RS62066B1 - Modifikovani fgf-21 polipeptidi i njihove primene - Google Patents

Description

Opis

OBLAST NA KOJU SE ODNOSI PRONALAZAK

[0001] Ova objava se odnosi na modifikovane FGF-21 polipeptide njihove terapijske primene. STANJE TEHNIKE

[0002] Faktori rasta fibroblasta su polipeptidi široko eksprimirani u tkivima u razvoju i zrelim tkivima (Baird i sarad., Cancer Cells, 3: 239-243, 1991) koji igraju presudne uloge u višestrukim fiziološkim funkcijama (McKeehan i sarad., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59: 135-176, 1998; Burgess, V. H. i sarad., Annu. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989). Prema literaturi, porodica FGF sastoji se od najmanje dvadeset dva člana (Reuss i sarad., Cell Tissue Res. 313: 139-157 (2003)).

[0003] Faktor rasta fibroblasta 21 (FGF-21) opisan je u literaturi (Nishimura i sarad., Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206 (2000); WO 01/36640; i WO 01/18172, i U.S.

[0004] Objava patenta sa br. 20040259780, ). Za razliku od drugih FGF-a, za FGF-21 je prijavljeno da nema proliferativne i tumorigene efekte (Ornitz i Itoh, Genome Biology 2001, 2(3):pregledi3005.1-3005.12).

[0005] Određeni FGF-21 polipeptidi i njihove primene su opisani u američkoj patentnoj objavi sa br. 20010012628, američkom patentu sa br. 6,716,626, američkoj patentnoj objavi sa br.

2004/0259780, WO 03/011213, Kharitonenkov i sarad. J Clin Invest. 2005 Jun;115(6):1627-35, WO 03/059270, američkoj patentnoj objavi sa br. 2005/0176631, WO 2005/091944, WO 2007/0293430, američkoj patentnoj objavi sa br. 2007/0293430, WO/2008/121563, američkom patentu sa br.4,904,584, WO 99/67291, WO 99/03887, WO 00/26354, i američkom patentu sa br.

5,218,092.

[0006] Zabeleženo je da humani FGF-21 ima sklonost podvrgavanja proteolizi in vivo, formira agregate in vitro, podvrgava se deamidaciji (Gimeno i Moller, Trends Endocrinol Metab. 2014 Jun;25(6):303-11; američki patent sa br.8,361,963; Hecht i sarad., PLoS One.2012;7(11):e49345; američka patentna objava sa br.2007/0293430; WO 2006/0065582), potencijalno ograničavajući rok trajanja farnaceutskih kompozicija koje sadrže FGF-21. Agregati i deamidirani oblici terapijskih polipeptida mogu potencijalno da povećavaju imunogenost (videti Američki departman za zdravstvo i ljudske resurse, "Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products," Avgust 2014; Subramanyam (ured.), "Therapeutic Protein Immunogenicity Focus Group Newsletter," Američka asocijacija farmaceutskih naučnika, tom.1, stavka 3 (Decembar 2011)).

[0007] AU 2012 268895A1 opisuje FGF-21 polipeptide koji sadrže neprirodno kodirane aminokiseline povezane sa poli(etilen glikolom).

[0008] Raniji rad objavljen kao WO 2008/121563 i američka patentna objava sa br.

2008/0255045 je prikazao da su određeni humani FGF-21 polipeptidi modifikovani da sadrže neprirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa poli(etilen glikolom) na određenim položajima ispoljavali povećani in vivo polu-život i/ili zadržali biološku aktivnost. Humani FGF-21 polipeptidi koji su uzeti kao primer nisu, međutim, uključili ovde opisane delecije ili supstitucije sekvenci.

[0009] Fibroza je stvaranje viška fibroznog vezivnog tkiva u organu ili tkivu. Prekomerno taloženje fibroznog tkiva povezano je sa patološkim stanjima koja mogu dovesti do oštećenja funkcije organa ili tkiva. Pogođeni organi mogu biti pluća (fibroza pluća ili pulmonalna), jetra (fibroza jetre ili hepatična), bubreg (fibroza bubrega ili renalna) i srce (kardijalna fibroza). Fibroza takođe može uticati na druga tkiva i organe, uključujući zglobove, kožu, creva, koštanu srž i druge. Primeri fibrotičnih stanja ili bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, bezalkoholni steatohepatitis (NASH), koji pogađa jetru; dijabetičnu bolest bubrega i dijabetičnu nefropatiju, koji utiču na bubreg; i metabolička srčana insuficijencija, koja utiče na srce. Na primer, NASH karakterišu masnoća, upala i oštećenje jetre kod ljudi koji konzumiraju malo ili nimalo alkohola i mogu dovesti do ciroze jetre. NASH ima tendenciju dijagnoze kod osoba sa prekomernom težinom ili gojaznih sredovečnih osoba koje često imaju povišene nivoe lipida u krvi i dijabetes ili predijabetes.

[0010] Tehnička rešenja ove objave se, između ostalog, bave problemima povezanim sa aktivnošću i proizvodnjom FGF-21 polipeptida, proizvodnjom FGF-21 polipeptida sa poboljšanim biološkim ili farmakološkim svojstvima, kao što je poboljšani terapijski poluživot, i postupcima lečenja ili sprečavanje bolesti i poremećaja.

REZIME PRONALASKA

[0011] Pronalazak se odnosi u prvom aspektu na modifikovan FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid sa SEQ 11) NO:201 pri čemu je para-acetil-fenilalaninski ostatak istog povezan sa poli(etilen glikol) segmentom, za primenu u postupku lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom odabrane od bezalkoholnog steatohepatitisa (NASH), fibroze jetre, i ciroze kod pacijenta.

[0012] Pronalazak se odnosi u drugom aspektu na modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid sa ID BR:201 pri čemu je para-acetil-fenilalaninski ostatak istog povezan sa poli(etilen glikol) segmentom, za primenu u postupku lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta.

[0013] Ovde stavljeni na uvid javnosti su modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID Nos(SEK ID BROJEVIMA): 1-7, izuzev što navedena aminokiselinska sekvenca sadrži: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je navedena interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 sa SEQ ID NO(SEK ID BR): 1, pri čemu je navedena interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0-12 aminokiselina; i (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija.

[0014] Takođe ovde stavljene na uvid javnosti su kompozicije koje sadrže bilo koji od modifikovanih FGF-21 polipeptida koji su ovde opisani i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0015] Ovde stavljeni na uvid javnosti su modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 1-7, izuzev što navedena aminokiselina sadrži: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je navedena interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 sa SEQ ID NO: 1, pri čemu je navedena interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0-12 aminokiselina; i (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija; i (iii) fuzioni partner.

[0016] Takođe stavljeni na uvid javnosti ovde su postupci regulisanja najmanje jednog od homeostaze glukoze i lipida, preuzimanja glukoze, eksprimiranja GLUT 1, i/ili serumskih koncentracija glukoze, triglicerida, insulina ili glukagona kod pacijenta koji ima potrebu za tim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0017] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci povećanja osetljivosti na insulin, povećanja nivoa adiponektina, smanjenja nivoa glukoze u krvi, smanjenja nivoa glukagona, smanjenja nivoa triglicerida, smanjenja nivoa fruktozamina, smanjenja nivoa holesterola male gustine, ili smanjenja nivoa C-reaktivnog proteina kod pacijenta koji ima potrebu za tim ili u uzorku krvi, seruma, ili drugom uzorku pomenutog pacijenta, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0018] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci tretiranja stanja ili poremećaja odabranog od gojaznosti, dijabetesa, pankreatitisa, insulinske rezistencije, hiperinsulinemije, intolerancije na glukozu, hiperglikemije, metaboličkog sindroma, oštećene tolerancije glukoze, neadekvatnog klirensa glukoze, visoke glukoze u krvi, tipa A insulinske rezistencije, tipa C insulinske rezistencije (poznat i kao HAIR-AN sindrom), Rabson-Mendenhall-ovog sindroma, Donohue-ovog sindroma ili leprešonizma, hiperandrogenizma, hirzuitizma, ili acanthosis nigricans-a, i Prader-Willi-ovog sindroma kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0019] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2 ili gojaznosti kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0020] Prema prvom aspektu pronalaska, modifikovani FGF-21 polipeptidi su za primenu u postupcima lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom odabrane od bezalkoholnog steatohepatitisa (NASH), fibroze jetre, i ciroze kod pacijenta.

[0021] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom koji obuhvataju administriranje pacijentu koji ima potrebu za njima efikasne količine kompozicije koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid koji je ovde opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0022] Prema tehničkom rešenju prvog aspekta pronalaska modifikovani FGF-21 polipeptidi su za primenu u postupcima lečenja fibroze jetre ili ciroze kod pacijenta koji ima potrebu za istim.

[0023] Prema drugom aspektu pronalaska modifikovani FGF-21 polipeptidi su za primenu u postupcima lečenja ili prevencije NASH-a kod pacijenta koji ima potrebu za njima.

[0024] Prema prvom aspektu pronalaska modifikovani FGF-21 polipeptidi su za primenu u postupcima lečenja NASH-a i/ili fibroze jetre.

[0025] U jednom tehničkom rešenju pronalaska modifikovani FGF-21polipeptidi su za primenu u postupcima smanjenja frakcije hepatične masnoće kod pacijenta koji ima potrebu za istim.

[0026] U jednom tehničkom rešenju pronalaska modifikovani FGF-21 polipeptidi su za primenu u postupcima povećanja nivoa adiponektina (kao što je ukupni adiponektin u plazmi i/ili adiponektin visoke molekulske mase) kod pacijenta koji ima potrebu za istim.

[0027] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja srčane insuficijencije ili kardijalne fibroze kod pacijenta koji ima potrebu za njima koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0028] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja bubrežne ili renalne fibroze kod pacijenta koji ima potrebu za njima koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0029] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja plućne fibroze kod pacijenta koji ima potrebu za njima koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan.

[0030] Takođe ovde stavljeni na uvid javnosti su postupci lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom kod pacijenta koji ima potrebu za njima, koji obuhvataju administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži jednu ili više neprirodno kodiranih aminokiselina, pri čemu navedeni modifikovani FGF-21 polipeptid poseduje najmanje 90% identičnosti sa humanim FGF-21 polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs:1-7 i 201, pri čemu navedena bolest koja je u vezi sa fibrozom je odabrana od NASH, fibroze jetre, dijabetine bubrežne bolesti, hronične bubrežne bolesti, renalne fibroze, plućne fibroze, kardijalne fibroze, srčane insuficijencije, i metabolične srčane insuficijencije.

KRATAK OPIS NEKOLIKO PRIKAZA CRTEŽA

[0031]

SL. 1A-B. Primeri modifikovanih FGF-21 polipeptidnih sekvenci. Navedene koordinate su u odnosu na divlji tip FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO:1. Svaki od potpunih polipeptida uključuje N-terminalnu sekvencu

MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLL

QLKALKPGVI QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY, praćenu naznačenom aminokiselinom na položaju 108, praćenu naznačenom sekvencom regiona obeleženom "Aminokiseline 109-149", praćenu sekvencom PGILAPQPPDVGSSDPLSM, praćenu naznačenom sekvencom regiona obeleženom "Aminokiseline 169-181." Potpune aminokiselinske sekvence modifikovanih FGF-21 polipeptida su takođe prikazane u Primeru 4, ispod.

SL. 2. Primer krive doznog odgovora za in vitro FGF-21 aktivnost (merenu pomoću fosforilacije zavisne od FGF21 kinaze regulisane vanćelijskim signalima (ERK) 1/2 u testu na bazi ćelija) za pegilovano jedinjenje 1 i pegilovano jedinjenje 2.

SL. 3. Reprezentativni rezultati diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (differential scanning calorimetry, DSC) izvedene radi procene termičke stabilnosti modifikovanih FGF-21 polipeptida. U ovom primeru, pokazano je da Pegilovano jedinjenje 2 ima središnju tačku temperature prelaza (transition midpoint, "Tm") približno 8 stepeni C višu nego Pegilovano jedinjenje 1. Termička reverzibilnost bila je >95% (nije prikazano). SL. 4. Reprezentativni rezultati termičke skenirajuće fluorescencije (thermal scanning fluorescence, TSF) izvedene radi evaluacije termičke stabilnosti modifikovanih FGF-21 polipeptida. Na ovoj slici, prikazano je da Jedinjenje 10 ima središnju tačku temperature prelaza ("Tm") približno 8 stepeni C višu nego Jedinjenje 1 (koje ima divlji tip FGF-21 sekvence osim što je uključen N-terminalni metionin za ekspresiju u E. coli).

SL. 5. Leva tabla: Merenje deamidacije tokom vremena (na šta ukazuje heterogenost naboja) na 25 stepeni C za Pegilovano jedinjenje 1 i Pegilovano jedinjenje 2. Pegilovano jedinjenje 2 ispoljava smanjeno formiranje heterogenosti naboja, što ukazuje na znatno usporenu deamidaciju. Desna tabla: Merenje formiranja agregata tokom vremena (mereno hromatografijom zasnovanom na veličini čestica) na 40 stepeni C za Pegilovano jedinjenje 1 i Pegilovano jedinjenje 2, svako u saharoza/histidin puferu na pH 7.0 i pri koncentraciji proteina od 7.5 mg/mL. Pegilovano jedinjenje 2 pokazuje smanjeno formiranje agregata. Zajedno, ovi rezultati predviđaju duži rok trajanja i mogućnost formulisanja do više koncentracije za Pegilovano jedinjenje 2 u odnosu na Pegilovano jedinjenje 1.

SL. 6. Merenje formiranja agregata visoke molekulske mase (HMW) tokom vremena, za modifikovane FGF-21 polipeptide na pH 6.5 u saharoza/histidin puferu (gornja tabla), pH 7.0 u saharoza/histidin puferu (srednja tabla), i pH 8.3 saharoza/TRIS puferu (donja tabla). Formiranje HMW agregata bilo je izraženije na pH 6.5 i pH 7.0 nego na pH 8.3. Većina FGF-21 varijanti ispoljila je smanjeno formiranje HMW agregata u odnosu na Pegilovano jedinjenje 1, mada je za nekoliko jedinjenja formiranje HMW agregata bilo slično ili više nego za Jedinjenje 1,

SL. 7. Merenje sklonosti ka deamidaciji (na šta ukazuje formiranje kiselih varijanti tokom vremena) za modifikovane FGF-21 polipeptide na pH 6.5 u saharoza/histidin puferu (gornja tabla), pH 7.0 u saharoza/histidin puferu (srednja tabla), i pH 8.3 saharoza/TRIS puferu (donja tabla). U poređenju sa Pegilovanim jedinjenjem 1, sva prikazana jedinjenja ispoljila su smanjeno formiranje varijanti sa kiselim nabojem, što ukazuje na smanjenje deamidacije.

SL. 8. Merenje rastvorljivosti za modifikovane FGF-21 polipeptide. Relativno niže formiranje agregata sa visokom molekulskom težinom pri datoj koncentraciji polipeptida ukazuje na veću rastvorljivost, koja bi rezultovala sposobnošću formulisanja u većoj koncentraciji. Opservacije koncentracije proteina prema procentnoj frakciji vrsta visoke molekulske mase (HMW) testiranih jedinjenja određene testom filtracije protičnog čepa u PBS puferu na pH 7.2. Linearizovani nagib linije koji odgovara svakoj od ovih opservacija upotrebljen je kao procena skolonosti proteina ka agregaciji.

SL. 9. Procenat donora sa proliferativnim odgovorom CD4+ T ćelija posle 7 dana inkubacije proteina i mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC). Kontrolni proteini su proteini eksprimirani u E. coli za koje je poznato da imaju osobine aktiviranja T ćelija. Upoređivanje nepegilisanih modifikovanih FGF-21 jedinjenja sa Jedinjenjem 1 (koje ima divlji tip FGF-21 sekvence osim što je uključen N-terminalni metionin za ekspresiju u E. coli). "ConA" je skraćenica za Konkanavalin A, poznati imunogeni protein.

SL. 10. Farmakokinetička analiza Pegilovanog jedinjenja 1 i Pegilovanog jedinjenja 2 posle jedne S.C. administracije 0.05 mg/kg ob/ob miševima. Nivoi modifikovanih FGF-21 jedinjenja mereni su kao ukupni i kao C-terminalno intaktni (aktivni) polipeptidi. Pegilovano jedinjenje 2 ispoljilo je znatno veću ukupnu AUC za C-terminalno intaktnu formu nego Pegilovano jedinjenje 1, što ukazuje na umnogome smanjenu in vivo proteolizu Pegilovanog jedinjenja 2. Rezultati su prikazani grafički na gornjoj tabli, a farmakokinetički parametri su prikazani tabelarno na donjoj levoj tabli (Pegilovano jedinjenje 1) i donjoj desnoj tabli (Pegilovano jedinjenje 2).

SL. 11A-B. Farmakokinetička analiza Pegilovanog jedinjenja 1 i Pegilovanog jedinjenja 2 posle administracije kod majmuna cinomolgusa. Nivoi modifikovanih FGF-21 jedinjenja mereni su kao (A) ukupni i (B) C-terminalno intaktni (aktivni) polipeptidi. Pegilovano jedinjenje 2 ispoljilo je znatno veću ukupnu AUC za C-terminalno intaktnu formu nego Pegilovano jedinjenje 1, što ukazuje na umnogome smanjenu in vivo proteolizu Pegilovanog jedinjenja 2.

SL. 12. Promena u glikozilovanom hemoglobinu (HbA1c) u odnosu na transporter na Dan 21 u studiji ponavljanog doziranja na ob/ob miševima.

SL. 13. Telesna težina tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima. SL. 14. Procenat promene telesne težine tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima.

SL. 15. Koncentracije insulina u plazmi tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima.

SL. 16. Koncentracije glukoze u plazmi tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima.

SL. 17. Promene AUC za koncentracije glukoze u plazmi tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima, izražene kao procentna razlika u odnosu na kontrole tretirane transporterom.

SL. 18. Koncentracije triglicerida u plazmi tokom 21-dnevne studije ponavljanog doziranja na ob/ob miševima.

SL. 19. Promene telesne težine u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 20. Ukupna konzumacija hrane u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 21. Telesna težina u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 22. Težina jetre u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 23. Odnos težine jetre prema telesnoj težini u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. SL. 24. Glukoza u celoj krvi u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 25. ALT u plazmi u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 26. Trigliceridi u plazmi u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 27. Ukupni holesterol u plazmi u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 28. Trigliceridi u jetri u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 29. Holesterol u jetri u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 30A-B. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih HE u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 31. Skor aktivnosti NAFLD u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 32A. Skor steatoze u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 32B. Skor lobusnog zapaljenja u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 32C. Skor "baloniranja" hepatocita u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 33A-B. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih Sirijus-crvenim u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 34. Oblast fibroze u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 35A-B. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre imunoobojenih na F4/80 u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 36 Oblast zapaljenja u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 37A-B. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih bojom Oil red u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 38. Oblast depoa masti u studiji na mišjem Stelic modelu NASH.

SL. 39A-D. Relativna genska ekspresija u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. Rezultati ekspresije za (A) Alfa-SMA, (B), TIMP-1, (C) Kolagen tipa 1, i (D) TGF-β. SL. 40A-D. Primeri modifikovanih FGF-21 polipeptidnih sekvenci fuzionisanih sa Fc domenom, PKE adnektinom ili albuminskim polipeptidom iz humanog seruma. "Fuzioni aranžman" opisuje opštu orijentaciju fuzionog proteina, od N- do C-terminusa, što treba da ilustruje, ali ne i da ograniči, odgovarajuću polipeptidnu sekvencu. HuSA(C34A): modifikovani humani serumski albumin koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:321); HuSA(C34A; des Leu-585): modifikovani humani serumski albumin koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:322; PKE(1): PKE adnektin koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:319; PKE(2): PKE adnektin koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:320. L praćeno brojem označava linker; FGF-21(Cmp. 2) označava FGF-21 sekvencu koja sadrži unutrašnju deleciju i zamenski peptid (specifično, Jedinjenje 2) i FGF-21 (Cmp. 1) označava FGF-21 sekvencu koja nema pomenutu deleciju i zamenski peptid (specifično, Jedinjenje 1). FGF-21(Cmp. 1) i FGF-21(Cmp. 2) mogu uključivati ili ne N-terminalni metionin sadržan u Jedinjenjima 1 i 2. Varijantne forme Fc polipeptidnih sekvenci identifikovane su u zagradi, npr., Fc(hIgG1a_191). Napomene FGF-21-1aa(Cmp. 2) i FGF-21-3aa(Cmp. 2) odnose se na sekvencu Jedinjenja 2 modifikovanu delecijom navedenog broja aminokiselina (1, odnosno 3) sa njenog C-terminusa.

SL. 41. Merenje rastvorljivosti modifikovanih FGF-21 polipeptida fuzionisanih sa adnektinskim fuzionim partnerom. Relativno niže formiranje agregata visoke molekulske mase pri datoj koncentraciji polipeptida ukazuje na veću rastvorljivost, što bi rezultovalo sposobnošću formulisanja u višoj koncentraciji. Opservacije koncentracije proteina u odnosu na procentnu frakciju vrsta visoke molekulske mase (HMW) testiranih jedinjenja određene testom filtracije protočnog čepa u PBS puferu na pH 7.2. Linearizovani nagib linije koji odgovara svakom od ovih zapažanja upotrebljen je kao procena skolonosti prteina ka agregaciji.

SL. 42A-B. Telesna težina u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem ("PEG-Jedinj.") 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 43A-B. Težina jetre u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Težina jetre bila je značajno smanjena (p<0.001) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-15.

SL. 44A-B. Odnos težine jetre prema telesnoj težini u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Odnos težine jetre prema telesnoj težini bio je značajno smanjen (p<0.01 i p<0.001) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 ili nedelja 9-15.

SL. 45A-B. Težina desnog bubrega u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 46A-B. Težina levog bubrega u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 47A-B. Glukoza u celoj krvi u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Glukoza u celoj krvi bila je značajno smanjena (p<0.05) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-15.

SL. 48A-B. ALT u plazmi u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. ALT u plazmi bila je značajno snižena (p<0.01) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-15.

SL. 49A-B. Trigliceridi u plazmi u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 50A-B. Ukupni holesterol u plazmi u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 51A-B. Trigliceridi u jetri u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Trigliceridi u jetri bili su značajno smanjeni (p<0.01, odnosno p<0.001) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 ili nedelja 9-15.

SL. 52A-B. Holesterol u jetri u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Holesterol u jetri bio je značajno smanjen (p<0.01, odnosno p<0.001) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 ili nedelja 9-15.

SL. 53A-H. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih HE miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 transporterom (A-B) ili PEG-Jedinjenjem 1 (C-D), i tokom nedelja 9-15 transporterom (E-F) ili PEG-Jedinjenjem 1 (G-H).

SL. 54A-B. Skor aktivnosti NAFLD u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Skor aktivnosti NAFLD bio je značajno smanjen (p<0.01, odnosno p<0.001) kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 ili nedelja 9-15.

SL. 55A-H. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih Sirijus-crvenim miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 transporterom (A-B) ili PEG-Jedinjenjem 1 (C-D), i tokom nedelja 9-15 transporterom (E-F) ili PEG-Jedinjenjem 1 (G-H).

SL. 56A-B. Zbirni prikaz područja fibroze jetre u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Područje fibroze bilo je značajno smanjeno (p<0.05) kod miševa tretiranih PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 57A-H. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre imunoobojenih na F4/80 miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 transporterom (A-B) ili PEG-Jedinjenjem 1 (C-D), i tokom nedelja 9-15 transporterom (E-F) ili PEG-Jedinjenjem 1 (G-H).

SL. 58A-B. Zbirni prikaz područja zapaljenja u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15.

SL. 59A-H. Reprezentativne fotomikrografije preseka jetre obojenih bojom Oil red miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 transporterom (A-B) ili PEG-Jedinjenjem 1 (C-D), i tokom nedelja 9-15 trensporterom (E-F) ili PEG-Jedinjenjem 1 (G-H).

SL. 60A-B. Zbirni prikaz područja depoa masti u grupama tretmana u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. A. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-12. B. Upoređivanje miševa tretiranih transporterom ili PEG-Jedinjenjem 1 tokom nedelja 9-15. Područje depoa masti bilo je značajno smanjeno kod miševa tretiranih tokom nedelja 9-12 ili nedelja 9-15 (za obe grupe p<0.001).

SL. 61. Merenja ukupnog adiponektina u serumu u studiji u mišjem Stelic modelu NASH. Ukupni adiponektin u serumu bio je značajno povećan kod miševa tretiranih PEG-Jedinjenjem 1 u dozi od 3.0 mg/kg, u poređenju sa miševima koji su bili tretirani transporterom, u završnim uzorcima plazme miševa tretiranih između nedelja 5-9 ili nedelja 7-9 (p<0.001, Dunnett-ov TTEST).

SL. 62. Merenja ukupnog adiponektina u serumu u studiji u mišjem Stelic modelu NASH. Ukupni adiponektin u serumu bio je značajno povećan kod miševa tretiranih PEG-Jedinjenjem 1 u dozi od 3.0 mg/kg, u poređenju sa miševima koji su bili tretirani transporterom, u završnim uzorcima plazme miševa po isteku nedelje 12 ili 15 (p<0.05, Dunnett-ov TTEST).

SL. 63. Krive zavisne od koncentracije za tri FGF21 varijante: N-terminalno His-obeleženo Jedinjenje 1 (His-Jedinj.1), PEG-Jedinjenje 1 (PEG-Jedinj. 1) i PEG-Jedinjenje 2 (PEG-Jedinj. 2) u 5 h Elk1-luciferaznom testu. Vrednosti su iz 6 nezavisnih eksperimenata sa 3 ili 4 ponavljanja po eksperimentu. Z' vrednosti varirale su između 0.6 - 0.9 ukazujući na to da je kvalitet testa prihvatljiv (Z' > 0.5).

SL. 64. Potencija FGF-21 varijatni merena u Elk1-luciferaznom testu baziranom na ćelijama. Svaki podatak označava pojedinačnu repliku, a horizontalni bar predstavlja srednju vrednost. Vrednosti su izražene kao logaritam sa osnovom 10 merenja vrednosti EC50u molovima.

SL. 65. Efekat jedne, akutne doze PEG-Jedinjenja 2 na procenat promene telesne težine C57BL/6J miševa. C57BL/6J miševi tretirani su transporterom (250 mM saharoza/20 mM Tris, pH 8.3), ili PEG-Jedinjenjem 2 u dozi od 0.03, 0.1, 0.3, ili 1.0 mg/kg, n=10/grupi. Određivana je procentna promena telesnih težina C57BL/6J miševa u početnom stanju (0), 24, 48, 72 i 144 h posle SC doze. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001 u odnosu na transporter, (jednofaktorska ANOVA praćena Dunnett-ovim testom).

SL. 66A. Efekat jedne, akutne doze PEG-Jedinjenja 2 na ukupni adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Određivana je koncentracija ukupnog adiponektina u plazmi u početnom stanju (0), 24, 48, 72, i 144 h posle SC doze. C57BL/6J miševi koji nisu gladovali tretirani su transporterom (250 mM saharoza/20 mM Tris, pH 8.3), ili PEG-Jedinjenjem 2 u dozi od 0.03, 0.1, 0.3, ili 1.0 mg/kg, n=10/grupi. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM **P<0.01, ***P<0.001, **** P<0.0001 u odnosu na transporter, (jednofaktorska ANOVA praćena Dunnett-ovim testom).

SL. 66B. Efekat jedne, akutne doze PEG-Jedinjenja 2 na procentnu promenu ukupnog adiponektina u plazmi C57BL/6J miševa. C57BL/6J miševi tretirani su transporterom (250 mM saharoza/20 mM Tris, pH 8.3), ili PEG-Jedinjenjem 2 u dozi od 0.03, 0.1, 0.3, ili 1.0 mg/kg, n=10/grupi. Određivana je koncentracija ukupnog adiponektina u plazmi u početnom stanju, 24, 48, 72, i 144 h posle SC doze, i određivana je procentna promena u odnosu na početnu vrednost. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM **P<0.01, ***P<0.001, **** P<0.0001 u odnosu na transporter, (jednofaktorska ANOVA praćena Dunnett-ovim testom).

SL. 67A. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Tretmani i PEG-Jedinjenjem 2 i PEG-Jedinjenjem 20 rezultovali su značajnim povećanjem ukupnog adiponektina u plazmi 6 dana posle doza od 0.3 i 1 mpk (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

SL. 67B. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Doze od 54.3 nmol/kg PEG-Jedinjenja 2, Jedinjenja 105, i Jedinjenja 112 značajno povećavaju procentnu promenu ukupnog adiponektina u poređenju sa procentnom promenom ukupnog adiponektina kontrola tretiranih prenosnikom, na Dane 3 i 6.

SL. 67C. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Doze od 18.1 i 54.3 nmol/kg Jedinjenja 182 značajno povećavaju procentnu promenu ukupnog adiponektina u plazmi (u poređenju sa procentnom promenom zapaženom za kontrole sa transporterom) na Dane 3 i 6.

SL. 67D. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Jedinjenje 171 i Jedinjenje 181 značajno su povećala procentnu promenu ukupnog adiponektina u plazmi u odnosu na početnu vrednost, na Dane 3 i 6 posle doziranja, na dozno-zavisan način, u poređenju sa kontrolom tretiranom transporterom.

SL. 67E. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Procentna promena ukupnog adiponektina u plazmi u odnosu na početnu vrednost (u poređenju sa transporterom) bila je značajno povećana Jedinjenjem 170 na Dane 3 i 6 u dozama od 18.1 nmol/kg i 54.3 nmol/kg.

SL. 67F. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u plazmi C57BL/6J miševa. Doza od 10 mg/kg PEG-Jedinjenja 1 značajno je povećala procentnu promenu ukupnog adiponektina u plazmi u odnosu na početnu vrednost u poređenju sa kontrolama tretiranim transporterom na Dane 3 i 6.

SL. 68. Efekti PEG-Jedinjenja 2 na albuminuriju (urin ACR). # P < 0.05, bolesni (unix db/db, transporter, n = 9-10) u odnosu na normalne (db/m mršavi, n = 10-12). * P < 0.05, PEG-Jedinjenje 2 (n = 13-14) u odnosu na Transporter. ANOVA sa Dunnett-ovim posthoc testom za svaki par u pojedinačnim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± S.E.M.

SL. 69. Sadržaj hidroksiprolina (HP) u srcu pokazan je posle 3 nedelje tretmana izoproterenolom i PEG-Jedinjenjem 2. Svaki podatak predstavlja sadržaj HP u celom srcu za pojedinačnog miša, normalizovan u odnosu na protein. *: P < 0.05, u odnosu na lažno tretirane Transporter, **: P < 0.05, u odnosu na Izo Transporter (jednofaktorska ANOVA praćena Bonferroni-jevim testom).

SL. 70A-C. Efekti FGF-21 varijanti na ukupan adiponektin u serumu (SL. 70A), adiponektina visoke molekulske mase (HMW) u serumu (SL. 70B), i odnos HMW adiponektina prema ukupnom adiponektinu (SL. 70C) u studiji na mišjem Stelic modelu NASH. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM.

SL. 71A-B. Težina jetre (SL. 71A) i odnos težine jetre prema telesnoj težini (BW) (SL.

71B) u životinjskom modelu NASH.

SL. 72. Efekti FGF-21 varijanti u životinjskom modelu NASH. Posle tretmana PEGilovanim jedinjenjem 1 ("PEG-Jedinj.1"), PEGilovanim jedinjenjem 2 ("PEG-Jedinj.

2") ili Jedinjenjem 170 ("Jedinj.170"), životinje su procenjivane u pogledu telesne težine (SL. 72A), težine jetre (SL. 72B), odnosa težine jetre prema telesnoj težini (SL. 72C), triglicerida u jetri (SL. 72D), ALT u plazmi (SL. 72E), holesterola u jetri (SL. 72F), i triglicerida u plazmi (SL.72G). Statistički značajne razlike u odnosu na kontrole tretirane transporterom su kako je prikazano. n.s.: nije detektovana statistička značajnost (tj., P≥0.05).

DETALJAN OPIS DEFINICIJE

[0032] Kako se koriste u ovom tekstu i priloženim patentnim zahtevima, izrazi u jednini uključuju i te izraze u množini ukoliko kontekstom jasno nije naznačeno drugačije. Prema tome, na primer, upućivanje na "FGF-21,""FGF-21 polipeptid," ili "modifikovani FGF-21 polipeptid" je upućivanje na jedan ili više takvih proteina i obuhvata njihove ekvivalente poznate prosečno obučenom stručnjaku u oblasti, i tako dalje.

[0033] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni izrazi imaju značenje koje bi uobičajeno razumeo prosečno obučen stručnjak u oblasti kojoj pronalazak pripada.

[0034] Normoglikemija: U predmetnoj objavi, izrazi normoglikemija ili euglikemija odnose se na stanje prisustva normalne koncentracije glukoze u krvi. Primer normalne koncentracije glukoze u krvi kod ljudi je između 70 mg/dl i 99 mg/dl kod gladnih adulta, i između 70 mg/dl i 140 mg/dl kod adulta posle obroka. Trajna normoglikemija odnosi se na održavanje normoglikemije tokom dugog vremenskog perioda, npr., najmanje jedan dan, najmanje dva dana, najmanje nedelju dana, najmanje dve nedelje, najmanje mesec dana, ili duže, na primer tokom trajanja tretmana modifikovanim FGF-21 polipeptidima ove objave.

[0035] Izraz "komponenta koja produžava poluživot" (ovde označena i kao "HLEM") odnosi se na farmaceutski prihvatljivu grupu, domen, ili molekul kovalentno povezan ("konjugovan" ili "fuzionisan") sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom opisanim ovde, opciono preko neprirodno kodirane aminokiseline, direktno ili preko linkera, koji sprečava ili ublažava in vivo proteolitičku degradaciju ili drugu hemijsku modifikaciju koja smanjuje aktivnost modifikovanog FGF-21 polipeptida, povećava poluživot, i/ili poboljšava ili menja druge farmakokinetičke ili biofizičke osobine uključujući, ali ne ograničavajući se na povećanje stope apsorpcije, smanjenje toksičnosti, poboljšanje rastvorljivosti, smanjenje agregacije proteina, povećanje biološke aktivnosti i/ili ciljne selektivnosti modifikovanog FGF-21 polipeptida, povećanje proizvodljivosti, i/ili smanjenje imunogenosti modifikovanog FGF-21 polipeptida, u poređenju sa komparatorskim jedinjenjem kao što je nekonjugovana forma modifikovanog FGF-21 polipeptida ili divlji tip FGF-21 polipeptida. Izraz "komponenta koja produžava poluživot" uključuje neproteinske komponente koje produžavaju poluživot, kao što su polimer rastvorljiv u vodi kao polietilen glikol (PEG) zasebni PEG, hidroksietil skrob (HES), lipid, granata ili negranata acil grupa, granata ili negranata C8-C30 acil grupa, granata ili negranata alkil grupa, i granata ili negranata C8-C30 alkil grupa; i proteinske komponente koje produžavaju poluživot, kao što su serumski albumin, transferin, adnektini (npr., albumin-vezujući ili adnektini koji produžavaju farmakokinetiku (PKE)), Fc domen, i nestrukturirani polipeptid, kao XTEN i PAS polipeptid (npr. konformaciono neuređene polipeptidne sekvence sastavljene od aminokiselina Pro, Ala, i/ili Ser), i fragment bilo kojeg od gore navedenog. Ispitivanje kristalne strukture FGF-21 ili člana(-ova) porodice FGF i njegove interakcije sa FGF receptorom, može ukazati na to koje određene aminokiselinske rezidue imaju bočne lance kojima rastvarač potpuno ili delimično može pristupiti. Bočni lanac neprirodno kodirane aminokiseline na ovim pozicijama može biti uperen sa površine proteina i upolje ka rastvaraču i tako biti povezan sa, npr., polimerom rastvorljivim u vodi.

[0036] Izraz "albumin-vezujuća komponenta" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koju hemijsku grupu sposobnu da se veže za albumin, tj. koja ima afinitet za vezivanje sa albuminom, na primer, albumin-vezujući ili PKE adnektin.

