的活性的倍数关系。从图中可以看出，血清中AST的相对活性水平在24h内持续始终处于较低水平；血清中ALT的相对活性水平在0h～12h时间段也一直处于低水平阶段，直到12h～24h时间段才发生急剧性上升；血清中FGF21的相对活性水平在0h～6h之间稳步上升，在6h时血清中的FGF21的相对活性达到峰值，而后在6h～24h又逐步下降。本项目结果显示，同案例1注射CCl₄造成的肝损伤趋势类似，腹腔注射APAP造成药物性肝损伤的小鼠血清中的ALT、AST在肝脏损伤发生的早期也因处于较低水平而无法准确得对肝脏的早期病变情况作出诊断。而血清中的FGF21在损伤出现的早期即发生显著性上升的，相对于血清中ALT、AST的活性变化具有更高的特异性和灵敏度，为肝损伤的早期诊断提供了可行性。

(3)APAP处理6h后，FGF21在小鼠相关器官的表达差异

根据图5所得出的结论，血清中FGF21的表达水平在6h时达到峰值。申请人为了深入探究血清中表达上升的FGF21的主要来源，在APAP注射6h后，分别取注射APAP的实验组小鼠具有合成分泌FGF21的相关器官或组织，以注射等剂量生理盐水的小鼠为对照。对组织中的FGF21mRNA的表达进行检测。结果如附图6所示，申请人采用QPCR技术分别检测实验组和对照组小鼠的胰脏、心脏、肾脏、白色脂肪、肌肉、褐色脂肪以及肝脏组织中的FGF21mRNA的表达情况。从图中可以看出，APAP处理后，肝脏中的FGF21mRNA的表达倍数显著性上升，差异具有统计学意义；且APAP处理后，小鼠肝脏中FGF21mRNA的相对表达量与其它组织器官中FGF21mRNA的相对表达量相比，腹腔注射了APAP的小鼠肝脏中FGF21mRNA的相对表达量均比其它组织器官显著性上升。该结果说明血清中FGF21的表达水平明显升高，主要是由于FGF21在肝脏大量表达分泌入血所引起的。

(4)APAP处理后不同时间点，肝脏中FGF21mRNA的表达量显著上升

在本项目中，申请者为了进一步探究经APAP处理后肝脏FGF21在不同时间点的表达情况，对注射APAP前(0h)及注射后2h、4h、6h、8h、12h各组小鼠肝脏FGF21mRNA进行QPCR检测。如附图7所示，以注射APAP前(0h)肝脏中FGF21mRNA的表达量为基准，注射APAP2h、4h、6h、8h、12h后各组小鼠肝脏FGF21mRNA相对表达量随时间的变化关系。从图中可以看出，注射APAP后0h～4h小鼠肝脏FGF21mRNA的表达量急剧上升，4h时达到表达量的峰值，而后4h～12h时间段又缓慢下降。说明腹腔注射APAP可引起小鼠肝脏中的FGF21mRNA的表达量发生显著性上升。

实施例3FGF21在酒精性脂肪性肝病(ALD)患者中的临床表现

1.ALD临床病例收集和临床分析方法

(1)临床诊断标准

根据我国现行的ALD临床诊断标准将酒精性脂肪肝患者列为研究对象。具体的诊断标准如下：①无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性每周140克，女性70克；②排除病毒性肝炎、药物性肝病、全胃肠外营养、肝豆状核变性等可导致脂肪肝的特定疾病。③除原发疾病临床表现外，有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特异性症状及体征。④可有超重/内脏性肥胖、空腹血糖增高、血脂紊乱、高血压等代谢综合征。⑤血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平可由轻至中度增高，通常以谷丙转氨酶升高为主⑥肝脏影像学表现符合弥漫性脂肪肝的影像学诊断标准⑦肝活检组织学改变符合脂肪性肝病的病理学诊断标准。凡具备上述第①～⑤项和第⑥或第⑦项中任何一项者即可诊断为脂肪肝。

