ES2874331T3 - Polipéptidos de FGF-21 modificados y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido FGF-21 modificado que comprende el polipéptido de SEQ ID NO:201 en donde el resto de para- acetil-fenilalanina del mismo está enlazado a un resto poli(etilenglicol), para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a fibrosis seleccionada de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis hepática y cirrosis en un paciente.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de FGF-21 modificados y usos de los mismos
Campo
La presente divulgación se refiere a polipéptidos FGF-21 modificados y sus usos terapéuticos.
Antecedentes
Los factores de crecimiento de fibroblastos son polipéptidos ampliamente expresados en tejidos adultos y en desarrollo (Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991) que cumplen funciones esenciales en múltiples funciones fisiológicas (McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. et al., Annu. Rev. Biochem.
58:575-606 (1989). De acuerdo con la bibliografía, la familia FGF consiste en al menos veintidós miembros (Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)).
El factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21, por sus siglas en inglés) se describió en la bibliografía (Nishimura et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000); el documento WO 01/36640; y el documento w O 01/18172 y la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780). A diferencia de otros FGF, se informó que el FGF-21 no tiene efectos proliferativos y tumorigénicos (Ornitz e Itoh, Genome Biology 2001, 2(3): reseñas 3005.1-3005.12).
Se describen determinados polipéptidos del FGF-21 y usos de los mismos en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20010012628, Patente de EE.UU. N.° 6.716.626, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2004/0259780, WO 03/011213, Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 Jun;115(6):1627-35, el documento WO 03/059270, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2005/0176631, el documento WO 2005/091944, el documento WO 2007/0293430, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2007/0293430, el documento WO/2008/121563, Patente de EE.UU. N.° 4.904.584, el documento WO 99/67291, el documento WO 99/03887, el documento WO 00/26354 y Patente de EE.UU. N.° 5.218.092.
Se informó que el FGF-21 humano tiende a experimentar proteólisis in vivo, a formar agregados in vitro, a experimentar desamidación (Gimeno y Moller, Trends Endocrinol Metab. Jun 2014; 25(6):303-11; Patente de EE.UU. N.° 8.361.963; Hecht et al., PLoS One. 2012;7(11):e49345; Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2007/0293430; documento WO 2006/0065582), que limita potencialmente la vida útil de composiciones farmacéuticas que contienen FGF-21. Los agregados y las formas desamidadas de los polipéptidos terapéuticos pueden aumentar potencialmente la inmunogenicidad (véase U.S. Department of Health and Human Services, "Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products," agosto de 2014; Subramanyam (ed.), "Therapeutic Protein Immunogenicity Focus Group Newsletter," American Association of Pharmaceutical Scientists, Vol. 1, edición 3 (diciembre de 2011)).
El documento AU 2012268895A1 describe polipéptidos de FGF-21 que comprenden aminoácidos no codificados de forma natural enlazados a poli(etilenglicol).
El trabajo anterior publicado como documento WO 2008/121563 y la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2008/0255045 demostraron que determinados polipéptidos FGF-21 humanos modificados para contener un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a poli(etilenglicol) en posiciones especificadas presentaron mayor semivida in vivo y/o retuvieron actividad biológica. Sin embargo, los polipéptidos FGF-21 humanos de ejemplo no incluyen sustituciones ni deleciones de secuencias descritas en el presente documento.
La fibrosis es la formación de un exceso de tejido conectivo fibroso en un órgano o tejido. El exceso en el depósito de tejido fibroso se asocia a las condiciones patológicas que pueden producir una disfunción orgánica o tisular. Los órganos afectados pueden incluir pulmones (fibrosis pulmonar o de pulmón), hígado (fibrosis hepática o de hígado), riñón (fibrosis renal o de riñón) y corazón (fibrosis cardíaca). La fibrosis también puede afectar otros tejidos y órganos que incluyen articulaciones, piel, intestino, médula ósea, pero no se limitan a. Algunos ejemplos de afecciones o enfermedades fibróticas incluyen, pero no se limitan a, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA, por sus siglas en inglés), que afecta al hígado; enfermedad renal diabética o nefropatía diabética, que afecta al riñón; e insuficiencia cardíaca metabólica, que afecta al corazón. Por ejemplo, EHNA se caracteriza por la presencia de grasa, inflamación y daño en el hígado en personas que consumen poco o nada de alcohol y puede producir cirrosis hepática. EHNA tiende a diagnosticarse en personas de mediana edad obesas o con sobrepeso, que suelen tener niveles altos de lípidos en sangre y diabetes o prediabetes.
Las realizaciones de la presente divulgación tratan, pero no se limitan a, problemas asociados a la actividad y producción de polipéptidos FGF-21, la producción de un polipéptido FGF-21 con propiedades farmacológicas o biológicas mejoradas, tales como semivida terapéutica mejorada, y los métodos para tratar o prevenir enfermedades y trastornos.
Sumario
La invención se refiere en un primer aspecto a un polipéptido FGF-21 modificado que comprende el polipéptido de SEQ ID NO:201 en donde el resto de para-acetil-fenilalanina del mismo está enlazado a un resto poli(etilenglicol), para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a fibrosis seleccionada de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis del hígado y cirrosis en un paciente.
La invención se refiere en un segundo aspecto a un polipéptido FGF-21 modificado que comprende el polipéptido de SEQ ID NO:201 en donde el resto de para-acetil-fenilalanina del mismo está enlazado a un resto poli(etilenglicol), para su uso en un método para tratar o prevenir EHNA en un paciente.
En el presente documento se desvelan polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto que dicha secuencia de aminoácidos comprende: (i) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (tal como entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud de entre 0-12 aminoácidos; y (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales.
En el presente documento también se desvelan composiciones que comprenden cualquiera de los polipéptidos FGF-21 modificados descritos en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se desvelan polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto que dicha secuencia de aminoácidos comprende: (i) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (tal como entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud de entre 0-12 aminoácidos; y (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales; y (iii) un compañero de fusión.
En el presente documento también se desvelan métodos para regular al menos uno de homeostasis de la glucosa y de lípidos, absorción de la glucosa, expresión de GLUT 1 y/o concentraciones en suero de glucosa, triglicéridos, insulina o glucagón en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento también se desvelan métodos para aumentar la sensibilidad a la insulina, aumentar el nivel de adiponectina, reducir el nivel de glucosa en sangre, reducir el nivel de glucagón, reducir el nivel de triglicéridos, reducir el nivel de fructosamina, reducir el nivel de colesterol de baja densidad o reducir el nivel de proteína reactiva C en un paciente que lo necesita o en una muestra de sangre, suero u otra muestra del paciente, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar una afección o un trastorno seleccionado de obesidad, diabetes, pancreatitis, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, tolerancia a la glucosa deteriorada, depuración inadecuada de glucosa, alto nivel de glucosa en sangre, resistencia a la insulina tipo A, resistencia a la insulina tipo C (también conocido como síndrome HAIR-AN), síndrome de Rabson-Mendenhall, síndrome de Donohue o leprechaunismo, hiperandrogenismo, hirsutismo o acantosis pigmentaria, y síndrome de Prader-Willi en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento, también se desvelan métodos para tratar la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 u obesidad en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención, los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis seleccionada de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis del hígado y cirrosis en un paciente.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis que comprenden administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una composición que comprende el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con una realización del primer aspecto de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para tratar la fibrosis o cirrosis hepática en un paciente que lo necesita.
De acuerdo con el segundo aspecto de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para tratar EHNA y/o fibrosis hepática.
En una realización de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para disminuir la fracción de grasa hepática en un paciente que lo necesita.
En una realización de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados son para su uso en métodos para aumentar los niveles de adiponectina (tales como adiponectina total en plasma y/o adiponectina de alto peso molecular) en un paciente que lo necesita.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar la insuficiencia cardíaca o fibrosis cardíaca en un paciente que lo necesita que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar la fibrosis renal o de riñón en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar la fibrosis pulmonar en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
En el presente documento también se desvelan métodos para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende uno o más aminoácidos codificados de manera no natural, en donde el polipéptido FGF-21 modificado posee al menos el 90 % de identidad con un polipéptido FGF-21 humano que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1-7 y 201, en donde dicha enfermedad asociada a la fibrosis se selecciona de EHNA, fibrosis hepática, enfermedad renal diabética, enfermedad renal crónica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis cardíaca, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca metabólica.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
Figura 1A-B. Secuencias de polipéptidos FGF-21 modificados de ejemplo. Las coordenadas indicadas se refieren al polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO:1. Cada polipéptido completo incluye la secuencia N-terminal MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLC QRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY, seguida del aminoácido indicado en la posición 108, seguido de la secuencia indicada de la región etiquetada "aminoácidos 109-149", seguida de la secuencia PGILAPQPPDVGSSDPLSM, seguida de la secuencia indicada de la región etiquetada "aminoácidos 169-181". Las secuencias de aminoácidos completas de los polipéptidos FGF-21 modificados también se muestran en el Ejemplo 4 a continuación.
Figura 2. Curva de respuesta a la dosis de ejemplo de para la actividad de FGF-21 in vitro (medida por la fosforilación dependiente de FGF21 de la quinasa regulada por la señal extracelular (ERK) 1/2 en un ensayo celular) para el compuesto pegilado 1 y compuesto pegilado 2.
Figura 3. Resultados representativos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) realizada para la evaluación de estabilidad térmica de polipéptidos FGF-21 modificados. En este ejemplo, el compuesto pegilado 2 demostró tener una temperatura de punto medio de la transición ("Tm") de aproximadamente 8 °C más que el compuesto pegilado 1. La reversibilidad térmica fue >95 % (no se muestra).
Figura 4. Resultados representativos de la fluorescencia por barrido térmico (TSF) realizada para la evaluación de la estabilidad térmica de polipéptidos FGF-21 modificados. En esta figura, el Compuesto 10 demostró tener una temperatura de punto medio de la transición ("Tm") de aproximadamente 8 °C más que el Compuesto 1 (que tiene una secuencia de FGF-21 de tipo silvestre, excepto por la metionina N-terminal incluida para la expresión en E. coli).
Figura 5. Panel izquierdo: Medición de la desamidación en el transcurso de un tiempo (indicada mediante una heterogeneidad de carga) a 25 °C para el compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2. El compuesto pegilado 2 exhibió menor formación de heterogeneidad de carga, lo que indica una desamidación altamente ralentizada. Panel derecho: Medición de formación de agregados en el transcurso de un tiempo (medida mediante la cromatografía de exclusión por tamaño) a 40 °C para el compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2, cada uno en tampón de sacarosa/histidina a pH 7,0 y a una concentración proteica de 7,5 mg/ml. El compuesto pegilado 2 presentó menor formación de agregados. Estos resultados juntos predicen mayor estabilidad en almacenamiento y capacidad para formulación a altas concentraciones para el compuesto pegilado 2 con respecto al compuesto pegilado 1.
Figura 6. Medición de la formación de agregados de alto peso molecular (HMW, por sus siglas en inglés) en el transcurso de un tiempo para polipéptidos FGF-21 modificados a pH 6,5 en tampón de sacarosa/histidina (panel superior), pH 7,0 en tampón de sacarosa/histidina (panel medio) y pH 8,3 en tampón de sacarosa/TRIS (panel inferior). La formación de agregados de HMW fue más pronunciada a pH 6,5 y pH 7,0 que a pH 8,3. La mayoría de las variantes de FGF-21 presentaron menor formación de agregados de HMW con respecto al compuesto pegilado 1, aunque para algunos compuestos, la formación de agregados de HMW fue similar o superior a la del Compuesto 1.
Figura 7. Medición de la propensión a desamidación (indicada mediante la formación de variantes ácidas en el transcurso de un tiempo) para polipéptidos FGF-21 modificados a pH 6,5 en tampón de sacarosa/histidina (panel superior), pH 7,0 en tampón de sacarosa/histidina (panel medio) y pH 8,3 en tampón de sacarosa/TRIS (panel inferior). En comparación con el compuesto pegilado 1, todos los compuestos mostrados presentaron una formación de variantes ácidas con menor carga, lo que indicó menor desamidación.
Figura 8. Medición de solubilidad para polipéptidos FGF-21 modificados. Una formación relativamente baja de agregados de alto peso molecular a una determinada concentración de polipéptidos indica mayor solubilidad, lo que daría como resultado la capacidad de formularse a una mayor concentración. Observaciones de concentración proteica con respecto a la fracción de porcentaje de especies de alto peso molecular (HMW) de los compuestos evaluados determinada mediante el ensayo de filtración de flujo de obturador en tampón PBS a pH 7,2. La pendiente alineada del ajuste de línea a cada una de estas observaciones se usó como un cálculo de la propensión a agregación de proteínas.
Figura 9. Porcentaje de donantes con una respuesta de proliferación de linfocitos T CD4+ después de una incubación de proteínas y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) durante 7 días. Las proteínas control son proteínas expresadas de E. coli con propiedades de activación de linfocitos T. Comparación de compuestos de FGF-21 modificado no pegilado con respecto al Compuesto 1 (que tiene una secuencia de FGF-21 de tipo silvestre, excepto por una metionina N-terminal incluida para la expresión en E. coli). "ConA" es una abreviatura de Concanavalina A, una proteína inmunógena conocida.
Figura 10. Análisis farmacocinético del compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2 después de una única administración S.C. de 0,05 mg/kg a ratones ob/ob. Los niveles de compuestos de FGF-21 modificado se midieron como polipéptidos totales e intactos (activos) C-terminal. El compuesto pegilado 2 presentó una AUC total mucho mayor para la forma intacta C-terminal que el compuesto pegilado 1, lo que indica una proteólisis in vivo del compuesto pegilado 2 altamente reducida. Los resultados se muestran gráficamente en el panel superior y los parámetros farmacocinéticos se tabulan el panel izquierdo inferior (compuesto pegilado 1) y en el panel derecho inferior (compuesto pegilado 2).
Figuras 11A-11B. Análisis farmacocinético del compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2 después de la administración a macacos. Los niveles de compuestos de FGF-21 modificado se midieron como polipéptidos (A) totales y (B) intactos (activos) C-terminales. El compuesto pegilado 2 presentó una AUC total mucho mayor para la forma intacta C-terminal que el compuesto pegilado 1, lo que indica una proteólisis in vivo del compuesto pegilado 2 altamente reducida.
Figura 12. Cambio en hemoglobina glicada (HbA1c) en comparación con vehículo el Día 21 de un estudio de dosis repetidas en ratones ob/ob.
Figura 13. Peso corporal durante 21 días de un estudio de dosis repetidas en ratones ob/ob.
Figura 14. Porcentaje de cambio en el peso corporal durante 21 días de un estudio de dosis repetidas en ratones ob/ob.
Figura 15. Concentraciones de insulina en plasma durante un estudio de dosis repetidas de 21 días en ratones ob/ob.
Figura 16. Concentraciones de glucosa en plasma durante un estudio de dosis repetidas de 21 días en ratones ob/ob.
Figura 17. Cambio en las concentraciones de glucosa en plasma de la AUC durante un estudio de dosis repetidas de 21 días en ratones ob/ob, expresadas como el porcentaje de diferencia con respecto a los controles tratados con vehículo.
Figura 18. Concentraciones de triglicéridos en plasma durante un estudio de dosis repetidas de 21 días en ratones ob/ob.
Figura 19. Cambios en el peso corporal en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 20. Consumo total de alimentos en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 21. Peso corporal en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 22. Peso del hígado en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 23. Relación de peso del hígado con respecto al cuerpo en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 24. Glucosa en sangre completa en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 25. ALT en plasma en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 26. Triglicéridos en plasma en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 27. Colesterol total en plasma en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 28. Triglicéridos en el hígado en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 29. Colesterol en el hígado en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figuras 30A-B. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con HE en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 31. Puntuación de actividad de NAFLD en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 32A. Puntuación de esteatosis en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 32B. Puntuación de inflamación lobular en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 32C. Puntuación de vacuolización de hepatocitos en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figuras 33A-B. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con rojo sirio en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 34. Área de fibrosis en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figuras 35A-B. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado inmunoteñidas con F4/80 en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 36. Área de inflamación en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figuras 37A-B. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con Rojo aceite en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figura 38. Área de depósito de grasa en un estudio de ratón Stelic EHNA.
Figuras 39A-D. Expresión de genes relativa en un estudio de ratón Stelic EHNA. Resultados de la expresión para (A) Alfa-SMA, (B), TIMP-1, (C) colágeno tipo 1 y (D) TGF-p.
Figuras 40A-D. Ejemplos de secuencias de polipéptidos FGF-21 modificado fusionado a un dominio Fc, una adnectina de prolongación de farmacocinética (PKE) o un polipéptido de albúmina de suero humano. "Disposición de la fusión" describe la orientación general de la proteína de fusión, N- al C-terminal, que pretende ilustrar la secuencia de polipéptidos correspondiente, pero no limitarla. HuSA(C34A): una albúmina de suero humano modificada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:321); HuSA(C34A; des Leu-585): una albúmina de suero humano modificada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:322; PKE(1): una adnectina PKE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:319; PKE(2): una adnectina PKE que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:320. L seguida de un número indica un enlazador; FGF-21 (comp. 2) indica una secuencia de FGF-21 que contiene una deleción interna y un péptido de reemplazo (específicamente, comp. 2), y FGF-21 (comp. 1) indica una secuencia de FGF-21 que carece de la deleción y el péptido de reemplazo (específicamente, compuesto 1). FGF-21 (comp. 1) y FGF-21 (comp. 2) pueden incluir o carecer de la metionina N-terminal contenida en los compuestos 1 y 2. Las formas variantes de secuencias de polipéptidos Fc se identifican entre paréntesis, por ejemplo, Fc(hIgG1a_191). Las notaciones FGF-21-1aa(comp. 2) y FGF-21-3aa(comp. 2) se refieren a la secuencia del compuesto 2 modificada mediante la deleción de la cantidad de aminoácidos indicada (1 o 3, respectivamente) de su C-terminal.
Figura 41. Medición de la solubilidad para polipéptidos FGF-21 modificados fusionados a un compañero de fusión de adnectina. Una formación relativamente baja de agregados de alto peso molecular a una determinada concentración de polipéptidos indica mayor solubilidad, lo que daría como resultado la capacidad de formularse a una mayor concentración. Observaciones de concentración proteica con respecto a la fracción de porcentaje de especies de alto peso molecular (HMW, por sus siglas en inglés) de los compuestos evaluados determinada mediante el ensayo de filtración de flujo de obturador en tampón PBS a pH 7,2. La pendiente alineada del ajuste de línea a cada una de estas observaciones se usó como un cálculo de la propensión a agregación de proteínas. Figuras 42A-B. Peso corporal de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 ("PEG-Cmp") durante las semanas 9-12. Figura B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 43A-B. Peso del hígado de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. El peso del hígado disminuyó considerablemente (p<0,001) para los ratones tratados durante las semanas 9-15.
Figuras 44A-B. Relación de peso del hígado con respecto a peso corporal de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. La relación de peso del hígado con respecto a peso corporal se redujo considerablemente (p<0,01 y p<0,001, respectivamente) para los ratones tratados durante las semanas 9-12 o las semanas 9-15.
Figuras 45A-B. Peso del riñón derecho de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 46A-B. Peso del riñón izquierdo de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 47 A-B. Glucosa en sangre completa de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. La glucosa en sangre completa se redujo considerablemente (p<0,05) para los ratones tratados durante las semanas 9-15.
Figuras 48A-B. ALT en plasma de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. ALT en plasma se redujo considerablemente (p<0,01) para los ratones tratados durante las semanas 9-15.
Figuras 49A-B. Triglicéridos en plasma de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 50A-B. Colesterol total en plasma de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 51A-B. Triglicéridos en el hígado de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. Los triglicéridos en el hígado disminuyeron considerablemente (p<0,01 y p<0,001, respectivamente) para los ratones tratados durante las semanas 9-12 o las semanas 9-15.
Figuras 52A-B. Colesterol en el hígado de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. El colesterol en el hígado se redujo considerablemente (p<0,01 y p<0,001, respectivamente) para los ratones tratados durante las semanas 9­ 12 o las semanas 9-15.
Figuras 53A-H. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con HE de ratones tratados durante las semanas 9-12 con vehículo (A-B) o PEG-compuesto 1 (C-D) y durante las semanas 9-15 con vehículo (E-F) o PEG-compuesto 1 (G-H).
Figuras 54A-B. Índice de puntuación de NAFLD de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. El índice de actividad de NAFLD se redujo considerablemente (p<0,01 y p<0,001, respectivamente) para los ratones tratados durante las semanas 9-12 o las semanas 9-15.
Figura 55A-H. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con rojo sirio de ratones tratados durante las semanas 9-12 con vehículo (A-B) o PEG-compuesto 1 (C-D) y durante las semanas 9-15 con vehículo (E-F) o compuesto PEG 1 (G-H).
Figuras 56A-B. Resumen del área de fibrosis hepática de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. El área de fibrosis se redujo considerablemente (p<0,05) para los ratones tratados con el PEG-compuesto 1 durante las semanas 9­ 15.
Figuras 57A-H. Fotomicrografías representativas del hígado inmunoteñido con F4/80 de ratones tratados durante las semanas 9-12 con vehículo (A-B) o PEG-compuesto 1 (C-D) y durante las semanas 9-15 con vehículo (E-F) o PEG-compuesto 1 (G-H).
Figuras 58A-B. Resumen del área de inflamación de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15.
Figuras 59A-H. Fotomicrografías representativas de secciones del hígado teñidas con Rojo aceite de ratones tratados durante las semanas 9-12 con vehículo (A-B) o PEG-compuesto 1 (C-D) y durante las semanas 9-15 con vehículo (E-F) o PEG-compuesto 1 (G-H).
Figuras 60A-B. Resumen del área de depósito de grasa de los grupos de tratamiento en un estudio de ratón Stelic EHNA. A. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-12. B. Comparación de ratones tratados con vehículo o PEG-compuesto 1 durante las semanas 9-15. El área de depósito de grasa se redujo considerablemente para los ratones tratados durante las semanas 9-12 o las semanas 9-15 (ambos p<0,001).
Figura 61. Mediciones de adiponectina total en suero en un estudio de ratón Stelic EHNA. La adiponectina total en suero aumentó considerablemente en ratones tratados con 3,0 mg/kg de PEG-compuesto 1, en comparación con los ratones tratados con vehículo, en muestras de plasma términos de ratones tratados entre las semanas 5-9 o las semanas 7-9 (p<0,001, prueba de Dunnett).
Figura 62. Mediciones de adiponectina total en suero en un estudio de ratón Stelic EHNA. La adiponectina total en suero aumentó considerablemente en ratones tratados con 3,0 mg/kg de PEG-compuesto 1, en comparación con los ratones tratados con vehículo, en muestras de plasma términos de ratones en la semana 12 o 15 (p<0,05, prueba de Dunnett).
Figura 63. Curvas de respuesta a la concentración para tres variantes de FGF21: Compuesto 1 etiquetado con His en N-terminal (His-Comp 1), PEG-compuesto 1 (PEG-Comp 1) y PEG-Compuesto 2 (PEG-Comp 2) en el ensayo de Elk1-luciferasa de 5 h. Los valores pertenecen a 6 experimentos independientes con 3 o 4 repeticiones por experimento. Los valores de Z' variaron entre 0,6 - 0,9, lo que indica una calidad de ensayo aceptable (Z' > 0,5). Figura 64. Potencia de variantes de FGF-21 medida en el ensayo celular de Elk1-luciferasa. Cada punto de datos indica una repetición individual, y la barra horizontal representa el valor medio. Los valores se expresan como el logaritmo en base 10 del valor de EC50 medido en moles.
Figura 65. Efecto de dosis únicas de PEG-Compuesto 2 en el porcentaje de cambio en el peso corporal de ratones C57BL/6J. Los ratones C57BL/6J se trataron con vehículo (sacarosa 250 mM/Tris 20 m, pH 8,3) o 0,03, 0,1, 0,3 o 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2, n=10/grupo. Se determinó el porcentaje de cambio en los pesos corporales de ratones C57BL/6J en el inicio (0), 24, 48, 72 y 144 h después de la dosis SC. Todos los valores representan la media ± SEM *P<0,05, ***P<0,001, ****P<0,0001 en comparación con el vehículo, (ANOVA de un factor y luego prueba de Dunnett).
Figura 66A. Efecto de dosis únicas del PEG-Compuesto 2 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. Se determinó la concentración de la adiponectina total en plasma en el inicio (0), 24, 48, 72 y 144 h después de la dosis SC. Los ratones C57BL/6J sin ayunar se trataron con vehículo (sacarosa 250 mM/Tris 20 mM, pH 8,3) o 0,03, 0,1, 0,3 o 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2, n=10/grupo. Todos los valores representan la media ± SEM **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 en comparación con el vehículo, (ANOVA de un factor y luego prueba de Dunnett).
Figura 66B. Efecto de dosis únicas del PEG-Compuesto 2 en el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. Los ratones C57BL/6J se trataron con vehículo (sacarosa 250 mM/Tris 20 mM, pH 8,3) o 0,03, 0,1, 0,3 o 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2, n=10/grupo. La concentración de adiponectina total en plasma se determinó en el inicio, 24, 48, 72 y 144 h después de la dosis SC, y se determinó el porcentaje de cambio con respecto al valor inicial. Todos los valores representan la media ± SEM **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 en comparación con el vehículo, (ANOVA de un factor y luego prueba de Dunnett).
Figura 67A. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. Los tratamientos con PEG-Compuesto 2 y con PEG-Compuesto 20 dieron como resultado aumentos significativos en la adiponectina total en plasma 6 días después de la dosis, en dosis de 0,3 y 1 mpk (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001).
Figura 67B. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. La dosis de 54,3 nmol/kg de PEG-Compuesto 2, compuesto 105 y compuesto 112 aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en la adiponectina total en comparación con el porcentaje de cambio en la adiponectina total en controles tratados con vehículo los Días 3 y 6.
Figura 67C. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. Las dosis de 18,1 y 54,3 nmol/kg del compuesto 182 aumentaron considerablemente el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma (en comparación con el porcentaje de cambio observado en los controles con vehículo) los Días 3 y 6.
Figura 67D. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. El compuesto 171 y el compuesto 181 aumentaron considerablemente el porcentaje de cambio con respecto al valor inicial de adiponectina total en plasma los Días 3 y 6 después de la dosis, de manera dependiente de la dosis, en comparación con el control tratado con vehículo.
Figura 67E. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. El porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma (en comparación con el vehículo) aumentó considerablemente con el compuesto 170 los Días 3 y 6 a 18,1 nmol/kg y 54,3 nmol/kg.
Figura 67F. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en plasma en ratones C57BL/6J. La dosis de 10 mg/kg de PEG-compuesto 1 aumentó considerablemente el porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma en comparación con los controles tratados con vehículo los Días 3 y 6.
Figura 68. Efecto del PEG-Compuesto 2 sobre la albuminuria (ACR en orina). # P < 0,05, enfermos (unix db/db, vehículo, n = 9-10) con respecto a normales (magros db/m, n = 10-12). * P < 0,05, PEG-Compuesto 2 (n = 13-14) en comparación con vehículo. ANOVA con una prueba post hoc de Dunnett para cada par en puntos temporales individuales. Datos expresados como media ± S.E.M.
Figura 69. El contenido de hidroxiprolina (HP) cardíaca se muestra en la semana 3 de tratamiento con isoproterenol y PEG-Compuesto 2. Cada punto de datos representa el contenido de HP total en el corazón de un ratón individual normalizado a proteína. *: P < 0,05, en comparación con tratamiento simulado vehículo, **: P < 0,05, en comparación con iso vehículo (ANOVA de un factor y luego prueba de Bonferroni).
Figuras 70A-C. Efectos de variantes de FGF-21 en la adiponectina total en suero (Figura 70A), adiponectina de alto peso molecular (HMW) en suero (Figura 70B) y la relación de adiponectina HMW con respecto a la adiponectina total (Figura 70C) en un estudio de ratón Stelic EHNA. Todos los valores representan la media ± SEM.
Figuras 71A-B. Peso del hígado (Figura 71A) y relación de peso del hígado con respecto a peso corporal (BW) (Figura 71B) en un modelo animal de EHNA.
Figuras 72A-72G. Efectos de las variantes de FGF-21 en un modelo animal de EHNA. Después del tratamiento con compuesto pegilado 1 ("PEG-Comp 1"), compuesto pegilado 2 ("PEG-Comp 2") o compuesto 170 ("Comp 170"), los animales fueron evaluados para determinar su peso corporal (Figura 72A), peso del hígado (Figura 72B), relación de peso del hígado con respecto al peso corporal (Figura 72C), triglicéridos en el hígado (Figura 72D), ALT en plasma (Figura 72E), colesterol en el hígado (Figura 72F) y triglicéridos en plasma (Figura 72G). Las diferencias considerables desde el punto de vista estadístico con respecto a los controles tratados con vehículo son como se muestran. n.s: no se detectaron diferencias considerables desde el punto de vista estadístico (es decir, P > 0,05).
Descripción detallada
Definiciones
Como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se mencionan "FGF-21", "polipéptido FGF-21" o "polipéptido FGF-21 modificado", se hace referencia a una o más de esas proteínas e incluyen equivalentes de estas conocidos por las personas expertas en la materia, etcétera.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que le otorga habitualmente una persona experta en la materia a quien pertenece esta invención.
Normoglucemia: en el presente documento descripción, los términos normoglucemia o euglucemia se refieren al estado de una concentración normal de glucosa en sangre. Un ejemplo de concentración normal de glucosa en sangre en seres humanos es de 70 mg/dl a 99 mg/dl en adultos en ayunas, y de 70 mg/dl a 140 mg/dl en adultos después de las comidas. La normoglucemia sostenida se refiere a mantener la normoglucemia durante un período prolongado, por ejemplo, al menos un día, al menos dos días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos un mes, o más, por ejemplo, durante el tratamiento en curso con un polipéptido FGF-21 modificado de la presente descripción.
La expresión "porción de prolongación de semivida" (también denominada "HLEM") se refiere a una porción, un dominio o una molécula farmacéuticamente aceptable enlazados covalentemente ("conjugados" o "fusionados") al polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento, opcionalmente mediante un aminoácido codificado de manera no natural, directamente o a través de un enlazador, que previene o atenúa la degradación proteolítica in vivo u otra modificación química que reduzca la actividad del polipéptido FGF-21 modificado, aumenta la semivida y/o mejora o altera otras propiedades farmacocinéticas o biofísicas incluyendo pero no limitado a, aumentar la velocidad de absorción, reducir la toxicidad, mejorar la solubilidad, reducir la agregación de proteínas, aumentar la actividad biológica y/o la selectividad objetivo del polipéptido FGF-21 modificado, aumentar la facilidad de fabricación y/o reducir la inmunogenicidad del polipéptido FGF-21 modificado, en comparación con un comparador, tal como una forma no conjugada del polipéptido FGF-21 modificado o el polipéptido FGF-21 de tipo silvestre. La expresión "porción de prolongación de semivida" incluye porciones de prolongación de semivida no proteicas, tales como un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol (PEG) o PEG discreto, almidón de hidroxietilo (HES), un lípido, un grupo acilo ramificado o no ramificado, un grupo acilo C8-C30 ramificado o no ramificado, un grupo alquilo ramificado o no ramificado y un grupo alquilo C8-C30 ramificado o no ramificado; y porciones de prolongación de semivida proteicas, tales como albúmina de suero, transferrina, adnectinas (por ejemplo, adnectinas de prolongación de farmacocinética (PKE) o de unión a albúmina), dominio Fc y polipéptido no estructurado, tal como polipéptido XTEN y PAS (por ejemplo, secuencias de polipéptidos de conformación desordenada compuestas por los aminoácidos Pro, Ala y/o Ser), y un fragmento de cualquiera de las anteriores. Un examen de la estructura del cristal de FGF-21 o de un miembro de la familia FGF y su interacción con el receptor de FGF puede indicar qué restos de aminoácidos determinados tienen cadenas laterales total o parcialmente accesibles para el disolvente. La cadena lateral de un aminoácido codificado de manera no natural en estas posiciones puede apuntar hacia afuera de la superficie de la proteína y hacia el solvente en el exterior y, por lo tanto, puede estar ligada, por ejemplo, a un polímero soluble en agua.
Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de unión a albúmina" se refiere a cualquier grupo químico que puede unirse a albúmina, es decir, tiene afinidad de unión a albúmina, por ejemplo, adnectina de unión a albúmina o PKE.
La "afinidad de unión a albúmina" puede determinarse mediante distintos métodos conocidos en el estado de la técnica. En un método, el compuesto que se debe medir se radioetiqueta, por ejemplo, con 125I o 3H y se incuba con albúmina inmovilizada (Kurtzhals et.al., Biochem.J., 312, 725-731 (1995)). Se calcula la unión del compuesto con respecto a un patrón. En otro método, un compuesto relacionado es radioetiquetado, y su unión a albúmina, inmovilizada, por ejemplo, sobre microesferas de SPA (microesferas del ensayo de proximidad de centelleo, PerkinElmer n.° de cat. RPNQ0001), compite con una serie de diluciones del compuesto que se desea medir. El valor EC50 para la competencia es una medición de la afinidad del compuesto. En un tercer método, la afinidad al receptor o potencia de un compuesto se mide en diferentes concentraciones de albúmina, y el desplazamiento en afinidad relativa o potencia del compuesto como una función de la concentración de albúmina refleja su afinidad a la albúmina.
La expresión "estabilidad térmica" se refiere a la capacidad de un polipéptido para resistir el desplegamiento al calentarse. En general, cuanto más alta es la estabilidad térmica de una molécula, más alta es la temperatura que se necesita para que el polipéptido se despliegue. Algunos ejemplos de métodos para determinar la estabilidad térmica de un polipéptido son la calorimetría diferencial de barrido (DSC) y la fluorescencia por barrido térmico, que se describen en el Ejemplo 6 del presente documento. La estabilidad térmica puede determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene mayor estabilidad térmica.
El término "agregación" se refiere a la tendencia de un polipéptido de formar complejos unidos de manera no covalente a otras moléculas (tales como otras moléculas del mismo polipéptido) y así formar complejos de alto peso molecular. Los ejemplos de métodos para medir la formación de agregados incluyen la cromatografía de exclusión por tamaño analítica descrita en el Ejemplo 7 del presente documento. Las cantidades relativas de agregación pueden determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene menor agregación.
El término "desamidación" se refiere a la tendencia de los restos de aminoácidos dentro de un polipéptido de experimentar la reacción de desamidación de manera espontánea, y así cambiar la estructura química del aminoácido y afectar potencialmente la función del polipéptido. Los ejemplos de métodos para medir la desamidación incluyen enfoque isoeléctrico capilar de imágenes (iclEF) como se describe en el Ejemplo 7 del presente documento. La cantidad relativa de desamidación puede determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene menor desamidación.
La expresión "proteólisis in vivo" se refiere a la escisión de un polipéptido cuando se introduce en un sistema viviente (por ejemplo, cuando se inyecta en un organismo), que puede ser el resultado de proteasas presentes en dicho organismo. La proteólisis puede afectar potencialmente la actividad biológica o la semivida de un polipéptido. Por ejemplo, el FGF-21 de tipo silvestre puede experimentar escisión en el C-terminal, lo que da como resultado un polipéptido inactivo truncado. Un ejemplo de método para medir proteólisis in vivo de FGF-21 es el ensayo de inmunoabsorción electroquimioluminiscente (ECLIA) basado en Meso Scale Discovery (MSD) descrito en el Ejemplo 10 del presente documento. La cantidad relativa de proteólisis in vivo puede determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene una reducción de proteólisis in vivo.
El término "solubilidad" se refiere a la cantidad de una sustancia que se puede disolver en otra sustancia, por ejemplo, la cantidad de un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado que se puede disolver en una solución acuosa. Un ejemplo de método para medir la solubilidad de un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado es la prueba de solubilidad en flujo de obturador descrita en el Ejemplo 8 del presente documento. La solubilidad relativa puede determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene mayor solubilidad.
La expresión "actividad biológica" se refiere a la capacidad de una molécula para afectar cualquier propiedad física o bioquímica de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción en relación con un organismo, lo que incluye, pero no se limita a, virus, bacterias, bacteriófagos, transposón, prion, insectos, hongos, plantas, animales y seres humanos. Por ejemplo, en el contexto de un FGF-21 modificado o no modificado, la actividad biológica incluye cualquiera de las funciones realizadas por FGF-21 como se describe en el presente documento. Los ejemplos de métodos para determinar si una molécula tiene al menos una actividad biológica de FGF-21 de tipo silvestre (tal como el polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1) puede incluir el ensayo in vitro descrito en el Ejemplo 5 o el ensayo in vitro descrito en el Ejemplo 17. El nivel relativo de actividad biológica puede determinarse con respecto a un compuesto comparador, por ejemplo, para identificar un polipéptido que tiene actividad biológica o que tiene actividad biológica lo suficientemente alta para un uso terapéutico deseado, por ejemplo, que tiene un EC50 menos de 5 veces, menos de 10 veces, menos de 20 veces, menos de 50 veces o menos de 100 veces mayor que el EC50 de un comparador.
El compuesto comparador descrito en el presente documento puede ser otra secuencia que no tenga una modificación, tal como una modificación descrita en el presente documento. Por ejemplo, el compuesto comparador puede ser la misma secuencia de polipéptidos FGF-21 modificados sin una deleción interna, sin un péptido de reemplazo o sin un compañero de fusión. Los ejemplos de compuestos comparadores incluyen, pero no se limitan a, el polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ iD NO:1, un polipéptido FGF-21 modificado de SEQ ID NO:201 u otro compuesto comparador. En algunas realizaciones, el compuesto comparador puede contener al menos un aminoácido codificado de manera no natural, que puede estar enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, péptido, polipéptido o porción de prolongación de semivida descritos en el presente documento (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, un compuesto comparador puede contener al menos un aminoácido codificado de manera no natural, que puede no estar enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, péptido, polipéptido o porción de prolongación de semivida descritos en el presente documento (por ejemplo, PEG). En algunas realizaciones, un compuesto comparador puede contener sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, la comparación puede realizarse con una forma pegilada o no pegilada del polipéptido; en el caso anterior, la comparación puede realizarse con un polipéptido que comprende o no comprende un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas realizaciones, un compuesto comparador puede contener una deleción interna que se reemplaza opcionalmente por un péptido (por ejemplo, la misma deleción interna y el mismo péptido de reemplazo en el compuesto con el que el comparador se compara), pero sin un compañero de fusión.
Los términos "Fc", "dominio Fc" o "región Fc" se refieren a un dominio Fc o a un fragmento de este. Una Fc puede ser una región Fc nativa que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza, o una región Fc variante que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fc nativa en al menos un aminoácido. En algunas realizaciones, la Fc tiene al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con una región Fc nativa o con la región Fc de un polipéptido de origen, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente veinte, de aproximadamente una a aproximadamente diez o de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en una región Fc nativa o en la región Fc del polipéptido de origen. La región Fc en el presente documento puede tener al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una región Fc nativa y/o con una región Fc de un polipéptido de origen. En algunas realizaciones, la región Fc puede tener al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia con una región Fc nativa y/o con una región Fc de un polipéptido de origen. En algunas realizaciones, la región Fc puede tener al menos aproximadamente el 95 % de identidad de secuencia con una región Fc nativa y/o con una región Fc de un polipéptido de origen. Algunos ejemplos de secuencias de aminoácidos de regiones Fc incluyen SEQ ID NO: 302 y 323-335. Algunos ejemplos de dominios o fragmentos de regiones Fc incluyen los polipéptidos de SEQ ID NO:303-309.
Como se usa en el presente documento, una "región Fc funcional" se refiere a un dominio Fc o un fragmento del mismo que retiene la capacidad de unirse a FcRn.
El término "correspondiente" se refiere a una posición ("posición correspondiente") o región ("región correspondiente") dentro de una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que se identifica mediante la comparación con una secuencia de referencia. La secuencia de referencia puede ser una secuencia de tipo silvestre o no modificada, tal como el polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO:1. Una posición o región correspondientes pueden identificarse mediante la alineación de la secuencia con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la "posición correspondiente al aminoácido 108 en SEQ ID NO:1" en una secuencia se refiere a la posición en la secuencia que está en la misma columna de alineación que el aminoácido 108 en SEQ ID NO:1 cuando dicha secuencia se alinea con SEQ ID NO:1. En la alineación, el aminoácido o nucleótido pueden o no coincidir con el aminoácido o nucleótido en la posición correspondiente en la secuencia de referencia. Cuando se hace referencia a una deleción de una región correspondiente, la alineación puede contener espacios en las columnas de alineación correspondientes a cada posición dentro de la región eliminada, a menos que la región eliminada haya sido reemplazada por un péptido de reemplazo que se puede alinear potencialmente con parte de la región eliminada. Por lo tanto, para una deleción reemplazada por un péptido de reemplazo, el péptido de reemplazo puede omitirse de la secuencia cuando se realiza la alineación, de modo que la alineación debería contener espacios en toda la región eliminada. De manera alternativa, el péptido de reemplazo, si está presente, puede no ser considerado cuando se identifica una región correspondiente.
La alineación usada para identificar una posición correspondiente o una región correspondiente puede obtenerse usando un algoritmo de alineación convencional, tal como Blast (Altschul et al., J Mol Biol. 5 de octubre de 1990;215(3):403-10), Smith-Waterman (Smith y Waterman, J Mol Biol., 25 de marzo de 1981; 147(1):195-7), o Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, J Mol Biol., marzo de 1970;48(3):443-53). El algoritmo de Needleman-Wunsch puede usarse para obtener la alineación global con calificación más alta (es decir, una alineación que contenga cada resto en ambas secuencias, a pesar de que una alineación pueda comenzar y/o terminar en los espacios). Ya sea que se utilice Blast, Smith-Waterman o Needleman-Wunsch, la alineación con calificación más alta se puede identificar usando parámetros "predeterminados", tal como el uso de la matriz de calificación BLOSUM62, una penalidad de apertura de espacios de 11, y una penalidad de extensión de espacio de 1, y (cuando se usa Blast para la alineación de pares) un tamaño de palabra de 3.
"Región" se refiere a una porción contigua de una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos. Una región se puede identificar mediante dos posiciones dentro de un polipéptido o polinucleótido que especifican las posiciones de inicio y finalización de la región dentro de la secuencia. A menos que se indique lo contrario, una región incluye las posiciones que definen la región dentro de la secuencia de referencia, es decir, incluye las posiciones de inicio y finalización determinadas. Por ejemplo, la región 119-130 de SEQ ID NO:1 se refiere a la porción de SEQ ID NO:1 que comienza en el aminoácido 119 y finaliza en el aminoácido 130, que incluye los aminoácidos 119 y 130, que tiene la secuencia PGNKSPHRDPAP (SEQ ID NO:73).
El término "deleción" se refiere a la retirada de uno o más (o una cantidad especificada de) aminoácidos o nucleótidos contiguos de un polipéptido o polinucleótido. Una "deleción interna" se refiere a una deleción que no incluye N- o C-terminal de un polipéptido o el extremo 5' o 3' de un polinucleótido. Una deleción o una deleción interna pueden identificarse especificando las posiciones de inicio y finalización de la deleción con respecto a una secuencia de referencia. Con respecto a un polipéptido FGF-21 modificado, una referencia a una deleción interna en general especifica la deleción de una región con respecto a un polipéptido FGF-21 de referencia, tal como una deleción de una región correspondiente a las posiciones del polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO:1, por ejemplo, las posiciones de aminoácidos 119-130 en SEQ ID NO:1 (es decir, PGNKSPHRDPAP (SEQ ID NO:73)).
"Péptido de reemplazo" se refiere a aminoácidos que se insertan en lugar de una deleción interna u otra deleción dentro de un polipéptido. La longitud del péptido de reemplazo puede diferir de la longitud de la deleción interna. Los ejemplos de péptidos de reemplazo pueden comprender uno o más restos de glicina, serina e histidina, y en algunos casos, restos de aminoácidos adicionales, tales como lisina y prolina. Sin embargo, cabe aclarar que un péptido de reemplazo no se limita a secuencias que contienen estos aminoácidos particulares, sino que, en su lugar, puede incluir cualquier aminoácido natural o aminoácido codificado de manera no natural. Un péptido de reemplazo puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, un solo aminoácido (es decir, que tiene una longitud de 1 aminoácido), dos o más aminoácidos, o tres o más aminoácidos. Un péptido de reemplazo que tiene una longitud de cero aminoácidos indica que no hay un péptido de reemplazo. En algunas realizaciones, el polipéptido de reemplazo puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de reemplazo puede tener una longitud de 1-10, 1-7, 1-5 o 1-3 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de reemplazo puede tener una longitud de 2-7, 2-5 o 2-3 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido de reemplazo puede tener una longitud de 3 aminoácidos. Algunos ejemplos de péptidos de reemplazo incluyen las secuencias G, GG, SG, GSG, GGH, SGG, GSGH (SEQ ID NO:343), HSG, HHSG (SEQ ID NO:344), HGSH (SEQ ID NO:345), GSGP (SEQ ID NO:346), HGG, HSGG (SEQ ID NO:347) y HGSG (SEQ ID NO:348). Otros ejemplos de péptidos de reemplazo incluyen las secuencias K, DKS, HKS, D, Q, KDS y KDSQ (SEQ ID NO:349).
"Compañero de fusión" se refiere a un péptido o polipéptido fusionado al polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento. El compañero de fusión puede estar fusionado al polipéptido FGF-21 modificado en N- y/o C-terminales. Los ejemplos de compañeros de fusión incluyen, pero no se limitan a, albúmina, transferrina, adnectinas (por ejemplo, adnectinas de prolongación de farmacocinética (PKE) o de unión a albúmina), dominio Fc y polipéptido no estructurado, tal como los polipéptidos XTEN y PAS (por ejemplo, secuencias de polipéptidos de conformación desordenada compuestas por los aminoácidos Pro, Ala y/o Ser), o un fragmento de cualquiera de los anteriores. El compañero de fusión puede estar fusionado al polipéptido FGF-21 modificado para cualquier fin, lo que incluye, pero no se limita a, purificación, facilidad de fabricación, prolongación de la semivida, mejores propiedades biofísicas (por ejemplo, solubilidad o estabilidad), menor inmunogenicidad o toxicidad, etc.
"Péptido de conexión" se refiere a una secuencia de aminoácidos cuyos N y C-terminales están fusionados a otros péptidos o polipéptidos. Un péptido de conexión puede estar presente en una proteína de fusión, por ejemplo, cuyos términos están fusionados (en cualquier orden) a un polipéptido FGF-21 modificado y a un compañero de fusión. Los ejemplos de péptidos de conexión pueden comprender entre 0 aminoácidos (es decir, ausencia de péptidos de conexión) y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 o 100 aminoácidos, o más. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede comprender entre 1 y 40, entre 1 y 30, entre 1 y 20, entre 1 y 10, entre 1 y 5, entre 2 y 40, entre 2 y 30, entre 2 y 20, entre 2 y 10, entre 5 y 40, entre 5 y 30, entre 5 y 20 o entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede comprender entre 5 y 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede comprender entre 10 y 20 aminoácidos. Sin embargo, algunos ejemplos de péptidos de conexión descritos en el presente documento pueden ser ricos en restos de serina y glicina, ya que debe comprenderse que el péptido de conexión no se limita a tales secuencias. Algunos ejemplos de péptidos de conexión incluyen las siguientes secuencias: GAGGGGSG (SEQ ID NO:74), EPKSSD (SEQ ID NO:75), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO:76), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO:77), GQPDEPGGS (SEQ ID NO:78), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO:79), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO:80), GSGSG (SEQ ID NO:81), GSGC (SEQ ID NO:82), AGGGGSG (SEQ ID NO:83), GSGS (SEQ ID NO:84), QPDEPGGS (SEQ ID NO:85), GSGSGS (SEQ ID NO:86), TVAAPS (SEQ ID NO:87), KAGGGGSG (SEQ ID NO:88), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO:89), KQPDEPGGS (SEQ ID NO:90), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO:91), KTVAAPS (SEQ ID NO:92), KAGGGGSGG (SEQ ID NO:93), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO:94), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO:95), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO:96), KTVAAPSG AGGGGSGG (SEQ ID NO:97), AGGGGSG (SEQ ID NO:98), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO:99), QPDEPGGSG (SEQ ID NO:100), TVAAPSG (SEQ ID NO:301), GGGGSGGGSGGGGGSGGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO:350), PSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO:351), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO:352), SSGGGGSGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:353), GS (SEQ ID NO: 354), GGGGS (SEQ ID NO: 355), EEEEDEEEED (SEQ ID NO: 356), PSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 357), GSHHHHHHHHGS (SEQ ID NO: 358), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 359), GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 360), GSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 361), PSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEQ ID NO: 362), RGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP (SEQ ID NO: 363), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 364), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP(SEQID NO: 365), PSTPPTPSPSTPPTPSPSPSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEQ ID NO: 366), PSPEP (SEQ ID NO: 367), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 368), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 369), PTPEPPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 370), PSPEPGGGSPTPEP (SEQ ID NO: 371), PSPEPEEEDPTPEP (SEQ ID NO: 372), PSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 373), PTPEPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 374), PTPEPPSPEPPTPEPGGGGSPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 375), PSPEPTPEPSPEPPTPEPSPEPTPEP (SEQ ID NO: 376), GETGS (SEQ ID NO: 377), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 378), GETGSSGEGT (SEQ ID NO: 379), GETGSSGEGTGSTGS (SEQ ID NO: 380), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 381), GETGSSGEGTGSTGSGAGES (SEQ ID NO: 382) y GETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGESGEGGS (SEQ ID NO: 383), es decir, SEQ ID NOs:74-100, 301, y 350-383.
La expresión "enfermedad asociada a la fibrosis" incluye enfermedades, trastornos y afecciones en los cuales se observó que la fibrosis se presentó o en los cuales se sabe o se cree que la fibrosis está asociada o contribuye a la etiología, progresión o los síntomas de enfermedad, o en los cuales se sabe o se cree que la fibrosis se presenta a medida que la enfermedad avanza. La fibrosis puede afectar un órgano o tejido, tal como páncreas, pulmón, corazón, riñón, hígado, ojos, sistema nervioso, médula ósea, ganglios linfáticos, endomiocardio o retroperitoneo. Algunos ejemplos de enfermedades asociadas a la fibrosis incluyen, pero no se limitan a, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis hepática, precirrosis, cirrosis, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, fibrosis quística, fibrosis de pulmón o pulmonar, fibrosis masiva progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis por inyección, fibrosis renal o hepática, enfermedad renal crónica, enfermedad renal diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA, mielofibrosis, insuficiencia cardíaca, insuficiencia cardíaca metabólica, fibrosis cardíaca, fibrosis por cataratas, cataratas, cicatrización ocular, fibrosis pancreática, fibrosis dérmica, fibrosis intestinal, estenosis intestinal, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, enfermedad de Crohn, fibrosis retroperitoneal, queloide, fibrosis sistémica nefrogénica, escleroderma, esclerosis sistémica, artrofibrosis, síndrome de Peyronie, contractura de Dupuytren, neuropatía diabética, capsulitis adhesiva, enfermedad hepática alcohólica, hepatoesteatosis, hepatitis viral, enfermedad biliar, hemocromatosis primaria, cirrosis relacionada con los fármacos, cirrosis criptógena, enfermedad de Wilson, y deficiencia de alfa 1 -antitripsina, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), enfermedad pulmonar fibrótica humana, degeneración macular, retinopatía retinal, retinopatía vítrea, fibrosis miocárdica, oftalmopatía de Grave, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, ateroesclerosis/reestenosis, cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática y enfermedad intestinal inflamatoria (que incluye, pero no se limitan a, colitis colagenosa). En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede incluir fibrosis hepática, fibrosis renal o de riñón, fibrosis pulmonar o de pulmón y fibrosis cardíaca o del corazón. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede ser fibrosis hepática. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede ser EHNA.
En general, la frase "obesidad clínicamente complicada" (también denominada "obesidad mórbida") se refiere a la afección de un subconjunto de individuos obesos que también tienen complicaciones de salud relacionadas con la obesidad o causadas por esta. La obesidad puede determinarse mediante la determinación del índice de masa corporal (peso en kilogramos dividido por la altura al cuadrado en metros), en donde un índice de masa corporal de 30 m/kg2 o mayor indica obesidad. Los ejemplos de complicaciones de salud presentes en la obesidad clínicamente complicada pueden incluir uno o más de diabetes mellitus tipo 2, hipertensión, apnea obstructiva del sueño, arteriopatía coronaria y otras enfermedades cardiovasculares (que incluyen arteriopatía coronaria, apoplejía, e insuficiencia cardíaca congestiva), y dislipidemia. Otras complicaciones de la salud que pueden estar presentes incluyen enfermedad del hígado graso no alcohólica (tal como esteatosis, esteatohepatitis o cirrosis), enfermedad respiratoria, apnea obstructiva del sueño, síndrome de hipoventilación y obesidad, asma, enfermedad pulmonar restrictiva, tipos de cáncer, osteoartritis, colelitiasis, enfermedad por reflujo gastroesofágico, anomalías ginecológicas, infertilidad, menstruación irregular, estasis venosa, problemas de la piel, intertrigo, celulitis, aumento de riesgo de desarrollar complicaciones durante cirugías o embarazo, incontinencia urinaria e hipertensión intracraneal idiopática. La obesidad clínicamente complicada también puede estar asociada al síndrome de Prader-Willi.
La expresión "sustancialmente purificado" se refiere a un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado que puede estar sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína tal como se encuentra en la naturaleza, es decir, una célula nativa, o una célula hospedadora en el caso de polipéptidos FGF-21 modificados o no modificados producidos de manera recombinante. El polipéptido FGF-21 modificado o no modificado que puede estar sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 25 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 15 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 3 %, menos de aproximadamente el 2 %, o menos de aproximadamente el 1 % (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado o una variante de este se producen de manera recombinante por las células hospedadoras, la proteína puede estar presente en aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 2 % o aproximadamente el 1 %, o menos, del peso seco de las células. Cuando el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado o una variante de este se producen de manera recombinante mediante las células hospedadoras, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo en aproximadamente 5 g/l, aproximadamente 4g/l, aproximadamente 3 g/l, aproximadamente 2 g/l, aproximadamente 1 g/l, aproximadamente 750 mg/l, aproximadamente 500 mg/l, aproximadamente 250 mg/l, aproximadamente 100 mg/l, aproximadamente 50 mg/l, aproximadamente 10 mg/l o aproximadamente 1 mg/l, o menos, del peso seco de las células. Por lo tanto, el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado "sustancialmente purificado" producido por los métodos de la presente divulgación puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 75 %, el 80 %, el 85 %, y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 90 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 95 %, un nivel de pureza de al menos aproximadamente el 99 % o más, según se determine mediante los métodos adecuados, tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC y electroforesis capilar.
Una "célula hospedadora recombinante" o "célula hospedadora" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, absorción directa, transducción, apareamiento-f u otros métodos conocidos en el estado de la técnica para crear células hospedadoras recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o de manera alternativa, puede estar integrado en el genoma hospedador.
Como se usa en el presente documento, el término "medio" incluye cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semisólido o soporte rígido que pueda soportar o contener cualquier célula hospedadora, lo que incluye células hospedadoras bacterianas, células hospedadoras de levadura, células hospedadoras de insectos, células hospedadoras vegetales, células hospedadoras eucariotas, células hospedadoras de mamíferos, células CHO, células hospedadoras procariotas o células hospedadoras de E. coli y Pseudomonas, y contenidos celulares. Por lo tanto, el término puede abarcar el medio en el cual se cultivó la célula hospedadora, por ejemplo, el medio en el cual se secretó el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado, que incluye el medio antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar tampones o reactivos que contienen lisados de células hospedadoras, tal como cuando el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado se produce de manera intracelular y las células hospedadoras son lisadas o alteradas para que liberen el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado.