[0037] "Afinitet za vezivanje sa albuminom" može se odrediti korišćenjem nekoliko postupaka poznatih u struci. U jednom postupku, jedinjenje koje se meri radioaktivno se obeleži npr. pomoću 1251 ili 3H i inkubira sa imobilisanim albuminom (Kurtzhals et.al., Biochem.J., 312, 725-731 (1995)). Izračunava se vezivanje jedinjenja u poređenju sa standardom. U drugom postupku, srodno jedinjenje se radioaktivno obeleži i sa njegovim vezivanjem za albumin imobilisan na npr. SPA perlicama (perlice za test blizine scintilacije, PerkinElmer kat. br. RPNQ0001) kompetira niz razblaženja jedinjenja za koje se vrši merenje. EC50 vrednost za kompeticiju predstavlja meru afiniteta jedinjenja. U trećem postupku, afinitet ili potencija jedinjenja meri se pri različitim koncentracijama albumina, i pomak relativnog afiniteta ili potencije jedinjenja u funkciji koncentracije albumina odražava njegov afinitet prema albuminu.

[0038] Izraz "termička stabilnost" odnosi se na sposobnost polipeptida da se odupre razmotavanju prilikom zagrevanja. Uopšteno, što je veća termička stabilnost molekula, viša je temperatura koja je potrebna da se polipeptid razmota. Primeri postupaka određivanja termičke stabilnosti polipeptida su postupci diferencijalno skenirajuće kalorimetrija (DSC) i termički skenirajuće fluorescencije opisani ovde u Primeru 6. Termička stabilnost može se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima povećanu termičku stabilnost.

[0039] Izraz "agregacija" odnosi se na tendenciju polipeptida da formira nekovalentno povezane komplekse sa drugim molekulima (kao što su drugi molekuli istog polipeptida) formirajući time komplekse velike molekulske mase. Primeri postupaka merenja formiranja agregata uključuju analitičku hromatografiju zasnovanu na veličini čestica, kako je ovde opisano u Primeru 7. Relativne količine agregacije mogu se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima smanjenu agregaciju.

[0040] Izraz "deamidacija" odnosi se na tendenciju aminokiselinskih rezidua u polipeptidu da spontano podlegnu reakciji deamidacije, čime se menja hemijska struktura aminokiseline i potencijalno utiče na funkciju polipeptida. Primeri postupaka merenja deamidacije uključuju kapilarno izoelektrično fokusiranje sa dobijanjem slike (icIEF) kako je ovde opisano u Primeru 7. Relativna količina deamidacije može se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima smanjenu deamidaciju.

[0041] Izraz "in vivo proteoliza" odnosi se na sečenje polipeptida kada se uvede u živi sistem (npr., kada se injektira u organizam) koje može biti rezultat proteaza koje se sreću u pomenutom organizmu. Proteoliza potencijalno može uticati na biološku aktivnost ili poluživot polipeptida. Na primer, divlji tip FGF-21 može biti podvrgnut sečenju na C-terminusu, što za rezultat ima skraćeni, neaktivni polipeptid. Primer postupka za merenje in vivo proteolize FGF-21 je elektrohemijsko-luminescentni imunotest (ECLIA) baziran na Meso Scale Discovery (MSD) platformi, opisan ovde u Primeru 10. Relativna količina in vivo proteolize može se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima smanjenu in vivo proteolizu.

[0042] Izraz "rastvorljivost" odnosi se na količinu supstance koja može da se rastvori u drugoj supstanci, npr., količinu nemodifikovanog ili modikovanog FGF-21 polipeptida koja može da se rastvori u vodenom rastvoru. Primer postupka za merenje rastvorljivosti nemodifikovanog ili modikovanog FGF-21 polipeptida je test rastvorljivosti protočnog čepa opisan ovde u Primeru 8. Relativna rastvorljivost može se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima povećanu rastvorljivost.

[0043] Izraz "biološka aktivnost" odnosi se na sposobnost molekula da utiče na neko fizičko ili biohemijsko svojstvo biološkog sistema, puta, molekula, ili interakciju u vezi sa organizmom, uključujući, ali ne ograničavajući se na viruse, bakterije, bakterofag, transpozon, prion, insekte, gljive, biljke, živtinje i ljude. Na primer, u kontekstu nemodifikovanog ili modikovanog FGF-21, biološka aktivnost uključuje bilo koju od funkcija koju obavlja FGF-21, kako je ovde opisano. Primeri postupaka za određivanje da li molekul poseduje najmanje jednu biološku aktivnost divljeg tipa FGF-21 (kao što je divlji tip FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO: 1) mogu uključivati in vitro test opisan u Primeru 5 ili in vitro test opisan u Primeru 17. Relativni nivo biološke aktivnosti može se odrediti u odnosu na komparatorsko jedinjenje, npr., da bi se identifikovao polipeptid koji ima biološku aktivnost ili koji ima dovoljno visoku biološku aktivnost za terapijsku upotrebu kojoj je namenjen, npr., koji ima EC50 manje od 5-struko, 10-struko, manje od 20-struko, manje od 50-strulo, ili manje od 100-struko višu od EC50 komparatora.

[0044] Ovde opisano komparatorsko jedinjenje može biti druga sekvenca koja nema modifikaciju, kao što je ovde opisana modifikacija. Na primer, komparatorsko jedinjenje može biti ista modifikovana FGF-21 polipeptidna sekvenca bez interne delecije, bez zamenskog peptida, ili bez fuzionog partnera. Primeri komparatorskih jedinjenja uključuju, bez ograničavanja, divlji tip FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO:1, modifikovani FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO:201, ili drugo komparatorsko jedinjenja. U nekim tehničkim rešenjima, komparatorsko jedinjenje može sadržati najmanje jednu neprirodno kodiranu aminokiselinu koja može biti povezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, peptidom, polipeptidom, ili komponentom za produžavanje poluživota opisanom ovde (npr. PEG). U nekim tehničkim rešenjima, komparatorsko jedinjenje može sadržati najmanje jednu neprirodno kodiranu aminokiselinu koja može biti nepovezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, peptidom, polipeptidom, ili komponentom za produžavanje poluživota opisanom ovde (npr. PEG). U nekim tehničkim rešenjima, komparatorsko jedinjenje može sadržati dodatne aminokiselinske supstitucije, delecije, i/ili insercije. U nekim tehničkim rešenjima, poređenje se može vršiti sa pegilisanom ili nepegilisanom formom polipeptida; u prvom slučaju, poređenje se može vršiti sa polipeptidom koji uključuje ili ne uključuje neprirodno kodiranu aminokiselinu. U nekim tehničkim rešenjima, komparatorsko jedinjenje može sadržati internu deleciju koja je opciono zamenjena peptidom (npr., ista interna delecija i zamenski peptid u jedinjenju sa kojim se komparator upoređuje), ali bez fuzionog partnera.

[0045] Izraz "Fc," "Fc domen," ili "Fc region" odnosi se na Fc domen ili njegov fragment. Fc može biti nativan Fc region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu identičnu sa aminokiselinskom sekvencom Fc regiona nađenog u prirodi, ili varijantni Fc region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one nativnog Fc regiona po najmanje jednoj aminokiselini. U nekim tehničkim rešenjima, Fc ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa nativnim Fc regionom ili Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr., od oko jedne do oko dvadeset, od oko jedne do oko deset, ili od oko jedne do oko pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija u nativnom Fc regionu ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Fc region ovde može imati najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencione identičnosti sa nativnim Fc regionom i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, Fc region može imati najmanje oko 90% sekvencione identičnosti sa nativnim Fc regionom i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, Fc region može imati najmanje oko 95% sekvencione identičnosti sa nativnim Fc regionom i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida. Primeri aminokiselinskih sekvenci Fc regiona uključuju SEQ ID NO: 302 i 323-335. Primeri domena ili fragmenata Fc regiona uključuju polipeptide sa SEQ ID NO:303-309.

[0046] Kako se ovde koristi, "funkcionalni Fc region" odnosi se na Fc domen ili njegov fragment koji zadržava sposobnost da se veže za FcRn.

[0047] Izraz "odgovarajući" odnosi se na poziciju ("pozicija koja odgovara" ili "odgovarajuća pozicija") ili region ("region koji odgovara" ili "odgovarajući region") unutar polipeptidne ili polinukleotidne sekvence koja se identifikuje upoređivanjem sa referentnom sekvencom. Referentna sekvenca može biti divlji tip ili nemodifikovana sekvenca, kao što je divlji tip FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO:1. Odgovarajuća pozicija ili region može se identifikovati poravnavanjem sekvence sa referentnom sekvencom. Na primer, "pozicija koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO:1" u sekvenci odnosi se na poziciju u sekvenci koja je u istoj koloni poravnavanja kao aminokiselina 108 u SEQ ID NO:1 kada se ta sekvenca poravna sa SEQ ID NO:1. U poravnavanju, aminokiselina ili nukleotid može, ali se ne mora poklapati sa aminokiselinom ili nukleotidom na odgovarajućoj poziciji u referentnoj sekvenci. Kada se poziva na deleciju odgovarajućeg regiona, poravnavanje može sadržati procepe u kolonama poravnavanja koji odgovaraju svakoj poziciji unutar deletovanog regiona, osim ako je deletovani region bio zamenjen zamenskim peptidom koji se potencijalno može poravnati sa delom deletovanog regiona. Prema tome, za deleciju nadoknađenu zamenskim peptidom, zamenski peptid se može izostaviti iz sekvence prilikom poravnavanja, tako da bi poravnavanje trebalo da sadrži procepe u deletovanom regionu. Alternativno, zamenski peptid, ako je prisutan, može da se zanemari kada se identifikuje odgovarajući region.

[0048] Poravnavanje upotrebljeno za identifikovanje odgovarajuće pozicije ili odgovarajućeg regiona može se dobiti korišćenjem konvencionalnog algoritma poravnavanja kao što je Blast (Altschul i sarad., J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3):403-10), Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol.1981 Mar 25;147(1):195-7), ili Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53). Needleman-Wunsch-ov algoritam može da se koristi da bi se dobilo globalno poravnavanje sa najvišom ocenom (tj., poravnavanje koje sadrži svaku reziduu u obe sekvence, mada poravnavanje može početi i/ili završiti se u procepima). Bez obzira na to da li se koristi Blast, Smith-Waterman, ili Needleman-Wunsch, poravnavanje sa najvišom ocenom može se identifikovati korišćenjem "uobičajenih" parametara, kao što je upotreba BLOSUM62 matrice za ocenjivanje, kazne za otvoreni procep 11, i kazne za produženje procepa 1, i (kada se koristi Blast za poravnavanje u paru) veličina reči 3.

[0049] "Region" se odnosi na neprekinuti deo polipeptidne ili polinukleotidne sekvence. Region se može identifikovati na osnovu dve pozicije u polipeptidu ili polinukleotidu, koje naznačavaju početnu i završnu pozicuju regiona u sekvenci. Ukoliko nije drugačije navedeno, region uključuje pozicije koje definišu region unutar referentne sekvence, tj., uključuje datu početnu i završnu poziciju. Na primer, region 119-130 SEQ ID NO:1 odnosi se na deo SEQ ID NO:1 koji počinje aminokiselinom 119 i završava se aminokiselinom 130, uključujući aminokiseline 119 i 130, koji ima sekvencu PGNKSPHRDPAP (SEQ ID NO:73).

[0050] Izraz "delecija" odnosi se na uklanjanje jedne ili više (ili naznačenog broja) kontinuiranih aminokiselina ili nukleotida iz polipeptida ili polinukleotida. "Interna delecija" označava deleciju koja ne uključuje N- ili C-terminus polipeptida ili 5' ili 3' kraj polinukleotida. Delecija ili interna delecija može se identifikovati navođenjem početne i završne pozicije delecije u odnosu na referentnu sekvencu. U vezi sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom, pominjanjem interne delecije obično se opisuje delecija regiona u odnosu na referentni FGF-21 polipeptid, kao što je delecija regiona koji odgovara pozicijama divljeg tipa FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO: 1, na primer, aminokiselinskim pozicijama 119-130 u SEQ ID NO:1 (tj., PGNKSPHRDPAP (SEQ ID NO:73)).

[0051] "Zamenski peptid" odnosi se na aminokiseline koje se insertuju na mesto interne delecije ili druge delecije u polipeptidu. Dužina zamenskog peptida može se razlikovati od dužine interne delecije. Primeri zamenskih peptida mogu uključivati jednu ili više glicinskih, serinskih, i histidinskih rezidua i u nekim slučajevima, dodatne aminokiselinske rezidue kao što su lizin i prolin. Međutim, treba razumeti da zamenski peptid nije ograničen na sekvence koje sadrže ove određene aminokiseline nego može uključivati bilo koju prirodnu aminokiselinu ili neprirodno kodiranu aminokiselinu. Zamenski peptid može biti bilo koje dužine, npr., jedna aminokiselina (tj., imati dužinu od 1 aminokiseline), dve ili više aminokiselina, ili tri ili više aminokiselina. Zamenski peptid koji ima dužinu nula aminokiselina ukazuje na to da zamenski peptid nije prisutan. U nekim tehničkim rešenjima, zamenski polipeptid može biti dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, zamenski polipeptid može biti dug 1-10, 1-7, 1-5, ili 1-3 aminokiseline. U nekim tehničkim rešenjima, zamenski polipeptid može biti dug 2-7, 2-5 ili 2-3 aminokiseline. U nekim tehničkim rešenjima, zamenski polipeptid može biti dug 3 aminokiseline. Primeri zamenskih peptida uključuju sekvence G, GG, SG, GSG, GGH, SGG, GSGH (SEQ ID NO:343), HSG, HHSG (SEQ ID NO:344), HGSH (SEQ ID NO:345), GSGP (SEQ ID NO:346), HGG, HSGG (SEQ ID NO:347), i HGSG (SEQ ID NO:348). Dodatni primeri zamenskih peptida uključuju sekvence K, DKS, HKS, D, Q, KDS, i KDSQ (SEQ ID NO:349).

[0052] "Fuzioni partner" označava peptid ili polipeptid fuzionisan sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom opisanim ovde. Fuzioni partner može biti fuzionisan sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom na N- i/ili C-terminusu. Primeri fuzionih partnera uključuju, ali se ne ograničavaju na albumin, transferin, adnektine (npr., albumin-vezujući adnektin ili adnektin koji produžava farmakokinetiku (PKE)), Fc domen, i nestrukturirane polipeptide kao što su XTEN i PAS polipeptid (npr. konformaciono neuređene polipeptidne sekvence sastavljene od aminokiselina Pro, Ala, i/ili Ser), ili fragment bilo kojeg od napred navedenog. Fuzioni partner može biti fuzionisan sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom u bilo koju svrhu, uključujući, ali ne ograničavajući se na prečišćavanje, proizvodljivost, produženje poluživota, poboljšanje biofizičkih svojstava (npr. rastvorljivost ili stabilnost), smanjenje imunogenosti ili toksičnosti, itd.

[0053] "Povezujući peptid" odnosi se na aminokiselinsku sekvencu koja ima i N- i C-terminus fuzionisan sa drugim peptidima ili polipeptidima. Povezujući peptid može biti prisutan u fuzionom proteinu, npr., imati svoje terminuse fuzionisane (bilo kojim redosledom) sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom i fuzionim partnerom. Primeri povezujućih peptida mogu uključivati između 0 aminokiselina (tj., povezujući peptid nije prisutan) i 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, ili 100 aminokiselina, ili više. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može uključivati između 1 i 40, između 1 i 30, između 1 i 20, između 1 i 10, između 1 i 5, između 2 i 40, između 2 i 30, između 2 i 20, između 2 i 10, između 5 i 40, između 5 i 30, između 5 i 20, ili između 5 i 10 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može uključivati između 5 i 20 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može uključivati između 10 i 20 aminokiselina. Određeni primeri povezujućih peptida opisanih ovde mogu biti bogati serinskim i glicinskim reziduama, međutim, treba razumeti da povezujući peptid nije ograničen na takve sekvence. Primeri povezujućih peptida uključuju sledeće sekvence: GAGGGGSG (SEQ ID NO:74), EPKSSD (SEQ ID NO:75), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO:76), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO:77), GQPDEPGGS (SEQ ID NO:78), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO:79), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO:80), GSGSG (SEQ ID NO:81), GSGC (SEQ ID NO:82), AGGGGSG (SEQ ID NO:83), GSGS (SEQ ID NO:84), QPDEPGGS (SEQ ID NO:85), GSGSGS (SEQ ID NO:86), TVAAPS (SEQ ID NO:87), KAGGGGSG (SEQ ID NO:88), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO:89), KQPDEPGGS (SEQ ID NO:90), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO:91), KTVAAPS (SEQ ID NO:92), KAGGGGSGG (SEQ ID NO:93), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO:94), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO:95), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO:96), KTVAAPSG AGGGGSGG (SEQ ID NO:97), AGGGGSG (SEQ ID NO:98), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO:99), QPDEPGGSG (SEQ ID NO:100), TVAAPSG (SEQ ID NO:301), GGGGSGGGSGGGGGSGGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO:350), PSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO:351), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO:352), SSGGGGSGGGSGGGGGS (SEQ ID NO:353), GS (SEQ ID NO: 354), GGGGS (SEQ ID NO: 355), EEEEDEEEED (SEQ ID NO: 356), PSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 357), GSHHHHHHHHGS (SEQ ID NO: 358), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 359), GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 360), GSGSGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 361), PSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEQ ID NO: 362), RGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP (SEQ ID NO: 363), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 364), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 365), PSTPPTPSPSTPPTPSPSPSTPPTPSPSTPPTPSPS (SEQ ID NO: 366), PSPEP (SEQ ID NO: 367), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 368), PSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEPPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 369), PTPEPPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 370), PSPEPGGGSPTPEP (SEQ ID NO: 371), PSPEPEEEDPTPEP (SEQ ID NO: 372), PSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEP (SEQ ID NO: 373), PTPEPPSPEPPTPEPEEEDPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 374), PTPEPPSPEPPTPEPGGGGSPSPEPPTPEPPSPEP (SEQ ID NO: 375), PSPEPTPEPSPEPPTPEPSPEPTPEP (SEQ ID NO: 376), GETGS (SEQ ID NO: 377), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 378), GETGSSGEGT (SEQ ID NO: 379), GETGSSGEGTGSTGS (SEQ ID NO: 380), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 381), GETGSSGEGTGSTGSGAGES (SEQ ID NO: 382), i GETGSSGEGTGSTGSGAGESGTGESGEGGS (SEQ ID NO: 383), tj., SEQ ID NO:74-100, 301, i 350-383.

[0054] Izraz "bolest udružena sa fibrozom" uključuje bolesti, poremećaje i stanja u kojima se može zapaziti pojava fibroze ili za koje se zna ili misli da su udruženi sa fibrozom ili da fibroza doprinosi etiologiji, napredovanju ili simptomima bolesti, ili za koje se zna ili misli da se fibroza javlja sa napredovanjem bolesti. Fibroza može uticati na organe ili tkiva kao što su pankreas, pluća, srce, bubreg, jetra, oči, nervni sistem, kostna srž, limfni čvorovi, endomiokard, ili retroperitoneum. Primeri bolesti udruženih sa fibrozom uključuju, ali se ne ograničavaju na nealkoholni steatohepatitis (NASH), fibrozu jetre, precirozu, cirozu, difuzno parenhimsko oboljenje pluća, cističnu fibrozu, plućnu ili pulmonalnu fibrozu, progresivnu masivnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, injekcionu fibrozu, bubrežnu ili renalnu fibrozu, hroničnu bolest bubrega, dijabetično oboljenje bubrega, fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu, membransku nefropatiju, IgA nefropatiju, mijelofibrozu, srčanu insuficijenciju, metaboličku srčanu insuficijenciju, srčanu fibrozu, kataraktnu fibrozu, kataraktu, ožiljke na oku, pankreasnu fibrozu, fibrozu kože, crevnu fibrozu, crevne strikture, endomiokardijalnu fibrozu, atrijalnu fibrozu, fibrozu medijastinuma, Crohn-ovu bolest, retroperitonealnu fibrozu, keloid, nefrogenu sistemsku fibrozu, sklerodermu, sistemsku sklerozu, artrofibrozu, Peyronie-ov sindrom, Dupuytren-ovu kontrakturu, dijabetičnu nefropatiju, adhezivni kapsulitis, alkoholnu bolest jetre, hepatosteatozu, virusni hepatitis, bilijarnu bolest, primarnu hemohromatozu, cirozu povezanu sa uzimanjem lekova, kriptogenu cirozu, Wilson-ovu bolest, i, deficijenciju alfa 1-antitripsina, intersticijalnu bolest pluća (ILD), fibroznu bolest pluća kod ljudi, makularnu degeneraciju, retinalnu retinopatiju, vitrealnu retinopatiju, miokardijalnu fibrozu, Graves-ovu oftalmopatiju, ergotizam indukovan lekovima, kardiovaskularnu bolest, aterosklerozu/restenozu, hipertrofične ožiljke, primarnu ili idiopatsku mijelofibrozu, i zapaljensku bolest creva (uključujući, ali ne ograničavajući se na kolagenski kolitis). U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može uključivati fibrozu jetre, bubrežnu ili renalnu fibrozu, plućnu ili pulmonalnu fibrozu i srčanu ili kardijalnu fibrozu. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti fibroza jetre. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti NASH.

[0055] Fraza "medicinski komplikovna gojaznost" (ponekad označena i kao "morbidna gojaznost") uopšteno se odnosi na stanje podgrupe gojaznih osoba koje imaju i zdravstvene komplikacije vezane ili izazvane gojaznošću. Gojaznost može da se odredi određivanjem indeksa telesne težine (težina u kilogramima podeljena sa kvadratom visine u metrima), pri čemu indeks telesne težine od 30 m/kg<2>ili veći ukazuje na gojaznost. Primeri zdravstvenih komplikacija prisutnih kod medicinski komplikovane gojaznosti mogu uključivati jedno ili više od dijabetesa melitusa tipa 2, hipertenzije, opstruktivne apnee tokom spavanja, koronarne arterijske bolesti i drugih kardiovaskularnih oboljenja (uključujući bolest koronarnih arterija, moždani udar, i kongestivnu srčanu insuficijenciju), i dislipidemije. Dodatne zdravstvene komplikacije koje mogu biti prisutne uključuju nealkoholnu masnu bolest jetre (kao što je steatoza, steatohepatitis, ili ciroza), respiratornu bolest, opstruktivnu apneu tokom spavanja, sindrom gojaznostihipoventilacije, astmu, restriktivnu bolest pluća, kancere, osteoartritis, holelitijazu, gastroezofagealni refluks, ginekološke abnormalnosti, sterilitet, abnormalnu menstruaciju, vensku stazu, probleme sa kožom, intertrigo, celulitis, povećani rizik od komplikacija tokom operacije ili trudnoće, urinarnu inkontinenciju i idiopatsku intrakranijalnu hipertenziju. Medicinski komplikovana gojaznost može biti udružena i sa Prader-Willi-jevim sindromom.

[0056] Izraz "suštinski prečišćen" odnosi se na nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid koji može da suštinski ili esencijalno ne sadrži komponente koje su normalno pridružene ili interaguju sa proteinom kada se on nalazi u svom prirodnom okruženju, tj. nativnoj ćeliji ili ćeliji-domaćinu u slučaju rekombinantno proizvedenih nemodifikovanih ili modifikovanih FGF-21 polipeptida. Nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid koji može da suštinski ne sadrži ćelijski materijal uključuje preparate proteina koji imaju manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, ili manje od oko 1% (suve težine) kontaminirajućeg proteina. Kada se nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid ili njegova varijanta rekombinantno proizvedu u ćelijama-domaćinima, protein može biti prisutan u oko 30%, oko 25%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, ili oko 1% ili manje od suve težine ćelija. Kada se nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid ili njegova varijanta rekombinantno proizvedu u ćelijama-domaćinima, protein može biti prisutan u medijumu kulture u količini od oko 5g/L, oko 4g/L, oko 3g/L, oko 2g/L, oko 1g/L, oko 750mg/L, oko 500mg/L, oko 250mg/L, oko 100mg/L, oko 50mg/L, oko 10mg/L, ili oko 1mg/L ili manje od suve težine ćelija. Prema tome, "suštinski prečišćen" nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid proizveden postupcima predmetne objave može imati nivo čistoće od najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, specifično, nivo čistoće od najmanje oko 75%, 80%, 85%, i još specifičnije, nivo čistoće od najmanje oko 90%, nivo čistoće od najmanje oko 95%, nivo čistoće od najmanje oko 99% ili više kako je određeno odgovarajućim postupcima kao što su SDS/PAGE analiza, RP-HPLC, SEC, i kapilarna elektroforeza.

[0057] "Rekombinantna ćelija-domaćin" ili "ćelija-domaćin" odnosi se na ćeliju koja sadrži egzogeni polinukleotid, bez obzira na postupak upotrebljen za inserciju, na primer, direktno preuzimanje, transdukcija, f-sparivanje ili drugi postupci poznati u struci za pravljenje rekombinantnih ćelija-domaćina. Egzogeni polinukleotid može da se održava kao neintegrisani vektor, na primer, plazmid, ili alternativno, može da se integriše u genom domaćina.

[0058] Kako se ovde koristi, izraz "medijum" ili "medijumi" uključuje svaki kultivacioni medijum, rastvor, čvrstu, polučvrstu ili rigidnu podlogu koja može podržavati ili sadržati bilo koju ćelijudomaćina, uključujući bakterijske ćelije-domaćine, kvaščeve ćelije-domaćine, insekatske ćelijedomaćine, biljne ćelije-domaćine, eukariotske ćelije-domaćine, sisarske ćelije-domaćine, CHO ćelije, prokariotske ćelije-domaćine, E. coli, ili Pseudomonas ćelije-domaćine, i sadržaje ćelija. Prema tome, izraz može obuhvatiti medijum u kojem su ćelije-domaćini rasle, npr., medijum u koji se sekretuje nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid, uključujući medijum pre ili posle koraka proliferacije. Izraz takođe može obuhvatiti pufere ili reagense koji sadrže ćelijske lizate, na primer u slučaju kada se nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid proizvodi unutar ćelije i ćelije-domaćini se liziraju ili oštete da bi oslobodile nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0059] Izraz "antidijabetično sredstvo" označavaće bilo koji lek koji je koristan za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje na drugi način jačine bilo kojeg poremećaja metabolizma glukoze, ili bilo koje njegove komplikacije, uključujući bilo koje od stanja, bolesti ili komplikacija opisanih ovde. Antidijabetična sredstva uključuju insulin, tiazolidindione, sulfoniluree, derivate benzoeve kiseline, inhibitore alfa-glukozidaze, ili slično. Antidijabetičke kompozicije mogu biti sposobne da smanje nivoe HbAlc za najmanje 10% ili najmanje 50% u odnosu na osnovnu-početnu vrednost. Antidijabetička sredstva uključuju pojačivače insulina, na primer uključujući, ali ne ograničavajući se na pojačivače insulina malih molekula, taurin, alfa lipoinsku kiselinu, ekstrakt dudinje, hrom, glutamin, Enicostemma littorale Blume, Scoparia dulcis, ekstrakt estragona, Andrographis paniculata, izomalzozu, trehalozu ili D-manozu, koji mogu dodatno pojačati sekreciju ili aktivnost insulina.

[0060] Kako se ovde koristi, "modifikovani FGF-21 polipeptid," "modifikovani faktor rasta fibroblasta 21" ili "modifikovani FGF-21" i njegove forme bez crtice, koriste se naizmenično i uključivaće one polipeptide i proteine koji se razlikuju od divljeg tipa FGF-21 (npr., divlji tip humanog FGF-21 sa SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:5) i tipično imaju najmanje jednu biološku aktivnost faktora rasta fibroblasta 21, kao i FGF-21 analoge, FGF-21 izoforme, FGF-21 mimetike, FGF-21 fragmente, hibridne FGF-21 proteine, fuzione proteine, oligomere i multimere, homologe, varijante obrazaca glikozilacije, varijante, splajsujuće varijante, i muteine, istog, bez obzira na njihovu biološku aktivnost. Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" i "modifikovani FGF-21" obuhvata FGF-21 polipeptide koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija. Na primer, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetne objave sadrže internu deleciju, uključujući interne delecije prikazane na SL.1 i druge ovde opisane.

[0061] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" obuhvata i polimorfizme (npr., prirodne varijante FGF-21 sekvence). Na primer, "P-forma" FGF-21 sadrži prolin (P) na poziciji 174 (pozicija 146 u zrelom polipeptidu sa SEQ ID NO: 1), dok "L-forma" sadrži leucin (L) na poziciji 174 (pozicija 146 u zrelom polipeptidu sa SEQ ID NO:5). Primeri P-forme FGF-21 polipeptidnih sekvenci sadržani su u SEQ ID NO: 1-4 dok su primeri L-forme FGF-21 polipeptidnih sekvenci sadržani u SEQ ID NO: 5-7.

[0062] Opisane su supstitucije na velikom broju različitih aminokiselinskih pozicija u prirodnom FGF-21. Supstitucije uključuju, ali se ne ograničavaju na one koje modulišu rastvorljivost ili stabilnost, povećavaju agonističku aktivnost, produžavaju in vivo ili in vitro poluživot, povećavaju otpornost na dejstvo proteaza, konvertuju polipeptid u antagonist, smanjuju imunogenost ili toksičnost, olakšavaju prečišćavanje ili proizvodljivost, itd. i obuhvaćene su izrazom "modifikovani FGF-21 polipeptid" ili "modifikovani FGF-21." U nekim slučajevima, neprirodno kodirana aminokiselinska supstitucija(-e) može se kombinovati sa drugim adicijama, supstitucijama ili delecijama u modifikovanom FGF-21 polipeptidu da bi se uticalo na druge biološke osobine modifikovanog FGF-21 polipeptida u odnosu na drugi FGF-21 polipeptid (npr., divlji tip FGF-21 polipeptida sa SEQ ID NO:1, modifikovani FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO:201, ili drugi FGF-21 polipeptid kao što je isti FGF-21 polipeptid bez pomenute adicije, supstitucije ili delecije, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 nemodifikovani ili modifikovani polipeptid). U nekim slučajevima, druge adicije, supstitucije ili delecije mogu povećati stabilnost (uključujući, ali ne ograničavajući se na otpornost prema proteolitičkoj degradaciji) modifikovanog FGF-21 polipeptida ili povećanje afiniteta modifikovanog FGF-21 polipeptida za njegov receptor. U nekim slučajevima, druge adicije, supstitucije ili delecije mogu povećati farmaceutsku stabilnost modifikovanog FGF-21 polipeptida. U nekim slučajevima, druge adicije, supstitucije ili delecije mogu povećati rastvorljivost (uključujući, ali ne ograničavajući se na slučajeve kada se eksprimira u E. coli ili drugim ćelijama-domaćinima) modifikovanog FGF-21 polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima adicije, supstitucije ili delecije mogu povećati rastvorljivost polipeptida posle ekspresije u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijamadomaćinima. U nekim tehničkim rešenjima biraju se mesta za supstituciju prirodno kodiranim ili neprirodnim aminokiselinama, pored drugog mesta za inkorporisanje neprirodne aminokiseline koja rezultuje povećanjem rastvorljivosti polipeptida posle ekspresije u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijama-domaćinima. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi sadrže drugu adiciju, supstituciju ili deleciju koja moduliše afinitet za receptor za FGF-21 polipeptid, vezujuće proteine, ili pridružene ligande, moduliše prenos signala posle vezivanja za receptor za FGF-21, moduliše poluživot u cirkulaciji, moduliše oslobađanje ili bioraspoloživost, olakšava prečišćavanje ili poboljšava ili menja određeni put administracije. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi sadrže adiciju, supstituciju ili deleciju koja povećava afinitet modifikovanog FGF-21 za njegov receptor. Slično tome, modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu sadržati sekvence hemijskog ili enzimskog sečenja, sekvence sečenja proteazom, reaktivne grupe, domene za vezivanje sa antitelom (uključujući, ali ne ograničavajući se na FLAG ili poli-His) ili druge sekvence bazirane na afinitetu (uključujući, ali ne ograničavajući se na FLAG, poli-His, GST, itd.) ili vezane molekule (uključujući, ali ne ograničavajući se na biotin) koji poboljšavaju detekciju (uključujući, ali ne ograničavajući se na GFP), prečišćavanje, transport kroz tkiva ili ćelijske membrane, oslobađanje proleka ili aktivaciju, smanjenje veličine modifikovanog FGF-21, ili druge osobine polipeptida.

[0063] Za sekvence FGF-21 kojima nedostaje liderska sekvenca, vidi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 5 u ovom tekstu. Za sekvence FGF-21 sa liderskom sekvencom, vidi SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7 u ovom tekstu. U nekim tehničkim rešenjima, FGF-21 polipeptidi objave suštinski su identični sa SEQ ID NO: 1-7 ili bilo kojom drugom sekvencom FGF-21 polipeptida. Identifikovan je višestruki polimorfizam FGF-21. Leucin ili prolin bili su opisani na istoj poziciji u američkoj patentnoj objavi br.20010012628 i američkom patentu br. 6,716,626. N-terminalne liderske ili signalne sekvence koje se razlikuju po 1 aminokiselini (leucin) prikazane su u američkom patentu br. 6,716,626 i američkoj patentnoj objavi br.20040259780. Varijante ili mutanti FGF-21 polipeptida uključuju, ali se ne ograničavaju na one koji su stavljeni na uvid javnosti u američkom patentu br.6,716,626; američkim patentnim objavama br. 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713, 2001/0012628; WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463; WO 01/018172; WO 09/149171; WO 10/042747; WO 12/066075; WO 11/154349; WO 13/052311; WO 13/188181.

[0064] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" uključuje i biološki aktivne fragmente, biološki aktivne varijante i stereoizomere FGF-21 koji se sreće u prirodi, kao i agonističke, mimetičke i antagonističke varijante FGF-21 koji se sreće u prirodi i njihove polipeptidne fuzije. Fuzije koje sadrže dodatne aminokiseline na amino terminusu, karboksilnom terminusu, ili oba, obuhvaćene su izrazom "modifikovani FGF-21 polipeptid." Primeri fuzija uključuju, ali se ne ograničavaju na npr., metionil FGF-21 u kojem je metionin vezan za N-terminus FGF-21 koji je rezultat rekombinantne ekspresije zrele forme FGF-21 bez liderskog ili signalnog peptida ili dela istog (metionin je povezan sa N-terminusom FGF-21 koji je rezultat rekombinantne ekspresije, npr. u E. coli), fuzije u svrhu prečišćavanja (uključujući, ali ne ograničavajući se na polihistidin ili afinitetne epitope), fuzije sa peptidima koji se vezuju za serumski albumin kao što je PKE adnektin i fuzije sa serumskim proteinima kao što je serumski albumin, i fuzione proteine koji uključuju FGF-21 i jedan ili više drugih molekula ("fuzioni partner"), uključujući, ali ne ograničavajući se na serumski albumin, Fc domen, konstantni region imunoglobulina, nestrukturirani polipeptid, i adnektin, i fragment istog. Svaki od tih fragmenata može se pripremiti od proteina standardnim biohemijskim postupcima, ili eksprimiranjem polinukleotida koji kodira fragment.

[0065] Osim kada je naznačeno drugačije, uopšteno, izrazi "FGF-21 polipeptid" "faktor rasta fibroblasta 21" i "FGF-21" kako se ovde koriste obuhvataju i nemodifikovane (tj., divlji tip) FGF-21 i modifikovane FGF-21 polipeptide.

[0066] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" uključuje polipeptide konjugovane sa polimerom kao što je PEG i mogu opciono sadržati jednu ili više dodatnih derivitizacija cisteina, lizina, ili drugih rezidua. Pored toga, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati linker ili polimer, pri čemu aminokiselina sa kojom je linker ili polimer konjugovan može biti neprirodna aminokiselina prema ovoj objavi, ili može biti konjugovan sa prirodno kodiranom aminokiselinom, korišćenjem tehnika poznatih u struci kao što je kuplovanje sa lizinom ili cisteinom.