(2)病例收集

根据上述的临床诊断标准，60例ALD患者(男29例/女31例)被收入本项目的研究工作。与此同时，50例(男25例/女24例)年龄、性别相匹配的正常人群被收录为本项目研究的对照组。所有入选本项目研究的人群入选前均由同一肝胆内科医生进行问卷调查以及临床生化检查，对有心血管疾病、高血压和糖尿病等相关疾病病史的人群，以及以前使用过降脂、抗高血压或是治疗糖尿病药物的ALD患者均不能入选为本项目的研究对象。此外，所有入选对象包括ALD患者和正常对照人群都签署了书面知情同意书，所有的程序均由温州医科大学伦理委员会批准。

(3)临床资料收集及生化检测

对所有受试者进行相关临床问卷调查评估后，过夜禁食10h，收集血样标本，分离血清标本，-80℃冷冻保持。机体指数检测(身高、体重、身体质量指数、腰围和血压)和生化指标参照前的研究报道的方式进行。血清中FGF21(ELISAkit，Biovendor，Modrice，CzechRepublic)根据商业试剂公司提供的说明书进行检测；在经过认证的临床检验实验室，对空腹血糖、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1(ApoAl)、载脂蛋白B100(ApoB100)、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯进行检测。

(4)统计学分析

本项目所有分析均采用统计学软件13.0版本(SPSS，Chicago，IL)根据以前报道的临床研究方式进行统计分析。简单来说，正态分布数据通常用mean±SD描述。非正态分布的数据用Kolmogorox-Smimov检验，分析前进行对数转换，用四分位距表示中位数。采用Student's成组t检验进行组间比较。用Pearson's相关性校正组间差异，并用Bonferroni校正多个检验结果。用多元回归分析方法分析血清中FGF21与其它临床指标、生化指标等参数之间的关联性。变量与血清FGF21呈显著性相关(用Bonferroni校正多个检验)的参数进入多元回归分析。在所有统计检验结果中，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2.案例结果

(1)脂肪性肝病患者血清中循环FGF21水平显著升高

ALD患者和健康对照组的生化指标及临床特征如表1所示。110例参与者的血清FGF21水平无性别差异。以身体质量指数(BMI)校正后的(表1和图8)统计分析结果显示，与对照组FGF21水平(167.9±15.6ng/L)相比较，ALD患者血清FGF21水平(475.5±47.5)显著高出2.5倍(P＜0.0001)。

表1ALD患者与正常对照人群的一般临床资料

注：SBP：收缩压；DBP：舒张压

(2)血清FGF21水平与甘油三酯代谢之间的关系

申请人随机在上述ALD患者病例和健康对照组中各选取17例(男8例/女9例)，对患者的血清FGF21和肝脏的甘油三酯的相关性进行分析。如图9所示，根据血清FGF21和肝脏的甘油三酯的表达水平绘制散点图，构建直线回归方程。回归方程的相关系数r分别为0.662和0.692，表明血清FGF21和肝脏的甘油三酯均存在着正相关性，具有统计学意义。

Claims (4)

1.成纤维细胞生长因子21(以下简称FGF21)作为急性肝功能衰竭的早期辅助诊断指标。其特征在于，所述急性肝功能衰竭指由四氯化碳和对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝功能衰竭；血清中FGF21在急性肝功能衰竭过程中的变化要早于临床上现行的诊断指标，即谷丙转氨酶和谷草转氨酶；FGF21作为急性肝功能衰竭的其诊断依据为血清中FGF21蛋白异常升高。

2.重组人FGF21作为治疗和保护由对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝功能衰竭的药物。其特征在于，重组人FGF21能够保护肝脏组织受APAP的损伤。

3.将FGF21列入临床上酒精性脂肪肝(ALD)辅助诊断指标，采用以下标准：人血清中FGF21含量的正常值为167.9±15.6ng/L；如果血清中FGF21的含量达到或者超过475.5±47.5ng/L，表明其有ALD的可能，但不作为确诊的唯一依据。

4.将血清FGF21浓度作为长期酗酒，体质虚弱易感冒人群潜在肝损伤的常规诊断指标。