La expresión "agente antidiabético" significa cualquier fármaco que es útil para tratar, prevenir o, de otro modo, reducir la gravedad de cualquier trastorno del metabolismo de la glucosa, o cualquier complicación del mismo, que incluyen cualquiera de las afecciones, enfermedades o complicaciones descritas en el presente documento. Los agentes antidiabéticos incluyen insulina, tiazolidindionas, sulfonilureas, derivados de ácido benzoico, inhibidores de alfaglucosidasa, o similares. Las composiciones antidiabéticas pueden ser capaces de reducir los niveles de HbA1c en al menos el 10 % o al menos el 50 % de cambio con respecto al valor inicial. Los agentes antidiabéticos incluyen potenciadores de la insulina, tales como pero no limitados a potenciadores de la insulina de moléculas pequeñas, taurina, ácido alfa lipoico, un extracto de moras, cromo, glutamina, Enicostemma littorale Blume, Scoparia dulcis, un extracto de estragón, Andrographis paniculata, isomalta, trehalosa o D-manosa, que pueden potenciar adicionalmente la secreción o actividad de la insulina.
Como se usan en el presente documento, "polipéptido FGF-21 modificado", "factor de crecimiento de fibroblastos 21 modificado" o "FGF-21 modificado" y formas de estos sin guion se usan indistintamente e incluyen aquellos polipéptidos y proteínas que difieren de FGF-21 de tipo silvestre (por ejemplo, FGF-21 humano de tipo silvestre de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:5) y, en general, tienen al menos una actividad biológica de un factor de crecimiento de fibroblastos 21, así como análogos de FGF-21, isoformas de FGF-21, miméticos de FGF-21, fragmentos de FGF-21, proteínas FGF-21 híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes del patrón de glucosilación, variantes, variantes de empalme y muteínas de estos, independientemente de su actividad biológica. Las expresiones "polipéptido FGF-21 modificado" y "FGF-21 modificado" abarcan polipéptidos FGF-21 que comprenden una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción comprenden una deleción interna, que incluye las deleciones internas que se muestran en la Figura 1 y otras descritas en el presente documento.
La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" también abarca polimorfismos (por ejemplo, variantes naturales de la secuencia de FGF-21). Por ejemplo, la "forma P" de FGF-21 contiene una prolina (P) en la posición 174 (posición 146 en el polipéptido maduro de SEQ ID NO:1), mientras que la "forma L" contiene una leucina (L) en la posición 174 (posición 146 en el polipéptido maduro de SEQ ID NO:5). Los ejemplos de secuencias del polipéptido FGF-21 de la forma P están contenidos en SEQ ID NO: 1-4, mientras que las secuencias del polipéptido FGF-21 de la forma L están contenidas en SEQ ID NO: 5-7.
Se describieron sustituciones en una amplia diversidad de posiciones de aminoácidos en FGF-21 naturales. Las sustituciones incluyendo pero no limitado a, las que modulan la solubilidad o estabilidad, aumentan la actividad agonista, aumentan la semivida in vivo o in vitro, aumentan la resistencia a la proteasa, convierten el polipéptido en un antagonista, reducen la inmunogenicidad o la toxicidad, facilitan la purificación o la facilidad de fabricación, etc. y están comprendidas en la expresión "polipéptido FGF-21 modificado" o "FGF-21 modificado". En algunos casos, las sustituciones del aminoácido codificado de manera no natural pueden combinarse con otras adiciones, sustituciones o deleciones dentro del polipéptido FGF-21 modificado para afectar otros rasgos biológicos del polipéptido FGF-21 modificado con respecto a otro polipéptido FGF-21 (por ejemplo, el polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO:1, el polipéptido FGF-21 modificado de SEQ ID NO:201, u otro polipéptido FGF-21, tal como el mismo polipéptido FGF-21 sin dicha adición, sustitución o deleción, u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado). En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la estabilidad (incluyendo, pero no limitado a, la resistencia a la degradación proteolítica) del polipéptido FGF-21 modificado o aumentar la afinidad del polipéptido FGF-21 modificado hacia su receptor. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la estabilidad farmacéutica del polipéptido FGF-21 modificado. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la solubilidad (incluyendo, pero no limitado a, cuando se expresa en E. coli o en otras células hospedadoras) del polipéptido FGF-21 modificado. En algunas realizaciones, las adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la solubilidad del polipéptido después de la expresión en E^coJ[o en otras células hospedadoras recombinantes. En algunas realizaciones, se seleccionan sitios para sustitución con un aminoácido no natural o codificado de manera natural, además de otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural que da como resultado una mayor solubilidad de polipéptido después de la expresión en E. coli o en otras células hospedadoras recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados comprenden otra adición, sustitución o deleción que modula la afinidad al receptor del polipéptido FGF-21, a las proteínas de unión o al ligando asociado, modula la transducción de la señal después de unirse al receptor de FGF-21, modula la semivida circulante, modula la liberación o biodisponibilidad, facilita la purificación, o mejora o altera una vía de administración particular. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados comprenden una adición, sustitución o deleción que aumenta la afinidad del FGF-21 modificado a su receptor. De manera similar, los polipéptidos FGF-21 modificados pueden comprender secuencias de escisión química o enzimática, secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión al anticuerpo (incluyendo, pero no limitado a, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo, pero no limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo, pero no limitado a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo, pero no limitado a, GFP), purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación o activación del profármaco, reducción del tamaño de FGF-21 modificado, u otros rasgos del polipéptido.
Para las secuencias de FGF-21 que carecen de una secuencia líder, véanse SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 en el presente documento. Para las secuencias de FGF-21 con una secuencia líder, véanse SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 de la divulgación son sustancialmente idénticos a SEQ ID NO: 1-7 o a cualquier otra secuencia de un polipéptido FGF-21. Se identificaron múltiples polimorfismos de FGF-21. La leucina o la prolina se describieron en la misma posición en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20010012628 y en la Patente de EE.UU. N.° 6.716.626. Las secuencias de líder o señal N-terminal que difieren en 1 aminoácido (leucina) se muestran en la Patente de EE.UU. N.° 6.716.626 y en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780. Las variantes o mutantes de polipéptido FGF-21 incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en la Patente de EE.UU. N.° 6,716,626; las publicaciones de patentes de EE.UU. N.° 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713 y 2001/0012628; WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463; WO01/018172; WO09/149171; WO10/042747; WO12/066075; WO11/154349; WO13/052311; WO13/188181.
La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" también incluye fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente activas y estereoisómeros del FGF-21 natural, además de variantes agonistas, miméticas y antagonistas del FGF-21 natural y las fusiones de polipéptidos de estos. Las fusiones que comprenden aminoácidos adicionales en el término amino, término carboxilo o ambos están comprendidas en la expresión "polipéptido FGF-21 modificado". Los ejemplos de fusiones incluyen, por ejemplo, FGF-21 de metionilo, en donde una metionina está ligada a N-terminal de FGF-21, que resulta de la expresión recombinante de la forma madura de FGF-21 que carece del péptido líder o péptido de señal o una porción de estos (una metionina está ligada a N-terminal de FGF-21, que resulta de la expresión recombinante, por ejemplo, en E. coli), fusiones con fines de purificación (incluyendo, pero no limitado a, polihistidina o epítopos de afinidad), fusiones con péptidos de unión a albúmina de suero, tales como adnectina PKE y fusiones con proteínas séricas, tales como albúmina de suero, y proteínas de fusión que comprenden FGF-21 y una o más moléculas diferentes ("compañero de fusión"), incluyendo, pero no limitado a, albúmina de suero, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina, polipéptido no estructurado, adnectina, y un fragmento de estos. Cualquiera de esos fragmentos puede prepararse de las proteínas mediante métodos bioquímicos estándares, o mediante la expresión de un polinucleótido que codifica el fragmento.
A menos que se indique lo contrario, en general, como se usan en el presente documento, las expresiones "polipéptido FGF-21" "factor de crecimiento de fibroblastos 21" y "FGF-21" abarcan tanto polipéptidos FGF-21 no modificados (es decir, de tipo silvestre) como polipéptidos FGF-21 modificados.
La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" incluye polipéptidos conjugados con un polímero, tal como PEG, y puede comprender opcionalmente una o más derivatizaciones adicionales de cisteína, lisina u otros restos. Asimismo, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender un enlazador o polímero, en donde el aminoácido al cual se conjugan el enlazador o el polímero puede ser un aminoácido no natural de acuerdo con la presente divulgación, o puede conjugarse con un aminoácido codificado de manera natural utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica, tales como acoplamiento a lisina o cisteína.
La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" también incluye FGF-21 modificado glucosilado, tal como pero no limitado a, polipéptidos glucosilados en cualquier posición de aminoácido, formas glucosiladas ligadas a N o ligadas a O del polipéptido. Las variantes que contienen un cambio de un solo nucleótido también se consideran variantes biológicamente activas del polipéptido FGF-21. Asimismo, se incluyen las variantes de corte y empalme. La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" también incluye heterodímeros del polipéptido FGF-21, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros de uno o más polipéptidos FGF-21 modificados o no modificados o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, molécula pequeña, enlazador, ligando u otra molécula biológicamente activa de cualquier tipo, ligada por medios químicos o expresada como una proteína de fusión, además de análogos de polipéptido que contienen, por ejemplo, deleciones específicas u otras modificaciones pero que aun así mantienen la actividad biológica.
Todas las referencias a las posiciones de aminoácidos en el FGF-21 modificado o no modificado que se describen en el presente documento se basan en la posición correspondiente en SEQ ID NO: 1, a menos que se indique lo contrario (es decir, cuando se establece que la comparación está basada en SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, o en otra secuencia de FGF-21). Por ejemplo, el aminoácido en la posición 77 de SEQ ID NO: 1, es una arginina, y la arginina correspondiente se ubica en SEQ ID NO: 2 en la posición 87. Las personas expertas en la materia comprenderán que las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones en SEQ ID NO: 1 pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula de FGF-21, tal como SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Las personas expertas en la materia comprenderán que las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o cualquier otra secuencia de FGF-21 pueden identificarse fácilmente en cualquier otra molécula de FGF-21, tal como fusiones, variantes, fragmentos, etc. de FGF-21. Por ejemplo, pueden usarse programas de alineación de secuencias, tales como BLAST, para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde a una posición en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u otra secuencia de FGF-21. Las sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos descritas en el presente documento en referencia a SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u otra secuencia de FGF-21 también se refieren a sustituciones, deleciones o adiciones en las posiciones correspondientes en fusiones, variantes, fragmentos, etc. de FGF-21 que se describen en el presente documento o que se conocen en el estado de la técnica y quedan abarcadas expresamente por la presente descripción.
Las expresiones "polipéptido FGF-21 modificado" o "FGF-21 modificado" abarcan polipéptidos FGF-21 que comprenden una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Por ejemplo, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción pueden estar compuestos por modificaciones con uno o más aminoácidos naturales, opcionalmente junto con una o más modificaciones de aminoácidos no naturales. Las sustituciones, inserciones o deleciones de ejemplo en una amplia variedad de posiciones de aminoácidos en polipéptidos FGF-21 (que incluye aquellos descritos en el presente documento y otros), lo que incluye sustituciones que modulan la estabilidad farmacéutica, que modulan una o más de las actividades biológicas del polipéptido FGF-21, por ejemplo, aumentan la actividad agonista, aumentan la solubilidad del polipéptido, reducen la susceptibilidad de la proteasa, disminuyen la desamidación, convierten el polipéptido en un antagonista, reducen la inmunogenicidad o la toxicidad, o facilitan la purificación o facilidad de fabricación, etc. están comprendidas en la expresión "polipéptido FGF-21 modificado".
En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados también comprenden una inserción, sustitución o deleción adicional que modula la actividad biológica del polipéptido FGF-21 modificado. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o deleciones pueden modular una o más propiedades o actividades de FGF-21 modificado. Por ejemplo, las adiciones, sustituciones o deleciones pueden modular la afinidad al receptor del polipéptido FGF-21, modular la semivida en circulación, modular la semivida terapéutica, modular la estabilidad del polipéptido, modular la escisión mediante proteasas, modular la dosis, modular la liberación o biodisponibilidad, facilitar la purificación, disminuir la desamidación, mejorar la semivida o mejorar o alterar una vía de administración particular. De manera similar, los polipéptidos FGF-21 modificados pueden comprender secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión al anticuerpo (incluyendo pero no limitado a, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero no limitado a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas ligadas (incluyendo pero no limitado a, biotina) que mejoran la detección (incluyendo pero no limitado a, GFP), la purificación u otros rasgos del polipéptido.
La expresión "polipéptido FGF-21 modificado" también abarca homodímeros, heterodímeros, homomultímeros y heteromultímeros que se forman mediante compañeros de fusión, tales como dominios Fc, o que están unidos, pero no se limitan a, a aquellos unidos directamente a través de cadenas laterales del aminoácido codificado de manera no natural, ya sea a las mismas cadenas laterales del aminoácido codificado de manera no natural o a cadenas laterales diferentes de este, a cadenas laterales del aminoácido codificado de manera natural, o indirectamente a través de un enlazador. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, compuestos orgánicos pequeños, polímeros solubles en agua de diversas longitudes, tales como poli(etilenglicol) o polidextrano, o polipéptidos de diferentes longitudes.
Un "aminoácido codificado de manera no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina ni selenocisteína. Otras expresiones que pueden usarse como sinónimo de la expresión "aminoácido codificado de manera no natural" son "aminoácido no natural", "aminoácido de origen no natural" y versiones con guion y sin guion de las mismas. La expresión "aminoácido codificado de manera no natural" también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que se producen por modificación (por ejemplo, modificaciones después de la traducción) de un aminoácido codificado de manera natural (que incluye, pero no se limita a, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína), pero que no se incorporan naturalmente en una cadena de polipéptidos de crecimiento por medio de un complejo de traducción. Los ejemplos de tales aminoácidos codificados de manera no natural incluyen, pero no se limitan a, A/-acetilglucosaminil-L-serina, W-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina.
Un "grupo de modificación del amino terminal" se refiere a cualquier molécula que puede unirse al amino terminal de un polipéptido. De manera similar, un "grupo de modificación del carboxi terminal" se refiere a cualquier molécula que puede unirse al carboxi terminal de un polipéptido. Los grupos de modificación del terminal incluyen, pero no se limitan a, distintos polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas, tales como albúmina de suero, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina, polipéptido no estructurado, adnectina o un fragmento de estos, u otras porciones que aumentan la semivida en suero (in vivo) de péptidos.
Las expresiones "grupo funcional", "porción activa", "grupo activador", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva" se usan en el estado de la técnica y en el presente documento para diversas porciones o unidades definibles de una molécula. Los términos son de algún modo sinónimos en el campo de la química y se usan en el presente documento para indicar las porciones de moléculas que realizan alguna función o actividad y que son reactivas con otras moléculas.
En el presente documento, el término "enlace" o "enlazador" se usa para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forman como resultado de una reacción química y, en general, son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo, pero no limitado a, en condiciones fisiológicas durante un período prolongado, tal vez indefinidamente. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significa que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, lo que incluye, por ejemplo, sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significa que el enlace puede ser degradado por una o más enzimas. Como se comprende en el estado de la técnica, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura principal del polímero o en el grupo enlazador entre la estructura principal del polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula polimérica. Por ejemplo, los enlaces éster formados por la reacción de ácidos carboxílicos PEG o ácidos carboxílicos PEG activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo en general se hidrolizan en condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otras enlaces hidrolíticamente degradables incluyen, pero no se limitan a, enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan de la reacción de una amina y un aldehído; enlaces de ésteres de fosfato formadas mediante la reacción de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona, que son el producto de la reacción de hidrazida y un aldehído; enlaces de acetal, que son el producto de la reacción de un aldehído y un alcohol; enlaces de ortoésteres, que son el producto de la reacción de un formiato y un alcohol; enlaces de péptidos formados por un grupo amina, incluyendo pero no limitado a, en un extremo de un polímero, tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótidos formados por un grupo fosforamidita, por ejemplo, en el extremo de un polímero, y un grupo hidroxilo 5' de un oligonucleótido.
En el presente documento, las expresiones "molécula biológicamente activa", "porción biológicamente activa" o "agente biológicamente activo" significan cualquier sustancia que puede afectar cualquier propiedad física o bioquímica de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción con respecto a un ser vivo. En particular, como se usa en el presente documento, las moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, cualquier sustancia utilizada para diagnosticar, curar, atenuar, tratar o prevenir la enfermedad en seres humanos u otros animales, o para mejorar el bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, carbohidratos, átomos o moléculas inorgánicos, tintes, lípidos, nucleósidos, radionúclidos, oligonucleótidos, toxoides, toxinas, polisacáridos, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, proteínas y porciones de los mismos obtenidos o derivados de virus, bacterias, insectos, animales o cualquier otra célula o tipo celular, liposomas, micropartículas y micelas.
El término "sustituyentes" incluye, pero no se limita a, "sustituyentes que no interfieren". Los "sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que producen compuestos estables. Los radicales o sustituyentes que no interfieren adecuados incluyen, pero no se limitan a, halo, alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, alcoxi C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloalquenilo C3-C12, fenilo, fenilo sustituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulfinilo C1-C6 , alquilsulfonilo C1-C10, --(CH2)m --O--(alquilo C1-C10), en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, --NO2, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 alquilo), --C(O)--(alquilo C1-C10), alquiltioalquilo C2-C10, --C(O)O--(alquilo C1-C10), --OH, --SO2, =S, --COOH, --NR2 , carbonilo, --C(O)--( alquilo C1-C10)-CF3, --C(O)—CF3, --C(O)NR2, --(arilo C1-C10)-S--(arilo C6-C10), --C(O)--(arilo C1-C10), --(CH2)m --O--(--(CH2)m--O--(alquilo C1-C10), en donde cada m es de 1 a 8, --c (o )NR2, --C(S)n R2, -- SO2NR2, --NRC(O) NR2 , --NRC(S) NR2 , sales de estos, y similares. Como se usa en el presente documento, cada R es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo o alcarilo.
Como se usa en el presente documento, la expresión "polímero soluble en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en disolventes acuosos. El enlace de polímeros solubles en agua con polipéptidos FGF-21 modificados puede dar como resultado cambios incluyendo pero no limitado a, mayor semivida en suero (in vivo) o semivida en suero (in vivo) modulada, o mayor semivida terapéutica o semivida terapéutica modulada, con respecto a la forma no modificada, toxicidad o inmunogenicidad modulada, características de asociación física modulada, tales como agregación y formación de multímeros, unión al receptor alterada, unión alterada a uno o más componentes de unión, y dimerización o multimerización del receptor alterada. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica, y puede usarse como un enlazador para unir el FGF-21 modificado a otras sustancias, incluyendo pero no limitado a, uno o más polipéptidos FGF-21 modificados o no modificados, o una o más moléculas biológicamente activas. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, polietilenglicol propionaldehído, mono alcoxi C1-C10 o derivados de ariloxi de estos (descritos en la Patente de EE.UU. N.° 5.252.714), monometoxi-polietilenglicol, PEG discreto, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol, poliaminoácidos, anhídrido maleico diviniléter, W-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano que incluyen sulfato de dextrano, polipropilenglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glucanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero no limitado a, metilcelulosa y carboximetilcelulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilenglicol y derivados de estos, copolímeros de polialquilenglicoles y derivados de los mismos, poliviniletiléteres y alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, y similares, o mezclas de los mismos. Los ejemplos de tales polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol y albúmina de suero.
Como se usa en el presente documento, el término "polialquilenglicol" (PEG) o "poli(alquenglicol)" se refiere a polietilenglicol (poli(etilenglicol)), polipropilenglicol, polibutilenglicol y derivados de los mismos. El término "polialquilenglicol" abarca polímeros lineales y ramificados, y pesos moleculares promedio de entre 0,1 kDa y 100 kDa. Se enumeran otras realizaciones de ejemplo, por ejemplo, en catálogos de proveedores comerciales, tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).
Como se usan en el presente documento, las expresiones "semivida en suero modulada" o "semivida in vivo modulada" y expresiones similares se refieren al cambio positivo o negativo en la semivida en circulación de un FGF-21 modificado con respecto a un comparador, tal como su forma no modificada. La semivida en suero puede medirse tomando muestras de sangre en distintos puntos temporales después de la administración de un FGF-21 modificado, y determinando la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración en suero con el tiempo permite calcular la semivida en suero. Una mayor semivida en suero (in vivo) puede tener, convenientemente, un aumento de al menos aproximadamente el doble, pero puede resultar útil un aumento menor, por ejemplo, en donde este permite un régimen de dosis satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas realizaciones, el aumento puede ser de al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces.
Como se usa en el presente documento, la expresión "semivida terapéutica modulada" significa el cambio positivo o negativo en la semivida en suero o in vivo de la cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento, con respecto a un comparador, tal como su forma no modificada o el FGF-21 de tipo silvestre. La semivida terapéutica se calcula midiendo las propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en distintos puntos temporales después de la administración. El aumento de la semivida terapéutica permite convenientemente un régimen de dosis particular, una dosis total beneficiosa particular, o evita un efecto no deseado. En algunas realizaciones, el aumento de la semivida terapéutica resulta de una mayor potencia, mayor o menor unión de la molécula modificada a su objetivo, mayor o menor descomposición de la molécula por parte de enzimas, tales como proteasas, o un aumento o una disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada o un aumento o una disminución de la depuración mediada por el receptor de la molécula.
Cuando se aplica a un ácido nucleico o a una proteína, el término "aislado" indica que el ácido nucleico o la proteína es libre de al menos algunos de los componentes celulares con que se asocia en el estado natural o que el ácido nucleico o la proteína se concentraron a un nivel mayor que la concentración de su producción in vivo o in vitro. Puede ser en un estado homogéneo. Las sustancias aisladas pueden estar en un estado seco o semiseco, o en solución, lo que incluye, pero no se limita a, una solución acuosa. Puede ser un componente de una composición farmacéutica que comprende vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. En general, la pureza y la homogeneidad se determinan usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación se purifica sustancialmente. En particular, un gen aislado se separa de marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y codifican una proteína que no es el gen de interés. El término "purificado" indica que un ácido nucleico o una proteína genera, sustancialmente, una banda en el gel electroforético. En particular, puede significar que el ácido nucleico o la proteína son al menos un 85 % puros, al menos un 90 % puros, al menos un 95 % puros, al menos un 99 % puros, o más.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sean monocatenarios o bicatenarios. A menos que se indique lo contrario, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique una limitación, el término también se refiere a análogos de oligonucleótidos que incluyen PNA (ácido peptidonucleico), análogos de ADN usados en tecnología antisentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y similares). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca, implícitamente, variantes de la misma modificadas de manera conservativa (lo que incluye, pero no se limita a, sustituciones del codón degenerado) y secuencias complementarias, además de la secuencia indicada de manera explícita.
En el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Esto quiere decir que una descripción dirigida a un polipéptido se aplica de igual manera a la descripción de un péptido y a la descripción de una proteína, y viceversa. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos naturales, así como a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un aminoácido codificado de manera no natural. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, lo que incluye proteínas de longitud completa, en donde los restos de aminoácidos se enlazan mediante enlaces de péptidos covalentes.
Las "variantes modificadas de manera conservativa" se refieren a secuencias de aminoácidos que contienen sustituciones conservativas. Algunos ejemplos de variantes modificadas de manera conservativa incluyen sustituciones, deleciones o inserciones a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que alteran, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos o secuencia de polipéptidos codificados, por ejemplo, hasta 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o hasta el 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 2,5 % o el 3,5 % de los aminoácidos en la secuencia de polipéptidos o secuencia de polipéptidos codificados, que opcionalmente puede ser o puede incluir la sustitución de aminoácidos con aminoácidos químicamente similares. Las personas expertas en la materia conocen las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar. Esas variantes modificadas de manera conservativa son adicionales y no excluyentes de las variantes polimorfas, los homólogos interespecies y los alelos de los polipéptidos FGF-21 modificados desvelados.
Las personas expertas en la materia conocen las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos de funcionalidad similar. Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M)
(Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2.a edición (diciembre de 1993).
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % de identidad en una región específica), cuando se compararan y se alinean para lograr una correspondencia máxima en una ventana de comparación o en una región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para las personas expertas en la materia) o mediante la alineación manual y la inspección visual. La identidad puede existir en una región o ventana de comparación que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos, o en una región que tiene una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos o, cuando no se especifica, en la totalidad de la secuencia de un polinucleótido o polipéptido. Como se usa en el presente documento, una "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento de uno cualquiera de los números de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, en general, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, con mayor frecuencia, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente dos secuencias. Algunos ejemplos de algoritmos que pueden ser adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLa St 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente, así como los algoritmos de Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol. 25 de marzo de 1981;147(1):195-7) o Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, J Mol Biol., marzo de 1970;48(3):443-53), que pueden realizarse con los parámetros predeterminados, por ejemplo, como se describe en las publicaciones respectivas.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal, en algunas realizaciones, a un mamífero, y en otras realizaciones, a un ser humano, que es el objeto del tratamiento, la observación o el experimento. Un animal puede ser un animal de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), un animal de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad del compuesto (por ejemplo, un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento) que se administra, que puede aliviar, en cierta medida, uno o más de los síntomas de la enfermedad, afección o trastorno que se esté tratando. Las composiciones que contienen el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento pueden administrarse para tratamientos profilácticos, potenciadores y/o terapéuticos.
Los términos "mejorar" o "mejorador" significan aumentar o prolongar, ya sea en potencia o en duración, un efecto deseado. Por lo tanto, en relación con la mejora del efecto de los agentes terapéuticos, el término "mejorar" se refiere a la capacidad de aumentar o prolongar, ya sea en potencia o en duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema.
Como se usa en el presente documento, el término "modificado" se refiere a cualquier cambio hecho a un polipéptido determinado, tal como cambios en la longitud del polipéptido, la secuencia de aminoácidos, la estructura química, la modificación simultánea a la traducción, o la modificación después de la traducción de un polipéptido. El término forma "(modificada)" significa que los polipéptidos analizados son opcionalmente modificados, es decir, los polipéptidos analizados pueden ser modificados o no modificados.
La expresión "post-traduccionalmente modificado" se refiere a cualquier modificación de un aminoácido natural o aminoácido no natural que se produce en ese aminoácido después que se haya incorporado en una cadena de polipéptidos. La expresión abarca, únicamente a modo de ejemplo, modificaciones in vivo simultáneas a la traducción, modificaciones in vitro simultáneas a la traducción (como ocurre en un sistema de traducción libre de células), modificaciones in vivo después de la traducción y modificaciones in vitro después de la traducción.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen el polipéptido FGF-21 modificado se administran a un paciente susceptible o en riesgo de contraer una enfermedad, un trastorno o una afección particulares. Esa cantidad se define como una "cantidad profilácticamente eficaz".
En aplicaciones terapéuticas, las composiciones que comprenden el polipéptido de aminoácido no natural modificado se administran a un paciente que ya tiene una enfermedad, afección o trastorno, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente o aliviar los síntomas de la enfermedad, el trastorno o la afección. Esa cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz," y puede depender de la gravedad y el curso de la enfermedad, el trastorno o la afección, un tratamiento anterior, el estado de salud del paciente y la respuesta a los fármacos, además del criterio del médico. Se considera que una persona experta en la materia sabrá determinar esas cantidades terapéuticamente eficaces mediante la experimentación de rutina (por ejemplo, un ensayo clínico de incremento de dosis).
El término "tratar" se usa para referirse a tratamientos profilácticos y/o tratamientos terapéuticos.
Los polipéptidos de aminoácidos codificados de manera no natural presentados en el presente documento pueden incluir compuestos etiquetados de manera tópica con uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o un número de masa diferentes de la masa atómica o el número de masa hallados en general en la naturaleza.
Todos los isómeros incluyendo pero no limitado a, diastereómeros, enantiómeros y mezclas de los mismos, se consideran parte de las composiciones descritas en el presente documento. En realizaciones adicionales, los polipéptidos de aminoácidos codificados de manera no natural se metabolizan después de la administración a un organismo que necesita producir un metabolito que luego se usa para producir un efecto deseado, que incluye un efecto terapéutico deseado. En realizaciones adicionales hay metabolitos activos de polipéptidos de aminoácidos codificados de manera no natural.
I. Descripción general
En la descripción se proporcionan moléculas de FGF-21 modificado que comprenden una deleción interna y, opcionalmente, comprenden al menos un aminoácido no natural. Se demostró que los ejemplos de realizaciones de polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden una deleción interna exhiben al menos una propiedad ventajosa, que incluye, pero no se limitan a, mayor estabilidad térmica, mejor solubilidad, menor desaminación, mejor facilidad de fabricación, mejor semivida in vivo de una forma biológicamente activa de longitud completa, a la vez que conservan un nivel de actividad biológica comparable con un polipéptido FGF-21 sin la deleción interna.
Se mitigó la desamidación y se mejoraron la vida útil y la pureza en los polipéptidos FGF-21 modificados que contenían una región eliminada y opcionalmente reemplazada por un péptido (véase la Figura 1). Se mostró que los ejemplos de secuencias modificadas mitigan un evento de desamidación que puede ocurrir durante el almacenamiento de la molécula. Además de mitigar la desamidación, esta modificación también aumentó la estabilidad térmica y/o la solubilidad de la proteína en solución y también minimizó las tendencias de agregación de proteínas en comparación con el FGF-21 de tipo silvestre o polipéptidos FGF-21 que carecen de esta deleción. La menor desamidación, mayor estabilidad térmica, mayor solubilidad y/o menor agregación indican características de formulación superiores, tales como una vida útil más prolongada y mayor pureza, además de la formulación a mayor concentración. Adicionalmente, mitigar la tendencia a la desamidación permite una mayor gama de opciones de formulación; de lo contrario, deberían seleccionarse condiciones de formulación para reducir la desamidación, lo que podría dar como resultado otras características de formulación no deseadas. Asimismo, es impredecible e inesperado que un polipéptido FGF-21 modificado que comprende una deleción interna de 5 a 19 aminoácidos contiguos y un péptido de reemplazo pueda conservar la función biológica de FGF-21 y tenga al menos una de las siguientes: desamidación disminuida, estabilidad térmica aumentada, solubilidad aumentada y agregación disminuida.
Otra modificación de ejemplo mitiga el truncamiento proteolítico in vivo de diez aminoácidos C-terminales de la proteína. Esta modificación prolonga la semivida en sangre de la molécula activa intacta, que da como resultado disminuciones en la dosis general, y dosis menos frecuentes. El ejemplo de modificación que mitiga el truncamiento proteolítico es la mutación puntual, G170E, aunque también pueden realizarse otras modificaciones.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto porque dicha secuencia de aminoácidos puede comprender: (I) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (tal como entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud de entre 0 y 12 aminoácidos; y (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener al menos un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131 o 146 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 77, 91, 108 o 131 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 108 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 72 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 77 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 86 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 87 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 91 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 110 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 126 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 131 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 146 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural es un derivado de fenilalanina. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede ser un derivado de fenilalanina para-sustituido, orto-sustituido 0 meta-sustituido. De acuerdo con la invención, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural es para-acetil-L-fenilalanina. De acuerdo con la invención, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural es para-acetil-L-fenilalanina incorporada en la posición correspondiente al aminoácido 108 en SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto porque dicha secuencia de aminoácidos puede comprender: (i) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (por ejemplo, entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud de entre 0 y 12 aminoácidos; (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido adicionales; (iii) un aminoácido codificado de manera no natural en la posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO:1, que puede comprender un derivado de fenilalanina para-sustituido, orto-sustituido o meta-sustituido, tal como para-acetil-L-fenilalanina.
En algunas realizaciones, dicho polipéptido FGF-21 modificado puede comprender una sustitución de ácido glutámico para glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede comprender o consistir en una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, dicho polipéptido FGF-21 modificado puede estar enlazado a un polímero, polímero soluble en agua o poli(etilenglicol), tal como un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia G, GG, SG, GSG, GGH o SGG. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia GSG.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 8 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 7 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 6 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 5 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 4 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 3 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 2 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener 1 sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos adicional. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una sustitución o deleción del aminoácido correspondiente al aminoácido G170 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una sustitución de ácido glutámico para glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede no contener sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene una deleción interna entre 4 y 19, entre 4 y 18, entre 4 y 17, entre 4 y 16, entre 4 y 15, entre 4 y 14, entre 4 y 13, entre 4 y 12, entre 4 y 11, entre 4 y 10, entre 4 y 9, entre 4 y 8, entre 4 y 7 o entre 4 y 6 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 4 y 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 4 y 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 4 y 10 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 4 y 8 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 4 y 6 aminoácidos.
En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 5 y 19, entre 5 y 18, entre 5 y 17, entre 5 y 16, entre 5 y 15, entre 5 y 14, entre 5 y 13, entre 5 y 12, entre 5 y 11, entre 5 y 10, entre 5 y 9, entre 5 y 8, entre 5 y 7 o entre 5 y 6 aminoácidos. En algunas realizaciones, la deleción interna puede ser entre 5 y 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, la deleción interna puede ser entre 5 y 12 aminoácidos.
En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 6 y 19, entre 6 y 18, entre 6 y 17, entre 6 y 16, entre 6 y 15, entre 6 y 14, entre 6 y 13, entre 6 y 12, entre 6 y 11, entre 6 y 10, entre 6 y 9, entre 6 y 8 o entre 6 y 7 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 6 y 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 6 y 12 aminoácidos.
En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 7 y 19, entre 7 y 18, entre 7 y 17, entre 7 y 16, entre 7 y 15, entre 7 y 14, entre 7 y 13, entre 7 y 12, entre 7 y 11, entre 7 y 10, entre 7 y 9 o entre 7 y 8 aminoácidos. En algunas realizaciones, la deleción interna puede ser entre 7 y 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 7 y 12 aminoácidos.
En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 8 y 19 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 8 y 14 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicha deleción interna puede ser entre 8 y 12 aminoácidos.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna de 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna de 13 aminoácidos.
En algunas realizaciones, la deleción interna descrita en el presente documento puede comprender la posición correspondiente al aminoácido 121 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna, en donde:
i) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 116 al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
ii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 117 al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 118 y al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iv) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 119 al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO: 1;
v) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 120 al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1; o
vi) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 121 al aminoácido 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna, en donde:
i) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 122 al aminoácido 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
ii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 123 al aminoácido 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 124 al aminoácido 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iv) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 125 al aminoácido 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
v) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 126 al aminoácido 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
vi) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 127 al aminoácido 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
vii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 128 al aminoácido 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
viii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 129 al aminoácido 133 o 134 de SEQ ID NO:1; o
ix) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 130 al aminoácido 134 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna, en donde:
i) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 116 al aminoácido 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1; ii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 117 al aminoácido 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 118 al aminoácido 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
iv) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 119 al aminoácido 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
v) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 120 al aminoácido 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
vi) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 121 al aminoácido 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
vii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 122 al aminoácido 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
viii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 123 al aminoácido 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
ix) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 124 al aminoácido 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
x) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 125 al aminoácido 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xi) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 126 al aminoácido 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 127 al aminoácido 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xiii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 128 al aminoácido 129, 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xiv) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 129 al aminoácido 130, 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xv) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 130 al aminoácido 131, 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xvi) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 131 al aminoácido 132, 133 o 134 de SEQ ID NO:1;
xvii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 132 al aminoácido 133 o 134 de SEQ ID NO:1; o
xviii) dicha deleción interna está dentro de o consiste en una región correspondiente al aminoácido 133 al aminoácido 134 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna, en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna, en donde dicha deleción interna comprende o consiste en una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto porque dicha secuencia de aminoácidos puede comprender: (i) una deleción interna de la región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud entre 0 y 12 aminoácidos; (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido adicionales; y (iii) un aminoácido codificado de manera no natural en la posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO:1, que puede comprender un derivado de fenilalanina para-sustituido, orto-sustituido o meta-sustituido, tal como para-acetil-L-fenilalanina. Dicho polipéptido FGF-21 modificado puede comprender una sustitución de ácido glutámico para glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1. Dicho polipéptido FGF-21 modificado puede estar enlazado a un polímero, polímero soluble en agua o poli(etilenglicol), tal como un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia G, GG, SG, GSG, GGH o SGG. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia GSG.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede comprender un polipéptido de reemplazo. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene una longitud de 2-8 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene una longitud de 2-5 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene una longitud de 3 aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo comprende restos de serina, histidina y/o glicina. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo comprende restos de serina y/o glicina. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia G, GG, SG, GSG, GGH o SGG. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia GSG.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede comprender una deleción interna dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1 y un péptido de reemplazo que tiene la secuencia GSG.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto porque dicha secuencia de aminoácidos puede comprender: (i) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (por ejemplo, entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene la secuencia G, GG, SG, GSG, GGH o SGG; (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido adicionales; (iii) un aminoácido codificado de manera no natural en la posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO:1, que puede comprender un derivado de fenilalanina para-sustituido, orto-sustituido o meta-sustituido, tal como para-acetil-L-fenilalanina. Dicho polipéptido FGF-21 modificado puede comprender una sustitución de ácido glutámico para glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1. Dicha deleción interna puede comprender o consistir en una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1. Dicho polipéptido FGF-21 modificado puede estar enlazado a un polímero, polímero soluble en agua o poli(etilenglicol), tal como un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia GSG.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener una deleción interna que comprende la región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1, un péptido de reemplazo que tiene la secuencia GSG, una sustitución de ácido glutámico por glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1 y, opcionalmente, un aminoácido codificado de manera no natural en la posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1 que puede comprender un derivado de fenilalanina para-sustituido, orto-sustituido o meta-sustituido, tal como para-acetil-L-fenilalanina.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede tener al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 95 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 97 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 98 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 99 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 202 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 202 sin la metionina N-terminal.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede tener al menos el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 95 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 97 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 98 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede tener al menos el 99 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 102 con o sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 102. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede comprender o consistir en el polipéptido de SEQ ID NO: 102 sin la metionina N-terminal.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender también un compañero de fusión. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un péptido de conexión que tiene una longitud de 0-50 aminoácidos entre dicha secuencia de aminoácidos y un compañero de fusión. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:74-100, 301 y 350-383. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede tener la secuencia de aminoácidos GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado también puede comprender un péptido de conexión que liga la secuencia de aminoácidos al compañero de fusión. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede tener una longitud entre 0 y 100, entre 2 y 80, entre 2 y 60, entre 2 y 50, entre 2 y 40, entre 2 y 30, entre 2 y 20, entre 2 y 10, entre 2 y 8, entre 2 y 6 o entre 2 y 4 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO:74-100, 301 y 350-383.
En algunas realizaciones, el péptido de conexión puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).
En algunas realizaciones, el compañero de fusión se selecciona de albúmina de suero, dominio Fc, región constante de inmunoglobulina, polipéptido no estructurado y adnectina o fragmentos de esta. En algunas realizaciones, el compañero de fusión comprende una región constante de inmunoglobulina o una región constante de inmunoglobulina modificada. En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender un polipéptido no estructurado, en donde el polipéptido no estructurado comprende un polipéptido XTEN o PAS. En algunas realizaciones, el polipéptido PAS puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 310-316 o una secuencia de aminoácidos al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a estas.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión comprende un dominio Fc o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el dominio Fc puede tener una secuencia de aminoácidos al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:302 y 323­ 335, o un fragmento de las mismas, tal como un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO:303-309. En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender un dominio Fc o un fragmento Fc que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 302 y 323-335. En algunas realizaciones, el dominio Fc puede tener una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:302 y 323-335, o un fragmento de estas. En algunas realizaciones, el dominio Fc puede tener una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a SEQ ID NO:302. En algunas realizaciones, el dominio Fc puede tener una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO:302. En algunas realizaciones, el dominio Fc puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:302.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido al menos el 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:475-487. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 90 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 95 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 96 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 97 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 98 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en un polipéptido al menos el 99 % idéntico a SEQ ID NO:475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende o consiste en el polipéptido de SEQ ID NO:475.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender una adnectina. En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender una adnectina de unión a albúmina o PKE. En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 320. En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido al menos el 90 % idéntico a SEQ ID NO: 320. En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido de SEQ ID NO:320. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido al menos el 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:401-423. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido al menos el 95 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:401-423. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:401-423.
En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a SEQ ID NO: 319. En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido al menos el 90 % idéntico a SEQ ID NO: 319. En algunas realizaciones, la adnectina PKE puede comprender el polipéptido de SEQ ID NO:319. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido al menos el 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO: 452-474. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido al menos el 95 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO: 452-474. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender o consistir en un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO: 452-474.
En algunas realizaciones, el compañero de fusión comprende albúmina de suero o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el compañero de fusión comprende albúmina de suero humana o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender un polipéptido al menos el 90 % idéntico a SEQ ID NO: 321 o 322. En algunas realizaciones, el compañero de fusión puede comprender el polipéptido de SEQ ID NO:321 o 322. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender un polipéptido al menos el 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID n O:424-432, 434-437, 440-443 y 446-451. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender un polipéptido al menos el 95 % idéntico a un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:424-432, 434-437, 440-443 y 446-451. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender un polipéptido seleccionado de: SEQ ID NO:424-432, 434-437, 440-443 y 446-451.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1-7, excepto porque dicha secuencia de aminoácidos puede comprender: (i) una deleción interna de entre 2 y 19 aminoácidos (tal como entre 5 y 19 aminoácidos), en donde dicha deleción interna está dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 116 a 134 de SEQ ID NO:1, en donde dicha deleción interna se reemplaza por un péptido de reemplazo que tiene una longitud de entre 0 y 12 aminoácidos; y (ii) 9 o menos sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos adicionales; en donde el polipéptido FGF-21 modificado también comprende un compañero de fusión. Dicho compañero de fusión puede comprender un dominio Fc o un fragmento del mismo. Dicho polipéptido FGF-21 modificado puede comprender una sustitución de ácido glutámico para glicina en la posición correspondiente al aminoácido 170 de SEQ ID NO: 1. Dicha deleción interna puede comprender o consistir en una región correspondiente a los aminoácidos 119-130 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia G, GG, SG, GSG, GGH o SGG. En algunas realizaciones, dicho péptido de reemplazo tiene la secuencia GSG. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende un péptido de conexión entre la secuencia de aminoácidos y el compañero de fusión, en donde el péptido de conexión comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener un aminoácido codificado de manera no natural que puede estar enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa, péptido, polipéptido o porción de prolongación de semivida. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener un aminoácido codificado de manera no natural que puede estar enlazado a una porción de prolongación de semivida. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida se selecciona de poli(etilenglicol) (PEG), monometoxi PEG (mPEG), un polipéptido no estructurado, una adnectina, albúmina de suero, albúmina de suero humana, un dominio Fc, una región constante de inmunoglobulina, un fragmento de cualquiera de los anteriores, un lípido, un grupo acilo ramificado o no ramificado, un grupo acilo C8-C30 ramificado o no ramificado, un grupo alquilo ramificado o no ramificado y un grupo alquilo C8-C30 ramificado o no ramificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que puede contener un aminoácido codificado de manera no natural que puede estar enlazado a un polipéptido no estructurado seleccionado de un polipéptido XTEN o PAS. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende un polímero de poli(etilenglicol) (PEG) o monometoxi PEG (mPEG). En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende un poli(etilenglicol) (PEG) ramificado o de múltiples ramificaciones, u otro polímero soluble en agua ramificado o de múltiples ramificaciones. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende una porción poli(etilenglicol) (PEG) o monometoxi PEG (mPEG) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 0,1 kDa a aproximadamente 100 kDa. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende una porción poli(etilenglicol) o monometoxi PEG (mPEG) que tiene un peso molecular promedio:
i) entre aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa;
ii) entre aproximadamente 1 kDa y 50 kDa;
iii) entre aproximadamente 10 kDa y 40 kDa;
iv) entre aproximadamente 20 kDa y 30 kDa;
v) entre aproximadamente 0,050 kDa y aproximadamente 100 kDa; o
vi) de aproximadamente 100 kDa, 95 kDa, 90 kDa, 85 kDa, 80 kDa, 75 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da o 100 Da.
En algunas realizaciones de la invención, dicha porción de prolongación de semivida comprende un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa. En algunas realizaciones, dicha porción de prolongación de semivida comprende un oligosacárido o polímero soluble en agua que no es poli(etilenglicol).
En algunas realizaciones, dicho aminoácido codificado de manera no natural descrito en el presente documento puede comprender un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural comprende una porción carbonilo y está enlazada a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida que comprende una porción aminooxi, una hidrazina, una hidrazida o una semicarbazida. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural comprende una porción aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida que está enlazada a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de amida. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural comprende una porción alquino que está enlazada a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de una porción azida. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural comprende una porción azida que está enlazada a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida que comprende una porción alquino. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural comprende una porción azida o alquino que está enlazada a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de amida. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de oxima. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de oxima, en donde dicho enlace de oxima tiene una estructura que resulta de la reacción de un grupo carbonilo y un grupo aminooxi. En algunas realizaciones, dicho al menos un aminoácido codificado de manera no natural está enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de oxima, en donde dicho enlace de oxima tiene una estructura que resulta de la reacción de un grupo carbonilo contenido en dicho aminoácido codificado de manera no natural y un grupo aminooxi contenido en dicho enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento tiene al menos una actividad biológica del polipéptido FGF-21 humano de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento tiene al menos uno de estabilidad térmica aumentada, agregación reducida, proteólisis in vivo disminuida, desamidación disminuida y solubilidad aumentada en comparación con un polipéptido FGF-21 sin dicha deleción interna o un polipéptido FGF-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 201, o en comparación con el mismo polipéptido FGF-21 modificado sin dicha deleción interna y péptido de reemplazo. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento tiene al menos uno de estabilidad térmica aumentada, agregación reducida, proteólisis in vivo disminuida, desamidación disminuida y solubilidad aumentada, en comparación con un polipéptido FGF-21 pegilado sin dicha deleción interna, un polipéptido FGF-21 no pegilado sin dicha deleción interna, un polipéptido FGF-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1, un polipéptido FGF-21 no pegilado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 201, pegilado SEQ ID NO: 201, o en comparación con el mismo polipéptido FGF-21 modificado sin dicha deleción interna y péptido de reemplazo.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con un polipéptido FGF-21 pegilado sin la deleción interna. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con un polipéptido FGF-21 no pegilado sin la deleción interna. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con un polipéptido FGF-21 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con SEQ ID NO: 201. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con una SEQ ID NO: 201 pegilada. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede compararse con el mismo polipéptido FGF-21 modificado sin la deleción interna y el péptido de reemplazo.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento exhibe un aumento en el punto medio de la transición (temperatura de fusión, Tm) de entre 2 °C y 12 °C, entre 2 °C y 10 °C, entre 2 °C y 8 °C, entre 4 °C y 8 °C, entre 4 °C y 10 °C, entre 4 °C y 12 °C o entre 6 °C y 8 °C en comparación con un polipéptido FGF-21 no modificado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 201 o un polipéptido FGF-21 sin dicha deleción interna.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100% de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211,212, 219, 220, 221,222, o 223. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos y 95 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211, 212, 219, 220, 221, 222, o 223. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211, 212, 219, 220, 221, 222, o 223. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 98 % de identidad con el polipéptido de SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202, en donde pAF en SEQ ID NO:202 puede estar enlazado a un poli(etilenglicol). En algunas realizaciones, el poli(etilenglicol) puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una metionina N-terminal (que puede estar presente después de la expresión en algunos sistemas, tales como E. coli). En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que no tiene una metionina N-terminal, por ejemplo, como resultado de procesamiento para suprimir un péptido de señal que contiene una metionina N-terminal, por ejemplo, en un sistema de expresión celular de mamífero. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede incluir cualquiera de las secuencias o variantes del mismo descritas en el presente documento, pero omitiendo una metionina N-terminal, por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO:101-132, 201-202, 205-206, 210-212, 219-223 o cualquiera de las formas variantes, modificadas o de fusión de estas descritas en el presente documento, en donde la metionina N-terminal se omite o está ausente. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede incluir cualquiera de las secuencias o variantes de este descritas en el presente documento, por ejemplo, una cualquiera de SEQ ID NO:401-487 o una cualquiera de las formas variantes, modificadas o de fusión descritas en el presente documento, en donde una metionina N-terminal se añade o está presente. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 (opcionalmente sin la metionina N-terminal), en donde pAF en SEQ ID NO:202 está enlazado a un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 sin la metionina N-terminal. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 sin la metionina N-terminal y un dominio Fc o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 y un dominio Fc o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender SEQ ID NO:475.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido FGF21 modificado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido FGF21 modificado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido FGF21 modificado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero, tal como CHO o HEK. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una bacteria, tal como E. coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para producir un polipéptido FGF-21 modificado, que comprende cultivar la célula hospedadora descrita en el presente documento y aislar el polipéptido FGF-21 modificado. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para producir un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural se codifica mediante un codón selector. En algunas realizaciones, el método comprende cultivar una célula hospedadora descrita en el presente documento, en donde la célula hospedadora comprende un ARNt ortogonal que reconoce al codón selector e introduce el aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido FGF-21 modificado, y aislar el polipéptido FGF-21 modificado.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende el polipéptido FGF21 modificado descrito en el presente documento y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones la descripción proporciona una composición que comprende un polipéptido FGF21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202, en donde pAF en SEQ ID NO:202 puede estar enlazado a un poli(etilenglicol), y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 102 sin la metionina N-terminal, fusionado a un dominio Fc o un fragmento de este, y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado que comprende SEQ ID NO:475 y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una composición que comprende el polipéptido FGF21 modificado descrito en el presente documento y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables y al menos un principio activo diferente. En algunas realizaciones, el al menos un principio activo diferente es un agente antidiabético, un agente controlador del colesterol, un agente antiinflamatorio, un agente contra la obesidad, un agente antihipertensor o un agente antifibrótico. En algunas realizaciones, al menos un principio activo diferente es un agonista de GLP-1 o una insulina. En algunas realizaciones, al menos un principio activo diferente es insulina de rápida acción, de corta reacción, de acción regular, de acción intermedia o de acción prolongada, Humalog, Lispro, Novolog, Apidra, Humulin, Aspart, insulina humana, NPH, Lente, Ultralente, Lantus, Glargine, Levemir, Detemirm; exenatida (Byetta/Bydureon), liraglutida (Victoza), lixisenatida (Lyxumia), albiglutida (Tanzeum), exenatida de acción prolongada (LAR), taspoglutida, albiglutida, LY2189265 (Dulaglutide); orlistat (Xenical), inhibidor de la lipasa pancreática, naltrexona, fentermina, topiramato (Qsymia), lorcaserina (Belviq), naltrexona y bupropion (Contravene), rimonabant (Acomplia), antagonista del receptor de cannabinoide, sibutramina (Meridia), lorcaserina, rimonabant, pramlintida, fentermina, topiramato, bupropion o glucomanano.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para regular al menos uno de homeostasis de glucosa y lípidos, absorción de glucosa, expresión de GLUT 1 y/o concentraciones en suero de glucosa, triglicéridos, insulina o glucagón en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones la divulgación proporciona un método para aumentar la sensibilidad a la insulina, aumentar los niveles de adiponectina, reducir los niveles de glucosa en sangre, reducir los niveles de glucagón, reducir los niveles de triglicéridos, reducir los niveles de fructosamina, reducir los niveles de colesterol de baja densidad o reducir los niveles de proteína reactiva C en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones la divulgación proporciona un método para tratar una afección o un trastorno seleccionado de obesidad, diabetes, pancreatitis, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperglucemia, síndrome metabólico, tolerancia a la glucosa deteriorada, depuración inadecuada de glucosa, alto nivel de glucosa en sangre y síndrome de Prader-Willi en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar una afección o un trastorno relacionados con la insulina seleccionados de resistencia a la insulina tipo A, resistencia a la insulina tipo C (también conocido como síndrome HAIR-AN), síndrome de Rabson-Mendenhall, síndrome de Donohue o leprechaunismo, hiperandrogenismo, hirsutismo o acantosis pigmentaria en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2 en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento. En algunas realizaciones la divulgación proporciona un método para tratar la obesidad en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o de una composición desvelada en el presente documento.
En otra realización de la divulgación, la presente divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado o de una composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede afectar un órgano o tejido, tal como el páncreas, pulmón, corazón, riñón, hígado, ojos, sistema nervioso, médula ósea, ganglios linfáticos, endomiocardio y/o retroperitoneo. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede ser fibrosis hepática o precirrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de: esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis, enfermedad pulmonar parenquimatosa difusa, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, fibrosis masiva progresiva, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis por inyección, fibrosis renal, enfermedad renal crónica, enfermedad renal diabética, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA, mielofibrosis, insuficiencia cardíaca, insuficiencia cardíaca metabólica, fibrosis cardíaca, fibrosis con cataratas, cataratas, cicatrización ocular, fibrosis pancreática, fibrosis dérmica, fibrosis intestinal, estenosis intestinal, fibrosis endomiocárdica, fibrosis auricular, fibrosis mediastínica, enfermedad de Crohn, fibrosis retroperitoneal, queloide, fibrosis sistémica nefrogénica, escleroderma, esclerosis sistémica, artrofibrosis, síndrome de Peyronie, contractura de Dupuytren, neuropatía diabética, capsulitis adhesiva, enfermedad hepática alcohólica, hepatoesteatosis, hepatitis vírica, enfermedad biliar, hemocromatosis primaria, cirrosis relacionada con los fármacos, cirrosis criptógena, enfermedad de Wilson, y deficiencia de alfa 1 -antitripsina, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), enfermedad pulmonar fibrótica humana, fibrosis hepática, degeneración macular, retinopatía retinal, retinopatía vitrea, fibrosis miocárdica, oftalmopatía de Grave, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, ateroesclerosis/reestenosis, cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática y enfermedad intestinal inflamatoria (que incluye, pero no se limita a, colitis colagenosa). En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis resulta de uno o más de enfermedad pulmonar, cáncer de pulmón, farmacoterapia, quimioterapia o radioterapia. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis resulta de uno o más de envejecimiento, ataque cardíaco, apoplejía, lesión miocárdica o disfunción del ventrículo izquierdo. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de fibrosis renal, nefritis glomerular, enfermedad renal crónica, falla renal crónica y nefritis asociada a lupus sistémico, cáncer, obstrucciones físicas, toxinas, enfermedades metabólicas, enfermedades inmunológicas o nefropatía diabética. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis resulta de uno o más de traumatismo, lesión medular, infección, cirugía, lesión isquémica, infarto de miocardio, quemaduras, exposición a contaminación ambiental, neumonía, tuberculosis o síndrome de dificultad respiratoria aguda. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar fibrótica humana, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis hepática, fibrosis cardíaca, fibrosis miocárdica, degeneración macular, retinopatía retinal, retinopatía vítrea, oftalmopatía de Grave, ergotismo inducido por fármacos, enfermedad cardiovascular, ateroesclerosis/reestenosis, queloides y cicatrices hipertróficas, mielofibrosis primaria o idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, colitis colagenosa, cicatrización ocular y fibrosis con cataratas. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de EHNA, fibrosis hepática y cirrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede ser EHNA. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de nefropatía diabética, enfermedad renal crónica y fibrosis renal. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede seleccionarse de insuficiencia cardíaca metabólica y fibrosis cardíaca. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a la fibrosis puede ser fibrosis pulmonar.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar la fibrosis hepática o cirrosis en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para disminuir la fracción de grasa hepática en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento, en donde, opcionalmente, el paciente está en riesgo de desarrollar EHNA o se le diagnosticó esta enfermedad. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para disminuir la rigidez hepática, disminuir el porcentaje de grasa corporal, disminuir el peso corporal, disminuir la relación del peso del hígado con respecto al peso corporal, disminuir el contenido lipídico hepático, disminuir el área de fibrosis hepática, disminuir los niveles de glucosa en sangre en ayunas, triglicéridos en ayunas, disminuir el colesterol LDL, disminuir ApoB, disminuir ApoC y/o aumentar el colesterol HDL en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento, en donde, opcionalmente, el paciente está en riesgo de desarrollar EHNA o se le diagnosticó esta enfermedad. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para aumentar los niveles de adiponectina en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento, en donde, opcionalmente, el paciente está en riesgo de desarrollar EHNA o se le diagnosticó esta enfermedad. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar uno o más síntomas asociados a EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento.