[0067] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" uključuje i glikozilovani modifikovani FGF-21, kao što su, bez ograničavanja, polipeptidi glikozilovani na bilo kojoj aminokiselinskoj poziciji, N-ili O-glikozilovane forme polipeptida. Varijante koje sadrže pojedinačne nukleotidne promene takođe se smatraju za biološki aktivne varijante FGF-21 polipeptida. Pored toga, uključene su i splajsovane varijante. Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" uključuje i FGF-21 polipeptidne heterodimere, homodimere, heteromultimere, ili homomultimere bilo kojeg ili više nemodifikovanih ili modifikovanih FGF-21 polipeptida ili bilo kojeg drugog polipeptida, proteina, ugljenog hidrata, polimera, malog molekula, linkera, liganda, ili drugog biološki aktivnog molekula bilo kojeg tipa, povezane hemijski ili eksprimirane u vidu fuzionog proteina, kao i polipeptidne analoge koji sadrže, na primer, specifične delecije ili druge modifikacije, a da još uvek zadržavaju biološku aktivnost.

[0068] Svako upućivanje na aminokiselinske pozicije u nemodifikovanom ili modifikovanom FGF-21 opisanom ovde bazira se na odgovarajućoj poziciji u SEQ ID NO: 1, ukoliko nije drugačije naznačeno (tj., kada se konstatuje da je poređenje bazirano na SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili drugoj sekvenci FGF-21). Na primer, aminokiselina na poziciji 77 u SEQ ID NO: 1, je arginin i odgovarajući arginin je lociran u SEQ ID NO: 2 na poziciji 87. Stručnjak u oblasti će razumeti da aminokiselinske pozicije koje odgovaraju pozicijama u SEQ ID NO: 1 lako mogu da se identifikuju u bilo kojem drugom molekulu FGF-21 kao što su SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, i 7. Stručnjaci u oblasti će razumeti da aminokiselinske pozicije koje odgovaraju pozicijama u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili bilo kojoj drugoj sekvenci FGF-21 lako mogu da se identifikuju u bilo kojem drugom molekulu FGF-21 kao što su FGF-21 fuzije, varijante, fragmenti, itd. Na primer, programi za poravnavanje sekvenci, kao što je BLAST, mogu se koristiti za poravnavanje i identifikovanje određene pozicije u proteinu koja odgovara poziciji u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili drugoj FGF-21 sekvenci. Supstitucije, delecije ili adicije aminokiselina ovde opisane u vezi sa SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili drugom FGF-21 sekvencom treba da se odnose i na supstitucije, delecije ili adicije na odgovarajućim pozicijama u FGF-21 fuzijama, varijantama, fragmentima, itd. opisanim ovde ili poznatim u struci i izričito su obuhvaćene predmetnom objavom.

[0069] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" ili "modifikovani FGF-21" obuhvata FGF-21 polipeptide koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija. Na primer, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetne objave mogu se sastojati od modifikacija jednom ili više prirodnih aminokiselina, opciono zajedno sa jednom ili više modifikacija neprirodnim aminokiselinama. Primeri supstitucija, insercija ili delecija na velikom broju različitih aminokiselinskih pozicija u FGF-21 polipeptidima (uključujući ovde opisane i druge), koji uključuju, ali se ne ograničavaju na supstitucije koje modulišu farmaceutsku stabilnost, koje modulišu jednu ili više bioloških aktivnosti FGF-21 polipeptida, kao što su, ali bez ograničavanja, povećana agonistička aktivnost, povećana rastvorljivost polipeptida, smanjena podložnost dejstvu proteaza, smanjena deamidacija, konvertovanje polipeptida u antagonist, smanjena imunogenost ili toksičnost, ili olakšano prečišćavanje ili proizvodljivost, itd. i obuhvaćeni su izrazom "modifikovani FGF-21 polipeptid."

[0070] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi sadrže još i dodatnu inserciju, supstituciju ili deleciju koja moduliše biološku aktivnost modifikovanog FGF-21 polipeptida. Na primer, adicije, supstitucije ili delecije mogu modulisati jednu ili više osobina ili aktivnosti modifikovanog FGF-21. Na primer, adicije, supstitucije ili delecije mogu modulisati afinitet prema receptoru za FGF-21 polipeptid, modulisati poluživot u cirkulaciji, modulisati terapijski poluživot, modulisati stabilnost polipeptida, modulisati sečenje proteazama, modulisati dozu, modulisati oslobađanje ili bioraspoloživost, olakšati prečišćavanje, smanjiti deamidaciju, poboljšati rok trajanja, ili poboljšati ili izmeniti određeni put administracije. Slično tome, modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu sadržati sekvence za sečenje proteazom, reaktivne grupe, domene vezivanja sa antitelom (uključujući, ali ne ograničavajući se na FLAG ili poli-His) ili druge sekvence bazirane na afinitetu (uključujući, ali ne ograničavajući se na FLAG, poli-His, GST, itd.) ili vezane molekule (uključujući, ali ne ograničavajući se na biotin) koji poboljšavaju detekciju (uključujući, ali ne ograničavajući se na GFP), prečišćavanje ili druga svojstva polipeptida.

[0071] Izraz "modifikovani FGF-21 polipeptid" obuhvata i homodimere, heterodimere, homomultimere, i heteromultimere koji se formiraju preko fuzionih partnera, kao što su Fc domeni, ili koji su povezani, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji su povezani direktno preko neprirodno kodiranih aminokiselinskih bočnih lanaca, sa istim ili različitim neprirodno kodiranim aminokiselinskim bočnim lancima, sa prirodno kodiranim aminokiselinskim bočnim lancima, ili indirektno preko linkera. Primeri linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na mala organska jedinjenja, polimere rastvorljive u vodi, različitih dužina, kao što su poli(etilen glikol) ili polidekstran, ili polipeptide različitih dužina.

[0072] "Neprirodno kodirana aminokiselina" odnosi se na aminokiselinu koja nije jedna od 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin ili selenocistein. Drugi izrazi koji mogu da se koriste kao sinonimi za izraz "neprirodno kodirana aminokiselina" su "ne-prirodna aminokiselina," "neprirodna aminokiselina," "aminokiselina koja se ne sreće u prirodi," i različite njihove verzije sa crticom ili bez nje. Izraz "neprirodno kodirana aminokiselina" uključuje još i, bez ograničavanja, aminokiseline koje se dobijaju modifikacijom (npr. posttranslacionim modifikacijama) prirodno kodirane aminokiseline (uključujući, ali ne ograničavajući se na 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin i selenocistein) ali koje se same ne inkorporišu translacionim kompleksom prirodno u rastući polipeptidni lanac. Primeri takvih neprirodno kodiranih aminokiselina uključuju, ali se ne ograničavaju na N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin, i O-fosfotirozin.

[0073] "Grupa koja modifikuje amino terminus" odnosi se na svaki molekul koji može da se prikači za amino terminus polipeptida. Slično tome, "grupa koja modifikuje karboksi terminus" odnosi se na svaki molekul koji može da se prikači za karboksi terminus polipeptida. Grupe koje modifikuju terminus uključuju, ali se ne ograničavaju na različite u vodi rastvorljive polimere, peptide ili proteine kao što su serumski albumin, Fc domen, konstantni region imunoglobulina, nestrukturirani polipeptid, adnektin, ili njegov fragment, ili druge komponente koje produžavaju poluživot peptida u serumu (in vivo).

[0074] Izrazi "funkcionalna grupa", "aktivna komponenta", "aktivirajuća grupa", "odlazeća grupa", "reaktivno mesto", "hemijski reaktivna grupa" i "hemijski reaktivna komponenta" koriste se u struci i u ovom tekstu da označe zasebne delove ili jedinice molekula, koji se mogu definisati. Izrazi su donekle sinonimi u hemijskoj struci i koriste se ovde da naznače delove molekula koji obavljaju neku funkciju ili aktivnost i koji su reaktivni sa drugim molekulima.

[0075] Izraz "veza" ili "linker" koristi se ovde da označi grupe ili veze koje se normalo formiraju kao rezultat hemijske reakcije i tipično to su kovalentne veze. Hidrolitički stabilne veze znači da su veze suštinski stabilne u vodi i da ne reaguju sa vodom na korišćenim pH vrednostima, uključujući, ali ne ograničavajući se na fiziološke uslove tokom produženog vremenskog perioda, moguće čak i neograničeno. Hidrolitički nestabilne ili degradabilne veze znači da su veze degradabilne u vodi ili vodenim rastvorima, uključujući na primer, krv. Enzimski nestabilne ili degradabilne veze znači da veza može da se razgradi jednim ili više enzima. Kako se podrazumeva u struci, PEG i srodni polimeri mogu uključiti degradabilne veze u osovini polimera ili u linkerskoj grupi između osovine polimera i jedne ili više terminalnih funkcionalnih grupa polimernog molekula. Na primer, estarske veze formirane reakcijom PEG karboksilnih kiselina ili aktiviranih PEG karboksilnih kiselina sa alkoholnim grupama na biološki aktivnom sredstvu obično se hidrolizuju pod fiziološkim uslovima da bi se sredstvo oslobodilo. Druge hidrolitički degradabilne veze uključuju, ali se ne ograničavaju na karbonatne veze; iminske veze koje su rezultat reakcije amina i aldehida; fosfatne estarske veze koje se formiraju reakcijom alkohola sa fosfatnom grupom; hidrazonske veze koje su reakcioni proizvod hidrazida i aldehida; acetalne veze koje su reakcioni proizvod aldehida i alkohola; ortoestarske veze koje su reakcioni proizvod formata i alkohola; peptidne veze koje formiraju amino grupa, uključujući, ali ne ograničavajući se na one na kraju polimera kao što je PEG, i karboskilna grupa peptida; i oligonukleotidne veze koje formiraju fosforamiditna grupa, uključujući, ali ne ograničavajući se na onu na kraju polimera, i 5' hidroksilna grupa oligonukleotida.

[0076] Izraz "biološki aktivni molekul", "biološki aktivna komponenta" ili "biološki aktivno sredstvo" kada se ovde koristi označava bilo koju supstancu koja može da utiče na neko fizičko ili biohemijsko svojstvo biološkog sistema, puta, molekula ili interakcije u vezi sa živim organizmom. Posebno, kako se ovde koristi, biološki aktivni molekuli uključuju, ali se ne ograničavaju na svaku supstancu koja je namenjena dijagnostikovanju, lečenju, ublažavanju, tretmanu, ili prevenciji bolesti kod ljudi ili drugih životinja, ili na drugi način poboljšanju fizičkog ili mentalnog blagostanja ljudi ili životinja. Primeri biološki aktivnih molekula uključuju, ali se ne ograničavaju na peptide, proteine, enzime, lekove sa malim molekulima, ugljene hidrate, neorganske atome ili molekule, boje, lipide, nukleozide, radionuklide, oligonukleotide, toksoide, toksine, polisaharide, nukleinske kiseline, peptide, polipeptide, proteine, i njihove delove dobijene ili izvedene iz virusa, bakterija, insekata ili neke druge ćelije ili ćelijskog tipa, lipozome, mikročestice i micele.

[0077] Izraz "supstituenti" uključuje, ali se ne ograničava na "neinterferirajuće supstituente". "Neinterferirajući supstituenti" su one grupe koje daju stabilna jedinjenja. Pogodni neinterferirajući supstituenti ili radikali uključuju, ali se ne ograničavaju na halo, C1-C10alkil, C2-C10alkenil, C2-C10alkinil, C1-C10alkoksi, C1-C12aralkil, C1-C12alkaril, C3-C12cikloalkil, C3-C12cikloalkenil, fenil, supstituisani fenil, toluoil, ksilenil, bifenil, C2-C12alkoksialkil, C2-C12alkoksiaril, C7-C12ariloksialkil, C7-C12oksiaril, C1-C6alkilsulfinil, C1-C10alkilsulfonil, --(CH2)m--O--(C1-C10alkil) gde je m od 1 do 8, aril, supstituisani aril, supstituisani alkoksi, fluoroalkil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, nitroalkil, -NO2, -CN, NRC(O)-(C1-C10alkil), -C(O)-(C1-C10alkil), C2-C10alkil tioalkil, --C(O)O-( C1-C10alkil), --OH, --SO2, =S, -COOH, -NR2, karbonil, -C(O)-(C1-C10alkil)-CF3,-C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(C1-C10aril)-S-(C6-C10aril), --C(O)--(C1-C10aril), -(CH2)m--O--(--(CH2)m- -O-(C1-C10alkil) gde je svaki m od 1 do 8, --C(O)NR2, --C(S)NR2, -- SO2NR2, -NRC(O) NR2,-NRC(S) NR2, soli istog i slično. Svaki R kako se ovde koristi je H, alkil ili supstituisani alkil, aril ili supstituisani aril, aralkil, ili alkaril.

[0078] Kako se ovde koristi, izraz "polimer rastvorljiv u vodi" odnosi se na svaki polimer koji je rastvorljiv u vodenim rastvaračima. Veza polimera rastvorljivih u vodi sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima može rezultovati promenama koje uključuju, ali se ne ograničavaju na produžen ili modulisan poluživot u serumu (in vivo), ili produžen ili modulisan terapijski poluživot u odnosu na nemodifikovanu formu, modulisanu imunogenost ili toksičnost, modulisane karakteristike fizičkog asociranja kao što su agregacija i formiranje multimera, izmenjeno vezivanje za receptor, izmenjeno vezivanje sa jednim ili više vezujućih partnera, i izmenjena dimerizacija ili multimerizacija receptora. Polimer rastvorljiv u vodi može, ali ne mora imati svoju sopstvenu biološku aktivnost, i može služiti kao linker za prikačinjanje modifikovanog FGF-21 za druge supstance, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više nemodifikovanih ili modifikovanih FGF-21 polipeptida, ili jedan ili više biološki aktivnih molekula. Pogodni polimeri uključuju, ali se ne ograničavaju na polietilen glikol, polietilen glikol propionaldehid, mono C1-C10 alkoksi ili ariloksi derivate istog (opisane u američkom patentu br. 5,252,714), monometoksi-polietilen glikol, zasebni PEG, polivinil pirolidon, polivinil alkohol, poliaminokiseline, diviniletar maleinski anhidrid, N-(2-hidroksipropil)-metakrilamid, dekstran, derivate dekstrana uključujući dekstran sulfat, polipropilen glikol, polipropilen oksid/etilen oksid kopolimer, polioksietilisani poliol, heparin, fragmente heparina, polisaharide, oligosaharide, glikane, celulozu i derivate celuloze, uključujući, ali ne ograničavajući se na metilcelulozu i karboksimetil celulozu, skrob i derivate skroba, polipeptide, polialkilen glikol i njegove derivate, kopolimere polialkilen glikola i njegove derivate, polivinil etil etre, i alfa-beta-poli[(2-hidroksietil)-DL-aspartamid, i slično ili njihove mešavine. Primeri takvih polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali se ne ograničavaju na polietilen glikol i serumski albumin.

[0079] Kako se ovde koristi, izraz "polialkilen glikol" (PEG) ili "poli(alken glikol)" odnosi se na polietilen glikol (poli(etilen glikol)), polipropilen glikol, polibutilen glikol, i njihove derivate. Izraz "polialkilen glikol" obuhvata linearne i granate polimere i prosečne molekulske mase između 0.1 kDa i 100 kDa. Drugi primeri tehničkih rešenja navedeni su, na primer, u katalozima komercijalnih dobavljača, kao što je katalog korporacije Shearwater "Polietilen glikol i derivati za primenu u biomedicini" (2001).

[0080] Kako se ovde koriste, izrazi "modulisani poluživot u serumu ili "modulisani poluživot in vivo" i slični izrazi, odnose se na pozitivnu ili negativnu promenu poluživota modifikovanog FGF-21 u cirkulaciji u odnosu na komparatora kao što je njegova nemodifikovana forma. Poluživot u serumu može se meriti uzimanjem uzoraka krvi u različitim vremenskim tačkama posle administriranja modifikovanog FGF-21, i određivanjem koncentracije tog molekula u svakom uzorku. Korelisanje koncentracije u serumu i vremena omogućava izračunavanje poluživota u serumu. Povećanje poluživota u serumu (in vivo) poželjno može biti najmanje dvostruko, ali može biti korisno i manje povećanje, na primer kada ono omogućava zadovoljavajući režim doziranja ili izbegavanje toksičnog efekta. U nekim tehničkim rešenjima, povećanje može iznositi najmanje oko tri puta, ili najmanje oko deset puta.

[0081] Izraz "modulisani terapijski poluživot" kako se ovde koristi znači pozitivnu ili negativnu promenu poluživota u serumu ili in vivo terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida opisanog ovde, u odnosu na komparatora kao što je njegova nemodifikovana forma ili divlji tip FGF-21. Terapijski poluživot se meri merenjem farmakokinetičkih i/ili farmakodinamičkih svojstava molekula u različitim vremenskim tačkama posle administriranja. Povećan terapijski poluživot poželjno omogućava određeni blagotvorni režim doziranja, određenu blagotvornu ukupnu dozu, ili izbegavanje neželjenog dejstva. U nekim tehničkim rešenjima, povećani terapijski poluživot rezultat je povećane potencije, povećanog ili smanjenog vezivanja modifikovanog molekula za cilj, povećanu ili smanjenu razgradnju molekula enzimima kao što su proteaze, ili povećanje ili smanjenje drugog parametra ili mehanizma dejstva nemodifikovanog molekula ili povećanje ili smanjenje receptorima posredovanog eliminisanja molekula.

[0082] Izraz "izolovan," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili protein, označava da nukleinska kiselina ili protein ne sadrže bar neke od ćelijskih komponenti sa kojima su udruženi u prirodnom stanju, ili da su nukleinska kiselina ili protein koncentrisani do nivoa većeg nego što iznosi koncentracija njihove proizvodnje in vivo ili in vitro. Mogu biti u homogenom stanju. Izolovane supstance mogu biti u suvom ili polusuvom stanju , ili u rastvoru, uključujući, ali ne ograničavajući se na vodeni rastvor. Mogu biti komponenta farmaceutske kompozicije koja sadrži farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense. Čistoća i homogenost se tipično određuju korišćenjem tehnika analitičke hemije kao što su elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ili tečna hromatografija visokih performansi. Protein koji je preovlađujuća vrsta prisutna u preparatu je suštinski prečišćen. Posebno, izolovani gen je odvojen od otvorenih ramova čitanja koji se nalaze bočno od gena i kodiraju protein različit od gena od interesa. Izraz "prečišćen" označava da nukleinska kiselina ili protein daju suštinski jednu traku na gelu za elektroforezu. Posebno, to može značiti da nukleinska kiselina ili protein imaju čistoću od najmanje 85%, čistoću od najmanje 90%, čistoću od najmanje 95%, čistoću od najmanje 99% ili veću čistoću.

[0083] Izraz "nukleinska kiselina" odnosi se na deoksiribonukleotide, deoksiribonukleozide, ribonukleozide ili ribonukleotide i njihove polimere, u jednolančanoj ili dvolančanoj formi. Ukoliko nije specifično ograničeno, izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slične vezujuće osobine kao referentna nukleinska kiselina i metabolišu se na način sličan prirodnim nukleotidima. Ukoliko nije specifično ograničeno, izraz se odnosi i na oligonukleotidne analoge koji uključuju PNK (peptidonukleinska kiselina), analoge DNK korišćene u "antismislenoj" tehnologiji (fosforotioati, fosforoamidati, i slično). Ukoliko nije drugačije navedeno, određena sekvenca nukleinske kiseline implicitno obuhvata i njene konzervativno modifikovane varijante (uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije izrođenosti kodona) i komplementarne sekvence kao i eksplicitno naznačenu sekvencu.

[0084] Izrazi "polipeptid," "peptid" i "protein" ovde se koriste naizmenično da označe polimer aminokiselinskih rezidua. Dakle, opis koji se odnosi na polipeptid jednako se primenjuje i na opis peptida i opis proteina, i obrnuto. Izrazi se primenjuju i na aminokiselinske polimere koji se sreću prirodno, kao i na aminokiselinske polimere u kojima su jedna ili više aminokiselinskih rezidua neprirodno kodirane aminokiseline. Kako se ovde koristi, izrazi obuhvataju aminokiselinske lance bilo koje dužine, uključujući proteine pune dužine, pri čemu su aminokiselinske rezidue povezane kovalentnim peptidnim vezama.

[0085] "Konzervativno modifikovane varijante" odnosi se na aminokiselinske sekvence koje sadrže konzervativne supstitucije. Primeri konzervativno modifikovanih varijanti uključuju supstitucije, delecije ili insercije u nukleinskokiselinskoj, peptidnoj, polipeptidnoj, ili proteinskoj sekvenci, koje menjaju, dodaju ili odstranjuju jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina u polipeptidnoj sekvenci ili kodiranoj polipeptidnoj sekvenci, npr., do 1, 2, 3, 4, ili 5 aminokiselina, ili do 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, ili 3.5% aminokiselina u polipeptidnoj sekvenci ili kodiranoj polipeptidnoj sekvenci, koje opciono mogu biti ili mogu uključivati supstituciju aminokiseline(-a) hemijski sličnom aminokiselinom(-ama). Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline poznate su prosečno obučenim stručnjacima u oblasti. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatne i ne isključuju polimorfne varijante, međuvrsne homologe, i alele modifikovanih FGF-21 polipeptida stavljenih na uvid javnosti.

[0086] Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline poznate su prosečno obučenim stručnjacima u oblasti. Svaka od sledećih osam grupa sadrži aminokiseline koje jedna za drugu predstavljaju konzervativne supstitucije:

1) Alanin (A), Glicin (G);

2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E);

3) Asparagin (N), Glutamin (Q);

4) Arginin (R), Lizin (K);

5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V);

6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W);

7) Serin (S), Treonin (T); i

8) Cistein (C), Metionin (M)

(vidi, npr., Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2, izdanje (decembar 1993)

[0087] Izrazi "identično" ili procenat "identičnosti," u kontekstu dve ili više nukleinskokiselinskih ili polipeptidnih sekvenci, odnosi se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste. Sekvence su "suštinski identične" ako imaju procenat aminokiselinskih rezidua ili nukleotida koji su isti (tj., oko 60% identičnosti, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, identičnosti duž naznačenog regiona), kada se upoređuju i poravnavaju za maksimalno korespondiranje duž prozora poređenja, ili naznačenog regiona, mereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za upoređivanje sekvenci (ili drugih algoritama dostupnih osobi prosečno obučenoj u struci) ili ručnim poravnavanjem i vizuelnim pregledom. Identičnost može postojati duž regiona ili prozora poređenja dugog najmanje oko 50 aminokiselina ili nukleotida, ili duž regiona dugog 75-100 aminokiselina ili nukleotida, ili, kada nije naznačeno, duž čitave sekvence polinukleotida ili polipeptida. "Prozor poređenja", kako se ovde koristi, uključuje upućivanje na segment bilo koje od brojnih kontinuiranih pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 20 do 600, obično oko 50 do oko 200, običnije oko 100 do oko 150, čija sekvenca se može uporediti sa referentnom sekvencom sa istimg brojem kontinuiranih pozicija pošto se dve sekvence optimalno poravnaju. Primeri algoritama koji mogu biti pogodni za određivanje procenta sekvencione identičnosti i sekvencione sličnosti su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi opisani u Altschul i sarad. (1997) Nuc. Acids Res.25:3389-3402, odnosno Altschul i sarad. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, kao i Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1):195-7), ili Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53) algoritmi, koji se mogu koristiti sa unapred zadatim parametrima, npr., kao što je opisano u tim odgovarajućim publikacijama.

[0088] Izraz "subjekt" kako se ovde koristi, odnosi se na životinju, u nekim tehničkim rešenjima sisara, i u drugim tehničkim rešenjima čoveka, koji je objekt lečenja, posmatranja ili eksperimenta. Životinja može biti životinja za društvo (npr., psi, mačke, i slično), životinja na farmi (npr., krave, ovce, svinje, konji i slično) ili laboratorijska životinja (npr., pacovi, miševi, zamorci, i slično).

[0089] Izraz "efikasna količina" kako se ovde koristi odnosi se na onu količinu administriranog jedinjenja (npr., modifikovanog FGF-21 polipeptida opisanog ovde) koja u nekoj meri može olakšati jedan ili više simptoma bolesti, stanja ili poremećaja koji se tretira. Kompozicije koje sadrže modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde mogu se administrirati radi profilaktičkog, pojačavajućeg, i/ili terapijskog tretmana.

[0090] Izrazi "pojačava" ili "pojačavajući" znači povećati ili produžiti jačinu ili trajanje željenog efekta. Prema tome, u vezi sa pojačavanjem efekta terapijskih sredstava, izraz "pojačavajući" odnosi se na sposobnost povećanja ili produženja, jačine ili trajanja efekta drugih terapijskih sredstava na sistem.

[0091] Izraz "modifikovani," kako se ovde koristi odnosi se na bilo kakve promene napravljene u datom polipeptidu, aminokiselinskoj sekvenci, hemijskoj strukturi, na kotranslacionu modifikaciju, ili posttranslacionu modifikaciju polipeptida. Oblik izraza "(modifikovan)" znači da su polipeptidi o kojima je reč opciono modifikovani, to jest, polipeptidi o kojima je reč mogu biti modifikovani ili nemodifikovani.

[0092] Izraz "posttranslaciono modifikovani" odnosi se na bilo kakvu modifikaciju prirodne ili neprirodne aminokiseline koja se dešava takvoj aminokiselini posle njenog inkorporisanja u polipeptidni lanac. Izraz obuhvata, samo kao primer, kotranslacione in vivo modifikacije, kotranslacione in vitro modifikacije (kao što su one u translacionom sistemu koji ne sadrži ćelije), posttranslacione in vivo modifikacije, i posttranslacione in vitro modifikacije.

[0093] U profilaktičkim primenama, kompozicije koje sadrže modifikovani FGF-21 polipeptid admministriraju se pacijentu koji je podložan ili na drugi način pod rizikom za određenu bolest, poremećaj ili stanje. Takva količina se definiše kao "profilaktički efikasna količina."

[0094] U terapijskim primenama, kompozicije koje sadrže modifikovani polipeptid sa neprirodnom aminokiselinom administriraju se pacijentu koji već pati od bolesti, stanja ili poremećaja, u količini dovoljnoj da se izleče ili bar delimično zaustave ili ublaže simptomi bolesti, poremećaja ili stanja. Takva količina se definiše kao "terapijski efikasna količina," i može zavisiti od jačine i toka bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, pacijentovog zdravstvenog stanja i odgovora na lekove, i procene ordinirajućeg lekara. Smatra se da je određivanje tih terapijski efikasnih količina rutinskim eksperimentom (npr., klinička studija rastućih doza) u okvirima obučenosti u struci.

[0095] Izraz "tretman" koristi se da označi profilaktički i/ili terapijski tretman.

[0096] Polipeptidi sa neprirodno kodiranim aminokiselinama predstavljeni ovde mogu uključivati izotopom obeležena jedinjenja sa jednim ili više atoma zamenjenim atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se obično sreće u prirodi.

[0097] Svi izomeri, uključujući, ali ne ograničavajući se na dijastereomere, enantiomere, i njihove mešavine razmatraju se kao deo ovde opisane kompozicije. U dodatnim ili daljim tehničkim rešenjima, polipeptidi sa neprirodno kodiranim aminokiselinama metabolišu se posle administriranja organizmu kojem je potrebno da proizvede metabolit koji se tada koristi da proizvede željeni efekat, uključujući željeni terapijski efekat. U dodatnim ili daljim tehničkim rešenjima su aktivni metaboliti polipeptida sa neprirodno kodiranim aminokiselinama.

I. Pregled

[0098] Modifikovani FGF-21 molekuli koji sadrže internu deleciju i koji opciono sadrže najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu obezbeđeni su u objavi. Pokazano je da primeri tehničkih rešenja modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže internu deleciju ispoljavaju najmanje jedno pogodno svojstvo uključujući, ali ne ograničavajući se na povećanu termičku stabilnost, poboljšanu rastvorljivost, smanjenu deaminaciju, poboljšanu proizvodljivost, poboljšan poluživot in vivo biološki aktivne forme pune dužine, uz zadržavanje nivoa biološke aktivnosti uporedivog sa FGF-21 polipeptidom bez interne delecije.

[0099] Deamidacija je ublažena, a rok trajanja produžen i čistoća poboljšana u modifikovanim FGF-21 polipeptidima koji sadrže deletovani region i opciono nadoknađen peptidom (vidi SL.1).

Pokazano je da primeri modifikovanih sekvenci ublažavaju deamidacione događaje do kojih dolazi tokom skladištenja molekula. Pored ublažavanja deamidacije, ova modifikacija takođe poboljšava termičku stabilnost i/ili rastvorljivost proteina u rastvoru i dodatno minimizira sklonost proteina ka agregaciji u odnosu na divlji tip FGF-21 ili FGF-21 polipeptide koji nemaju ovu deleciju. Smanjena deamidacija, povećana termička stabilnost, povećana rastvorljivost, i/ili smanjena agregacija ukazuju na superiorne formulacione karakteristike, kao što su duži rok trajanja i veća čistoća, kao i formulisanje u većoj koncentraciji. Pored toga, ublažavanje sklonosti ka deamidaciji dopušta veći raspon opcija formulisanja; inače, uslove formulisanja bi bilo potrebno birati tako da se smanji deamidacija, što bi potencijalno rezultovalo drugim neželjenim formulacionim karakteristikama. Pored toga, nepredviđeno je i neočekivano da modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži internu deleciju između 5 i 19 aminokiselina u nizu i zamenski peptid, može zadržati biološku funkciju FGF-21 i imati najmanje jedno od smanjene deamidacije, povećane termičke stabilnosti, povećane rastvorljivosti, i smanjene agragacije.

[0100] Dodatni primeri modifikacija ublažavaju in vivo proteolitičko odsecanje deset C-terminalnih aminokiselina iz proteina. Ova modifikacija produžava poluživot u krvi intaktnog, aktivnog molekula što rezultuje smanjenjem ukupne doze, i manje čestim doziranjem. Primer modifikacija koje ublažavaju proteolitičko isecanje je tačkasta mutacija, G170E, iako se mogu koristiti i druge modifikacije.

[0101] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 1-7, osim što pomenuta aminokiselinska sekvenca može uključivati: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je navedena interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 SEQ ID NO: 1, pri čemu je pomenuta interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0 i 12 aminokiselina; i (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija.

[0102] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati najmanje jednu neprirodno kodiranu aminokiselinu. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131, ili 146 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 77, 91, 108 ili 131 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 72 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 77 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 86 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 87 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 91 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 110 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 126 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 131 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je na poziciji koja odgovara aminokiselini 146 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je derivat fenilalanina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti parasupstituisani, ortosupstituisani, ili metasupstituisani derivat fenilalanina. Prema pronalasku, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je para-acetil-L-fenilalanin. Prema pronalasku. pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina je para-acetil-L-fenilalanin inkorporisan na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO:1.

[0103] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 1-7, osim što pomenuta aminokiselinska sekvenca može uključivati: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je pomenuta interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je pomenuta interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0 i 12 aminokiselina; (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija; (iii) neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1, koja može uključivati parasupstituisani, ortosupstituisani, ili metasupstituisani derivat fenilalanina, kao što je para-acetil-L-fenilalanin.

[0104] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1.

[0105] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može sadržati ili sastojati se od regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može biti povezan sa polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi, ili poli(etilen glikolom), kao što je poli(etilen glikol) koji ima procečnu molekulsku masu od oko 30 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu G, GG, SG, GSG, GGH, ili SGG. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu GSG.

[0106] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 8 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 7 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 6 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 5 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 4 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 3 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 2 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati 1 dodatnu aminokiselinsku supstituciju, deleciju, i/ili inserciju. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati supstituciju ili deleciju aminokiseline koja odgovara aminokiselini G170 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može da ne sadrži dodatne aminokiselinske supstitucije, delecije, i/ili insercije.

[0107] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži internu deleciju između 4 i 19, između 4 i 18, između 4 i 17, između 4 i 16 između 4 i 15, između 4 i 14, između 4 i 13, između 4 i 12, između 4 i 11, između 4 i 10, između 4 i 9, između 4 i 8, između 4 i 7, ili između 4 i 6 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 4 i 14 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 4 i 12 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 4 i 10 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 4 i 8 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 4 i 6 aminokiselina.

[0108] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 5 i 19, između 5 i 18, između 5 i 17, između 5 i 16, između 5 i 15, između 5 i 14, između 5 i 13, između 5 i 12, između 5 i 11, između 5 i 10, između 5 i 9, između 5 i 8, između 5 i 7, ili između 5 i 6 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 5 i 14 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 5 i 12 aminokiselina.

[0109] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 6 i 19, između 6 i 18, između 6 i 17, između 6 i 16, između 6 i 15, između 6 i 14, između 6 i 13, između 6 i 12, između 6 i 11, između 6 i 10, između 6 i 9, između 6 i 8, ili između 6 i 7 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 6 i 14 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 6 i 12 aminokiselina.

[0110] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 7 i 19, između 7 i 18, između 7 i 17, između 7 i 16, između 7 i 15, između 7 i 14, između 7 i 13, između 7 i 12, između 7 i 11, između 7 i 10, između 7 i 9, ili između 7 i 8 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 7 i 14 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 7 i 12 aminokiselina.

[0111] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 8 i 19 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 8 i 14 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta interna delecija može iznositi između 8 i 12 aminokiselina.

[0112] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju 12 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju 13 aminokiselina.

[0113] U nekim tehničkim rešenjima, interna delecija opisana ovde može uključivati poziciju koja odgovara aminokiselini 121 u SEQ ID NO:1.

[0114] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju pri čemu: i) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 116 do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

ii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 117 do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 118 i do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iv) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 119 do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO: 1;

v) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 120 do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1; ili

vi) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 121 do aminokiseline 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1.

[0115] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju pri čemu: i) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 122 do aminokiseline 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

ii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 123 do aminokiseline 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 124 do aminokiseline 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iv) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 125 do aminokiseline 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

v) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 126 do aminokiseline 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

vi) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 127 do aminokiseline 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

vii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 128 do aminokiseline 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

viii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 129 do aminokiseline 133, ili 134 u SEQ ID NO:1; ili

ix) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 130 do aminokiseline 134 u SEQ ID NO:1.

[0116] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju pri čemu: i) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 116 do aminokiseline 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

ii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 117 do aminokiseline 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 118 do aminokiseline 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

iv) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 119 do aminokiseline 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

v) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 120 do aminokiseline 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

vi) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 121 do aminokiseline 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

vii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 122 do aminokiseline 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

viii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 123 do aminokiseline 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1; ix) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 124 do aminokiseline 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1; x) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 125 do aminokiseline 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xi) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 126 do aminokiseline 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 127 do aminokiseline 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xiii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 128 do aminokiseline 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xiv) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 129 do aminokiseline 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xv) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 130 do aminokiseline 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xvi) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 131 do aminokiseline 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO:1;

xvii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 132 do aminokiseline 133, ili 134 u SEQ ID NO:1; ili

xviii) pomenuta interna delecija je unutar ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselini 133 do aminokiseline 134 u SEQ ID NO:1.

[0117] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju, pri čemu je navedena interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju, pri čemu pomenuta interna delecija uključuje ili se sastoji od regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1.

[0118] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1-7, osim što pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati: (i) internu deleciju regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je navedena interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0 i 12 aminokiselina; (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija; i (iii) neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1, koja može uključivati parasupstituisani, ortosupstituisani, ili metasupstituisani derivat fenilalanina, kao što je para-acetil-L-fenilalanin.

Pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1. Pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može biti povezan sa polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi, ili poli(etilen glikolom), kao što je poli(etilen glikol) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu G, GG, SG, GSG, GGH, ili SGG. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu GSG.

[0119] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati zamenski polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid je dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid je dug 2-8 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid je dug 2-5 aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid je dug 3 aminokiseline. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid sadrži serinske, histidinske, i/ili glicinske rezidue. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid sadrži serinske i/ili glicinske rezidue. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu G, GG, SG, GSG, GGH, ili SGG. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu GSG.

[0120] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1 i zamenski peptid koji ima sekvencu GSG.

[0121] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1-7, osim što pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je pomenuta interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je pomenuta interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima sekvencu G, GG, SG, GSG, GGH, ili SGG; (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija; (iii) neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1, koja može uključivati parasupstituisani, ortosupstituisani, ili metasupstituisani derivat fenilalanina, kao što je para-acetil-L-fenilalanin. Pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1.