En el presente documento se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 202. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 202. En el presente documento, también se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende SEQ ID NO: 202, en donde el resto de pAF de este está enlazado a una porción poli(etilenglicol). En algunas realizaciones, dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0,1 kDa y 100 kDa, o de entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 40kDa, o de aproximadamente 30kDa. En algunas realizaciones, dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa.
En el presente documento se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:102. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 102. En el presente documento, también se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende (a) SEQ ID NO:102 sin la Met N-terminal, o (b) SEQ ID NO:102.
En el presente documento, se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 475. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95 % idéntica a SEQ ID NO: 475. En el presente documento se desvelan métodos para tratar o prevenir EHNA en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende SeQ ID n O: 475.
En algunas realizaciones de la invención, el paciente presenta fibrosis por EHNA CRN de fase 1-3, que, opcionalmente, es EHNA CRN de fase 1-3 que se determina mediante una biopsia hepática. En algunas realizaciones de la invención, antes del tratamiento, el paciente puede presentar un índice de hígado graso de al menos de aproximadamente 60. En algunas realizaciones de la invención, antes del tratamiento, el paciente puede presentar un porcentaje de fracción de grasa hepática de al menos el 10 %, que, opcionalmente, se determina mediante imagen por resonancia magnética.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar la insuficiencia cardíaca o la fibrosis cardíaca en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar la fibrosis renal o de riñón en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar la fibrosis pulmonar en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento o de una composición descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis en un paciente que lo necesita, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende uno o más aminoácidos codificados de manera no natural, en donde el polipéptido FGF-21 modificado posee al menos el 90 % o el 95 % de identidad con un polipéptido FGF-21 humano que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1-7 y 201, en donde la enfermedad asociada a la fibrosis se selecciona de EHNA, fibrosis hepática, enfermedad renal diabética, enfermedad renal crónica, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis cardíaca, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca metabólica.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado posee al menos el 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con un polipéptido FGF-21 humano que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:1-7 y 201.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención los polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden el polipéptido de SEQ ID NO:201 son para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis seleccionada de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis hepática y cirrosis en un paciente, en donde el resto de para-acetilfenilalanina del mismo está enlazado a poli(etilenglicol), que opcionalmente tiene un peso molecular de entre 1 y 100 kDa o aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131 o 146 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 108 en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural está en una posición correspondiente al aminoácido 77, 91 o 131 en SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural puede comprender un análogo o derivado de fenilalanina. De acuerdo con la invención, el aminoácido codificado de manera no natural es para-acetil-L-fenilalanina. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural puede comprender para-acetil-L-fenilalanina y puede estar en la posición correspondiente al aminoácido 108 en SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar enlazado a una porción poli(etilenglicol) (PEG) o monometoxi PEG (mPEG) que tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En algunas realizaciones, al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar enlazado a una porción poli(etilenglicol) o monometoxi PEG (mPEG) que tiene un peso molecular promedio: i) entre aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa; ii) entre aproximadamente 1 kDa y 50 kDa; iii) entre aproximadamente 10 kDa y 40 kDa; iv) entre aproximadamente 20 kDa y 30 kDa; v) entre aproximadamente 0,050 kDa y aproximadamente 100 kDa; o vi) de aproximadamente 100 kDa, 95 kDa, 90 kDa, 85 kDa, 80 kDa, 75 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da o 100 Da. En algunas realizaciones, al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar enlazado a un poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar enlazado a un enlazador, polímero, molécula biológicamente activa o porción de prolongación de semivida a través de un enlace de oxima. En algunas realizaciones, el enlace de oxima tiene una estructura que resulta de la reacción de un grupo carbonilo y un grupo aminooxi.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede poseer al menos una actividad biológica del polipéptido FGF21 humano de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o de otro polipéptido FGF-21.
En algunas realizaciones, el método puede comprender también la administración al paciente de al menos un principio activo diferente, en donde dicho principio activo adicional puede estar contenido en la misma composición que el polipéptido FGF-21 modificado o puede administrarse por separado. En algunas realizaciones, el al menos un principio activo diferente puede seleccionarse de agentes antifibróticos, antagonista de N-cadherina, anticuerpo de anti-N cadherina, antagonista de N-cadherina de moléculas pequeñas, fragmento antagonístico de N-cadherina, agentes antiinflamatorios, agentes hepatoprotectores que suprimen el sistema renina-angiotensina (RAS), probióticos y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). En algunas realizaciones, el agente antifibrótico puede seleccionarse de nintedanib, Pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas del receptor de LPA1, análogo de GLP1, tralokinumab (IL-13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de hedgehog, Roche), PRM-151 (pentraxin-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab biespecífico IL-4&IL-13, Sanofi), simtuzumab (anticuerpo de tipo anti-lisil oxidasa 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inh./pentoxifilina/NAC oral de liberación control., Pacific Ther.), omipalisib (oral PI3K/mTOR inhibidor, GSK), IW-001 (mod. de solución oral de colágeno de tipo V bovino, ImmuneWorks), STX-100 (integrin alfa V/ beta-6 ant, Stromedix/ Biogen), Actimmune (IFN gamma), PC-SOD (midismase; inhalado, LTT Bio-Pharma/CKD Pharm), lebrikizumab (mAb anti-IL-13 SC humanizado, Roche), AQX-1125 (activador de SHIP1, Aquinox), CC-539 (inhibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen) y SAR-100842 (Sanofi). En algunas realizaciones, el agente hepatoprotector puede ser ácido ursodeoxicólico (UDCA) o ácido obeticólico (OCA o INT-747, Intercept).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un polipéptido FGF21 modificado adaptado para su uso en el método para tratar una enfermedad asociada a la fibrosis como se describe en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición puede comprender también al menos un principio activo diferente. En algunas realizaciones, al menos un principio activo diferente puede seleccionarse de agentes antifibróticos, Pirfenidona, antagonista de N-cadherina, anticuerpo de anti-N cadherina, antagonista de N-cadherina de moléculas pequeñas, fragmento antagonístico de N-cadherina, agentes antiinflamatorios, agentes hepatoprotectores, tales como ácido ursodeoxicólico (UDCA), ácido obeticólico (OCA o INT-747, Intercept), que suprimen el sistema renina-angiotensina (RAS), probióticos y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA).
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para tratar la obesidad clínicamente complicada, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido FGF-21 modificado como se describe en el presente documento o de una composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la obesidad clínicamente complicada puede estar asociada al síndrome de Prader-Willi.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento o la composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables pueden administrarse por vía oral, tópica o mediante inyección. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición pueden administrarse mediante inyección subcutánea, inyección IV, inyección intraperitoneal, inyección intramuscular.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición que se desvelan en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez por día, o con una frecuencia menor que aproximadamente una vez por día. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente dos veces por semana, o con una frecuencia menor que aproximadamente dos veces por semana. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez por semana, o con una frecuencia menor que aproximadamente dos veces por semana. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez cada dos semanas, o con una frecuencia menor que aproximadamente dos veces por semana. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez cada tres semanas, o con una frecuencia menor que aproximadamente dos veces por semana. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez por mes, o con una frecuencia menor que aproximadamente una vez por mes. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de una vez cada cuatro semanas. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez por día. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición desvelados en el presente documento se administran con una frecuencia de aproximadamente una vez por semana.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento puede administrarse en una cantidad entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 500 mg por dosis, entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 200 mg por dosis, entre aproximadamente 0,2 mg y aproximadamente 100 mg por dosis, entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 80 mg por dosis, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 60 mg por dosis, entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 40 mg por dosis, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 30 mg por dosis, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 20 mg por dosis, entre aproximadamente 0,2 mg y aproximadamente 1 mg por dosis, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg por dosis, entre aproximadamente 2 mg y aproximadamente 4 mg por dosis, entre aproximadamente 4 mg y aproximadamente 6 mg por dosis, entre aproximadamente 6 mg y aproximadamente 10 mg por dosis, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 20 mg por dosis, entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 40 mg por dosis, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 60 mg por dosis, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 80 mg por dosis, entre aproximadamente 80 mg y aproximadamente 100 mg por dosis, entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 120 mg por dosis, entre aproximadamente 120 mg y aproximadamente 140 mg por dosis, entre aproximadamente 140 mg y aproximadamente 160 mg por dosis, entre aproximadamente 160 mg y aproximadamente 180 mg por dosis, entre aproximadamente 180 mg y aproximadamente 200 mg por dosis, o entre aproximadamente 200 mg y aproximadamente 240 mg por dosis.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento puede administrarse en una cantidad seleccionada de aproximadamente 0,2 mg, aproximadamente 0,6 mg, aproximadamente 1 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 4 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 8 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 120 mg, aproximadamente 140 mg, aproximadamente 160 mg, aproximadamente 180 mg y aproximadamente 200 mg por dosis. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento puede administrarse en una cantidad seleccionada de aproximadamente 0,2 mg, aproximadamente 0,6 mg, aproximadamente 2 mg, aproximadamente 6 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 40 mg y aproximadamente 60 mg por dosis.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado o la composición que comprende un polipéptido FGF-21 modificado desvelado en el presente documento y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden coadministrarse o administrarse de manera separada (simultánea o secuencial) con al menos un principio activo diferente. En algunas realizaciones, al menos un principio activo diferente se selecciona de agentes antidiabéticos, agentes contra la obesidad, agentes controladores del colesterol, agentes antiinflamatorios y agentes antihipertensores.
En algunas realizaciones, el al menos un principio activo diferente se selecciona de una estatina, un agonista de GLP-1 e insulina. En algunas realizaciones, el al menos un principio activo diferente se selecciona de amilina, análogo de amilina, inhibidor de alfa-glucosidasa, tal como miglitol, acarbosa, voglibosa, metformina, biguanida, glitazona, tal como rosiglitazona, pioglitazona, troglitazona, un secretagogo, tal como exenatida, liraglutida, taspoglutida o lixisenatida, glucosúrico, un inhibidor de dipeptidil peptidasa-4, insulina, insulina de rápida acción, de corta acción, de acción regular, de acción intermedia o de acción prolongada, Humalog, Lispro, Novolog, Apidra, Humulin, Aspart, insulina humana, NPH, Lente, Ultralente, Lantus, Glargine, Levemir, Detemir, Atorvastatina, Cerivastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Mevastatina, Pitavastatina, Pravastatina, Rosuvastatina, Simvastatina Vytorin, Advicor, Besylate Caduet, Simcor, orlistat (Xenical), inhibidor de lipasa pancreática, naltrexona, fentermina y topiramato (Qsymia), lorcaserina (Belviq), naltrexona, bupropion (Contravene), rimonabant (Acomplia), antagonista del receptor cannabinoide, sibutramina (Meridia), lorcaserina, rimonabant, exenatida, pramlintida, fentermina, topiramato, un estabilizante del estado de ánimo, bupropion, glucomanano, goma guar, Dexedrina, digoxina, fármaco anorexígeno, fármaco contra la obesidad, exenatida (Byetta/Bydureon), liraglutida (Victoza), lixisenatida (Lyxumia), albiglutida (Tanzeum), exenatida de acción prolongada (LAR), taspoglutida, albiglutida y LY2189265 (Dulaglutida).
De manera ventajosa, los compuestos de FGF-21 modificados que se describen en el presente documento pueden aumentar la efectividad, lo que permite una semivida en circulación más prolongada que requiere menos dosis, aumentar la conveniencia de un sujeto que necesita dicho tratamiento y la probabilidad del cumplimiento del paciente con los requisitos de dosificación.
Por lo general, el síndrome metabólico se diagnostica en paciente que presentan al menos tres de los siguientes signos: grasa abdominal - en la mayoría de los hombres, una cintura de 101,6 cm (40 pulgadas) o más; niveles altos de azúcar en sangre —al menos 110 miligramos por decilitro (mg/dl) después del ayuno; niveles altos de triglicéridos - al menos 150 mg/dl en el torrente sanguíneo; HDL bajo —menos de 40 mg/dl; y presión sanguínea de 130/85 o más.
Los métodos presentes pueden ser eficaces para tratar o retrasar el inicio de la diabetes tipo II y/o de la obesidad en un paciente que los necesita. El paciente puede haber sido diagnosticado con prediabetes o puede presentar uno o más factores de riesgo de desarrollar diabetes tipo II, tales como antecedentes familiares de diabetes tipo II; uno o más padres o hermanos diagnosticados previamente con diabetes tipo II; dislipidemia; niveles totales de triglicéridos en sangre de al menos 200 mg/dl; niveles de lipoproteína de alta densidad en sangre menor de 35 mg/dl; obesidad; índice de masa corporal mayor de 25 kg/m2; antecedentes de diabetes gestacional; previamente dio a luz a un niño con un peso de nacimiento mayor de 4,08 kg (9 lb).; hipertensión; presión sanguínea sistólica de al menos 140 mmHg; presión sanguínea diastólica de al menos 90 mmHg; medición previa de glucosa en sangre en ayunas de la menos 99 mg/dl; enfermedad vascular; síndrome del ovario poliquístico; o acantosis pigmentaria.
El paciente puede presentar uno o más síntomas de prediabetes, tales como nivel de glucosa en sangre en ayunas de entre 100 mg/dl y 125 mg/dl; nivel de azúcar en sangre de entre 140 mg/dl y 199 mg/dl dos horas después de ingerir 75 gramos de solución de glucosa o una solución de glucosa de 1,75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal, a una dosis máxima de 75 gramos; y/o hemoglobina glicada de entre el 5,7 % y el 6,4 %.
El paciente puede presentar uno o más síntomas de diabetes, tales como nivel de glucosa en sangre en ayunas mayor de 125 mg/dl; nivel de azúcar en sangre de al menos 200 mg/dl dos horas después de ingerir 75 gramos de solución de glucosa o una solución de glucosa de 1,75 gramos de glucosa por kilogramo de peso corporal, a una dosis máxima de 75 gramos; y/o hemoglobina glicada de al menos el 6,5 %.
El paciente puede haber sido diagnosticado con diabetes tipo II.
El paciente puede no responder al tratamiento con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: GLP-1, exenatida-l, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, liraglutida, lixisenatida, albiglutida, exenatida LAR, un inhibidor de DPP-4, un agonista del receptor GLP-1 y otro agonista de GLP-1; o dicho compuesto puede estar contraindicado para la administración al paciente.
Los métodos también pueden comprender administrar a dicho paciente un agente antidiabético o un agente contra la obesidad además del polipéptido FGF-21 modificado. Dicho agente antidiabético o agente contra la obesidad pueden comprender uno o más de amilina, agonista de amilina, sulfonilureas, calcitonina, glucagón, agonistas PPAR-gamma, agonistas del receptor GPL-1, inhibidor de la dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidor de la alfa-glucosidasa, secuestradores de ácidos biliares antidislipidémicos, exendina, análogo de exendina, agonista de exendina, péptido inhibidor gástrico (GIP), péptido incretina, insulina, inhibidor de SGLT2, un inhibidor de la reabsorción de glucosa, fenofibrato, fibrato, un anticuerpo antigrelina o un fragmento de anticuerpo antigrelina, un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR)-1(IIIb), FGFR-1(IIIc), un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo y/o FGFR-4(IIIc), un anticuerpo anti-CD38 o un fragmento de anticuerpo anti-CD38, un anticuerpo anti-MIC-1 o un fragmento de unión a MIC-1, metformina o una combinación de cualquiera de los anteriores.
En una realización de ejemplo de la divulgación, dicho agente contra la diabetes puede ser metformina, insulina glargina, tal como Lantus (Sanofi), sitagliptina, tal como Januvia, insulina aspart, tal como NovoLog y NovoRapid (Novo Nordisk), insulina lispro, tal como Humalog (Eli Lilly), liraglutida, tal como Victoza (Novo Nordisk), insulina detemir, tal como Levemir (Novo Nordisk), sitagliptina en combinación con metformina, tal como Janumet (Merck), insulina aspart soluble e insulina aspart cristalizada con protamina en la relación 30/70, tal como Novo Mix 30 (Novo Nordisk), o pioglitazona, tal como Actos (Takeda).
El método puede ser eficaz para producir pérdida de peso.
Los agentes antidiabéticos que se usan en combinación con los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, secretagogos de insulina o sensibilizadores de insulina, inhibidores de MGAT2 u otros agentes antidiabéticos. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DP4) (por ejemplo, sitagliptina, saxagliptina, alogliptina, vildagliptina y similares), biguanidas (por ejemplo, metformina, fenformina y similares), sulfonilureas (por ejemplo, gliburida, glimepirida, glipizida y similares), inhibidores de glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol y similares), agonistas de PPARy, tales como tiazolidindionas (por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona y similares), agonistas duales de PPAR a/Y (por ejemplo, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar y similares), activadores de glucoquinasa (como se describen en Fyfe, M.C.T. et al., Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)), moduladores del receptor de GPR40, moduladores del receptor de GPR119 (MBX-2952, PSN821, APD597 y similares), inhibidores de SGLT2 (dapagliflozina, canagliflozina, remagliflozina y similares), análogos de amilina, tales como pramlintida y/o insulina. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente invención también pueden emplearse opcionalmente en combinación con agentes para el tratamiento de complicaciones de la diabetes. Estos agentes incluyen inhibidores de PKC y/o inhibidores de AGE.
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente invención también pueden emplearse opcionalmente en combinación con uno o más agentes hipofágicos, tales como dietilpropiona, fendimetrazina, fentermina, orlistat, sibutramina, lorcaserina, pramlintida, topiramato, antagonistas del receptor de MCHR1, oxintomodulina, naltrexona, péptido amilina, moduladores del receptor de NPY Y5, moduladores del receptor de NPY Y2, moduladores del receptor de NPY Y4, cetilistat, moduladores del receptor de 5HT2c y similares. Los polipéptidos FGF-21 modificados también puede emplearse en combinación con un agonista del receptor de péptido 1 tipo glucagón (GLP-1 R), tal como exenatida, liraglutida, amida GPR-1(1-36), amida GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) (como se desvela en la Patente de EE.UU. N.° 5.614.492 de Habener), que puede administrarse mediante inyección, por vía intranasal o mediante dispositivos transdérmicos o bucales.
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente invención también pueden emplearse opcionalmente en combinación con uno o más de otros tipos de agentes terapéuticos, tales como inhibidores de DGAT, fármacos reductores de LDL, tales como estatinas (inhibidores de HMG CoA reductasa) o inhibidores de la absorción del colesterol, moduladores de PCSK9 y fármacos que aumentan HDL, tales como inhibidores de CETP.
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural puede estar enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, el polímero soluble en agua comprende un porción poli(etilenglicol). En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural está enlazado al polímero soluble en agua con un enlazador o está unido al polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, la molécula de poli(etilenglicol) es un polímero bifuncional. En algunas realizaciones, el polímero bifuncional está enlazado a un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos dos aminoácidos codificados de manera no natural unidos a un polímero soluble en agua que comprende una porción poli(etilenglicol). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos codificados de manera no natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en FGF-21 modificado: antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos codificados de manera no natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en FGF-21 modificado: 10, 52, 117, 126, 131, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108 y 110 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos codificados de manera no natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en FGF-21 modificado: 10, 52, 77, 117, 126, 131, 162 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos codificados de manera no natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en FGF-21 modificado: 87, 77, 83, 72 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2­ 7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos codificados de manera no natural se incorporan en una o más de las siguientes posiciones en FGF-21 modificado: 69, 79, 91, 96, 108 y 110 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos no naturales se incorporan en la secuencia líder o de señales de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7 u otra secuencia de FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, las secuencias líder se pueden elegir de SEQ ID NO: 39, 40, 41,42, 43 o 44. En algunas realizaciones, los construcciones de secreción de FGF-21 modificado se clonan en pVK7ara (Nde/Eco) con una secuencia líder elegida de SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43 o 44.
En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más de estas posiciones está enlazado a un polímero soluble en agua, que incluye, pero no se limitan a, las siguientes posiciones: antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal), 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más posiciones desde antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) hasta el C-terminal en SEQ ID NO: 34-36 está enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más de estas posiciones está enlazado a un polímero soluble en agua, que incluye, pero no se limitan a, las siguientes posiciones: 10, 52, 117, 126, 131, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108 y 110 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más de estas posiciones está enlazado a un polímero soluble en agua, que incluye, pero no se limitan a, las siguientes posiciones: 10, 52, 77, 117, 126, 131, 162 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más de estas posiciones está enlazado a un polímero soluble en agua: 87, 77, 83, 72 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, el aminoácido no natural en una o más de estas posiciones está enlazado a un polímero soluble en agua: 69, 79, 91, 96, 108 y 110 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos naturales en la secuencia líder o de señales de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43, 44 u otra secuencia de FGF-21 modificado están unidos a un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos naturales en la secuencia líder o de señales de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7 u otra secuencia de FGF-21 modificado están unidos a un polímero soluble en agua.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, adición o deleción que modula la afinidad del polipéptido FGF-21 modificado a un receptor del polipéptido FGF-21 o a un componente de unión al polipéptido FGF-21, incluyendo pero no limitado a, una proteína, un polipéptido, una molécula pequeña o un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, adición o deleción que aumenta la estabilidad del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la estabilidad del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, adición o deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que disminuye la inmunogenicidad del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la inmunogenicidad del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la semivida en suero o el tiempo de circulación del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la semivida en suero o el tiempo de circulación del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que disminuye la desamidación del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la desamidación del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la solubilidad acuosa del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la solubilidad acuosa del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la solubilidad del polipéptido FGF-21 modificado producido en una célula hospedadora cuando se compara con la solubilidad del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la expresión del polipéptido FGF-21 modificado en una célula hospedadora o aumenta la síntesis in vitro cuando se compara con la expresión o la síntesis del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. El polipéptido FGF-21 modificado que comprende esta sustitución puede retener actividad agonista y retiene o mejora los niveles de expresión en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la resistencia a la proteasa o reduce la escisión de la proteasa (tal como la escisión de aminoácidos C-terminales) del polipéptido FGF-21 modificado cuando se compara con la resistencia a la proteasa del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. La Patente de EE.UU. N.° 6.716.626 indicó que los posibles sitios que pueden sustituirse para alterar la escisión de la proteasa incluyen, pero no se limitan a, un sitio monobásico dentro de 2 restos de una prolina. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que modula la actividad de transducción de señal del receptor de FGF-21 modificado cuando se compara con la actividad del receptor después de la interacción con el polipéptido FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que modula su unión a otra molécula, tal como un receptor cuando se compara con la unión del polipéptido FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende al menos una sustitución, una adición o una deleción que aumenta la compatibilidad del polipéptido FGF-21 modificado con conservantes farmacéuticos (por ejemplo, m-cresol, fenol, alcohol bencílico) cuando se compara con la compatibilidad del FGF-21 correspondiente sin la al menos una sustitución, una adición o una deleción, o cuando se compara con un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO: 1, 201 u otro polipéptido FGF-21 modificado o no modificado. Esta compatibilidad aumentada permitiría la preparación de una formulación farmacéutica conservada que mantiene las propiedades fisicoquímicas y la actividad biológica de la proteína durante el almacenamiento. El documento WO 2005/091944 analiza los siguientes ejemplos de muteínas de FGF-21 con una mejor estabilidad farmacéutica: la sustitución con un aminoácido cargado y/o polar pero no cargado para una de las siguientes: glicina 42, glutamina 54, arginina 77, alanina 81, leucina 86, fenilalanina 88, lisina 122, histidina 125, arginina 126, prolina 130, arginina 131, leucina 139, alanina 145, leucina 146, isoleucina 152, alanina 154, glutamina 156, glicina 161, serina 163, glicina 170 o serina 172 de SEQ ID NO: 1 del documento WO 05/091944. Un polipéptido FGF-21 modificado de la presente divulgación puede incluir al menos una de estas sustituciones en la posición correspondiente en el polipéptido y/o puede incluir una o más sustituciones, adiciones o deleciones. En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos no naturales se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: glicina 42, glutamina 54, arginina 77, alanina 81, leucina 86, fenilalanina 88, lisina 122, histidina 125, arginina 126, prolina 130, arginina 131, leucina 139, alanina 145, prolina/leucina 146, isoleucina 152, alanina 154, glutamina 156, glicina 161, serina 163, glicina 170, serina 172 (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2­ 7). En algunas realizaciones, uno o más aminoácidos no naturales se sustituyen en una o más de las siguientes posiciones: glutamato 91, arginina 131, glutamina 108, arginina 77, arginina 72, histidina 87, leucina 86, arginina 126, glutamato 110, tirosina 83, prolina 146, arginina 135, arginina 96, arginina 36, (posiciones de aminoácidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7).
El documento WO 05/091944 describe muteínas adicionales de FGF-21 con una mejor estabilidad farmacéutica. Las muteínas incluyen la sustitución de una cisteína para dos o más de las siguientes en FGF-21 (véase SEQ ID NO: 1 del documento WO 05/091944): arginina 19, tirosina 20, leucina 21, tirosina 22, treonina 23, aspartato 24, aspartato 25, alanina 26, glutamina 27, glutamina 28, alanina 31, leucina 33, isoleucina 35, leucina 37, valina 41, glicina 42, glicina 43, glutamato 50, glutamina 54, leucina 58, valina 62, leucina 66, glicina 67, lisina 69, arginina 72, fenilalanina 73, glutamina 76, arginina 77, aspartato 79, glicina 80, alanina 81, leucina 82, glicina 84, serina 85, prolina 90, alanina 92, serina 94, fenilalanina 95, leucina 100, aspartato 102, tirosina 104, tirosina 107, serina 109, glutamato 110, prolina 115, histidina 117, leucina 118, prolina 119, asparagina 121, lisina 122, serina 123, prolina 124, histidina 125, arginina 126, aspartato 127, alanina 129, prolina 130, glicina 132, alanina 134, arginina 135, leucina 137, prolina 138 o leucina 139. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden incluir una de estas sustituciones en la posición correspondiente en el polipéptido y/o pueden incluir una o más sustituciones, adiciones o deleciones.
El documento WO 05/091944 también describe muteínas específicas de FGF-21 con puentes disulfuro modificados por ingeniería genética (aminoácidos sustituidos con cisteína), además del natural en Cys75-Cys93, que son las siguientes: G1n76Cys-Ser109Cys, Cys75-Ser85Cys, Cys75-Ala92Cys, Phe73Cys-Cys93, Ser123Cys-His125Cys, Asp102Cys-Tyr104Cys, Asp127Cys-Gly132Cys, Ser94Cys-Glu110Cys, Pro115Cys-His117Cys, Asn121Cys-Asp127Cys, Leu100Cys-Asp102Cys, Phe95Cys-Tyr107Cys, Arg19CysPro138Cys, Tyr20Cys-Leu139Cys, Tyr22Cys-Leu137Cys, Arg77Cys-Asp79Cys, Pro90Cys-Ala92Cys, Glu50Cys-Lys69Cys, Thr23Cys-Asp25Cys, Ala31Cys-Gly43Cys, Gln28Cys-Gly43Cys, Thr23Cys-Gln28Cys, Val41Cys-Leu82Cys, Leu58Cys-Val62Cys, Gln54Cys-Leu66Cys, Ile35Cys-Gly67Cys, Gly67Cys-Arg72Cys, Ile35Cys-Gly84Cys, Arg72Cys-Gly84Cys o Arg77Cys-Ala81Cys, cuando la numeración es en función de SEQ ID NO: 1 del documento WO 05/091944. Las muteínas adicionales con puentes disulfuro modificados por ingeniería genética son Tyr22Cys-Leu139Cys; Asp24Cys-Arg135Cys; Leu118Cys-Gly132Cys; His117Cys-Pro130Cys; His117Cys-Ala129Cys; Leu82Cys-Pro119Cys; Gly80Cys-Ala129Cys; Gly43Cys-Pro124Cys; Gly42Cys-Arg126Cys; Gly42Cys-Pro124Cys; Gln28Cys-Pro124Cys; Gln27Cys-Ser123Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; o Asp25Cys-Lys122Cys, cuando la numeración es en función de SEQ ID NO: 1 del documento W o 05/091944. Las muteínas adicionales con puentes disulfuro modificados por ingeniería genética son Leu118Cys-Ala134Cys; Leu21Cys-Leu33Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys, cuando la numeración es en función de s Eq ID NO: 1 del documento WO 05/091944. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción pueden incluir una o más de estas sustituciones en la posición correspondiente en el polipéptido y/o pueden incluir una o más sustituciones, adiciones o deleciones.
El documento WO 05/091944 describe muteínas adicionales de FGF-21 que estaban PEGiladas. Estas muteínas tenían una de las siguientes sustituciones: D25C, D38C, L58C, K59C, P60C, K69C, D79C, H87C, E91C, E101C, D102C, L114C, L116C, K122C, R126C, P130C, P133C, P140C. El documento WO 05/091944 describe sustituciones de cisteína en las siguientes posiciones: 19, 21, 26, 28, 29, 30, 36, 39, 42, 50, 56, 61, 64, 65, 68, 70, 71, 77, 81, 85, 86, 90, 92, 94, 98, 107, 108, 112, 113, 123 y 124. El documento WO 05/091944 indica sustituciones de cisteína en las siguientes posiciones: 24, 27, 37, 40, 44, 46, 49, 57, 88, 89, 106, 110, 111, 115, 120 y 139. El documento WO 05/091944 también describe sustituciones de cisteína en las siguientes posiciones: 18, 45, 47, 48, 78, 83, 99, 103, 125, 128, 131, 132 y 138. El documento WO 05/091944 también describe sustituciones de cisteína en las siguientes posiciones: 25, 38, 58, 59, 60, 69, 79, 87, 91, 101, 102, 114, 116, 122, 126, 130, 133 y 140.
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden incluir una o más de las sustituciones anteriormente mencionadas en la posición correspondiente en el polipéptido y/o pueden incluir una o más sustituciones, adiciones o deleciones. En el presente documento, también se proporcionan composiciones que comprenden un polipéptido FGF21 modificado adaptado para su uso en los métodos descritos en el presente documento y un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido FGF-21 modificado con al menos un aminoácido no natural incluye al menos una modificación post-traduccional. En algunas realizaciones, la modificación post-traduccional se realiza in vitro. En algunas realizaciones, la modificación post-traduccional se realiza in vivo en una célula eucariota o en una célula no eucariota.
En algunas realizaciones, la proteína incluye al menos una modificación post-traduccional que se realiza in vivo mediante una célula hospedadora, donde la modificación post-traduccional no se realiza normalmente mediante otro tipo de célula hospedadora. En algunas realizaciones, la proteína incluye al menos una modificación post-traduccional que se realiza in vivo mediante una célula hospedadora, en donde la modificación post-traduccional no se realiza normalmente mediante una célula no eucariota. Algunos ejemplos de modificaciones post-traduccionales incluyen, pero no se limitan a, glucosilación, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace de glucolípidos y similares. En algunas realizaciones, una proteína o un polipéptido de la divulgación pueden comprender una secuencia de secreción o localización, un marcador de epítopo, un marcador FLAG, un marcador de polihistidina, una fusión a GST y/o similares.
La divulgación también proporciona derivados solubles en agua e hidrolíticamente estables de derivados de PEG y polímeros hidrófilos relacionados que tienen una o más porciones acetileno o azida. Los derivados del polímero PEG que contiene porciones acetileno son altamente selectivos para el acoplamiento con porciones azida que se introdujeron selectivamente en proteínas en respuesta a un codón selector. De manera similar, los derivados del polímero PEG que contienen porciones azida son altamente selectivas para acoplamiento con porciones acetileno que se introdujeron selectivamente en proteínas en respuesta al codón selector.
Más específicamente, las porciones azida comprenden, pero no se limitan a, azidas de alquilo, azidas de arilo y derivados de estas azidas. Los derivados de azidas de alquilo y arilo pueden incluir otros sustituyentes siempre y cuando se mantenga la reactividad específica de acetileno. Las porciones acetileno comprenden acetilenos de alquilo y arilo, y derivados de cada uno. Los derivados de acetilenos de alquilo y arilo pueden incluir otros sustituyentes siempre y cuando se mantenga la reactividad específica de azida.
La presente divulgación proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia diversidad de grupos funcionales, sustituyentes o porciones, con otras sustancias incluyendo pero no limitado a, un marcador; un tinte; un polímero; un polímero hidrosoluble; un derivado de polietilenglicol; un fotorreticulador; un radionúclido; un compuesto citotóxico; un fármaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o un polipéptido o un análogo de polipéptido; un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo; un quelante de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido; un dendrímero hidrosoluble; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; un marcador giratorio; un fluoróforo; una porción que contiene metal; una porción radiactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas; una porción activada por luz; una porción excitable de radiación actínica; una porción fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado a carbono; un principio activo por redox; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente marcada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo de densidad de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un marcador detectable; una molécula pequeña; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionucleótido; un radiotransmisor; un agente de captura neutrónica; o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseados. La presente descripción también incluye conjugados de sustancias que tienen porciones azida o acetileno con derivados del polímero PEG que tienen las porciones acetileno o azida correspondientes. Por ejemplo, un polímero PEG que contiene una porción azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contiene un aminoácido no codificado genéticamente que tiene una funcionalidad de acetileno. El enlace mediante la cual el PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan incluye, pero no se limita a, el producto de la cicloadición de Huisgen [3+2].
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo, un grupo acetilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino.
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura:
Figure imgf000039_0001
en donde n es 0-10; Ri es alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación del amino terminal, y R4 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación del carboxi terminal.
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo aminooxi. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo hidrazida. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo hidrazina. En algunas realizaciones, el resto de aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo semicarbazida.
En algunas realizaciones, el resto de aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo azida. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura:
Figure imgf000039_0002
en donde n es 0-10; R1 es alquilo, arilo, alquilo sustituido, arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S, o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de amino terminal, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de carboxi terminal.
En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo alquino. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural tiene la estructura:
Figure imgf000039_0003
en donde n es 0-10; R1 es alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido; X es O, N, S, o no está presente; m es 0­ 10, R2 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de amino terminal, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido o un grupo de modificación de carboxi terminal.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede ser un agonista, un agonista parcial, un antagonista, un antagonista parcial o un agonista inverso. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado comprende un aminoácido codificado de manera no natural enlazado a una porción poli(etilenglicol).
La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a SEQ ID NO: 8-14. La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas a SEQ ID NO: 8-14 en donde el polinucleótido comprende al menos un codón selector. La presente descripción también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido que codifica los polipéptidos que se muestran como SEQ ID NO: 1-7 o un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento. En algunas realizaciones de la divulgación, el polinucleótido aislado descrito en el presente documento comprende al menos un codón selector, por ejemplo, un codón selector que codifica un aminoácido codificado de manera no natural contenido en el polipéptido FGF-21 modificado.
En algunas realizaciones de la divulgación, el codón selector se selecciona del grupo que consiste en un codón ámbar, un codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro, un codón de 5 bases y un codón de 4 bases.
La presente divulgación también proporciona métodos para obtener un polipéptido FGF-21 modificado unido a un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende poner en contacto un polipéptido FGF-21 modificado aislado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural con un polímero soluble en agua que comprende una porción que se hace reaccionar con el aminoácido codificado de manera no natural. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido FGF-21 modificado es reactivo a un polímero soluble en agua que, de otro modo, no es reactivo a cualquiera de los 20 aminoácidos comunes. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido FGF-21 modificado es reactivo a un enlazador, un polímero o una molécula biológicamente activa que, de otro modo, no son reactivos a cualquiera de los 20 aminoácidos comunes.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado enlazado al polímero soluble en agua se obtiene mediante la reacción de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido que contiene carbonilo con un enlazador, polímero, tal como una molécula de poli(etilenglicol), o una molécula biológicamente activa, que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. En algunas realizaciones, el grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida están unidos a la molécula de poli(etilenglicol) mediante un enlace de amida.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado enlazado al polímero soluble en agua se obtiene mediante la reacción de una molécula de poli(etilenglicol) que comprende un grupo carbonilo con un polipéptido que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido FGF-21 modificado enlazado al polímero soluble en agua se obtiene mediante la reacción de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido que contiene alquino con una molécula de poli(etilenglicol) que comprende una porción azida. En algunas realizaciones, el grupo azida o alquino está enlazado a la molécula de poli(etilenglicol) mediante un enlace de amida.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido FGF-21 modificado enlazado al polímero soluble en agua se obtiene mediante la reacción de un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido que contiene azida con una molécula de poli(etilenglicol) que comprende una porción alquino. En algunas realizaciones de la divulgación, el grupo azida o alquino está enlazado a la molécula de poli(etilenglicol) mediante un enlace de amida.
En algunas realizaciones, el polímero soluble en agua enlazado al polipéptido FGF-21 modificado comprende una porción polialquilenglicol. En algunas realizaciones, el resto de aminoácido codificado de manera no natural incorporado al polipéptido FGF-21 modificado comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, una hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas realizaciones, el resto de aminoácido codificado de manera no natural incorporado al polipéptido FGF-21 modificado comprende una porción carbonilo, y el polímero soluble en agua comprende un grupo aminooxi, hidrazida, hidrazina o semicarbazida. En algunas realizaciones de la divulgación, el resto de aminoácido codificado de manera no natural incorporado al polipéptido FGF-21 modificado comprende una porción alquino, y el polímero soluble en agua comprende una porción azida. En algunas realizaciones de la divulgación, el resto de aminoácido codificado de manera no natural incorporado al polipéptido FGF-21 modificado comprende una porción azida, y el polímero soluble en agua comprende una porción alquino.
La presente divulgación también proporciona células que comprenden un polinucleótido que codifica el polipéptido FGF-21 modificado que comprende un codón selector. En algunas realizaciones de la divulgación, las células comprenden una ARN sintetasa ortogonal y/o un ARNt ortogonal para sustituir un aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido FGF-21 modificado.
La presente divulgación también proporciona métodos para obtener un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural. En algunas realizaciones de la divulgación, los métodos comprenden cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido FGF-21 modificado, una ARN sintetasa ortogonal y/o un ARNt ortogonal en condiciones que permitan la expresión del polipéptido FGF-21 modificado; y purificar el polipéptido FGF-21 modificado de las células y/o del medio de cultivo.
Se incluye dentro del alcance de la presente divulgación la secuencia líder o de señales de FGF-21 unida a la región codificante de FGF-21 modificado y la secuencia de señales heteróloga unida a una región de codificante de FGF-21 modificado. La secuencia líder o de señales heteróloga seleccionada debería ser una que sea reconocida y procesada, por ejemplo, por el sistema de secreción de célula hospedadora para secretar y, posiblemente, escindirse mediante una peptidasa de señal, por la célula hospedadora. Las secuencias líder de la presente divulgación se pueden elegir de las siguientes: los tres líderes de leucina de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6 (posiciones de aminoácidos 1-28), los dos líderes de leucina de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7 (posiciones de aminoácidos 1-27), la etiqueta His de SEQ ID NO: 2 (posiciones de aminoácidos 1-10), SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44. Un método para tratar una afección o un trastorno con FGF-21 modificado de la presente descripción se refiere al tratamiento con un polipéptido FGF-21 modificado con o sin un péptido líder o señal.
La presente divulgación también proporciona métodos para inducir un aumento en la absorción de glucosa en células adiposas, en donde el método comprende administrar FGF-21 modificado a las células en una cantidad eficaz para inducir un aumento en la absorción de glucosa. Dicho aumento en la absorción de glucosa puede producir un aumento en el gasto energético debido al uso más rápido y efectivo de glucosa.
II. Ácidos nucleicos recombinantes generales y métodos para su uso con los polipéptidos FGF-21 modificados desvelados
En diversas realizaciones de la presente descripción, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido FGF-21 modificado de interés se puede aislar, clonar y, a menudo, modificar usando métodos recombinantes. Tales realizaciones pueden usarse, pero no se limitan a, para la expresión de proteínas o durante la generación de variantes, derivados, casetes de expresión u otras secuencias derivadas de un polipéptido FGF-21 modificado. En algunas realizaciones, las secuencias que codifican los polipéptidos FGF-21 modificados de la descripción se ligan operativamente a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones, el uso del codón de ADN en las secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido FGF-21 modificado se puede optimizar para la expresión de E. coli o de una célula de mamífero (por ejemplo, CHO) usando técnicas que son conocidas en el estado de la técnica.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma P de FGF-21 sin la secuencia líder se muestra como SEQ ID NO: 8. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 1.
Un ejemplo de ADNc que codifica una forma P etiquetada con His de FGF-21 sin una secuencia líder se muestra como SEQ ID NO: 9. El polipéptido se muestra como s Eq ID NO: 2.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma P de FGF-21 con una secuencia líder que contiene 3 leucinas juntas se muestra como SEQ ID NO: 10. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 3.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma P de FGF-21 con una secuencia líder que contiene 2 leucinas juntas se muestra como SEQ ID NO: 11. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 4.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma L de FGF-21 sin la secuencia líder se muestra como SEQ ID NO: 12. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 5.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma L de FGF-21 con una secuencia líder que contiene 3 leucinas juntas se muestra como SEQ ID NO: 13. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 6.
Un ejemplo de ADNc que codifica la forma L de FGF-21 con una secuencia líder que contiene 2 leucinas juntas se muestra como SEQ ID NO: 14. El polipéptido se muestra como SEQ ID NO: 7.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede sintetizarse sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de origen, que incluye, pero no se limita a, tener la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1-7 y luego cambiar la secuencia de nucleótidos para realizar la introducción (es decir, incorporación o sustitución) o retirada (es decir, deleción o sustitución) del resto o restos de aminoácidos correspondientes. La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con métodos convencionales. De manera alternativa, la secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante síntesis química, que incluye, pero no se limita a, el uso de un sintetizador de oligonucleótidos, en donde los oligonucleótidos se diseñan en función de la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y, preferentemente, la selección de los codones que resultan favorecidos en la célula hospedadora en donde se produce el polipéptido recombinante. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican porciones del polipéptido deseado se pueden sintetizar y ensamblar mediante PCR, enlace o reacción en cadena de enlace. Véase, por ejemplo, Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); Patente de EE.UU.
6.521.427.
La divulgación también se refiere a células hospedadoras eucariotas, células hospedadoras no eucariotas y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural a través de pares de ARNt/RS ortogonales. Las células hospedadoras se modifican por ingeniería genética (lo que incluye, pero no se limita a, células transformadas, transducidas o transfectadas) con los polinucleótidos de la descripción o construcciones que incluyen un polinucleótido de la descripción, que incluye, pero no se limita a, un vector de la descripción, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. Por ejemplo, las regiones codificantes del ARNt ortogonal, la sintetasa de ARNt ortogonal y la proteína que se desea derivatizar están operativamente ligadas elementos de control de la expresión génica que son funcionales en la célula hospedadora deseada. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de un plásmido, un cósmido, un fago, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores pueden introducirse en células y/o microrganismos mediante métodos convencionales.
CODONES SELECTORES
Los codones selectores de la divulgación expanden el marco de codón genético de la maquinaria biosintética de proteínas. Por ejemplo, un codón selector incluye, pero no se limita a, un codón único de tres bases, un codón sin sentido, tal como un codón de parada, que incluye, pero no se limita a, un codón ámbar (UAG), un codón ocre o un codón ópalo (UGA), un codón no natural, un codón de cuatro o más bases, un codón extraño, o similares. Resulta evidente para la persona experta en la materia que existe una amplia diversidad de cantidad de codones selectores que pueden introducirse en un gen deseado o polinucleótido, que incluye, pero no se limita a, uno o más, dos o más, tres o más, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica al menos una porción del polipéptido FGF-21 modificado.
En una realización de la divulgación, los métodos implican el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales (es decir, codificados de manera no natural) in vivo. Por ejemplo, se produce un O-ARNt que reconoce el codón de parada, lo que incluye, pero no se limita a, UAG, y se aminoacila mediante un O-RS con un aminoácido no natural deseado. Este O-ARNt no se reconoce mediante las aminoacil-ARNt sintetasas del hospedador natural. La mutagénesis dirigida al sitio convencional puede usarse para introducir el codón de parada, que incluye, pero no se limita a, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Véase, por ejemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), 5 -3 ’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802. Cuando el O-RS, O-ARNt y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés se combinan in vivo, el aminoácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para obtener un a polipéptido que contiene el aminoácido no natural en la posición especificada.
La incorporación de aminoácidos no naturales in vivo puede realizarse sin alterar de manera considerable la célula hospedadora eucariota. Por ejemplo, debido a que la eficacia de supresión del codón UAG depende de la competencia entre los O-ARNt, que incluye, pero no se limita a, el ARNt supresor ámbar y un factor de liberación eucariótico (que incluye, pero no se limita a, eRF) (que se une a un codón de parada e inicia la liberación del péptido en crecimiento desde el ribosoma), la eficiencia de deleción puede modularse mediante, por ejemplo, el aumento del nivel de expresión de O-ARNt y/o el ARNt supresor.
Los aminoácidos no naturales también pueden codificarse con codones raros. Por ejemplo, cuando se reduce la concentración de arginina en una reacción de síntesis de proteínas in vitro, el codón raro de arginina, AGG, demostró ser eficaz en la inserción de Ala mediante un ARNt sintético acilado con alanina. Véase, por ejemplo, Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). En este caso, el ARNt sintético compite con el ARNtArg natural, que existe como una especie secundaria en Escherichia coli. Algunos organismos no usan todos los codones tripletes. Un codón AGA sin asignar en Micrococcus luteus se utilizó para la inserción de aminoácidos en un extracto de transcripción/traducción in vitro. Véase, por ejemplo, Kowal y Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Los componentes de la presente descripción pueden generarse para su uso estos codones raros in vivo.
Los codones selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero no limitado a, codones de cuatro o más bases, por ejemplo codones de cuatro, cinco, seis o más bases. Los ejemplos de codones de cuatro bases incluyen, pero no se limitan a, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y similares. Los ejemplos de codones de cinco bases incluyen, pero no se limitan a, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, uA g GC y similares. Una característica de la descripción incluye usar codones prolongados en función de la deleción del desplazamiento del marco de lectura. Los codones de cuatro o más bases pueden insertar, por ejemplo, uno o varios aminoácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en presencia de O-ARNt mutados, que incluyen ARNt supresores del desplazamiento del marco de lectura especial, con bucles del anticodón, por ejemplo, con bucles del anticodón de al menos 8-10 nt, el codón de cuatro o más bases se lee como un solo aminoácido. En otras realizaciones, los bucles del anticodón pueden decodificar, al menos, un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de 6 bases o más. Debido a que existen 256 posibles codones de cuatro bases, pueden codificarse varios aminoácidos no naturales en la misma célula usando un codón de cuatro o más bases.
En una realización de la divulgación, los codones prolongados en función de codones raros o codones sin sentido pueden usarse en la presente divulgación, lo cual puede reducir la lectura completa de contrasentido y la deleción del desplazamiento del marco de lectura en otros sitios no deseados.
Para un sistema determinado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no usa (o rara vez usa) el codón de base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un ARNt que reconoce el codón de tres bases natural, y/o un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro.
Los codones selectores incluyen opcionalmente pares de bases no naturales. Estos pares de bases no naturales prolongan aún más el alfabeto genético existente. Un par de bases extra aumenta la cantidad de codones tripletes de 64 a 125. Las propiedades de pares de terceras bases incluyen apareamiento estable y selectivo de bases, incorporación enzimática eficaz en ADN con alta fidelidad mediante una polimerasa, y prolongación continua eficaz del cebador después de la síntesis del par de bases no natural emergente. Las descripciones de pares de bases no naturales que se pueden adaptar para los métodos y las composiciones incluyen, por ejemplo, Hirao, et al., (2002), Nature Biotechnology.20:177-182. Véase también, Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630.
Los genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés, tales como un polipéptido FGF-21 modificado, pueden mutagenizarse mediante métodos conocidos por las personas expertas en la materia y, según se describe en el presente documento, incluyen, por ejemplo, uno o más codones selectores para la incorporación de un aminoácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, lo que permite la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales. La descripción incluye cualquiera de esas variantes, pero no se limitan a, versiones mutantes de cualquier proteína, por ejemplo, que incluye al menos un aminoácido no natural.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés, tales como un polipéptido FGF-21 modificado, pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteína en cualquier posición deseada del polipéptido. La cisteína se usa ampliamente para introducir moléculas reactivas, agua, polímeros solubles, proteínas o una amplia diversidad de otras moléculas, en una proteína de interés.
III. Aminoácidos codificados de manera no natural
Una diversidad muy amplia de aminoácidos codificados de manera no natural es adecuada para su uso en la presente divulgación. Puede introducirse cualquier cantidad de aminoácidos codificados de manera no natural en un polipéptido FGF-21 modificado. En general, los aminoácidos codificados de manera no natural introducidos son sustancialmente inertes en términos químicos con respecto a los 20 aminoácidos comunes genéticamente codificados (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina). En algunas realizaciones, los aminoácidos codificados de manera no natural incluyen grupos funcionales de la cadena lateral que reaccionan de manera eficiente y selectiva con grupos funcionales no hallados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitado a, grupos azido, cetona, aldehído y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, un polipéptido FGF-21 modificado que incluye un aminoácido codificado de manera no natural que contiene un grupo funcional azido puede hacerse reaccionar con un polímero (que incluye, pero no se limita a, poli(etilenglicol) o, de manera alternativa, un segundo polipéptido que contiene una porción alquino para formar un conjugado estable que se produce para la reacción selectiva de la azida y los grupos funcionales alquino para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2].
La estructura genérica de un aminoácido alfa se ilustra de la siguiente manera (Fórmula I):
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Un aminoácido codificado de manera no natural es normalmente cualquier estructura que tiene la fórmula mencionada anteriormente, en donde el grupo R es cualquier sustituyente que no se use en los 20 aminoácidos naturales, y puede ser adecuado para su uso en los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación. Debido a que los aminoácidos codificados de manera no natural de la descripción difieren, en general, de los aminoácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los aminoácidos codificados de manera no natural forman enlaces de amida con otros aminoácidos, incluyendo pero no limitado a, aminoácidos codificados de manera natural o no natural, de la misma manera que se forman en polipéptidos naturales. Sin embargo, los aminoácidos codificados de manera no natural tienen grupos de la cadena lateral que se distinguen de los aminoácidos naturales. Por ejemplo, R comprende, opcionalmente, un grupo alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno, sulfonilo, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino o similares, o cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos de aminoácidos codificados de manera no natural que pueden ser adecuados para su uso en la presente divulgación y que son útiles para las reacciones con polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, aquellos con grupos reactivos carbonilo, aminooxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino. En algunas realizaciones, los aminoácidos codificados de manera no natural comprenden una porción sacárido. Los ejemplos de estos aminoácidos incluyen A/-acetil-L-glucosam¡n¡l-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, /V-acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-manosaminil-L-serina.
Muchos de los aminoácidos codificados de manera no natural proporcionados en el presente documento están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) o Peptech (Burlington, MA, EE.UU.). Aquellos que no se encuentran disponibles en el mercado se sintetizan, opcionalmente, como se indica en el presente documento o mediante métodos convencionales conocidos por las personas expertas en la materia. Con respecto a técnicas de síntesis orgánica, véase, por ejemplo, Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, segunda edición, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York); y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York). Véanse también las patentes de EE.UU. N.° 7.045.337 y 7.083.970. Además de los aminoácidos no naturales que contienen cadenas laterales novedosas, los aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente divulgación también comprenden, opcionalmente, estructuras principales modificadas, incluyendo pero no limitado a, las que se ilustran mediante las estructuras de las Fórmulas II y III:
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en donde Z comprende, en general, OH, NH2, SH, NH-R' o S-R'; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, comprenden, normalmente, S u O, y R y R', que son opcionalmente iguales o diferentes, se seleccionan, en general, de la misma lista de constituyentes para el grupo R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales que tienen la Fórmula I así como hidrógeno. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales de la descripción comprenden, opcionalmente, sustituciones en el grupo amino o carboxilo, como se ilustra mediante las Fórmulas II y III. Los aminoácidos no naturales de este tipo incluyen, pero no se limitan a, ácidos a-hidroxi, a-tioácidos, aaminotiocarboxilatos, incluyendo pero no limitado a, con cadenas laterales correspondientes a los 20 aminoácidos naturales comunes o con cadenas laterales no naturales. Asimismo, las sustituciones en a-carbono incluyen, opcionalmente, pero no se limitan a, aminoácidos L, D o a-adisustituidos, tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico y similares. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos, tales como análogos de prolina, así como análogos de prolina con anillos de 3, 4, 6, 7, 8 y 9 miembros, aminoácidos p y y, tales como p-alanina sustituida y ácido Y-aminobutírico.
Muchos aminoácidos no naturales se basan en aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, fenilalanina y similares, y son adecuados para su uso en la presente divulgación. Los análogos de tirosina incluyen, pero no se limitan a, tirosinas parasustituidas, tirosinas ortosustituidas y tirosinas metasustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende, pero no se limita a, un grupo ceto (que incluye, pero no se limita a, un grupo acetilo), un grupo benzoílo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo C6 - C20 de cadena lineal o ramificada, un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéter, un grupo nitro, un grupo alquinilo o similares. Asimismo, también se contemplan anillos de arilo sustituidos de manera múltiple. Los análogos de glutamina que pueden ser adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, derivados de a-hidroxi, derivados Y sustituidos, derivados cíclicos y derivados de glutamina sustituida con amida. Los ejemplos de análogos de fenilalanina que pueden ser adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, fenilalaninas parasustituidas, fenilalaninas ortosustituidas y fenilalaninas metasustituidas, en donde el sustituyente comprende, pero no se limita a, un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehído, un azido, un iodo, un bromo, un grupo ceto (que incluye, pero no se limita a, un grupo acetilo), un benzoílo, un grupo alquinilo o similares. Los ejemplos específicos de aminoácidos no naturales que pueden ser adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, una p-acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3-(2-naftil)alanina, una 3-metil-fenilalanina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, una L-dopa, una fenilalanina fluorinada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-iodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina y una p-propargiloxi-fenilalanina, y similares.
En una realización, se desvelan composiciones de un polipéptido FGF-21 modificado que comprenden un aminoácido no natural (tal como p-(propargiloxi)-fenilalanina). Se desvelan también diversas composiciones que comprenden p-(propargiloxi)-fenilalanina y que incluyen pero no limitado a, proteínas y/o células. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido no natural p-(propargiloxi)-fenilalanina también incluye ARNt ortogonal. El aminoácido no natural puede unirse (por ejemplo, de manera covalente) a ARNt ortogonal, por ejemplo, puede unirse de manera covalente a ARNt ortogonal mediante un enlace de amino-acilo, puede unirse de manera covalente a 3'OH o 2'OH de un azúcar ribosa terminal de ARNt ortogonal, etcétera.
El polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un aminoácido codificado de manera no natural descrito en la Patente de EE.UU. N.° 8.012.931.
ESTRUCTURA Y SÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES: GRUPOS CARBONILO, TIPO CARBONILO, CARBONILO ENMASCARADO, CARBONILO PROTEGIDO, E HIDROXILAMINA
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona FGF-21 modificado enlazado a un polímero soluble en agua, por ejemplo, PEG, mediante un enlace de oxima. Muchos tipos de aminoácidos codificados de manera no natural son adecuados para formar enlaces de oxima. Estos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos codificados de manera no natural que contienen un grupo carbonilo, dicarbonilo, tipo carbonilo, carbonilo oculto, carbonilo protegido, o un grupo hidroxilamina. Estos aminoácidos, así como su estructura y síntesis, se describen en la Patente de EE.UU. N.° 8.012.931.