Pomenuta interna delecija može sadržati ili sastojati se od regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1. Pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može biti povezan sa polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi, ili poli(etilen glikolom), kao što je poli(etilen glikol) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu GSG.

[0122] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati internu deleciju koja sadrži region koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1, zamenski peptid koji ima sekvencu GSG, supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1, i opciono neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1, koja može uključivati parasupstituisani, ortosupstituisani, ili metasupstituisani derivat fenilalanina, kao što je para-acetil-L-fenilalanin.

[0123] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može imati najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 95% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 97% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 98% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 99% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 202 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 202 bez N-terminalnog metionina.

[0124] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može imati najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina.

U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 95% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 97% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 98% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može imati najmanje 99% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 102 sa ili bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 102. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati ili se sastojati od polipeptida sa SEQ ID NO: 102 bez N-terminalnog metionina.

[0125] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može dodatno sadržati fuzionog partnera. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati povezujući peptid koji ima dužinu 0-50 aminokiselina između pomenute aminokiselinske sekvence i fuzionog partnera. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može imati aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO:74-100, 301, i 350-383. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može imati aminokiselinsku sekvencu GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).

[0126] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može dodatno sadržati povezujući peptid koji povezuje pomenutu aminokiselinsku sekvencu i pomenutog fuzionog partnera. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može biti dug između 0 i 100, između 2 i 80, između 2 i 60, između 2 i 50, između 2 i 40, između 2 i 30, između 2 i 20, između 2 i 10, između 2 i 8, između 2 i 6, ili između 2 i 4 aminokiseline. U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može sadržati ili se sastojati od aminokiselinske sekvence odabrane od: SEQ ID NO:74-100, 301, i 350-383.

[0127] U nekim tehničkim rešenjima, povezujući peptid može sadržati ili se sastojati od aminokiselinske sekvence GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).

[0128] U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner se bira između serumskog albumina, Fc domena, konstantnog regiona imunoglobulina, nestrukturiranog polipeptida, i adnektina i njihovih fragmenata. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner sadrži konstantni region imunoglobulina ili modifikovani konstantni region imunoglobulina.. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati nestrukturirani polipeptid, pri čemu pomenuti nestrukturirani polipeptid sadrži XTEN ili PAS polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, PAS polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 310-316 ili aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95% identična sa njom.

[0129] U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner sadrži Fc domen ili njegov fragment. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom između SEQ ID NO:302 i 323-335, ili njen fragment, kao što je polipeptid odabran između SEQ ID NO:303-309. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati Fc domen ili Fc fragment koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 302 i 323-335. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskim sekvencama odabranim između SEQ ID NO:302 i 323-335, ili njen fragment. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO:302. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO:302. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:302.

[0130] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO:475-487. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO:475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 95% identičan sa SEQ ID NO:475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 96% identičan sa SEQ ID NO:475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 97% identičan sa SEQ ID NO:475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 98% identičan sa SEQ ID NO:475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida koji je najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO:475.

U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži ili se sastoji od polipeptida sa SEQ ID NO:475.

[0131] U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati adnektin. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati albumin-vezujući ili PKE adnektin. U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid koji je najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa SEQ ID NO: 320. U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO: 320. U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid sa SEQ ID NO:320. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO:401-423. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida koji je najmanje 95% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO:401-423. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida odabranog između: SEQ ID NO:401-423.

[0132] U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid koji je najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa SEQ ID NO: 319. U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO: 319. U nekim tehničkim rešenjima, PKE adnektin može sadržati polipeptid sa SEQ ID NO:319. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO: 452-474. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida koji je najmanje 95% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO: 452-474. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati ili se sastojati od polipeptida odabranog između: SEQ ID NO: 452-474.

[0133] U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner sadrži serumski albumin ili njegov fragment. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner sadrži humani serumski albumin ili njegov fragment. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati polipeptid koji je najmanje 90% identičan sa SEQ ID NO: 321 ili 322. U nekim tehničkim rešenjima, fuzioni partner može sadržati polipeptid sa SEQ ID NO:321 ili 322. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati polipeptid koji je najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO:424-432, 434-437, 440-443, i 446-451. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati polipeptid koji je najmanje 95% identičan sa polipeptidom odabranim između: SEQ ID NO:424-432, 434-437, 440-443, i 446-451. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati polipeptid odabran između: SEQ ID NO:424-432, 434-437, 440-443, i 446-451.

[0134] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 1-7, osim što pomenuta aminokiselinska sekvenca može sadržati: (i) internu deleciju između 2 i 19 aminokiselina (kao što je između 5 i 19 aminokiselina), pri čemu je pomenuta interna delecija unutar regiona koji odgovara aminokiselinama 116 do 134 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je pomenuta interna delecija zamenjena zamenskim peptidom koji ima dužinu između 0 i 12 aminokiselina; i (ii) 9 ili manje dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili insercija; pri čemu pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži još i fuzionog partnera. Pomenuti fuzioni partner može sadržati Fc domen ili njegov fragment. Pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati supstituciju glicina glutaminskom kiselinom na poziciji koja odgovara aminokiselini 170 u SEQ ID NO: 1. Pomenuta interna delecija može sadržati ili se sastojati od regiona koji odgovara aminokiselinama 119-130 u SEQ ID NO:1. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu G, GG, SG, GSG, GGH, ili SGG. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti zamenski peptid ima sekvencu GSG. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži povezujući peptid između pomenute aminokiselinske sekvence i fuzionog partnera, pri čemu pomenuti povezujući peptid sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:360).

[0135] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu koja može biti spojena sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, peptidom, polipeptidom, ili komponentom koja produžava poluživot. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu koja može biti spojena sa komponentom koja produžava poluživot. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot odabrana je između poli(etilen glikola) (PEG), monometoksi PEG (mPEG), nestrukturiranog polipeptida, adnektina, serumskog albumina, humanog serumskog albumina, Fc domena, konstantnog regiona imunoglobulina, fragmenta bilo kojeg od gore navedenog, lipida, granate ili negranate acil grupe, granate ili negranate C8-C30 acil grupe, granate ili negranate alkil grupe, i granate ili negranate C8-C30 alkil grupe. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu koja može biti vezana sa nestrukturiranim polipeptidom odabranim između XTEN ili PAS polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži poli(etilen glikol) (PEG) ili monometoksi PEG (mPEG) polimer. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži granati ili višekraki poli(etilen glikol) (PEG), ili drugi granati ili višekraki polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži poli(etilen glikol) (PEG) ili monometoksi PEG (mPEG) komponentu koja ima prosečnu molekulsku masu između oko 0.1kDa i oko 100 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži poli(etilen glikol) ili monometoksi PEG (mPEG) komponentu koja ima prosečnu molekulsku masu:

i) između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa;

ii) između oko 1 kDa i 50 kDa;

iii) između oko 10 kDa i 40 kDa;

iv) između oko 20 kDa i 30 kDa;

v) između oko 0.050 kDa i oko 100 kDa; ili

vi) oko 100 kDa, 95 kDa, 90 kDa, 85 kDa, 80 kDa, 75 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, ili 100 Da.

[0136] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži poli(etilen glikol) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta komponenta koja produžava poluživot sadrži nepoli(etilen glikolni) polimer rastvorljiv u vodi ili oligosaharid.

[0137] U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta neprirodno kodirana aminokiselina opisana ovde može sadržati karbonilnu grupu, aminooksi grupu, hidrazidnu grupu, hidrazinsku grupu, semikarbazidnu grupu, azidnu grupu, ili alkinsku grupu. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonilnu komponentu i povezana je sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom ili komponentom koja produžava poluživot koja sadrži aminooksi, hidrazinsku, hidrazidnu ili semikarbazidnu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina sadrži aminooksi, hidrazinsku, hidrazidnu ili semikarbazidnu komponentu koja je povezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko amidne veze. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina sadrži alkinsku komponentu koja je povezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko azidne komponente. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina sadrži azidnu komponentu koja je povezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot koja sadrži alkinsku komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina sadrži azidnu ili alkinsku komponentu koja je povezana sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko amidne veze. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina povezana je sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko oksimske veze. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina povezana je sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko oksimske veze, pri čemu pomenuta oksimska veza ima strukturu koja je rezultat reakcije karbonilne grupe i aminooksi grupe. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuta najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina povezana je sa linkerom, polimerom, biološki aktivnim molekulom, ili komponentom koja produžava poluživot preko oksimske veze, pri čemu pomenuta oksimska veza ima strukturu koja je rezultat reakcije karbonilne grupe sadržane u pomenutoj neprirodno kodiranoj aminokiselini i aminooksi grupe sadržane u pomenutom linkeru, polimeru, biološki aktivnom molekulu, ili komponenti koja produžava poluživot.

[0138] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde poseduje najmanje jednu biološku aktivnost divljeg tipa humanog FGF-21 polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde poseduje najmanje jedno od povećane termičke stabilnosti, smanjene agregacije, smanjene in vivo proteolize, smanjene deamidacije, i povećane rastvorljivosti u poređenju sa FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije ili FGF-21 polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO: 201, ili u poređenju sa istim modifikovanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije i zamenskog peptida. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde poseduje najmanje jedno od povećane termičke stabilnosti, smanjene agregacije, smanjene in vivo proteolize, smanjene deamidacije, i povećane rastvorljivosti u poređenju sa pegilisanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije, nepegilisanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije, FGF-21 polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, nepegilisanim FGF-21 polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 201, pegilisanom SEQ ID NO: 201, ili u poređenju sa istim modifikovanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije i zamenskog peptida.

[0139] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa pegilisanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa nepegilisanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa FGF-21 polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa SEQ ID NO: 201. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa pegilisanim SEQ ID NO: 201. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može se uporediti sa istim modifikovanim FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije i zamenskog peptida.

[0140] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde ispoljava povećanje središnje tačke tranzicije (temperatura topljenja, Tm) od između 2 °C i 12 °C, između 2 °C i 10 °C, između 2 °C i 8 °C, između 4 °C i 8 °C, između 4 °C i 10 °C, između 4 °C i 12 °C, ili između 6 °C i 8 °C u poređenju sa nemodifikovanim FGF-21 polipeptidom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO: 201 ili FGF-21 polipeptidom bez pomenute interne delecije.

[0141] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211, 212, 219, 220, 221, 222, ili 223. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211, 212, 219, 220, 221, 222, ili 223. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 98% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 202, 205, 206, 210, 211, 212, 219, 220, 221, 222, ili 223. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 98% identičnosti sa polipeptidom sa SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202, pri čemu pAF u SEQ ID NO:202 može biti vezan za poli(etilen glikol). U nekim tehničkim rešenjima, poli(etilen glikol) može imati prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa.

[0142] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima N-terminalni metionin (koji može biti prisutan posle ekspresije u nekim sistemima, kao što je E. coli). U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji nema N-terminalni metionin, na primer kao rezultat obrade kojom se uklanja signalni peptid koji sadrži N-terminalni metionin, npr. u ekspresionom sistemu baziranom na sisarskim ćelijama. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može uključivati bilo koju od sekvenci ili njihovih varijanti stavljenih ovde na uvid javnosti, ali izostavljajući N-terminalni metionin, npr., bilo koju od SEQ ID NO:101-132, 201-202, 205-206, 210-212, 219-223, ili bilo koju od njihovih varijantnih, modifikovanih ili fuzionih formi opisanih ovde, sa izostavljenim ili odsutnim N-terminalnim metioninom. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može uključivati bilo koju od sekvenci ili njihovih varijanti stavljenih na uvid javnosti ovde, npr., bilo koju od SEQ ID NO:401-487 ili bilo koju od njihovih varijantnih, modifikovanih ili fuzionih formi opisanih ovde, sa N-terminalnim metioninom dodatim ili prisutnim. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202 bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202 (opciono bez N-terminalnog metionina), pri čemu je pAF u SEQ ID NO:202 vezan za poli(etilen glikol) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa.

[0143] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102 bez N-terminalnog metionina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102 bez N-terminalnog metionina i Fc domena ili njegovog fragmenta. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102 i Fc domen ili njegov fragment. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati SEQ ID NO:475.

[0144] U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde. U nekim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđen ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde. U nekim tehničkim rešenjima, ovde je obezbeđena ćelija-domaćin koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde. U nekim tehničkim rešenjima, ćelija-domaćin je ćelija sisara, kao što je CHO ili HEK. U nekim tehničkim rešenjima, ćelija-domaćin je bakterija, kao što je E. coli. U nekim tehničkim rešenjima, ćelija-domaćin je kvasac, kao što je Saccharomyces cerevisiae. U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje postupak proizvodnje modifikovanog FGF-21 polipeptida, koji uključuje kultivisanje ćelije-domaćina opisane ovde i izolaciju pomenutog modifikovanog FGF-21 polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje postupak proizvodnje modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina kodirana je selektorskim kodonom. U nekim tehničkim rešenjima, postupak uključuje kultivisanje ćelije-domaćina opisane ovde pri čemu pomenuta ćelija-domaćin sadrži ortogonalnu tRNK koja prepoznaje pomenuti selektorski kodon i uvodi pomenutu neprorodno kodiranu aminokiselinu u pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid, i izolovanje pomenutog modifikovanog FGF-21 polipeptida.

[0145] U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202, pri čemu pAF u SEQ ID NO:202 može biti vezan za poli(etilen glikol), i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U nekim tehničkim rešenjima poli(etilen glikol) ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa.

[0146] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 102 bez N-terminalnog metionina, fuzionisan sa Fc domenom ili njegovim fragmentom, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži SEQ ID NO:475 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0147] U nekim tehničkim rešenjima, objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens i najmanje jedno drugo aktivno sredstvo. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo je antidijabetično sredstvo, sredstvo za kontrolu holesterola, antizapaljensko sredstvo, sredstvo protiv gojaznosti, antihipertenzivno sredstvo, ili antifibrozno sredstvo. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo je GLP-1 agonist ili insulin. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo je brzodejstvujući, kratkodejstvujući, regularnodejstvujući, intermedijarnodejstvujući, ili dugodejstvujući insulin, Humalog, Lispro, Novolog, Apidra, Humulin, Aspart, humani insulin, NPH, Lente, Ultralente, Lantus, Glargine, Levemir, Detemirm; eksenatid (Byetta/Bydureon), liraglutid (Victoza), liksisenatid (Lyxumia), albiglutid (Tanzeum), eksenatid sa produženim oslobađanjem (LAR), taspoglutid, albiglutid, LY2189265 (Dulaglutide); orlistat (Xenical), inhibitor pankreasne lipaze, naltrekson, fentermin, topiramat (Qsymia), lorkaserin (Belviq), naltrekson i bupropion (Contravene), rimonabant (Acomplia), antagonist kanabinoidnog receptora, sibutramin (Meridia), lorkaserin, rimonabant, pramlintid, fentermin, topiramat, bupropion, ili glukomanan.

[0148] U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak regulisanja najmanje jednog od homeostaze glukoze i lipida, preuzimanja glukoze, ekspresije GLUT 1, i/ili koncentracije glukoze, triglicerida, insulina ili glukagona u serumu, kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak povećanja insulinske senzitivnosti, povećanja nivoa adiponektina, smanjenja nivoa glukoze u krvi, smanjenja nivoa glukagona, smanjenja nivoa triglicerida, smanjenja nivoa fruktozamina, smanjenja nivoa holesterola male gustine, ili smanjenja nivoa C-reaktivnog proteina kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak lečenja stanja ili poremećaja odabranog između gojaznosti, dijabetesa, pankreatitisa, insulinske rezistencije, hiperinsulinemije, intolerancije na glukozu, hiperglikemije, metaboličkog sindroma, oštećene tolerancije glukoze, neadekvatnog klirensa glukoze, visoke glukoze u krvi, i Prader-Willi sindroma kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak lečenja stanja ili poremećaja vezanog za insulin odabranog između insulinske rezistencije tipa A, insulinske rezistencije tipa C (poznata i kao HAIR-AN sindrom), Rabson-Mendenhall-ovog sindroma, Donohue-ovog sindroma ili leprešonizma, hiperandrogenizma, hirzuitizma, ili acanthosis nigricans kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak lečenja dijabetesa tipa 1 ili dijabetesa tipa 2 kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti. U nekim tehničkim rešenjima objava obezbeđuje postupak lečenja gojaznosti kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ovde stavljenog na uvid javnosti ili kompozicije ovde stavljene na uvid javnosti.

[0149] U sledećem tehničkom rešenju objave, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom koji obuhvata administriranje pacijentu koji ima potrebu za istim efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida ili kompozcije koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid kako je ovde opisano. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može uticati na organe ili tkiva kao što su pankreas, pluća, srce,bubreg, jetra, oči, nervni sistem, kostna srž, limfni čvorovi, endomiokard, i/ili retroperitoneum. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti fibroza jetre ili preciroza. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti odabrana između: nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), ciroze, difuzne bolesti plućnog parenhima, cistične fibroze, plućne fibroze, progresivne masivne fibroze, idiopatske plućne fibroze, injekcione fibroze, renalne fibroze, hronične bolesti bubrega, dijabetične bolesti bubrega, fokusne segmentalne glomeruloskleroze, membranske nefropatije, IgA nefropatije, mijelofibroze, srčane insuficijencije, metaboličke srčane insuficijencije, srčane fibroze, kataraktne fibroze, katarakte, ožiljaka na oku, pankreasne fibroze, fibroze kože, crevne fibroze, striktura creva, endomiokardijalne fibroze, atrijalne fibroze, fibroze medijastinuma, Crohn-ove bolesti, retroperitonealne fibroze, keloida, nefrogene sistemske fibroze, skleroderme, sistemske skleroze, artrofibroze, Peyronie sindroma, Dupuytren-ove kontrakture, dijabetične neuropatije, adhezivnog kapsulitisa, alkoholne bolesti jetre, hepatosteatoze, virusnog hepatitisa, bilijarne bolesti, primarne hemohromatoze, ciroze povezane sa uzimanjem lekova, kriptogene ciroze, Wilson-ove bolesti, i, deficijencije alfa 1-antitripsina, intersticijalne bolesti pluća (ILD), fibrozne bolesti pluća kod ljudi, fibroze jetre, makularne degeneracije, retinalne retinopatije, vitrealne retinopatije, miokardijalne fibroze, Graves-ove oftalmopatije, ergotizma indukovanog lekovima, kardiovaskularne bolesti, ateroskleroze/restenoze, hipertrofičnih ožiljaka, primarne ili idiopatske mijelofibroze, i zapaljenske bolesti creva (uključujući, ali ne ograničavajući se na kolagenski kolitis). U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom rezultat je jednog ili više od bolesti pluća, kancera pluća, terapije lekovima, hemioterapije, ili radijacione terapije. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom rezultat je jednog ili više od starenja, srčanog udara, moždanog udara, oštećenja srca, ili disfunkcije leve komore. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti odabran između renalne fibroze, glomerularnog nefritisa, hronične bolesti bubrega, hronične bubrežne insuficijencije, i nefritisa udruženog sa sistemskim lupusom, kancerom, fizičkim opstrukcijama, toksinima, metaboličkim oboljenjem, imunološkim oboljenjima, ili dijabetičkom nefropatijom. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom rezultat je jednog ili više od traume, povrede kičme, infekcije, ishemične povrede, srčanog napada, opekotina, izlaganja sredinskim zagađivačima, pneumonije, tuberkuloze, ili sindroma akutnog respiratornog distresa. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može se odabrati između plućne fibroze, intersticijalne bolesti pluća, humane fibrozne bolesti pluća, idiopatske plućne fibroze, fibroze jetre, srčane fibroze, fibroze miokarda, makularne degeneracije, retinalne retinopatije, vitrealne retinopatije, Graves-ove oftalmopatije, ergotizma indukovanog lekovima, kardiovaskularne bolesti, ateroskleroze/restenoze, keloida i hipertrofičnih ožiljaka, primarne ili idiopatske mijelofibroze, zapaljenske bolesti creva, kolagenskog kolitisa, ožiljaka na očima i kataraktne fibroze. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti odabrana između NASH, fibroze jetre, i ciroze. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti NASH. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može se odabrati između dijabetičke bolesti bubrega, hronične bolesti bubrega, i renalne fibroze. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može se odabrati između metaboličke srčane insuficijencije i srčane fibroze. U nekim tehničkim rešenjima, bolest udružena sa fibrozom može biti fibroza pluća.

[0150] U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja fibroze jetre ili ciroze kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde.

[0151] U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak smanjenja frakcije hepatične masnoće kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde, pri čemu je opciono pomenuti pacijent pod rizikom da razvije ili da mu se dijagnostikuje NASH. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak smanjenja krutosti jetre, smanjenja procenta telesne masti, smanjenja telesne težine, smanjenja odnosa težine jetre prema težini tela, smanjenja lipidnog sadržaja u jetri, smanjenja područja fibroze jetre, smanjenja nivoa glukoze u krvi u gladovanju, triglicerida u gladovanju, smanjenja LDL holesterola, smanjenja ApoB, smanjenja ApoC, i/ili povećanja HDL holesterola kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde, pri čemu je opciono pomenuti pacijent pod rizikom da razvije ili da mu se dijagnostikuje NASH. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak povećanja nivoa adiponektina kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde, pri čemu je opciono pomenuti pacijent pod rizikom da razvije ili da mu se dijagnostikuje NASH. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja jednog ili više simptoma udruženih sa NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde.

[0152] Ovde su stavljeni na uvid javnosti postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 202. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 202. Ovde su stavljeni na uvid javnosti i postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 202, pri čemu je njegova pAF rezidua vezana za poli(etilen glikolnu) komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti poli(etilen glikol) ima molekulsku masu između oko 0.1 kDa i 100 kDa, ili između oko 20 kDa i oko 40kDa, ili oko 30kDa. U nekim tehničkim rešenjima, pomenuti poli(etilen glikol) ima molekulsku masu od oko 30kDa.

[0153] Ovde su stavljeni na uvid javnosti postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 102. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 102. Ovde su stavljeni na uvid javnosti i postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži (a) SEQ ID NO: 102 bez N-terminalnog Met, ili (b) SEQ ID NO: 102.

[0154] Ovde su stavljeni na uvid javnosti postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 475. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 475. Ovde su stavljeni na uvid javnosti postupci lečenja ili prevencije NASH kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu koji ima potrebe za istim terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 475.

[0155] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, pacijent ispoljava NASH CRN stadijum 1-3 fibroze, koji je opciono NASH CRN stadijum 1-3 fibroza određen biopsijom jetre. U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, pre lečenja pacijent može ispoljiti indeks masne jetre od najmanje oko 60. U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, pre lečenja pacijent može ispoljiti procenat frakcije masti u jetri od najmanje 10%, što je opciono određeno dobijanjem slike magnetnom rezonancom.

[0156] U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja srčane insuficijencije ili srčane fibroze kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja bubrežne ili renalne fibroze kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde. U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja fibroze pluća kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvata administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji je ovde opisan ili kompozicije opisane ovde.

[0157] U nekim tehničkim rešenjima predmetna objava obezbeđuje postupke lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom kod pacijenta koji ima potrebu za istim, koji obuhvataju administriranje pacijentu efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži jednu ili više neprirodno kodiranih aminokiselina, pri čemu pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid poseduje najmanje 90% ili 95% identičnosti sa humanim FGF-21 polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 1-7 i 201, pri čemu je pomenuto oboljenje udruženo sa fibrozom odabrano između NASH, fibroze jetre, dijabetične bolesti bubrega, hronične bolesti bubrega, renalne fibroze, plućne fibroze, srčane fibroze, srčane insuficijencije, i metaboličke srčane insuficijencije.

[0158] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid poseduje najmanje 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa humanim FGF-21 polipeptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NO: 1-7 i 201.

[0159] Prema prvom aspektu pronalaska modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže polipeptid sa SEQ ID NO:201 su za upotrebu u postupku lečenja bolesti udružene sa fibrozom, odabrane od bezalkoholnog steatohepatitisa (NASH), fibroze jetre, i ciroze kod pacijenta, pri čemu je njegova para-acetil-fenilalaninska rezidua vezana za poli(etilen glikol), koji opciono ima molekulsku masu između 1 i 100 kDa ili oko 30 kDa.

[0160] U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131, ili 146 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 77, 91, ili 131 u SEQ ID NO:1.

[0161] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina može sadržati fenilalaninski analog ili derivat. Prema pronalasku, neprirodno kodirana aminokiselina je paraacetil-L-fenilalanin. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina može sadržati para-acetil-L-fenilalanin i može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1.

[0162] U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za poli(etilen glikolnu) (PEG) ili monometoksi PEG (mPEG) komponentu koja ima prosečnu molekulsku masu između oko 0.1kDa i oko 100 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za poli(etilen glikolnu) ili monometoksi PEG (mPEG) komponentu koja ima prosečnu molekulsku masu: i) između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa; ii) između oko 1 kDa i 50 kDa; iii) između oko 10 kDa i 40 kDa; iv) između oko 20 kDa i 30 kDa; v) između oko 0.050 kDa i oko 100 kDa; ili vi) od oko 100 kDa, 95 kDa, 90 kDa, 85 kDa, 80 kDa, 75 kDa, 70 kDa, 65 kDa, 60 kDa, 55 kDa, 50 kDa, 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, ili 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za poli(etilen glikol) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa.

[0163] U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti vezana za linker, polimer, biološki aktivni molekul, ili komponentu koja produžava poluživot preko oksimske veze. U nekim tehničkim rešenjima, oksimska veza ima strukturu koja je rezultat reakcije karbonilne grupe i aminooksi grupe.

[0164] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF 21 polipeptid može posedovati najmanje jednu biološku aktivnost divljeg tipa humanog FGF 21 polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili drugog FGF-21 polipeptida.

[0165] U nekim tehničkim rešenjima, postupak može dodatno uljučivati primenu najmanje jednog drugog aktivnog sredstva kod pomenutog pacijenta, pri čemu pomenuto dodatno aktivno sredstvo može biti sadržano u istoj kompoziciji kao pomenuti modifikovani FGF-21 polipeptid ili se može administrirati odvojeno. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo može se odabrati između antifibroznih sredstava, N-kadherinskog antagonista, anti-N kadherinskog antitela, N-kadherinskog antagonista malog molekula, antagonističkog N-kadherinskog fragmenta, antizapaljenskih sredstava, hepatoprotektivnih sredstava koja suprimiraju sistem renin-angiotenzin (RAS), probiotika, i polinezasićenih masnih kiselina (PUFA). U nekim tehničkim rešenjima, anitofibrotičko sredstvo može da se izabere između nintedaniba, Pirfenidona, LPA1 antagonista, LPA1 receptorskih antagonista, GLP1 analoga, tralokinumaba (IL-13, AstraZeneca), vismodegiba ("hedgehog" antagonista, Roche), PRM-151 (pentraksin-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (bispecifično Mab IL-4&IL-13, Sanofi), simtuzumaba (anti-lizil oksidaza-slično 2 (anti-LOXL2) antitelo, Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inh./pentoksifilin/NAC oralno kontrol. oslobađanje, Pacific Ther.), omipalisiba (oralni PI3K/mTOR inhibitor, GSK), IW-001 (oralni rast. goveđi tip V kolagen mod., ImmuneWorks), STX-100 (integrin alfa V/ beta-6 ant, Stromedix/ Biogen), Actimmune (IFN gama), PC-SOD (midismaza; inhalaciono, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumaba (anti-IL-13 SC humanizovano mAb, Roche), AQX-1125 (SHIP1 aktivator, Aquinox), CC-539 (JNK inhibitor, Celgene), FG-3019 (FibroGen), i SAR-100842 (Sanofi). U nekim tehničkim rešenjima, hepatoprotektivno sredstvo može biti ursodeoksiholna kiselina (UDCA) ili obetiholna kiselina (OCA ili INT-747, Intercept).

[0166] U nekim tehničkim rešenjima, predmetna objava obezbeđuje kompoziciju koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid prilagođen za upotrebu u postupku lečenja bolesti udružene sa fibrozom kako je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U nekim tehničkim rešenjima, kompozicija može sadržati još i najmanje jedno drugo aktivno sredstvo. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo može biti odabrano između antifibroznih sredstava, Pirfenidona, N-kadherinskog antagonista, anti-N kadherinskog antitela, N-kadherinskog antagonista malog molekula, antagonističkog N-kadherinskog fragmenta, antizapaljenskih sredstava, hepatoprotektivnih sredstava kao što su ursodeoksiholina kiselina (UDCA), obetiholna kiselina (OCA ili INT-747, Intercept), koja suprimiraju renin-angiotenzin sistem (RAS), probiotika i polinezasićenih masnih kiselina (PUFA).

[0167] U nekim tehničkim rešenjima predmetna objava obezbeđuje postupak lečenja medicinski komplikovane gojaznosti koji obuhvata administriranje pacijentu kojem je to potrebo efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida prema opisanom ovde ili kompozicije koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid kako je ovde opisano. U nekim tehničkim rešenjima medicinski komplikovana gojaznost može biti udružena sa Prader-Willi-jevim sindromom.

[0168] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti ili kompozicija koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens mogu se administrirati oralno, površinski, ili injekcijom. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija mogu se administrirati subkutanom injekcijom, IV injekcijom, intraperitonealnom injekcijom, intramuskularnom injekcijom.

[0169] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom na dan, ili manje često nego oko jednom na dan. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti primenjuju se sa učestalošću od oko dva puta nedeljno, ili manje često nego oko dva puta nedeljno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti primenjuju se sa učestalošću od oko jednom nedeljno, ili manje često nego oko dva puta nedeljno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom na dve nedelje, ili manje često nego oko dva puta nedeljno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom na tri nedelje, ili manje često nego oko dva puta nedeljno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom mesečno, ili manje često nego oko jednom mesečno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od jednom na četiri nedelje. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom dnevno. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija ovde stavljeni na uvid javnosti administriraju se sa učestalošću od oko jednom nedeljno.

[0170] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti može se administrirati u količini između oko 0.01 mg i oko 500 mg po dozi, između oko 0.1 mg i oko 200 mg po dozi, između oko 0.2 mg i oko 100 mg po dozi, između oko 0.5 mg i oko 80 mg po dozi, između oko 1 mg i oko 60 mg po dozi, između oko 5 mg i oko 40 mg po dozi, između oko 10 mg i oko 30 mg po dozi, između oko 10 mg i oko 20 mg po dozi, između oko 0.2 mg i oko 1 mg po dozi, između oko 1 mg i oko 2 mg po dozi, između oko 2 mg i oko 4 mg po dozi, između oko 4 mg i oko 6 mg po dozi, između oko 6 mg i oko 10 mg po dozi, između oko 10 mg i oko 20 mg po dozi, između oko 20 mg i oko 40 mg po dozi, između oko 40 mg i oko 60 mg po dozi, između oko 60 mg i oko 80 mg po dozi, između oko 80 mg i oko 100 mg po dozi, između oko 100 mg i oko 120 mg po dozi, između oko 120 mg i oko 140 mg po dozi, između oko 140 mg i oko 160 mg po dozi, između oko 160 mg i oko 180 mg po dozi, između oko 180 mg i oko 200 mg po dozi, ili između oko 200 mg i oko 240 mg po dozi.

[0171] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti može se administrirati u količini odabranoj od oko 0.2 mg, oko 0.6 mg, oko 1 mg, oko 2 mg, oko 4 mg, oko 6 mg, oko 8 mg, oko 10 mg, oko 20 mg, oko 40 mg, oko 60 mg, oko 80 mg, oko 100 mg, oko 120 mg, oko 140 mg, oko 160 mg, oko 180 mg, i oko 200 mg po dozi. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti može se administrirati u količini odabranoj između oko 0.2 mg, oko 0.6 mg, oko 2 mg, oko 6 mg, oko 20 mg, oko 40 mg, i oko 60 mg po dozi.

[0172] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ili kompozicija koja sadrži modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens mogu se koadministrirati, ili administrirati odvojeno (istovremeno ili sekvencijalno) sa najmanje jednim drugim aktivnim sredstvom. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo bira se između antidijabetičkih sredstava, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za kontrolu holesterola, antizapaljenskih sredstava, i antihipertenzivnih sredstava.

[0173] U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo bira se između statina, GLP-1 agonista, i insulina. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedno drugo aktivno sredstvo bira se između amilina, analoga amilina, inhibitora alfa-glukozidaze kao što je miglitol, akarboze, vogliboze, metformina, biguanida, glitazona kao što su rosiglitazon, pioglitazon, troglitazon, sekretagoge kao što je eksenatid, liraglutid, taspoglutid ili liksisenatid, glikozurika, inhibitora dipeptidil peptidaze-4, insulina, brzodejstvujućeg, kratkodejstvujućeg, regularnodejstvujućeg, intermedijarnodejstvujućeg, ili dugodejstvujućeg insulina, Humaloga, Lisproa, Novologa, Apidre, Humulina, Asparta, humanog insulina, NPH, Lente, Ultralente, Lantusa, Glargina, Levemira, Detemira, Atorvastatina, Cerivastatina, Fluvastatina, Lovastatina, Mevastatina, Pitavastatina, Pravastatina, Rosuvastatina, Simvastatina Vytorina, Advicora, Besylate Cadueta, Simcora, orlistata (Xenical), inhibitora pankreasne lipaze, naltreksona, fentermina i topiramata (Qsymia), lorkaserina (Belviq), naltreksona, bupropiona (Contravene), rimonabanta (Acomplia), antagonista kanabinoidnog receptora, sibutramina (Meridia), lorkaserina, rimonabanta, eksenatida, pramlintida, fentermina, topiramata, stabilizatora raspoloženja, bupropiona, glukomanana, guarove gume, Dexedrina, digoksina, anorektičkog leka, leka protiv gojaznosti, eksenatida (ByettalBydureon), liraglutida (Victoza), liksisenatida (Lyxumia), albiglutida (Tanzeum), eksenatida sa produženim oslobađanjem (LAR), taspoglutida, albiglutida, i LY2189265 (Dulaglutide).

[0174] Pogodno, modifikovana FGF-21 jedinjenja opisana ovde mogu povećati efikasnost omogućavanjem dužeg poluživota u cirkulaciji zahtevajući manji broj doza, čime se povećava pogodnost za subjekta kojem je takva terapija potrebna i verovatnoća da subjekt bude saradljiv u vezi sa zahtevima doziranja.

[0175] Metabolički sindrom se tipično dijagnostikuje kod pacijenata koji ispoljavaju najmanje tri od sledećih znakova: abdominalna mast - kod većine muškaraca, obim struka 40 inča ili više; visok šećer u krvi - najmanje 110 miligrama po decilitru (mg/dL) posle gladovanja; visoki trigliceridi najmanje 150 mg/dL u krvnom toku; niski HDL - manje od 40 mg/dL; i krvni pritisak od 130/85 ili viši.

[0176] Predmetni postupci mogu biti efikasni za lečenje ili odlaganje pojave dijabetesa tipa II i/ili gojaznosti kod pacijenta koji ima potrebu za istim. Pomenuti pacijent može imati dijagnozu predijabetesa ili može ispoljavati jedan ili više faktora rizika za razvoj dijabetesa tipa II, kao što su porodična istorija dijabetesa tipa II; jedan ili više od roditelja ili braće i sestara sa prethodnom dijagnozom dijabetesa tipa II; dislipidemija; nivo ukupnih triglicerida u krvi najmanje 200 mg/dL; nivo lipoproteina velike gustine u krvi manji od 35 mg/dL; gojaznost; indeks telesne mase veći od 25 kg/m2; istorija gestacionog dijabetesa; prethodno rađanje deteta sa težinom na rođenju većom od 9 lbs.; hipertenzija; sistolni krvni pritisak najmanje 140 mmHg; dijastolni krvni pritisak najmanje 90 mmHg; prethodno izmerena glukoza u krvi u gladovanju najmanje 99 mg/dL; vaskularno oboljenje; sindrom policističnih ovarijuma; ili acanthosis nigricans.

[0177] Pacijent može ispoljiti jedan ili više simptoma predijabetesa kao što su nivo glukoze u krvi u gladovanju između 100 mg/dL i 125 mg/dl; nivo šećera u krvi između 140 mg/dL i 199 mg/dL dva sata posle ingestije 75 grama rastvora glukoze ili rastvora glukoze od 1.75 grama glukoze po kilogramu telesne težine, do maksimalne doze od 75 grama; i/ili glikovani hemoglobin između 5.7 procenata i 6.4 procenta.

[0178] Pacijent može ispoljiti jedan ili više simptoma dijabetesa, kao što su nivo glukoze u krvi u gladovanju preko 125 mg/dl; nivo šećera u krvi najmanje 200 mg/dL dva sata posle ingestije 75 grama rastvora glukoze ili rastvora glukoze od 1.75 grama glukoze po kilogramu telesne težine, do maksimalne doze od 75 grama; i/ili glikovani hemoglobin od najmanje 6.5 procenata.

[0179] Pacijent može imati dijagnozu dijabetesa tipa II.

[0180] Pacijent može da ne odgovara na lečenje najmanje jednim jedinjenjem odabranim iz grupe koju čine: GLP-1, eksenatid-1, eksendin, eksendinski analog, eksendinski agonist, liraglutid, liksisenatid, albiglutid, eksenatid LAR, DPP-4 inhibitor, agonist GLP-1 receptora, i drugi agonist GLP-1; ili takva jedinjenja mogu biti kontraindikovana za administriranje pacijentu.

[0181] Postupci mogu uključivati još i administriranje pomenutom pacijentu antidijabetičkog sredstva ili sredstva protiv gojaznosti pored pomenutog modifikovanog FGF-21 polipeptida. Pomenuto antidijabetičko sredstvo ili sredstvo protiv gojaznosti može uključivati jedno ili više od amilina, amilinskog agonista, sulfonilurea, kalcitonina, glukagona, agonista PPAR-gama, GPL-1 receptorskih agonista, inhibitora dipeptidil peptidaze IV, analoga amilina, biguanida, agonista dopaminskog D2 receptora, meglitinida, inhibitora alfa-glukozidaze, antidislipidemijskih sekvestranata žučne kiseline, eksendina, eksendinskog analoga, eksendinskog agonista, gastričnog inhibitornog peptida (GIP), inkretinskog peptida, insulina, SGLT2 inhibitora, inhibitora reapsorpcije glukoze, fenofibrata, fibrata, antigrelinskog antitela ili fragmenta antitela, receptora za faktor rasta fibroblasta (FGFR)-1(IIIb), FGFR-1(IIIc), antitela ili fragmenta antitela, i/ili FGFR-4(IIIc), anti-CD38 antitela ili fragmenta antitela, anti-MIC-1 antitela, ili MIC-1 vezujućeg fragmenta, metformina ili kombinaciju bilo kojih od napred navedenih.

[0182] U primeru tehničkog rešenja objave, pomenuto antidijabetičko sredstvo može biti metformin, insulin glargin kao Lantus (Sanofi), sitagliptin kao Januvia, insulin aspart kao NovoLog i NovoRapid (Novo Nordisk), insulin lispro kao Humalog (Eli Lilly), liraglutid kao Victoza (Novo Nordisk), insulin detemir kao Levemir (Novo Nordisk), sitagliptin u kombinaciji sa metforminom kao Janumet (Merck), rastvorljivi insulin aspart i protamin-kristalisani insulin aspart u odnosu 30/70 kao Novo Mix 30 (Novo Nordisk), ili pioglitazon kao Actos (Takeda).

[0183] Postupak može biti efikasan u izazivanju gubitka težine.

[0184] Antidijabetička sredstva upotrebljena u kombinaciji sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima predmetne objave uključuju, ali se ne ograničavaju na insulinske sekretagoge ili insulinske senzitizere, MGAT2 inhibitore, ili druga antidijabetička sredstva. Ova sredstva uključuju, ali se ne ograničavaju na inhibitore dipeptidil peptidaze IV (DP4) (na primer, sitagliptin, saksagliptin, alogliptin, vildagliptin i slično), biguanide (na primer, metformin, fenformin i slično), sulfonil uree (na primer, gliburid, glimepirid, glipizid i slično), inhibitore glukozidaze (na primer, akarboza, miglitol, i slično), PPARγ agoniste kao što su tiazolidindioni (na primer, rosiglitazon, pioglitazon, i slično), PPAR α/γ dvojne agoniste (na primer, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar, i slično), aktivatore glukokinaze (kako je opisano u Fyfe, M.C.T. i sarad., Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)), modulatore GPR40 receptora, modulatore GPR119 receptora (MBX-2952, PSN821, APD597 i slično), SGLT2 inhibitore (dapagliflozin, kanagliflozin, remagliflozin i slično), analoge amilina kao pramlintid, i/ili insulin. Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog pronalaska mogu opciono da se koriste i u kombinaciji sa sredstvima za lečenje komplikacija dijabetesa. Ova sredstva uključuju PKC inhibitore i/ili AGE inhibitore.

[0185] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog pronalaska mogu takođe opciono da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više hipofagičnih sredstava kao što su dietilpropion, fendimetrazin, fentermin, orlistat, sibutramin, lorkaserin, pramlintid, topiramat, antagonisti MCHR1 receptora, oksintomodulin, naltrekson, amilinski peptid, modulatori NPY Y5 receptora, modulatori NPY Y2 receptora, modulatori NPY Y4 receptora, cetilistat, modulatori 5HT2c receptora, i slično. Modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa agonistom receptora za glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1R), kao što su eksenatid, liraglutid, GPR-1(1-36) amid, GLP-1(7-36) amid, GLP-1(7-37) (kako je stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu br. 5,614,492 za Habenera), koji mogu da se administriraju injekcijom, intranazalno, ili transdermalnim ili bukalnim uređajima.

[0186] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog pronalaska mogu takođe opciono da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više drugih tipova terapijskih sredstava, kao što su inhibitori DGAT, lekovi za snižavanje LDL kao što su statini (inhibitori HMG CoA reduktaze) ili inhibitori apsorpcije holesterola, modulatori PCSK9, lekovi koji povećavaju HDL kao što su inhibitori CETP.

[0187] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirane aminokiseline mogu biti vezane za polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi sadrži poli(etilen glikolnu) komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina je vezana sa polimerom rastvorljivim u vodi linkerom ili je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, poli(etilen glikolni) molekul je bifunkcionalni polimer. U nekim tehničkim rešenjima, bifunkcionalni polimer je vezan sa drugim polipeptidom. U nekim tehničkim rešenjima, drugi polipeptid je nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0188] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje dve neprirodno kodirane aminokiseline vezane za polimer rastvorljiv u vodi koji sadrži poli(etilen glikolnu) komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je na jednu ili više od sledećih pozicija u modifikovanom FGF-21: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (tj., na karboksilnom terminusu proteina) (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je na jednoj ili više od sledećih pozicija u modifikovanom FGF-21: 10, 52, 117, 126, 131, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108, i 110 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je na jednoj ili više od sledećih pozicija u modifikovanom FGF-21: 10, 52, 77, 117, 126, 131, 162 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je na jednoj ili više od sledećih pozicija u modifikovanom FGF-21: 87, 77, 83, 72 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je na jednoj ili više od sledećih pozicija u modifikovanom FGF-21: 69, 79, 91, 96, 108, i 110 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina inkorporisano je u lidersku ili signalnu sekvencu SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, ili drugu nemodifikovanu ili modifikovanu FGF-21 sekvencu. U nekim tehničkim rešenjima, liderske sekvence mogu se odabrati između SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, ili 44. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 sekrecioni konstrukti klonirani su u pVK7ara (Nde/Eco) sa liderskom sekvencom odabranom između SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, ili 44.

[0189] U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više od ovih pozicija vezana je za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na pozicije: pre poziciji 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (tj., na karboksilnom terminusu proteina) (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više pozicija počevši od pozicije pre 1 (tj. na N-terminusu) do C terminusa u SEQ ID NO: 34-36 vezana je za polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više od ovih pozicija vezana je za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na pozicije: 10, 52, 117, 126, 131, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108, i 110 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više od ovih pozicija vezana je za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na pozicije: 10, 52, 77, 117, 126, 131, 162 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više od ovih pozicija vezana je za polimer rastvorljiv u vodi: 87, 77, 83, 72 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina koja se ne sreće prirodno, na jednoj ili više od ovih pozicija vezana je za polimer rastvorljiv u vodi: 69, 79, 91, 96, 108, i 110 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselina koje se ne sreću prirodno, u liderskoj ili signalnoj sekvenci SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ili drugoj modifikovanoj FGF-21 sekvenci vezane su za polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više aminokiselina koje se ne sreću prirodno, u liderskoj ili signalnoj sekvenci SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, ili drugoj modifikovanoj FGF-21 sekvenci vezane su za polimer rastvorljiv u vodi.

[0190] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše afinitet modifikovanog FGF-21 polipeptida za receptor za FGF-21 polipeptid ili vezujući partner, uključujući, ali ne ograničavajući se na protein, polipeptid, mali molekul, ili nukleinska kiselina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava stabilnost modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa stabilnošću odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja smanjuje imunogenost modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa imunogenošću odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava poluživot u serumu ili vreme u cirkulaciji modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa poluživotom u serumu ili vremenom u cirkulaciji odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0191] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja smanjuje deamidaciju modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa deamidacijom odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava rastvorljivost u vodi modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa rastvorljivošću u vodi odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava rastvorljivost modifikovanog FGF-21 polipeptida proizvedenog u ćeliji-domaćinu u poređenju sa rastvorljivošću odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava ekspresiju modifikovanog FGF-21 polipeptida u ćeliji-domaćinu ili povećava sintezu in vitro u poređenju sa ekspresijom ili sintezom odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. Modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži ovu supstituciju može zadržati agonističku aktivnost i zadržava ili poboljšava nivoe ekspresije u ćeliji-domaćinu. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava rezistenciju na proteazu ili smanjuje sečenje proteazom (kao što je sečenje C-terminalnih aminokiselina) modifikovanog FGF-21 polipeptida u poređenju sa rezistencijom na proteazu odgovarajućeg FGF-21 bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. Američki patent br. 6,716,626 ukazuje na to da potencijalna mesta koja mogu biti supstituisana da bi se izmenilo sečenje proteazom uključuju, ali se ne ograničavaju na monobazno mesto unutar 2 rezidue prolina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše aktivnost prenosa signala receptora za modifikovani FGF-21 u poređenju sa aktivnošću receptora posle interakcije sa odgovarajućim FGF-21 polipeptidom bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja moduliše njegovo vezivanje sa drugim molekulom kao što je receptor u poređenju sa vezivanjem odgovarajućeg FGF-21 polipeptida bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0192] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži najmanje jednu supstituciju, adiciju ili deleciju koja povećava kompatibilnost modifikovanog FGF-21 polipeptida sa farmaceutskim prezervansima (npr., m-krezol, fenol, benzil alkohol) u poređenju sa kompatibilnošću odgovarajućeg FGF-21 polipeptida bez najmanje jedne supstitucije, adicije ili delecije, ili kada se upoređuje sa komparatorskim jedinjenjem kao što je FGF-21 polipeptid sa SEQ ID NO: 1, 201, ili drugi nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid. Ova povećana kompatibilnost omogućila bi pripremanje prezervirane farmaceutske formulacije koja zadržava fizičko-hemijska scojstva i biološku aktivnost proteina tokom skladištenja. WO 2005/091944, razmatra sledeće primere FGF-21 muteina sa poboljšanom farmaceutskom stabilnošću: supstitucija naelektrisanom i/ili polarnom ali nenaelektrisanom aminokiselinom jedne od sledećih: glicin 42, glutamin 54, arginin 77, alanin 81, leucin 86, fenilalanin 88, lizin 122, histidin 125, arginin 126, prolin 130, arginin 131, leucin 139, alanin 145, leucin 146, izoleucin 152, alanin 154, glutamin 156, glicin 161, serin 163, glicin 170, ili serin 172 u SEQ ID NO: 1 iz WO 05/091944. Modifikovani FGF-21 polipeptid predmetne objave može uključivati najmanje jednu od ovih supstitucija na odgovarajućoj poziciji u polipeptidu i/ili može uključivati jednu ili više drugih supstitucija, adicija ili delecija. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodnih aminokiselina supstituišu na jednoj ili više od sledećih pozicija: glicin 42, glutamin 54, arginin 77, alanin 81, leucin 86, fenilalanin 88, lizin 122, histidin 125, arginin 126, prolin 130, arginin 131, leucin 139, alanin 145, prolin/leucin 146, izoleucin 152, alanin 154, glutamin 156, glicin 161, serin 163, glicin 170, serin 172 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više neprirodnih aminokiselina supstituišu na jednoj ili više od sledećih pozicija: glutamat 91, arginin 131, glutamin 108, arginin 77, arginin 72, histidin 87, leucin 86, arginin 126, glutamat 110, tirozin 83, prolin 146, arginin 135, arginin 96, arginin 36, (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7).

[0193] WO 05/091944 opisuje dodatne muteine FGF-21 sa poboljšanom farmaceutskom stabilnošću. Takvi muteini uključuju supstituciju cisteinom dve ili više od sledećih u FGF-21 (vidi SEQ ID NO: 1 iz WO 05/091944): arginin 19, tirozin 20, leucin 21, tirozin 22, treonin 23, aspartat 24, aspartat 25, alanin 26, glutamin 27, glutamin 28, alanin 31, leucin 33, izoleucin 35, leucin 37, valin 41, glicin 42, glicin 43, glutamat 50, glutamin 54, leucin 58, valin 62, leucin 66, glicin 67, lizin 69, arginin 72, fenilalanin 73, glutamin 76, arginin 77, aspartat 79, glicin 80, alanin 81, leucin 82, glicin 84, serin 85, prolin 90, alanin 92, serin 94, fenilalanin 95, leucin 100, aspartat 102, tirozin 104, tirozin 107, serin 109, glutamat 110, prolin 115, histidin 117, leucin 118, prolin 119, asparagin 121, lizin 122, serin 123, prolin 124, histidin 125, arginin 126, aspartat 127, alanin 129, prolin 130, glicin 132, alanin 134, arginin 135, leucin 137, prolin 138, ili leucin 139. Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetne objave mogu uključivati najmanje jednu od ovih supstitucija na odgovarajućim pozicijama u polipeptidu i/ili mogu uključivati jednu ili više drugih supstitucija, adicija, ili delecija.

[0194] WO 05/091944 dalje opisuje specifične muteine FGF-21 sa inženjerisanim disulfidnim vezama (aminokiseline supstituisane cisteinom), Pored one koja se prirodno sreće na Cys75Cys93, to su sledeće: G1n76Cys-Ser109Cys, Cys75-Ser85Cys, Cys75-Ala92Cys, Phe73Cys-Cys93, Ser123Cys-His125Cys, Asp102Cys-Tyr104Cys, Asp127Cys-Gly132Cys, Ser94Cys-Glu110Cys, Pro115Cys-His117Cys, Asn121Cys-Asp127Cys, Leu100Cys-Asp102Cys, Phe95Cys-Tyr107Cys, Arg19CysPro138Cys, Tyr20Cys-Leu139Cys, Tyr22Cys-Leu137Cys, Arg77Cys-Asp79Cys, Pro90Cys-Ala92Cys, Glu50Cys-Lys69Cys, Thr23Cys-Asp25Cys, Ala31Cys-Gly43Cys, Gln28Cys-Gly43Cys, Thr23Cys-Gln28Cys, Val41Cys-Leu82Cys, Leu58Cys-Val62Cys, Gln54Cys-Leu66Cys, Ile35Cys-Gly67Cys, Gly67Cys-Arg72Cys, Ile35Cys-Gly84Cys, Arg72Cys-Gly84Cys, ili Arg77Cys-Ala81Cys, gde je numerisanje bazirano na SEQ ID NO: 1 iz WO 05/091944. Dodatni muteini sa inženjerisanim disulfidnim vezama su Tyr22Cys-Leu139Cys; Asp24Cys-Arg135Cys; Leu118Cys-Gly132Cys; His117Cys-Pro130Cys; His117Cys-Ala129Cys; Leu82Cys-Pro119Cys; Gly80Cys-Ala129Cys; Gly43Cys-Pro124Cys; Gly42Cys-Arg126Cys; Gly42Cys-Pro124Cys; Gln28Cys-Pro124Cys; Gln27Cys-Ser123Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; ili Asp25Cys-Lys122Cys, gde je numerisanje bazirano na SEQ ID NO: 1 iz WO 05/091944. Dodatni muteini sa inženjerisanim disulfidnim vezama su Leu118Cys-Ala134Cys; Leu21Cys-Leu33Cys; Ala26Cys-Lys122Cys; Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys, gde je numerisanje bazirano na SEQ ID NO: 1 iz WO 05/091944. Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetne objave mogu uključivati jednu ili više od ovih supstitucija na odgovarajućoj poziciji(-ama) u polipeptidu i/ili mogu uključivati jednu ili više drugih supatitucija, adicija ili delecija.

[0195] WO 05/091944 opisuje dodatne muteine FGF-21 koji su PEGilisani. Ovi muteini imaju jednu ili više od sledećih supstitucija: D25C, D38C, L58C, K59C, P60C, K69C, D79C, H87C, E91C, E101C, D102C, L114C, L116C, K122C, R126C, P130C, P133C, P140C. WO 05/091944 opisuje cisteinske supstitucije na sledećim pozicijama: 19, 21, 26, 28, 29, 30, 36, 39, 42, 50, 56, 61, 64, 65, 68, 70, 71, 77, 81, 85, 86, 90, 92, 94, 98, 107, 108, 112, 113, 123, i 124. WO 0S/091944 naznačava cisteinske supstitucije na sledećim pozicijama: 24, 27, 37, 40, 44, 46, 49, 57, 88, 89, 106, 110, 111, 115, 120, i 139. WO 05/091944 takođe opisuje cisteinske supstitucije na sledećim pozicijama: 18, 45, 47, 48, 78, 83, 99, 103, 125, 128, 131, 132, i 138. WO 05/091944 takođe opisuje cisteinske supstitucije na sledećim pozicijama: 25, 38, 58, 59, 60, 69, 79, 87, 91, 101, 102, 114, 116, 122, 126, 130, 133, i 140.

[0196] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetne objave mogu uključivati jednu ili više od gore navedenih supstitucija na odgovarajućoj poziciji u polipeptidu i/ili mogu uključivati jednu ili više drugih supstitucija, adicija ili delecija. Ovde su obezbeđene i kompozicije koje sadrže modifikovani FGF-21 polipeptid prilagođen upotrebi u metodima opisanim ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens

[0197] U određenim tehničkim rešenjima objave, modifikovani FGF-21 polipeptid sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju. U određenim tehničkim rešenjima, posttranslaciona modifikacija napravljena je in vitro. U određenim tehničkim rešenjima, posttranslaciona modifikacija napravljena je in vivo u eukariotskoj ćeliji ili u neeukariotskoj ćeliji.

[0198] U određenim tehničkim rešenjima, protein uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koja je napravljena in vivo od strane jedne ćelije-domaćina, pri čemu posttranslacionu modifikaciju normalno ne pravi drugi tip ćelije-domaćina. U određenim tehničkim rešenjima, protein uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koja je napravljena in vivo od strane jedne eukariotske ćelije, pri čemu posttranslacionu modifikaciju normalno ne pravi neeukariotska ćelija. Primeri posttranslacionih modifikacija uključuju, ali se ne ograničavaju na glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, lipidnu modifikaciju, palmitoilaciju, adiciju palmitata, fosforilaciju, modifikaciju vezivanjem glikolipida, i slično. U određenim tehničkim rešenjima, protein ili polipeptid objave može sadržati sekrecionu ili lokalizacionu sekvencu, epitopsku oznaku, FLAG oznaku, polihistidinsku oznaku, GST fuziju, i/ili slično.

[0199] Objava takođe obezbeđuje u vodi rastvorljive i hidrolitički stabilne derivate PEG derivata i srodnih hidrofilnih polimera koji imaju jednu ili više acetilenskih ili azidnih komponenti. PEG polimerni derivati koji sadrže acetilenske komponente visoko su selektivni za kuplovanje sa azidnim komponentama koje su uvedene selektivno u proteine u odgovoru na selektorski kodon. Slično tome, derivati PEG polimera koji sadrže azidne komponente visoko su selektivni za kuplovanje sa acetilenskim komponentama koje su bile uvedene selektivno u proteine u odgovoru na selektorski kodon.

[0200] Specifičnije, azidne komponente uključuju, ali se ne ograničavaju na alkil azide, aril azide i derivate ovih azida. Derivati alkil i aril azida mogu uključiti druge supstituente dokle god se zadržava acetilen-specifična reaktivnost. Acetilenske komponente uključuju alkil i aril acetilene i derivate svakog od njih. Derivati alkil i aril acetilena mogu uključivati druge supstituente dokle god se zadržava azid-specifična reaktivnost.

[0201] Predmetna objava obezbeđuje konjugate supstanci koje imaju široku raznovrsnost funkcionalnih grupa, supstituenata ili komponenti, sa drugim supstancama uključujući, ali ne ograničavajući se na obeleživač; boju; polimer; polimer rastvorljiv u vodi; derivat polietilen glikola; foto-unakrsni povezivač; radionuklid; citotoksično jedinjenje; lek; afinitetni obeleživač; fotoafinitetni obeleživač; reaktivno jedinjenje; smolu; drugi protein ili polipeptid ili polipeptidni analog; antitelo ili fragment antitela; helator metala; kofaktor; masnu kiselinu; ugljeni hidrat; polinukleotid; DNK; RNK; "besmisleni" polinukleotid; saharid; dendrimer rastvorljiv u vodi; ciklodekstrin; inhibitornu ribonukleinsku kiselinu; biomaterijal; nanočesticu; spinski obeleživač; fluoroforu, komponentu koja sadrži metal; radioaktivnu komponentu; novu funkcionalnu grupu; grupu koja kovalentno ili nekovalentno interaguje sa drugim molekulima; fotoosetljivu komponentu; komponente koje se ekscitiraju aktiničnim zračenjem; fotoizomerizabilnu komponentu; biotin; derivat biotina; biotinski analog; komponentu koja inkorporiše teški atom; hemijski odsecajuću grupu; fotoodsecajuću grupu; produženi bočni lanac; šećer vezan preko ugljenika; redoks-aktivno sredstvo; amino tiokiselinu; toksičnu komponentu; izotopom obeleženu komponentu; biofizičku probu; fosforescentnu grupu; hemiluminescentnu grupu; elektronski gustu grupu; magnetnu grupu; interkalirajuću grupu; hromoforu; sredstvo za transfer energije; biološki aktivno sredstvo; detektabilni obeleživač; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; neutron-zadržavajuće sredstvo; ili bilo koju kombinaciju gornjeg, ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu. Predmetna objava uključuje i konjugate supstanci koje imaju azidne ili acetilenske komponente sa PEG polimernim derivatima koji imaju odgovarajuće acetilenske ili azidne komponente. Na primer, PEG polimer koji sadrži azidnu komponentu može da se kupluje sa biološki aktivnim molekulom na poziciji u proteinu koja sadrži negenetički kodiranu aminokiselinu koja nosi acetilensku funkcionalnost. Veza kojom su kuplovani PEG i biološki aktivni molekul uključuje, ali se ne ograničava na Huisgen-ov [3+2] cikloadicioni proizvod.

[0202] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonilnu grupu, acetil grupu, aminooksi grupu, hidrazinsku grupu, hidrazidnu grupu, semikarbazidnu grupu, azidnu grupu, ili alkinsku grupu.

[0203] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonilnu grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:

pri čemu n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril; R2je H, alkil, aril, supstituisani alkil, i supstituisani aril; i R3je H, amino kiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje amino terminus, i R4je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje karboksi terminus.

[0204] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži aminooksi grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži hidrazidnu grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži hidrazinsku grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselinska rezidua sadrži semikarbazidnu grupu.

[0205] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselinski rezidua sadrži azidnu grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:

pri čemu n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, supstituisani aril ili nije prisutan; X je O, N, S ili nije prisutan; m je 0-10; R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje amino terminus, i R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje karboksi terminus.

[0206] U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina sadrži alkinsku grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:

pri čemu n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil ili supstituisani aril; X je O, N, S ili nije prisutan; m je 0-10, R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje amino terminus, i R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa koja modifikuje karboksi terminus.

[0207] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid može biti agonist, delimični agonist, antagonist, delimični antagonist, ili inverzni agonist. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu vezanu za poli(etilen glikolnu) komponentu.

[0208] Predmetna objava obezbeđuje i izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima sa SEQ ID NO: 8-14. Predmetna objava obezbeđuje i izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji se hibridizuje pod stringentnim uslovima sa SEQ ID NO: 8-14 pri čemu polinukleotid sadrži najmanje jedan selektorski kodon. Predmetna objava obezbeđuje i izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEQ ID NO: 1-7 ili modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde. U nekim tehničkim rešenjima objave, izolovani polinukleotid opisan ovde sadrži najmanje jedan selektorski kodon, npr., selektorski kodon koji kodira neprirodno kodiranu aminokiselinu sadržanu u pomenutom modifikovanom FGF-21 polipeptidu.

[0209] U nekim tehničkim rešenjima objave, selektorski kodon se bira iz grupe koja se sastoji od amber kodona, oker kodona, opal kodona, jedinstvenog kodona, retkog kodona, petobaznog kodona, i četvorobaznog kodona.

[0210] Predmetna objava obezbeđuje i postupke pravljenja modifikovanog FGF-21 polipeptida vezanog za polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima objave, postupak uključuje dovođenje u kontakt izolovanog modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži komponentu koja reaguje sa neprirodno kodiranom aminokiselinom. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid reaktivna je prema polimeru rastvorljivom u vodi koji inače nije reaktivan prema nekoj od 20 uobičajenih aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid reaktivna je prema linkeru, polimeru, ili biološki aktivnom molekulu koji inače nije reaktivan prema nekoj od 20 uobičajenih aminokiselina.

[0211] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid vezan za polimer rastvorljiv u vodi napravljen je reakcijom modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži karbonilsadržavajuću aminokiselinu sa linkerom, polimerom, kao što je poli(etilen glikolni) molekul, ili biološki aktivniim molekulom koji sadrži aminooksi, hidrazinsku, hidrazidnu ili semikarbazidnu grupu. U nekim tehničkim rešenjima, aminooksi, hidrazinska, hidrazidna ili semikarbazidna grupa vezana je sa poli(etilen glikolnim) molekulom preko amidne veze.

[0212] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid vezan za polimer rastvorljiv u vodi napravljen je reakcijom poli(etilen glikolnog) molekula koji sadrži karbonilnu grupu sa polipeptidom koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži aminooksi, hidrazinsku, hidrazidnu ili semikarbazidnu grupu.

[0213] U nekim tehničkim rešenjima objave, modifikovani FGF-21 polipeptid vezan za polimer rastvorljiv u vodi napravljen je reakcijom modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži alkinsadržavajuću aminokiselinu sa poli(etilen glikolnim) molekulom koji sadrži azidnu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, azidna ili alkinska grupa vezana je za poli(etilen glikolni) molekul preko amidne veze.

[0214] U nekim tehničkim rešenjima objave, modifikovani FGF-21 polipeptid vezan za polimer rastvorljiv u vodi napravljen je reakcijom modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži azidsadržavajuću aminokiselinu sa poli(etilen glikolnim) molekulom koji sadrži alkinsku komponentu. U nekim tehničkim rešenjima objave, azidna ili alkinska grupa vezana je za poli(etilen glikolni) molekul preko amidne veze.

[0215] U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi vezan za modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži polialkilen glikolnu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselinska rezidua inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži karbonilnu grupu, aminooksi grupu, hidrazidnu grupu, hidrazinsku, semikarbazidnu grupu, azidnu grupu, ili alkinsku grupu. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselinska rezidua inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži karbonilnu komponentu i polimer rastvorljiv u vodi koji sadrži aminooksi, hidrazidnu, hidrazinsku ili semikarbazidnu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima objave, neprirodno kodirana aminokiselinska rezidua inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži alkinsku komponentu i polimer rastvorljiv u vodi sadrži azidnu komponentu. U nekim tehničkim rešenjima objave, neprirodno kodirana aminokiselinska rezidua inkorporisana u modifikovani FGF-21 polipeptid sadrži azidnu komponentu i polimer rastvorljiv u vodi sadrži alkinsku komponentu.

[0216] Predmetna objava obezbeđuje i ćelije koje sadrže polinukleotid koji kodira modifikovani FGF-21 polipeptid, koji sadrži selektorski kodon. U nekim tehničkim rešenjima objave, ćelije sadrže ortogonalnu RNK sintetazu i/ili ortogonalnu tRNK za supstituisanje neprirodno kodirane aminokiseline u modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0217] Predmetna objava obezbeđuje i postupke pravljenja modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu. U nekim tehničkim rešenjima objave, postupci uključuju kultivisanje ćelija koje sadrže polinukleotid ili polinukleotide koji kodiraju modifikovani FGF-21 polipeptid, ortogonalnu RNK sintetazu i/ili ortogonalnu tRNK pod uslovima koji dopuštaju ekspresiju modifikovanog FGF-21 polipeptida; i prečišćavanje modifikovanog FGF-21 polipeptida iz ćelija i/ili medijuma kulture.

[0218] U obim ove objave uključena je FGF-21 liderska ili signalna sekvenca spojena sa kodirajućim regionom modifikovanog FGF-21, kao i heterologna signalna sekvenca spojena sa kodirajućim regionom modifikovanog FGF-21. Odabrana heterologna liderska ili signalna sekvenca trebalo bi da bude ona koju prepoznaje i obrađuje, npr. sekrecioni sistem ćelije-domaćina da bi se sekretovala i moguće isekla signalnom peptidazom, od strane ćelije-domaćina. Liderske sekvence predmetne objave mogu se odabrati između sledećih: troleucinski lider iz SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 6 (aminokiselinske pozicije 1-28), dvoleucinski lider iz SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 7 (aminokiselinske pozicije 1-27), His oznaka iz SEQ ID NO: 2 (aminokiselinske pozicije 1-10), SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44. Postupak lečenja stanja ili poremećaja modifikovanim FGF-21 predmetne objave treba da podrazumeva lečenje modifikovanim FGF-21 polipeptidom sa ili bez signalnog ili liderskog peptida.

[0219] Predmetna objava obezbeđuje i postupke indukovanja porasta preuzimanja glukoze u adipocitne ćelije, pomenuti postupak obuhvata administriranje modifikovanog FGF-21 pomenutim ćelijama u količini efikasnoj da indukuje porast preuzimanja glukoze. Pomenuti porast preuzimanja glukoze može dovesti do porasta potrošnje energije bržim i efikasnijim utroškom glukoze.

II. Opšte rekombinantne nukleinske kiseline i postupci za upotrebu sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima stavljenim na uvid javnosti

[0220] U brojnim tehničkim rešenjima predmetne objave, nukleinske kiseline koje kodiraju modifikovani FGF-21 polipeptid od interesa mogu se izolovati, klonirati i često izmeniti korišćenjem rekombinantnih postupaka. Takva tehnička rešenja mogu se upotrebiti, uključujući, bez ograničavanja, za ekspresiju proteina ili tokom generisanja varijanti, derivata, ekspresionih kaseta, ili drugih sekvenci izvedenih iz modifikovanog FGF-21 polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, sekvence koje kodiraju modifikovane FGF-21 polipeptide objave operabilno su povezane sa heterolognim promotorom. U nekim tehničkim rešenjima upotreba DNK kodona u polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju modifikovani FGF-21 polipeptid može se optimizovati za ekspresiju u E. coli ili sisarskoj ćeliji (npr. CHO) korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci.

[0221] Primer cDNK koja kodira P-formu FGF-21 bez liderske sekvence prikazan je kao SEQ ID NO: 8. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 1.

[0222] Primer cDNK koja kodira His-označenu P-formu FGF-21 bez liderske sekvence prikazan je kao SEQ ID NO: 9. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 2.

[0223] Primer cDNK koja kodira P-formu FGF-21 sa liderskom sekvencom koja sadrži 3 leucina zajedno prikazan je kao SEQ ID NO: 10. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 3.

[0224] Primer cDNK koja kodira P-formu FGF-21 sa liderskom sekvencom koja sadrži 2 leucina zajedno prikazan je kao SEQ ID NO: 11. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 4.

[0225] Primer cDNK koja kodira L-formu FGF-21 bez liderske sekvence prikazan je kao SEQ ID NO: 12. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 5.

[0226] Primer cDNK koja kodira L-formu FGF-21 sa liderskom sekvencom koja sadrži 3 leucina zajedno prikazan je kao SEQ ID NO: 13. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 6.

[0227] Primer cDNK koja kodira L-formu FGF-21 sa liderskom sekvencom koja sadrži 2 leucina zajedno prikazan je kao SEQ ID NO: 14. Ovaj polipeptid prikazan je kao SEQ ID NO: 7.

[0228] Nukleotidna sekvenca koja kodira modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može se sintetisati na osnovu aminokiselinske sekvence roditeljskog polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na onaj sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 1-7 i zatim menjanjem nukleotidne sekvence tako da se izvrši uvođenje (tj., inkorporisanje ili supstitucija) ili uklanjanje (tj., delecija ili supstitucija) relevantne aminokiselinske rezidue(-a). Nukleotidna sekvenca može biti pogodno modifikovana usmerenom mutagenezom prema konvencionalnim postupcima. Alternativno, nukleotidna sekvenca može biti pripremljena hemijskom sintezom, uključujući, ali ne ograničavajući se na upotrebu sintetizera oligonukleotida, pri čemu se oligonukleotidi dizajniraju na osnovu aminokiselinske sekvence željenog polipeptida, i poželjno biranjem onih kodona koji su favorizovani u ćeliji-domaćinu u kojoj će se proizvoditi rekombinantni polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetisati i sklopiti pomoću PCR, ligacije ili lančane reakcije ligacije. Vidi, npr., Barany, i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); američki patent 6,521,427.

[0229] Objava se odnosi i na eukariotske ćelije-domaćine, neeukarioteske ćelije-domaćine, i organizme za inkorporisanje neprirodnih aminokiselina preko ortogonalnih tRNK/RS parova. Ćelije-domaćini su genetički inženjerisane (uključujući, ali ne ograničavajući se na transformisane, transdukovane ili transfektovane) sa polinukleotidima objave ili konstruktima koji uključuju polinukleotid objave, uključujući, ali ne ograničavajući se na vektor objave, koji može biti, na primer, klonirajući vektor ili ekspresioni vektor. Na primer, kodirajući regioni za ortogonalnu tRNK, ortogonalnu tRNK sintetazu, i protein koji će se derivatizovati operabilno su povezani sa kontrolnim elementima za gensku ekspresiju koji su funkcionlani u željenim ćelijamadomaćinima. Vektor može biti, na primer, u formi plazmida, kozmida, faga, bakterije, virusa, ogoljenog polinukleotida, ili konjugovanog polinukleotida. Vektori se mogu introdukovati u ćelije i/ili mikroorganizme standardnim postupcima.

SELEKTORSKI KODONI

[0230] Selektorski kodoni objave proširuju mrežu genetičkih kodona mašinerije za biosintezu proteina. Na primer, selektorski kodon uključuje, ali se ne ograničava na jedinstveni trobazni kodon, besmisleni kodon, kao što je stop kodon, uključujući, ali ne ograničavajući se na amber kodon (UAG), oker kodon, ili opal kodon (UGA), neprirodni kodon, kodon od četiri ili više baza, retki kodon, ili slično. Prosečno obučenom stručnjaku u oblasti očigledno je da postoji širok raspon u broju selektorskih kodona koji se mogu uvesti u željeni gen ili polinukleotid, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više, dva ili više, tri ili više, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više, u jedan polinukleotid koji kodira bar deo modifikovanog FGF-21 polipeptida.

[0231] U jednom tehničkom rešenju objave, postupci uključuju upotrebu selektorskog kodona koji je stop kodon za inkorporisanje jedne ili više neprirodnih (tj., neprirodno kodiranih) aminokiselina in vivo. Na primer, proizvedena je O-tRNK koja prepoznaje stop kodon, uključujući, ali ne ograničavajući se na UAG, i aminoacilovana je pomoću O-RS željenom neprirodnom aminokiselinom. Ovu O-tRNK ne prepoznaju prirodne domaćinove aminoacil-tRNK sintetaze. Konvencionalna usmerena mutageneza može se upotrebiti za uvođenje stop kodona, uključujući, ali ne ograničavajući se na TAG, na mesto od interesa u polipeptidu od interesa. Vidi, npr., Sayers, J.R., i sarad. (1988), 5 '-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Kada se O-RS, O-tRNK i nukleinska kiselina koja kodira polipeptid od interesa kombinuju in vivo, neprirodna aminokiselina se inkorporiše u odgovoru na UAG kodon da bi dala polipeptid koji sadrži neprirodnu aminokiselinu na naznačenoj poziciji.