IV. Estructura y síntesis de aminoácidos no naturales: Aminoácidos que contienen hidroxilamina
La solicitud de patente provisional de EE.UU. N.° 60/638.418 se desvela en el presente documento. Por lo tanto, las divulgaciones proporcionadas en la sección V (titulada "Aminoácidos no naturales"), parte B (titulada "Estructura y síntesis de aminoácidos no naturales: Aminoácidos que contienen hidroxilamina"), en la patente provisional de EE.UU. N.° 60/638.418 aplican completamente a los métodos, las composiciones, técnicas y estrategias para hacer, purificar, caracterizar y usar aminoácidos no naturales, polipéptidos de aminoácidos no naturales y polipéptidos de aminoácidos no naturales modificados descritos en el presente documento. Las publicaciones de patentes de EE.UU. N.° 2006/0194256, 2006/0217532 y 2006/0217289 y el documento WO 2006/069246 tituladas "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides" también se desvelan en el presente documento.
SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES
Muchos de los aminoácidos no naturales adecuados para su uso en la presente divulgación se encuentran disponibles en el mercado, por ejemplo, de Sigma (EE.UU.) o Aldrich (Milwaukee, WI, EE.UU.). Aquellos que no se encuentran disponibles en el mercado se sintetizan, opcionalmente, como se indica en el presente documento, como se indica en diversas publicaciones o mediante métodos convencionales conocidos por las personas expertas en la materia. Con respecto a técnicas de síntesis orgánica, véase, por ejemplo, Organic Chemistry por Fessendon and Fessendon, (1982, segunda edición, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry por March (Tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York); y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (Tercera edición, Partes A y B, 1990, Plenum Press, Nueva York). Otras publicaciones que describen la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, el documento WO 2002/085923, titulado "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"; Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of Y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem.53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; y Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualatesensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Véase también la Publicación de Patente de e E.UU. N.° 2004/0198637 titulada "Protein Arrays".
A. Grupos reactivos carbonilo
Los aminoácidos con un grupo reactivo carbonilo permiten que varias reacciones liguen moléculas (incluyendo pero no limitado a, PEG u otras moléculas soluble en agua) mediante adición nucleofílica o reacciones de condensación de aldol, entre otros.
La síntesis de p-acetil-(+/-)-fenilalanina y m-acetil-(+/-)-fenilalanina se describe en Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Una persona experta en la materia puede preparar de manera similar otros aminoácidos que contienen carbonilo.
En algunas realizaciones, un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural puede modificarse químicamente para generar un grupo funcional carbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad de aldehído útil para reacciones de conjugación se puede generar de una funcionalidad que tiene grupos adyacentes amino e hidroxilo. Cuando la molécula biológicamente activa es un polipéptido, puede usarse, por ejemplo, una serina o treonina N-terminal (que pueden estar presentes normalmente o pueden exponerse mediante digestión química o enzimática) para generar una funcionalidad de aldehído en condiciones de escisión oxidativa leve usando peryodato. Véase, por ejemplo, Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Sin embargo, los métodos conocidos en el estado de la técnica se limitan al aminoácido en el N-terminal del péptido o de la proteína.
En la presente divulgación, un aminoácido codificado de manera no natural, que tiene grupos hidroxilo y amino adyacentes, puede incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad de aldehído "oculta". Por ejemplo, 5-hidroxilisina tiene un grupo hidroxilo adyacente a la amina épsilon. Las condiciones de reacción para generar el aldehído, en general, incluyen la adición de metaperyodato de sodio en exceso molar en condiciones leves para evitar la oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación es, en general, aproximadamente 7,0. Una reacción típica incluye la adición de metaperyodato de sodio en un exceso molar de aproximadamente 1,5 a una solución tamponada del polipéptido, que luego se incubó durante aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Véase, por ejemplo, la Patente de Ee .UU. N.° 6.423.685.
La funcionalidad de carbonilo puede hacerse reaccionar de manera selectiva con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida en condiciones leves en una solución acuosa, para formar los enlaces de hidrazona, oxima o semicarbazona, respectivamente, que son estables en condiciones fisiológicas. Véase, por ejemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Además, la reactividad única del grupo carbonilo permite la modificación selectiva en presencia de las otras cadenas laterales de aminoácidos. Véase, por ejemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
B. Grupos reactivos hidrazina, hidrazida o semicarbazida
Los aminoácidos codificados de manera no natural que contienen un grupo nucleofílico, tal como hidrazina, hidrazida o semicarbazida, permiten la reacción con varios grupos electrófilos para formar conjugados (por ejemplo, con PEG u otros polímeros solubles en agua).
Los aminoácidos que contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida se encuentran disponibles en fuentes comerciales. Por ejemplo, L-glutamato-Y-hidrazida se encuentra disponible de Sigma Chemical (San Luis, MO). Una persona experta en la materia puede preparar otros aminoácidos no disponibles en el mercado. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.281.211.
Los polipéptidos FGF-21 modificados que contienen aminoácidos codificados de manera no natural, que tienen funcionalidades de hidrazida, hidrazina o semicarbazida, pueden hacerse reaccionar de manera eficaz y selectiva con diversas moléculas que contienen aldehídos u otros grupos funcionales con reactividad química similar. Véase, por ejemplo, Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). La reactividad única de los grupos funcionales hidrazida, hidrazina y semicarbazida los hace considerablemente más reactivos a aldehídos, cetonas y otros grupos electrófilos, en comparación con los grupos nucleófilos presentes en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitado a, el grupo hidroxilo de serina o treonina, o los grupos amino de lisina y N-terminal).
C. Aminoácidos que contienen aminooxi
Los aminoácidos codificados de manera no natural que contienen un grupo aminooxi (también denominado una hidroxilamina) permiten la reacción con diversos grupos electrófilos para formar conjugados (por ejemplo, con PEG u otros polímeros solubles en agua). Como hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilidad mejorada del grupo aminooxi le permite reaccionar de manera eficiente y selectiva con diversas moléculas que contienen aldehídos u otros grupos funcionales con actividad química similar. Véase, por ejemplo, Shao, J. y Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Si bien el resultado de la reacción con un grupo hidrazina es la hidrazona correspondiente, una oxima surge, en general, como resultado de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carbonilo, tal como cetona.
Los aminoácidos que contienen aminooxi pueden prepararse de precursores de aminoácidos de fácil acceso (homoserina, serina y treonina). Véase, por ejemplo, M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Determinados aminoácidos que contienen aminooxi, tales como ácido L-2-amino-4-(aminooxi)butírico, se aislaron de fuentes naturales (Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Una persona experta en la materia puede preparar otros aminoácidos que contienen aminooxi.
D. Grupos reactivos azida y alquino
La reactividad única de los grupos funcionales azida y alquino los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Las azidas orgánicas, en particular, azidas alifáticas, y alquinos, en general, son estables en condiciones químicas de reacción comunes. En particular, los grupos funcionales azida y alquino son inertes con respecto a las cadenas laterales (es decir, grupos R) de los 20 aminoácidos comunes encontrados en polipéptidos naturales. Sin embargo, al aproximarse, se revela la naturaleza "de acción por resorte" de los grupos azida y alquino, y estos reaccionan de manera selectiva y eficiente mediante la reacción de cicloadición Huisgen [3+2] para generar el triazol correspondiente. Véase, por ejemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).
Dado que la reacción de cidoadición Huisgen implica una reacción de cidoadición selectiva (véase, por ejemplo, Padwa, A., en Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. en 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176), más que una sustitución nucleofílica, la incorporación de aminoácidos codificados de manera no natural que tienen cadenas laterales que contienen azida y alquino permite que los polipéptidos resultantes se modifiquen de manera selectiva en la posición de los aminoácidos codificados de manera no natural. La reacción de cicloadición, que incluye un polipéptido FGF-21 modificado que contiene azida o alquino, puede realizarse a temperatura ambiente en condiciones acuosas, mediante la adición de Cu(II) (por ejemplo, en forma de una cantidad catalítica de CuSO4), en presencia de un agente reductor para reducir Cu(II) a Cu(I), in situ, en una cantidad catalítica. Véase, por ejemplo, Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192­ 3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. ed. int.
41:2596-2599 (2002). Los ejemplos de agentes reductores incluyen, pero no se limitan a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutatión, cisteína, Fe2+, Co2+ y un potencial eléctrico aplicado.
En algunos casos, en donde se desea una reacción de cicloadición de Huisgen [3+2] entre una azida y un alquino, el polipéptido FGF-21 modificado puede comprender un aminoácido codificado de manera no natural, que comprende una porción alquino, y el polímero soluble en agua que debe unirse al aminoácido puede comprender una porción azida. De manera alternativa, también puede realizarse la reacción inversa (es decir, con la porción azida en el aminoácido y la porción alquino en el polímero soluble en agua).
El grupo funcional azida también puede hacerse reaccionar de manera selectiva con un polímero soluble en agua que contiene un éster de arilo, y puede funcionalizarse de manera adecuada con una porción arilfosfina para generar un enlace de amida. El grupo arilfosfina reduce la azida in situ, y la amina resultante luego reacciona de manera eficiente con un enlace de éster próximo para generar la amida correspondiente. Véase, por ejemplo, E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). El aminoácido que contiene azida puede ser una azida de alquilo (que incluye, pero no se limita a, ácido 2-amino-6-azido-1-hexanoico) o una azida de arilo (p-azido-fenilalanina).
El grupo funcional azida también puede hacerse reaccionar de manera selectiva con un polímero soluble en agua que contiene un tioéster, y puede funcionalizarse de manera adecuada con una porción arilfosfina para generar un enlace de amida. El grupo arilfosfina reduce la azida in situ, y la amina resultante luego reacciona de manera eficiente con el enlace de tioéster para generar la amida correspondiente.
Los aminoácidos que contienen alquino están disponibles en el comercio. Por ejemplo, propargilglicina está disponible en el mercado, de Peptech (Burlington, MA). De manera alternativa, los aminoácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo con métodos convencionales. Por ejemplo, p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo, como se describe en Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), y 4-alquinil-L-fenilalanina puede sintetizarse como se describe en Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Una persona experta en la técnica puede preparar otros aminoácidos que contienen alquino.
Los aminoácidos que contienen azida se encuentran disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, 4-azidofenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Para aquellos aminoácidos que contienen azida y no están disponibles en el mercado, el grupo azida puede prepararse de manera relativamente fácil, usando métodos convencionales conocidos por las personas expertas en la materia, incluyendo pero no limitado a, el desplazamiento de un grupo saliente adecuado (por ejemplo, haluro, mesilato, tosilato) o la apertura de una lactona protegida de manera adecuada. Véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry por March (tercera edición, 1985, Wiley and Sons, Nueva York).
Una molécula que puede añadirse a una proteína de la divulgación a través de una cicloadición [3+2] incluyen casi cualquier molécula con un derivado de azida o alquinilo. Las moléculas incluyen, pero no se limitan a, tintes, fluoróforos, agentes de reticulación, derivados de sacárido, polímeros (incluyendo pero no limitado a, polímeros que comprenden polietilenglicol), fotorreticulantes, compuestos citotóxicos, marcadores de afinidad, derivados de biotina, resinas, microesferas, una segunda proteína o un segundo polipéptido (o más), polinucleótidos (incluyendo pero no limitado a, ADN, ARN, etc.), quelantes de metal, cofactores, ácidos grasos, hidratos de carbono y similares. Estas moléculas pueden añadirse a un aminoácido no natural con un grupo alquinilo, que incluye, pero no se limita a, ppropargiloxifenilalanina, o un grupo azido, que incluye, pero no se limita a, p-azido-fenilalanina, respectivamente.
E. Grupos reactivos aminotiol
La reactividad única de grupos funcionales aminotiol beta-sustituidos los hace extremadamente útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehído mediante la formación de tiazolidina. Véase, por ejemplo, J. Shao y J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899. En algunas realizaciones, los aminoácidos de aminotiol beta-sustituidos pueden incorporarse en los polipéptidos FGF-21 modificados y luego hacerse reaccionar con polímeros solubles en agua que comprenden una funcionalidad aldehído. En algunas realizaciones, un polímero soluble en agua, conjugado de fármaco u otra carga útil puede acoplarse a un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido de aminotiol beta-sustituido mediante la formación de tiazolidina.
F. Grupos reactivos adicionales
Los grupos reactivos adicionales y aminoácidos codificados de manera no natural que pueden incorporarse en polipéptidos FGF-21 modificados de la divulgación se describen en las siguientes solicitudes de patentes: Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2006/0194256, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2006/0217532, Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2006/0217289, patente provisional de EE.UU. N.° 60/755.338; patente provisional de EE.UU. N.° 60/755.711; patente provisional de EE.UU. N.° 60/755.018; solicitud de patente internacional N.° PCT/US06/49397; WO 2006/069246; patente provisional de EE.UU. N.° 60/743.041; patente provisional de EE.UU. N.° 60/743.040; solicitud de patente internacional N.° PCT/US06/47822; patente provisional de EE.UU. N.° 60/882.819; patente provisional de EE.UU. N.° 60/882.500; y patente provisional de EE.UU. N.° 60/870.594.
ABSORCIÓN CELULAR DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES
La absorción de aminoácidos no naturales por parte de una célula es una cuestión que se considera, en general, al diseñar y seleccionar aminoácidos no naturales incluyendo, pero no limitado a, para la incorporación en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de a-aminoácidos sugiere que es poco probable que estos compuestos sean permeables a las células. La célula eucariota absorbe los aminoácidos mediante una serie de sistemas de transporte a base de proteínas. Puede realizarse una selección rápida que evalúe qué aminoácidos no naturales son absorbidos por células. Véanse, por ejemplo, los ensayos de toxicidad, por ejemplo, en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2004/0198637 titulada "Protein Arrays"; y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. p Na S Estados Unidos 96:4780-4785. Si bien la absorción se analiza con facilidad mediante diversos ensayos, una alternativa para diseñar aminoácidos no naturales que respondan a rutas de absorción celular es proporcionar rutas biosintéticas para crear aminoácidos in vivo.
BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES
Ya existen diversas rutas biosintéticas en las células para la producción de aminoácidos y otros compuestos. Si bien es posible que un método biosintético para un aminoácido no natural en particular no exista en la naturaleza, por ejemplo, en una célula, la divulgación proporciona estos métodos. Por ejemplo, las rutas biosintéticas para aminoácidos no naturales se generan, opcionalmente, en células hospedadoras, agregando nuevas enzimas o modificando rutas de células hospedadoras existentes. Las nuevas enzimas adicionales son, opcionalmente, enzimas naturales o enzimas artificiales. Por ejemplo, la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta en un ejemplo en el documento WO 2002/085923 titulado "In vivo incorporation of unnatural amino acids") depende de la adición de una combinación de enzimas conocidas de otros organismos. Los genes para estas enzimas pueden introducirse en una célula eucariota, transformando la célula con un plásmido que comprende los genes. Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan una ruta enzimática para sintetizar el compuesto deseado. A continuación se proporcionan ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente. Las secuencias de enzimas adicionales se encuentran, por ejemplo, en GenBank. Las enzimas artificiales también se añaden opcionalmente en una célula de la misma manera. De este modo, la maquinaria celular y los recursos de una célula se manipulan para producir aminoácidos no naturales.
Se encuentra disponible varios métodos para producir enzimas novedosas para su uso en rutas biosintéticas o para la evolución de rutas existentes. Por ejemplo, la recombinación recursiva, que incluye, pero no se limita a, aquella desarrollada por Maxygen, Inc. (disponible en la web en maxygen.com), se usa opcionalmente para desarrollar enzimas y rutas novedosas. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; y Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination formolecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. De manera similar, DesignPath™, desarrollado por Genencor (disponible en la web en genencor.com) se usa opcionalmente para diseñar rutas metabólicas, que incluye, pero no se limita a, diseñar una ruta para crear O-metil-L-tirosina en una célula. Esta tecnología reconstruye rutas existentes en organismos hospedadora usando una combinación de nuevos genes, incluyendo pero no limitado a, aquellos identificados mediante genómica funcional y evolución y diseño moleculares. Diversa Corporation (disponible en la web en diversa.com) también proporciona tecnología para un rastreo rápido de genotecas y rutas de genes, que incluye, pero no se limita a, crear nuevas rutas.
En general, el aminoácido no natural producido mediante una ruta biosintética modificada por ingeniería genética de la divulgación se produce en una concentración suficiente para una biosíntesis de proteínas eficaz, que incluye, pero no se limita a, una cantidad celular natural, pero no en una medida tal que afecte la concentración de los otros aminoácidos o que agote los recursos celulares. Las concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0,05 mM. Una vez que una célula se transforma con un plásmido que comprende los genes usados para producir las enzimas deseadas para una vía específica y se genera un aminoácido no natural, se usan opcionalmente selecciones in vivo para optimizar la producción del aminoácido no natural para la síntesis de proteína ribosómica y el crecimiento celular.
V. Generación in vivo de polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden aminoácidos codificados de manera no natural
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la divulgación pueden generarse in vivo usando ARNt y ARNt sintetasas modificadas para agregar o sustituir aminoácidos que no están codificados en sistemas naturales. Estos métodos se describen en la Patente de EE.UU. N.° 8.012.931.
Los métodos para generar ARNt y ARNt sintetasas, que usan aminoácidos que no están codificados en sistemas naturales, se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N.° 7.045.337 y 7.083.970. Estos métodos implican generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente de las sintetasas y ARNt endógenos al sistema de traducción (y, por lo tanto, a veces se denominan "ortogonales"). En general, el sistema de traducción comprende un ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS). En general, la O-RS, preferentemente, aminoacila el O-ARNt con al menos un aminoácido no natural en el sistema de traducción, y el O-ARNt reconoce al menos un codón selector que otros ARNt no reconocen en el sistema. De esta manera, el sistema de traducción inserta el aminoácido codificado de manera no natural en una proteína producida en el sistema, en respuesta a un codón selector codificado, y así "sustituye" un aminoácido en una posición en el polipéptido codificado.
El uso de O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasas incluye la selección de un codón específico que codifica el aminoácido codificado de manera no natural. Si bien puede usarse cualquier codón, en general, es generalmente deseable seleccionar un codón que se usa con poca frecuencia o que no se usa nunca en la célula en la que se expresa O-ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa. Los ejemplos de codones incluyen codones sin sentido, tales como codones de parada (ámbar, ocre y ópalo), cuatro o más codones de inicio y otros codones naturales de tres bases que no se usan o se usan con poca frecuencia.
El codón o codones selectores específicos pueden introducirse en posiciones adecuadas en la secuencia codificante del polinucleótido FGF-21 modificado usando métodos de mutagénesis conocidos en el estado de la técnica (incluyendo pero no limitado a, mutagénesis dirigida, mutagénesis por inserción de un casete, mutagénesis de restricción y selección, etc.).
VI. Ubicación de aminoácidos codificados de manera no natural en polipéptidos FGF-21 modificados
La presente divulgación contempla la incorporación de uno o más aminoácidos codificados de manera no natural en polipéptidos FGF-21 modificados. Pueden incorporarse uno o más aminoácidos codificados de manera no natural en una posición particular que no altere la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse mediante sustituciones "conservativas" incluyendo pero no limitado a, sustituir aminoácidos hidrófobos con aminoácidos hidrófobos, aminoácidos voluminosos por aminoácidos voluminosos, aminoácidos hidrófilos por aminoácidos hidrófilos y/o insertar el aminoácido no natural en una ubicación que no se necesita para la actividad.
En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la divulgación comprenden uno o más aminoácidos no naturales ubicados en una región de la proteína que no altera la estructura del polipéptido.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos en el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender al menos un aminoácido codificado de manera no natural. El al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede incorporarse en cualquier posición en la secuencia de aminoácidos, que incluye las posiciones correspondientes a los aminoácidos 1-181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la divulgación. En algunas realizaciones, al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar en una posición que corresponde al aminoácido 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108 o 110 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131 o 146 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido no natural puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede ser un derivado de fenilalanina. En algunas realizaciones, la posición que corresponde al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1 puede ser un derivado de fenilalanina. En algunas realizaciones, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural puede ser para-acetil-L-fenilalanina. En algunas realizaciones, la posición que corresponde al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1 puede ser para-acetil-L-fenilalanina. En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 91 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 131 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). De acuerdo con la invención, el aminoácido no natural está en la posición 108 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 77 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 72 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 87 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 86 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 126 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 110 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2­ 7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 83 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 146 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 135 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización de la divulgación, el aminoácido no natural está en la posición 96 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7). En una realización, el aminoácido no natural está en la posición 36 en FGF-21 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7).
En otra realización de la divulgación, la secuencia de aminoácidos en el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un aminoácido codificado de manera no natural en una posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1 y al menos un aminoácido codificado de manera no natural diferente en una posición correspondiente a cualquier otro de los aminoácidos 1-181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi-terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la divulgación. En otra realización de la divulgación, el al menos un aminoácido codificado de manera no natural diferente puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108 o 110 de SEQ ID NO: 1. En otra realización de la divulgación, al menos un aminoácido codificado de manera no natural diferente puede estar en una posición correspondiente al aminoácido 91 o 131 de SEQ ID NO: 1.
En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 91 y uno o más aminoácidos no naturales diferentes en una o más de las siguientes posiciones: posición correspondiente a cualquier otro de los aminoácidos 1-181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la descripción. En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 91 y uno o más aminoácidos no naturales diferentes en una o más de las siguientes posiciones: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 y 36 (posición del aminoácido correspondiente a Se Q ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7).
En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 131 y otro aminoácido no natural diferente en una o más de las siguientes posiciones: posición correspondiente a cualquier otro de los aminoácidos 1­ 181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la descripción. En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 131 y un aminoácido no natural diferente en una o más de las siguientes posiciones: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 y 36 (posición del aminoácido correspondiente a SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7).
En otra realización de la divulgación, la secuencia de aminoácidos en el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede comprender un aminoácido codificado de manera no natural en una posición que corresponde al resto 108 de SEQ ID NO: 1 y al menos dos aminoácidos codificados de manera no natural diferentes en las posiciones correspondientes a al menos dos de los siguientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1: posición correspondiente a cualquier otro de los aminoácidos 1-181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la divulgación. En otra realización de la divulgación, la secuencia de aminoácidos en el polipéptido FGF-21 modificado descrita en el presente documento puede comprender un aminoácido codificado de manera no natural en una posición correspondiente al aminoácido 108 de SEQ ID NO: 1 y al menos dos aminoácidos no naturales diferentes en posiciones que corresponden a al menos dos de los siguientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1: 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108 o 110 de SEQ ID NO: 1.
En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 77 y otro aminoácido no natural diferente en una o más de las siguientes posiciones: posición correspondiente a cualquier otro de los aminoácidos 1­ 181 de SEQ ID NO: 1 o antes de la posición 1 (es decir, en N-terminal) o en la posición 182 (es decir, en el carboxi terminal de la proteína) en aquella o los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 2-7 u otro polipéptido FGF-21 modificado de la divulgación. En otra realización de la divulgación, hay un aminoácido no natural en la posición 77 y otro aminoácido no natural diferente en una o más de las siguientes posiciones: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96 y 36 (SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos correspondientes de SEQ ID NO: 2-7).
VII. Expresión en no eucariotas y eucariotas
I. Sistemas de expresión, cultivo y aislamiento
Los polipéptidos FGF-21 modificados o no modificados pueden expresarse en cualquier cantidad de sistemas de expresión adecuados que incluyen, por ejemplo, levadura, células de insecto, células de mamífero y bacterias. A continuación, se proporciona una descripción de sistemas de expresión de ejemplo.
Levadura: como se usa en el presente documento, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras capaces de expresar un gen que codifica un polipéptido FGF-21 modificado.
Las especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis y Candida, incluyendo pero no limitado a, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa y H. polymorpha son de particular interés para su uso con la presente divulgación. El documento WO 2005/091944 en el presente documento, describe la expresión de FGF-21 en levadura.
Células de insecto infectadas con baculovirus: la expresión "hospedador insecto" o "célula hospedadora de insecto" se refiere a un insecto que puede usarse, o se usó, como un receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula hospedadora de insecto original que se transfectó. Cabe destacar que la progenie de una sola célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo a la célula parental original en cuanto a la morfología o al complemento de ADN genómico o total, debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que es lo suficientemente similar a la célula parental para que se caracterice por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FGF-21 modificado, se incluye en la progenie a la que se refiere la presente definición.
E. Coli, especies de Pseudomonas y otras procariotas:
La expresión "hospedador bacteriano" o "célula hospedadora bacteriana" se refiere a una bacteria que puede usarse, o se usó, como un receptor para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia. La expresión incluye la progenie de la célula hospedadora bacteriana original que se transfectó. Cabe destacar que la progenie de una sola célula parental puede no ser necesariamente idéntica por completo a la célula parental original en cuanto a la morfología o al complemento de ADN genómico o total, debido a una mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula parental que es lo suficientemente similar a la célula parental para que se caracterice por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado, se incluye en la progenie que tiene por fin la presente definición.
En la selección de hospedadores bacterianos para la expresión, los hospedadores adecuados pueden incluir aquellos que muestran tener, entre otros, buena capacidad de formación de cuerpos de inclusión, baja actividad proteolítica y solidez general. En general, la fermentación industrial/farmacéutica usa bacterias derivadas de cepas K (por ejemplo, W3110) o bacterias derivadas de cepas B (por ejemplo, BL21). Otros ejemplos de hospedadores de E. coli adecuados incluyen, pero no se limitan a, cepas de BL21, DH10B, o sus derivados. En otra realización de los métodos de la presente descripción, el hospedadora de E. coli es una cepa deficiente en proteasas incluyendo pero no limitado a, OMP- y LON-. La cepa de la célula hospedadora puede ser una especie de Pseudomonas, que incluye, pero no se limitan a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida. Se sabe que el biovar 1 de Pseudomonas fluorescens, designada como cepa MB101, es útil para la producción recombinante y está disponible para los procesos terapéuticos de producción de proteínas.
Una vez que una cepa de la célula hospedadora recombinante se estableció (es decir, la construcción de expresión se introdujo en la célula hospedadora, y las células hospedadoras con la construcción de expresión adecuada se aislaron), la cepa de la célula hospedadora recombinante se cultiva en condiciones adecuadas para la producción de polipéptidos FGF-21 modificados.
Las células hospedadoras recombinantes pueden cultivarse en formatos continuos o de lote, con la cosecha de células (en el caso donde el polipéptido FGF-21 modificado se acumula de manera intracelular) o la cosecha de sobrenadante de cultivo en formatos continuos o de lote.
Los polipéptidos FGF-21 modificados producidos en células hospedadoras bacterianas pueden ser poco solubles o insolubles (en forma de cuerpos de inclusión). En una realización de la presente divulgación, las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente en el polipéptido FGF-21 modificado, y, por lo tanto, se seleccionan para aumentar la solubilidad de la proteína producida de manera recombinante. El polipéptido FGF-21 modificado puede solubilizarse, por ejemplo, con urea o clorhidrato de guanidina.
En el caso de una proteína soluble FGF-21 modificada, FGF-21 se puede segregar en el espacio periplásmico o en el medio de cultivo. Por ejemplo, FGF-21 modificado se segrega en el espacio periplásmico de las células W3110-B2 usando plásmidos que codifican construcciones que incluyen ocho secuencias líder diferentes, que incluyen aquellas enumeradas en SEQ ID NO: 39-44, y transformando aquellos en células W3110-B2; luego las células se cultivaron a 37 °C hasta que la DO alcanzó aproximadamente 0,8, en cuyo punto la expresión se indujo con arabinosa al 0,01 %. Después de cinco horas, las muestras de liberación periplásmica pueden prepararse de los cultivos. Asimismo, el FGF-21 modificado soluble puede estar presente en el citoplasma de las células hospedadoras. Puede ser deseable concentrar FGF-21 modificado soluble antes de realizar las etapas de purificación.
Cuando el polipéptido FGF-21 modificado se produce como una proteína de fusión, la secuencia de fusión puede retirarse. La retirada de una secuencia de fusión puede lograrse mediante escisión enzimática o química. La deleción enzimática de secuencias de fusión puede lograrse usando métodos conocidos por el experto en la materia. La elección de enzimas para la retirada de la secuencia de fusión puede determinarse mediante la identidad de la fusión, y las condiciones de reacción pueden especificarse mediante la elección de enzimas, como será evidente para la persona experta en la materia. La escisión química puede lograrse usando reactivos conocidos por la persona experta en la materia, incluyendo pero no limitado a, bromuro de cianógeno, proteasa TEV y otros reactivos. El polipéptido FGF-21 modificado escindido puede purificarse de la secuencia de fusión escindida mediante los métodos conocidos por la persona experta en la materia.
En general, se desea ocasionalmente desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y luego hacer que los polipéptidos vuelvan a plegarse en la conformación preferida. Por ejemplo, pueden añadirse guanidina, urea, DTT, DTE y/o una chaperonina a un producto de traducción de interés. Las proteínas pueden volver a plegarse en un tampón redox que contiene, incluyendo pero no limitado a, glutationa oxidada y L-arginina. Los reactivos de replegamiento pueden hacerse fluir o, de otra manera, mover para que entren en contacto con uno o más polipéptidos u otro producto de expresión, o viceversa.
En el caso de la producción procariótica del polipéptido FGF-21 modificado, el polipéptido FGF-21 modificado así producido se puede plegar de manera incorrecta y, por lo tanto, tiene menor actividad biológica o carece de esta. La bioactividad de la proteína puede recuperarse mediante el "replegamiento". En general, el polipéptido FGF-21 modificado o no modificado mal plegado se vuelve a plegar mediante la solubilización (en donde el polipéptido FGF-21 modificado también es insoluble), el desplegamiento y la reducción de la cadena de polipéptidos usando, por ejemplo, uno o más agentes caotrópicos (por ejemplo, urea y/o guanidina) y un agente reductor capaz de reducir puentes disulfuro (por ejemplo, ditiotreitol, DTT o 2-mercaptoetanol, 2-ME). En una concentración moderada de caotrópicos, luego se agrega un agente de oxidación (por ejemplo, oxígeno, cistina o cistamina), que permite que se vuelvan a formar puentes disulfuro. El polipéptido FGF-21 modificado se puede volver a plegar usando los métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. N.° 4.511.502, 4.511.503 y 4.512.922. El polipéptido FGF-21 modificado también puede coplegarse con otras proteínas para formar heterodímeros o heteromultímeros.
Después del replegamiento, el FGF-21 modificado puede purificarse adicionalmente. La purificación de FGF-21 modificado puede lograrse usando diversas técnicas conocidas por la persona experta en la materia, que incluyen cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa, cromatografía de afinidad y similares, o cualquier combinación de los mismos. La purificación adicional también puede incluir una etapa de secado o precipitación de la proteína purificada.
Después de la purificación, FGF-21 modificado puede intercambiarse en diferentes tamponesy/o se puede concentrar mediante diversos métodos conocidos en el estado de la técnica, que incluyen, por ejemplo, diafiltración y diálisis. El FGF-21 modificado que se proporciona como una sola proteína purificada puede someterse a agregación y precipitación.
El FGF-21 modificado purificado puede ser al menos 90 % puro (como se mide mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa, RP-HPLC, o electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, SDS-PAGE) o al menos 95 % puro, o al menos 98 % puro, o al menos 99 % puro o más. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza de FGF-21 modificado, el FGF-21 modificado es lo suficientemente puro como para que se use como un producto farmacéutico o para procesamiento adicional, tal como la conjugación con un polímero soluble en agua, tal como PEG.
Determinadas moléculas de FGF-21 modificado pueden usarse como agentes terapéuticos en ausencia de otros ingredientes activos o proteínas (que no sean excipientes, vehículos, estabilizantes, albúmina de suero y similares), o pueden formar un complejo con otra proteína o un polímero.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el rendimiento de FGF-21 modificado, después de cada etapa de purificación, puede ser de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, al menos aproximadamente el 99,9 % o al menos aproximadamente el 99,99 % de FGF-21 modificado o no modificado en el material de inicio para cada etapa de purificación.
VIII. Expresión en sistemas alternativos
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden expresarse usando un sistema de traducción libre de células (por ejemplo, in vitro). Los sistemas de traducción pueden ser celulares o libres de células, procariotas o eucariotas. Los sistemas de traducción celulares incluyen, pero no se limitan a, preparaciones celulares completas, tales como células o cultivos celulares permeabilizados, en donde una secuencia de ácido nucleico deseada puede transcribirse a ARNm, y ARNm puede traducirse. Los sistemas de traducción libres de células están disponibles en el mercado, de los cuales se conocen diversos tipos y sistemas. Algunos ejemplos de sistemas libres de células incluyen, pero no se limitan a, lisados procariotas, tales como lisados de Escherichia coli, y lisados eucarióticos, tales como extractos de germen de trigo, lisados de células de insectos, lisados de reticulocitos de conejos, lisados de oocitos de conejos y lisados de células humanas. Los extractos membranosos, tales como los extractos pancreáticos caninos que contienen membranas microsomales, también se encuentran disponibles y son útiles para traducir proteínas secretoras.
IX. Polímeros macromoleculares acoplados a polipéptidos FGF-21 modificados
Pueden realizarse diversas modificaciones a los polipéptidos de aminoácidos no naturales descritos en el presente documento usando las composiciones, los métodos, las técnicas y las estrategias descritos en el presente documento. Estas modificaciones incluyen la incorporación de una funcionalidad adicional en el componente de aminoácido no natural del polipéptido, la cual incluye, pero no se limita a; un marcador; tinte; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilenglicol; un fotorreticulador; un radionúclido; un compuesto citotóxico; un fármaco; un marcador de afinidad; un marcador de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o un polipéptido o un análogo de polipéptido; un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo; un quelante de metal; un cofactor; un ácido graso; un carbohidrato; un polinucleótido; un ADN; un ARN; un polinucleótido antisentido; un sacárido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibidor; un biomaterial; una nanopartícula; un marcador giratorio; un fluoróforo; una porción que contiene metal; una porción radiactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa de manera covalente o no covalente con otras moléculas; una porción activada por luz; una porción excitable de radiación actínica; una porción fotoisomerizable; biotina; un derivado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazado a carbono; un principio activo por redox; un tioácido de amino; una porción tóxica; una porción isotópicamente etiquetada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo de densidad de electrones; un grupo magnético; un grupo intercalante; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; un marcador detectable; una molécula pequeña; un punto cuántico; un nanotransmisor; un radionucleótido; un radiotransmisor; un agente de captura neutrónica; o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o sustancia deseados. Como ejemplo ilustrativo no limitativo de las composiciones, los métodos, las técnicas y las estrategias descritos en el presente documento, la siguiente descripción se centrará en la adición de polímeros macromoleculares al polipéptido de aminoácido no natural, sin embargo, cabe destacar que las composiciones, los métodos, las técnicas y las estrategias descritos en el presente documento también son aplicables (con las modificaciones adecuadas, de ser necesario, que la persona experta en la materia podría realizar con las descripciones en el presente documento) a la adición de otras funcionalidades, incluyendo pero no limitado a, aquellas enumeradas anteriormente.
Una amplia diversidad de polímeros macromoleculares y otras moléculas pueden enlazarse a polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación para modular las propiedades biológicas del polipéptido FGF-21 modificado y/o proporcionar propiedades biológicas nuevas a la molécula de FGF-21 modificado. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al polipéptido FGF-21 modificado mediante un aminoácido codificado de manera natural o un aminoácido codificado de manera no natural, o mediante cualquier sustituyente funcional de un aminoácido natural o no natural, o cualquier sustituyente o grupo funcional añadido a un aminoácido natural o no natural. El peso molecular del polímero puede ser de un intervalo amplio, que incluye, pero no se limita a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da o más. El peso molecular del polímero puede ser entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da, incluyendo, pero no limitado a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9000 Da, 8000 Da, 7000 Da, 6000 Da, 5000 Da, 4000 Da, 3000 Da, 2000 Da, 1000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 50.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 1.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 5.000 Da y aproximadamente 40.000 Da. En algunas realizaciones, el peso molecular del polímero es entre aproximadamente 10.000 Da y aproximadamente 40.000 Da.
El polímero seleccionado puede ser soluble en agua, de manera tal que la proteína a la que se une no se precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero puede ser farmacéuticamente aceptable.
Algunos ejemplos de polímeros incluyen, pero no se limitan a, polialquiléteres y análogos de los mismos con terminaciones de alcoxi (por ejemplo, polioxietilenglicol, polioxietilen/propilenglicol, y análogos de los mismos con terminaciones de metoxi o etoxi, en especial, polioxietilenglicol, el último también se denomina polietilenglicol o PEG); PEG discreto (dPEG); polivinilpirrolidonas; polivinilalquiléteres; polioxazolinas, polialquiloxazolinas y polihidroxialquiloxazolinas; poliacrilamidas, polialquilacrilamidas y polihidroxialquilacrilamidas (por ejemplo, polihidroxipropilmetacrilamida y derivados de los mismos); acrilatos de polihidroxialquilo; ácidos polisiálicos y análogos de los mismos; secuencias peptídicas hidrófilas; polisacáridos y sus derivados, que incluyen dextrano y derivados de dextrano, por ejemplo, carboximetildextrano, sulfatos de dextrano, aminodextrano; celulosa y sus derivados, por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxialquilcelulosa; quitina y sus derivados, por ejemplo, quitosano, succinilquitosano, carboximetilquitina, carboximetilquitosano; ácido hialurónico y sus derivados; almidones; alginatos; sulfato de condroitina; albúmina; pululano y carboximetilpululano; poliaminoácidos y derivados de los mismos, por ejemplo, ácidos poliglutámicos, polilisinas, ácidos poliaspárticos, poliaspartamidas; copolímeros de anhídrido maleico tales como: copolímero de anhídrido maleico estireno, copolímero de anhídrido maleico diviniletiléter; polivinilalcoholes; copolímeros de estos; terpolímeros de los mismos; mezclas de los mismos; y derivados de los anteriores.
Como se usa en el presente documento, y cuando se contemplan los conjugados PEG:polipéptido FGF-21 modificado, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que produce el beneficio deseado a un paciente. La cantidad puede variar de una persona a otra y puede depender de una cantidad de factores, que incluyen la condición física general del paciente y la causa subyacente de la afección que se desea tratar. La cantidad de polipéptido FGF-21 modificado que se usa para el tratamiento produce una velocidad de cambio aceptable y mantiene la respuesta deseada a un nivel beneficioso.
El polímero soluble en agua puede ser de cualquier forma estructural que incluye, pero no se limita a, una forma lineal, bifurcada o ramificada. Normalmente, el polímero soluble en agua es un poli(alquilenglicol), tal como poli(etilenglicol) (PEG), pero pueden usarse también otros polímeros solubles en agua. A modo de ejemplo, PEG se usa para describir algunas realizaciones de la presente descripción.
El término "PEG" se usa ampliamente para referirse a cualquier molécula de polietilenglicol, independientemente del tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar como enlazado al polipéptido FGF-21 modificado mediante la siguiente fórmula:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
en donde n es 2 a 10.000, y X es H o una modificación terminal, que incluye, pero no se limita a, alquilo C1-4, un grupo protector o un grupo funcional terminal.
En algunos casos, un PEG usado en los polipéptidos de la descripción termina en un extremo con hidroxi o metoxi, es decir, X es H o CH3 ("metoxi PEG"). De manera alternativa, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, y, de esta manera, se forma un polímero bifuncional. Los grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se usan comúnmente para reaccionar con los grupos funcionales encontrados en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitado a, grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitado a, pnitrofeniléster), ésteres activados (incluyendo pero no limitado a, N-hidroxisuccinimida, p-nitrofeniléster) y aldehídos), así como grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes, pero que reaccionan de manera específica con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos codificados de manera no natural (incluyendo pero no limitado a, grupos azida, grupos alquino). Cabe destacar que el otro extremo del PEG, que se muestra en la fórmula anterior mediante Y, puede unirse de manera directa o indirecta a un polipéptido FGF-21 modificado mediante un aminoácido codificado de manera natural o no natural. Por ejemplo, Y puede ser una enlace de carbamato, amida o urea a un grupo amina (que incluye, pero no se limita a, la amina épsilon de lisina o el N-terminal) del polipéptido. De manera alternativa, Y puede ser una enlace de maleimida a un grupo tiol (que incluye, pero no se limita a, el grupo tiol de cisteína). De manera alternativa, Y puede ser una enlace a un resto que no es accesible comúnmente mediante los 20 aminoácidos comunes. Por ejemplo, un grupo azida en el PEG puede hacerse reaccionar con un grupo alquino en el polipéptido FGF-21 modificado para formar un producto de cicloadición de Huisgen [3+2]. De manera alternativa, un grupo alquino en el PEG puede hacerse reaccionar con un grupo azida presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar un producto similar. En algunas realizaciones, un nucleófilo fuerte (que incluye, pero no se limita a, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) puede hacerse reaccionar con un grupo aldehído o cetona presente en un aminoácido codificado de manera no natural para formar una hidrazona, oxima o semicarbazona, según corresponda, que, en algunos casos, puede reducirse adicionalmente mediante el tratamiento con un agente reductor adecuado. De manera alternativa, el nucleófilo fuerte puede incorporarse en el polipéptido FGF-21 modificado mediante un aminoácido codificado de manera no natural y puede usarse para reaccionar, preferentemente, con un grupo cetona o aldehído presente en el polímero soluble en agua.
Cualquier masa molecular para PEG puede usarse como prácticamente se desee, que incluye, pero no se limita a, de aproximadamente 100 Dalton (Da) a 100.000 Da o más, según se desee (que incluye, pero no se limita a, a veces, 0,1-50 kDa o 10-40 kDa). El peso molecular de PEG puede ser de un intervalo amplio, que incluye, pero no se limita a, entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da o más. PEG puede ser entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da, que incluye, pero no se limita a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da. Pueden usarse también PEG de cadena ramificada, incluyendo pero no limitado a, moléculas de PEG en donde cada cadena tiene un peso molecular (MW) que varía de 1-100 kDa (que incluye, pero no se limita a, 1-50 kDa o 5-20 kDa). El peso molecular de cada cadena de PEG de cadena ramificada puede ser, pero no se limita a, entre aproximadamente 1000 Da y aproximadamente 100.000 Da o más. El peso molecular de cada cadena de PEG de cadena ramificada puede ser entre aproximadamente 1000 Da y aproximadamente 100.000 Da, pero no se limitan a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da y 1.000 Da. En general, al menos un terminal de la molécula de PEG está disponible para la reacción con el aminoácido codificado de manera no natural. Por ejemplo, los derivados de PEG que tienen porciones alquino y azida para la reacción con las cadenas laterales de aminoácidos pueden usarse para unir PEG a los aminoácidos codificados de manera no natural como se describe en el presente documento. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende una azida, entonces PEG puede contener, en general, ya sea una porción alquino para realizar la formación del producto de cicloadición [3+2] o una especie de PEG activada (es decir, éster, carbonato) que contiene un grupo fosfina para realizar la formación del enlace de amida. De manera alternativa, si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un alquino, entonces PEG puede contener, en general, una porción azida para realizar la formación del producto de cicloadición [3+2] Huisgen. Si el aminoácido codificado de manera no natural comprende un grupo carbonilo, PEG puede comprender, en general, un potente nucleófilo (que incluye, pero no se limita a, una funcionalidad de hidrazida, hidrazina, hidroxilamina o semicarbazida) para realizar la formación de los enlaces correspondientes de hidrazona, oxima y semicarbazona, respectivamente. En otras alternativas, se puede invertir la orientación de los grupos reactivos descritos anteriormente, es decir, una porción azida en el aminoácido codificado de manera no natural puede hacerse reaccionar con un derivado de PEG que contiene un alquino.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado con un derivado de PEG contiene una funcionalidad química que es reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona derivados de polímeros que contienen azida y acetileno que comprenden una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da. La estructura principal de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol). Sin embargo, cabe destacar que una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero no limitado a, poli(etilen)glicol y otros polímeros relacionados, que incluyen poli(dextrano) y poli(propilenglicol), son también adecuados para su uso en los polipéptidos de la presente descripción y que el uso del término PEG o poli(etilenglicol) pretende abarcar e incluir todas aquellas moléculas.
La estructura principal de polímero puede ser lineal o ramificada. En general, las estructuras principales de polímero ramificadas son conocidas en el estado de la técnica. En general, un polímero ramificado tiene una porción del núcleo de ramificación central y diversas cadenas de polímeros lineales ligadas al núcleo de ramificación central. El PEG ramificado también puede estar en forma de PEG bifurcado representado mediante PEG(--YCHZ2)n, en donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH mediante una cadena de átomos de longitud definida. El PEG colgante es aun otra forma bifurcada que tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a lo largo de la estructura principal de PEG en lugar de en el extremo de las cadenas de PEG.
Muchos otros polímeros son también adecuados para su uso en los polipéptidos de la presente divulgación. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) ("PPG"), copolímeros de los mismos (incluyendo pero no limitado a, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol), terpolímeros de los mismos, mezclas de los mismos y similares. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura principal de polímero puede variar, está, en general, en el intervalo de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100.000 Da, con frecuencia, de aproximadamente 6.000 Da a aproximadamente 80.000 Da. El peso molecular de cada cadena de la estructura principal del polímero puede ser entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100.000 Da, que incluye, pero no se limita a, 100.000 Da, 95.000 Da, 90.000 Da, 85.000 Da, 80.000 Da, 75.000 Da, 70.000 Da, 65.000 Da, 60.000 Da, 55.000 Da, 50.000 Da, 45.000 Da, 40.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 25.000 Da, 20.000 Da, 15.000 Da, 10.000 Da, 9.000 Da, 8.000 Da, 7.000 Da, 6.000 Da, 5.000 Da, 4.000 Da, 3.000 Da, 2.000 Da, 1.000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da y 100 Da.
Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse a los polipéptidos FGF-21 modificados de la divulgación. Los polímeros solubles en agua puedan estar unidos mediante un aminoácido codificado de manera no natural incorporado en el polipéptido FGF-21 modificado o cualquier grupo funcional o sustituyente de un aminoácido codificado de manera natural o no natural, o cualquier grupo funcional o sustituyente añadido a un aminoácido codificado de manera natural o no natural. De manera alternativa, los polímeros solubles en agua están unidos a un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural mediante un aminoácido no natural (que incluye, pero no se limita a, cisteína, lisina o el grupo amina del resto N-terminal). En algunos casos, los polipéptidos FGF-21 modificados de la descripción comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más aminoácido o aminoácidos codificados de manera no natural están unidos a polímero o polímeros solubles en agua (incluyendo pero no limitado a, PEG y/u oligosacáridos). En algunos casos, los polipéptidos FGF-21 modificados de la descripción también comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácido o aminoácidos codificados de manera natural unidos a polímeros solubles en agua. En algunos casos, los polipéptidos FGF-21 modificados de la descripción comprenden uno o más aminoácido o aminoácidos codificados de manera no natural unidos a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos no naturales unidos a polímeros solubles en agua. En algunas realizaciones, los polímeros solubles en agua usados en la presente divulgación mejoran la semivida en suero del polipéptido FGF-21 modificado con respecto a un compuesto comparador, tal como el polipéptido FGF-21 de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:201, el mismo polipéptido FGF-21 sin el polímero soluble en agua, u otro compuesto comparador descrito en otra parte en el presente documento.
La cantidad de polímeros solubles en agua unidos a un polipéptido FGF-21 modificado (es decir, el alcance de pegilación o glucosilación) de la presente divulgación puede ajustarse para proporcionar una característica farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica alterada (que incluye, pero no se limita a, un aumento o una disminución), tal como semivida in vivo. En algunas realizaciones, la semivida de FGF-21 modificado aumenta al menos aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 50 veces, o al menos aproximadamente 100 veces en un polipéptido no modificado.
Derivados de PEG que contienen un grupo nucleofílico fuerte (es decir, hidrazida, hidrazina, hidroxilamina o semicarbazida)
En una realización de la presente divulgación, un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo puede modificarse con un derivado de PEG que contiene una porción del terminal hidrazina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida que está ligada directamente a la estructura principal de PEG.
El grado y los sitios en los que los polímeros solubles en agua están unidos al polipéptido FGF-21 modificado pueden modular la unión del polipéptido FGF-21 modificado al receptor del polipéptido FGF-21. En algunas realizaciones, los enlaces se pueden disponer de modo que el polipéptido FGF-21 modificado se une al receptor del polipéptido FGF-21 con Kd de aproximadamente 400 nM o menos, con Kd de 150 nM o menos, y en algunos casos, con Kd de 100 nM o menos, según se mide mediante un ensayo de unión de equilibrio, tal como el que se describe en Spencer et al., J. Biol. Chem, 263:7862-7867 (1988) para FGF-21 modificado.
Los métodos y la química para la activación de polímeros así como para la conjugación de péptidos se describen en la bibliografía y son conocidos en el estado de la técnica. Los métodos comúnmente usados para la activación de polímeros incluyen, pero no se limitan a, activación de grupos funcionales con bromuro de cianógeno, peryodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina, etc. La pegilación (es decir, adición de cualquier polímero soluble en agua) de polipéptidos FGF-21 modificados que contienen un aminoácido codificado de manera no natural, tal como p-azido-L-fenilalanina, puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado, tal como aquellos descritos en la Patente de EE.UU. N.° 8.012.931. Un polímero soluble en agua enlazado a un aminoácido de un polipéptido FGF-21 modificado de la descripción también puede derivatizarse o sustituirse sin limitación.
En otra realización de la divulgación, un polipéptido FGF-21 modificado puede modificarse con un derivado de PEG que contiene una porción azida que puede reaccionar con una porción alquino presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural. En general, los derivados de PEG pueden tener un peso molecular promedio en el intervalo de 1-100 kDa y, en algunas realizaciones, de 10-40 kDa.
En algunas realizaciones, el derivado de PEG azida terminal puede tener la estructura:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
en donde R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio es de 5-40 kDa).
En otra realización de la divulgación, el derivado de PEG azida terminal puede tener la estructura:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-Na
en donde R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1.000 (es decir, el peso molecular promedio es de 5-40 kDa).
En otra realización de la divulgación, un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido que contiene alquino también puede modificarse con un derivado de PEG ramificado que contiene una porción azida terminal, en donde cada cadena de PEG ramificado tiene un MW en el intervalo de 10-40 kDa y puede ser de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el derivado de PEG del terminal azida puede tener la siguiente estructura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pNa
en donde R es un alquilo sencillo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1.000, y X es, opcionalmente, O, N, S o un grupo carbonilo (C=O), en cada caso en que pueda estar presente o ausente.
En otra realización de la divulgación, un polipéptido FGF-21 modificado puede modificarse con un derivado de PEG que contiene una porción alquino que puede reaccionar con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural.
En otra realización de la divulgación, un polipéptido FGF-21 modificado puede modificarse con un derivado de PEG que contiene un grupo funcional activado (que incluye, pero no se limita a, éster, carbonato) que también comprende un grupo aril fosfina que puede reaccionar con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido codificado de manera no natural.
Un polipéptido FGF-21 modificado puede conjugarse con PEG que contiene hidrazida mediante los siguientes ejemplos de métodos. Un polipéptido FGF-21 modificado que incorpora un aminoácido que contiene carbonilo (tal como pAcF) puede prepararse de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Una vez modificado, el PEG que contiene hidrazida que tiene la siguiente estructura puede conjugarse con el polipéptido FGF-21 modificado:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
en donde, por ejemplo, R = metilo, n=2 y N = 10.000 de MW, y X es un grupo carbonilo (C=O). El FGF-21 modificado purificado que contiene p-acetilfenilalanina se disuelve entre 0,1-10 mg/ml en MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0, o en acetato de sodio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, se hace reaccionar con un exceso de 1 a 100 veces de PEG que contiene hidrazida, y la hidrazona correspondiente se reduce in situ mediante la adición de reserva de NaCNBH3 1M (Sigma Chemical, St. Louis, MO), disuelta en H2O, hasta obtener una concentración final de 10-50 mM. Las reacciones se llevan a cabo en la oscuridad a 4 °C a TA durante 18-24 horas. Las reacciones se detienen mediante la adición de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) a aproximadamente pH 7,6 hasta obtener una concentración final de Tris de 50 mM o se diluyen en un tampón adecuado para la purificación inmediata.
Introducción de un aminoácido que contiene alquino en un polipéptido FGF-21 modificado y derivatización con Mpeg-Azida
Los polipéptidos FGF-21 modificados que contienen un aminoácido que contiene alquino pueden producirse y derivatizarse con Mpeg-Azida mediante los siguientes ejemplos de métodos. Una posición seleccionada puede sustituirse con el siguiente aminoácido codificado de manera no natural:
Figure imgf000057_0001
Las secuencias utilizadas para la incorporación específica de sitio de p-propargil-tirosina en FGF-21 modificado Tyr
pueden serSEQ ID NO: 1 (FGF-21), SEQ ID NO: 16 o 17 (muttARNt, mtARN CUA M.jannaschii), 22, 23 o 24 descritas anteriormente. El polipéptido FGF-21 modificado que contiene propargil-tirosina puede expresarse en E. coli y puede purificarse usando las condiciones descritas anteriormente para la purificación de un polipéptido FGF-21 modificado que contiene un aminoácido que contiene carbonilo.
El FGF-21 modificado purificado que contiene propargil-tirosina disuelto entre 0,1-10 mg/ml en tampón PB (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0,15 M, pH = 8) y un exceso de 10 a 1000 veces de PEG que contiene azida se añade a la mezcla de reacción. Después, se añade una cantidad catalítica de CuSO4 y alambre de Cu a la mezcla de reacción. Después de que la mezcla se incuba (por ejemplo, aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente o 37 °C, o durante la noche a 4 °C), se añade H2O, y la mezcla se filtra a través de una membrana de diálisis. La muestra puede analizarse para confirmar el rendimiento.
X. Proteínas de fusión que contienen polipéptidos FGF-21 modificados
La divulgación también proporciona polipéptidos FGF-21 modificados, o fragmentos de los mismos, que comprenden la secuencia del polipéptido FGF-21 modificado y un compañero de fusión. El compañero de fusión puede conferir una propiedad funcional, que incluye, pero no se limita a, la prolongación de la semivida, facilitar la purificación y/o fabricación de proteínas, propiedades biofísicas mejoradas, tales como el aumento de la solubilidad o estabilidad, e inmunogenicidad o toxicidad reducidas, o cualquier otro fin. Por ejemplo, la proteína de fusión puede exhibir semivida in vivo prolongada y, de esta manera, facilitar una dosis menos frecuente (por ejemplo, una dosis dos veces por semana, una vez por semana o una vez cada dos semanas, etc.) en un régimen terapéutico. Las proteínas de fusión de ejemplo comprenden un FGF-21 modificado fusionado a un compañero de fusión, tal como una albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano), adnectina de prolongación de farmacocinética (PKE), XTEN, dominio Fc, o un fragmento o una combinación de cualquiera de los anteriores. Una proteína de fusión puede producirse expresando un ácido nucleico que codifica la secuencia del polipéptido FGF-21 modificado y la secuencia de un compañero de fusión en el mismo marco de lectura, opcionalmente separados por una secuencia que codifica un péptido de conexión. La proteína de fusión puede comprender el polipéptido FGF-21 modificado y el compañero de fusión en cualquier orden, por ejemplo, uno o más compañeros de fusión unidos a N-terminal y/o C-terminal de la secuencia del polipéptido FGF-21 modificado, o uno o más compañeros de fusión unidos a N-terminal y/o C-terminal.
La fusión puede formarse uniendo un compañero de fusión a cualquier extremo (es decir, ya sea N- o C-terminal) de un polipéptido FGF-21 modificado, es decir, con una disposición compañero de fusión-FGF-21 modificado o FGF-21 modificado-compañero de fusión. Además, el polipéptido FGF-21 modificado puede fusionarse a uno o más compañeros de fusión en ambos extremos, opcionalmente, con un péptido de conexión en cualquiera de los extremos o en ambos extremos. En algunas realizaciones, el compañero de fusión y el FGF-21 modificado se fusionan mediante un péptido de conexión. Los péptidos de conexión de ejemplo pueden comprender o consistir en una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:74-100, 301 y 350-383, o una combinación de las anteriores (por ejemplo, dos, tres o más de las secuencias anteriores). Los péptidos de conexión de ejemplo pueden tener longitudes de entre 0 (es decir, sin presencia de péptido de conexión) y 100 o más aminoácidos, por ejemplo, entre al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y hasta 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos. Las longitudes no limitantes de un péptido de conexión de ejemplo incluyen entre 1 y 100 aminoácidos, 1 y 40 aminoácidos, entre 1 y 20 aminoácidos, entre 1 y 10 aminoácidos o entre 3 y 5 aminoácidos de longitud.