[0232] Inkorporisanje neprirodnih aminokiselina in vivo može se obaviti bez značajnog remećenja eukariotske ćelije-domaćina. Na primer, zbog toga što efikasnost supresije za UAG kodon zavisi od kompeticije između O-tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na amber supresorsku tRNK, i eukariotskog oslobađajućeg faktora (uključujući, ali ne ograničavajući se na eRF) (koji se vezuje za stop kodon i inicira oslobađanje rastućeg peptida sa ribozoma), efikasnost supresije može se modulisati, uključujući, bez ograničavanja, povećavanje nivoa ekspresije O-tRNK, i/ili supresorske tRNK.

[0233] Neprirodne aminokiseline mogu biti kodirane i retkim kodonima. Na primer, kada se smanji koncentracija arginina u in vitro reakciji sinteze proteina, retki argininski kodon, AGG je dokazano efikasan za inserciju Ala sintetskom tRNK acilovanom alaninom. Vidi, npr., Ma i sarad., Biochemistry, 32:7939 (1993). U ovom slučaju, sintetska tRNK kompetira sa prirodnom tRNKArg, koja postoji kao minorna vrsta u Escherichia coli. Neki organizmi ne koriste sve tripletske kodone. Neraspoređeni kodon AGA u Micrococcus luteus bio je korišćen za inserciju aminokiselina u in vitro transkripcionom/translacionom ekstraktu. Vidi, npr., Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Komponente predmetne objave mogu se generisati da koriste ove retke kodone in vivo.

[0234] Selektorski kodoni takođe uključuju produžene kodone, uključujući, ali ne ograničavajući se na kodone od četiri ili više baza, kao što su kodoni od četiri, pet, šest ili više baza. Primeri kodona od četiri baze uključuju, ali se ne ograničavaju na AGGA, CUAG, UAGA, CCCU i slično. Primeri kodona od pet baza uključuju, ali se ne ograničavaju na AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC i slično. Karakteristika objave uključuje korišćenje produženih kodona na bazi supresije pomaka rama čitanja ("frameshift suppression"). Kodoni od četiri ili više baza mogu insertovati, uključujući, bez ograničavanja, jednu ili više neprirodnih aminokiselina, u isti protein. Na primer, u prisustvu mutiranih O-tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na specijalne "frameshift" supresorske tRNK, sa antikodonskim petljama, na primer, sa antikodonskim petljama od najmanje 8-10 nt, kodon od četiri ili više baza čita se kao jedna aminokiselina. U drugim tehničkim rešenjima, antikodonske petlje mogu dekodirati, uključujući, bez ograničavanja, najmanje četvorobazni kodon, najmanje petobazni kodon, ili najmanje šestobazni kodon ili veći. Pošto postoji 256 mogućih četvorobaznih kodona, korišćenjem kodona od četiri ili više baza, u istoj ćeliji može se kodirati veliki broj neprirodnih aminokiselina.

[0235] U jednom tehničkom rešenju objave, u ovoj objavi mogu se koristiti produženi kodoni na bazi retkih kodona ili besmislenih kodona, koji mogu smanjiti očitavanje pogrešnog smisla i "frameshift" supresiju na drugim neželjenim mestima.

[0236] Za dati sistem, selektorski kodon može takođe uključivati jedan od prirodnih trobaznih kodona, kada endogeni sistem ne koristi (ili koristi retko) prirodni bazni kodon. Na primer, ovo uključuje sistem kojem nedostaje tRNK koja prepoznaje prirodni trobazni kodon, i/ili sistem u kojem je trobazni kodon redak kodon.

[0237] Selektorski kodoni opciono sadrže neprirodne bazne parove. Ovi neprirodni bazni parovi dodatno proširuju postojeći genetički alfabet. Jedan dodatni bazni par povećava broj tripletskih kodona sa 64 na 125. Osobine trećeg baznog para uključuju stabilno i selektivno sparivanje baza, efikasnu enzimsku inkorporaciju polimerazom u DNK sa velikom vernošću i efikasno kontinuirano prajmersko produžavanje posle sinteze nascentnog neprirodnog baznog para. Opisi neprirodnih baznih parova koji se mogu prilagoditi postupcima i kompozicijama uključuju, npr., Hirao, i sarad., (2002), Nature Biotechnology, 20:177-182. Vidi, takođe, Wu, Y., i sarad., (2002) J. Am. Chem. Soc.124:14626-14630.

[0238] Geni koji kodiraju proteine ili polipeptide od interesa kao što je modifikovani FGF-21 polipeptid mogu biti mutagenizovani korišćenjem postupaka poznatih prosečno obučenom stručnjaku u oblasti i ovde opisanih, tako da uključe, na primer, jedan ili više selektorskih kodona za inkorporisanje neprirodne aminokiseline. Na primer, nukleinska kiselina za protein od interesa je mutagenizovana tako da uključi jedan ili više selektorskih kodona, čime se obezbeđuje inkorporisanje jedne ili više neprirodnih aminokiselina. Objava uključuje svaku takvu varijantu, uključujući, ali ne ograničavajući se na mutant, verzije bilo kojeg proteina, na primer, koji uključuje najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu.

[0239] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju protein od interesa kao što je modifikovani FGF-21 polipeptid mogu se lako mutirati da se cistein uvede na bilo koju željenu poziciju polipeptida. Cistein se široko koristi za uvođenje reaktivnih molekula, polimera rastvorljivih u vodi, proteina, ili velikog broja drugih različitih molekula, u protein od interesa.

III. Neprirodno kodirane aminokiseline

[0240] Neprirodno kodirane aminokiseline široke raznovrsnosti pogodne su za upotrebu u predmetnoj objavi. Bilo koji broj neprirodno kodiranih aminokiselina može se uvesti u modifikovani FGF-21 polipeptid. Uopšteno, uvedene neprirodno kodirane aminokiseline suštinski su hemijski inertne prema 20 uobičajenih, genetički kodiranih aminokiselina (tj., alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselna, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin). U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirane aminokiseline uključuju funkcionalne grupe bočnih lanaca koje efikasno i selektivno reaguju sa funkcionalnim grupama koje se ne nalaze na 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući, ali ne ograničavajući se na azido, ketonsku, aldehidnu i aminooksi grupu) da formiraju stabilne konjugate. Na primer, modifikovani FGF-21 polipeptid koji uključuje neprirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži azido funkcionalnu grupu može reagovati sa polimerom (uključujući, ali ne ograničavajući se na poli(etilen glikol) ili, alternativno, drugi polipeptid koji sadrži alkinsku komponentu da se formira stabilni konjugat što rezultuje selektivnom reakcijom azidne i alkinske funkcionalne grupe da se formira Huisgen-ov [3+2] cikloadicioni proizvod.

[0241] Generička struktura alfa-amino kiseline ilustrovana je kako sledi (Formula I):

[0242] Neprirodno kodirana aminokiselina je tipično bilo koja struktura koja ima gore navedenu formulu gde je R grupa bilo koji supstituent različit od onog koji je upotrebljen u dvadeset prirodnih aminokiselina, i može biti pogodna za upotrebu u modifikovanim FGF-21 polipeptidima predmetne objave. Zbog toga što se neprirodno kodirane aminokiseline objave tipično razlikuju od prirodnih aminokiselina samo po strukturi bočnog lanca, neprirodno kodirane aminokiseline formiraju amidne veze sa drugim aminokiselinama, uključujući, ali ne ograničavajući se na prirodno ili neprirodno kodirane, na isti način na koji se one formiraju u polipeptidima koji se prirodno sreću. Međutim, neprirodno kodirane aminokiseline imaju grupe bočnog čanca koje ih razlikuju od prirodnih aminokiselina. Na primer, R opciono sadrži alkil-, aril-, acil-, keto-, azido-, hidroksil-, hidrazin, cijano-, halo-, hidrazid, alkenil, alkinil, etar, tiol, seleno-, sulfonil-, borat, boronat, fosfo, fosfono, fosfin, heterociklik, enon, imin, aldehid, estar, tiokiselinsku, hidroksilamino, amino grupu, ili slično ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0243] Primeri neprirodno kodiranih aminokiselina koje mogu biti pogodne za korišćenje u predmetnoj objavi i koje su korisne za reakcije sa polimerima rastvorljivim u vodi uključuju, ali se ne ograničavaju na one sa karbonil, aminooksi, hidrazin, hidrazid, semikarbazid, azid i alkin reaktivnim grupama. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirane aminokiseline sadrže saharidnu komponentu. Primeri takvih aminokiselina uključuju N-acetil-L-glukozaminil-L-serin, N-acetil-L-galaktozaminil-L-serin, N-acetil-L-glukozaminil-L-treonin, N-acetil-L-glukozaminil-L-asparagin i O-manozaminil-L-serin.

[0244] Mnoge od neprirodno kodiranih aminokiselina obezbeđenih ovde komercijalno su dostupne, npr., od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (ogranak EMD Biosciences, Darmstadt, Germany), ili Peptech (Burlington, MA, USA). One koje nisu komercijalno dostupne sintetišu se opciono kako je ovde dato ili korišćenjem standardnih postupaka poznatih prosečno obučenom stručnjaku u oblasti. Za tehnike organske sinteze, vidi, npr., Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, drugo izdanje, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry, March (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, New York); i Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (treće izdanje, delovi A i B, 1990, Plenum Press, New York). Vidi, takođe, američke patente br. 7,045,337 i 7,083,970. Pored neprirodnih aminokiselina koje sadrže nove bočne lance, neprirodne aminokiseline koje mogu biti pogodne za upotrebu u predmetnoj objavi takođe opciono sadrže modifikovane osovinske strukture, uključujući, ali ne ograničavajući se na ilustrovane strukturama Formule II i III:

gde Z tipično uključuje OH, NH2, SH, NH-R', ili S-R'; X i Y, koji mogu biti isti ili različiti, tipično uključuju S ili O, i R i R', koji su opciono isti ili različiti,tipično se biraju iz iste liste konstituenata za R grupu opisanih gore za neprirodne aminokiseline koje imaju Formulu I kao i vodonika. Na primer, neprirodne aminokiseline objave opciono sadrže supstitucije u amino ili karboksilnoj grupi kako je ilustrovano Formulama II i III. Neprirodne aminokiseline ovog tipa uključuju, ali se ne ograničavaju na α-hidroksi kiseline, α-tiokiseline, α-aminotiokarboksilate, uključujući, ali ne ograničavajući se na one sa bočnim lancima koji odgovaraju bočnim lancima uobičajenih dvadeset prirodnih aminokiselina ili neprirodnim bočnim lancima. Pored toga, supstitucije na α-ugljeniku opciono uključuju, ali se ne ograničavaju na L, D, ili α-α-disupstituisane aminokiseline kao što su D-glutamat, D-alanin, D-metil-O-tirozin, aminobuterna kiselina, i slično. Druge strukturne alternative uključuju ciklične aminokiseline, kao što su prolinski analozi kao i analozi prolina sa 3, 4, 6, 7, 8, i 9-članim prstenovima, β i γ aminokiseline kao što su supstituisani β-alanin i γaminobuterna kiselina.

[0245] Mnoge neprirodne aminokiseline bazirane su na prirodnim aminokiselinama, kao što su tirozin, glutamin, fenilalanin, i slično, i pogodne su za upotrebu u predmetnoj objavi. Tirozinski analozi uključuju, ali se ne ograničavaju na parasupstituisane tirozine, ortosupstituisane tirozine, i metasupstituisane tirozine, pri čemu supstituisani tirozin sadrži, uključujući, ali ne ograničavajući se, keto grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na acetil grupu), benzoil grupu, amino grupu, hidrazinsku, hidroksiaminsku, tiolnu grupu, karboksi grupu, izopropil grupu, metil grupu, C6-C20ugljovodonik linearnog ili granatog lanca, zasićeni ili nezasićeni ugljovodonik, O-metil grupu, polietarsku grupu, nitro grupu, alkinil grupu ili slično. Pored toga, u vidu se imaju i višestruko supstituisani aril prstenovi. Glutaminski analozi koji mogu biti pogodni za upotrebu u predmetnoj objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na α-hidroksi derivate, γ-supstituisane derivate, ciklične derivate, i amid-supstituisane glutaminske derivate. Primeri fenilalaninskih analoga koji mogu biti pogodni za upotrebu u predmetnoj objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na parasupstituisane fenilalanine, orthosupstituisane fenilalanine, i metasupstituisane fenilalanine, gde supstituenti sadrže, uključujući bez ograničavanja, hidroksi grupu, metoksi grupu, metil grupu, alil grupu, aldehidnu, azido, jodo, bromo, keto grupu (uključujući, ali ne ograničavajući se na acetil grupu), benzoil, alkinil grupu, ili slično. Specifični primeri neprirodnih aminokiselina koje mogu biti pogodne za upotrebu u predmetnoj objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na p-acetil-L-fenilalanin, O-metil-L-tirozin, L-3-(2-naftil)alanin, 3-metil-fenilalanin, O-4-alil-L-tirozin, 4-propil-L-tirozin, tri-O-acetil-GlcNAcβ-serine, L-Dopa, fluorinisanifenilalanin, izopropil-L-fenilalanin, p-azido-L-fenilalanin, p-acil-L-fenilalanin, p-benzoil-L-fenilalanin, L-fosfoserin, fosfonoserin, fosfonotirozin, p-jodo-fenilalanin, p-bromofenilalanin, p-amino-L-fenilalanin, izopropil-L-fenilalanin, i p-propargiloksi-fenilalanin, i slično.

[0246] U jednom tehničkom rešenju, kompozicije modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži neprirodnu aminokiselinu (kao što je p-(propargiloksi)-fenilalanin) stavljene su na uvid javnosti. Različite kompozicije koje sadrže p-(propargiloksi)-fenilalanin, uključujući, ali ne ograničavajući se na proteine i/ili ćelije, takođe su stavljeni na uvid javnosti. U jednom aspektu, kompozcija koja uključuje p-(propargiloksi)-fenilalanin neprirodnu aminokiselinu, uključuje još i ortogonalnu tRNK. Neprirodna aminokiselina može biti vezana (uključujući, ali ne ograničavajući se na kovalentnu vezu) sa ortogonalnom tRNK, uključujući, ali ne ograničavajući se na kovalentnu vezu sa ortogonalnom tRNK preko amino-acil veze, kovalentnu vezu sa 3'OH ili 2'OH terminalnog riboznog šećera ortogonalne tRNK, itd.

[0247] Modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu opisanu u američkom patentu br.8,012,931.

STRUKTURA I SINTEZA NEPRIRODNIH AMINOKISELINA: KARBONIL, KARBONIL-SLIČNE, MASKIRANE KARBONILNE, PROTEKTOVANE KARBONILNE GRUPE, I HIDROKSILAMINSKE GRUPE

[0248] U nekim tehničkim rešenjima predmetna objava obezbeđuje modifikovani FGF-21 vezan za polimer rastvorljiv u vodi, npr., PEG, oksimskom vezom. Mnogi tipovi neprirodno kodiranih aminokiselina pogodni su za formiranje oksimskih veza. Oni uključuju, ali se ne ograničavaju na neprirodno kodirane aminokiseline koje sadrže karbonil, dikarbonil, karbonil-sličnu, maskiranu karbonil, protektovanu karbonil, ili hidroksilaminsku grupu. Takve aminokiseline, njihova struktura i sinteza opisane su u američkom patentu br.8,012,93 1.

.IV. Struktura i sinteza neprirodnih aminokiselina: Hidroksilamin-sadržavajuće aminokiseline [0249] Američka privremena patentna prijava br. 60/638,418 ovde je stavljena na uvid javnosti. Prema tome, objave obezbeđene u Odeljku V (pod naslovom "Non-natural Amino Acids"), Deo B (pod naslovom " Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids"), američke privremene patentne prijave br. 60/638,418 odnose se u potpunosti na postupke, kompozicije, tehnike i strategije za pravljenje, prečišćavanje, karakterizaciju, i korišćenje neprirodnih aminokiselina, polipeptida sa neprirodnim aminokiselinama i modifikovanih polipeptida sa neprirodnim aminokiselinama opisanih ovde američke patentne objave br. 2006/0194256, 2006/0217532, i 2006/0217289 i WO 2006/069246 pod naslovom "Compositions containing, methods involving, and uses of nonnatural amino acids and polypeptides," takođe su ovde stavljeni na uvid javnosti.

HEMIJSKA SINTEZA NEPRIRODNIH AMINOKISELINA

[0250] Mnoge od neprirodnih aminokiselina pogodnih za upotrebu u predmetnoj objavi komercijalno su dostupne, npr., od Sigma (USA) ili Aldrich (Milwaukee, WI, USA). One koje nisu komercijalno dostupne sintetišu se opciono kako je ovde dato ili kako je dato u različitim publikacijama ili korišćenjem standardnih postupaka poznatih prosečno obučenom stručnjaku u oblasti. Za tehnike organske sinteze, vidi, npr., Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, drugo izdanje, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry, March (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, New York); i Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (treće izdanje, delovi A i B, 1990, Plenum Press, New York). Dodatne publikacije koje opisuju sintezu neprirodnih aminokiselina uključuju, npr., WO 2002/085923 pod naslovom "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas i sarad., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of y-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates forAnti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc.81, 3750-3752; Craig, J.C. i sarad. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(dietilamino)-1-metilbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem.53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and IminiumIon Cyclization. J. Org. Chem.

50:1239-1246; Barton i sarad., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alphaaminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; and, Subasinghe i sarad., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Vidi takođe, američka patentna objava sa br. U.S.2004/0198637 pod naslovom "Protein Arrays".

A. Karbonilne reaktivne grupe

[0251] Aminokiseline sa karbonilnom reaktivnom grupom dopuštaju različite reakcije za povezivanje molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na PEG ili druge molekule rastvorljive u vodi) reakcijama nukleofilne adicije ili aldolne kondnezacije između ostalih.

[0252] Sinteza p-acetil-(+/-)-fenilalanina i m-acetil-(+/-)-fenilalanina opisana je u Zhang, Z., i sarad., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Prosečno obučeni stručnjak u oblasti može na sličan način pripremiti druge karbonil-sadržavajuće aminokiseline.

[0253] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu može biti hemijski modifikovan tako da generiše reaktivnu karbonilnu funkcionalnu grupu. Na primer, aldehidna funkcionalnost korisna za reakcije konjugacije može se generisati od funkcionalnosti koja ima susedne amino i hidroksilne grupe. Kada je biološki aktivan molekul polipeptid, na primer, N-terminalni serin ili treonin (koji može biti normalno prisutan ili može biti izložen putem hemijske ili enzimske digestije) može se koristiti za generisanje aldehidne funkcionalnosti pod blagim uslovima oksidativnog sečenja korišćenjem perjodata. Vidi, npr., Gaertner, i sarad., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner i sarad., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Međutim, postupci poznati u struci ograničeni su na aminokiseline na N-terminusu peptida ili proteina.

[0254] U predmetnoj objavi, neprirodno kodirana aminokiselina koja nosi susedne hidroksilne i amino grupe može se inkorporisati u polipeptid kao "maskirana" aldehidna funkcionalnost. Na primer, 5-hidroksilizin nosi hidroksilnu grupu susednu epsilon aminu. Uslovi reakcije za generisanje aldehida tipično uključuju dodavanje molarnog viška natrijum metaperjodata pod blagim uslovima da bi se izbegla oksidacija na drugim mestima u polipeptidu. pH oksidacione reakcije tipično je oko 7.0. Tipična reakcija uključuje dodavanje oko 1.5 molarnog viška natrijum metaperjodata u puferisani rastvor polipeptida, što je praćeno inkubacijom u trajanju od oko 10 minuta u mraku. Vidi, npr. američki patent br.6,423,685.

[0255] Karbonilna funkcionalnost može selektivno reagovati sa hidrazin-, hidrazid-, hidroksilamin-, ili semikarbazid-sadržavajućim reagensom pod blagim uslovima u vodenom rastvoru da se formiraju odgovarajuće hidrazonske, oksimske, odnosno semikarbazonske veze, koje su stabilne pod fiziološkim uslovima. Vidi, npr., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc.117:3893-3899 (1995). Štaviše, jedinstvena reaktivnost karonilne grupe omogućava selektivnu modifikaciju u prisustvu drugih aminokiselinskih bočnih lanaca. Vidi, npr., Cornish, V. W., i sarad., J Am. Chem. Soc.118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem.3:138-146 (1992); Mahal, L. K., i sarad., Science 276:1125-1128 (1997).

B. Hidrazinske, hidrazidne ili semikarbazidne reaktivne grupe

[0256] Neprirodno kodirane aminokiseline koje sadrže nukleofilnu grupu, kao što je hidrazinska, hidrazidna ili semikarbazidna, omogućavaju reakciju sa različitim elektrofilnim grupama da formiraju konjugate (uključujući, ali ne ograničavajući se na konjugate sa PEG ili drugim polimerima rastvorljivim u vodi).

[0257] Hidrazid-, hidrazin-, i semikarbazid-sadržavajuće aminokiseline se mogu nabaviti iz komercijalnih izvora. Na primer, L-glutamat-γ-hidrazid se može nabaviti od Sigma Chemical (St. Louis, MO). Prosečno obučeni stručnjak u oblasti može pripremiti druge aminokiseline koje se ne mogu nabaviti komercijalno. Vidi, npr., američki pat. br.6,281,211.

[0258] Modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže neprirodno kodirane aminokiseline koje nose hidrazinske, hidrazidne ili semikarbazidne funkcionalnosti mogu efikasno i selektivno reagovati sa različitim molekulima koji sadrže aldehide ili druge funkcionalne grupe sa sličnom hemijskom reaktivnošću. Vidi, npr., Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Jedinstvena reaktivnost hidrazinske, hidrazidne i semikarbazidne funkcionalne grupe čini ih značajno reaktivnijim prema aldehidima, ketonima i drugim elektrofilnim grupama u poređenju sa nukleofilnim grupama prisutnim na 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući, ali ne ograničavajući se na hidroksilnu grupu serina ili treonina ili amino grupu lizina i N-terminusa).

C. Aminooksi-sadržavajuće aminokiseline

[0259] Neprirodno kodirane aminokiseline koje sadrže aminooksi (nazvanu još i hidroksilamin) grupu omogućavaju reakciju sa različitim elektrofilnim grupama da bi se formirali konjugati (uključujući, ali ne ograničavajući se na one sa PEG ili drugim polimerima rastvorljivim u vodi). Kao za hidrazine, hidrazide i semikarbazide, povećana nukleofilnost aminooksi grupe omogućava joj da efikasno i selektivno reaguje sa različitim molekulima koji sadrže aldehide ili druge funkcionalne grupe sa sličnom hemijskom reaktivnošću. Vidi, npr., Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Dok je rezultat reakcije sa hidrazinskom grupom odgovarajući hidrazon, oksim je, međutim, obično rezultat reakcije aminooksi grupe sa karbonil-sadržavajućom grupom kao što je keton.

[0260] Aminooksi-sadržavajuće aminokiseline mogu se pripremiti od aminokiselinskih prekursora (homoserin, serin i treonin) koji se lako mogu nabaviti. Vidi, npr., M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem.68: 8853-8858 (2003). Određene aminooksi-sadržavajuće aminokiseline, kao što je L-2-amino-4-(aminooksi)buterna kiselina), izolovane su iz prirodnih izvora (Rosenthal, G., Life Sci.

60: 1635-1641 (1997). Prosečno obučeni stručnjak u oblasti može pripremiti druge aminooksisadržavajuće aminokiseline.

D. Azidne i alkinske reaktivne grupe

[0261] Jedinstvena reaktivnost azidnih i alkinskih funkcionalnih grupa čini ih izuzetno korisnim za selektivno modifikovanje polipeptida i drugih bioloških molekula. Organski azidi, posebno alifatični azidi, i alkini obično su stabilni u uobičajenim reaktivnim hemijskim uslovima. Posebno, i azidne i alkinske funkcionlne grupe inertne su prema bočnim lancima (tj., R grupama) 20 uobičajenih aminokiselina koje se nalaze u polipeptidima koji se sreću prirodno. Kada se blisko približe, međutim, "opružna" priroda azidnih i alkinskih grupa se otkriva i one reaguju selektivno i efikasno putem Huisgen-ove [3+2] cikloadicione reakcije da bi se generisao odgovarajući triazol. Vidi, npr., Chin J., i sarad., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., i sarad., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., i sarad., J. Am. Chem. Soc.124:9026-9027 (2002).

[0262] Zbog toga što Huisgen-ova cikloadiciona reakcija podrazumeva selektivnu cikloadicionu reakciju (vidi, npr., Padwa, A., u COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (izd. Trost, B. M., 1991), str. 1069-1109; Huisgen, R. u 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (izd. Padwa, A., 1984), str. 1-176), a ne nukleofilnu supstituciju, inkorporisanje neprirodno kodirane aminokiseline koja nosi azid i alkin-sadržavajuće bočne lance dopušta da se dobijeni polipeptidi modifikuju selektivno na poziciji neprirodno kodirane aminokiseline. Cikloadiciona reakcija koja uključuje azid ili alkin-sadržavajući modifikovani FGF-21 polipeptid može se izvoditi na sobnoj temperaturi pod vodenim uslovima dodavanjem Cu(II) (uključujući, ali ne ograničavajući se na dodavanje u vidu katalitičke količine CUSO4) u prisustvu redukujućeg sredstva za redukovanje Cu(II) u Cu(I), in situ, u katalitičkoj količini. Vidi, npr., Wang, Q., i sarad., J. Am. Chem. Soc.125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., i sarad., J. Org. Chem.67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, i sarad., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Primeri redukujućih sredstava uključuju, bez ograničavanja, askorbat, metalni bakar, kinin, hidrohinon, vitamin K, glutation, cistein, Fe<2+>, Co<2+>, i primenu električnog potencijala.

[0263] U nekim slučajevima, kada je poželjna Huisgen-ova [3+2] cikloadiciona reakcija između azida i alkina, modifikovani FGF-21 polipeptid može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži alkinsku komponentu, a polimer rastvorljiv u vodi koji će biti prikačen za aminokiselinu može sadržati azidnu komponentu. Alternativno, može se izvesti obrnuta reakcija (tj., sa azidnom komponentom na aminokiselini i alkinskom komponentom prisutnom na polimeru rastvorljivom u vodi).

[0264] Azidna funkcionalna grupa takođe može selektivno reagovati sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži aril estar i na odgovarajući način biti funkcionalizovana aril fosfinskom komponentom da se generiše amidna veza. Aril fosfinska grupa redukuje azid in situ i rezultujući amin zatim reaguje efikasno sa proksimalnom estarskom vezom da bi se generisao odgovarajući amid. Vidi, npr., E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). Azid-sadržavajuća aminokiselina može biti ili alkil azid (uključujući, ali ne ograničavajući se na 2-amino-6-azido-1-heksansku kiselinu) ili aril azid (p-azido-fenilalanin).

[0265] Azidna funkcionalna grupa takođe može selektivno reagovati sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži tioestar i na odgovarajući način biti funkcionalizovana aril fosfinskom komponentom da se generiše amidna veza. Aril fosfinska grupa redukuje azid in situ i rezultujući amin zatim reaguje efikasno sa tioestarskom vezom da bi se generisao odgovarajući amid.

[0266] Alkin-sadržavajuće aminokiseline mogu se komercijalno nabaviti. Na primer, propargilglicin se može komercijalno nabaviti od Peptech (Burlington, MA). Alternativno, alkinsadržavajuće aminokiseline mogu se pripremiti u skladu sa standardnim postupcima. Na primer, ppropargiloksifenilalanin može da se sintetiše, na primer, kako je opisano u Deiters, A., i sarad., J. Am. Chem. Soc.125: 11782-11783 (2003), i 4-alkinil-L-fenilalanin može da se sintetiše kako je opisano u Kayser, B., i sarad., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Prosečno obučeni stručnjak u oblasti može pripremiti druge alkin-sadržavajuće aminokiseline.

[0267] Azid-sadržavajuće aminokiseline mogu se nabaviti iz komercijalnih izvora. Na primer, 4-azidofenilalanin može se nabaviti od Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Za one azid-sadržavajuće aminokiseline koje se ne mogu nabaviti komercijalno, azidna grupa može se pripremiti relativno lako korišćenjem standardnih postupaka poznatih stručnjacima prosečno obučenim u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na izmeštanje pogodne odlazeće grupe (uključujući, ali ne ograničavajući se na halid, mezilat, tozilat) ili otvaranjem pogodno protektovanog laktona. Vidi, npr., Advanced Organic Chemistry, March (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, New York).

[0268] Molekul koji može da se doda proteinu objave preko [3+2] cikloadicije uključuje praktično svaki molekul sa azidnim ili alkinil derivatom. Molekuli uključuju, ali se ne ograničavaju na boje, fluorofore, unakrsno povezujuća sredstva, saharidne derivate, polimere (uključujući, ali ne ograničavajući se na polimere koji sadrže polietilen glikol), fotounakrsne povezivače, citotoksična jedinjenja, afinitetne obeleživače, derivate biotina, smole, perlice, drugi protein ili polipeptid (ili više), polinukleotid(-e) (uključujući, ali ne ograničavajući se na DNK, RNK, itd.), helatore metala, kofaktore, masne kiseline, ugljene hidrate i slično. Ovi molekuli se mogu dodati neprirodnoj aminokiselini sa alkinil grupom, uključujući, ali ne ograničavajući se na ppropargiloksifenilalanin, ili azido grupom, uključujući, ali ne ograničavajući se na p-azidofenilalanin, respektivno.

E. Aminotiolne reaktivne grupe

[0269] Jedinstvena reaktivnost beta-supstituisanih aminotiolnih funkcionalnih grupa čini ih izuzetno korisnim za selektivno modifikovanje polipeptida i drugih bioloških molekula koji sadrže aldehidne grupe, putem formiranja tiazolidina. Vidi, npr., J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc.

1995, 117 (14) 3893-3899. U nekim tehničkim rešenjima, beta-supstituisane aminotiol aminokiseline mogu se inkorporisati u modifikovane FGF-21 polipeptide i zatim reagovati sa polimerima rastvorljivim u vodi koji sadrže aldehidnu funkcionalnost. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi, konjugat leka ili drugi korisni teret može se kuplovati sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom koji sadrži beta-supstituisanu aminotiol amino kiselinu, putem formiranja tiazolidina.

F. Dodatne reaktivne grupe

[0270] Dodatne reaktivne grupe i neprirodno kodirane aminokiseline koje se mogu inkorporisati u modifikovane FGF-21 polipeptide objave opisane su u sledećim patentnim prijavama: američka patentna objava br. 2006/0194256, američka patentna objava br. 2006/0217532, američka patentna objava br. 2006/0217289, američki privremeni patent br. 60/755,338; američki privremeni patent br. 60/755,711; američki privremeni patent br. 60/755,018; Međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; američki. privremeni patent br.

60/743,041; američki privremeni patent br. 60/743,040; Međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/47822; američki. privremeni patent br.60/882,819; američki privremeni patent br.

60/882,500; i američki privremeni patent br.60/870,594.

ĆELIJSKO PREUZIMANJE NEPRIRODNIH AMINOKISELINA

[0271] Preuzimanje neprirodnih aminokiselina u ćeliju je jedno pitanje koje se tipično razmatra kada se dizajniraju i biraju neprirodne aminokiseline za, uključujući, bez ograničavanja, inkorporisanje u protein. Na primer, visoka gustina naelektrisanja α-aminokiselina sugeriše da nije verovatno da će ćelija biti permeabilna za ova jedinjenja. Prirodne aminokiseline preuzimaju se u eukariotsku ćeliju grupom transportnih sistema na bazi proteina. Može se obaviti brza pretraga da bi se procenilo koje će neprirodne aminokiseline, ako ih uopšte ima, biti preuzete u ćelije. Vidi, npr., testove toksičnosti u, npr., američkoj patentnoj objavi br. U.S. 2004/0198637 pod nazivom "Protein Arrays"; i Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785. Iako se preuzimanje lako analizira različitim testovima, alternativa dizajniranju neprirodnih aminokiselina koje podležu putevima preuzimanja u ćeliju je obezbediti biosintetske puteve za kreiranje aminokiselina in vivo. BIOSINTEZA NEPRIRODNIH AMINOKISELINA

[0272] U ćelijama već postoje mnogi biosintetski putevi za proizvodnju aminokiselina i drugih jedinjenja. Iako postupak biosinteze određene neprirodne aminokiseline ne mora postojati u prirodi, uključujući, ali ne ograničavajući se na ćeliju, objava obezbeđuje takve postupke. Na primer, biosintetski putevi za neprirodne aminokiseline se opciono generišu u ćeliji-domaćinu dodavanjem novih enzima ili modifikovanjem postojećih puteva u ćeliji-domaćinu. Dodatni novi enzimi su opciono enzimi koji se sreću u prirodi ili veštački razvijeni enzimi. Na primer, biosinteza p-aminofenilalanina (kako je prikazano u primeru u WO 2002/085923 pod nazivom "In vivo incorporation of unnatural amino acids") počiva na dodavanju kombinacije poznatih enzima iz drugih organizama. Geni za ove enzime mogu da se uvedu u eukariotsku ćeliju transformisanjem ćelije plazmidom koji sadrži gene. Geni, kada se eksprimiraju u ćeliji, obezbeđuju enzimski put za sintetisanje željenog jedinjenja. Primeri tipova enzima koji se opciono dodaju obezbeđeni su u primerima u nastavku. Sekvence dodatnih enzima nalaze se, na primer, u GenBank. Veštački razvijeni enzimi se takođe opciono dodaju u ćeliju na isti način. Na taj način, manipuliše se ćelijskom mašinerijom i resursima ćelije da bi se proizvele neprirodne aminokiseline.

[0273] Za proizvodnju novih enzima za upotrebu u biosintetskim putevima ili za razvijanje postojećih puteva, na raspolaganju su različiti postupci. Na primer, rekurzivna rekombinacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na onu koju su razvili Maxygen, Inc. (dostupna na World Wide Web na maxygen.com), opciono se koristi za razvijanje novih enzima i puteva. Vidi, npr., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; i, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Slično tome DesignPath™, razvijen od strane Genencor (dostupan na World Wide Web na genencor.com) opciono se koristi za inženjerisanje metaboličkog puta, uključujući, ali ne ograničavajući se na inženjerisanje puta za stvaranje O-metil-L-tirozina u ćeliji. Ova tehnologija rekonstruiše postojeće puteve u domaćinskim organizmima korišćenjem kombinacije novih gena, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji su identifikovani funkcionalnom genomikom, i molekulskom evolucijom i dizajnom. Diversa Corporation (dostupan na World Wide Web na diversa.com) takođe obezbeđuje tehnologiju za brzu pretragu biblioteka gena i genskih puteva, uključujući, ali ne ograničavajući se na stvaranje novih puteva.

[0274] Tipično, neprirodna aminokiselina proizvedena inženjerisanim biosintetskim putem objave proizvedena je u koncentraciji koja je dovoljna za efikasnu biosintezu proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na prirodnu ćelijsku količinu, ali ne u toj meri da bi se uticalo na koncentraciju drugih aminokiselina ili iscrpili ćelijski resursi. Tipične koncentracije proizvedene in vivo na ovaj način su oko 10 mM do oko 0.05 mM. Kada se ćelija transformiše plazmidom koji sadrži gene koji se upotrebljavaju za proizvodnju željenih enzima za specifični put i kada se stvori neprirodna aminokiselina, in vivo selekcionisanja se opciono koriste da se dodatno optimizuje proizvodnja neprirodne aminokiseline i za sintezu ribozomskih proteina i ćelijski rast.