Un polipéptido FGF-21 modificado, o un fragmento del mismo, puede producirse como una proteína de fusión que comprende albúmina de suero humano (HSA) o una porción de la misma. Estas construcciones de fusión pueden ser adecuadas para mejorar la expresión del FGF-21 modificado, o un fragmento del mismo, en una célula hospedadora eucariota, tal como CHO, o en una bacteria, tal como E. coli. Las porciones de HSA de ejemplo incluyen el polipéptido N-terminal (aminoácidos 1-369, 1-419, y longitudes intermedias que comienzan con el aminoácido 1), como se desvela en la Patente de EE.UU. N.° 5.766.883 y en la publicación PCT WO 97/24445. En algunas realizaciones, la proteína de fusión puede comprender una proteína HSA con un FGF-21 modificado, o fragmentos del mismo, unido a cada uno de los N- y C-terminales de HSA. Los construcciones de HSA de ejemplo se describen en la Patente de EE.UU. N.° 5.876.969. Los ejemplos de métodos de expresión de células de mamíferos de FGF-21 se describen en el documento WO 2005/091944.
El polipéptido FGF-21 modificado puede fusionarse a una molécula de XTEN. Las moléculas de XTEN también se denominan polímeros recombinantes no estructurados, polipéptidos recombinantes no estructurados (URP), y se describen, en general, en Schellenberger et al., Nat Biotechnol., diciembre de 2009; 27(12):1186-90, publicación de EE.UU. N.° 2012/0220011, Patente de EE.UU. N.° 7.846.445 y el documento WO/2012/162542. La semivida del polipéptido FGF-21 modificado puede modificarse variando la constitución de la molécula de XTEN, por ejemplo, variando su tamaño. Por ejemplo, una molécula de XTEN puede seleccionarse con el fin de lograr una semivida deseada, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 50 horas, por ejemplo, al menos 1, 2, 5, 10, 12, 15, 20 o 25 horas o más.
Las moléculas de XTEN de ejemplo incluyen un URP que comprende al menos 40 aminoácidos contiguos, en donde: (a) el URP comprende al menos tres tipos diferentes de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en restos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P), en donde la suma de dicho grupo de aminoácidos contenidos en el URP constituye más de aproximadamente el 80 % de los aminoácidos totales del URP, y en donde dicho URP comprende más de un resto de prolina, en donde dicho URP tiene sensibilidad reducida a la degradación proteolítica relacionada con la carencia correspondiente del URP de más de un resto de prolina; (b) al menos 50 % de los aminoácidos de dicho URP está desprovisto de estructura secundaria como lo determina el algoritmo de Chou-Fasman; y (c) la puntuación de Tepitope de dicho URP es menor a -5. Otras moléculas de XTEN de ejemplo comprenden un polímero recombinante no estructurado (URP) que comprende al menos aproximadamente 40 aminoácidos contiguos, y en donde (a) la suma de los restos de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P) contenidos en el URP constituye al menos un 80 % de los aminoácidos totales del URP, y el resto, cuando está presente, consiste en arginina o lisina, y el resto no contiene metionina, cisteína, asparagina y glutamina, en donde dicho URP comprende al menos tres tipos diferentes de aminoácidos seleccionados de glicina (G), aspartato (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) y prolina (P); (b) al menos 50 % de al menos 40 aminoácidos contiguos en dicho URP está desprovisto de estructura secundaria como lo determina el algoritmo de Chou-Fasman; y (c) en donde el URP tiene una puntuación de Tepitope menor a -4.
Otras moléculas de XTEN de ejemplo incluyen moléculas de rPEG. En algunas realizaciones, la molécula de rPEG puede no incluir un resto hidrófobo (por ejemplo, F, I, L, M, V, W o Y), un resto que contiene una amida de la cadena lateral (por ejemplo, N o Q) o un resto de la cadena lateral cargado de manera positiva (por ejemplo, H, K o R). En algunas realizaciones, la porción mejoradora puede incluir A, E, G, P, S o T. En algunas realizaciones, rPEG puede incluir glicina al 10-20 %, 20-30 %, 30-40 %, 40-50 %, 50-60 %, 60-70 %, 70-80 %, 80-90 %, 90-99 %, o incluso glicina al 100 %.
Dicha molécula de XTEN también puede estar ligada a polietilenglicol.
El término "PAS" y/o "PASilación" se refiere a la fusión genética de una proteína biofarmacéutica de interés, tal como el polipéptido FGF-21 modificado, con una secuencia de polipéptidos de conformación desordenada, compuesta por los aminoácidos Pro, Ala y Ser (por eso se denominan "polipéptido PAS" y "PASilación"). La PASilación puede aumentar la semivida en suero, aumentar la solubilidad, la estabilidad y/o la resistencia a la proteasa, y/o disminuir la inmunogenicidad de la proteína de interés, por ejemplo, la proteína de fusión (como referencia, véanse los documentos WO2008155134 A1 y US20140073563). Las secuencias de PAS pueden unirse mediante fusión génica a N-terminal, al C-terminal o a ambos términos de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGF-21 modificado. En algunas realizaciones, un polipéptido PAS puede comprender al menos dos dominios que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más restos de aminoácidos que forman una conformación de enrollamiento aleatorio, y en donde el segundo dominio comprende restos de alanina, serina y prolina, por medio de los cuales la conformación de enrollamiento aleatorio media un aumento de la estabilidad in vivo y/o in vitro de la proteína biofarmacéutica a la que el polipéptido PAS está fusionado. En algunas realizaciones, el segundo dominio que comprende restos de alanina, serina y prolina puede seleccionarse de ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (Se Q ID NO: 310); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 311); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 312), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 313), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 314), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 315) and ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 316). El polipéptido PAS puede contener uno o más sitios para la modificación covalente.
En realizaciones de ejemplo, el FGF-21 modificado se fusiona a una adnectina, por ejemplo, una adnectina PKE o de unión a albúmina. Las adnectinas de ejemplo se describen en la publicación de EE.UU. N.° 2011/0305663. Dicha adnectina puede estar basada en un dominio de fibronectina tipo III a la décima y se puede fijar a albúmina de suero. La adnectina puede comprender uno o más bucles BC que comprenden la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 45, un bucle DE que comprende la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 46, y un bucle FG que comprende la secuencia de aminoácidos que se indica en SEQ ID NO: 47, o comprende un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 y 52-72, o comprende un polipéptido al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % idéntico a SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 o 52-72, que corresponden, respectivamente, a SEQ ID NO 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20 y 24-44 de la publicación de EE.UU. N.° 2011/0305663.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado puede fusionarse a un dominio Fc de inmunoglobulina ("dominio Fc"), o un fragmento o variante del mismo, tal como la región Fc funcional. Una región Fc funcional se une a FcRn, pero no tiene función efectora. La capacidad de la región Fc o un fragmento de esta de unirse a FcRn puede determinarse mediante ensayos de unión convencionales conocidos en el estado de la técnica. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión de C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Las funciones efectoras pueden analizarse mediante varios ensayos conocidos en el estado de la técnica para evaluar tales funciones efectoras del anticuerpo.
En una realización de ejemplo de la divulgación, el dominio Fc deriva de una subclase IgG1; sin embargo, también pueden usarse otras subclases (por ejemplo, IgG2, IgG3 e IgG4). A continuación, se muestra un ejemplo de secuencia de un dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
kAKGQPREPQVYTLPPSRDELTIvNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMEIEALHNEIYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO.302)
En algunas realizaciones, la región Fc usada en la proteína de fusión puede comprender la región bisagra de una molécula Fc. Un ejemplo de la región bisagra comprende los restos bisagra del núcleo que abarcan las posiciones 1­ 16 (es decir, DKTHt Cp PCPAPELLG (SEQ ID n O:303)) de la secuencia del dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana de ejemplo que se proporcionó anteriormente. En ciertas realizaciones, la proteína de fusión puede adoptar una estructura multimérica (por ejemplo, dímero) que se debe, en parte, a los restos de cisteína en las posiciones 6 y 9 dentro de la región bisagra de la secuencia del dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana de ejemplo que se proporcionó anteriormente. En otras realizaciones, la región bisagra, como se usa en el presente documento, puede también incluir restos derivados de las regiones CH1 y CH2 que flanquean la secuencia bisagra del núcleo de la secuencia del dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana de ejemplo que se proporcionó anteriormente. Aun en otras realizaciones, la secuencia bisagra puede comprender o consistir en GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO:304).
En algunas realizaciones, la secuencia bisagra puede incluir una o más sustituciones que confieren propiedades farmacocinéticas, biofísicas y/o biológicas deseables. Algunas secuencias bisagra de ejemplo incluyen EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:305), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:308) y DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:309). En una realización de la divulgación, el resto P en la posición 18 de la secuencia del dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana de ejemplo que se proporcionó anteriormente puede reemplazarse por S para retirar la función efectora de Fc; este reemplazo se ejemplifica en las bisagras que tienen las secuencias EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307) y DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID No :309). En otra realización de la divulgación, los restos DK en las posiciones 1-2 de la secuencia del dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana de ejemplo que se proporcionó anteriormente pueden reemplazarse por GS para retirar un posible sitio de truncamiento; este reemplazo se ejemplifica en la secuencia EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307). En otra realización de la divulgación, el C en la posición 103 de la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana (es decir, los dominios CH1--CH3) puede reemplazarse por S para prevenir la formación inadecuada del enlace de cisteína en ausencia de una cadena liviana; este reemplazo se ejemplifica en las secuencias EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:305), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306) y EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307).
Otras secuencias adicionales Fc de ejemplo incluyen las siguientes:
hIgG1a_191 [subtipo A]
d k t h t c p p c p a p e l l g g p s v f l f p p k p k d t l m is r t p e v t c v w d v s h e d p e v k f
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLFIQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTkNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTFPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:323)
hIgG1a_189 [hIgG1a_191 sans "GK" en el C-terminal; subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTICPREEQYNSTYRWSVLWLF1QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSK.LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
(SEQ ID NO:324)
hIgG1a_191b [subtipo A/F]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVFTNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLFIQDWLNGKEYKCKVSNRALPAPIEKTTS
ICAKGQPREPQVYTLPPSRDEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDRSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYtQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:325)
hIgG1f_1.1_191 [contiene 5 mutaciones puntuales para alterar la función de ADCC, subtipo F]
Figure imgf000061_0001
hIgG1f_1.1_186 [contiene 5 mutaciones puntuales para alterar la función de ADCC y C225S (numeración Edlemen); subtipo F]
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDF EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIE KTISKAK.GQPREPQVYTLPPSREEMTRNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTYT>KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:327)
hIgG1a_(N297G)_191 [subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLBQDWLNGKEYICCKVSNKALPAPIEKT1S KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:328)
hIgG1a_190 [hIgG1a_190 sans "K" en el C-terminal; subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK.VSNKALPAP1EKT1S KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:329)
hIgG1a_(N297Q)_191 [subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC'VVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCRVSNKALPAPIElCnS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDLAVEWESNGQPENNY’KTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:330)
hIgG1a_(N297S)_191 [subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAK.TKPREEQYSSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYICCKVSNKAEPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDEL.TKNQVSLTCLVIvGFYPSDIAVE'WESNCQPENNYKXI PPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVIVIHEAEHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:3311
hIgG1a_(N297A)_191 [subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK.CItVSNKALPAPlEKTlS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSR YVQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:332)
hIgG1a_(N297H)_191 [subtipo A]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF
NWYVDG V E V FINAKTKPREEQ YFIST YRVV S VLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKT1S
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDiAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDRSRWQQGNYTSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:333)
hIgG4
DKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQE
DPEVQFNWYVDGVEVFINAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS
LERTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:334)
hIgG4_(S241P)
DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQE
DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:335)
En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 302 y 323-335. Debe comprenderse que la lisina C-terminal de un dominio Fc es un componente opcional de una proteína de fusión que comprende un dominio Fc. En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 302 y 323-335, excepto que la lisina C-terminal de este se omite. En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 302. En algunas realizaciones, el dominio Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 302, excepto que la lisina C-terminal de este se omite.
En algunas realizaciones, se produce el polipéptido FGF-21 modificado que comprende una secuencia de unión a albúmina. Los ejemplos de secuencias de unión a albúmina incluyen, pero no se limitan a, el dominio de unión a albúmina de la proteína estreptocócica G (véase, por ejemplo, Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:534-542 (1996) y Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)), o péptidos que se fijan a albúmina, tales como aquellos descritos, por ejemplo, en Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).
En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción se acilan con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven la unión a albúmina de suero. Véase, por ejemplo, Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995).
En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se fusionan directamente con albúmina de suero (que incluye, pero no se limitan a, albúmina de suero humano). Las personas expertas en la materia reconocerán que una amplia diversidad de otras moléculas también puede enlazarse a los FGF-21 modificados de la presente descripción para modular la unión a albúmina de suero u otros componentes séricos.
XI. Glucosilación de polipéptidos FGF-21 modificados y no modificados
La presente descripción incluye polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden uno o más aminoácidos codificados de manera no natural que tienen restos de sacáridos. Los restos de sacáridos pueden ser naturales (incluyendo pero no limitado a, N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero no limitado a, 3-fluorogalactosa). Los sacáridos pueden estar unidos a los aminoácidos codificados de manera no natural ya sea por un enlace glucosídico enlazado por N u O (que incluye, pero no se limita a, N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace no natural (que incluye, pero no se limita a, una oxima o el glucósido unido por C o S correspondiente).
Las porciones sacárido (incluyendo pero no limitado a, glucosilo) pueden añadirse a polipéptidos FGF-21 modificados ya sea in vivo o in vitro. En algunas realizaciones de la presente descripción, un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo puede modificarse con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glucosilado correspondiente enlazado mediante un enlace de oxima. Una vez que se unió al aminoácido codificado de manera no natural, el sacárido se puede elaborar adicionalmente mediante tratamiento con glucosiltransferasas y otras enzimas para generar un oligosacárido unido al polipéptido FGF-21 modificado. Véase, por ejemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).
En algunas realizaciones de la presente descripción, un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene carbonilo puede modificarse directamente con un glucano con estructura definida preparado como un derivado de aminooxi. Otras funcionalidades, que incluyen azida, alquino, hidrazida, hidrazina y semicarbazida, pueden usarse para enlazar el sacárido al aminoácido codificado de manera no natural.
En algunas realizaciones de la presente descripción, un péptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural que contiene azida o alquinilo puede modificarse, incluyendo pero no limitado a, mediante una reacción de cicloadición de Huisgen [3+2] con, incluyendo pero no limitado a, derivados de alquinilo o azida, respectivamente.
XII. Dímeros y multímeros de FGF-21
La presente divulgación también proporciona combinaciones de FGF-21 y FGF-21 modificados, tales como homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros (es decir, trímeros, tetrámeros, etc.), en donde el FGF-21 modificado que contiene uno o más aminoácidos codificados de manera no natural está unido a otro FGF-21 o FGF-21 modificado, o una variante de los mismos, o a cualquier otro polipéptido que no sea FGF-21, FGF-21 modificado o una variante de estos, ya sea directamente a la estructura principal del polipéptido o mediante un enlazador. Debido a su peso molecular alto en comparación con los monómeros, los conjugados de dímeros o multímeros de FGF-21 pueden exhibir propiedades nuevas o deseadas, incluyendo pero no limitado a, diferente semivida terapéutica modulada, farmacológica, farmacocinética, farmacodinámica, o semivida plasmática modulada con respecto al FGF-21 monomérico. En algunas realizaciones, los dímeros de FGF-21 modificados de la presente descripción pueden modular la transducción de señal del receptor de FGF-21. En otras realizaciones, los dímeros o multímeros de FGF-21 modificados de la presente descripción pueden actuar como antagonistas, agonistas o moduladores del receptor de FGF-21.
XIII. Medición de la actividad del polipéptido FGF-21 y de la afinidad del polipéptido FGF-21 al receptor de polipéptido FGF-21
Se demostró que el FGF-21 estimula la absorción de glucosa y mejora la sensibilidad a la insulina en adipocitos 3T3-L1, en un modelo in vitro utilizado para el estudio del metabolismo del tejido adiposo como se muestra en el Ejemplo 3 de la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780. Una característica de la diabetes tipo 2 es la deficiencia de absorción de glucosa en varios tipos de tejidos, incluso el tejido adiposo. Por lo tanto, el FGF-21 modificado puede ser útil para tratar la diabetes tipo 2, ya que disminuye los niveles de glucosa en sangre. Además, el FGF-21 modificado puede ser útil para tratar la obesidad, ya que aumenta el gasto energético debido al uso más rápido y efectivo de glucosa. Además, se demostró que el FGF-21 estimula la absorción de glucosa en adipocitos 3T3-L1 de manera independiente de la insulina, lo cual indica que también es útil para tratar diabetes tipo 1. Véase la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780. Se demostró que el FGF-21 estimula la absorción de glucosa en adipocitos 3T3-L1 en una manera dependiente de la concentración en una concentración de insulina subóptima (5 nM) y en ausencia de insulina en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780. Además, FGF-21 induce la absorción de glucosa en un modelo de tejido ex vivo, descrito en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780.
Los polipéptidos FGF-21 modificados pueden someterse a ensayos para determinar la actividad biológica. En general, la prueba para determinar la actividad biológica debe proporcionar un análisis para el resultado deseado, tal como el aumento o la disminución de la actividad biológica, actividad biológica diferente, análisis de afinidad del receptor o del componente de unión, cambios estructurales o conformacionales de FGF-21 modificado o su receptor o análisis de la semivida en suero, en comparación con FGF-21 no modificado u otro compuesto comparador como se describe en otra parte en el presente documento.
Los ejemplos de métodos para la diferenciación de 3T3-L1 a adipocitos y el ensayo de absorción de glucosa se describen en la Patente de EE.UU. N.° 8.012.931.
XIV. Medición de la potencia, semivida in vivo funcional y parámetros farmacocinéticos
Un aspecto de la presente divulgación es la semivida biológica prolongada que puede obtenerse mediante la construcción del polipéptido FGF-21 modificado, que puede conjugarse con una porción de polímero soluble en agua o fusionar a un compañero de fusión. La rápida disminución posterior a la administración de las concentraciones en suero de polipéptido FGF-21 hizo que fuera de importancia terapéutica evaluar las respuestas biológicas al tratamiento con el polipéptido FGF-21 modificado. El polipéptido FGF-21 modificado de la presente divulgación puede prolongar las semividas en suero también después de la administración, por ejemplo, la administración por vía subcutánea o intravenosa, lo cual permite la medición, por ejemplo, mediante método ELISA o un ensayo de evaluación primario. La medición de la semivida biológica in vivo se lleva a cabo como se describe en el presente documento.
La potencia y la semivida in vivo funcional del polipéptido FGF-21 modificado que comprende una deleción interna y/o un aminoácido codificado de manera no natural pueden determinarse de acuerdo con los protocolos conocidos por las personas expertas en la materia y como se describe en el presente documento.
En un ensayo de ejemplo, los parámetros farmacocinéticos de un polipéptido FGF-21 modificado o no modificado descrito en el presente documento pueden evaluarse en ratas macho Sprague-Dawley normales (N=5 animales por grupo de tratamiento). Los animales pueden recibir una dosis única de 25 ug/rata por vía intravenosa o 50 ug/rata por vía subcutánea, y se toman aproximadamente 5-7 muestras de sangre de acuerdo con un curso de tiempo predeterminado, en general, que cubre aproximadamente 6 horas para un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural no conjugado con un polímero soluble en agua, y aproximadamente 4 días para un polipéptido FGF-21 modificado que comprende un aminoácido codificado de manera no natural y conjugado con un polímero soluble en agua. Los datos farmacocinéticos para un FGF-21 modificado pueden compararse con un compuesto comparador, tal como un polipéptido FGF-21 de tipo silvestre de SEQ ID NO:1, el polipéptido FGF-21 modificado de SEQ ID NO:201, el mismo polipéptido FGF-21 modificado que carece de una deleción interna u otro compuesto comparador descrito en el presente documento.
Los parámetros farmacocinéticos también pueden evaluarse en un primate, por ejemplo, macaco. En general, se administra una inyección única ya sea por vía subcutánea o intravenosa, y los niveles de FGF-21 en suero se controlan en el transcurso de un tiempo.
Los polipéptidos de la presente descripción pueden usarse para tratar a mamíferos que padecen diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM: tipo 2), diabetes insulinodependiente (tipo 1), así como obesidad, depuración inadecuada de glucosa, hiperglucemia, hiperinsulinemia, y similares. FGF-21 es eficaz en modelos de animales de diabetes y obesidad, como se muestra en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 20040259780. Como los perfiles metabólicos difieren entre diversos modelos de animales de obesidad y diabetes, se llevó a cabo el análisis de varios modelos para separar los efectos de la hiperinsulinemia, la hiperglucemia y la obesidad. Los ratones con diabetes (db/db) y con obesidad (ob/ob) se caracterizan por obesidad mórbida, hiperfagia, hiperglucemia variable, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia y termogénesis defectuosa (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, 4.a ed., 1990), pp. 299-340). Sin embargo, la diabetes es mucho más grave en el modelo de db/db (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, 4.a ed., 1990), pp.
299-340). Las ratas Zucker (fa/fa) son gravemente obesas, hiperinsulinémicas y resistentes a la insulina (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin y D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, 4.a ed., 1990), pp. 299- 340), y la mutación fa/fa puede ser el equivalente de rata de la mutación db murina (Friedman et al., Cell 69:217-220, 1992; Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806, 1991). Los ratones Tubby (tub/tub) se caracterizan por obesidad, resistencia a la insulina moderada e hiperinsulinemia sin hiperglucemia significativa (Coleman et al., J. Heredity 81:424, 1990).
El modelo de glutamato monosódico (MSG) para la obesidad químicamente inducida (Olney, Science 164:719, 1969; Cameron et al., Cli. Exp. Pharmacol. Physiol. 5:41, 1978), en el que la obesidad es menos grave que en los modelos genéticos y se desarrolla sin hiperfagia, hiperinsulinemia ni resistencia a la insulina, también puede examinarse. Finalmente, el modelo de estreptozotocina (STZ) para la diabetes químicamente inducida puede probarse para examinar los efectos de la hiperglucemia en ausencia de obesidad. Los animales tratados con STZ tienen deficiencia de insulina y son gravemente hiperglucémicos (Coleman, Diabetes 31:1, 1982; E. Shafrir, en Diabetes Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva York, 4.a ed., 1990), pp. 299-340).
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden evaluarse en un modelo de choque séptico in vivo en ratones ob/ob. Véase la Publicación de Patente de EE.Uu . N.° 20050176631.
Métodos para el análisis de la fosforilación de ERK1/2 inducida por FGF-21
La fosforilación de ERK1/2 inducida por FGF-21 (polipéptidos FGF-21 modificados o de tipo silvestre que incluyen aquellos enlazados a un PEG u otro enlazador, polímero o molécula biológicamente activa) puede llevarse a cabo mediante los siguientes métodos de ejemplo:
Se siembran 293 células transfectadas de manera estable con Klotho beta humano a 100.000 células/pocillo (DMEM+10 % de FBS) en una placa recubierta con poli-Lys. El día siguiente, las células llegan a un 100 % de confluencia, el medio se aspira y se reemplaza por medio nuevo, y se incuban durante la noche. Después de 24 horas, las células se estimulan con el FGF-21 modificado o no modificado o el análogo de FGF-21 seleccionado usando un FGF21WT convencional. Cada compuesto individual se prepara mediante la dilución de los compuestos en PBS/1 % de BSA. Las células se tratan en triplicado durante 10 min a 37 °C en la incubadora. Después de 10 min, se aspiran cuidadosamente los medios de incubación de cada pocillo, y se añaden 40 ul de tampón de lisis Cell Signaling 1x frío que contiene inhibidores de proteasa/fosfatasa (cóctel PI, Na3VN4 y PMSF) a cada pocillo para producir lisados de células. Se coloca una placa de 96 pocillos en hielo durante 20 minutos y luego se centrifuga a 4000 rpm durante 10 min. Los lisados de células se congelan a -80 °C. Luego, cada muestra se descongela y se añaden 10 ul de lisados de células a una placa tratada en MSD recubierta con anticuerpo que captura las formas fosforiladas y no fosforiladas de ERK1/2. La incubación con el anticuerpo primario se produce durante 2 h, luego la placa se lava varias veces con tampón específico, y luego se añade el anticuerpo secundario. Después de 1 hora, la placa de incubación se vuelve a lavar varias veces. Se añade tampón para lectura a cada pocillo. La placa se transfiere a una máquina lectora MSD. La curva que se produce se basa en las unidades de lectura ERK1/2 antifosforilada, y el EC50 se calcula usando Sigma Plot. La pérdida de la actividad se calcula dividiendo el EC50 del compuesto de prueba con el EC50 de aquel de tipo silvestre.
Determinación de las propiedades farmacocinéticas de los polipéptidos FGF-21 modificados en ratas
Estos ejemplos de métodos pueden usarse para medir las propiedades farmacocinéticas de compuestos de FGF-21 modificado y nativo en ratas cateterizadas. La farmacocinética de los artículos de prueba se evalúa mediante ELISA específico para FGF-21 humano de muestras de suero obtenidas en puntos temporales específicos después de la dosificación del fármaco.
A doce (12) ratas Sprague-Dawley (SD) macho que pesan aproximadamente 250-275 gramos al inicio del estudio, se les colocan quirúrgicamente catéteres en la vena yugular. Los animales están en buenas condiciones y deben haberse aclimatado al lugar del estudio durante al menos 3 días antes del inicio del estudio. Las ratas se pesan el día de la administración del artículo de prueba. Los animales se albergan en condiciones estándares libres de patógenos, y se les suministran alimentos y agua a demanda.
Los compuestos se administran por vía subcutánea, por ejemplo, a 0,25 mg/kg.
Los animales se pesan antes de la administración del artículo de prueba. Los compuestos se formulan de modo que se administran a 1X peso corporal en |jl. La administración por vía subcutánea del artículo de prueba se inyecta en la región escapular dorsal. Los animales reciben una inyección única del artículo de prueba (tiempo=0). En puntos temporales seleccionados, se extrae sangre de los animales, se recolecta en tubos de recolección Microtainer SST. Puede coagularse el suero durante 30 minutos antes de la centrifugación. El suero puede transferirse a tubos de titulación de polipropileno, sellados con microcintas, que se almacenan a -80 °C hasta que se analizan mediante ELISA para determinar las concentraciones en suero de FGF-21 modificado o no modificado.
Cada animal puede usarse para un curso de tiempo PK completo. Se pueden extraer aproximadamente 0,25 ml de sangre de los catéteres en las venas yugulares. Inmediatamente después de la recolección de sangre, los catéteres pueden purgarse con 0,1 ml de solución salina. Los siguientes puntos temporales de recolección para los animales que reciben el material del artículo de prueba deben seleccionarse, pero pueden modificarse basándose en el perfil farmacocinético anticipado de los artículos de prueba:
Pre-sangrado, 1, 2, 4, 8, 24, 32 48, 56, 72 y 96 horas después de la dosis. Los parámetros farmacocinéticos se determinan para cada compuesto de prueba, los cuales pueden incluir Lambda_z, Lambda_z_inferior, Lambda_z_superior, HL_Lambda_z, Tmáx, Cmáx, C0, AUCINF_obs, Vz_obs, Cl_obs, MRTINF_obs y/o Vss_obs.
Estudios in vivo de FGF-21 modificado en ratas ZDF
Se administra FGF-21 modificado, FGF-21 no modificado y solución tampón a ratones o ratas. Los resultados muestran la actividad y la semivida de los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación en comparación con FGF-21 no modificados.
El documento WO 2005/091944 describe estudios farmacocinéticos que pueden llevarse a cabo con compuestos de FGF-21, tales como los compuestos de la presente divulgación. Se administra un polipéptido FGF-21 modificado de la presente divulgación mediante vía intravenosa o subcutánea a ratones. Se extrae sangre de los animales antes de la dosis y en determinados puntos temporales posteriores a esta. Se recolecta plasma de cada muestra y se analiza mediante radioinmunoensayo. La semivida de deleción se puede calcular y comparar entre polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden una deleción interna y/o un aminoácido codificado de manera no natural o compañero de fusión, y FGF-21 de tipo silvestre o diversas formas de polipéptidos FGF-21 de la presente divulgación. De manera similar, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden administrarse a macacos. Se extrae sangre de los animales antes de la dosis y en determinados puntos temporales posteriores a esta. Se recolecta plasma de cada muestra y se analiza mediante radioinmunoensayo.
Los polipéptidos de la presente divulgación pueden administrarse a ratas macho ZDF (ratas obesas diabéticas; de 8 semanas de vida al inicio del estudio, Charles River-GMI). A las ratas, se les suministra alimento Purina 5008 a demanda. Se configuran los siguientes grupos de prueba: Solución salina; Insulina 4 U/día; FGF-21 modificado o no modificado, 500 ug/día Aguda (el grupo de dosificación Aguda recibe la dosis una vez, y se les extrae sangre T=0, 2, 4, 8 y 24 horas después de la dosis); FGF-21 modificado o no modificado, 100 ug/día; FGF-21 modificado o no modificado, 250 ug/día; FGF-21 modificado o no modificado, 500 ug/día; FGF-21 modificado o no modificado (una vez/día) 500 ug/ml; Magros Solución salina; Magros Insulina 4U/día; Magros FGF-21 modificado o no modificado 500 ug/día. Los grupos magros representan ratas ZDF magras no diabéticas.
Los compuestos se inyectan por vía subcutánea (dos veces al día), excepto por el segundo grupo de 500 ug/día, que recibe una inyección por día durante el curso del estudio (7 días). Las ratas de control reciben una inyección de vehículo (PBS; 0,1 ml). En los siguientes 7 días de dosificación, los animales se someten a una prueba de tolerancia a la glucosa oral. Se recolecta sangre para determinar los niveles de glucosa y triglicéridos mediante un corte en la punta de la cola sin anestésico. Los polipéptidos FGF-21 modificados pueden reducir los niveles de glucosa en plasma en una manera dependiente de la dosis. Además, las ratas ZDF magras pueden no volverse hipoglucémicas después de la exposición a los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción en comparación con ratas que recibieron dosis de insulina.
Estudios in vivo de FGF-21 modificado en modelos de obesidad ob/ob
El modelo de ratón ob/ob es un modelo animal de hiperglucemia, resistencia a la insulina y obesidad. Los niveles de glucosa en plasma después del tratamiento con polipéptido FGF-21 modificado o no modificado en comparación con los grupos de control de vehículo e insulina se pueden medir en ratones ob/ob. En este modelo de obesidad, los grupos de prueba de ratones macho ob/ob (7 semanas de vida) reciben una inyección de vehículo solo (PBS), insulina (4 U/día) o polipéptido FGF-21 modificado o no modificado (5 pg/día y 25 pg/día) por vía subcutánea (0,1 ml, dos veces por día) durante siete días. Se recolecta sangre mediante un corte en la punta de la cola en los días 1, 3 y 7, una hora después de la primera inyección de compuesto, y los niveles de glucosa en plasma se miden usando un protocolo convencional. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación estimulan la absorción de glucosa si reducen los niveles de glucosa en plasma en comparación con el grupo de control de vehículo. Los niveles de triglicéridos pueden compararse después del tratamiento con los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción en comparación con otras moléculas. El polipéptido puede administrarse a los ratones mediante múltiples dosis, infusión continua o una dosis única, etc.
Evaluación farmacocinética de polipéptidos FGF21 modificados:
Las propiedades farmacocinéticas de FGF-21 modificado con diferentes sitios de conjugación con PEG se evalúan en ratas. Otros parámetros estudiados son el peso molecular de PEG, así como la dosis del compuesto administrado. Se determina el porcentaje de biodisponibilidad.
Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee. Las ratas macho Sprague-Dawley (175-300 g) se obtienen de Charles River Laboratories. Las ratas se albergan individualmente en jaulas, en habitaciones con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad y se aclimatan al terrario durante al menos 3 días antes de la experimentación. Los animales tienen acceso a alimento para roedores 5001 certificado de Purina y agua a demanda.
Se colocan quirúrgicamente catéteres en la vena yugular para recolectar muestras de sangre. Después de la colocación exitosa de los catéteres, los animales se asignan a grupos de tratamiento antes de la dosificación. Se administra una dosis única de compuesto por vía intravenosa o subcutánea en un volumen de dosis de 1 ml/kg. Las concentraciones de dosis del compuesto se derivan por dilución en PBS usando la concentración de reserva como se asigna en el certificado de aptitud. Las muestras de sangre se recolectan en diferentes puntos temporales mediante el catéter permanente y se colocan en tubos Microfuge SST. Después de la centrifugación, se recolecta el suero y se almacena a -80 °C hasta el análisis.
El ensayo para cuantificar FGF-21 modificado en suero de rata Sprague-Dawley se lleva a cabo de la siguiente manera. Se recubren los pocillos de microplacas con anticuerpo policlonal IgG FGF-21 antihumano de cabra (PAb; RnD Systems, clon AF2539) que se usa como reactivo de captura. Las muestras convencionales (STD) y de control de calidad (QC), preparadas añadiendo FGF-21 modificado o no modificado a suero de rata Sprague Dawley al 100 %, y las muestras de estudio se cargaron en los pocillos después de tratarlas previamente 1:100 con tampón I-Block. El FGF-21 modificado o no modificado en las muestras STD, QC y de estudio es capturado por el PAb inmovilizado. Los materiales no unidos se retiran lavando los pocillos. El PAb IgG FGF-21 antihumano de cabra biotinilado (RnD Systems, clon BAF2539) se añade a los pocillos, seguido de una etapa de lavado y la adición de estreptavidinaperoxidasa de rábano (SA-HRP; RnD Systems, n.° de catálogo DY998) para detectar el FGF-21 modificado o no modificado capturado. Después de otra etapa de lavado, se añade solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB, Kirkegaard Perry Laboratories) a los pocillos. La TMB reacciona con el peróxido en presencia de HRP y produce una señal colorimétrica proporcional a la cantidad de FGF-21 (FGF-21 modificado o de tipo silvestre) unida al reactivo de captura en la etapa inicial. El desarrollo del color se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico 2 N, y la intensidad del color (densidad óptica, OD) se mide a 450 nm. La conversión de unidades de OD para las muestras del estudio y las muestras de QC en concentración se logra mediante una comparación mediada por un software informático con una curva patrón en la misma placa, que se somete a regresión de acuerdo con un modelo de regresión logística de 5 parámetros usando el paquete de reducción de datos SOFTmax Pro v5. Los resultados se informan en unidades de concentración de ng/ml.
Las concentraciones también pueden medirse mediante un ensayo tipo sándwich de anticuerpos dobles u otros métodos conocidos por las personas expertas en la materia. Las concentraciones se calculan usando una curva patrón generada del compuesto dosificado correspondiente. Los parámetros farmacocinéticos se estiman usando el programa de modelado WinNonlin (Pharsight, versión 4.1). Se usa el análisis no compartimental para los datos de los animales individuales con integración trapezoidal lineal hacia arriba/logarítmica hacia abajo, y los datos de concentración se ponderan uniformemente.
XV. Administración y composiciones farmacéuticas
La divulgación también proporciona composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido FGF-21 modificado, descrito en el presente documento, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo o excipiente incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y/o combinaciones de los mismos. La formulación se prepara según el modo de administración. En general, los métodos para administrar proteínas son conocidos por las personas expertas en la materia y pueden aplicarse a la administración de los polipéptidos de la presente descripción.
En una realización de la invención, un polipéptido FGF-21 modificado se administra a un paciente en una concentración de entre 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal del paciente receptor. En una realización de la invención, un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede administrarse a un paciente en una concentración de entre 0,5-5 mg/kg de peso corporal del paciente receptor. En otra realización de la invención, un polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede administrarse a un paciente receptor con una frecuencia de entre una vez por día y una vez cada dos semanas, por ejemplo, aproximadamente una o dos veces por semana, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días o una vez cada seis días.
Debe comprenderse que la concentración del polipéptido FGF-21 modificado administrado a un paciente determinado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administración de ejemplo establecidas anteriormente.
En función de la información proporcionada en la presente divulgación, una persona experta en la materia será capaz de determinar una dosis y frecuencia de administración eficaces mediante experimentos de rutina, por ejemplo, guiándose por la descripción en el presente documento y las explicaciones en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Filadelfia: Lippincott Williams & Wilkins; y Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Filadelfia, Pa., (etc.): Lippincott Williams & Wilkins.
Las cantidades promedio de FGF-21 modificado pueden variar y, en particular, deben basarse en las recomendaciones y la receta de un médico calificado. La cantidad exacta de FGF-21 modificado es una cuestión de preferencia sujeta a factores, tales como el tipo exacto de afección que se trata, la afección del paciente que se trata, así como los otros ingredientes de la composición. La presente descripción también proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de otro principio activo. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad que debe administrarse.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Estas composiciones se pueden formular específicamente para la administración mediante una o más vías de administración, incluyendo pero no limitado a, bucal, epicutánea, epidural, inhalación, intraarterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal mediante un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosa. Además, la administración puede ser mediante inyección, polvo, líquido, gel, gotas y otros medios de administración.
Como se usa en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, que son fisiológicamente compatibles. En una realización de la divulgación, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. De manera alternativa, el vehículo puede ser adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede estar presente en una forma liofilizada. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para obtener una concentración farmacológica alta. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La divulgación además contempla la inclusión de un estabilizante en la composición farmacéutica. La correcta fluidez puede mantenerse, por ejemplo, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos.
En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Al incluir un agente tal como sales de monoestearato y gelatina, la absorción de las composiciones inyectables puede prolongarse. Además, el polipéptido puede formularse en una formulación de liberación programada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que pueden proteger el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros poliglicólicos polilácticos (PLG). Muchos de los métodos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por las personas expertas en la técnica.
Los polipéptidos FGF-21 modificados y las composiciones de la presente descripción pueden administrarse mediante cualquier vía de administración convencional adecuada para proteínas o péptidos, incluyendo pero no limitado a, inyecciones, por ejemplo, parenterales, e incluyen, pero no se limitan a, subcutáneas o intravenosas, o cualquier otra forma de inyección o infusión. Las composiciones de polipéptidos pueden administrarse mediante varias vías de administración, incluyendo pero no limitado a, la administración por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, subcutánea, tópica, sublingual o rectal. Las composiciones que comprenden FGF-21 modificado también pueden administrarse mediante liposomas. El polipéptido FGF-21 modificado puede usarse solo o combinado con otros componentes adecuados, tales como un vehículo farmacéutico. El polipéptido FGF-21 modificado puede usarse combinado con otros agentes, incluyendo pero no limitado a, un agente antidiabético oral.
La expresión "agente antidiabético" significa cualquier fármaco útil para tratar, prevenir o, de otro modo, reducir la gravedad de cualquier trastorno del metabolismo de la glucosa, o cualquiera de sus complicaciones, que incluyen cualquiera de las afecciones, enfermedades o complicaciones descritas en el presente documento. Los agentes antidiabéticos incluyen insulina, tiazolidindionas, sulfonilureas, derivados de ácido benzoico, inhibidores de alfaglucosidasa, o similares.
Los fármacos o agentes antidiabéticos actuales usados para controlar la diabetes y los síndromes precursores, tales como la resistencia a la insulina, que son conocidos en el estado de la técnica, incluyen cinco clases de compuestos: biguanidas, por ejemplo, metformina; tiazolidindionas, por ejemplo, troglitazona; sulfonilureas, por ejemplo, tolbutamida y gliburida; derivados de ácido benzoico, por ejemplo, repaglinida; e inhibidores de glucosidasa. Además de estos agentes, varios otros tratamientos pueden usarse en combinación con los polipéptidos FGF-21 de la presente descripción para mejorar el control de la glucosa, incluyendo pero no limitado a, inhibidores de DPP-4. Los compuestos inhibidores de DPP-4 de partida que se probaron en ensayos clínicos incluyen vildagliptina (Galvus) (LAF237), sitagliptina (Januvia), saxagliptina y alogliptina, compuesto de Novartis 1-[[[2-[(5-danopiridin-2-il)amino] etil]amino]acetil]-2- ciano-(S)-pirrolidina (NVP DPP728).
Otra categoría de agentes antidiabéticos son los inhibidores de carnitina palmitoil-transferasa I (CPT-I), tales como etomoxir.
Otros agentes antidiabéticos conocidos incluyen preparaciones de insulina (por ejemplo, preparaciones de insulina animal extraída de páncreas de bovinos y porcinos; preparaciones de insulina humana sintetizada genéticamente usando Escherichia coli, levadura; insulina zinc; insulina zinc protamina; fragmento o derivado de insulina (por ejemplo, INS-1), preparación de insulina oral), sensibilizadores de insulina (por ejemplo, pioglitazona o una sal de la misma (preferentemente, clorhidrato), rosiglitazona o una sal de la misma (preferentemente, maleato), Netoglitazone, Rivoglitazone (CS-011), FK-614, el compuesto descrito en WO01/38325, Tesaglitazar (AZ-242), Ragaglitazar (N,N-622), Muraglitazar (BMS-298585), edaglitazona (BM-13-1258), Metaglidasen (MBX-102), Naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131(T-131), THR-0921), inhibidores de a-glucosidasa (por ejemplo, voglibosa, acarbosa, miglitol, emiglitate, etc.), biguanidas (por ejemplo, fenformina, metformina, buformina o una sal de los mismos (por ejemplo, clorhidrato, fumarato, succinato)), secretagogos de insulina [sulfonilurea (por ejemplo, tolbutamida, glibenclamida, gliclazida, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, gliclopiramida, glimepirida, glipizida, glibuzol), repaglinida, nateglinida, mitiglinida o hidrato de sal de calcio de los mismos], inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (por ejemplo, vidagliptina (LAF237), P32/98, sitagliptina (MK-431), P93/01, PT-100, saxagliptina (BMS-477118), T-6666, TS-021), agonistas de p3 (por ejemplo, AJ-9677), agonistas de GPR40, polipéptidos tipo glucagón (I) (glp I), (glp2), y otras hormonas peptídicas diabetogénicas, agonistas del receptor de GLP-1 [por ejemplo, GLP-1, agente GLP-1MR, N,N-2211, AC-2993 (exendin-4), BIM-51077, Aib(8.35)hGLP-1 (7,37)NH2, CJC-[131], agonistas de amilina (por ejemplo, pramlintida), inhibidores de fosfotirosina fosfatasa (por ejemplo, vanadato de sodio), inhibidores de la gluconeogénesis (por ejemplo, inhibidores de glucógeno fosforilasa, inhibidores de glucosa-6-fosfatasa, antagonistas de glucagón), inhibidores de SGLT2 (cotransporte de sodio-glucosa) (por ejemplo, T-1095), inhibidores de 11phidroxiesteroide deshidrogenasa (por ejemplo, BVT-3498), adiponectina o agonistas de la misma, inhibidores de IKK (por ejemplo, AS-2868), fármacos mejoradores de la resistencia a la leptina, agonistas del receptor de somatostatina (compuestos descritos en WO01/25228, WO03/42204, WO98/44921, WO98/45285, WO99/2273.5 etc.), activadores de glucoquinasa (por ejemplo, Ro-28-1675), GIP (péptido insulinotrópico dependiente de glucosa) y similares.
El FGF-21 modificado también se puede fabricar en formulaciones en aerosol (es decir, pueden "nebulizarse") para la administración mediante inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, por vía de administración intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones inyectables estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación se torne isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las formulaciones de FGF-21 modificado se pueden presentar en recipientes sellados de dosis única o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales.
La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente divulgación, es suficiente para tener una respuesta terapéutica favorable en el paciente en el transcurso de un tiempo, u otra actividad adecuada, según la aplicación. La dosis se determina por la eficacia de la formulación, y la actividad, estabilidad o semivida en suero del polipéptido FGF-21 modificado usado y el estado del paciente, así como el peso corporal o área de superficie del paciente que se trata.
La dosis administrada, por ejemplo, a un paciente de 70 kilogramos, está, en general, dentro del intervalo equivalente a las dosificaciones de proteínas terapéuticas que se usan en la actualidad, ajustada según la actividad alterada o la semivida en suero de la composición relevante.
Para la administración, las formulaciones de la presente descripción se administran a una frecuencia determinada por la LD-50 o ED-50 de la formulación relevante y/o la observación de cualquier efecto secundario de los polipéptidos FGF-21 modificados en diversas concentraciones, incluyendo pero no limitado a, como se aplican a la masa y a la salud general del paciente. La administración puede lograrse mediante una dosis única o dosis divididas.
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden administrarse directamente a un sujeto que es un mamífero. La administración es mediante cualquiera de las vías de administración que en general se usan para introducir polipéptido FGF-21 en un sujeto. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden prepararse en una mezcla en una forma inyectable de dosis unitaria (que incluye, pero no se limita a, solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente descripción también pueden administrarse mediante infusión continua (usando, pero no se limitan a, minibombas, tales como bombas osmóticas), un solo bolo o formulaciones de depósitos de liberación lenta.
Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, tampones bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación se torne isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. Las soluciones y suspensiones pueden prepararse de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
Las formulaciones y las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden comprender un estabilizante, un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones que contienen succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo pero no limitado a, ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular, incluyendo pero no limitado a, aquellos con menos de aproximadamente 10 restos; proteínas, incluyendo pero no limitado a, albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, incluyendo pero no limitado a, polivinilpirrolidona; aminoácidos, incluyendo pero no limitado a, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina o derivados de histidina, metionina, glutamato o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo pero no limitado a, trehalosa, sacarosa, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, incluyendo pero no limitado a, EDTA y edentato disódico; iones metálicos divalentes, incluyendo pero no limitado a, zinc, cobalto o cobre; alcoholes de azúcar, incluyendo pero no limitado a, manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, incluyendo pero no limitado a, sodio y cloruro de sodio; y/o tensioactivos no iónicos, incluyendo pero no limitado a, Tween™ (que incluye, pero no se limita a, Tween 80 (polisorbato 80) y Tween 20 (polisorbato 20), Pluronics™ y otros ácidos plurónicos, incluyendo pero no limitado a, otros ácidos plurónicos, incluyendo pero no limitado a, ácido plurónico F68 (poloxámero 188) o PEG. Los tensioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, poliéteres a base de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), es decir, (PEO-PPO-PEO), o poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), es decir, (PPO-PEO-PPO), o una combinación de estos. PEO-PpO-PEO y PPO-PEO-PPO están disponibles en el comercio con las marcas Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ y R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) y se describen con más detalle en la Patente de EE.UU. N.° 4.820.352. Otros polímeros en bloque de etileno/polipropileno pueden ser tensioactivos adecuados. Un tensioactivo o una combinación de tensioactivos pueden usarse para estabilizar el FGF-21 modificado pegilado contra uno o más tipos de estrés, incluyendo pero no limitado a, el estrés que resulta de la agitación. Algunos de los anteriores se pueden denominar "agentes volumétricos". Algunos también se pueden denominar "modificadores de la tonicidad". Los conservantes antimicrobianos también pueden aplicarse para lograr la estabilidad del producto y eficacia antimicrobiana; los conservantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, alcohol de bencilo, cloruro de benzalconio, metacresol, metil/propil parabeno, cresol y fenol, o una combinación de estos.
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación, que incluyen aquellos unidos a polímeros solubles en agua, tales como PEG, también pueden administrarse mediante sistemas de liberación sostenida o como parte de estos. Las composiciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos de diferentes formas, incluyendo pero no limitado a, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen materiales biocompatibles, tales como poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), etileno vinil acetato (o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, polilactidas (ácido poliláctico), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), polianhídridos de poliláctido coglicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato, poli(orto)ésteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona y silicona. Las composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto encapsulado en liposomas. Los liposomas que contienen el compuesto se preparan mediante métodos conocidos.
La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente descripción debe ser suficiente para causar una respuesta favorable en el sujeto en el transcurso de un tiempo. Por lo general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de polipéptido FGF-21 modificado de la presente descripción administrada por vía parenteral por dosis se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,01 pg/kg/día a aproximadamente 100 pg/kg, o aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de peso corporal del paciente, aunque esto depende del criterio terapéutico.
En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación modulan el efecto de un agente antidiabético. En otra realización de la presente divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados pueden coadministrarse con un agente antidiabético. En otra realización de la presente divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados pueden administrarse antes del tratamiento con un agente antidiabético. En otra realización de la presente divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados pueden administrarse después del tratamiento con un agente antidiabético. En otra realización de la presente divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados se coadministran con metformina. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se coadministran con Klotho beta. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se coadministran con Klotho beta que incluye uno o más aminoácidos codificados de manera no natural. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se coadministran con Klotho beta y un agente antidiabético. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se coadministran con un agente antidiabético. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se usan en combinación con uno o más de los siguientes: taurina, ácido alfa lipoico, un extracto de moras, cromo, glutamina, Enicostemma littorale Blume, Scoparia dulcís, un extracto de estragón y Andrographis paniculata. En algunas realizaciones, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se usan en combinación con uno o más de los siguientes: preparaciones de insulina (por ejemplo, preparaciones de insulina animal extraída de páncreas de bovinos y porcinos; preparaciones de insulina humana sintetizada genéticamente usando Escherichia coli, levadura; insulina zinc; insulina zinc protamina; fragmento o derivado de insulina (por ejemplo, INS-1), preparación de insulina oral), sensibilizadores de insulina (por ejemplo, pioglitazona o una sal de la misma (preferentemente, clorhidrato), rosiglitazona o una sal de la misma (preferentemente, maleato), Netoglitazone, Rivoglitazone (CS-011), FK-614, el compuesto descrito en el documento WO01/38325, Tesaglitazar (AZ-242), Ragaglitazar (N,N-622), Muraglitazar (BMS-298585), edaglitazona (BM-13-1258), Metaglidasen (MBX-102), Naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131(T-131), THR-0921), inhibidores de a-glucosidasa (por ejemplo, voglibosa, acarbosa, miglitol, emiglitate, etc.), biguanidas (por ejemplo, fenformina, metformina, buformina o una sal de estos (por ejemplo, clorhidrato, fumarato, succinato)), secretagogos de insulina [sulfonilurea (por ejemplo, tolbutamida, glibenclamida, gliclazida, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, gliclopiramida, glimepirida, glipizida, glibuzol), repaglinida, nateglinida, mitiglinida o hidrato de sal de calcio de los mismos], inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (por ejemplo, vidagliptina (LAF237), P32/98, sitagliptina (MK-431), P93/01, PT-100, saxagliptina (BMS-477118), T-6666, TS-021), agonistas de p3 (por ejemplo, AJ-9677), agonistas de GPR40, polipéptidos tipo glucagón (I) (glp I), (glp2), y otras hormonas peptídicas diabetogénicas, agonistas del receptor de GLP-1 [por ejemplo, GLP-1, agente GLP-1MR, N,N-2211, AC-2993 (exendin-4), BIM-51077, Aib(8.35)hGLP-1 (7,37)NH2, CJC-[131], agonistas de amilina (por ejemplo, pramlintida), inhibidores de fosfotirosina fosfatasa (por ejemplo, vanadato de sodio), inhibidores de la gluconeogénesis (por ejemplo, inhibidores de glucógeno fosforilasa, inhibidores de glucosa-6-fosfatasa, antagonistas de glucagón), inhibidores de SGLUT (cotransporte de sodio-glucosa) (por ejemplo, T-1095), inhibidores de 11p-hidroxiesteroide deshidrogenasa (por ejemplo, BVT-3498), adiponectina o agonistas de esta, inhibidores de IKK (por ejemplo, AS-2868), fármacos mejoradores de la resistencia a la leptina, agonistas del receptor de somatostatina (compuestos descritos en los documentos WO01/25228, WO03/42204, WO98/44921, WO98/45285, WO99/22735 etc.), activadores de glucoquinasa (por ejemplo, Ro-28-1675), GIP (péptido insulinotrópico dependiente de glucosa).
Una manera en que la efectividad terapéutica de los polipéptidos y los tratamientos combinados que incluyen los polipéptidos de la presente divulgación pueden determinarse es mediante una disminución de los niveles de HbA1c en el paciente. En una realización de la divulgación, los polipéptidos de la presente divulgación disminuyen los niveles de HbA1c en al menos un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, o al menos cambian un 50 % de los niveles de HbA1c registrados dos meses antes del inicio del tratamiento con polipéptidos FGF-21 modificados, registrados tres meses antes del inicio del tratamiento con polipéptidos FGF-21 modificados, o cambian el porcentaje en comparación con los niveles iniciales. En otra realización de la divulgación, los polipéptidos de la presente descripción administrados a un paciente que también se está tratando con un agente antidiabético modulan la capacidad del agente antidiabético para disminuir la glucosa en sangre.
En otra realización de la divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación modulan la capacidad de troglitazona de disminuir los requerimientos de insulina. Troglitazona en combinación con el polipéptido de la presente descripción puede usarse para retrasar o prevenir la diabetes tipo 2 en algunas realizaciones de la presente divulgación.
En una realización de la presente divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados se coadministran con una sulfonilurea o se administran después o antes del tratamiento con esta. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tratamiento con una dosis terapéutica de polipéptidos FGF-21 modificados modula la glucosa en suero. En otra realización de la divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se administran con Klotho beta, que modula los efectos de los polipéptidos sobre la glucosa en sangre. En otra realización de la divulgación, los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación se administran con Klotho beta, que disminuye la glucosa en sangre más que el uso de polipéptidos FGF-21 modificados solos.
XVI. Usos terapéuticos de los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación
Los polipéptidos FGF-21 modificados de la presente divulgación pueden usarse para tratar a mamíferos que padecen diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM: tipo 2), diabetes insulinodependiente (tipo 1), así como obesidad, depuración inadecuada de glucosa, hiperglucemia, hiperinsulinemia y cualquier otra enfermedad o afección que se pueda mediar por FGF-21.
El síndrome de Prader-Willi (P.W.S. o PWS) es un trastorno genético poco común en el que siete genes (o algún subconjunto de estos) en el cromosoma 15 (q 11-13) están suprimidos o no se expresan (deleción parcial del cromosoma 15q) en el cromosoma paterno. Las características del PWS son hipotonía muscular, baja estatura, desarrollo sexual incompleto, incapacidades cognitivas, problemas conductuales y una sensación crónica de hambre que puede provocar la ingesta excesiva de alimentos y obesidad potencialmente mortal.
La presente divulgación proporciona un método para tratar a un mamífero que exhibe uno o más de diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, obesidad, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa o hiperglucemia, que comprende administrar al mamífero que necesita el tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido FGF-21 modificado de la presente descripción.
El método para tratar puede ser suficiente para lograr en el mamífero al menos una de las siguientes modificaciones: reducción en las reservas de grasa corporal, disminución de la resistencia a la insulina, reducción de la hiperinsulinemia, aumento de la tolerancia a la glucosa y reducción de la hiperglucemia.
La presente divulgación también abarca un método para reducir la mortalidad y la morbilidad en pacientes gravemente enfermos que padecen síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) asociado a lesiones infecciosas, tales como sepsis, pancreatitis, isquemia, politraumatismo y lesión tisular, choque hemorrágico, lesión de órganos mediada por el sistema inmunitario, dificultad respiratoria, choque, falla renal y síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS), así como a causas patológicas no infecciosas, que comprende administrar a los pacientes gravemente enfermos una cantidad terapéuticamente eficaz de FGF-21 modificado.
En una realización de la divulgación, la divulgación proporciona composiciones y métodos con los polipéptidos FGF-21 modificados descritos en el presente documento en combinación con un agente adicional para tratar el metabolismo alterado de la glucosa, así como la resistencia a la insulina, la secreción alterada de insulina o la hiperglucemia. Los agentes adicionales incluyen, por ejemplo, una o más sulfonilureas, agonistas de PPAR-gamma, agonistas del receptor de GPL-1, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV, análogos de amilina, biguanidas, agonistas del receptor de dopamina D2, meglitinidas, inhibidores de alfa-glucosidasa, secuestradores de ácidos biliares antidislipidémicos, insulina, tratamiento con citocinas, tratamiento génico y tratamiento con anticuerpos. En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede administrarse a un paciente que no logra la normoglucemia con la administración de otro tratamiento, por ejemplo, tratamiento con metformina, pioglitazona, una sulfonilurea, una glinida, una tiazolidindiona oral (TZD), por ejemplo, pioglitazona, un agonista del receptor de péptido tipo glucagón 1 (GLP-1), por ejemplo, exenatida, un inhibidor de DPP4, por ejemplo, sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina, alogliptina, linagliptina o teneligliptina, o un tratamiento conjunto, por ejemplo, metformina y pioglitazona, metformina y una sulfonilurea, metformina y una glinida, metformina y una TZD, metformina y pioglitazona, metformina y un agonista del receptor de GLP-1, metformina y exenatida, sitagliptina y metformina, sitagliptina y simvastatina, vildagliptina y metformina, saxagliptina y metformina, alogliptina y pioglitazona, o linagliptina y metformina, o inhibidores de SGLT2, por ejemplo, dapagliflozina, canagliflozina, empagliflozina, ipragliflozina o tofogliflozina.
En algunas realizaciones de la divulgación, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede administrarse para la prevención o el tratamiento de la obesidad (por ejemplo, un índice de masa corporal de al menos 25). El polipéptido FGF-21 modificado puede administrarse en combinación con un agente contra la obesidad, tal como orlistat, rimonabant, sibutramina, un péptido YY (PYY, un péptido de 36 aminoácidos que reduce el apetito), un análogo de PYY, un antagonista de CB-1, rimonabant, leptina, un análogo de leptina o una fentermina.
En algunas realizaciones, el polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento puede administrarse para la prevención o el tratamiento del síndrome de Prader-Willi.
Cabe destacar que los ejemplos y las realizaciones descritas en el presente documento son solo ilustrativos, y que las diversas modificaciones o cambios en función de estos serán sugeridos a las personas expertas en la materia. Cabe aclarar también que la terminología usada en el presente documento tiene como fin describir realizaciones de ejemplo únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente divulgación, en donde aquellas solo están limitadas por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos tienen como finalidad ilustrar la invención reivindicada, pero sin limitarla.
Ejemplo 1
Expresión y purificación de FGF-21 en E. Coli
Los plásmidos que contienen construcciones de expresión de FGF-21 modificado o no modificado bajo el control del promotor T7 se transformaron en una cepa de E. coli, tal como la cepa W3110 B2 de E. coli, en la cual la expresión de la polimerasa T7 está bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Los cultivos bacterianos de toda la noche pueden diluirse 1:100 en matraces de agitación que contienen medio de cultivo 2X YT y cultivarse a 37 °C a una DO600 de ~ 0,8. La expresión proteica puede inducirse mediante la adición de arabinosa (0,2 % final) y para-acetilfenilalanina (pAcF) hasta obtener una concentración final de 4 mM. Los cultivos pueden incubarse durante un tiempo adecuado y a una temperatura adecuada, por ejemplo, a 37 °C durante 4 horas. Las células pueden convertirse en gránulos y volver a suspender en tampón de lisis B-PER (Pierce), 100 ul/OD/ml 10 ug/ml de DNasa, y pueden incubarse a 37 °C durante 30 min. El material celular puede retirarse mediante centrifugación, y el sobrenadante puede retirarse. El gránulo se puede volver a suspender en una cantidad igual de tampón de carga de proteínas SDS-PAGE. Las muestras se pueden cargar en un gel de PAGE al 4-12 % con MES y DTT. Los métodos para la purificación de FGF-21 son conocidos por las personas expertas en la materia, y la purificación puede confirmarse mediante SDS-PAGE, análisis de transferencia Western, espectrometría de masa de trampa de iones por ionización de electropulverización, y similares.
La pasta celular se volvió a suspender mezclando hasta obtener un sólido al 10 % final en tampón I de cuerpos de inclusión (IB) a 4 °C (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Triton X-100 1 %; 4 °C). Las células se lisaron haciendo pasar el material resuspendido a través de un microfluidizador un total de dos veces, luego se centrifugó (10.000 g; 15 min; 4 °C), y el sobrenadante se decantó. El gránulo de IB se lavó volviendo a suspender en un volumen adicional de tampón I de IB (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; Triton X-100 1 %; 4 °C), y el material resuspendido se hizo pasar a través de un microfluidizador un total de dos veces, luego se centrifugó (10.000 g; 15 min; 4 °C), y el sobrenadante se decantó. El gránulo de IB se volvió a suspender en un volumen de tampón II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C), luego se centrifugó (10.000 g; 15 min; 4 °C), y el sobrenadante se decantó. El gránulo de IB luego se volvió a suspender en A volumen de tampón II (Tris 50 mM pH 8,0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM; 4 °C). Los IB se dividieron en alícuotas en recipientes adecuados, luego se centrifugaron (10.000 g; 15 min; 4 °C), y el sobrenadante se decantó. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron (en este momento, se podrían haber almacenado a -80 °C hasta el próximo uso).
Los cuerpos de inclusión se solubilizaron hasta obtener una concentración final de 10-15 mg/ml en tampón de solubilización (Tris 20 mM, pH 8,0; urea 8 M; 10 mM de p-ME), y los IB solubilizados se incubaron a temperatura ambiente mezclando en forma constante durante 1 hora. El material insoluble se retiró mediante filtración (filtro PES de 0,45 |jm), y la concentración proteica se ajustó (no siempre es necesario) mediante dilución con un tampón de solubilización adicional (cuando la concentración proteica es alta).
El replegamiento puede llevarse a cabo mediante la dilución hasta obtener una concentración proteica final de 0,5 mg/ml en Tris 20 mM, pH 8,0; 4 °C. El replegamiento continúa durante 18 a 24 horas a 4 °C.
Para la purificación, la reacción de replegamiento filtrada puede hacerse pasar por un filtro PES de 0,45 jM . El material cargado en una columna Q HP (GE Healthcare) se equilibró en tampón A (Tris 20 mM, pH 7,5). Elución de FGF-21 modificado o no modificado con un gradiente lineal en 20 CV a 100 % de tampón B (Tris 20 mM, pH 7,5; NaCl 250 mM). De esta manera, el FGF-21 monomérico puede producirse de fracciones eluidas agrupadas. La agrupación de Q HP se absorbió, y el tampón se intercambió en Tris 20 mM, pH 8,0; urea 2 M; 1 EDTA mM. El pH se bajó a 4,0 con 50 % de ácido acético glacial. La muestra se concentró de manera descendente hasta obtener 4,0±1,0 mg/ml. A la muestra, se agregó un exceso molar de 12:1 de PEG y una concentración final de 1 % de hidrazida acética, pH 4,0. La muestra se incubó a 28 °C durante 48-72 horas. A la reacción de PEG, luego se añadió un final de Tris 50 mM base, y se diluyó 10 veces con agua RO. Se verificó que la conductividad fuera de <1 mS/cm, y el pH era de 8,0-9,0. El material se cargó en una columna Source 30Q (GE Healthcare) equilibrada en tampón A (Tris 20 mM, pH 8,0). PEG-FGF-21 se eluyó con un gradiente lineal en 20 CV a 100 % de B (Tris 20 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM). PEG-FGF-21 se agrupó, y el tampón se intercambió en Tris 20 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM. El material de PEG se concentró hasta obtener 1-2 mg/ml, y se esterilizó mediante un filtro usando un filtro PES de 0,22 |jm. El material se almacenó a 4 °C. Para el almacenamiento prolongado, debe someterse a congelamiento criogénico y almacenarse a -80 °C.
Ejemplo 2
Métodos para producir polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un aminoácido codificado de manera no natural
Un sistema de traducción introducido que comprende ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil-ARNt sintetasa ortogonal (O-RS) puede usarse para expresar FGF-21 modificado que contiene un aminoácido codificado de manera no natural. La O-RS aminoacila, preferentemente, el O-ARNt con un aminoácido codificado de manera no natural. A su vez, el sistema de traducción inserta el aminoácido codificado de manera no natural en FGF-21, en respuesta a un codón selector codificado. Las secuencias de O-RS y O-ARNt adecuadas se describen en el documento WO 2006/068802, con el título "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof" (E9; SEQ ID NO: 15) y en el documento WO 2007/021297, con el título "Compositions of tRNA and Uses Thereof' (F13; SEQ ID NO: 16). Las secuencias de O-RS y de O-ARNt de ejemplo se incluyen en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2: Identificadores de secuencia de los ejemplos de secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de ARNt ortogonal (O-ARNt) y aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS)
Figure imgf000073_0001
Tabla 3: Ejemplos de secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de FGF-21, ARNt ortogonal (O-ARNt) y una aminoacil ARNt sintetasa orto onal O-RS
Figure imgf000074_0001
(continuación)
Figure imgf000075_0001
(continuación)
Figure imgf000076_0001
(continuación)
Figure imgf000077_0001
(continuación)
Figure imgf000078_0001
(continuación)
Figure imgf000079_0001
La transformación de E. coli con plásmidos que contienen el gen FGF-21 modificado y el par ARNt/aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (específico para el aminoácido codificado de manera no natural deseado) permite la incorporación específica de sitio del aminoácido codificado de manera no natural en el polipéptido FGF-21 modificado.
El FGF-21 maduro de tipo silvestre se puede amplificar por PCR de una reacción de síntesis de ADNc, por ejemplo, derivado de poliA+ ARNm de hígado humano sano (Biochain), usando protocolos convencionales y puede clonarse en un vector, tal como pET30 (por ejemplo, usando los sitios de escisión NcoI-BamHI). Opcionalmente, después de la confirmación de la secuencia, FGF-21 (que puede incluir un marcador de purificación, tal como una secuencia HHHHHHSGG en N-terminal) puede subclonarse. Por ejemplo, FGF-21 puede subclonarse en un vector de deleción que contiene un tirosil ARNtTyr/CUA supresor ámbar de Methanococcus jannaschii (Mj ARNtTyr/CUA) y puede enlazarse a un promotor adecuado, por ejemplo, bajo el control constitutivo de un promotor de síntesis derivado de la secuencia promotora de lipoproteína de E. coli (Miller, J.H., Gene, 1986), así como la tirosil-ARNt-sintetasa ortogonal (MjTyrRS) bajo el control del promotor de GlnRS de E. coli. La expresión de FGF-21 modificado o no modificado puede estar bajo el control del promotor T7. Las mutaciones ámbar pueden introducirse usando protocolos estándares de mutación de cambios rápidos (Stratagene; La Jolla, California). Puede verificarse la secuencia de las construcciones.
Dos aminoácidos codificados de manera no natural diferentes pueden introducirse en polipéptidos FGF-21 modificados introduciendo un codón selector en dos sitios diferentes dentro del ácido nucleico.
Supresión con para-acetil-fenilalanina (pAcF)
Los plásmidos que contienen construcciones de expresión de FGF-21 modificado y construcciones de expresión de O-ARNt y O-RS (que pueden estar en el mismo plásmido o en diferentes plásmidos, o estar transfectados de manera estable en la cepa) pueden transformarse en la cepa W3110 B2 de E. coli en la cual la expresión de la polimerasa T7 está bajo el control de un promotor inducible por arabinosa. Los cultivos bacterianos de toda la noche pueden diluirse 1:100 en matraces de agitación que contienen medio de cultivo 2X YT y cultivarse a 37 °C a una DO600 de ~ 0,8. La expresión proteica puede inducirse mediante la adición de arabinosa (0,2 % final) y para-acetil-fenilalanina (pAcF) hasta obtener una concentración final de 4 mM. Los cultivos pueden incubarse durante un tiempo adecuado y a una temperatura adecuada, por ejemplo, a 37 °C durante 4 horas. Las células pueden convertirse en gránulos y volver a suspender en tampón de lisis B-PER (Pierce), 100ul/OD/ml 10ug/ml de DNasa, y pueden incubarse a 37 °C durante 30 min. El material celular puede retirarse mediante centrifugación, y el sobrenadante puede retirarse. El gránulo se puede volver a suspender en una cantidad igual de tampón de carga de proteínas SDS-PAGE. Las muestras se pueden cargar en un gel de PAGE al 4-12 % con MES y DTT. Los métodos para la purificación de FGF-21 son conocidos por las personas expertas en la materia, y la purificación puede confirmarse mediante SDS-PAGE, análisis de transferencia Western, espectrometría de masa de trampa de iones por ionización de electropulverización, y similares.
Las proteínas FGF-21 mutantes etiquetadas con His o no etiquetadas con His pueden purificarse usando métodos conocidos por las personas expertas en la materia. Por ejemplo, la resina quelante de níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, CA) puede usarse mediante los procedimientos estándares de purificación de proteínas etiquetadas con His proporcionados por el fabricante.
Ejemplo 3
Introducción de un aminoácido que contiene carbonilo en un polipéptido FGF-21 modificado y reacción posterior con un PEG que contiene aminooxi
El siguiente método de ejemplo puede usarse para generar un polipéptido FGF-21 modificado enlazado a una porción de prolongación de semivida. El método incorpora un aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona, que se hizo reaccionar, posteriormente, con una porción de prolongación de semivida, tal como un PEG que contiene aminooxi, que tiene un peso molecular de aproximadamente 30.000 Da. Un resto seleccionado de FGF-21 se sustituyó con un aminoácido codificado de manera no natural que tenía la siguiente estructura:
O
H2N CO;H
Las secuencias utilizadas para la incorporación específica de sitio de p-acetil-fenilalanina en FGF-21 pueden serSEQ
IV»
ID NO: 1 (FGF-21), SEQ ID NO: 16 o 17 (mutARNt, rntARN1'1' M. jannaschii), 15, 29, 30 o 31 (TyrRS LW1, 5 o 6), o cualquier polipéptido FGF-21 modificado descrito en el presente documento.
Una vez modificado, el polipéptido FGF-21 que comprende el aminoácido que contiene carbonilo se hizo reaccionar con un derivado de PEG que contiene aminooxi de forma:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
donde R es metilo, n es 3, y N es un peso molecular seleccionado, por ejemplo, aproximadamente 30.000 Da.
De manera alternativa, el aminoácido codificado de manera no natural que contiene cetona puede estar enlazado a un reactivo de PEG que tiene la siguiente estructura:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
donde R = metilo, n=4, y N es un peso molecular seleccionado, por ejemplo, aproximadamente 30.000 Da.
El FGF-21 modificado purificado que contiene p-acetilfenilalanina disuelto a 10 mg/ml en MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0, o en acetato de sodio 10 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5, se hizo reaccionar con un exceso de 10 a 100 veces de PEG que contiene aminooxi, y luego se agitó durante 10 -16 horas a temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 475). El p EG-FGF-21 luego se diluyó en tampón adecuado para la purificación inmediata y análisis.
Ejemplo 4
Producción de polipéptidos FGF-21 modificados
Se produjeron los polinucleótidos que codifican cada uno de los polipéptidos FGF-21 modificados que se muestran en las Figuras 1A-B. El uso del codón de ADN en las secuencias de polinucleótidos se optimizó para la expresión de E. coli usando métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica (SEQ ID NO: 317 y 318 son secuencias de polinucleótidos de ejemplo que codifican el compuesto 2 y el PEG-Compuesto 2ilado, respectivamente). Si había un péptido de conexión, su secuencia codificante se seleccionó en función del código genético convencional, por ejemplo, g Gu , GGC, GGA o GGG para glicina, UCU, UCC, UCA, UCG, AGU o AGC para serina, CAU o CAC para histidina, etc. Los polipéptidos FGF-21 modificados se expresaron en E. coli y se purificaron (los métodos de ejemplo se describen en el presente documento). Se produjeron los polipéptidos FGF-21 modificados que contienen el aminoácido codificado de manera no natural para-acetil-fenilalanina (cuya abreviatura es pACF o pAF) (los métodos de ejemplo se proporcionan en el Ejemplo 2). En síntesis, el polinucleótido codificador se modificó adicionalmente para incorporar un codón selector en la posición correspondiente en la secuencia de polinucleótidos para codificar pACF, y se expresó en una célula modificada por ingeniería genética para expresar ARNt ortogonal (O-ARNt) y aminoacil ARNt sintetasa ortogonal (O-RS), de modo que el codón selector dirigía la inclusión de pACF en la posición seleccionada. La pACF luego se ligó a poli(etilenglicol) (PEG) que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30 kDa (los métodos de ejemplo se proporcionan en el Ejemplo 3).
Secuencia codificante del compuesto 2 (SEQ ID NO:317)
M H P I P D s E P L L 0 F G G O V R Ü F.
1 ATG CAT CCT ATT CCT GAT TCT TCT CCT CTG CTG CAA TTT GGG GGT CAG GTG CGC CAA
CGT
Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D
G
61 TAC CTG TAC ACC GAC GAT GCG CAA CAG ACT GAG GCT CAC CTG GAG ATC CGT GAG GAC GGG T V G G A A D 0 L r*t P E £ L E Q L K A L K
12 i ACT GTC GGA GGG GCT GCC GAT CAA TCC CCA GAG TCA CTG CTG CAA CTG AAA GCC CTG AAG
P G V I Q I I G V K T S R F 1 C Q R P
D
181 CCT GGG GTC ATT CAG ATC CTG GGC GTA AAG ACG AGT CGT TTC CTG TGC CAA CGT CCT GAC
G A L Y G E L H F D P E A C S F R E L
L
241 GGG GCA CTG TAT GGC TCG CTG CAT TTT GAT CCT GAG GCT TGT AGT TTT CGC GAA CTG CTG
L E D G Y 11 V Y Q S E A H G L F L H L
G
301 CTG GAA GAT GGT TAC AAT GTG TAT CAG AGT GAA GCA CAC GGT CTG CCT CTG CAC CTG GGT
3 G R G P A R F L P L P G L F F A F F
E
361 TCT GGT CGT GGT CCG GCG CGT TTT CTG CCA CTG CCT GGC CTG CCT CCA GCA CCA CCT GAA
P ? G I L A P Q F P D V G S 3 D F L 3
M
421 CCA CCG GGT ATT CTG GCT CCG CAA CCT CCA GAC GTC GGG AGT TCA GAT CCT CTG TCG ATG V E P S Q G R 3 P 3 Y A O F?
481 GTA GAA CCG TCA CAA GGT CGC TCT CCT AGT TAC GCG TCA
Secuencia codificante del PEG-Compuesto 2ilado (SEQ ID NO:318)
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Como se detalla en los siguientes ejemplos, los polipéptidos FGF-21 modificados se caracterizaron adicionalmente, lo que incluye la evaluación para determinar la actividad biológica in vitro, la estabilidad, la tendencia a la desamidación y a la formación de agregados, la resistencia a la proteólisis in vivo, la inmunogenicidad, la farmacocinética y la actividad biológica in vivo en un modelo de diabetes.
Las secuencias de polipéptidos completas de los polipéptidos FGF-21 modificados producidos (cuyas secuencias parciales se muestran en las Figuras 1A-B) son de la siguiente manera:
Compuesto 1
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYT'DDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGR3PSYAS (3EQ ID N O :101)
Compuesto 2
i r i - ■ ■ '• 1 i" i ' j r - \n 1.p 7 r r ’ V r , lGoJD.At»: i k - *ALr: l»7>r , . 11 : * Ti! í’ f t . O V!' ,* U C í m í iO i AC'.r " T,t. ; W ' \ ), . *mq , ■ - igixü ;i gv • • n . « F iLi v .p 7 * J ,'PaZLkVQTfV W Z 2 ' i I t X L : W £ r iW . ‘ 1 ’ i - 1 f :• >:i.: i í- 1 >
Compuesto 3
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQ3EAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFL PLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYA3 (SEQ ID N O :103)
Compuesto 4
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGKKSPHRDPAPRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :104 )
Compuesto 5
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSFESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQFPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 105)
C o m p u e s to 6
M Ü F IP D 3 S F I¿ Q £ G D Q V B Q P Y L V ? a m Q y T E A tíX £ Ifl£ D G T V ^G ÍA D Q 8 P E S U .0 L W U ^P 6 V IQ IH S V KTSP.B'LCQRFOGALVGSI.BFDPEAGSFRSLI-LlEPGyt'JWQSEAHGLPiHLPGHKSRDPAPJRfiPARFLFL POLPPAPPEFPGIEAFQPPDVGS3DPLEI-5VEPSQGRSPSYAS (3EQ ID WOtlO-6 )
Compuesto 7
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGDKSPHRDPAPRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :107 )
Compuesto 8
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGARFLPLPGLPPAPPEP PGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :108 )
Compuesto 9
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGQKSPHRDPAPRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :109 )
Compuesto 10
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPGLPPAPP EPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :110 )
Compuesto 11
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGHRDPAPRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :111 )
Compuesto 12
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPHHSGRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :112 )
Compuesto 13
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGKDSQDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :113 )
Compuesto 14
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :114 )
Compuesto 15
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGREPSYAS (SEQ ID NO:115)
C o m p u e s to 16
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:116)
Compuesto 17
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :117 )
Compuesto 18
M H P I P D S S P L L Q F G G Q V R Q R Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D G T V G G A A D Q S P E S L L Q L K A L K P G V I Q I L G V K T S R F L C Q R P D G A L Y G S L H F D P E A C S F R E L L L E D G Y N V Y Q S E A H G L P L H L P G N K S P H R D P A P R G P A R F L P L P G L P P A P P E P P G I L A P Q P P D V G S S D P L S M V E P ( S E Q I D N O : 118 )
Compuesto 19
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGPHRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :119 )
Compuesto 20
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGGHRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :120 )
Compuesto 21
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRDPAPRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :121 )
Compuesto 22
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLSGGPAPRGPARFLPLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :122 )
Compuesto 23
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGGGPARFLPLPGLPPAP PEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :123 )
Compuesto 24
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGGRFLPLPGLPPAPPE PPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :124 )
Compuesto 25
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPSGGRFLPLPGLPPAPP EPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:125)
C o m p u e s to 26
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHSGGPAPRGPARFLPLPGL PPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:126)
Compuesto 27
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHGSGGPARFLPLPGLPPAP PEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O : 127 )
Compuesto 28
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHGGRFLPLPGLPPAPPEPPG ILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O : 128 )
Compuesto 29
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHSGGRFLPLPGLPPAPPEPP GILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :129 )
Compuesto 30
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPHGSGRFLPLPGLPPAPPEPP GILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :130 )
Compuesto 31
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPGLPPA PPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVTPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O : 131 )
Compuesto 32
MHHHHHHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAP RGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :132 )
Compuesto pegilado 1
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPR GPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :201 )
Compuesto pegilado 2
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :202 )
Compuesto pegilado 5
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGDKSRDPAPRGP ARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:205)
C o m p u e s to pe g ilad o 6
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGHKSRDPAPRGP ARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:206)
Compuesto pegilado 10
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLGSGGPARFLPLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :210 )
Compuesto pegilado 11
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLGSGHRDPAPRGPA RFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :211 )
Compuesto pegilado 12
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPHHSGRDPAPRGP ARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :212 )
Compuesto pegilado 19
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLGSGPHRDPAPRGP ARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :219 )
Compuesto pegilado 20
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLGGHRDPAPRGPAR FLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :220 )
Compuesto pegilado 21
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGSGRDPAPRGPAR FLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :221 )
Compuesto pegilado 22
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF) SEAHGLPLHLSGGPAPRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O : 222 )
Compuesto pegilado 23
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLGGGPARFLPLPGL PPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID N O :223 )
Se produjeron polipéptidos FGF-21 modificados adicionales como proteínas de fusión. Algunos de los polipéptidos FGF-21 modificados contenían la secuencia del compuesto 2 (SEQ ID NO:102), con o sin la metionina N-terminal, fusionada a uno o más compañeros de fusión, tales como un dominio Fc o un fragmento del mismo, una adnectina PKE ("PKE"), o una secuencia de albúmina de suero humano ("HSA") modificada o no modificada y, opcionalmente, un péptido de conexión. Otros polipéptidos FGF-21 modificados se basaron en una secuencia de tipo silvestre del compuesto 1 (con o sin la metionina N-terminal). Se incluyeron diferentes formas de secuencia de adnectina PKE. A estas se las denominan "PKE(1)" o "PKEI" y "PKE(2)" o PKEII. La secuencia de aminoácidos de PKE(1) fue GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKPGVDYTITVYAVYGS KYYYPISINYRTEIEKPSQ (SEQ ID NO:319). La secuencia de aminoácidos de PKE(2) fue GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITV YAVTGSGESPASSKPISINYRTP (SEQ ID NO:320). Cuando PKE(1) o PKE(2) se encontraba incluida en N-terminal de la proteína de fusión, la secuencia expresada en E. coli incluía una metionina N-terminal, que se preveía que fuera escindida por una met-exopeptidasa cuando estuviera expresada en E. coli, lo cual produjo una secuencia madura sin la metionina N-terminal; la forma madura prevista de las proteínas de fusión PKE sin la metionina N-terminal se muestra en la lista a continuación.
Una secuencia de albúmina de suero humano contenida en algunas de las proteínas de fusión fue HuSA(C34A). Su secuencia de aminoácidos es:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NY AEAKD VFLGMFL YE Y ARRHP D Y SWLLLRLAKTYETTLEKCCA AADPH EC Y AKVF DEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:321).
Otra secuencia de albúmina de suero humano contenida en algunas de las proteínas de fusión fue HSA (C34A, des Leu-585). Su secuencia de aminoácidos es:
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRFIPYFYAPELLFFAfCRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK n y a e a k d v f l g m f l y e y a r r h p d y s w l l l r l a k t y e t t l e k c c a a a d p f ie c y a k .v f d e f k .pl VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALG (SEQ IDNO:322).
G4Sx3 se refiere a la secuencia GGGGS repetida 3 veces, es decir, GGGGSGGGGSGGGGS.
Las proteínas de fusión de ejemplo contenían más de un polipéptido FGF-21 modificado, por ejemplo, los compuestos 141-146.
Las secuencias de los compuestos de la proteína de fusión se muestran a continuación, y las características de estas proteínas de fusión se resumen en las Figuras 40A-C.
C o m p u e s to 101: P K E (2 )-L 1 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQ QTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEA CSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLS MVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:401)
Compuesto 102: PKE(2)-L2-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYT1TVYAVTGSGESPASSKPIS1NYRTPGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTD DAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFD PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSD PLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:402)
Compuesto 103: PKE(2)-L3-FGF21 (Compuesto 2)
GVS D VPRDLE WAATPTSLLIS WDAPAVTYRYYRITY GREV QKY SDLGPL YIY QEFTVPGSKST A TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPEEEEDEEEEDHPIPDSSPLLQFGGQVRQR YLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALY GSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPP DVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ 1DNO:403)
Compuesto 104: PKE(2)-L4-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLRPGVDYTITVYAVTGSGESPASSRPISINYRTPPSPEPPTPEPHP1PDSSPLLQFGGQVRQRY LYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGS LHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDV GSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:404)
Compuesto 105: PKE(2)-L5-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGSHHHHHHHHGSHPIPDSSPLLQFGGQVR QRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGA LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPG1LAPQ PPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:405)
Compuesto 106: PKE(2)-L6-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPIS1NYRTPGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGG QVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGIL APQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:406)
Compuesto 107: PKE(2)-L7-FGF21 (Compuesto 2)
GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA
T1SGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGGGGGSGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGG QVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGIL APQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:407)
Compuesto 108: PKE(2)-L8-FGF21 (Compuesto 2)
GYSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGSGSGSGSGSGSGSGSHPIPDSSPLLQFGG QVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGIL APQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:408)
Compuesto 109: PKE(2)-L9-FGF21 (Compuesto 2)
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLK.PGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSTPPTPSPSTPPTPSPSHPIPDSSPLLQFGG QVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRP DGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGIL APQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:409)
Compuesto 110: PKE(2)-L10-FGF21 (Compuesto 2)
GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPHPIPDS SPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKT SRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPP APPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:410)
Compuesto 111: PKE(2)-L11-FGF21 (Compuesto 2)
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHPI PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGL PPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:411)
C o m p u e s to 112: P K E (2 )-L 12 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHP1 PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGL PPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:412)
Compuesto 113: PKE(2)-L13-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSTPPTPSPSTPPTPSPSPSTPPTPSPSTPPTP SPSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNYYQSEAHGLPLHLGSGRGPARF LPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:413)
Compuesto 114: PKE(2)-L14-FGF21 (Compuesto 2)
G VSD VPRDLEW A ATPTSLLIS WD APA VTVRYYRITY GRE V QKY SDLGPLYIY QEFTVPGSKST A TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDD AQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDP EACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPG1LAPQPPDVGSSDP LSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:414)
Compuesto 115: PKE(2)-L15-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQF GGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ RPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPP GILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:415)
Compuesto 116: PKE(2)-L16-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEVYAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSP EPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKAL KPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRG PARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:416)
Compuesto 117: PKE(2)-L17-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPHP1PDSSPLLQF GGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ RPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPP GILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:417)
Compuesto 118: PKE(2)-L18-FGF21 (Compuesto 2) GVSDWRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPGGGSPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQV RQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQ1LGVKTSRFLCQRPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAP QPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:418)
Compuesto 119: PKE(2)-L19-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPEEEDPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVR QRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGA LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQ PPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:419)
Compuesto 120: PKE(2)-L20-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPIS1NYRTPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPHPIPDSSP LLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSR FLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAP PEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ IDNO:420)
Compuesto 121: PKE(2)-L21-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEYVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYTYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYT1TVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPTPEPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPPSP EPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVI QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:421)
Compuesto 122: PKE(2)-L22-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPTPEPPSPEPPTPEPGGGGSPSPEPPTPEPPS PEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARF LPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:422)
Compuesto 123: PKE(2)-L23-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGREVQKYSDLGPLYIYQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGSGESPASSKPISINYRTPPSPEPTPEPSPEPPTPEPSPEPTPEPHPIPDS SPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKT SRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPP APPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:423>
Compuesto 124: HuSA(C34A)-L201-FGF21 (Compuesto 2) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYE1ARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NY AEAKD VFLGMFLYEY ARRHPD Y S WLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHEC Y AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQS PESLLQLKALKPGVIQ1LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHG LPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPG1LAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYAS (SEQ ID NO:424)
Compuesto 125: HuSA(C34A)-L202-FGF21 (Compuesto 2) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKD VFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNL1KQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGA ADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQS EAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYAS (SEQ ID NO:425)
C o m p u e s to 126: H u S A (C 34 A )-L 203 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
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Compuesto 127: HuSA(C34A)-L204-FGF21 (Compuesto 2) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVYLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHAD1CTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGT VGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYN VYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYA
S (SEQ ID NO:427)
Compuesto 128: HuSA(C34A)-L205-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 129: HuSA(C34A)-L206-FGF21 (Compuesto 2) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NY AEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDY S WLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHEC Y AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE IREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLL EDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQER SPSYAS (SEQ ID NO:429)
Compuesto 130: HuSA(C34A)-L207-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 131: HuSA(C34A)-L208-FGF21 (Compuesto 2) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD
K.SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK.DDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETELKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCFIGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEARDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GRKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQT EAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACS FRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMV EPSQERSPSYAS (SEQ IDNO:431)
Compuesto 132: HuSA(C34A)-L209-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 133: HuSA(C34A, des Leu-585)-L211-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 134: HuSA(C34A, des Leu-585)-L207-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 135: HuSA(C34A, des Leu-585)-L211-FGF21 (Compuesto 1) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NY AEAKD VFLGM F LYE Y ARRHPD Y S WLLLRLAKTYETTLEKC C AAADPHEC Y AKVF DEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEI REDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLL EDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNK.SPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPL SMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:436)
Compuesto 136: HuSA(C34A, des Leu-585)-L207-FGF21 (Compuesto 1) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGK ASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPL VEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAK RMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFT FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEE GKKLVAASQAALGGETGSSGEGTGSTGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIR EDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLE DGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLS MVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:437)
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(SEQ ID NO:440)
Compuesto 138: FGF21 (Compuesto 2)-L209-HuSA(C34A)-HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALY GSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESDAHK SEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAK QRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRA DLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK DVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKYGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGL (SEQ ID NO:441)
C o m p u e s to 139: FG F21 (C o m p u e s to 2 )-L 210 -H u S A (C 34 A )
HPTPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVTQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGES GEGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVD VMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDWLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQMLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFN AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:442)
Compuesto 140: FGF21 (Compuesto 1)-L209-HuSA(C34A)-HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALY GSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPA PRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASGETGSSGEGTGSTGS GAGESDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVD VMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAYARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK D V CKNYAEAKD VFLGMFLYEYARRHPD Y S WLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHEC YAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKYGSKCCK HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFN AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:443)
Compuesto 141: FGF21 (Compuesto 2)-L209-HuSA(C34A)-G4Sx3-FGF21 (Compuesto 2) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESDAHK SEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAK QRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRA DLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEK.SHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK DVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKWDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNV YQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYAS
(SEQ ID NO:446)
Compuesto 142: FGF21 (Compuesto 1)-L209-HuSA(C34A)-G4Sx3-FGF21 (Compuesto 1) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNYYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPA PRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASGETGSSGEGTGSTGS GAGESDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVD VMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFN AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQT EAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACS FRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDV GSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:447)
C o m p u e s to 143: FG F21 (C o m p u e s to 2 )-L 209 -H u S A (C 34 A , des Le u -585 )-G 4 S x3 -F G F 21 (C o m p u e s to 2) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESDAHK SEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAK QRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRA DLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAK DVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQN LIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICT LSEKERQIKKQTALVELVKJHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTV GGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNV YQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYAS
(SEQ ID NO:448)
Compuesto 144: FGF21 (Compuesto 1)-L209-HuSA(C34A, des Leu-585)-G4Sx3-FGF21 (Compuesto 1) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPA PRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASGETGSSGEGTGSTGS GAGESDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVD VMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPRLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDS1SSKLRECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK HPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFN AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTE AHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALBCPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSF RELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVG SSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:449)
C o m p u e s to 145: FG F21 (C o m p u e s to 2 )-L 210 -H u S A (C 34 A )-G 4 S x3 -F G F 21 (C o m p u e s to 2) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPL PGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQERSPSYASGETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGES GEGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVD VMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHG DLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESK DVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCK HPEAKRMPCAED YLS VYLNQLC VLHEKTP VSDRVTKCCTESL VNRRPCFS ALEVDETYVPKEFN
AETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKET CFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQT EAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACS FRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMV EPSQERSPSYAS (SEQ ID NO:450)
Compuesto 146: FGF21 (Compuesto 1)-L210-HuSA(C34A)-G4Sx3-FGF21 (Compuesto 1) HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQI LGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAFIGLPLHLPGNKSPHRDPA PRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYASGETGSSGEGTGSTGS GAGESGTGESGEGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEF AKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKXYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAA CLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT KVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPS LAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADP HECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSK.CCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYYPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEK CCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRY LYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGS LHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPG ILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:451)
C o m p u e s to 147: P K E (1 )-L 1 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
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Compuesto 148: PKE(1)-L2-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQ QTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEA CSFRELLLEDGYNYYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLS MVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:453)
Compuesto 149: PKE(1)-L3-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQEEEEDEEEEDHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYT DDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHF DPEACSFRELLLEDGYNYYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSS DPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:454)
Compuesto 150: PKE(1)-L4-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSiCYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTD DAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFD PEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSD PLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:455)
Compuesto 151: PKE(1)-L5-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQGSHHHHHHHHGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRY LYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGS LHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDV GSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:456)
Compuesto 152: PKE(1)-L6-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYR1TYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQGGGGSGGGGSGGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVR QRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGA LYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPG1LAPQ PPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:457)
C o m p u e s to 153: P K E (1 )-L 7 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
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Compuesto 154: PKE(1)-L8-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 155: PKE(1)-L9-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 156: PKE(1)-L10-FGF21 (Compuesto 2)
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Compuesto 157: PKE(1)-L11-FGF21 (Compuesto 2)
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C o m p u e s to 158: P K E (1 )-L 12 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
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Compuesto 159: PKE(1)-L13-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSTPPTPSPSTPPTPSPSPSTPPTPSPSTPPTPSPSH PIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL GVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:464)
Compuesto 160: PKE(1)-L14-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQ TEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV1QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEAC SFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSM VEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:465)
Compuesto 161: PKE(1)-L15-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQV RQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAP QPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:466)
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Compuesto 163: PKE(1)-L17-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPHPIPDSSPLLQFGGQV RQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDG ALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAP QPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:468)
C o m p u e s to 164: P K E (1 )-L 18 -F G F 21 (C o m p u e s to 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEK.PSQPSPEPGGGSPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRY LYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGS LHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDV GSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:469)
Compuesto 165: PKE(1)-L19-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPEEEDPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRY LYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK.TSRFLCQRPDGALYGS LHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDV GSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:470)
Compuesto 166: PKE(1)-L20-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQF GGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQ RPDGALY GSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPP GILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:471)
Compuesto 167: PKE(1)-L21-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPPSPEPHPI PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGV KTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGL PPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:472)
Compuesto 168: PKE(1)-L22-FGF21 (Compuesto 2) GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPTPEPPSPEPPTPEPGGGGSPSPEPPTPEPPSPEPH PIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL GVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPD V GS S DPLS MVEPS QGRSPS Y AS (SEQ ID NO:473)
C o m p u e s to 169: P K E (1 )-L 23 -F G F 21 (C o m p u e s to 2)
GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWHSYYEQNSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPYSQTTATISGLKP GVDYTITVYAVYGSKYYYPISINYRTEIEKPSQPSPEPTPEPSPEPPTPEPSPEPTPEPHPIPDSSPLLQ FGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLC QRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEP PGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:474)
Compuesto 170 [Fc(hIgG1a_191)-L7-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHP IPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:475)
Compuesto 171 [Fc(hIgG1a_191)- L250-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGSGGGGGSG GGSGGGGSGGGSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESL LQLKALICPGVIQILGVK.TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLH LGSGRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:476)
Compuesto 172 [Fc(hIgG1a_191)-L12-FGF21(Comp. 2)] KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTYDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP PSPEPPTPEPHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLK ALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSG RGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:477)
Compuesto 173 [Fc(hIgG1a_191)-L251-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTK.PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKPSPEPPTPEPPSPEPHPIPD SSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLP PAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:478)
C o m p u e s to 174 [F c (h Ig G 1 a _ 191 )-L 5 -F G F 21 (C o m p . 2)] DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM3SRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQRSLSLSPGKGSHHHHHHHHGSHP1PD SSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLP PAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:479)
Compuesto 175 [Fc(hIgG1a_191)-L252-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKELQLEESAAEAQEGELEH PIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL GVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:480)
Compuesto 176 [Fc(hIgG1a_190)-L253-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKLDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSGGGGSGGGSGGGGGSH PIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQIL GVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLP GLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:481)
Compuesto 177 [Fc(hIgG1a_191)-L6-FGF21(Comp. 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSHP IPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:482)
C o m p u e s to 178 [F c (h Ig G 1 a _ 189 )-L 6 -F G F 21 (C o m p . 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGSHPIPDS SPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKT SRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPGLPP APPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:483)
Compuesto 179 [Fc(hIgG1a_191)-L7-FGF21-1aa(Comp. 2 con el aminoácido C-terminal suprimido)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVE VHN AKTKPREEQYNSTYRVY S VLTVLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP API EKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHP IPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPG LPPAPPEPPG1LAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYA (SEQ ID NO:484)
Compuesto 180 [Fc(hIgG1a_191)-L7-FGF21-3aa(Comp. 2 con los tres aminoácidos C-terminal suprimidos)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPRDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHP
1PDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE1REDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV1Q1LG VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPG LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPS (SEQ ID NO:485)
Compuesto 181 [Fc(hIgG1f_1.1_186)-L7-FGF21 (Comp. 2)]
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGBCEYKCKVSNKALPSS1E KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGG GSHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLE1REDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVI QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFL PLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:486)
C o m p u e s to 182 [F c (h Ig G 1 a _ 191 b )-L 7 -F G F 21 (C o m p . 2)]
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTfCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGSGGGSGGGGSHP
IPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG
VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNYYQSEAHGLPLHLGSGRGPARFLPLPG
LPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVEPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO:487)
Ejemplo 5
Potencia in vitro de las moléculas de eliminación de FGF-21
En este ejemplo, la potencia de varios polipéptidos FGF-21 modificados se evalúa y se compara con la potencia del compuesto pegilado 1 en un ensayo celular de activación del receptor in vitro. Se demostró que varios polipéptidos FGF-21 modificados, incluso el compuesto pegilado 2, tienen una potencia comparable a la del compuesto pegilado 1.
Métodos
Una línea celular de células renales de embrión humano (HEK) 293 clonales, que expresa de manera estable P-klotho humano, se generó para caracterizar variantes de FGF21 en el ensayo in vitro primario. Las células HEK-293 se transfectaron de acuerdo con el protocolo del fabricante para el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y usando un plásmido linearizado que codifica P-klotho humano con un marcador FLAG en el C-terminal (N-DYKDDDDK-C en un código de aminoácidos de letras) bajo el control de un promotor de citomegalovirus. Los clones positivos se aislaron después de 14 días de cultivo en medio de selección [600 pg/ml de Geneticin (Invitrogen) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l de D-glucosa que contiene L-glutamina, Hepes (Invitrogen) y 10 % de suero bovino fetal (FBS)].
El ensayo primario midió la fosforilación dependiente de la variante de FGF21 de la quinasa regulada por la señal extracelular 1/2 (pERK1/2) en una línea celular HEK-293 clonal que expresa de manera estable P-klotho humano. Para los ensayos, las células se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon) a 40.000 células por pocillo en 200 pl de medio de selección y se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 humidificada. Después de 48 horas, el medio de selección completo se reemplazó por medio libre de suero (DMEM con 4,5 g/l de D-glucosa y 0,1 % de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos), y las células se mantuvieron durante 6 horas a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 humidificada. Los compuestos que se iban a evaluar se diluyeron en serie en un medio libre de suero. El ensayo se inició reemplazando el medio libre de suero en las células con los compuestos diluidos, la incubación continuó durante 7 minutos a temperatura ambiente, y la reacción finalizó al retirar los compuestos y agregar 100 pl de tampón de lisis (kit AlphaScreen de Perkin Elmer) a cada pocillo. Las placas se agitaron a ~ 80 rpm durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenaron congeladas a -80 °C. Se analizó una alícuota (4 pl) de cada pocillo del lisado de células descongelado para determinar la presencia de pERK1/2 de acuerdo con el protocolo del fabricante para el kit Surefire AlphaScreen pERK1/2 y el kit de detección de IgG AlphaScreen, proteína A, (Perkin Elmer) usando Proxiplates (Perkin Elmer) blancas de 384 pocillos. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas en la oscuridad y luego se leyeron en un lector multiplaca Envision 2103 (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo de AlphaScreen. Los datos se ajustaron a una ecuación de log(agonista) contra respuesta de 4 parámetros mediante regresión no lineal usando el software GraphPad Prism 5.
Resultados
La potencia in vitro se determinó midiendo la fosforilación dependiente de FGF21 de la quinasa regulada por la señal extracelular (ERK) 1/2 en una línea celular de células renales de embrión humano (HEK) 293 en la que se introdujo de manera estable P-Klotho humano para funcionar como un correceptor con variantes de corte y empalme de FGFR expresadas de manera endógena. La potencia se evaluó determinando el valor medio de EC50 o pEC50 (log 10 de base negativa de la concentración de EC50 expresada en mol por litro) para cada compuesto evaluado. Un ejemplo de curva de respuesta a la dosis se muestra en la Figura 2 para el compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2. Los resultados para los compuestos evaluados adicionales se muestran en las Tablas 4 y 5.
T - K.
Figure imgf000112_0001
T - K.
Figure imgf000112_0002
Ejemplo 6
Evaluación de estabilidad térmica de polipéptidos FGF-21 modificados
En este ejemplo, se midió la estabilidad térmica de polipéptidos FGF-21 modificados usando fluorescencia por barrido térmico (TSF) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). En la bibliografía, se reconoce que la estabilidad térmica tiene valor predictivo para determinar la tendencia a formar agregados (véase, por ejemplo, Webster, "Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins," Pharmaceutical Technology, volumen 37, edición 11, pp. 42-48, 2 de noviembre de 2013).
Métodos
Los puntos medios térmicos de desnaturalización se midieron mediante calorimetría diferencial de barrido en un MicroCal (Malvern Instruments) auto VP-DSC. Para el análisis mediante DSC, las muestras de proteínas se formularon en 250 mM de sacarosa, 20 mm de histidina pH 7,0 a aproximadamente 2 mg/ml con una tasa de barrido de 90 °C por hora. La célula de referencia se llenó con un tampón idéntico sans proteína. Los puntos medios de transición (Tm) del cambio de fase entre dominios proteicos plegados y desplegados de manera térmica en las condiciones de solución y la tasa de barrido aplicadas se determinaron de los picos máximos que se observaron en el rastro de termograma (flechas).
Para la fluorescencia por barrido térmico (TSF), la proteína se diluyó hasta obtener 0,2 mg/ml en el tampón de interés, y se añadió una pequeña cantidad de ácido anilinonaftalen sulfónico (ANS) fluoróforo fluorescente. Las muestras se colocaron en una placa de paredes delgadas para PCR de 96 pocillos, y la temperatura de la muestra de proteínas en presencia del fluoróforo extrínseco aumentó mientras que la fluorescencia de la muestra se controló en un instrumento de PCR Bio-Rad CT1000-RT. El punto medio del despliegue térmico de la proteína se determinó controlando el aumento en la señal fluorescente de la sonda mientras interactuaba con el núcleo hidrófobo recientemente expuesto de la proteína desnaturalizada de manera térmica. La temperatura en el punto medio de despliegue (Tm) en las condiciones de tasa de barrido y tampón examinadas se definió como el punto de inflexión térmico del aumento de la curva de señal fluorescente.
Resultados
Los resultados representativos del análisis mediante DSC se muestran en la Figura 3. Se observó que el compuesto pegilado 2 tenía una temperatura de punto medio de transición ("Tm") de aproximadamente 8 °C más que el compuesto pegilado 1. La reversibilidad térmica fue >95 % (no se muestran datos).
La Figura 4 muestra resultados representativos de la TSF. El compuesto 10 presentó un aumento de aproximadamente 8 °C en Tm con respecto al compuesto 1 (que tiene secuencia de FGF-21 de tipo silvestre, excepto que se incluye una metionina N-terminal para la expresión en E. coli). Los resultados para los compuestos adicionales se muestran en la Tabla 6 más adelante.
En conjunto, estos resultados indican que, razonablemente, se prevé que los compuestos de ejemplo tengan una menor tendencia a formar agregados, por ejemplo, los compuestos 2, 10 y 16. Se prevé que la menor tendencia a formar agregados confiera una semivida más prolongada y/o la capacidad de formulación en una concentración mayor. Tabla 6. Resultados de la estabilidad térmica determinados mediante fluorescencia por barrido térmico para polipéptidos FGF-21 modificados en comparación con el compuesto 1. Se observó mayor estabilidad térmica de hasta aproximadamente 7-8 °C para algunos compuestos.
Figure imgf000113_0001
Ejemplo 7
Desamidación y formación de agregados
Este ejemplo describe la evaluación de la desamidación y la formación de agregados para polipéptidos FGF-21 modificados.
Métodos
Pruebas de estrés térmico:
Las muestras de proteínas de interés se prepararon en el tampón de prueba sacarosa (250 mM, histidina 20 mM, pH 6,5 y pH 7, o TRIS 20 mM pH 7,5) en una concentración de 7,5 mg de proteína/ml. Las muestras se examinaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica (aSEC) y análisis de variantes de carga mediante enfoque isoeléctrico capilar de imágenes (icIEF) en el tiempo = 0. Las muestras evaluaron para determinar el estrés colocándolas en una incubadora a 25 °C durante 1 semana, y luego a 40 °C durante 5 semanas. Se retiraron alícuotas y se examinaron mediante icIEF y aSEC en varios puntos temporales durante las siguientes 4 a 5 semanas. Se volvieron a retirar y se examinaron adicionalmente mediante aSEC e icIEF para controlar la estabilidad.
aSEC
La cromatografía de exclusión por tamaño (aSEC) se llevó a cabo en un sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) en una columna Zenix-C 300 SEC (Sepax Technologies, Newark, DE, EE. UU.) con una dimensión de 300 x 4,6 mm. La fase móvil usada fue de fosfato de potasio 200 mM y cloruro de sodio 150 mM ajustada a pH 6,9, a un caudal de 0,35 ml/min. Se inyectaron aproximadamente 20 |jg de muestra para cada análisis. La separación se controló a UV 280 nm. La cuantificación del monómero en comparación con las especies de HMW se llevó a cabo mediante la integración del área por debajo de la curva en los tiempos de retención correspondientes para cada especie.
icIEF
La desamidación se detectó mediante análisis de variantes de carga (la desamidación aumenta la carga negativa neta de la proteína y la formación de variantes ácidas) llevada a cabo mediante enfoque isoeléctrico capilar de imágenes (icIEF), que se realizó en un instrumento iCE280 (ProteinSimple, Santa Clara, CA, EE.UU.) usando un capilar recubierto con fluorocarbono, 100 jm x 50 mm. La muestra se diluyó hasta obtener 0,3 mg/ml usando una solución que contenía 0,35 % de metilcelulosa, 4 % de pH3-10 Pharmalytes, urea 4 M y 2 % de marcador de pl. El anolito y el catolito son ácido fosfórico 0,08 M e hidróxido de sodio 0,1 M, respectivamente. El enfoque se logró aplicando 1,5 kV durante 2 min y luego 3,0 kV durante 11 min. La cuantificación de las especies modificadas de carga (-) con respecto a las especies de origen se llevó a cabo mediante la integración del área correspondiente debajo de las curvas.
Resultados
Las propiedades biofísicas del compuesto pegilado 2 demostraron ser superiores a las del compuesto pegilado 1. No se observó degradación durante 5 semanas a 2-8 °C y se observaron bajas tasas de degradación en condiciones aceleradas a 40 °C con respecto al compuesto pegilado 1 (Figura 5). Los estudios acelerados de ocho semanas indican que el compuesto pegilado 2 es superior al compuesto pegilado 1 en la formulación evaluada (histidina/sacarosa, pH 7,0). En estas condiciones excipientes, la desamidación se anula y el compuesto pegilado 2 tiene una menor tendencia a formar agregados solubles de alto peso molecular (HMW). Estos resultados sugieren que el compuesto pegilado 2 tiene una ventana de pH más amplia para las opciones de formulaciones con menores tendencias a la formación de agregados con respecto al compuesto pegilado 1.
La formación de agregados de HMW también se evaluó. La formación de un agregado de menor HMW a una determinada concentración indica mayor solubilidad, lo que daría como resultado la capacidad de formularse a una mayor concentración. La Figura 6 ilustra la formación de agregados de HMW para varios polipéptidos FGF-21 modificados y el compuesto 1. Para la mayoría de los compuestos probados, la formación de agregados fue menor con respecto al compuesto pegilado 1 (por ejemplo, el compuesto pegilado 2 y el compuesto pegilado 10). Para algunos compuestos, la formación de agregados de HMW fue similar a la del compuesto pegilado 1 o mayor.
También se evaluó la desamidación. La Figura 7 ilustra los niveles detectados de desamidación (indicada por la formación de variantes ácidas en el transcurso de un tiempo) para varios polipéptidos FGF-21 modificados y el compuesto pegilado 1. Para todos los polipéptidos FGF-21 modificados que se muestran, el nivel de desamidación detectado disminuyó con respecto al compuesto pegilado 1.
Ejemplo 8
Evaluación de la solubilidad de polipéptidos FGF-21 modificados
Este ejemplo describe la medición de la solubilidad relativa de los polipéptidos FGF-21 modificados. Los resultados indican la capacidad de un compuesto para formularse en una concentración relativamente alta, lo que permitiría una más simple administración de una dosificación eficaz.
Métodos
Las evaluaciones de solubilidad relativa se realizaron mediante ciclos de concentración de flujo de obturador seguidos de análisis de cromatografía de exclusión por tamaño. Las muestras, formuladas en PBS pH 7,2 en concentraciones iniciales similares, pero no idénticas, se colocaron en pipetas de concentradores centrífugos de 3 kDa de peso molecular y se hicieron girar a 4750 RPM durante ciclos de 10 minutos, 15 minutos y 30 minutos a 4 °C. Entre los ciclos de giros, se retiraron las alícuotas del aparato de concentración, y se realizó un análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño (aSEC) (en una columna GE Healthcare Superdex S-75 10/300 GL equilibrada en tampón PBS pH 7,2) para determinar la concentración de especies monoméricas y HMW en la solución.
Las concentraciones totales se determinaron mediante absorbancia a 280 nm con un espectrofotómetro NanoDrop. El porcentaje de alto peso molecular se determinó mediante cálculos del área debajo de la curva de picos de alto peso molecular con respecto a picos monoméricos en rastro de cromatograma SEC. Los puntos de datos resultantes se trazan para visualizar el orden de clasificación de las construcciones menos solubles a las construcciones más solubles en las condiciones de prueba, en donde cuanto más baja sea la pendiente creada por los puntos de datos, más estable será la variante proteica en las condiciones de prueba.
Resultados
La solubilidad relativa de los polipéptidos FGF-21 modificados se determinó midiendo la formación de agregados de alto peso molecular (HMW) como una función de concentración proteica. La formación de un agregado de menor HMW a una determinada concentración indica mayor solubilidad, lo que daría como resultado la capacidad de formularse a una concentración más alta.
La pendiente de la curva de solubilidad del flujo de obturador para los compuestos probados se muestran a continuación en la Tabla 7 (valores más bajos indican menos formación de agregados y, por ende, la capacidad de formularse a una concentración más alta). Se observaron niveles de formación de agregados relativamente bajos para varios de los compuestos (por ejemplo, el compuesto 2 y el compuesto 10), lo cual indica una baja formación de agregados y una mayor solubilidad (Figura 8 y Tabla 7). La pendiente de solubilidad de flujo de obturador más alta se observó para el compuesto 1.
T l 7. R l l ili fl r r r l li i F F-21 m ifi
Figure imgf000115_0001
Ejemplo 9
Evaluación de inmunogenicidad de moléculas de deleción de FGF-21
Se llevaron a cabo estudios de respuesta de activación de linfocitos T, e indicaron que la secuencia proteica usada en la mayoría de los compuestos presentaba una respuesta equivalente a la secuencia proteica en el compuesto pegilado 1.
Métodos
La inmunogenicidad se evaluó mediante un ensayo de proliferación de linfocitos T CD4+. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un conjunto variado de donantes de sangre humana usando un gradiente Ficoll. Los donantes se evaluaron para rastrear HLA (antígenos leucocitarios humanos) para garantizar la cobertura de la variabilidad en el alelo de MHC clase II presente en la población humana. Después del etiquetado, las PBMC con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se colocaron en un formato de placas de 96 pocillos a 200.000 células por pocillo en medio de cultivo celular convencional en presencia del compuesto evaluado durante 7 días. La proliferación de los linfocitos T CD4+ se analizó etiquetando un anticuerpo anti CD4 y mediante citometría de flujo. El porcentaje de antigenicidad de las proteínas se calculó como el porcentaje de donantes que muestran respuesta significativa a la proliferación de linfocitos T CD4+ T con respecto a un control de medio.
Resultados
En una evaluación de riesgos de inmunogenicidad in vitro usando un ensayo de proliferación de linfocitos T humanos, 13 de cada 40 donantes (32,5 %) mostraron respuesta proliferativa de CD4+ después de 7 días de exposición al compuesto 2 en comparación con 15 de cada 40 donantes que mostraron una señal positiva del compuesto 1 (que tiene una secuencia de FGF-21 de tipo silvestre, excepto que se incluye una metionina N-terminal para la expresión en E. coli) (Figura 9). Mientras que este experimento celular no reemplaza las observaciones de respuesta inmunitaria humana real, este análisis sugiere que no hay un mayor riesgo de inmunogenicidad humana para el compuesto 2 en comparación con FGF21 de tipo silvestre.