V. In vivo generisanje modifikovanih FGF-21 polipeptida koji uključuju neprirodno kodirane aminokiseline

[0275] Modifikovani FGF-21 polipeptidi objave mogu se generisati in vivo korišćenjem modifikovanih tRNK i tRNK sintetaza za dodavanje ili supstituisanje aminokiselina koje nisu kodirane u sistemima koji se sreću u prirodi. Takvi postupci opisani su u američkom patentu br.

8,012,931.

[0276] Postupci za generisanje tRNK i tRNK sintetaza koje koriste aminokiseline koje nisu kodirane u sistemima koji se sreću u prirodi opisani su u, npr., američkim patentima br.

7,045,337 i 7,083,970. Ovi postupci uključuju generisanje translacione mašinerije koja funkcioniše nezavisno od sintetaza i tRNK endogenih translacionom sistemu (i stoga se ponekad označavaju kao "ortogonalne"). Tipično, translacioni sistem sadrži ortogonalnu tRNK (O-tRNK) i ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS). Tipično, O-RS preferencijalno aminoaciliše O-tRNK najmanje jednom aminokiselinom koja se ne sreće prirodno u translacionom sistemu i O-tRNK prepoznaje najmanje jedan selektorski kodon koji ne prepoznaju druge tRNK u sistemu. Translacioni sistem tako insertuje neprirodno kodiranu aminokiselinu u protein proizveden u sistemu, u odgovoru na kodirani selektorski kodon, "supstituišući" time aminokiselinu na poziciji u kodiranom polipeptidu.

[0277] Upotreba O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze podrazumeva izbor specifičnog kodona koji kodira neprirodno kodiranu aminokiselinu. Iako svaki kodon može da se koristi, obično je poželjno odabrati kodon koji se retko ili nikada ne koristi u ćeliji u kojoj se eksprimira O-tRNK/aminoaciltRNK sintetaza. Na primer, primeri kodona uključuju besmisleni kodon kao što su kodoni (amber, oker, i opal), kodoni sa četiri ili više baza i drugi prirodni trobazni kodoni koji se retko koriste ili se ne koriste.

[0278] Specifični selektorski kodon(-i) mogu se uvesti na odgovarajuće pozicije u modifikovanom FGF-21 polinukleotidu koji kodira sekvencu, korišćenjem postupaka mutageneze poznatih u struci (uključujući, ali ne ograničavajući se na mutagenezeu specifičnu za mesto, kasetnu mutagenezu, restrikciono selekcionu mutagenezu, itd.).

VI. Lokacija neprirodno kodiranih aminokiselina u modifikovanim FGF-21 polipeptidima [0279] Predmetna objava razmatra inkorporisanje jedne ili više neprirodno kodiranih amino kiselina u modifikovane FGF-21 polipeptide. Jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina mogu se inkorporisati na određenu poziciju, čime se ne narušava aktivnost polipeptida. Ovo se može postići pravljenjem "konzervativnih" supstitucija, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstituisanje hidrofobnih aminokiselina hidrofobnim aminokiselinama, glomaznih aminokiselina glomaznim aminokiselinama, hidrofilnih aminokiselina hidrofilnim aminokiselinama i/ili insertovanjem aminokiseline koja se ne sreće u prirodi na lokaciji koja nije potrebna za aktivnost.

[0280] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi objave sadrže jednu ili više aminokiselina koje se ne sreću u prirodi pozicioniranih u regionu proteina koji ne narušava strukturu polipeptida.

[0281] U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselinska sekvenca u modifikovanom FGF-21 polipeptidu opisanom ovde može sadržati najmanje jednu neprirodno kodiranu aminokiselinu. Najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti inkorporisana na bilo kojoj poziciji u aminokiselinskoj sekvenci, uključujući pozicije koje odgovaraju aminokiselinama 1-181 iz SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil-terminusu proteina) u njoj ili na odgovarajućim aminokiselinama u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108, ili 110 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 72, 77, 86, 87, 91, 108, 110, 126, 131, ili 146 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti derivat fenilalanina. U nekim tehničkim rešenjima, pozicija koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1 može biti derivat fenilalanina. U nekim tehničkim rešenjima, najmanje jedna neprirodno kodirana aminokiselina može biti para-acetil-L-fenilalanin. U nekim tehničkim rešenjima, pozicija koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1 može biti para-acetil-L-fenilalanin. U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće prirodno je na poziciji 91 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće prirodno je na poziciji 131 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). Prema pronalasku, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 108 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 77 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 72 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 87 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 86 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 126 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 110 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 83 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 146 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 135 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 96 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7). U jednom tehničkom rešenju objave, aminokiselina koja se ne sreće u prirodi je na poziciji 36 u FGF-21 (SEQ ID NO: 1 ili na poziciji odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7).

[0282] U sledećem tehničkom rešenju objave, aminokiselinska sekvenca u modifikovanom FGF-21 polipeptidu opisanom ovde može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1 i najmanje jednu drugu neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara bilo kojoj drugoj od aminokiselina 1-181 iz SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil-terminusu proteina) u njemu ili na odgovarajućim aminokiselinama u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U sledećem tehničkom rešenju, najmanje jedna druga neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108, ili 110 u SEQ ID NO: 1. U sledećem tehničkom rešenju objave, najmanje jedna druga neprirodno kodirana aminokiselina može biti na poziciji koja odgovara aminokiselini 91 ili 131 u SEQ ID NO: 1.

[0283] U sledećem tehničkom rešenju objave, na poziciji 91 postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi i jedna ili više drugih aminokiselina koje se ne sreću u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: pozicija koja odgovara bilo kojoj drugoj od aminokiselina 1-181 iz SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil-terminusu proteina) u njemu ili na odgovarajućim aminokiselinama u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U sledećem tehničkom rešenju objave, na poziciji 91 postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi i jedna ili više drugih aminokiselina koje se ne sreću u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, i 36 (aminokiselinske pozicije koje odgovaraju SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7).

[0284] U sledećem tehničkom rešenju objave, na poziciji 131 postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi i jedna druga aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: pozicija koja odgovara bilo kojoj drugoj od aminokiselina 1-181 u SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil terminusu proteina) u njoj ili na odgovarajućime aminokiselinama u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U sledećem tehničkom rešenju objave, na 131 postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi i jedna druga aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, i 36 (aminokiselinska pozicija koja odgovara SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7).

[0285] U sledećem tehničkom rešenju objave, aminokiselinska sekvenca u modifikovanom FGF-21 polipeptidu opisanom ovde može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara rezidui 108 u SEQ ID NO: 1 i najmanje dve druge neprirodno kodirane aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju najmanje dvema od sledećih aminokiselina u SEQ ID NO: 1: pozicija koja odgovara bilo kojoj drugoj od aminokiselina 1-181 u SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil terminusu proteina) u njemu ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U sledećem tehničkom rešenju objave, aminokiselinska sekvenca u modifikovanom FGF-21 polipeptidu opisanom ovde može sadržati neprirodno kodiranu aminokiselinu na poziciji koja odgovara aminokiselini 108 u SEQ ID NO: 1 i najmanje dve druge aminokiseline koje se ne sreću u prirodi na pozicijama koje odgovaraju najmanje dvema od sledećih aminokiselina u SEQ ID NO: 1: 10, 36, 52, 117, 126, 131, 135, 146, 162, 87, 77, 83, 72, 69, 79, 91, 96, 108, ili 110 u SEQ ID NO: 1.

[0286] U sledećem tehničkom rešenju objave, postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na 77 i jedna druga aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: pozicija koja odgovara bilo kojoj drugoj od aminokiselina 1-181 u SEQ ID NO: 1 ili pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu) ili na poziciji 182 (tj., na karboksil terminusu proteina) u njoj ili na odgovarajućim aminokiselinama u SEQ ID NO: 2-7 ili drugom modifikovanom FGF-21 polipeptidu objave. U sledećem tehničkom rešenju objave, postoji aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na 77 i jedna druga aminokiselina koja se ne sreće u prirodi na jednoj ili više od sledećih pozicija: 131, 108, 77, 72, 87, 86, 126, 110, 83, 146, 135, 96, i 36 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 2-7).

VII. Ekspresija u neeukariotima i eukariotima

I. Ekspresioni sistemi, kultura i izolacija

[0287] Nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu se eksprimirati u bilo kojem broju pogodnih ekspresionih sistema uključujući, na primer, kvasac, insekatske ćelije, sisarske ćelije, i bakterije. Opis primera ekspresionih sistema dat je u nastavku.

[0288] Kvasac: Kako se ovde koristi, izraz "kvasac" uključuje neki od različitih kvasaca sposobnih da eksprimiraju gen koji kodira modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0289] Od posebnog interesa za upotrebu sa predmetnom objavom su vrste u rodovima Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, i Candida, uključujući ali ne ograničavajući se na, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, i H. polymorpha. WO 2005/091944, ovde opisuje ekspresiju FGF-21 u kvascu.

[0290] Baculovirusom inficirane insekatske ćelije: Izraz "insekatski domaćin" ili "insekatska ćelija-domaćin" odnosi se na insekta koji može biti ili je bio upotrebljen kao primalac rekombinantnog vektora ili druge transfer DNK. Izraz uključuje potomstvo originalne insekatske ćelije-domaćina koja je bila transfektovana. Podrazumeva se da potomstvo jedne roditeljske ćelije ne mora obavezno biti potpuno identično po morfologiji ili genomskom ili ukupnom DNK komplementu sa originalnim roditeljem, zbog slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditelju da bi se karakterisalo relevantnom osobinom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira modifikovani FGF-21 polipeptid, uključeno je u potomstvo na koje se odnosi ova definicija.

E. Coli, vrste roda Pseudomonas, i drugi prokarioti:

[0291] Izraz "bakterijski domaćin" ili "bakterijska ćelija-domaćin" odnosi se na bakteriju koja može biti ili je bila upotrebljena kao primalac rekombinantnog vektora ili druge transfer DNK. Izraz uključuje potomstvo originalne bakterijske ćelije-domaćina koja je bila transfektovana. Podrazumeva se da potomstvo jedne roditeljske ćelije ne mora obavezno biti potpuno identično po morfologiji ili genomskom ili ukupnom DNK komplementu sa originalnim roditeljem, zbog slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditelju da bi se karakterisalo relevantnom osobinom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid, uključeno je u potomstvo na koje se odnosi ova definicija.

[0292] U izboru bakterijskih domaćina za ekspresiju, pogodni domaćini mogu uključivati one za koje je između ostalih dokazano da imaju dobar kapacitet formiranja inkluzionih tela, nisku proteolitičku aktivnost, i ukupnu robusnost. U industrijskoj/farmaceutskoj fermentaciji obično se koriste bakterije izvedene iz K sojeva (npr. W3110) ili iz bakterija izvedenih iz B sojeva (npr. BL21). Drugi primeri pogodnih E. coli domaćina uključuju, ali se ne ograničavaju na sojeve BL21, DH10B, ili njihove derivate. U drugom tehničkom rešenju postupaka predmetne objave, E.

coli domaćin je proteaza minus soj, uključujući, ali ne ograničavajući se na OMP- i LON-. Soj ćelije-domaćina mogu biti vrste Pseudomonas, uključujući, ali ne ograničavajući se na Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, i Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, naznačeni soj MB 101, poznat je kao koristan za rekombinantnu proizvodnju i dostupni su za procese proizvodnje terapijskih proteina.

[0293] Kada se uspostavi soj rekombinantne ćelije-domaćina (tj., ekspresioni konstrukt je uveden u ćeliju-domaćina i ćelije-domaćini sa ispravnim ekspresionim konstruktom su izolovane), rekombinantni soj ćelija-domaćina kultiviše se pod uslovima odgovarajućim za proizvodnju modifikovanih FGF-21 polipeptida.

[0294] Rekombinantne ćelije-domaćini mogu da se kultivišu u seriji ili kontinuiranim formatima, uz sakupljanje ćelija (u slučaju kada se modifikovani FGF-21 polipeptid akumulira unutarćelije) ili sakupljanjem supernatanta kulture, u formatu serije ili kontinuirano.

[0295] Modifikovani FGF-21 polipeptidi proizvedeni u bakterijskim ćelijama-domaćinima mogu biti slabo rastvorljivi ili nerastvorljivi (u formi inkluzionih tela). U jednom tehničkom rešenju predmetne objave, aminokiselinske supstitucije koje se biraju u svrhu povećanja rastvorljivosti rekombinantno proizvedenog proteina, mogu lako da se naprave u modifikovanom FGF-21 polipeptidu. Modifikovani FGF-21 polipeptid može da se solubilizuje, na primer, ureom ili guanidin hidrohloridom.

[0296] U slučaju rastvorljivog modifikovanog FGF-21 proteina, FGF-21 može da se sekretuje u periplazmatski prostor ili u kultivacioni medijum. Na primer, modifikovani FGF-21 se sekretuje u periplazmatski prostor W3110-B2 ćelija korišćenjem plazmida koji kodiraju konstrukte koji uključuju osam različitih liderskih sekvenci, uključujući one navedene u SEQ ID NO: 39-44, i transformisanjem ovih u W3110-B2 ćelije, ćelije zatim rastu na 37°C dok OD ne dostigne oko 0.8, kada se ekspresija indukuje 0.01% arabinozom. Pet sati kasnije, iz kultura se mogu pripremiti uzorci oslobođeni u periplazmu. Pored toga, rastvorljivi modifikovani FGF-21 može biti prisutan u citoplazmi ćelija-domaćina. Pre izvođenja koraka prečišćavanja može biti poželjno koncentrisati rastvorljivi modifikovani FGF-21.

[0297] Kada se modifikovani FGF-21 polipeptid proizvodi kao fuzioni protein, fuziona sekvenca može da se ukloni. Uklanjanje fuzione sekvence može da se obavi enzimskim ili hemijskim sečenjem. Enzimsko uklanjanje fuzionih sekvenci može se obaviti korišćenjem postupaka poznatih prosečno obučenom stručnjaku u oblasti. Izbor enzima za uklanjanje fuzione sekvence može se odrediti identitetom fuzije, i reakcioni uslovi mogu da se odrede izborom enzima što će biti očigledno prosečno obučenom stručnjaku u oblasti. Hemijsko sečenje može da se izvede korišćenjem reagenasa poznatih stručnjaku prosečno obučenom u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na cijanogen bromid, TEV proteazu, i druge reagense. Isečeni modifikovani FGF-21 polipeptid može da se prečisti od odečene fuzione sekvence postupcima poznatim prosečno obučenom stručnjaku u oblasti.

[0298] Uopšteno, povremeno je poželjno denaturisati i redukovati eksprimirane polipeptide i zatim izazvati da se polipeptidi ponovo saviju u poželjnu konformaciju. Na primer, guanidin, urea, DTT, DTE, i/ili šaperonin mogu se dodati translacionom proizvodu od interesa. Proteini mogu da se ponovo saviju u redoks puferu koji sadrži, uključujući, bez ograničavanja, oksidisani glutation i L-arginin. Reagensi za ponovno savijanje mogu se uliti ili na drugi način dovesti u kontakt sa jednim ili više polipeptida ili drugog ekspresionog proizvoda, ili obrnuto.

[0299] U slučaju proizvodnje modifikovanog FGF-21 polipeptida u prokariotu, modifikovani FGF-21 polipeptid tako proizveden može biti pogrešno savijen i tako ima smanjenu biološku aktivnost ili je uopšte nema. Bioaktivnost proteina može se ponovo uspostaviti "ponovnim savijanjem". Uopšteno, pogrešno savijeni nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid se ponovo savija solubilizovanjem (kada je modifikovani FGF-21 polipeptid i nerastvorljiv), razvijanjem i redukovanjem polipeptidnog lanca korišćenjem, na primer, jednog ili više haotropnih sredstava (npr. urea i/ili guanidin) i redukujućeg sredstva sposobnog da redukuje disulfidne veze (npr. ditiotreitol, DTT ili 2-merkaptoetanol, 2-ME). Pri umerenoj koncentraciji haotropa, oksidišuće sredstvo se zatim doda (npr., kiseonik, cistin ili cistamin), što omogućava ponovno formiranje disulfidnih veza. Modifikovani FGF-21 polipeptid može da se ponovo savije korišćenjem standardnih postupaka poznatih u struci, kao što su oni opisani u američkom pat. br.

4,511,502, 4,511,503, i 4,512,922. Modifikovani FGF-21 polipeptid može takođe da se savija zajedno sa drugim proteinima da formira heterodimere ili heteromultimere.

[0300] Posle ponovnog savijanja, modifikovani FGF-21 može dodatno da se prečišćava. Prečišćavanje modifikovanog FGF-21 može da se obavi korišćenjem različitih tehnika poznatih onima koji su prosečno obučeni u struci, uključujući hromatografiju hidrofobne interakcije, hromatografiju zasnovanu na veličini čestica, jonoizmenjivačku hromatografiju, reverzno-faznu tečnu hromatografiju visokih performansi, afinitetnu hromatografiju, i slično ili bilo koju njihovu kombinaciju. Dodatnao prečišćavanje može uključivati i korak sušenja ili precipitacije prečišćenog proteina.

[0301] Posle prečišćavanja, modifikovani FGF-21 može biti stavljan u različite pufere i/ili koncentrisan nekim od različitih postupaka poznatih u struci, uključujući ali ne ograničavajući se na dijafiltraciju i dijalizu. Modifikovani FGF-21 koji je obezbeđen kao pojedinačni prečišćen protein, može se izložiti agregaciji i precipitaciji.

[0302] Prečišćeni modifikovani FGF-21 može biti čist najmanje 90% (kako je mereno reverznofaznom tečnom hromatografijom visokih performanski, RP-HPLC, ili elektroforezom na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu, SDS-PAGE) ili čist najmanje 95%, ili čist najmanje 98%, ili čist najmanje 99% ili čistiji. Bez obzira na tačnu brojčanu vrednost čistoće modifikovanog FGF-21, modifikovani FGF-21 je dovoljno čist da se koristi kao farmaceutski proizvod ili za dalju obradu, kao što je konjugacija sa polimerom rastvorljivim u vodi, kao što je PEG.

[0303] Određeni modifikovani FGF-21 molekuli mogu se primeniti kao terapijska sredstva u odsustvu drugih aktivnih sastojaka ili proteina (osim ekscipijenasa, nosača i stabilizatora, serumskog albumina i slično), ili mogu biti u kompleksu sa drugim proteinima ili polimerom.

[0304] U nekim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića, prinos modifikovanog FGF-21 nakon svakog koraka prečišćavanja može biti najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, najmanje oko 99.9%, ili najmanje oko 99.99%, nemodifikovanog ili modifikovanog FGF-21 u polaznom materijalu za svaki korak prečišćavanja.

VIII. Ekspresija u alternativnim sistemima

[0305] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se eksprimovati primenom bezćelijskog (npr., in vitro) translacionog sistema. Translacioni sistemi mogu biti ćelijski ili bezćelijski, i mogu biti i prokariotski ili eukariotski. Ćelijski translacioni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, preparate celih ćelija, kao što su permeabilizovane ćelije ili ćelijske kulture, pri čemu se željena sekvenca nukleinske kiseline može transkribovati u mRNA i mRNA translirati. Bezćelijski translacioni sistemi su komercijalno dostupni i poznati su mnogi različiti tipovi i sistemi. Primeri bezćelijskih sistema uključuju, ali nisu ograničeni na, prokariotske lizate kao što su Escherichia coli lizati, i eukariotske lizate kao što su ekstrakti pšeničnih klica, lizati ćelija insekta, lizati zečijih retikulocita, lizati jajnih ćelija zeca i lizati humanih ćelija. Dostupni su i membranski ekstrakti, kao što su pseći ekstrakti pankreasa koji sadrže mikrozomalne membrane, koji su primenljivi za translaciju sekrecijskih proteina.

IX. Makromolekularni polimeri kuplovani sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima

[0306] Različite modifikacije neprirodnih aminokiselina ovde opisanih polipeptida mogu se izvršiti primenom kompozicija, postupaka, tehnika i strategija ovde opisanih. Ove modifikacije uključuju inkorporiranje dalje funkcionalnosti na neprirodnu aminokiselinsku komponentu polipeptida, uključujući, ali bez ograničenja, obeleživač; boju; polimer; vodorastvorni polimer; derivat polietilen glikola; fotokroslinker; radionuklid; citotoksično jedinjenje; lek; obeleživač afiniteta; obeleživač fotoafiniteta; reaktivno jedinjenje; smolu; drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida; antitelo ili fragment antitela; metalni helator; kofaktor; masnu kiselinu; ugljeni hidrat; polinukleotid; DNK; RNK; antisense polinukleotid; saharid; vodorastvorni dendrimer; ciklodekstrin; inhibitornu ribonukleinsku kiselinu; biomaterijal; nanočesticu; spin obeleživač; fluorofor, deo koji sadrži metal; radioaktivni deo; novu funkcionalnu grupu; grupu koja kovalentno ili nekovalentno interaguje sa drugim molekulima; fotoosetljivi deo; aktinični radioaktivno pobuđeni deo; fotoizomeribilni deo; biotin; derivat biotina; analog biotina; deo koji inkorporira teški atom; hemijski odlazeću grupa; fotoodlazeću grupu; izduženi bočni lanac; šećer vezan sa ugljenikom; redoks-aktivno sredstvo; amino tiokiselinu; toksični deo; izotopski obeleženi deo; biofizičku sondu; fosforescentnu grupu; hemiluminescentnu grupu; elektron gustu grupu; magnetnu grupu; interkalacionu grupu; hromofor; sredstvo za prenos energije; biološki aktivno sredstvo; detektabilni obeleživač; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; sredstvo za hvatanje neutrona; ili bilo koju kombinaciju gore navedenog, ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili supstancu. Kao ilustrativni, neograničavajući primer ovde opisanih kompozicija, postupaka, tehnika i strategija, sledeći opis će se fokusirati na dodavanje makromolekularnih polimera neprirodnoj aminokiselini polipeptida, uz razumevanje da su opisane kompozicije, postupci, tehnike i strategije takođe primenljive (uz odgovarajuće modifikacije, ako je potrebno i koje stručnjak iz date oblasti tehnike može napraviti sa ovim otkrićima) za dodavanje drugih funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na one gore navedene.

[0307] Širok spektar makromolekularnih polimera i drugih molekula može da bude vezan sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima predmetnog otkrića kako bi se modulisala biološka svojstva modifikovanog FGF-21 polipeptida, i/ili obezbedila nova biološka svojstva modifikovanom FGF-21 molekulu. Ovi makromolekularni polimeri mogu se vezati sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom putem prirodne kodirane aminokiseline, neprirodne kodirane aminokiseline, ili bilo kojim funkcionalnim supstituentom prirodne ili neprirodne aminokiseline, ili bilo kojim supstituentom ili funkcionalnom grupom koji su dodati na prirodnu ili neprirodnu aminokiselinu. Molekularna težina polimera može biti u širokom opsegu, uključujući, ali bez ograničenja, između oko 100 Da i oko 100,000 Da ili više. Molekularna težina polimera može biti između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući, ali bez ograničenja, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekularna težina polimera je između oko 100 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima molekularna težina polimera je između oko 100 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekularna težina polimera je između oko 1,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekularna težina polimera je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekularna težina polimera je između oko 10,000 Da i oko 40,000 Da.

[0308] Odabrani polimer može biti rastvorljiv u vodi, tako da se protein za koji je vezan ne taloži u vodenoj sredini, kao što je fiziološka sredina. Polimer može biti razgranat ili nerazgranat. Za terapijsku primenu krajnjeg proizvoda, polimer može biti farmaceutski prihvatljiv.

[0309] Primeri polimera uključuju ali nisu ograničeni na polialkil etre i njihove alkoksi-zatvorene analoge (npr., polioksietilen glikol, polioksietilen/propilen glikol, i njihovi metoksi ili etoksizatvoreni analozi, posebno polioksietilen glikol, poslednji poznat i kao polietilen glikol ili PEG); diskretni PEG (dPEG); polivinilpirolidone; polivinilalkil etre; polioksazoline, polialkil oksazoline i polihidroksialkil oksazoline; poliakrilamide, polialkil akrilamide, i polihidroksialkil akrilamide (npr., polihidroksipropilmetakrilamid i njegovi derivati); polihidroksialkil akrilate; polisijalne kiseline i njihove analoge; hidrofilne peptidne sekvence; polisaharide i njihove derivate, uključujući dekstran i derivate dekstrana, npr., karboksimetildekstran, dekstran sulfate, aminodekstran; celulozu i njene derivate, npr., karboksimetil celulozu, hidroksialkil celulozu; hitin i njegove derivate, npr., hitozan, sukcinil hitozan, karboksimetilhitin, karboksimetilhitozan; hijaluronska kiselina i njeni derivati; skrobove; alginate; hondroitin sulfat; albumin; pululan i karboksimetil pululan; poliaminokiseline i njihove derivate, npr., poliglutaminske kiseline, polizine, poliaspartanske kiseline, poliaspartamide; kopolimere anhidrida maleinske kiseline kao što su: kopolimer anhidrida maleinske kiseline stirena, kopolimer anhidrida maleinske kiseline diviniletil etra; polivinil alkohole; njihovi kopolimeri; njihovi terpolimeri; njihove smeše; i derivati prethodno navedenog.

[0310] Kako se ovde primenjuje, i kada se razmatraju PEG:modifikovani FGF-21 polipeptidni konjugati, termin "terapijski efikasna količina" odnosi se na količinu koja pacijentu daje željenu korist. Količina može varirati od pojedinca do pojedinca i može zavisiti od niza faktora, uključujući celokupno fizičko stanje pacijenta i osnovni uzrok stanja koje treba lečiti. Količina modifikovanog FGF-21 polipeptida koji se primenjuje za terapiju daje prihvatljivu brzinu promena i održava željeni odgovor na povoljnom nivou.

[0311] Vodorastvorni polimer može biti bilo kog strukturnog oblika uključujući, ali bez ograničenja linearni, račvasti ili razgranati. Tipično, vodorasvorni polimer je poli(alkilen glikol), kao što je poli(etilen glikol) (PEG), ali takođe se mogu koristiti i drugi vodorastvorni polimeri. Kao primer, PEG se primenjuje da opiše određena tehnička rešenja ovog otkrića.

[0312] Termin "PEG" se široko primenjuje da obuhvati bilo koji molekul polietilen glikola, bez obzira na veličinu ili modifikaciju na kraju PEG, i može se predstaviti kao vezan sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom formulom:

XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y

gde n je 2 do 10,000 i X je H ili terminalna modifikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na C1-4alkil, zaštitnu grupu ili terminalnu funkcionalnu grupu.

[0313] U nekim slučajevima, PEG koji se primenjuje u polipeptidima ovog otkrića završava se na jednom kraju sa hidroksi ili metoksi, tj., X je H ili CH3("metoksi PEG"). Alternativno, PEG se može završiti sa reaktivnom grupom, stvarajući tako bifunkcionalni polimer. Tipične reaktivne grupe mogu da uključuju one reaktivne grupe koje se obično primenjuju za reakciju sa funkcionalnim grupama koje se nalaze u 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući, ali bez ograničenja na maleimidne grupe, aktivirane karbonate (uključujući, ali bez ograničenja na, pnitrofenil estar), aktivirane estre (uključujući, ali bez ograničenja na N-hidroksisukcinimid, pnitrofenil estar) i aldehide) kao i funkcionalne grupe koje su inertne prema 20 uobičajenih aminokiselina, ali koje specifično reaguju sa komplementarnim funkcionalnim grupama prisutnim u neprirodnim kodiranim aminokiselinama (uključujući, ali bez ograničenja na azidne grupe, alkinske grupe). Primećeno je da se drugi kraj PEG, koji je u gornjoj formuli prikazan sa Y, može prikačiti ili direktno ili indirektno na modifikovani FGF-21 polipeptid preko prirodne aminokiseline ili neprirodne kodirane aminokiseline. Na primer, Y može da bude amid, karbamat ili urea vezana sa amino grupom (uključujući, ali bez ograničenja na, epsilon amin lizina ili N-završetke) polipeptida. Alternativno, Y može da bude maleimid vezan sa tiolnom grupom (uključujući, ali bez ograničenja na, tiolnu grupu cisteina). Alternativno, Y može da bude vezan sa ostatkom kojem nije uobičajeno dostupan preko 20 uobičajenih aminokiselina. Na primer, azidna grupa na PEG može reagovati sa alkinskom grupom na modifikovanom FGF-21 polipeptidu da se formira proizvod Huisgen [3+2] cikloadicije. Alternativno, alkinska grupa na PEG može reagovati sa azidnom grupom prisutnom u neprirodnoj kodiranoj aminokiselini da se formira sličan proizvod. U nekim tehničkim rešenjima, jaki nukleofil (uključujući, ali bez ograničenja na, hidrazin, hidrazid, hidroksilamin, semikarbazid) može reagovati sa aldehidnom ili keto grupom prisutnom u neprirodnoj kodiranoj aminokiselini da se formira hidrazon, oksim ili semikarbazon, prema potrebi, koji se u nekim slučajevima može dalje smanjiti tretiranjem odgovarajućim redukcionim sredstvom. Alternativno, jaki nukleofil se može ugraditi u modifikovani FGF-21 polipeptid preko neprirodne kodirane aminokiseline i primenjuje se za prioritetnu reakciju sa keto ili aldehidnom grupom prisutnom u vodorastvornom polimeru.

[0314] Bilo koja molekularna masa za PEGmože se primeniti prema praktičnoj želji, uključujući, ali bez ograničenja na, od oko 100 daltona (Da) do 100,000 Da ili više po želji (uključujući, ali bez ograničenja na, ponekad 0.1-50 kDa ili 10-40 kDa). Molekularna težina PEG može biti u širokom opsegu, uključujući, ali bez ograničenja na, između oko 100 Da i oko 100,000 Da ili više. PEG može da bude između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući, ali bez ograničenja na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. PEG-ovi razgranatog lanca, uključujući, ali bez ograničenja na, PEG molekule sa svakim lancem koji ima MW opsega od 1-100 kDa (uključujući, ali bez ograničenja na, 1-50 kDa or 5-20 kDa) mogu se takođe primeniti. Molekularna težina svakog lanca PEG razgranatog lanca može da bude, uključujući, ali bez ograničenja na, između oko 1,000 Da i oko 100,000 Da ili više. Molekularna težina svakog lanca PEG razgranatog lanca može da bude između oko 1,000 Da i oko 100,000 Da, uključujući, ali bez ograničenja na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, i 1,000 Da. Generalno, najmanje jedan završetak PEG molekula je dostupan za reakciju sa neprirodnom kodiranom aminokiselinom. Na primer, PEG derivati koji sadrže alkinske i azidne delove za reakciju sa aminokiselinskim bočnim lancem mogu da se primene da prikače PEG za neprirodne kodirane aminokiseline kako je ovde opisano. Ako neprirodna kodirana aminokiselina obuhvata azid, tada PEG može tipično da sadrži ili alkinski ostatak da se postigne formiranje proizvoda [3+2] cikloadicije ili aktivirane PEG vrste (tj., estar, karbonat) koje sadrže fosfinsku grupu da se postigne formiranje amidne veze. Alternativno, ako neprirodna kodirana aminokiselina obuhvata alkin, tada PEG može tipično da sadrži azidni deo da se postigne formiranje proizvoda [3+2] Huisgen cikloadicije. Ako neprirodna kodirana aminokiselina obuhvata karbonilnu grupu, PEG može tipično da obuhvati potentni nukleofil (uključujući, ali bez ograničenja na, hidrazid, hidrazin, hidroksilamin, ili semikarbazid) kako bi se postiglo formiranje odgovarajućih hidrazon, oksim, i semikarbazon veza. U drugim alternativama, može se primeniti obrnuta orijentacija gore opisanih reaktivnih grupa, tj., azidni deo u neprirodnoj kodiranoj aminokiselini može da reaguje sa PEG derivatom koji sadrži alkin.

[0315] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid sa PEG derivatom sadrži hemijsku funkcionalnost koja je reaktivna sa hemijskom funkcionalnosti prisutnom na bočnom lancu neprirodne kodirane aminokiseline.

[0316] Otkriće obezbeđuje u nekim tehničkim rešenjima derivate polimera koji sadrže azid i acetilen koji obuhvata osnovu vodorastvornog polimera koji ima prosečnu molekularnu težinu od oko 800 Da do oko 100,000 Da. Osnova polimera vodorastvornog polimera može da bude poli(etilen glikol). Međutim, treba razumeti da je širok spektar vodorastvornih polimera uključujući, ali bez ograničenja na poli(etilen)glikol i druge srodne polimere, uključujući poli(dekstran) i poli(propilen glikol), takođe pogodan za primenu u predmetno otkrivenim polipeptidima i da primena termina PEG ili poli(etilen glikol) je namenjena da obuhvati i uključi sve takve molekule.

[0317] Osnova polimera može da bude linearna ili razgranata. Razgranete polimerne osnove su opšte poznate u stanju tehnike. Tipično, razgranati polimer ima sredinu jezgra centralne grane i mnoštvo linearnih polimernih lanaca vezanih sa jezgrom centralne grane. Razgranati PEG takođe može biti u obliku račvastog PEG koji je predstavljen sa PEG(--YCHZ2)n, gde Y je vezna grupa i Z je aktivirana terminalana grupa vazana za CH lancem atoma definisane dužine. Još jedan razgranati oblik, pandan PEG, ima reaktivne grupe, kao što je karboksil, duž PEG osnove, umesto na kraju PEG lanaca.

[0318] Mnogi drugi polimeri su takođe pogodni za primenu u polipeptidima predmetnog otkrića. Primeri pogodnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, druge poli(alkilen glkole), kao što je poli(propilen glikol) ("PPG"), njihove kopolimerimere (uključujući, ali bez ograničenja na kopolimere etilen glikola i propilen glikola), terpolimere, njihove smeše, i slično. Iako molekularna težina svakog lanca polimerne osnove može da varira, ona je tipično u opsegu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, često od oko 6,000 Da do oko 80,000 Da. Molekularna težina svakoh lanca polimerne osnove može da bude između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući, ali bez ograničenja na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da.

[0319] Vodorastvorni polimeri mogu se vezati za modifikovani FGF-21 polipeptid ovog otkrića. Vodorastvorni polimeri mogu se vezati preko neprirodne kodirane aminokiseline ugrađene u modifikovani FGF-21 polipeptid ili bilo koje funkcionalne grupe ili supstituenta neprirodne kodirane ili prirodne kodirane aminokiseline, ili bilo koje funkcionalne grupe ili supstituenta koji su dodati u neprirodnu kodiranu ili prirodnu kodiranu aminokiselinu. Alternativno, vodorastvorni polimeri su vezani za modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata neprirodnu kodiranu aminokiselinu preko aminokiseline koja se javlja u prirodi (uključujući, ali bez ograničenja na, cistein, lizin ili amino grupu N-terminalnog ostatka). U nekim slučajevima, modifikovani FGF-21 polipeptidi ovog otkrića obuhvataju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 neprirodnih aminokiselina, pri čemu jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina su vezane za vodorastvorni polimer(e) (uključujući, ali bez ograničenja na, PEG i/ili oligosaharide). U nekim slučajevima, modifikovani FGF-21 polipeptidi ovog otkrića dalje obuhvataju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više prirodnih kodiranih aminokiselina koje su vezane za vodorastvorne polimere. U nekim slučajevima, modifikovani FGF-21 polipeptidi ovog otkrića obuhvataju jednu ili više neprirodnih kodiranih aminokiselina vezanih za vodorastvorne polimere i jednu ili više aminokiselina koje se nalaze u prirodi vezane za vodorastvorne polimere. U nekim tehničkim rešenjima, vodorastvorni polimeri primenjeni u predmetnom otkriću povećavaju poluživot seruma modifikovanog FGF-21 polipeptida u odnosu na uporedno jedinjenje kao što je FGF-21 polipeptid iz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:201, isti FGF-21 polipeptid bez navedenog vodorastvornog polimera, ili drugo uporedno jedinjenje opisano na drugom mestu ovde.

[0320] Broj vodorastvornih polimera vezanih za modifikovani FGF-21 polipeptid (tj., obim PEGilacije ili glikozilacije) predmetnog otkrića može da se prilagodi da obezbedi izmenjenu (uključujući, ali bez ograničenja na, rastuću ili opadajuću) farmakološku, farmakokinetičku, ili farmakodinamičku karakteristiku kao što je in vivo poluživot. U nekim tehničkim rešenjima, poluživot modifikovanog FGF-21 raste najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 procenata, 2-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta, 11-puta, 12-puta, 13-puta, 14-puta, 15-puta, 16-puta, 17-puta, 18-puta, 19-puta, 20-puta, 25-puta, 30-puta, 35-puta, 40-puta, 50-puta, ili najmanje oko 100-puta u odnosu na nemodifikovani polipeptid.