Otros polipéptidos FGF-21 modificados se evaluaron en el ensayo de proliferación de CD4+ en comparación con el compuesto 1 (Figura 9). Por lo general, la inmunogenicidad fue similar a la observada en la secuencia de FGF21 de control (compuesto 1), con la excepción del compuesto 10, que presentó una respuesta inmunitaria relativamente más alta, lo cual indica que el compuesto puede ser indeseablemente inmunogénico si se administra a pacientes humanos.
Ejemplo 10
Estabilidad in vivo de polipéptidos FGF-21 modificados C-terminalmente intactos (activos)
Este estudio evaluó el nivel de los polipéptidos FGF-21 modificados C-terminalmente intactos (es decir, activos) in vivo. El compuesto pegilado 2 presentó un gran aumento en la proporción de polipéptidos activos, C-terminalmente intactos, en comparación con el compuesto pegilado 1, lo que incluye una mayor duración de la actividad in vivo.
Métodos
La farmacocinética del compuesto pegilado 2 y el compuesto pegilado 1 se evaluó en macacos siguiendo una dosis subcutánea (SC) de 0,25 mg/kg y 0,225 mg/kg, respectivamente. Se recolectaron muestras de sangre (0,2 ml) 0, 0,25, 0,5, 1, 3, 7, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h después de la administración del fármaco y se almacenaron a - 80 ° C hasta que se sometieron a bioanálisis.
Los parámetros farmacocinéticos del compuesto pegilado 1 y el compuesto pegilado 2 totales y C-terminalmente intactos se obtuvieron mediante análisis no compartimental de la concentración en suero o plasmática en comparación con los datos del tiempo (Phoenix™ WinNonlin®, 6.3, Pharsight Corporation, St. Louis, MO). El área bajo la curva desde el tiempo cero hasta la infinidad [AUC(tot)] se calculó usando una combinación de sumas trapezoidales lineales y logarítmicas. El cálculo de AUC y semivida (t 1/2) se realizó usando un mínimo de 3 puntos temporales con concentraciones cuantificables.
Las concentraciones del compuesto pegilado 1 total en los estudios de PK de dosis única se midieron usando un ensayo de inmunoabsorción electroquimioluminiscente (ECLIA) basado en Meso Scale Discovery (MSD) no validado. Se usó un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de PEG para capturar el compuesto pegilado 1, seguido del uso de un anticuerpo policlonal (pAb) anti-FGF21 de conejo para la detección del compuesto pegilado 1 total.
La farmacocinética (PK) subcutánea (SC) del compuesto pegilado 2 y el compuesto pegilado 1 también se evaluó en ratones Ob/Ob macho. El compuesto pegilado 2 se administró a ratones (n=3/punto temporal/vía) como una única inyección SC de 0,1 mg/kg. El compuesto pegilado 1 se administró como una dosis SC única de 0,05 mg/kg. Las muestras de sangre se recolectaron en varios puntos temporales después de la administración del fármaco y se procesaron esencialmente como se describió para macacos.
La lectura fue mediante electroquimioluminiscencia, expresada en unidades de luz relativa (RLU, por sus siglas en inglés), que fue proporcional a la cantidad de compuesto pegilado 1 total unido por los reactivos de detección y de captura. Las curvas patrón fueron entre 0,2 y 154 ng/ml. Las muestras de prueba se cuantificaron usando un modelo de regresión logística ideal de 4 parámetros con un factor de ponderación de 1/Y. El mismo ensayo se usó para medir las concentraciones del compuesto pegilado 1 intacto C-terminal en suero de ratas ZDF y macacos, excepto que se usó un pAb anti-FGF21 de conejo específico C-terminal del compuesto pegilado 1 para la detección. Las curvas patrón fueron entre 0,2 y 154 ng/ml. Las muestras de prueba se cuantificaron usando un modelo de regresión logística ideal de 4 parámetros con un factor de ponderación de 1/Y.
Resultados
El compuesto pegilado 1 se somete a proteólisis in vivo, de modo que, con el transcurso de un tiempo, gran parte del compuesto pasa a tener una forma truncada, inactiva. La estabilidad proteolítica in vivo de los compuestos pegilados 1 y 2 se comparó en ratones ob/ob (Figura 10) y macaco (Figura 11). Estos resultados muestran que el AUC de la forma intacta C-terminal activa aumentó de 7 a 8 veces para el compuesto de FGF-21 modificado que contiene la deleción (compuesto pegilado 2) en comparación con el compuesto pegilado 1, lo cual indica que el compuesto pegilado 2 aumentó la estabilidad proteolítica in vivo.
Ejemplo 11
Estudios farmacocinéticos de polipéptidos FGF-21 modificados
Este ejemplo presenta los resultados de los estudios farmacocinéticos usando polipéptidos FGF-21 modificados en ratones, ratas y macacos (véase la Tabla 8, más adelante).
En síntesis, la depuración del compuesto pegilado 2 fue baja en ratones, ratas y monos (intervalo: 0,94 - 2,6 ml/h/kg). El volumen de distribución (Vss), a ~0,04 - 0,05 l/kg, fue muy cercano al volumen plasmático e indicó una distribución mínima en el espacio extravascular. La biodisponibilidad subcutánea (SC) fue aceptable en ratones (40 %) y monos (58 %), mientras que fue relativamente baja en ratas (16 %). Esta baja biodisponibilidad SC puede ser específica de las ratas, ya que se observó que otras moléculas pegiladas producen un fenómeno similar (baja biodisponibilidad SC en ratas, buena biodisponibilidad en ratones, monos y seres humanos). Con mayor importancia, la biodisponibilidad SC para el compuesto pegilado 2 en estas especies (que incluyen ratas) fue 2 - 3,4 veces más alta en comparación con el compuesto pegilado 1.
Después de la administración SC del compuesto pegilado 2 a ratones, ratas y monos, se produjo un aumento constante (7-8 veces) en exposición normalizada a la dosis (AUC) de la proteína intacta, en comparación con el compuesto pegilado 1. El aumento de la exposición del compuesto pegilado 2 intacto después de la administración subcutánea se puede atribuir a la baja depuración sistémica (2 - 5 veces) junto con una mejora (2 - 3,4 veces) en la biodisponibilidad subcutánea en las tres especies en comparación con el compuesto pegilado 1.
El compuesto pegilado 2 total, compuesto por una mezcla de fragmentos proteolíticos y compuesto pegilado 2 intacto, también se midió en estos estudios farmacocinéticos. La relación de AUC entre el compuesto pegilado 2 intacto y el compuesto pegilado 2 total en ratones y ratas fue cercana a 1 después de la administración IV, lo cual indica una proteólisis sistémica mínima. Sin embargo, después de la administración SC, la relación fue de 0,6 - 0,86 en estas especies, lo cual indica que se produce proteólisis en el sitio SC. Se observó una tendencia similar en monos, en donde la relación de AUC entre el compuesto pegilado 2 intacto y el compuesto pegilado 2 total fue apenas menor después de la administración SC en comparación con la administración IV (0,7 después de la dosificación SC contra 0,8 después de la dosificación IV).
En general, el compuesto pegilado 2 demostró propiedades farmacocinéticas in vitro e in vivo favorables, incluso mayor biodisponibilidad, menor depuración y mayor AUC (área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo).
T l . F rm in i IV l r ín F F-21 m ifi in n r n r m n .
Figure imgf000117_0001
Abreviaturas: CL: depuración corporal total aparente del fármaco en plasma; Vss: volumen de distribución aparente en estado estable; MRT: tiempo medio de residencia; SC BA: biodisponibilidad subcutánea; SC AUC: área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo subcutánea.
Ejemplo 12
Estudios in vivo de dosis repetidas de polipéptidos FGF-21 modificados en un modelo de ratón de diabetes
El compuesto pegilado 2 y el compuesto pegilado 1 se evaluaron en un estudio de dosis repetidas durante 21 días. Los resultados demostraron que, mientras que ambos compuestos fueron eficaces para mejorar los síntomas metabólicos, la semivida in vivo más prolongada del compuesto pegilado 2 activo produjo mayores efectos terapéuticos, en particular, cuando se comparan con los efectos de las dosis semanales.
Métodos
En el comienzo del estudio, los ratones ob/ob macho (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) tenían 8 semanas de vida. Los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento en función de su peso corporal y sus niveles de glucosa. Todos los grupos se trataron con administración subcutánea (s.c.) de 1 ml/kg de soluciones de dosis. Los grupos de tratamiento fueron los siguientes: 1) vehículo (sacarosa 250 mM/Tris 20 mM, pH 8,3) dos veces por semana (BIW), 2) compuesto pegilado 1, 0,15 mg/kg BIW, 3) compuesto pegilado 2, 0,15 mg/kg BIW, 4) compuesto pegilado 1, 0,3 mg/kg una vez por semana (QW), o 5) compuesto pegilado 2, 0,3 mg/kg QW. Los ratones a los que solo se les administró compuesto una vez por semana recibieron vehículo los días en que los grupos BIW recibieron su segunda inyección semanal de compuesto. El peso corporal, glucosa en plasma, triglicéridos (analizador de química clínica Olympus AU680) e insulina (ELISA, Mercodia Inc.) se determinaron en el período de dosis de 21 días después de la ingestión de alimentos. Se determinó la hemoglobina glicada (HbA1c) en sangre al inicio y final del estudio, también con el analizador de Olympus.
Resultados
Tanto el compuesto pegilado 1 como el compuesto pegilado 2 se administraron por vía subcutánea usando dosis de 0,15 mg/kg dos veces por semana (BIW) y 0,3 mg/kg QW. Las concentraciones plasmáticas mínimas medidas el día 21 muestran que la exposición de FGF21 total (intacto y proteolizado) fue similar para ambas variantes, pero la exposición del compuesto pegilado 2 intacto C-terminal activo fue 12 a 25 veces más alta que la del compuesto pegilado 1 después de la administración QW o BIW, respectivamente (Tabla 9).
Tabla 9: Exposición del compuesto pegilado 1 intacto C-terminal y el compuesto pegilado 2 en su concentración mínima después de 21 días de dosis repetidas en ratones ob/ob (media de s.e.m.)
Parámetro Compuesto Compuesto Compuesto Compuesto pegilado 2 BIW pegilado 1 BIW pegilado 2 pegilado 1 (0,15 mg/kg) (0,15 mg/kg) QW (0,3 QW (0,3 mg/kg) mg/kg) Niveles mínimos de 175 43 7 0,7 38 3 3 0,1
conc. (ng/ml)
Cmáx proyectada 1064 313 2149 633
(ng/ml)*
(continuación)
Parámetro Compuesto Compuesto Compuesto Compuesto pegilado 2 BIW pegilado 1 BIW pegilado 2 pegilado 1 (0,15 mg/kg) (0,15 mg/kg) QW (0,3 QW (0,3
mg/kg) mg/kg)
AUC proyectada 107 18 107 18
(|jg/ml*h)*
* Proyectada en función de datos farmacocinéticos de dosis única en ratones ob/ob
La hemoglobina glicada (HbA1c) se generó in vivo a partir de la adición no enzimática de glucosa a aminoácidos específicos dentro de esta proteína, y el porcentaje de HbA1c medido corresponde al promedio de glucosa en sangre integrada durante la vida de eritrocitos circulantes. Un valor de HbA1c mayor de 6,5 % es un criterio de diagnóstico para diabetes. Los cambios corregidos con vehículo en HbA1c el día 21 del estudio de dosis repetidas se muestran en la Figura 12. La administración BIW de 0,15 mg/kg de polipéptidos FGF21 normalizó la HbA1c a valores de menos de 5 % después de 21 días de administración. Sin embargo, solo el compuesto pegilado 2 redujo considerablemente, desde el punto de vista estadístico, la AHbA1c en comparación con vehículo con la administración QW de 0,3 mg/kg, lo que guarda relación con el aumento considerable en la exposición funcional a la proteína intacta C-terminal activa. Estos resultados indican que el mantenimiento de una concentración mínima diana (Cmínima) puede ser suficiente para la eficacia (Tabla 9).
De manera coherente con los resultados de reducción de HbA1c, los niveles de glucosa en plasma también se redujeron de manera considerable durante el estudio (todos los grupos p<0,01 los días 2 a 21 en comparación con vehículo, excepto las dosis QW el día 14, para lo cual el compuesto pegilado 2 alcanzó significancia estadística (p<0,05) y el compuesto pegilado 1 no fue considerable) (Figura 16). En general, el cambio en la AUC de la glucosa (porcentaje de diferencia desde el vehículo) se redujo considerablemente mediante todos los tratamientos durante el curso del estudio (p<0,001 en comparación con vehículo) (Figura 17).
De manera adicional, los niveles de triglicéridos en plasma se redujeron considerablemente en el grupo del compuesto pegilado 2 en comparación con el de vehículo, los días 2 y 4 para el grupo BIW (p<0,01) y los días 2, 4, 10 y 17 para el grupo QW (p<0,01), así como los días 2 y 17 para el grupo QW de compuesto pegilado 1 (p<0,05) (Figura 18).
El compuesto pegilado 2 redujo considerablemente el porcentaje de aumento de peso corporal con respecto al vehículo o compuesto pegilado 1 durante el curso del estudio de 21 días en ratones ob/ob (Figura 13 y en la Figura 14) . La administración QW de 0,3 mg/kg de compuesto pegilado 2 mostró menor eficacia los días 7, 14 y 21 cuando el peso corporal se midió en concentraciones mínimas, lo que indicó nuevamente que mantener una concentración mínima diana (Cmínima) puede ser suficiente para lograr efectividad.
La administración BIW de 0,15 mg/kg de compuesto pegilado 2 redujo considerablemente, desde el punto de vista estadístico, los niveles de insulina en plasma durante el estudio de dosis repetidas de 21 días en ratones ob/ob (Figura 15) ; la administración BIW de compuesto pegilado 1 no logró reducir de manera considerable la insulina en plasma después del Día 10, La administración QWde 0,3 mg/kg de compuesto pegilado 2 produjo un perfil "dentado" evidente con una tendencia a superar los valores en el grupo de vehículo los Días 14 y 21 cuando la insulina se midió en las concentraciones mínimas del compuesto. Este patrón sugiere que el compuesto pegilado 2 puede conservar el contenido de insulina en el páncreas con una dosis crónica.
Estos resultados muestran que manteniendo una concentración mínima de 175 ng/ml (Tabla 9) para el compuesto pegilado 2 en el brazo 0,15 mg/kg BIW, se produjeron mejoras considerables en las mediciones de cambios en glucemia y peso corporal.
Con respecto al compuesto pegilado 1, una mayor exposición al compuesto pegilado 2 intacto C-terminal activo en el modelo de ratón ob/ob dio como resultado una potencia in vivo mejorada basado en la dosis y duración de acción extendida con administración QW, lo que produjo mayores reducciones en HbA1c, aumento de peso e insulina en plasma.
Ejemplo 13
La progresión de hígado graso a esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) puede provocar, en última instancia, fibrosis hepática. Este ejemplo describe el uso de un polipéptido FGF-21 que comprende un polipéptido FGF-21 humano modificado para contener una sustitución de para-acetil-L-fenilalanina por glutamina en la posición 108 y enlazado a un poli(etilenglicol) 30 kDa ("compuesto pegilado 1" o "PEG-compuesto 1", SEQ ID NO:201) en un modelo de fibrosis. Específicamente, el PEG-compuesto 1 se evaluó en el modelo de 2 entradas de EHNA de Stelic Institute, en el que los ratones C57BL6 se tratan con estreptozotocina poco tiempo después de su nacimiento para inducir la diabetes, y luego son puestos en dieta grasa a las 4 semanas de vida. Estos ratones desarrollaron hígado graso (5 semanas), EHNA (7 semanas), fibrosis hepática (9 semanas) y, en última instancia, carcinoma hepatocelular (16 semanas) durante el curso de un tiempo reproducible. El PEG-compuesto 1 previno o revirtió eficazmente el desarrollo de EHNA en el modelo Stelic cuando los ratones recibieron tratamiento a las 5 a 9 semanas de vida (modelo preventivo) o a las 7 a 9 semanas de vida (modelo terapéutico). El PEG-compuesto 1 también redujo la fibrosis hepática en el punto temporal de 9 semanas en este estudio.
La secuencia del PEG-compuesto 1 es la siguiente:
MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQR PDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGI LAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 201), en donde pAF está enlazado a un PEG de 30 kDa.
Materiales y métodos
Los ratones C57BL/6 (hembras con 15 días de preñez) se obtuvieron de Charles River Laboratories Japan, Inc. (Kanagawa, Japón). Todos los animales usados en el estudio fueron alojados y cuidados de acuerdo con la normativa sobre el uso de animales que brinda la Sociedad Japonesa de Farmacología.
Los animales se mantuvieron en una instalación SPF en condiciones controladas de temperatura (23 ± 2 °C), humedad (45 ± 10 %), iluminación (12 horas de luz artificial y ciclos de oscuridad; luz de 8:00 a 20:00) e intercambio de aire. Se mantuvo una presión alta (20 ± 4 Pa) en la sala de experimentos para evitar la contaminación de las instalaciones. Los animales se alojaron en jaulas de policarbonato KN-600 (Natsume Seisakusho, Japón) con un máximo de 4 ratones por jaula. Se usó PULMASj esterilizado (Material Research Center, Japón) para hacer los lechos y se reemplazó una vez por semana.
Se proporcionó a demanda una dieta sólida de alto contenido graso (HFD) esterilizada, que se colocó en la tapa de metal sobre la jaula. Se proporcionó agua pura a demanda de una botella de agua equipada con un obturador de goma y un sorbete. Las botellas de agua se reemplazaron una vez por semana, se limpiaron, se esterilizaron en autoclave y se reutilizaron.
EHNA fue inducido en 40 ratones macho mediante una sola inyección subcutánea de 200 |jg de solución de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich Co. LLC., EE. UU.) 2 días después del nacimiento, que recibieron una dieta de alto contenido graso (HFD, 57 kcal % de grasa, n.° cat.: HFD32, CLEA Japan, Inc., Japón) después de las 4 semanas de vida ("ratones STAM"). El consumo de alimentos se midió a diario por semana durante el período de tratamiento.
Se administraron PEG-compuesto 1 y vehículo (20 mM de Tris/250 mM de sacarosa, pH 8,3) por vía subcutánea en un volumen de 1 ml/kg. El PEG-compuesto 1 se administró en dosis de 1 y 3 mg/kg dos veces por semana.
La glucosa en sangre sin ayuno se midió usando LIFE CHECK (EIDIA Co. Ltd., Japón). Para la bioquímica en plasma, se extrajo sangre en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japón) y se centrifugó a 1000 xg durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recolectó y se almacenó a -80 °C hasta que se usó. Los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), triglicéridos y colesterol total en plasma se midieron con FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation, Japón).
Los extractos de lípidos totales del hígado se obtuvieron mediante el método de Folch (Folch J. et al., J. Biol. Chem.
1957;226: 497). Las muestras de hígado se homogeneizaron en cloroformo-metanol (2:1, v/v) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Después del lavado con cloroformo-metanol-agua (8:4:3, v/v/v), los extractos se evaporaron hasta secarse y se disolvieron en isopropanol. El contenido de triglicéridos y colesterol en el hígado se midió mediante las pruebas de epsilometría E-test de triglicéridos y E-test de colesterol, respectivamente (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón).
Para la tinción con hematoxilina y eosina (HE), se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido del hígado prefijado en solución de Bouin y teñido con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japón) y solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). El índice de actividad (NAS) de la enfermedad del hígado graso (NAFLD) se calculó de acuerdo con los criterios de Kleiner (Kleiner DE. et al., Hepatology, 2005;41:1313). Para visualizar la grasa macro y microvesicular, se cortaron criosecciones de tejidos hepáticos congelados, prefijados en 10 % de formalina en tampón neutral, embebidos en compuesto O.C.T. Tissue-Tek (Sakura Finetek Japan Co. Ltd., Japón) y se tiñeron con Rojo aceite O (Sigma-Aldrich). Para la inmunohistoquímica, se cortaron secciones de tejidos hepáticos congelados embebidos en compuesto Tissue-Tek O.C.T. y fijados en acetona. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó usando 0,03 % de H2O2 durante 5 minutos, y luego se incubó con Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Japón) durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con una dilución de 200 veces de anticuerpo anti-F4/80 (BMA Biomedicals, Suiza) durante una noche a temperatura ambiente. Después de la incubación con anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra antirrata HRP, Invitrogen, EE. UU.), se realizaron reacciones de enzima-sustrato usando solución de 3,3'-diaminobencidina/H2O2 (Nichirei Bioscience Inc., Japón).
Para el análisis cuantitativo de áreas con fibrosis, depósito de grasa e inflamación, se capturaron imágenes de campo brillante de secciones teñidas con rojo sirio, con rojo aceite e inmunoteñidas con F4/80 aproximadamente la vena central usando una cámara digital (DFC280; Leica, Alemania) con una ampliación de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron usando el software ImageJ (National Institute of Health, EE.UU.).
Para PCR cuantitativo, se extrajo el ARN total de las muestras hepáticas usando ARNiso (Takara Bio Inc., Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un |jg de ARN se transcribió de manera inversa usando una mezcla de reacción que contenía MgCl24,4 mM (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Suiza), 40 U de inhibidor de RNasa (Toyobo Co., Ltd., Japón), dNTP 0,5 mM (Promega Corporation, EE.UU.), hexámero aleatorio 6,28 jM (Promega Corporation), 5 x de tampón de primera cadena (Promega), ditiotreitol 10 mM (Invitrogen) y MMLV-RT 200 U (Invitrogen) en un volumen final de 20 j l . La reacción se llevó a cabo durante 1 hora a 37 °C, luego durante 5 minutos a 99 °C. Se realizó PCR en tiempo real usando PCR DICE en tiempo real y SYBR premix Taq (Takara Bio). Para calcular el nivel de expresión de ARNm relativo, la expresión de cada gen se normalizó a la del gen de referencia 36B4 (símbolo del gen: Rplp0). Las secuencias de cebadores de PCR fueron las siguientes: 36B4: 5'-TTCCAGGCTTTGGGCATCA-3' directo; 5'-ATGTTCAGCATGTTCAGCAGTGTG-3' inverso; Alfa-SMA: 5'-AAGAGCATCCGACACTGCTGAC-3' directo; 5'-AGCACAGCCTGAATAGCCACATAC-3' inverso; TIMP-1: 5'-TGAGCCCTGCTCAGCAAAGA-3' directo; 5'-GAGGACCTGATCCGTCCACAA-3' inverso; Colágeno tipo 1: 5'-CCAACAAGCATGTCTGGTTAGGAG-3' directo; 5'-GCAATGCTGTTCTTGCAGTGGTA-3' inverso; TGF-beta: MA030397 5'-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3' directo; 5'-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3' inversa. Las identidades génicas son las siguientes: 36B4 : Proteína ribosómica, grande, P0, Alfa-SMA: Actina muscular, alfa 2, músculo liso, aorta (Acta2), Timp-1: Tejido muscular inhibidor de metaloproteinasa 1 (Timpl), variante del transcrito 1, Colágeno tipo 1: Colágeno muscular, tipo I, alfa 2 (Col1a2), TGF-beta: factor beta de crecimiento transformante.
Para el período de tratamiento de 5-9 semanas, se realizaron análisis estadísticos mediante la prueba de comparación múltiple Bonferroni usando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., EE.UU.) Para el período de tratamiento de 7­ 9 semanas, se realizaron análisis estadísticos t mediante la prueba t de Student usando GraphPad Prism 4. Los valores P < 0,05 se consideraron importantes desde el punto de vista estadístico. Se identificó una tendencia a la significancia estadística cuando una prueba t de una cola devolvía valores P < 0,10. Los resultados se expresaron como desviación estándar (SD) de la media ±.
Cada grupo de estudio contenía 8 ratones STAM tratados por vía subcutánea con vehículo o PEG-compuesto 1 en un volumen de 1 ml/kg dos veces por semana. Los animales se sacrificaron a las 9 semanas. Los grupos del estudio fueron los siguientes:
Grupo 1: Vehículo. A 8 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo en un volumen de 1 ml/kg dos veces por semana, desde las 5 hasta las 9 semanas de vida.
Grupo 2: PEG-compuesto 1-dosis baja. A 8 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo enriquecido con PEG-compuesto 1 en una dosis de 1 mg/kg dos veces por semana, desde las 5 hasta las 9 semanas de vida.
Grupo 3: PEG-compuesto 1-dosis alta. A 8 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo enriquecido con PEG-compuesto 1 en una dosis de 3 mg/kg dos veces por semana, desde las 5 hasta las 9 semanas de vida.
Grupo 4: Vehículo. A 8 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo en un volumen de 1 ml/kg dos veces por semana, desde las 7 hasta las 9 semanas de vida.
Grupo 5: PEG-compuesto 1-dosis alta. A 8 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo enriquecido con PEG-compuesto 1 en una dosis de 3 mg/kg dos veces por semana, desde las 7 hasta las 9 semanas de vida.
La viabilidad, los signos clínicos y el comportamiento se monitorizaron a diario. Se registró el peso corporal antes del tratamiento. Se observaron los ratones para detectar signos clínicos significativos de toxicidad, agonía y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Al final del estudio, los animales se sacrificaron por desangramiento a través de punción cardíaca directa bajo anestesia de éter (Wako Pure Chemical Industries).
Resultados
Los cambios de peso corporal se muestran en la Figura 19.
Para el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), el peso corporal aumentó gradualmente durante el período de tratamiento. La media del peso corporal del grupo de PEG-compuesto 1-bajo fue considerablemente menor que la del grupo de vehículo los días 11, 13, 15, 16, 18, 19, 20, y desde el día 22 hasta el día 28. La media del peso corporal del grupo de PEG-compuesto 1 -alto fue considerablemente menor que la del grupo de vehículo desde el día 10 hasta el día 28. Ninguno de los animales mostró deterioro en las condiciones generales.
Para el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el peso corporal aumentó gradualmente durante el período de tratamiento. La media del peso corporal del grupo PEG-compuesto 1 -alto fue considerablemente menor que la del grupo de vehículo los días 5, 6, 9 y desde el día 11 hasta el día 14. Ninguno de los animales mostró deterioro en las condiciones generales.
El consumo total de alimentos se muestra en la Figura 20.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), no hubo diferencias significativas en el consumo total de alimentos entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (vehículo: 130 ± 4 g/ratón, PEG-compuesto 1-bajo: 130 ± 3 g/ratón, PEG-compuesto 1 -alto: 131 ± 3 g/ratón).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el consumo total de alimentos tendió a aumentar en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 62 ± 3 g/ratón, PEG-compuesto 1 -alto: 68 ± 2 g/ratón).
El peso corporal en el momento del sacrificio se muestra en la Figura 21 y en la Tabla 10.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), en el momento del sacrificio, los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable en la media de peso corporal en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 21,7 ± 1,4 g, PEG-compuesto 1-bajo: 19,5 ± 1,4 g, PEG-compuesto 1 -alto: 18,9 ± 1,6 g).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), en el momento del sacrificio, el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en la media de peso corporal en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 21,5 ± 1,4 g, PEG-compuesto 1 -alto: 19,8 ± 1,0 g).
El peso del hígado y la relación de peso del hígado con respecto a peso corporal se muestran en la Figura 22 y en la Figura 23 y en la Tabla 10).
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable en la media de peso del hígado en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1511 ± 66 mg, PEG-compuesto 1-bajo: 1163 ± 117 mg, PEG-compuesto 1 -alto: 970 ± 237 mg). Los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable en la media de relación de peso del hígado con respecto a peso corporal en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 7,0 ± 0,4 %, PEG-compuesto 1-bajo: 6,0 ± 0,5 %, PEG-compuesto 1 -alto: 5,1 ± 0,9 %).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en la media de peso del hígado en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1364 ± 126 mg, PEG-compuesto 1 -alto: 1008 ± 135 mg). Los grupos de PEG-compuesto 1 -alto mostraron una reducción considerable en la media de relación de peso del hígado con respecto al peso corporal en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 6,4 ± 0,5 %, PEG-compuesto 1 -alto: 5,1 ± 0,8 %).
T l 1 . P r r l l hí .
Figure imgf000121_0001
__________
La glucosa en sangre completa se muestra en la Figura 24 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en la media de glucosa en sangre completa en comparación con el grupo de vehículo. Los niveles de glucosa en sangre tendieron a disminuir en el grupo de PEG-compuesto 1-bajo en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 691 ± 114 mg/dl, PEG-compuesto 1-bajo: 566 ± 119 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 493 ± 136 mg/dl).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en la media de glucosa en sangre en comparación con el grupo de vehículo (Vehículo: 656 ± 85 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 454 ± 104 mg/dl).
ALT en plasma se muestra en la Figura 25 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), no hubo diferencias significativas en los niveles de ALT en plasma entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (vehículo: 82 ± 66 U/l, PEG-compuesto 1-bajo: 64 ± 36 U/l, PEG-compuesto 1 -alto: 108 ± 78 U/l).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), los niveles de ALT en plasma tendieron a disminuir en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 229 ± 285 U/l, PEG-compuesto 1 -alto: 36 ± 8 U/l).
Los niveles de triglicéridos en plasma se muestran en la Figura 26 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable en los niveles de triglicéridos en plasma en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 322 ± 341 mg/dl, PEG-compuesto 1-bajo: 75 ± 39 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 64 ± 22 mg/dl). Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en los niveles de triglicéridos en plasma en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 139 ± 39 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 59 ± 51 mg/dl).
Los niveles de colesterol total en plasma se muestran en la Figura 27 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los niveles de colesterol total en plasma tendieron a disminuir en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de colesterol total entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1-bajo (vehículo: 121 ± 20 mg/dl, PEG-compuesto 1-bajo: 114 ± 19 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 98 ± 31 mg/dl).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), no hubo diferencias significativas en los niveles de colesterol total en plasma entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 -alto (Vehículo: 121 ± 19 mg/dl, PEG-compuesto 1 -alto: 115 ± 29 mg/dl).
El contenido de triglicéridos en el hígado se muestra en la Figura 28 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable en el contenido de triglicéridos en el hígado en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 54 ± 13 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1-bajo: 25 ± 7 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1 -alto: 22 ± 9 mg/g de hígado).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró una reducción considerable en los niveles de triglicéridos en el hígado en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 53 ± 11 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1 -alto: 17 ± 6 mg/g de hígado).
El contenido de colesterol en el hígado se muestra en la Figura 29 y en la Tabla 11.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1,2 y 3), no hubo diferencias significativas en el contenido de colesterol en el hígado entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (vehículo: 2,9 ± 0,7 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1-bajo: 2,9 ± 0,6 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1 -alto: 3,1 ± 0,4 mg/g de hígado).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), no hubo diferencias significativas en el contenido de colesterol en el hígado entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (vehículo: 3,1 ± 0,8 mg/g de hígado, PEG-compuesto 1 -alto: 3,6 ± 1,5 mg/g de hígado).
T l 11. Bi ími n l n r n l hí .
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Análisis histológico: Tinción con HE e índice de actividad de NAFLD
Los fotomicrógrafos representativos de las secciones teñidas con HE se muestran en las Figuras 30A-30B, y los resultados de los índices de actividad de NAFLD se muestran en la Figura 31, en las Figuras 32A-32C y en la Tabla 12. (El índice de actividad de NALFD (Figura 31) es un conjunto de índices de esteatosis, vacuolización de hepatocitos e inflamación lobular). Los resultados que se muestran en la Tabla 12 se basaron en los criterios de clasificación que se muestran en la Tabla 13.
Tabla 12. Índice de actividad de NAFLD.
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Tabla 13. Definición de com onentes NAS
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continuación
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Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), las secciones de hígado del grupo de vehículo presentaron depósito de grasa micro y macrovesicular grave, vacuolización hepatocelular e infiltración celular inflamatoria. Los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron mejoras marcadas (reducciones) en el depósito de grasa, vacuolización hepatocelular e infiltración celular inflamatoria, con una reducción significativa en el índice de actividad de NAFLD (NAS) en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 5,6 ± 0,7, PEG-compuesto 1-bajo: 4,0 ± 1,2, PEG-compuesto 1 -alto: 2,9 ± 1,2).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el grupo de PEG-compuesto 1 -alto mostró mejoras marcadas (reducciones) en el depósito de grasa, vacuolización hepatocelular e infiltración celular inflamatoria, con una reducción significativa en NAS en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 5,6 ± 0,7, PEG-compuesto 1 -alto: 2,4 ± 1,3).
Análisis histológico: Tinción con rojo sirio
Los resultados de la tinción con rojo sirio se muestran en las Figuras 33A-B, en la Figura 34 (que muestran la tinción representativa) y en la Tabla 14.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), las secciones de hígado del grupo de vehículo presentaron depósito de colágeno en la región pericentral del lóbulo del hígado. El área de fibrosis (área rojo sirio positiva) se redujo considerablemente en los grupos de tratamiento del PEG-compuesto 1 en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1,10 ± 0,24 %, PEG-compuesto 1-bajo: 0,71 ± 0,17 %, PEG-compuesto 1 -alto: 0,71 ± 0,19 %).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el área de fibrosis se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1,25 ± 0,29 %, PEG-compuesto 1 -alto: 0,75 ± 0,21 %).
Análisis histológico: Inmunohistoquímica F4/80
Los resultados de la inmunohistoquímica F4/80 se muestran en las Figuras 35A-B, en la Figura 36 (que muestran la tinción representativa) y en la Tabla 14.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1,2 y 3), la inmunotinción de F4/80 de secciones de hígado del grupo de vehículo demostró la acumulación de células F4/80+ en el lóbulo del hígado. No hubo diferencias significativas en cantidad y tamaño de células F4/80+ entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1, como tampoco en el porcentaje de área de inflamación (área F4/80 positiva) (vehículo: 6,9 ± 0,9 %, PEG-compuesto 1-bajo: 7,6 ± 1,5 %, PEG-compuesto 1 -alto: 7,1 ± 0,7 %).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), no hubo diferencias significativas en cantidad y tamaño de células F4/80+ entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 -alto, como tampoco en el porcentaje de área de inflamación (vehículo: 7,1 ± 0,7 %, PEG-compuesto 1 -alto: 6,3 ± 1,1 %).
Análisis histológico: Tinción con rojo aceite
Los resultados de la tinción con rojo aceite se muestran en las Figuras 37A-B (que muestra la tinción representativa), en la Figura 38 y en la Tabla 14.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), las secciones de hígado del grupo de vehículo presentaron depósito de grasa micro y macrovesicular en los hepatocitos. El porcentaje de área con depósito de grasa (área de rojo aceite positiva) se redujo considerablemente en los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 30,4 ± 4,8 %, PEG-compuesto 1-bajo: 20,5 ± 8,8 %, PEG-compuesto 1 -alto: 16,2 ± 6,1 %).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), el porcentaje de área con depósito de grasa se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 30,7 ± 5,6 %, PEG-compuesto 1-alto: 13,9 ± 7,7 %).
Tabla 14. Anáisis histoló ico
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Análisis de expresión génica
Los resultados de la expresión génica se muestran en las Figuras 39A-D y en la Tabla 15 para alfa-SMA, TIMP-1, Colágeno Tipo 1 y TGF-beta.
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los niveles de expresión de alfa-SMA en ARNm tendieron a regularse negativamente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de a-SMA en ARNm entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1-bajo (vehículo: 1,00 ± 1,14, PEG-compuesto 1-bajo: 0,52 ± 0,60, PEG-compuesto 1 -alto: 0,39 ± 0,30).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), no hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de a-SMA en ARNm entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 -alto (vehículo: 1,00 ± 0,88, PEG-compuesto 1 -alto: 1,14 ± 1,01).
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2 y 3), los niveles de expresión de TIMP-1 en ARNm tendieron a regularse negativamente en el grupo de PEG-compuesto 1-bajo en comparación con el grupo de vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de TIMP-1 en ARNm entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 -alto (vehículo: 1,00 ± 0,39, PEG-compuesto 1-bajo: 0,73 ± 0,28, PEG-compuesto 1 -alto: 0,88 ± 0,31).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), los niveles de expresión de TIMP-1 en ARNm tendieron a regularse negativamente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1,00 ± 0,57, PEG-compuesto 1 -alto: 0,65 ± 0,34).
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2, y 3), no hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de ARNm de colágeno tipo 1 entre el grupo de vehículo y los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (vehículo: 1,00 ± 0,22, PEG-compuesto 1-bajo: 0,88 ± 0,24, PEG-compuesto 1 -alto: 0,89 ± 0,34).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), la expresión del ARNm de colágeno tipo 1 se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1,00 ± 0,29, PEG-compuesto 1 -alto: 0,69 ± 0,20).
Durante el período de tratamiento de 5-9 semanas (grupos 1, 2, y 3), los niveles de expresión del ARNm de TGF-p tendieron a regularse negativamente en el grupo de PEG-compuesto 1-bajo en comparación con el grupo de vehículo. No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión del ARNm de TGF-p entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 -alto (vehículo: 1,00 ± 0,24, PEG-compuesto 1-bajo: 1,07 ± 0,60, PEG-compuesto 1 -alto: 0,90 ± 0,26).
Durante el período de tratamiento de 7-9 semanas (grupos 4 y 5), los niveles de expresión del ARNm en TGF-p tendieron a regularse negativamente en el grupo de PEG-compuesto 1 -alto en comparación con el grupo de vehículo (vehículo: 1,00 ± 0,45, PEG-compuesto 1 -alto: 0,77 ± 0,22).
Tabla 15. Análisis de expresión génica
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Como se mencionó anteriormente, el PEG-compuesto 1 redujo la acumulación de grasa hepática según se evaluó mediante un ensayo bioquímico que mide el contenido de triglicéridos hepáticos y la histología después de la tinción de secciones de hígado con hematoxilina y eosina o rojo aceite O. Se informó en la bibliografía que esta actividad antiesteatótica de FGF21 nativo depende de la adiponectina en el ratón (véase Lin et al., Cell Metab. 17: 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17: 790-797 (2013). Por lo tanto, las concentraciones de adiponectina total se midieron en muestras de suero terminal preparadas de los ratones tratados. La adiponectina en suero se midió de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un kit ELISA disponible en el mercado (catálogo de Alpco No. 47-ADPMS-E01).
La administración de 3 mg/kg de PEG-compuesto 1 dos veces por semana aumentó considerablemente, desde el punto de vista estadístico, la adiponectina total en suero, en comparación con el grupo de vehículo correspondiente, en todos los puntos temporales del terminal evaluados (Figura 61). Este resultado guarda relación con la hipótesis de que la adiponectina contribuye a la eficacia del PEG-compuesto 1 en el modelo de EHNA de Stelic.
Análisis
Este ejemplo muestra los resultados de experimentos que evaluaron la eficacia del PEG-compuesto 1 tanto en un modelo de EHNA preventivo como en uno terapéutico. En el modelo preventivo, el tratamiento se inició cuando el hígado graso fue evidente en este modelo (a partir de la semana 5, es decir, grupo de las semanas 5-9). En el modelo terapéutico, el tratamiento se inició cuando EHNA fue evidente en este modelo (a partir de la semana 7, es decir, grupos de las semanas 7-9). Por eso, se demostró la efectividad terapéutica del PEG-compuesto 1 tanto en el modelo preventivo como en el modelo terapéutico.
El tratamiento con PEG-compuesto 1 redujo considerablemente el área de fibrosis (detectada mediante tinción con rojo sirio) en ambos modelos de tratamiento, lo que demostró el efecto antifibrótico del PEG-compuesto 1. El tratamiento con PEG-compuesto 1 también redujo los niveles de expresión del ARNm de a-SMA, TIMP-1 y Colágeno tipo 1, lo que respalda adicionalmente las propiedades antifibróticas del PEG-compuesto 1. El tratamiento con PEG-compuesto 1 también causó reducciones considerables, desde el punto de vista estadístico, en el peso corporal y el peso del hígado, la relación de peso del hígado con respecto a peso corporal, la glucosa en sangre, los triglicéridos en plasma y en el hígado, el índice de actividad de NAFLD y el área con depósito de grasa (detectada mediante tinción con rojo aceite).
Todos los grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 mostraron una reducción considerable de NAS, que es uno de los criterios de valoración clínicos para evaluar la actividad de EHNA (Sanyal AJ. et al., Hepatology, 2011;54:344).
Asimismo, el tratamiento con PEG-compuesto 1 mejoró el metabolismo de lípidos y glucosa, como lo muestra la reducción de los niveles de glucosa en sangre, los niveles de triglicéridos en plasma y el contenido de triglicéridos en el hígado.
En conclusión, el PEG-compuesto 1 mostró efectos anti-EHNA, anti-fibróticos asociados a la mejora del metabolismo de lípidos y glucosa en el presente estudio.
Ejemplo 14
Evaluación de solubilidad de los polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un compañero de fusión
Este ejemplo describe la medición de la solubilidad relativa de los polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un compañero de fusión. Los resultados indican la capacidad de un compuesto para formularse en una concentración muy superior, lo que permitiría una más simple administración de una dosificación eficaz.
Métodos
Las evaluaciones de solubilidad relativa se realizaron mediante ciclos de concentración de flujo de obturador seguidos de análisis de cromatografía de exclusión por tamaño. Las muestras, formuladas en 20 mM de tampón de histidina, pH 7,0 en concentraciones iniciales similares, pero no idénticas, se colocaron en pipetas de concentradores centrífugos de 3 kDa de peso molecular y se hicieron girar a 4.750 RPM durante ciclos de 15 minutos, 15 minutos y 40 minutos a 4 °C. Entre los ciclos de giros, se retiraron las alícuotas del aparato de concentración, y se realizó un análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño (aSEC) (en una columna GE Healthcare Superdex S-75 10/300 GL equilibrada en tampón PBS pH 7,2) para determinar la concentración de especies monoméricas y HMW en la solución.
Las concentraciones totales se determinaron mediante absorbancia a 280nm con un espectrofotómetro NanoDrop. El porcentaje de alto peso molecular se determinó mediante cálculos del área debajo de la curva de picos de alto peso molecular con respecto a picos monoméricos en rastro de cromatograma SEC. Los puntos de datos resultantes se trazan para visualizar el orden de clasificación de las construcciones menos solubles a las construcciones más solubles en las condiciones de prueba, en donde cuanto más baja sea la pendiente creada por los puntos de datos, más estable será la variante proteica en las condiciones de prueba.
Resultados
La solubilidad relativa de los polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un compañero de fusión se determinó midiendo la formación de agregados de alto peso molecular (HMW) como una función de concentración proteica. La formación de un agregado de menor HMW a una determinada concentración indica mayor solubilidad, lo que daría como resultado la capacidad de formularse a una concentración más alta.
Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 41. La pendiente de la curva de solubilidad del flujo de obturador para los compuestos evaluados se muestran a continuación en la Tabla 16 (valores más bajos indican menos formación de agregados y, por ende, la capacidad de formularse a una concentración más alta).
Tabla 16. Resultados de solubilidad de flujo de obturador para los polipéptidos FGF-21 modificados que comprenden un com añero de fusión
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Ejemplo 15 Un estudio de múltiples dosis, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, de grupos paralelos para evaluar los efectos de seguridad, farmacocinética y farmacodinámica del PEG-compuesto 1 en adultos con esteatohepatitis no alcohólica
En los Estados Unidos, EHNA es una de las causas principales de cirrosis en adultos; hasta el 20 % de los adultos con EHNA desarrollan cirrosis. Los descubrimientos histológicos de EHNA incluyen esteatosis, inflamación y degeneración del vacuolización con distintas cantidades de fibrosis pericelular en el hígado, y ocurren sin el consumo considerable de alcohol. Los pacientes con EHNA exhiben mayores tasas de mortalidad, con muertes relacionadas con problemas cardiovasculares, hepáticos y cáncer. No hay opciones de tratamiento medicinal específico disponibles.
Este ejemplo describe un ensayo clínico en seres humanos aleatorizado, doble ciego y controlado con placebo para evaluar los efectos de seguridad, farmacocinética y farmacodinámica del PEG-compuesto 1 (polipéptido de SEQ ID NO: 201, en donde pAF está enlazado a un PEG de 30 kDa) en adultos con EHNA, que incluye la evaluación de seguridad, tolerabilidad y cambio en la fracción de grasa hepática (%) según MRI.
Población del estudio: Se inscribieron aproximadamente 90 sujetos de sexo masculino y femenino entre 21 y 75 años de edad que reunían los siguientes criterios: una biopsia del hígado realizada dentro de 1 año a partir de la selección con resultados documentados de EHNA con fibrosis de EHNA CRN en etapa 1-3 o equivalente usando un sistema de calificación diferente; un IMC de > 30 (peso (kg)/[altura (m)]2); un índice de hígado graso > 60; una fracción de grasa hepática (%) > 10 % según MRI realizada durante el período de selección. Los sujetos se sometieron a evaluaciones de análisis para determinar la elegibilidad dentro de los 42 días previos a la aleatorización.
Los sujetos eran excluidos del estudio si presentaban evidencia de enfermedad concurrente, por ejemplo, enfermedad hepática crónica (que no fuera EHNA), cirrosis, enfermedad hepática descompensada, diabetes no controlada y algunas otras afecciones o antecedentes médicos.
Se realizaron análisis iniciales aproximadamente 14 a 35 días antes de la dosis del Día 1 del fármaco activo o placebo, para determinar el contenido de grasa hepática según imagen por resonancia magnética (MRI), rigidez hepática según elastografía por resonancia magnética (MRE) y composición corporal según absorciometría por rayos X de energía dual (DXA). La evaluación inicial adicional de los pacientes incluía determinar el peso, el IMC y la circunferencia de la cintura.
Régimen de tratamiento: El PEG-compuesto 1 se administró diariamente o semanalmente durante 16 semanas a adultos con EHNA. El tratamiento se autoadministró por vía subcutánea después de que el paciente recibiera un entrenamiento de 7 días para aprender a usar correctamente el inyector con placebo. Aproximadamente 90 sujetos elegibles se aleatorizaron el Día 1 en uno de los tres grupos de tratamiento (30 por grupo), que luego fueron tratados (a partir del Día 1) de la siguiente manera: Tratamiento A: 10 mg de PEG-compuesto 1 diariamente; Tratamiento B: 20 mg de PEG-compuesto 1 semanalmente; Tratamiento C: Placebo diariamente. Los sujetos se separaron en estratos usando diagnósticos de diabetes mellitus tipo 2 (sí frente a no) en función de criterios actuales de la American Diabetes Association.
Todos los sujetos se autoadministraron PEG-compuesto 1 o placebo una vez por día. El PEG-compuesto 1 se proporciona en una solución de 10 mg/ml. Para el Grupo de tratamiento B (20 mg/sem), se administraron de manera concurrente 2 inyecciones de 1 ml cada una el Día 1 (D 1), y los Días 2-7, la inyección fue placebo. Para mantener el carácter ciego, los otros dos grupos también recibieron dos inyecciones el Día 1, en donde una o ambas contenían un placebo. Los Días 2-7, la inyección es 1 ml de PEG-compuesto 1 (Grupo de tratamiento A) o 1 ml de placebo (Grupo de tratamiento C). El tratamiento continuó hasta el Día 112 (D 112) (es decir, 16 semanas).
Evaluación de los pacientes: La evaluación de los pacientes se realiza en D -7 (el inicio de la derivación con placebo únicamente), D 1, D 15, D 29, D 43, D 57, D 86 y D 112. Se realizan exámenes físicos, mediciones de los signos vitales, electrocardiogramas (ECG) de 12 derivaciones, evaluaciones de laboratorio clínico y análisis de MRI, MRE y DXA. Los análisis de MRI, MRE y DXA de finalización del estudio se realizan el Día 112 (+/- 1 semana). Se realizan visitas de seguimiento aproximadamente el D 142 y D 292, y el análisis de seguimiento DXA se realiza 6 meses (+/- 2 semanas) después de la última dosis. Se extrae sangre para análisis de farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD). La concentración en suero del PEG-compuesto 1 (total e intacto C-terminal) se mide mediante un ensayo validado. Todos los datos de PK recolectados en el estudio se evalúan mediante un modelo de PK de población desarrollado para calcular parámetros basados en el modelo, tales como CL/F, Vc/F, Ka etc. Asimismo, los cálculos de parámetros de exposición individuales (tales como Cavg, Cmin, Cmáx y AUC en estado estable) se derivan de los parámetros basados en el modelo. Los sujetos son monitoreados cuidadosamente para detectar efectos adversos durante el estudio.
Criterios de valoración primarios: El objetivo primario es evaluar el efecto de dosis diarias o semanales del PEG-compuesto 1 sobre la seguridad, tolerabilidad y fracción de grasa hepática (%) según MRI en pacientes con EHNA demostrado por biopsia. Esto se evaluará mediante el criterio de valoración primario de cambio en el porcentaje de fracción de grasa hepática (%) desde el inicio hasta la Semana 16, determinado según la MRI hepática de fracción de grasa por densidad de protones. El valor inicial se define como la última medición anterior a la dosis para todos los criterios de valoración. Se prevé que el PEG-compuesto 1 administrado diariamente o semanalmente durante 16 semanas a pacientes con EHNA reduce la fracción de grasa hepática (%) en mayor medida que el placebo. Los criterios de valoración primarios también incluyen criterios de valoración de seguridad, que incluyen la incidencia de efectos adversos (AE), AE graves y episodios de especial interés, tales como evaluación del lugar de inyección, AE que conducen a la interrupción, y muerte, así como anormalidades notables en pruebas de laboratorio clínico, mediciones de los signos vitales, ECG, exámenes físicos y densidad mineral ósea (BMD) recolectados mediante análisis de DXA en puntos temporales específicos.
Criterios de valoración secundarios: Los criterios de valoración secundarios incluyen criterios de valoración de farmacocinética y criterios de valoración de inmunogenicidad. Los criterios de valoración de farmacocinética se evalúan mediante parámetros de farmacocinética basados en el modelo de concentración en suero del PEG-compuesto 1 (total e intacto C-terminal): Cavg, Cmin, Cmáx y AUC(TAU) determinados de mediciones realizadas en determinados puntos temporales. Los criterios de valoración de inmunogenicidad se evalúan mediante niveles de anticuerpos anti-PEG-compuesto 1 y anticuerpos anti-FGF21 en los pacientes. Se determinan los parámetros de farmacocinética basados en el modelo de la concentración en suero del PEG-compuesto 1 (total e intacto C-terminal). Los parámetros de PK primarios incluyen: CL/F (depuración evidente después de la administración extravenosa); V/F (volumen evidente de distribución después de la administración extravenosa); y Ka (constante de absorción desde el lugar de inyección hasta la circulación sanguínea). De los parámetros de PK primarios, se derivan los parámetros de PK secundarios, que incluyen Cmáx (concentración en suero máxima calculada); T1/2 (semivida de deleción); AUC(TAU) (área bajo la curva de concentración-tiempo en un intervalo de dosis); Cmin (concentración mínima dentro del intervalo de dosis); y Cavg (concentración promedio dentro del intervalo de dosis).
Análisis: Se usa un análisis de mediciones longitudinales repetidas para analizar el cambio en la fracción de grasa hepática (%) en la Semana 16 desde el inicio en la población tratada que tiene una medición al inicio y al menos una medición posterior al inicio. El modelo incluye grupo de tratamiento, semana e interacciones tratamiento-por-semana como efectos principales, y fracción de grasa hepática (%) inicial y estado diabético inicial como covariantes. Se usa una matriz de covarianza no estructurada para representar la correlación de las medidas repetidas en cada sujeto. El modelo proporciona estimaciones puntuales, errores estándares e intervalos de confianza bilaterales de 90 % para la media del cambio desde el inicio durante los tratamientos y entre estos. Los valores P se calculan para comparar el efecto del tratamiento en cada uno de los dos grupos de tratamiento de PEG-compuesto 1 (10 mg diariamente y 20 mg semanalmente) con el del grupo de tratamiento de placebo en la Semana 16. Cada comparación del grupo de tratamiento se realiza en un nivel de significación unilateral de 0,05. No se realizan ajustes por multiplicidad.
Se estudia la relación entre la exposición al PEG-compuesto 1 (total e intacto C-terminal) y otros biomarcadores o criterios de valoración para mostrar relaciones dosis-respuesta. Estas mediciones también se analizan para mostrar su relación con respecto al cambio en la fracción de grasa hepática y cómo estos biomarcadores predicen el cambio o se relacionan con él. Estos criterios de valoración y biomarcadores incluyen cambios en la rigidez del hígado según MRE, peso corporal, IMC, circunferencia de la cintura, composición corporal según DXA, homeostasis de la glucosa, sensibilidad a la insulina, lípidos en ayunas, homeostasis ósea, ALT y AST, además de biomarcadores asociados al riesgo de progresión y complicaciones de la enfermedad. En general, la EHNAse asocia a la reducción de los niveles de adiponectina (hipoadiponectinemia), y la reducción de los niveles se asocia a una necroinflamación más amplia. Se cree que la adiponectina aumenta la sensibilidad a la insulina mejorando la oxidación de las grasas y reduciendo el almacenamiento de lípidos hepáticos. Se espera que los niveles de adiponectina total en suero aumenten mediante el tratamiento con PEG-compuesto 1. También se espera que el tratamiento con PEG-compuesto 1 reduzca los triglicéridos en ayunas, LDL, ApoB, ApoC3, y que aumente el HDL en pacientes con EHNA.
El análisis de los resultados del estudio, mediante una matriz de covarianza no estructurada descrita anteriormente, se realiza para mostrar una reducción considerable, desde el punto de vista estadístico (p<0,05), en la fracción de grasa hepática en pacientes tratados con PEG-compuesto 1 (en los grupos de estudio de administración tanto diaria como semanal) en comparación con los controles de placebo.
Ejemplo 16
Este ejemplo también estudia la eficacia del PEG-compuesto 1 en el modelo STAM de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). Los ratones recibieron tratamiento entre las 9 y las 12 semanas de vida o hasta las 15 semanas de vida.
Métodos
Se suministraron PEG-compuesto 1 y vehículo (20 mM de Tris/250 mM de sacarosa, pH 8,3). Para preparar la solución de dosis, la solución de PEG-compuesto 1 se preparó mediante la dilución adecuada con el vehículo suministrado.
Los ratones C57BL/6 (hembra con 15-días-de preñez) se obtuvieron de Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japón). Todos los animales usados en el estudio fueron alojados y cuidados de acuerdo con la normativa sobre el uso de animales que brinda la Sociedad Japonesa de Farmacología. Se indujo EHNA en 60 ratones macho con una sola inyección subcutánea de 200 |jg de solución de estreptozotocina (s Tz , Sigma-Aldrich, EE.UU.) 2 días después del nacimiento y se los alimentó con una dieta de alto contenido graso (HFD, 57 kcal % de grasa, cat. No.: HFD32, CLEA Japan, Inc., Japón) después de las 4 semanas de vida.
Se administraron PEG-compuesto 1 y vehículo por vía subcutánea en un volumen de 1 ml/kg en una dosis de 3 mg/kg dos veces por semana. Los animales se mantuvieron en una instalación SPF en condiciones controladas de temperatura (23 ± 2 °C), humedad (45 ± 10 %), iluminación (12 horas de luz artificial y ciclos de oscuridad; luz de 8:00 a 20:00) e intercambio de aire. Se mantuvo una presión alta (20 ± 4 Pa) en la sala de experimentos para evitar la contaminación de las instalaciones. Los animales se alojaron en jaulas de policarbonato KN-600 (Natsume Seisakusho, Japón) con un máximo de 4 ratones por jaula. Se usó Paper-Clean esterilizado (Japan SLC) como lecho y se reemplazó una vez por semana. Se proporcionó a demanda HFD sólida esterilizada, que se colocó en la tapa de metal sobre la jaula. Se proporcionó agua pura a demanda de una botella de agua equipada con un obturador de goma y un sorbete. Las botellas de agua se reemplazaron una vez por semana, se limpiaron, se esterilizaron en autoclave y se reutilizaron. Los ratones fueron identificados con números grabados en aros. Cada jaula se etiquetó con un código de identificación específico.
La glucosa en sangre sin ayuno se midió en sangre completa usando LIFE CHECK (EIDIA Co. Ltd., Japón). Para la bioquímica en plasma, se extrajo sangre en tubos de polipropileno con anticoagulante (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japón) y se centrifugó a 1000 xg durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante se recolectó y se almacenó a -80 °C hasta que se usó. Se midieron los niveles de ALT en plasma, triglicéridos y colesterol total mediante FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation, Japón).
Los extractos de lípidos totales del hígado se obtuvieron mediante el método de Folch (Folch J. et al., J. Biol. Chem.
1957;226: 497). Las muestras de hígado se homogeneizaron en cloroformo-metanol (2:1, v/v) y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Después del lavado con cloroformo-metanol-agua (8:4:3, v/v/v), los extractos se evaporaron hasta secarse y se disolvieron en isopropanol. El contenido de triglicéridos y colesterol en el hígado se midió mediante las pruebas de epsilometría E-test de triglicéridos y E-test de colesterol, respectivamente (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japón).
Para la tinción con HE, se cortaron secciones de bloques de parafina de tejido del hígado prefijado en solución de Bouin y teñido con hematoxilina de Lillie-Mayer (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japón) y solución de eosina (Wako Pure Chemical Industries). El índice de actividad (NAS) de NAFLD se calculó de acuerdo con los criterios de Kleiner (Kleiner DE. et al., Hepatology, 2005;41:1313). Para visualizar el depósito de colágeno, las secciones de hígado fijadas en Bouin se tiñeron con solución picro-rojo sirio (Waldeck, Alemania). Para visualizar la grasa macro y microvesicular, se cortaron criosecciones de tejidos hepáticos congelados, prefijados en 10 % de formalina en tampón neutral, embebidos en compuesto O.C.T. Tissue-Tek (Sakura Finetek Japan Co. Ltd., Japón) y se tiñeron con Rojo aceite O (Sigma-Aldrich). Para la inmunohistoquímica, se cortaron secciones de tejidos hepáticos congelados embebidos en compuesto Tissue-Tek O.C.T. y fijados en acetona. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó usando 0,03 % de H2O2 durante 5 minutos, y luego se incubó con Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Japón) durante 10 minutos. Las secciones se incubaron con una dilución de 200 veces de anticuerpo anti-F4/80 (BMA Biomedicals, Suiza) durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra antirrata HRP, Invitrogen, EE.UU.), se realizaron reacciones de enzima-sustrato usando solución de 3, 3'-diaminobencidina/H2O2 (Nichirei Bioscience Inc., Japón).
El riñón se fijó en solución de Bouin. La arquitectura glomerular se observó usando tinción PAS con secciones oxidadas con 0,5 % de ácido periódico y teñidas con reactivo de Schiff (ambos de Wako Pure Chemical Industries). Para visualizar el depósito de colágeno, las secciones de riñón se tiñeron con solución picro-rojo sirio (Waldeck).
Para el análisis cuantitativo de áreas con fibrosis, depósito de grasa e inflamación, se capturaron imágenes de campo brillante de secciones teñidas con rojo sirio, con rojo aceite e inmunoteñidas con F4/80 aproximadamente la vena central en el caso de los hígados o en la región intersticial en el caso de los riñones usando cámara digital (DFC280; Leica, Alemania) con una ampliación de 200 veces, y las áreas positivas en 5 campos/sección se midieron usando el software ImageJ (National Institute of Health, EE.UU.).
Se realizaron análisis estadísticos mediante la prueba de comparación múltiple Bonferroni en GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., EE.UU.). Los valores P < 0,05 se consideraron importantes desde el punto de vista estadístico. Se asumió una tendencia cuando la prueba t de una cola devolvía valores P < 0,05. Los resultados se expresaron como media ± SD.
Resultados
Los grupos de estudio fueron los siguientes (resumidos a continuación en la Tabla 17).
Grupo 1: Vehículo. Se les administró vehículo por vía subcutánea a veinte ratones EHNA en un volumen de 1 ml/kg dos veces por semana desde las 9 hasta las 12 semanas de vida o hasta las 15 semanas de vida.
Grupo 2: PEG-compuesto 1. A 20 ratones EHNA se les administró por vía subcutánea vehículo enriquecido con PEG-compuesto 1 en una dosis de 3 mg/kg dos veces por semana desde las 9 hasta las 12 semanas de vida o hasta las 15 semanas de vida.
Tabla 17. Resumen del tratamiento.
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La viabilidad, los signos clínicos y el comportamiento se monitorizaron a diario. Se registró el peso corporal antes del tratamiento. Se observaron los ratones para detectar signos clínicos significativos de toxicidad, agonía y mortalidad aproximadamente 60 minutos después de cada administración. Los animales se sacrificaron por desangramiento a través de punción cardíaca directa bajo anestesia de éter (Wako Pure Chemical Industries). Se sacrificaron 6 animales en todos los grupos a las 12 semanas de vida para los siguientes ensayos, y los animales restantes se mantuvieron hasta el día del sacrificio a las 15 semanas de vida.
El peso corporal en todos los grupos no cambió de manera evidente durante el período de tratamiento. No hubo diferencias significativas en la media del peso corporal entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1. Durante el período de tratamiento, los ratones murieron antes de llegar al día 40 de la siguiente manera: ocho de 20 ratones murieron en el grupo de vehículo. No se encontró ningún animal muerto en el grupo de PEG-compuesto 1. La causa de muerte continúa incierta y podría estar relacionada con la progresión de la enfermedad en el grupo de vehículo. Los días de muerte de los ratones individuales fueron los días 7, 17 (dos ratones), 20 (dos ratones), 34, 38 y 40. Después de que murieran 5 ratones en el grupo de vehículo, se tomó la decisión de modificar el protocolo original del estudio y reducir la cantidad de ratones sacrificados en la semana 12 de 8 a 6 por grupo en un intento por garantizar que al menos 6 ratones en cada grupo sobrevivieran a la semana 15.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, no hubo diferencias significativas en la media del peso corporal el día del sacrificio entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 42A). Asimismo, en los animales tratados entre las semanas 9-15, no hubo diferencias significativas en la media del peso corporal el día del sacrificio entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 42B).
Se muestran el peso del órgano y la relación de peso del hígado con respecto al peso corporal en las Figuras 43-46 y se resumen en la Tabla 18.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, el grupo de PEG-compuesto 1 mostró menores tendencias en la media del peso del hígado en comparación con el grupo de vehículo (Figura 43A). La media de relación de peso del hígado con respecto al peso corporal se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 en comparación con el grupo de vehículo (p<0,01) (Figura 44A). No hubo diferencias significativas en la media del peso del riñón derecho entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 45A). La media del peso del riñón izquierdo tendió a disminuir en el grupo de PEG-compuesto 1 en comparación con el grupo de vehículo (Figura 46A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el grupo de PEG-compuesto 1 redujo considerablemente la media del peso del hígado (p<0,001) (Figura 43B) y la media de la relación de peso del hígado con respecto a peso corporal (p<0,001) (Figura 44B) en comparación con el grupo de vehículo. No hubo diferencias significativas en la media del peso del riñón derecho (Figura 45B) y en la media del peso del riñón izquierdo (Figura 46B) entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1.
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Los resultados de la medición bioquímica se muestran en las Figuras 47-52 y se resumen a continuación en la Tabla 19.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, no hubo diferencias significativas en los niveles de glucosa en sangre entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 47A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, los niveles de glucosa en sangre completa en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujeron considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,05) (Figura 47B). En los animales tratados entre las semanas 9-12, no hubo diferencias significativas en los niveles de ALT en plasma entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 48A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, los niveles de ALT en plasma en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujeron considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,01) (Figura 48B).
En los animales tratados entre las semanas 9-12, el grupo de PEG-compuesto 1 mostró una tendencia a la reducción de los niveles de triglicéridos en plasma en comparación con el grupo de vehículo (Figura 49A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, no hubo diferencias significativas en los niveles de triglicéridos en plasma entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 49B).
En los animales tratados entre las semanas 9-12, no hubo diferencias significativas en el colesterol total en plasma entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 50A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, no hubo diferencias significativas en el colesterol total en plasma entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 50B).
En los animales tratados entre las semanas 9-12, el contenido de triglicéridos en el hígado en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujo considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,01) (Figura 51A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el contenido de triglicéridos en el hígado en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujo considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,001) (Figura 51B).
En los animales tratados entre las semanas 9-12, el contenido de colesterol en el hígado en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujo considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,01) (Figura 52A).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el contenido de colesterol en el hígado en el grupo de PEG-compuesto 1 se redujo considerablemente en comparación con el grupo de vehículo (p<0,001) (Figura 52B).
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Los micrógrafos representativos que muestran el análisis histológico de muestras de hígado se muestran en las Figuras 53, 55, 57 y 59. Los resúmenes de los resultados histológicos se muestran gráficamente en las Figuras 54, 56, 58 y 60, y se tabulan a continuación en la Tabla 22.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, las secciones de hígado teñidas con HE del grupo de vehículo presentaron depósito de grasa micro y macrovesicular grave, vacuolización hepatocelular e infiltración de células inflamatorias (Figuras 53A-B). El grupo de PEG-compuesto 1 mostró mejoras notables en el depósito de grasa, vacuolización hepatocelular e infiltración celular inflamatoria, con una reducción considerable de NAS en comparación con el grupo de vehículo (Figuras 53C-D).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el grupo de PEG-compuesto 1 mostró mejoras notables en el depósito de grasa, vacuolización hepatocelular e infiltración de células inflamatorias (Figuras 53E-F), con una reducción considerable de NAS en comparación con el grupo de vehículo (Figuras 53G-H).
Los resultados del índice de actividad de NALFD se muestran gráficamente en la Figuras 54A-B para los animales tratados entre las semanas 9-12 y 9-13, respectivamente, y se resumen en la Tabla 20. El índice de actividad de NALFD se redujo considerablemente en ambos grupos de tratamiento (p<0,01 y p<0,001 para los animales tratados entre las semanas 9-12 y 9-15, respectivamente).
Tabla 20. Resumen de los resultados del índice de actividad de NALFD. Los componentes del índice son como se muestran a continuación en la Tabla 21.
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Tabla 21. Com onentes del índice de la actividad de NALFD.
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En los animales tratados entre las semanas 9-12, las secciones de hígado teñidas con rojo sirio del grupo de vehículo presentaron depósito de colágeno en la región pericentral del lóbulo del hígado (Figuras 55A-B). No hubo diferencias significativas en el área de fibrosis entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figuras 55C-D), como se resume en la Figura 56A.
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el área de fibrosis se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 (Figuras 55E-F) en comparación con el grupo de vehículo (Figuras 55G-H), como se resume en la Figura 56B (p<0,05).
Los fotomicrógrafos representativos de las secciones inmunoteñidas con F4/80 se muestran en la Figura 57.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, la inmunotinción con F4/80 de las secciones de hígado del grupo de vehículo demostró la acumulación de células F4/80+ en el lóbulo del hígado (Figuras 57A-B). No hubo diferencias significativas en la cantidad y el tamaño de las células F4/80+ entre el grupo de vehículo y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figuras 57C-D), como se resume en la Figura 58A.
En los animales tratados entre las semanas 9-15, no hubo diferencias significativas en la cantidad y el tamaño de las células F4/80+ entre el grupo de vehículo (Figura 57E-F) y el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 57G-H), como se resume en la Figura 58B.
Los fotomicrógrafos representativos de las secciones teñidas con rojo aceite se muestran en las Figuras 59A-H.
En los animales tratados entre las semanas 9-12, las secciones de hígado teñidas con rojo aceite del grupo de vehículo presentaron depósito de grasa micro y macrovesicular en los hepatocitos (Figura 59A-59B). El porcentaje de área con depósito de grasa (área rojo aceite positiva) se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 (Figura 59C-D) en comparación con el grupo de vehículo, como se resume en la Figura 60A (p<0,001).
En los animales tratados entre las semanas 9-15, el porcentaje de área con depósito de grasa se redujo considerablemente en el grupo de PEG-compuesto 1 (Figuras 59E-F) en comparación con el grupo de vehículo (Figuras 59G-H), como se resume en las Figuras 60B (p<0,001).
Tabla 22. Resumen de descubrimientos histoló icos
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Como se mencionó anteriormente, el PEG-compuesto 1 redujo la acumulación de grasa hepática según se evaluó mediante un ensayo bioquímico que mide el contenido de triglicéridos hepáticos y la histología después de la tinción de secciones de hígado con hematoxilina y eosina o rojo aceite O. Se informó en la bibliografía que esta actividad antiesteatótica de FGF21 nativo depende de la adiponectina en el ratón (véase Lin et al., Cell Metab. 17: 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17: 790-797 (2013)). Por lo tanto, las concentraciones de adiponectina total se midieron en muestras de suero terminal preparadas de los ratones tratados. La adiponectina en suero se midió de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un kit ELISA disponible en el comercio (catálogo de Alpco No. 47-ADPMS-E01).
La administración de 3 mg/kg de PEG-compuesto 1 dos veces por semana aumentó considerablemente, desde el punto de vista estadístico, la adiponectina total en suero, en comparación con el grupo de vehículo correspondiente, en todos los puntos temporales del terminal evaluados (Figura 62). Este resultado guarda relación con la hipótesis de que la adiponectina contribuye a la eficacia del PEG-compuesto 1 en el modelo de EHNA de Stelic.
En resumen, el tratamiento durante tres semanas con PEG-compuesto 1 redujo significativamente la relación entre el peso del hígado y el peso corporal, el contenido lipídico hepático (triglicéridos y colesterol), el área con depósito de grasa y NAS. Además de estos efectos, el tratamiento durante 6 semanas con PEG-compuesto 1 redujo significativamente la glucosa en sangre, ALT en plasma y el área de fibrosis. Asimismo, el tratamiento con PEG-compuesto 1 mejoró la tasa de supervivencia en comparación con el grupo de vehículo.
En conclusión, el PEG-compuesto 1 mostró efectos antiEHNA y antifibróticos que incluyen la mejora del metabolismo de lípidos y glucosa.
Ejemplo 17
Caracterización in vitro del compuesto pegilado 2 en células de riñón embrionario humano que expresan de manera estable beta-klotho.
FGF21 utiliza pklotho como correceptor junto con receptores FGF para su actividad de señalización específica de tejido (véanse, por ejemplo, Kurosu et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:26687-26695; Ogawa et al., 2007, Proc. Natl. Acad. of Sci., EE.UU. 104:7432-7437). FGF21 primero se une a P-klotho, y el complejo luego puede activar receptores FGF para iniciar una cascada de señalización intracelular que rápidamente activa quinasas reguladas por señal extracelulares 1/2 (ERK1/2) durante el transcurso de minutos. Durante períodos prolongados, ERK fosforilada (pERK) activada se puede traslocar al núcleo celular, y fosforilar y activar diversos reguladores de la transcripción, que incluyen un factor de complejo ternario denominado proteína 1 de tipo E Twenty-Six (ETS) (Elk1). Elk1 activada forma un complejo con un factor de respuesta al suero que se une a determinadas secuencias de ADN para regular la expresión de determinados genes.
Generación de una línea celular que coexpresa P-klotho humano de manera estable y un constructo transindicador de Elkl-luciferasa
La línea celular de transindicación de Elk1-luciferasa se generó con células HEK293 que utilizan el sistema de transindicación de Elk1 PathDetect de Agilent Technologies. Este sistema tiene un plásmido de fusión transactivador que expresa una proteína de fusión del dominio de unión a ADN de la proteína activadora de la transcripción en la levadura, Gal4, y luego del dominio de activación de Elk1. Cuando el activador de la transcripción, Elk1, se fosforila y se activa mediante la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) ante la estimulación mediante FGF21, la proteína activadora de fusión se une como un dímero a la secuencia de activación corriente arriba de GAL4 y activa la transcripción de la enzima indicadora de luciferasa. La expresión de luciferasa del plásmido indicador muestra la activación de la proteína transactivadora de fusión y, por lo tanto, la presencia de la proteína quinasa endógena. En consecuencia, la actividad de la luciferasa refleja la activación de ERK en la célula y las vías de transducción de señal correspondientes, en este caso, la activación de Elk1.
Las células HEK293 se cotransfectaron con el plásmido transactivador de fusión, el plásmido indicador y un plásmido que codifica p-klotho humano. Las células transfectadas se sometieron a la selección de G-418 (500 pg/ml) y blasticidina (10 pg/ml). Los clones que sobrevivieron a la selección antibiótica dual se analizaron mediante la estimulación con una construcción de FGF21 y el seguimiento de la actividad de Elkl-luciferasa. HEK Luc Clone2 se seleccionó como línea celular para todos los ensayos futuros.
Ensayo celular de Elk1-luciferasa
Las células HEK293 Luc Clone2 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 25.000 células por pocillo. Las placas se incubaron en una incubadora de cultivo tisular a 37 °C con 5 % de CO2 durante dos días. El día del ensayo, se preparó una serie de tres diluciones en serie de las proteínas FGF21 en medio DMEM libre de rojo de fenol enriquecido con L-glutamina 1x, 10 mM de Hepes, pH de 7,2 - 7,5 y 10 % de FBS. Se retiró el medio de crecimiento de cultivo celular antiguo. Para iniciar el tratamiento, se agregaron 50 pl de medio DMEM libre de rojo de fenol con los compuestos de prueba en cada pocillo, y las placas se volvieron a colocar en la incubadora de cultivo celular. Después de 5 horas de incubación, se agregó un volumen igual de la mezcla de sustrato reactivo de luciferasa en cada pocillo. Las placas se cubrieron y se colocaron en un agitador orbital durante 3 min a 600 rpm. La luminiscencia se midió en un lector multiplaca Envision 2103 de Perkin Elmer.
Análisis de datos
Los datos sin procesar de todos los puntos de datos de replicación individuales se analizaron mediante el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., CA) usando un análisis de regresión no lineal. Los datos se ajustaron usando la ecuación log(agonista) contra respuesta con 4 parámetros: Inferior (mínimo), superior (máximo), log EC50 (medida de potencia) y una pendiente variable. La potencia (EC50) se definió como la concentración que produjo un aumento máximo medio en la respuesta por encima del valor inicial y se calculó mediante el programa de ajuste de curvas.
Resultados
Las curvas de respuesta a la concentración representativas para tres variantes de FGF21 (compuesto 1 etiquetado con His N-terminal (compuesto 1 His), PEG-compuesto 1 y PEG-Compuesto 2) y los valores de potencia y eficacia calculados durante el ensayo de Elk1-luciferasa de 5 horas se muestran en la Figura 63 y en la Tabla 23. Las potencias de las tres variantes fueron similares durante el ensayo de Elk1-luciferasa de 5 horas (Tabla 23).
Tabla 23. Potencia eficacia de las variantes de FGF21 durante el ensa o de Elk1-luciferasa de 5 horas
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Se compararon diversas moléculas de fusión de Fc-FGF-21 en el ensayo celular de Elk1-luciferasa. Todas las moléculas, excepto el compuesto 180 y el compuesto 175, presentaron potencias nM de un solo dígito o menores, y fueron comparables a la potencia medida del PEG-Compuesto 2 o menores (Figura 64 y Tabla 24 a continuación).
Tabla 24. Valores EC50 de la media geométrica con intervalos de confianza de 95 %.
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Ejemplo 18: Efectos de los compuestos de variantes de FGF-21 en los niveles de adiponectina en ratones C57BL/6J
FGF21 estimula la secreción de adiponectina de adipocitos, y la amplia distribución de receptores de adiponectina proporciona una vía potencial por la cual la acción de FGF21 se puede extender a otros tejidos. Se informó que muchos de los efectos metabólicos de FGF21 nativo, incluso su actividad antiesteatótica, requieren adiponectina en el ratón (Lin, Z. et al., Cell Metab. 17: 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17: 790-797 (2013)). El presente ejemplo muestra los efectos de las dosis ascendentes únicas del compuesto 2PEG en marcadores farmacodinámicos seleccionados de actividades de FGF21 en ratones C57BL/6J no diabéticos normales.
Los ratones C57BL/6J macho de 8 semanas de vida se aleatorizaron en los siguientes grupos de tratamiento (tamaño de la muestra n=10/grupo): 1) vehículo, 2) PEG-Compuesto 2, 0,03 mg/kg, 3) PEG-Compuesto 2, 0,1 mg/kg, 4) PEG-Compuesto 2, 0,3 mg/kg o 5) PEG-Compuesto 2, 1,0 mg/kg, y recibieron dosis subcutáneas con su respectivo tratamiento de 5 ml/kg. Después de la dosificación sin ayunar, las muestras de sangre se centrifugaron, y se dividieron en alícuotas 20 |jl de plasma para la determinación cuantitativa de adiponectina total y de alto peso molecular (HMW) (Alpco Diagnostics, Salem, NH, n.° cat 47-ADPMS-E01). Se volvió a extraer sangre de los ratones sin ayunar 24, 48, 72 y 144 horas después de la dosis única para el análisis de glucosa en plasma y adiponectina, y el peso corporal se midió antes de cada extracción de sangre.
Las concentraciones plasmáticas de adiponectina total y de alto peso molecular (HMW) se midieron de acuerdo con el protocolo del fabricante para el kit ELISA total y de HMW en ratones (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Las exposiciones en plasma de PEG-Compuesto 2 se determinaron mediante ELISA. El análisis estadístico de todos los datos se llevó a cabo mediante ANOVA de un factor y luego mediante la prueba t de Dunnett usando el grupo de vehículo como control (JMP de SAS, Cary, NC). La significancia estadística se determinó en la probabilidad (P) < 0,05.
El peso corporal se determinó en el valor inicial (0), 24, 48, 72 y 144 horas después del tratamiento. Cuando se convirtió al porcentaje de cambio con respecto al peso corporal de inicio (día 0), se observó una disminución dependiente de la dosis significativa en respuesta a dosis SC únicas de PEG-Compuesto 2 (Figura 65). El porcentaje de efecto de pérdida de peso fue máximo 72 horas después de la dosis y comenzó a regresar a los valores iniciales el día 6, y la respuesta a la dosis de 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2 permaneció significativamente reducida en comparación con aquella en el grupo de vehículo. El peso corporal se redujo considerablemente, en comparación con el grupo de tratamiento con vehículo, para el grupo de tratamiento con 0,3 mg/kg después de 72 horas (P<0,001) y para el grupo de tratamiento con 1,0 mg/kg después de 48 horas (P<0,05), 72 horas (P<0,0001) y 144 horas (P<0,001).
Las concentraciones de adiponectina total en plasma aumentaron considerablemente en comparación con el vehículo mediante el tratamiento con dosis de 0,1, 0,3 y 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2, 72 y 144 horas después de la dosis (Figura 66A). La dosis de 0,03 mg/kg de PEG-Compuesto 2 evaluada no produjo un aumento significativo de los efectos de adiponectina total en comparación con el vehículo en cualquier punto medido. La adiponectina total en plasma aumentó considerablemente en el grupo de tratamiento con 0,1 mg/kg después de 72 horas (P<0,001) y 144 horas (P<0,01), en el grupo de tratamiento con 0,3 mg/kg después de 72 horas (P<0,01) y 144 horas (P<0,01) y en el grupo de tratamiento con 1 mg/kg después de 72 horas (P<0,0001) y 144 horas (P<0,0001).
Cuando se expresaron como porcentaje de cambio con respecto al valor inicial, las concentraciones de adiponectina total en plasma aumentaron considerablemente en comparación con el vehículo, mediante el tratamiento con todas las dosis de PEG-Compuesto 2 en algunos puntos temporales (Figura 66B). No se presentó ninguna diferencia significativa en el porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en comparación con el vehículo 24 horas después del tratamiento con cualquier dosis de PEG-Compuesto 2, y 72 horas después de la dosis, todas las dosis de PEG-Compuesto 2 produjeron aumentos considerables, desde el punto de vista estadístico, en comparación con el vehículo. El cambio máximo observado fue un aumento de 75 % en el cambio del valor inicial de adiponectina 144 horas después de la dosis con 1 mg/kg de PEG-Compuesto 2. El porcentaje de cambio en adiponectina total en plasma aumentó considerablemente en el grupo de tratamiento con 0,03 mg/kg después de 72 horas (P<0,01), en el grupo de tratamiento con 0,1 mg/kg después de 48 horas (P<0,01), 72 horas (P<0,0001) y 144 horas (p <0,001), en el grupo de tratamiento con 0,3 mg/kg después de 72 horas (P<0,0001) y 144 horas (P<0,0001) y en el grupo de tratamiento con 1,0 mg/kg después de 48 horas (P<0,01), 72 horas (P<0,0001) y 144 horas (P<0,0001).
Las concentraciones de adiponectina HMW en plasma aumentaron considerablemente en comparación con el vehículo mediante el tratamiento con dosis de 0,1 y 1,0 mg/kg de PEG-Compuesto 2, mientras que las dosis de 0,03 y 0,3 mg/kg de PEG-Compuesto 2 no produjeron un aumento considerable de adiponectina HMW en comparación con el vehículo en cualquier punto medido (no se muestran los datos).
Cuando se midieron al final del estudio, 144 horas después del tratamiento, las concentraciones plasmáticas de PEG-Compuesto 2 aumentaron de manera dependiente de la dosis para la forma intacta C-carboxi terminal activa y la forma total (intacta y proteolizada) de la molécula en la Tabla 25.
Tabla^ - - nicas
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PEG-Compuesto 2 total e intacto C-terminal en plasma de ratón C57BL/6J 144 horas después de la dosis SC.
Todos los valores representan la media ± S.E.M.
Se siguió un protocolo similar con moléculas de compuesto 20 PEG, compuesto 105, compuesto 112, compuesto 182, compuesto 171, compuesto 170, compuesto 181 y PEG-compuesto 1, con ratones C58BL/6J de 9-11 semanas de vida, excepto que la adiponectina total solo se midió en el inicio, a los 3 días (72 horas) y a los 6 días (144 horas) después de la dosis. Los compuestos se expresaron en E. coli excepto por el compuesto 181, que se expresó en células HEK. Todos los compuestos aumentaron considerablemente la adiponectina total en plasma en comparación con el vehículo el Día 3 y/o Día 6 en determinadas dosis evaluadas (véase las Figuras 67A-F).
En dosis de 0,3 mg/kg y 1 mg/kg, cada uno de PEG-Compuesto 2 y compuesto 20 PEG dio como resultado aumentos significativos en la adiponectina total en plasma 6 días después de la dosis (P<0,001 para 1 mg/kg de cualquier compuesto, P<0,01 para 0,3 mg/kg de PEG-Compuesto 2 y P<0,05 para 0,3 mg/kg de compuesto 20 PEG) (Figura 67A).
En una dosis de 54,3 nmol/kg, el porcentaje de cambio con respecto al valor inicial de adiponectina total en plasma aumentó considerablemente con el PEG-Compuesto 2, compuesto 105 y compuesto 112 (en comparación con los controles tratados con vehículo) los Días 3 y 6 (P<0,001 para todos los puntos de datos excepto por el PEG-Compuesto 2 el día 3, P<0,05) (Figura 67B). Asimismo, la dosis de 5,43 nmol/kg de compuesto 112 aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en adiponectina total en plasma, en comparación con los controles tratados con vehículo, solo el Día 3 (P<0,05) (Figura 67B).
El porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma aumentó considerablemente con el compuesto 182 en dosis de 18,1 nmol/kg (P<0,01 los Días 3 y 6) y 54,3 nmol/kg (P<0,001 y P<0,05, respectivamente, los Días 3 y 6) (Figura 67C). El aumento en el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma para la dosis de 5,43 nmol/kg de compuesto 182 fue significativa solo el Día 6 (P<0,05). Asimismo, el PEG-Compuesto 2 (dosis de 54,3 nmol/kg) aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma el Día 3 y Día 6 (P<0,001 ambos días) (Figura 67C).
El porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma aumentó considerablemente con el compuesto 171 y el compuesto 181 el Día 3 y Día 6 de manera dependiente de la dosis, en comparación con el control tratado con vehículo (P<0,001 para todos los puntos de datos excepto por P<0,01 para la dosis de 5,43 nmol/kg de compuesto 181 el Día 6) (Figura 67D). Asimismo, el PEG-Compuesto 2 (dosis de 54,3 nmol/kg) aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma el Día 3 y Día 6 (P<0,001 ambos días) (Figura 67D).
El porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma aumentó considerablemente con el compuesto 170 los Días 3 y 6 en dosis de 18,1 nmol/kg (P<0,01, ambos días) y 54,3 nmol/kg (P<0,05 el Día 3 y P<0,001 el Día 6); el aumento en el porcentaje de cambio en adiponectina total en plasma para la dosis de 5,43 nmol/kg fue significativo solo el Día 6 (P<0,05) (Figura 67E). Asimismo, el PEG-Compuesto 2 (dosis de 54,3 nmol/kg) aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en la adiponectina total en plasma el Día 3 y Día 6 (P<0,001 ambos días) (Figura 67E).
El porcentaje de cambio con respecto al valor inicial en adiponectina total en plasma aumentó considerablemente con el compuesto 1 los Días 3 y 6 en una dosis de 10 mg/kg (P<0,001, ambos días). Además, el PEG-Compuesto 2 (1 mg/kg) aumentó considerablemente el porcentaje de cambio en adiponectina total en plasma el Día 6 (P<0,001) (Figura 67F).
Ejemplo 19: Efectos en la enfermedad renal diabética en ratones db/db
Los ratones db/db no nefrectomizados (unix) son un modelo de roedor de enfermedad renal diabética (DKD) en el cual la extirpación quirúrgica de un riñón exacerba y acelera la lesión y disfunción renales como resultado de la diabetes tipo 2 (Ninichuk et al., Eur J Med Res 12:351-355 (2007)).
Estudio de 4 semanas
En este estudio, los ratones db/db de 8 semanas de vida se sometieron a la extirpación del riñón izquierdo bajo anestesia con 5 % de isoflurano para acelerar el desarrollo de la nefropatía diabética. Tres semanas después de la uninefrectomía, se distribuyeron grupos de catorce ratones no nefrectomizados en el tratamiento con PEG-Compuesto 2 o con vehículo, en función de la aleatorización con la relación entre la albúmina y la creatinina en orina (uACR), glucosa en sangre y peso corporal, en ese orden. Se asignó un grupo de ratones magros db/m (n=12) como control normal no diabético. El tratamiento con PEG-Compuesto 2 o con vehículo en los ratones db/db no nefrectomizados comenzó tres semanas después de la cirugía. Se administraron 0,15 mg/kg de PEG-Compuesto 2 dos veces por semana (BIW) mediante inyección subcutánea (SC) en un vehículo que contenía sacarosa 250 mM, Tris 20 mM, pH 8,3. Las muestras de sangre de inicio se recolectaron mediante extracción de sangre retroorbital bajo anestesia con 5 % de isoflurano. Se obtuvieron múltiples recolecciones de manchas de orina durante tres horas para medir la glucosa, albúmina y creatinina en orina de cada ratón en el inicio, y después de 2, 3 y 4 semanas de tratamiento.
Los ratones se sacrificaron bajo anestesia de isoflurano después de cuatro semanas de tratamiento. Se realizó el análisis estadístico de los datos usando análisis de varianza de un factor (ANOVA) y la prueba de Dunnett, a menos que se indique lo contrario (software de análisis estadístico JMP, SAS, Cary, NC). La significancia estadística se determinó en la probabilidad (P) < 0,05. Se excluyeron cuatro ratones en el grupo de vehículo unix db/db del análisis de datos (excepto por el consumo de alimentos y agua) debido a que presentaron pielonefritis grave.
Los grupos de PEG-Compuesto 2 y de vehículos presentaron niveles similares de glucosa en plasma (765 ± 42 en comparación con 815 ± 46, P > 0,05) en el inicio antes del tratamiento. Después de cuatro semanas de tratamiento, al final del estudio, la glucosa en plasma en el grupo de PEG-Compuesto 2 fue 23 % menor que aquella del grupo de vehículo (485 ± 39 en comparación con 629 ± 43, P < 0,05) (véase la Tabla 26).
T l 2 . El r mi n n PE - m 2 r l l n n r m l .
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Después del inicio del tratamiento con PEG-Compuesto 2, los niveles de glucosa en orina disminuyeron progresivamente. Los niveles de glucosa en orina del grupo de PEG-Compuesto 2 mostraron reducciones significativas de 71 %, 73 % y 84 % con 2, 3 y 4 semanas de tratamiento, respectivamente, en comparación con el grupo de vehículo (todos P < 0,05; Tabla 5).
T l 27. El PE - m 2 r l l n rin m l .
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Se informó en la bibliografía que la microalbuminuria (relación de albúmina con respecto a creatinina en orina (uACR) > 30 Mg/mg) es uno de los indicadores más sensibles y específicos de nefropatía temprana en pacientes diabéticos (véase Chae et al., J Korean Med Sci. 2012, 27 784-787). La microalbúmina se midió después de 3 horas de recolección de manchas de orina, y los valores se normalizaron a creatinina en orina. Los ratones magros db/m no diabéticos tuvieron valores medios de uACR en un intervalo de 21 a 37 Mg/mg durante el curso del estudio (Figura 68 y en la Tabla 28).
Durante el estudio, uACR en ratones unix db/db aumentó considerablemente de 23 a 62 veces (todos P < 0,05) en comparación con los ratones db/m magros no diabéticos (Figura 68 y en la Tabla 28). La uACR del grupo tratado con vehículo progresó de 838 ± 159 Mg/mg en el inicio a 1341 ± 284 Mg/mg después de 4 semanas (Tabla 28), de manera coherente con el daño renal progresivo.
En comparación con el grupo de vehículo, los ratones unix db/db tratados con PEG-Compuesto 2 mostraron una disminución significativa en los valores de uACR de 49 %, 53 % y 66 % con 2, 3 y 4 semanas de tratamiento, respectivamente (todos P < 0,05; Figura 68). Los valores de uACR después del tratamiento con PEG-Compuesto 2 fueron menores que aquellos medidos al inicio, antes del tratamiento (Tabla 28).
Tabla 28. El PEG-Compuesto 2 redujo la uACR (Mg/mg)a.
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El peso húmedo del riñón refleja el estado de la hipertrofia renal debida a la hiperfiltración en diabetes mellitus. El peso medio del riñón fue significativamente mayor en ratones unix db/db en comparación con ratones magros no diabéticos, con un aumento del 59 % en el peso del riñón en ratones unix db/db tratados con vehículo. El tratamiento con PEG-Compuesto 2 durante cuatro semanas inhibió significativamente el aumento del peso del riñón en los ratones diabéticos (286 ± 6,3 en comparación con 253 ± 7,4, vehículo en comparación con PEG-Compuesto 2, P < 0,05).
Estudio de 8 semanas
A las 8 semanas de vida, los ratones db/db se sometieron a extirpación del riñón izquierdo con 3 % de isoflurano en oxígeno para acelerar el desarrollo de nefropatía diabética. Tres semanas después de la uninefrectomía, grupos de catorce ratones no nefrectomizados se bloquearon, se aleatorizaron y se distribuyeron en el tratamiento con PEG-Compuesto 2 a 0,15 mg/kg o a 0,015 mg/kg, o tratamiento con vehículo, en función de la relación de albúmina con respecto a creatinina en orina (uACR), la glucosa en sangre y el peso corporal, en ese orden. Un grupo de ratones magros db/m (n=11) se asignó como control normal no diabético. El tratamiento subcutáneo dos veces por semana con PEG-Compuesto 2 a 0,15 o 0,015 mg/kg o con vehículo en ratones unix db/db comenzó tres semanas después de la cirugía. Los ratones se sacrificaron con 3 % de isoflurano en oxígeno y la posterior luxación cervical después de ocho semanas de tratamiento. Los riñones se extrajeron, se desencapsularon y se pesaron.
El grupo de dosis de 0,015 mg/kg no mostró disminución significativa de la glucosa en sangre ni mejoría de los parámetros renales. La dosis de 0,15 mg/kg de PEG-Compuesto 2 disminuyó significativamente los niveles de glucosa en sangre y orina y redujo la albuminuria en un ~50 %, en comparación con aquella en ratones tratados con vehículo (todos P < 0,05). Un cúmulo de genes fibróticos e inflamatorios se reguló significativamente de manera ascendente en los riñones de ratones db/db no nefrectomizados en comparación con ratones magros, y el tratamiento con el PEG-Compuesto 2 a 0,15 mg/kg redujo significativamente la expresión de estos genes con respecto a los niveles observados en los ratones magros db/m de control. El peso húmedo medio del riñón también fue significativamente más alto en ratones db/db no nefrectomizados en comparación con el de los ratones magros, y el tratamiento con el PEG-Compuesto 2 a 0,15 mg/kg durante 57 días redujo significativamente el peso húmedo medio del riñón en comparación con el tratamiento con vehículo.
Las secciones del tercio medio del riñón se tiñeron con hematoxilina y eosina para el análisis histológico. Las lesiones renales se clasificaron de acuerdo con los criterios definidos en las notas de la Tabla 29. Todos los ratones unix db/db presentaron glomerulopatía mesangial, el fenotipo previsto de este modelo (Tabla 29). El tratamiento con el PEG-Compuesto 2 a 0,15 mg/kg, pero no a 0,015 mg/kg, pareció reducir la gravedad de la glomerulopatía mesangial. Algunos ratones unix db/db presentaron lesiones intersticiales-tubulares secundarias a la glomerulopatía, lo cual es coherente con la patogenia subyacente del modelo.
Estas observaciones proporcionan pruebas de que el PEG-Compuesto 2 a 0,15 mg/kg es nefroprotector en el marco de la diabetes tipo 2 crónica.
Tabla 29. PEG-Com uesto 2: Incidencia rado de las lesiones renales.
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continuación
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Ejemplo 20. Efectos sobre la hipertrofia cardíaca y la fibrosis cardíaca en ratón Balb/C infundido con isoproterenol
El ratón Balb/c (iso)-infundido con isoproterenol es un modelo de roedor de hipertrofia y fibrosis cardíacas.
Se aleatorizaron ratones Balb/c macho de 10 a 12 semanas en función del peso corporal antes de la administración del fármaco. Se administró iso o vehículo (0,02 % de ácido ascórbico en solución salina) por vía subcutánea mediante minibombas osmóticas durante 3 semanas. Los ratones recibieron dosis de manera concurrente dos veces por semana (BIW) con 0,5 mg/kg de PEG-Compuesto 2 o vehículo durante el transcurso de 3 semanas. Los animales luego se sometieron a eutanasia, y los corazones se retiraron de los grandes vasos, se secaron levemente para retirar restos de sangre de los ventrículos y se pesaron. De los 24 ratones restantes en cada grupo, el corazón entero se congeló en hielo seco y se almacenó a < 70°C para el análisis de hidroxiprolina (HP).
El análisis de contenido de HP cardíaco (criterio de valoración de fibrosis cardíaca) se llevó a cabo usando un kit de ensayo Total Collagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Quickzyme Biosciences, Países Bajos).
Al final de la fase de vida de 3 semanas, se midió el contenido de HP total en el corazón. El contenido de HP normalizado aumentó 114 % (P<0,05) en el grupo de iso vehículo (21,35 0,81 Mg/mg) en comparación con el grupo de tratamiento simulado vehículo (9,96 0,38 Mg/mg). Esto indicó que la fibrosis cardíaca se había establecido en respuesta a la infusión con iso en los ratones Balb/c. El contenido de HP cardíaco en ratones que recibían iso PEG-Compuesto 2 (0,5 mg/kg) (15,91 0,49 Mg/mg) fue significativamente menor que en los animales de iso vehículo (Figura 69 y en la Tabla 30). Por lo tanto, cuando se administró de modo preventivo, el PEG-Compuesto 2 (0,5 mg/kg) redujo el grado de fibrosis e hipertrofia cardíacas.
Tabla 30. Contenido de HP cardíaca en la semana 3 del tratamiento con isoproterenol y PEG-Compuesto 2. Los datos representan el contenido de HP total en el corazón normalizado a proteína. Todos los valores representan la media ± S.E.M. *: P < 0,05, en comparación con tratamiento simulado vehículo, **: P < 0,05, en comparación con iso vehículo ANOVA de un factor lue o rueba de Bonferroni .
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Se realizó un estudio de intervención para determinar si 0,5 mg/kg de PEG-Compuesto 2 podía revertir la fibrosis y la hipertrofia cardíacas preestablecidas o retardar su progresión en ratones Balb/c que se habían infundido con iso durante 1 semana antes de iniciar las 3 semanas de tratamiento con la variante de PEG-FGF21. La intervención con PEG-Compuesto 2 (0,5 mg/kg) produjo una reducción del 24 % en la masa ventricular izquierda (LV) (un criterio de valoración de hipertrofia cardíaca evaluado mediante ecocardiografía). Esta observación se asoció con una pérdida significativa de 14 % del peso corporal y un aumento del 23 % de los niveles circulantes de adiponectina. No se observó una diferencia significativa entre los grupos de iso vehículo e iso PEG-Compuesto 2 en fibrosis cardíaca (contenido de HP) o función sistólica cardíaca (medida mediante ecocardiografía).
Ejemplo 21: Estudio de dosis ascendente única y múltiples, controlado con placebo y aleatorizado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica del PEG-Compuesto 2 en sujetos sanos
El estudio consiste en tres partes: Parte A: Dosis ascendente única (SAD; Parte B: Dosis ascendentes múltiples (MAD); y Parte C: Dosis ascendentes múltiples en sujetos japoneses (J-MAD). Se administra el PEG-Compuesto 2 o placebo mediante inyección subcutánea como tratamiento a ciegas. Los sujetos de la Parte A recibieron una dosis única del tratamiento a ciegas, y los sujetos de las Partes B y C recibieron múltiples dosis del tratamiento a ciegas.
Se seleccionó la dosis inicial de 0,6 mg de PEG-Compuesto 2 en SAD. También se seleccionó una dosis máxima de 60 mg en SAD y una dosis de 60 mg semanal para MAD para explorar el extremo más alto del intervalo de dosis eficaz proyectado. Un sujeto puede recibir una dosis de 0,6 mg, 2 mg, 6 mg, 20 mg, 40 mg o hasta 60 mg de PEG-Compuesto 2 en el grupo de SAD. En los grupos MAD, un sujeto puede recibir una dosis semanal de 2 mg, 6 mg, 20 mg, 40 mg o 60 mg (QW o BIW).
Se pueden incluir sujetos de sexo femenino y masculino entre 21-55 años de edad con un IMC entre 30 y 40 (Partes A y B) o entre 20 y 35 (Parte C).
Criterios de valoración primarios:
El objetivo (evaluar la seguridad y tolerabilidad de dosis subcutáneas únicas o múltiples de PEG-Compuesto 2 en sujetos sanos) se medirá de acuerdo con los siguientes criterios de valoración: incidencia de AE, AE graves y episodios de especial interés, tales como evaluación del lugar de inyección, AE que conducen a la interrupción, y muerte, así como anormalidades notables en pruebas de laboratorio clínico, mediciones de los signos vitales, ECG, exámenes físicos que ocurran hasta 30 días después de la última dosis del medicamento de estudio.
Criterios de valoración secundarios:
Parte A: Los parámetros farmacocinéticos de la dosis única (Cmáx, Tmáx, AUC(0-T), AUC(INF), T-HALF y CLT/F) derivaron de la concentración en suero del PEG-Compuesto 2 intacto C-terminal en comparación con los datos del tiempo, el día del tratamiento con dosis única y durante un período de reposo farmacológico de hasta 4 semanas después de la dosis única.
Partes B y C: Los parámetros farmacocinéticos de las dosis múltiples (Cmáx, Tmáx, AUC(TAU) y el índice de acumulación (AI)) derivaron de la concentración en suero del PEG-Compuesto 2 en comparación con los datos del tiempo después de la primera dosis y la última dosis. T-HALF se calcula solo para la última dosis. La concentración en suero mínima del PEG-Compuesto 2 (CMínima) se obtiene los días seleccionados durante el transcurso de 22 días de tratamiento y hasta 4 semanas después de la última dosis.
Ejemplo 22. Evaluación del PEG-compuesto 1, PEG-Compuesto 2 y compuesto 170 en un modelo de ratón de EHNA
Se analizaron tres variantes de FGF-21, PEG-compuesto 1, PEG-Compuesto 2 y compuesto 170, en el modelo de 2 entradas de EHNA de Stelic Institute descrito anteriormente en el Ejemplo 13. Se indujo EHNA en 40 ratones macho con una sola inyección subcutánea de 200 |jg de solución de estreptozotocina 2 días después del nacimiento y se los alimentó con una dieta de alto contenido graso (HFD, 57 % de grasa por kcal) luego de las 4 semanas de vida ("ratones STAM"). Los ratones recibieron 3 mg/kg de PEG-compuesto 1 (n=8), 0,5 mg/kg de PEG-Compuesto 2 (n=8), 2,5 mg/kg de compuesto 170 (n=8), o vehículo (Tris 20 mM/sacarosa 250 mM, pH 8,3) (n=8), por vía subcutánea dos veces por semana desde las 7 hasta las 9 semanas de vida. Estos ratones se sacrificaron a las 9 semanas de vida para diversos análisis. Otro grupo de ocho ratones sirvieron como el control de valor inicial y se sacrificaron a las 7 semanas de vida.
Se midieron las concentraciones de adiponectina total y de alto peso molecular (HMW) en muestras de suero terminal preparadas de los ratones mediante un kit ELISA disponible en el comercio (catálogo de Alpco No. 47-ADPMS-E01) siguiendo el protocolo del fabricante. En comparación con el grupo de vehículo, las 3 variantes de FGF21 aumentaron de manera significativa la adiponectina total en suero (Figura 70A) (p<0,0001 para PEG-compuesto 1, PEG-Compuesto 2 y compuesto 170), adiponectina de HMW en suero (Figura 70B) (p<0,005, PEG-compuesto 1; y p<0,0001, PEG-Compuesto 2 y compuesto 170), y la relación de adiponectina HMW/total (Figura 70C) (p<0,05, PEG-compuesto 1; y p<0,01, PEG-Compuesto 2 y compuesto 170).
Se determinaron peso corporal, peso del hígado, triglicéridos en el hígado, colesterol en el hígado, y niveles de glucosa, triglicéridos y ALT en plasma. Las tres variantes de FGF21 redujeron considerablemente el peso corporal (Figura 72A), el peso del hígado (Figura 72B) la relación de peso del hígado con respecto al peso corporal (Figura 72C), triglicéridos en el hígado (Figura 72D) y ALT en plasma (Figura 72E). El PEG-Compuesto 2 y el compuesto 170 redujeron considerablemente el colesterol en el hígado (Figura 72F), y el PEG-Compuesto 2 redujo considerablemente los triglicéridos en plasma (Figura 72G). Ningún compuesto redujo considerablemente el colesterol o la glucosa en plasma (no se muestran los datos) en este estudio.
Ejemplo 23. Evaluación del PEG-Compuesto 2 y compuesto 170 durante 3 semanas de dosis BIW en ratones ob/ob
Se evaluaron el compuesto pegilado 2 y el compuesto 170 en un estudio de dosis repetidas durante 21 días. Los resultados demostraron que los dos compuestos causaron reducciones en el peso del hígado y reducciones dependientes de dosis en esteatosis de hepatocitos en el lóbulo lateral izquierdo del hígado, en comparación con el vehículo.
A las 8 semanas de vida, los ratones ob/ob macho (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) se aleatorizaron en 5 grupos, como se describe en el Ejemplo 12. Los ratones recibieron vehículo, compuesto pegilado 2 y compuesto 170 por vía subcutánea dos veces por semana (BIW) de la siguiente manera (n=12 para cada grupo): 1) vehículo (sacarosa 250 mM/Tris 20 mM, pH 8,3); 2) compuesto pegilado 2, 8,14 nmol/kg (0,15 mg/kg); 3) compuesto 170, 8,14 nmol/kg; 4) compuesto pegilado 2, 81,45 nmol/kg (1,5 mg/kg); y 5) compuesto 170, 81,45 nmol/kg. Se determinaron peso corporal, glucosa en plasma, triglicéridos, insulina, ácidos grasos no esterificados (NEFA), p-OH-butirato, adiponectina total y adiponectina de alto peso molecular (HMW) mediante el período de dosis de 21 días después de la ingestión de alimentos. La hemoglobina glicada (HbA1c) en sangre se determinó al principio y final del estudio. El peso del hígado y los triglicéridos en el hígado se determinaron al final del estudio. La histología hepática se realizó con el lóbulo lateral izquierdo del hígado para evaluar la esteatosis de hepatocitos. El tejido se fijó en 10 % de formalina en tampón y se procesó para histología. Las secciones de tejidos embebidos en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina usando los métodos estándares. Los primeros 6 ratones en cada grupo de tratamiento se evaluaron (total =30 ratones). La esteatosis de hepatocitos (metamorfosis grasa micro y macrovesicular) se limitó en mayor medida a zonas II/III en ratones de control; a este grado de esteatosis se asignó arbitrariamente un grado (índice) 2. Otras muestras se clasificaron a ciegas (se asignó grado 0 al grado más bajo de esteatosis observada). De manera adicional, se observaron células perisinusoidales cargadas con lípidos, células aparentemente estrelladas (Ito), en ratones tratados con PEG-Compuesto 2 o compuesto 170, pero no cuando se los trató con vehículo en el que las células Ito se enmascararon mediante esteatosis de hepatocitos. La abundancia de células Ito se evaluó a ciegas (sin contar), y cada muestra se clasificó arbitrariamente para proporcionar una evaluación semicuantitativa (en donde el índice 3 indicaba la mayor abundancia).
Las dos dosis de ambos compuestos redujeron de manera significativa la glucosa pospandrial a niveles normoglucémicos (no se muestran los datos), y redujeron de manera significativa la insulina en plasma y HbA1c (no se muestran los datos). Se observaron aumentos significativos en adiponectina de alto peso molecular (HMW) con respecto al vehículo del Día 8 al Día 21, con una tendencia a la dependencia de dosis, mientras que la adiponectina total en plasma presentó algunos aumentos pequeños, pero inconsistentes, en comparación con el vehículo (no se muestran los datos). Tanto NEFA en plasma como p-OH-butirato aumentaron con los dos compuestos (en especial, en la dosis alta) en comparación con el vehículo (no se muestran los datos), lo cual sugirió un aumento de la oxidación de ácidos grasos. Se observaron disminuciones significativas tanto en el peso absoluto del hígado como en el peso del hígado corregido para peso corporal el Día 21 en todos los grupos de tratamiento (Figuras 71A y 71B). De manera específica, en los cuatro grupos tratados con variantes de FGF-21, el peso absoluto del hígado se redujo de manera significativa (p<0,0001) con respecto al control de vehículo, y la dosis más alta de PEG-Compuesto 2 redujo de manera significativa el peso absoluto del hígado con respecto a una dosis más baja de este compuesto (p<0,05) (Figura 71A). De manera adicional, en los cuatro grupos tratados con variantes de FGF-21, la relación entre el peso del hígado y el peso corporal se redujo de manera significativa (p<0,0001) con respecto al control de vehículo (Figura 71B). Se observó una reducción dependiente de dosis en la gravedad de la esteatosis de hepatocitos en ratones tratados con PEG-Compuesto 2 o compuesto 170 en comparación con el vehículo (Tabla 31). Se observaron células perisinusoidales cargadas con lípidos (aparentemente células Ito o células estrelladas hepáticas) en secciones de ratones tratados con PEG-Compuesto 2 y compuesto 170 (Tabla 32), pero no se pudieron visualizar en secciones de ratones tratados con vehículo debido a la interferencia de la esteatosis de hepatocitos. Se observó una reducción dependiente de dosis en la gravedad de la importancia de la célula Ito en secciones de ratones tratados con PEG-Compuesto 2 o compuesto 170.
Tabla 31. Incidencia de esteatosis de hepatocitos (metamorfosis grasa) e índices de histología en ratones ob/ob PEG-Comp 2 (8,14 Comp 170 (8,14 PEG-Comp 2 Comp 170 (81,45 Vehículo nmol/kg) nmol/kg) (81,45 nmol/kg) nmol/kg Puntuación N.° 6 6 6 6 6
0 - - 1 6 6
1 - 6 5 - -
2 6 - - - -
Tabla 32. Incidencia de células perisinusoidales cargadas con lípidos e índices de histología en ratones ob/ob Vehículo PEG-Comp 2 (8,14 Comp 170(8,14 PEG-Comp 2 (81,45 Comp 170 nmol/kg) nmol/kg) nmol/kg) (81,45 nmol/kg Puntuación No. 6 6 6 6 6
0 ND - - 1 -
1 ND - 1 4 1
2 ND - - 1 5
3 ND 6 5 -

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido FGF-21 modificado que comprende el polipéptido de SEQ ID NO:201 en donde el resto de paraacetil-fenilalanina del mismo está enlazado a un resto poli(etilenglicol), para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a fibrosis seleccionada de esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), fibrosis hepática y cirrosis en un paciente.
2. Un polipéptido FGF-21 modificado que comprende el polipéptido de SEQ ID NO:201 en donde el resto de paraacetil-fenilalanina del mismo está enlazado a un resto poli(etilenglicol), para su uso en un método para tratar o prevenir EHNA en un paciente.
3. El polipéptido para su uso de la reivindicación 2, en donde se trata EHNA.
4. El polipéptido para su uso de la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad asociada a fibrosis es cirrosis.
5. El polipéptido para su uso de la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad asociada a fibrosis es fibrosis hepática.
6. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0,1 kDa y aproximadamente 100 kDa.
7. El polipéptido para su uso de la reivindicación 6, en donde dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 10 kDa y 40 kDa.
8. El polipéptido para su uso de la reivindicación 7, en donde dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa.
9. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que da como resultado uno o más de fracción de grasa hepática disminuida y niveles de adiponectina aumentados en dicho paciente.
10. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe un índice de hígado graso de al menos aproximadamente 60.
11. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe un porcentaje de fracción de grasa hepática de al menos el 10 %, que opcionalmente se determina mediante obtención de imágenes por resonancia magnética.
12. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe fibrosis por EHNA CRN de fase 1-3, que opcionalmente es EHNA CRN de fase 1-3 determinada por una biopsia del hígado.
13. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicho polipéptido FGF-21 modificado es para administrarse por inyección subcutánea.
14. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho polipéptido FGF-21 modificado es para administrarse a una frecuencia de aproximadamente una vez por día; aproximadamente una vez por semana; aproximadamente dos veces por semana; aproximadamente una vez cada dos semanas; aproximadamente una vez cada tres semanas; o una vez cada cuatro semanas.
15. El polipéptido para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde dicho polipéptido FGF-21 modificado es para administrarse en una dosificación de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal del paciente.
16. El polipéptido para su uso de la reivindicación 3, en donde dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa y dicho polipéptido FGF-21 es para administrarse por inyección subcutánea a una frecuencia de aproximadamente una vez por día; aproximadamente una vez por semana; aproximadamente dos veces por semana; aproximadamente una vez cada dos semanas; aproximadamente una vez cada tres semanas; o una vez cada cuatro semanas en una dosificación de entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal del paciente.
17. El polipéptido para su uso de la reivindicación 16, que da como resultado uno o más de fracción de grasa hepática disminuida y niveles de adiponectina aumentados en dicho paciente.
18. El polipéptido para su uso de la reivindicación 16, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe un índice de hígado graso de al menos aproximadamente 60.
19. El polipéptido para su uso de la reivindicación 16, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe un porcentaje de fracción de grasa hepática de al menos el 10 %, que opcionalmente se determina mediante obtención de imágenes por resonancia magnética.
20. El polipéptido para su uso de la reivindicación 16, en donde antes del tratamiento el paciente exhibe fibrosis por EHNA CRN de fase 1-3, que opcionalmente es EHNA CRN de fase 1-3 determinada por una biopsia del hígado.
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