PEG derivati koji sadrže jaku nukleofilnu grupu (tj., hidrazid, hidrazin, hidroksilamin ili semikarbazid)

[0321] U jednom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata karbonil koji sadrži neprirodnu kodiranu aminokiselinu može se modifikovati sa PEG derivatom koji sadrži terminalni hidrazinski, hidroksilaminski, hidrazidni ili semikarbazidni deo koji je direktno vezan za PEG osnovu.

[0322] Stepen i mesta na kojima su vodorastvorni polimer(i) vezani za modifikovani FGF-21 polipeptid mogu da moduliraju vezivanje modifikovanog FGF-21 polipeptida za FGF-21 polipeptidni receptor. U nekim tehničkim rešenjima, veze mogu da budu raspoređena tako da modifikovani FGF-21 polipeptid veže FGF-21 polipeptidni receptor sa Kdod oko 400 nM ili nižim, sa Kdod 150 nM ili nižim, i u nekim slučajevima sa Kdof 100 nM ili nižim, mereno testom ravnotežnog vezivanja, kao što je opisano u Spencer i sarad., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) za modifikovani FGF-21.

[0323] Postupci i hemija za aktivaciju polimera kao i za konjugaciju peptida opisani su u literaturi i poznati su u stanju tehnike. Uobičajeni primenjeni postupci za aktivaciju polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, aktivaciju funkcionalnih grupa sa cijanogen bromidom, perjodatom, glutaraldehidom, biepoksidima, epihlorohidrinom, divinilsulfonom, karbodiimidom, sulfonilhalidima, trihlorotriazinom, itd.PEGilacija (tj., dodavanje bilo kog vodorastvornog polimera) modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže neprirodnu kodiranu aminokiselinu, kao što je p-azido-L-fenilalanin, može da se izvrši bilo kojim pogodnim postupkom, kao što su oni opisani u U.S. patentu broj 8,012,931. Vodorastvorni polimer vezan za aminokiselinu modifikovanog FGF-21 polipeptida ovog otkrića može se dalje derivatizovati ili supstituisati bez ograničenja.

[0324] U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovni FGF-21 polipeptid može se modifikovati sa PEG derivatom koji sadrži azidni deo koji može da reaguje sa alkinskim delom koji je prisutan na bočnom lancu neprirodne kodirane aminokiseline. Uopšteno, PEG derivati mogu da imaju prosečnu molekularnu težinu opsega od 1-100 kDa i, u nekim tehničkim rešenjima, od 10-40 kDa.

[0325] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivat sa terminalnim azidom može da ima strukturu:

RO-(CH2CH2O)nO-(CH2)m-N3

gde R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekularna težina je između 5-40 kDa).

[0326] U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, PEG derivat sa terminalnim azidom može da ima strukturu:

RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3

gde R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekularna težina je između 5-40 kDa).

[0327] U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata aminokiselinu koja sadrži alkin može se dalje modifikovati sa razgranatim PEG derivatom koji sadrži terminalni azidni deo, sa svakim lancem razgranatog PEG koji ima MW opsega od 10-40 kDa i može da bude od 5-20 kDa. Na primer, u nekim tehničkim rešenjima, PEG derivat sa terminalnim azidom može da ima sledeću strukturu:

[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3

gde R je jednostavni alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, i n je 100-1,000, i X je opciono O, N, S ili karbonilna grupa (C=O), u svakom slučaju koji može biti prisutan ili odsutan.

[0328] U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid može se modifikovti sa PEG derivatom koji sadrži alkinski deo koji može reagovati sa azidnim delom koji je prisutan na bočnom lancu neprirodne kodirane aminokiseline.

U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid može se modifikovati sa PEG derivatom koji sadrži aktiviranu funkcionalnu grupu (uključujući, ali bez ograničenja na, estar, karbonat) koja dalje obuhvata aril fosfinsku grupu koja može reagovati sa azidnim delom prisutan na bočnom lancu neprirodne kodirane aminokiseline.

[0329] Modifikovani FGF-21 polipeptid može se konjugovati sa PEG koji sadrži hidrazid sledećim primernim postupcima. Modifikovani FGF-21 polipeptid sa ugrađenom aminokiselinom koja sadrži karbonil (kao što je pAcF) može se pripremiti prema gore opisanom postupku. Jednom modifikovani, PEG koji sadrži hidrazid sledeće strukture može se konjugovti sa modifikovanim FGF-21 polipeptidom:

R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2

[0330] gde, na primer, R = metil, n=2 i N = 10,000 MW i X je karbonil (C=O) grupa. Prečišćeni modifikovani FGF-21 koji sadrži p-acetilfenilalanin je rastvoren između 0.1-10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, reaguje sa 1 do 100-strukim viškom PEG koji sadrži hidrazid, i odgovarajući hidrazon je smanjen in situ dodavanjem zaliha 1M NaCNBH3(Sigma Chemical, St. Louis, MO), rastvoren u H2O, do krajnje koncentracije od 10-50 mM. Reakcije se izvode u mraku na 4 °C do sobne temperature za 18-24 sati. Reakcije se zaustavljaju dodavanjem 1 M Tris (Sigma Chemical, St. Louis, MO) na oko pH 7.6 do krajnje Tris koncentracije od 50 mM ili razblažene u odgovarajućem puferu za trenutno prečišćavanje.

Uvođenje aminokiseline koja sadrži alkin u modifikovani FGF-21 polipeptid i derivatizacija sa Mpeg-azidom

[0331] Modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže aminokiselinu koja sadrži alkin mogu se proizvesti i mogu se derivatizovati sa mPEG-azidom sledećim primernim postupcima. Odabrani položaj može da bude supstituisan sa sledećom neprirodnom kodiranom aminokiselinom:

[0332] Sekvence koriščene za ugrađivanje p-propargil-tirozina specifično na mesto u modifikovani FGF-21 mogu da budu SEQ ID NO: 1 (FGF-21), SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNA, M. jannaschii mtRNA ), 22, 23 ili 24 gore opisano. Modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži propargil tirozin može da bude ekspresovan u E. coli i prečišćen primenom gore opisanih uslova za prečišćavanje modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil.

[0333] Prečišćeni modifikovani FGF-21 koji sadrži propargil-tirozin rastvoren između 0.1-10 mg/mL u PB puferu (100 mM natrijum fosfata, 0.15 M NaCl, pH = 8) i 10 do 1000-puta viška PEG koji sadrži azid su dodati u reakcionu smešu. Katalitička količina CuSO4i Cu žice je zatim dodata u reakcionu smešu. Nakon što je smeša inkubirana (uključujući, ali bez ograničenja na oko 4 sata na sobnoj temperaturi ili 37° C, ili preko noći na 4°C), dodata je H2O i smeša je filtrirana kroz dijaliznu membranu. Uzorak može da bude analiziran kako bi se potvrdio prinos.

X. Fuzioni proteini koji sadrže modifikovane FGF-21 polipeptide

[0334] Otkriće takođe obezbeđuje modifikovane FGF-21 polipeptide, ili njihove fragmente, koji obuhvataju sekvencu modifikovanog FGF-21 polipeptida i fuzioni partner. Fuzioni partner može doprineti funkcionalnom svojstvu, uključujući, ali bez ograničenja na, produženje poluživota, olakšavajuće prečišćavanje i/ili proizvodnju proteina, poboljšana biofizička svojstva kao što je porast rastvorljivosti ili stabilnosti, i smanjenje imunogenosti ili toksičnosti, ili bilo koja druga svrha. Na primer, fuzioni protein može pokazati produženi in vivo poluživot, omogućavajući tako ređe doziranje (kao što je doziranje dva puta nedeljno, jednom nedeljno, ili jednom svake druge nedelje, itd.) u terapijskom režimu. Primerni fuzioni proteini obuhvataju modifikovani FGF-21 koji je fuzionisan sa fuzionim partnerom kao što je albumin (npr., humani serum albumin), PK produžavajući (PKE) adnektin, XTEN, Fc domen, ili fragment bilo čega od prethodno navedenog, ili kombinacija bilo čega od prethodno navedenog. Fuzioni protein može da bude proizveden ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira sekvencu modifikovanog FGF-21 polipeptida i sekvencu fuzionog partnera u istom okviru za čitanje, opciono odvojene sekvencom koja kodira peptid koji povezuje. Fuzioni protein može da obuhvata modifikovni FGF-21 polipeptid i fuzioni partner u bilo kom redosledu, npr., jedan ili više fuzionih partnera koji su vezani za N-završetak i/ili C-završetak sekvence modifikovanog FGF-21 polipeptida, ili jednog ili više fuzionih partnera koji su vezani i za N-završetak i za C-završetak.

[0335] Fuzija se može formirati kačenjem fuzionog partnera za bilo koji kraj (tj., N ili C-završetak) modifikovanog FGF-21 polipeptida, tj., fuzioni partner-modifikovani FGF-21 ili modifikovani FGF-21-fuzioni partner. Pored toga, modifikovani FGF-21 polipeptid može da bude fuzionisan sa jednim ili više fuzionih partnera na oba kraja, opciono sa spajajućim peptidom na jedan od krajeva ili oba kraja. U određenim tehničkim rešenjima, fuzioni partner i modifikovani FGF-21 su fuzionisani preko spajajućeg peptida. Primerni spajajući peptidi mogu da obuhvate ili da se sastoje od sekvence odabrane od SEQ ID NO:74-100, 301, i 350-383, ili kombinacije prethodno navedenih (npr., dve, tri, ili više prethodno navedenih sekvenci). Primerni spajajući peptidi mogu da imaju dužine između 0 (tj., spajajući peptid nije prisutan) i 100 ili više aminokiselina, kao što je između najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 i do 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, ili 11 aminokiselina. Primerne neograničavajuće dužine spajajućeg peptida uključuju između 1 i 100 aminokiselina, 1 i 40 aminokiselina, između 1 i 20 aminokiselina, između 1 i 10 aminokiselina, ili između 3 i 5 aminokiselina u dužini.

[0336] Modifikovani FGF-21 polipeptid, ili njegov fragment, može se proizvesti kao fuzioni protein koji obuhvata humani serum albumin (HSA) ili njegov deo. Takve fuzione konstrukcije mogu biti pogodne za povećanje ekspresije modifikovanog FGF-21, ili njegovog fragmenta, u eukariotskoj ćeliji domaćina, kao što je CHO, ili u bakteriji kao što je E. coli. Primerni HSA delovi uključuju N-terminalni polipeptid (aminokiseline 1-369, 1-419, i srednje dužine koje počinju sa aminokiselinom 1), kao što je otkriveno u U.S. pat. br.5,766,883, i PCT objavi WO 97/24445. U određenim tehničkim rešenjima, fuzioni protein može da obuhvata HSA protein sa modifikovanim FGF-21, ili njegovim fragmentima, prikačen za svaki od C-terminalnih i N-terminalnih krajeva HSA. Primerne HSA konstrukcije su otkrivene u U.S. pat. br. 5,876,969. Primerni postupci espresije ćelije sisara FGF-21 su opisani u WO 2005/091944.

[0337] Modifikovani FGF-21 polipeptid može da bude fuzionisan XTEN molekulom. XTEN molekuli se takođe nazivaju nestrukturirani rekombinantni polimeri, nestrukturirani rekombinantni polipeptidi (URP), i generalno su opisani u Schellenberger i sarad., Nat Biotechnol., 2009 Dec;27(12):1186-90, U.S. obj. br. 2012/0220011, U.S. pat. br. 7,846,445, i WO/2012/162542. Poluživot modifikovanog FGF-21 polipeptida može da varira promenom konstitucije XTEN molekula, npr., promenom njegove veličine. Na primer, XTEN molekul može da bude odabran kako bi se postigao željeni poluživot, kao što je u opsegu od 1 do 50 sati, kao što je najmanje 1, 2, 5, 10, 12, 15, 20, ili 25 sati, ili duže.

[0338] Primerni XTEN molekuli uključuju URP koji obuhvataju najmanje 40 susednih aminokiselina, pri čemu: (a) URP obuhvata najmanje tri različite vrste aminokiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od ostataka glicina (G), aspartata (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), pri čemu zbir navedene grupe aminokiselina sadržanih u URP čini više od oko 80% ukupnih aminokiselina URP, i pri čemu navedeni URP sadrži više od jednog ostatka prolina, i pri čemu navedeni URP poseduje smanjenu osetljivost na proteolitičku razgradnju u odnosu na odgovarajući URP u kome nedostaje više od jednog navedenog prolinskog ostatka; (b) najmanje 50% aminokiselina navedenog URP je lišeno sekundarne strukture kako je utvrđeno Chou-Fasman-ovim algoritmom; i (c) Tepitop rezultat navedenog URP je manji od -5. Dodatni primerni XTEN molekuli obuhvataju nestrukturirani rekombinantni polimer (URP) koji obuhvata najmanje oko 40 susednih aminokiselina, i pri čemu (a) zbir ostataka glicina (G), aspartata (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) sadržana u URP, čini najmanje 80% ukupnih amiokiselina URP, i ostatak, kada je prisutan, sastoji se od arginina ili lizina, i ostatak ne sadrži metionin, cistein, asparagin i glutamin, pri čemu navedeni URP obuhvata najmanje tri različite vrste aminokiselina odabranih od glicina (G), aspartata (D), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P); (b) najmanje 50% od najmanje 40 susednih aminokiselina u navedenom URP je lišeno sekundarne strukture kako je utvrđeno Chou-Fasman-ovim algoritmom; i (c) pri čemu URP ima Tepitop rezultat manji od -4.

[0339] Dodatni primerni XTEN molekuli uključuju rPEG molekule. U nekim tehničkim rešenjima, rPEG molekul možda neće uključiti hidrofobni ostatak (npr., F, I, L, M, V, W ili Y), bočni lanac ostatka koji sadrži amid (npr., N ili Q) ili pozitivno naelektrisani ostatak bočnog lanca (npr., H, K ili R). U nekim tehničkim rešenjima, pojačavajući deo može da uključuje A, E, G, P, S ili T. U nekim tehničkim rešenjima, rPEG može da uključi glicin sa 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-99%, ili čak glicin sa 100%.

[0340] Navedeni XTEN molekul može biti dalje vezan sa polietilen glikolom.

[0341] Termin "PAS" i/ili "PASilacija" odnosi se na genetsku fuziju biofarmaceutskog proteina od interesa kao što je modifikovani FGF-21 polipeptid sa konformaciono poremećenom polipeptidnom sekvencom sastavljenom od aminokiselina Pro, Ala i Ser (otuda termin "PAS polipeptid" i "PASilacija"). PASilacija može povećati poluživot u serumu, povećanu rastvorljivost, stabilnost, i/ili rezistenciju na proteazu, i/ili smanjenu imunogenost proteina od interesa, npr. fuzionog proteina (za refernecu, videti WO2008155134 A1 i US20140073563). PAS sekvence mogu biti prikačene preko gena fuzijom za N-završetak, ili C-završetak ili za oba kraja sekvence aminokiseline modifikovanog FGF-21 polipeptida. U nekim tehničkim rešenjima, PAS polipeptid može da obuhvati najmanje dva domena koja obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje oko 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, ili više aminokiselinskih ostataka koji formiraju konformaciju slučajne zavojnice i pri čemu navedeni drugi domen obuhvata ostatke alanina, serina i prolina, pri čemu navedena konformacija slučajne zavojnice posreduje u povećanoj in vivo i/ili in vitro stabilnosti biofarmaceutskog proteina za koji je PAS polipeptid fuzionisan. U nekim tehničkim rešenjima, drugi domen koji obuhvata ostatke alanina, serina i prolina može biti odabran od ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 310); AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 311); APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 312), SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 313), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 314), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 315) i ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 316). PAS polipeptid može da sadrži jedan ili više mesta za kovalentnu modifikaciju.

[0342] U primernim tehničkim rešenjima modifikovani FGF-21 je fuzionisan sa adnektinom, npr. vezujućim albuminom ili PKE adnektinom. Primerni adnektini su otkriveni u U.S. pub. br.

2011/0305663. Navedeni adnektin može se zasnivati na desetom domenu fibronektina tipa III i može se vezati za serum albumina. Navedeni adnektin može da obuhvati jednu ili više BC petlji koje obuhvataju aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 45, DE petlju koja obuhvata amnikokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 46, i FG petlju koja obuhavata aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 47, ili obuhvata polipeptid odabran od SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, i 52-72, ili obuhvata polipeptid najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmenje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičan sa SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, ili 52-72, koji respektivno odgovaraju SEQ ID NOS 5, 6, 7, 8, 12, 16, 20, i 24-44 U.S. obj. br.2011/0305663.

[0343] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani GF-21 polipeptid može se fuzionisati sa Fc domenom imunoglobulina ("Fc domain"), ili fragmentom ili njegovom varijantom, kao što je funkcionalni Fc region. Funkcionalni Fc region se vezuje za FcRn, ali nema efektorsku funkciju. Sposobnost Fc regiona ili njegovog fragmenta da se veže za FcRn može se odrediti standardnim testovima vezivanja poznatim u stanju tehnike. Primerne "efektorske funkcije" uključuju vezivanje C1q; citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitizu; smanjenje regulacije receptora na površini ćelije (npr., receptor B ćelije; BCR), itd. Takve efektorske funkcije mogu se proceniti primenom različitih testova poznatih u stanju tehnike za ocenu takvih efektorskih funkcija antitela.

[0344] U primernom tehničkom rešenju otkrića, Fc domen je izveden iz IgG1 podklase, međutim, druge podklase (npr., IgG2, IgG3, i IgG4) se modu takođe primenjivati. Ispod je prikazana primerna sekvenca Fc domena humanog imunoglobulina IgG1:

[0345] U nekim tehničkim rešenjima, Fc region koji se primenjuje u fuzionom proteinu može da obuhvata zglobni region Fc molekula. Primerni zglobni regon obuhvata jezgro zglobnih ostataka koji se protežu u položajima 1-16 (tj., DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO:303)) primerne sekvence Fc domena humanog imunoflobulina IgG1 koja je data gore. U određenim tehničkim rešenjima, fuzioni protein može da usvoji multimernu strukturu (npr., dimer) delimično zahvaljujući ostacima cisteina na pozicijama 6 i 9 unutar zglobnog regiona primerne sekvence Fc domena humanog imunoflobulina IgG1 koja je data gore. U drugim tehničkim rešenjima, zglobni region koji se ovde primenjuje može dalje uključivati ostatke izvedene iz CH1 i CH2 regiona koji okružuju sekvencu zglobnog jezgra primerne sekvence Fc domena humanog imunoflobulina IgG1 koja je data gore. U još nekim tehničkim rešenjima, zglobna sekvenca može da obuhvata ili da se sastoji od GSTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO:304).

[0346] U nekim tehničkim rešenjima, zglobna sekvenca može da uključi jednu ili više supstitucija koje dodaju poželjna farmakokinetička, biofizička, i/ili biološka svojstva. Neke primerne zglobne sekvence uključuju EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:305), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:308), i DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:309). U jednom tehničkom rešenju ovog otkrića, ostatak P na položaju 18 primerne sekvence Fc domena humanog imunoflobulina IgG1 koja je data gore može biti zamenjen sa S da odstrani Fc efektorsku funkciju; ova zamena je prikazana u zglobnim primerima koji imaju sekvence EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307), i DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:309). U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, ostaci DK na položajima 1-2 primerne sekvence Fc domena humanog imunoflobulina IgG1 koja je data gore mogu biti zamenjeni sa GS da bi se uklonilo potencijalno mesto isečka; ova zamena je prikazana u sekvenci EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307). U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, C na položaju 103 konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1 (tj., domena CH1--CH3), može se zameniti sa S da bi se sprečilo nepravilno formiranje cisteinske veze u odsustvu lakog lanca; ova zamena je prikazana u sekvencama EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO:305), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:306), i EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO:307).

[0347] Dodatne primerne Fc sekvence uključuju sledeće:

hlgGla_191 [podtip A]

hIgG1a_189[MgG1a_191 bez "GK" na C term; podtip A]

hIgGlf_1.1_191[Sadrži 5 tačkastih mutacija radi promene ADCC funkcije, podtip F]

hlgG1f_1.1_186 [Sadrži 5 tačkastih mutacija radi promene ADCC funkcije i C225S (Edleman numeracija) ; podtip F]

hIgG1a_190 [hIgG1a_190 bez "K" na C term; podtip A]

hIgG4_(S241P)

[0348] U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen obuhvata sekvencu aminokiseline odabranu od SEQ ID NO: 302 i 323-335. Treba razumeti da je C-terminalni lizin Fc domena opciona komponenta fuzionog proteina koji obuhvata Fc domen. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen obuhvata sekvencu aminokiseline odabranu od SEQ ID NO: 302 i 323-335, osim što je izostavljen njegov C-terminalni lizin. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 302. U nekim tehničkim rešenjima, Fc domen obuhvata sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 302 osim što je izostavljen njegov C-terminalni lizin.

[0349] U nekim tehničkim rešenjima, napravljen je modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži albumin vezujuću sekvencu. Primeri albumin vezujućih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, albumin vezujući domen iz streptokoknog proteina G (videti npr., Makrides i sarad., J. Pharmacol. Exp. Ther.277:534-542 (1996) i Sjolander i sarad., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)), ili albumin-vezujući peptidi kao što su oni opisani u, npr., Dennis, i sarad., J. Biol. Chem.277:35035-35043 (2002).

[0350] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića su acilirani sa masnim kiselinama. U nekim slučajevima, masne kiseline pospešuju vezivanje za serum albumina. Videti, npr., Kurtzhals, i sarad., Biochem. J.312:725-731 (1995).

[0351] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića su fuzionisani direktno sa serumom albumina (uključujući, ali ne ograničavajući se na, humani serum albumin). Stručnjaci u ovoj oblasti tehnike prepoznaće da širok spektar drugih molekula takođe može da bude vezan sa modifikovanim FGF-21 u predmetnom otkriću kako bi modulisao vezivanje za serumski albumin ili druge serumske komponente.

XI. Glikolizacija modifikovanih i nemodifikovanih FGF-21 polipeptida

[0352] Predmetno otkriće uključuje modifikovane FGF-21 polipeptide koji obuhvataju jednu ili više neprirodnih kodiranih aminokiselina noseći ostatke saharida. Ostaci saharida mogu biti ili prirodni (uključujući, ali bez ograničenja na, N-acetilglukozamin) ili neprirodni (uključujući, ali bez ograničenja na, 3-fluorogalaktozu). Saharidi mogu se vezati za neprirodne kodirane aminokiseline pomoću N- ili O-vezane glikozidne veze (uključujući, ali bez ograničenja na, Nacetilgalaktoze-L-serin) ili neprirodne veze (uključujući, ali bez ograničenja na, oksim ili odgovarajući C- ili S-vezani glikozid).

[0353] Saharidni (uključujući, ali bez ograničenja na, glikozil) delovi mogu se dodati modifikovanim FGF-21 polipeptidima ili in vivo ili in vitro. U nekim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptdi koji obuhvataju neprirodnu kodiranu aminokiselinu koja sadrži karbonil mogu se modifikovati sa saharidom derivatizovanim sa aminoksi grupom da se dobije odgovarajući glikozilatni polipeptid vezan preko oksimske veze. Jednom prikačen za neprirodnu kodiranu aminokiselinu, saharid može se dalje obrađivati tretiranjem sa glikoziltransferazama i drugim enzimima da se dobije oligosaharid vezan za modifikovani FGF-21 polipeptida. Videti, npr., H. Liu, i sarad. J. Am. Chem. Soc.125: 1702-1703 (2003).

[0354] U nekim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata neprirodnu kodiranu aminokiselinu koja sadrži karbonil može se direktno modifikovati sa glikanom definisane strukture pripremljenim kao aminoksi derivat. Ostale funkcionalnosti, uključujući azid, alkin, hidrazid, hidrazin, i semikarbazid, mogu se primeniti za vezivanje saharida sa neprirodnom kodiranom aminokiselinom.

[0355] U nekim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata azid ili neprirodnu kodiranu aminokiselinu koja sadrži alkinil može se zatim modifikovati, uključujući, ali bez ograničenja, reakcijom Huisgen [3+2] cikloadicije sa, uključujući, ali bez ograničenja na, alkinil ili azid derivate.

XII. FGF-21 dimeri i multimeri

[0356] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje za FGF-21 i modifikovane FGF-21 kombinacije kao što su homodimeri, heterodimeri, homomultimeri, ili heteromultimeri (tj., trimeri, tetrameri, itd.) gde modifikovani FGF-21 koji sadrži jednu ili više neprirodnih kodiranih aminokiselina je vezan za drugi FGF-21 ili modifikovani FGF-21 ili njegovu varijantu ili bilo koji drugi polipeptid koji nije FGF-21 ili modifikovani FGF-21 ili njegovu varijantu, ili direktno za osnovu polipeptida ili preko linkera. Zbog povećane molekularne težine u poređenju sa monomerima, FGF-21 dimer ili multimer konjugati mogu pokazivati nova ili poželjna svojstva, uključujući, ali bez ograničenja na različit farmakološki, farmakokinetički, farmakodinamički, modulisan terapijski poluživot, ili modulisani poluživot u plazmi u odnosu na monomerni FGF-21. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 dimeri predmetnog otkrića mogu modulisati transdukciju signala FGF-21 receptora. U drugim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 dimeri ili multimeri predmetnog otkrića mogu delovati kao FGF-21 receptor antagonist, agonist, ili modulator.

XIII. Merenje aktivnosti FGF-21 polipeptida i afiniteta FGF-21 polipeptida za FGF-21 polipeptidni receptor

[0357] FGF-21 je pokazao da stimuliše unos glukoze i pojačava osetljivost na insulin u 3T3-L1 adipocitima, u in vitro modelu koji se koristi za proučavanje metabolizma masnog tkiva, kao što je prikazano u Primeru 3 objave U.S. patenta br.20040259780. Karakteristika dijabetesa tip 2 je nedostatak unosa glukoze u različite tipove tkiva uključujući masno tkivo. Prema tome, modifikovani FGF-21 može biti koristan za lečenje dijabetesa tip 2 snižavanjem nivoa glukoze u krvi. Štaviše, modifikovani FGF-21 može biti primenljiv za lečenje gojaznosti povećanjem potrošnje energije bržim i efikasnijim iskorišćavanjem glukoze. Pored toga, FGF-21 je pokazao da stimuliše unos glukoze u 3T3-L1 adipocite na način nezavisno od insulina, što ukazuje da je koristan i za lečenje dijabetesa tip 1. Videti objavu U.S. patenta br. 20040259780. FGF-21 je pokazao da stimuliše unos glukoze u 3T3-L1 adipocite na način da zavisi od koncentracije pri suboptimalnoj koncentraciji insulina (5 nM) i u odsustvu insulina u objavi U.S. patenta br.

20040259780. Pored toga, FGF-21 indukuje unos glukoze u modelu ex vivo tkiva, koji je opisan u objavi U.S. patenta br.20040259780.

[0358] Modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu biti predmet ispitivanja biološke aktivnosti. Uopšteno, test biološke aktivnosti treba da pruži analizu željenog rezultata, kao što su povećanje ili smanjenje biološke aktivnosti, različita biološka aktivnost, analiza afiniteta receptora ili partnera za vezivanje, konformacione ili strukturne promene samog modifikovanog FGF-21 ili njegovog receptora, ili analiza poluživota u serumu, u poređenju sa nemodifikovanim FGF-21 ili drugim uporednim jedinjenjem kako je opisano na drugom mestu ovde.

[0359] Primerne metode za diferencijaciju 3T3-L1 u adipocite test unosa glukoze opisani su u U.S. patentu br.8,012,931.

XIV. Merenje potencijala, in vivo funkcionlnog poluživota, i farmakokinetičkih parametara

[0360] Aspekt predmetnog otkrića je produženi biloški poluživot koji se može dobiti konstrukcijom modifikovanog FGF-21 polipeptida, koji može biti konjugovan sa vodorastvornim polimernim delom, ili fuzionisan sa fuzijonim partnerom. Brzo smanjenje koncentracije FGF-21 polipeptida u serumu nakon administracije učinilo je terapijski značajnim procenu bioloških odgovora na lečenje modifikovanim FGF-21 polipeptidom. Modifikovani FGF-21 polipeptid predmetnog otkrića može imati produžene poluživote u serumu i nakon administracije putem, npr. subkutane ili i.v. administracije, omogućavajući merenje, npr. ELISA metodom ili primarnim skrining testom. Merenje in vivo biologoškog poluživota se izvodi kako je ovde opisano.

[0361] Potencijal i in vivo functionalni poluživot modifikovanog FGF-21 polipeptida koji obuhvata unutrašnju deleciju i/ili neprirodnu kodiranu aminokiselinu mogu se odrediti prema protokolima poznatim stručnjacima iz date oblasti tehnike i kako je ovde opisano.

[0362] U primernom testu, farmakokinetički parametri za nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid koji je ovde opisan mogu se proceniti na normalnim Sprague-Dawley muškim pacovima (N=5 životinja po tretiranoj grupi). Životinje mogu primiti ili pojedinačnu dozu od 25 ug/pacov iv ili 50 ug/pacov sc, i približno 5-7 uzoraka krvi može se uzeti prema unapred definisanom vremenskom intervalu, koji obično pokriva oko 6 sati za modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata neprirodnu kodiranu aminokiselinu koja nije konjugovana sa vodorastvornim polimerom i oko 4 dana za modifikovani FGF-21 polipeptid koji obuhvata neprirodnu kodiranu aminokiselinu i konjugaciju sa vodorastvornim polimerom. Farmakokinetički podaci za modifikovani FGF-21 mogu se uporediti sa uporednim jedinjenjem kao što je divlji tip FGF-21 polipeptida SEQ ID NO:1, modifikovani FGF-21 polipeptid SEQ ID NO:201, isti modifikovani FGF-21 polipeptid kome nedostaje unutrašnja delecija, ili drugo jedinjenje za upoređivanje koje je ovde opisano.

[0363] Farmakokinetički parametri se takođe mogu proceniti kod primata, npr., cinomolgus majmuna. Tipično se injekcija administrira ili subkutano ili intravenski, i nadgledaju se nivoi FGF-21 u serumu tokom vremena.

[0364] Polipeptidi predmetnog otkrića mogu se primeniti za lečenje sisara koji pate od insulin nezavisnog dijabetes melitusa (NIDDM: tip 2), insulin zavisnog dijabetesa (tip 1), kao i gojaznosti, neadekvatnog klirensa glukoze, hiperglikemije, hiperinsulinemije, i slično. FGF-21 je efikasan na životinjskim modelima dijabetesa i gojaznosti, kao što je prikazano u objavi U.S. patenta br.

20040259780. Kako se metabolički profili razlikuju među različitim životinjskim modelima gojaznosti i dijabetesa, sprovedena je analiza više modela kako bi se razdvojili efekti hiperinsulinemije, hiperglikemije i gojaznosti. Miševe sa dijabetesom (db/db) i gojaznosti (ob/ob) karakteriše masovna gojaznost, hiperfagija, promenljiva hiperglikemija, insulinska rezistencija, hiperinsulinemija i oštećena termogeneza (Coleman, Dijabetesa 31:1, 1982; E. Shafrir, in Dijabetesa Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed. 4, 1990), pp. 299-340). Međutim, dijabetes je mnogo teži u db/db modelu (Coleman, Dijabetesa 31:1, 1982; E. Shafrir, in Dijabetesa Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed.4, 1990), pp.299-340). Zucker (fa/fa) pacovi su jako gojazni, hiperinsulinemični, i otporni su na insulin (Coleman, Dijabetesa 31:1, 1982; E. Shafrir, in Dijabetesa Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed.4, 1990), pp.299- 340), i fa/fa mutacija može biti pacovski ekvivalent mišije db mutacije (Friedman i sarad., Cell 69:217-220, 1992; Truett i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7806, 1991). Tubby (tub/tub) miševe karakteriše gojaznost, umerena insulinska rezistencija i hiperinsulinemija bez značajne hiperglikemije (Coleman i sarad., J. Heredity 81:424, 1990).

[0365] Može se ispitati model mononatrijum glutamata (MSG) za hemijski izazvanu gojaznost (Olney, Science 164:719, 1969; Cameron i sarad., Cli. Exp. Pharmacol. Physiol. 5:41, 1978), kod koga je gojaznost blaža nego kod genetskih modela i razvija se bez hiperfagije, hiperinsulinemije i insulinske rezistencije. Na kraju, model streptozotocina (STZ) za hemijski izazvani dijabetes može se testirati kako bi se ispitali efekti hiperglikemije u odsustvu gojaznosti. Životinje tretirane STZ imaju deficit insulina i težu hiperglikemiju (Coleman, Dijabetesa 31:1, 1982; E. Shafrir, in Dijabetesa Mellitus; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, ed.4, 1990), pp.299-340).

[0366] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se proceniti u in vivo modelu septičkog šoka kod ob/ob miševa. Videti objavu U.S. patenta br.20050176631.

Metode za analizu ERK1/2 fosforilacije izazvane FGF-21

[0367] ERK1/2 fosforilacija izazvane FGF-21 (divlji tip ili modifikovani FGF-21 polipeptidi uključujući one vezane za PEG ili drugi linker, polimer, ili biološki aktivni molekul) može se izvršiti sledećim primernim metodama:

[0368] Seme 293-stabilno transfektovano humanim Klotho beta u 100,000 ćelija/otvora (DMEM+10%FBS) u poli-Lys obloženoj ploči. Sledećeg dana ćelije su 100% slivne, medijum se odsisava i zamenjuje svežim medijumom i inkubira preko noći. Nakon 24 sata ćelije se stimulišu odabranim nemodifikovanim ili modifikovanim FGF-21 ili FGF-21 analogom primenjujući kao standard FGF21WT. Svako pojedinačno jedinjenje se priprema razblaživanjem u PBS/1%BSA. Ćelije se trostruko tretiraju za 10 min @ 37° C u inkubatoru. Nakon 10 minuta inkubiranja medijum se pažljivo odsisa iz svakog otvora i 40ul hladnog 1x pufera za liziranje signalnih ćelija koji sadrži inhibitore proteaze/fosfataze (PI koktel, Na3VN4 i PMSF) se doda u svaki otvor za proizvodnju ćelijskoh lizata. 96otvor/ploča se postavlja na led 20 minuta i zatim okreće na 4000rpm za 10minuta. Ćelijski lizati se zamrzavaju na -80° C. Kasnije se svaki uzorak odmrzne i doda se 10ul ćelijskih lizata na ploču tretiranu MSD obloženu antitelom hvatajući i nefosforilirani i fosforilirani oblik ERK1/2. Inkubacija sa primarnim antitelom se dešava tokom 2 sata zatim se ploča opere nekoliko puta sa specifičnim puferom, praćena dodavanjem sekundarnog antitela. Nakon 1 sata ploča za inkubaciju se opere nekoliko puta. U svaki otvor se dodaje pufer za čitanje. Ploča se prenosi na MSD mašinu za čitanje. Izrađena kriva se zasniva na antifosforiliranim ERK1/2 jedinicama za čitanje i EC50 se izračunava primenom Sigma Plot. Višestruki gubitak aktivnosti se izračunava deljenjem EC50 testiranog jedinjenja sa EC50 WT.

Određivanje farmakokinetičkih svojstava modifikovanih FGF-21 polipeptida kod pacova

[0369] Ove primerne metode mogu se primeniti za merenje farmakokinetičkih svojstava nativnih i modifikovanih FGF-21 jedinjenja kod kateterizovanih pacova. Farmakokinetika test proizvoda se ispituje ELISA testom specifičnim za humani FGF-21 iz uzoraka seruma dobijenih u određemim vremenskim tačkama nakon doziranja leka.

[0370] Dvanaest (12) mužjaka Sprague-Dawley (SD) pacova težine približno 250-275 grama na početku studije mogu imati hirurški postavljene katetere u vratnu venu. Životinje su u dobrom stanju i mogu se prilagoditi mestu studije najmanje 3 dana pre početka studije. Pacovi se mogu meriti na dan administriranja test proizvoda. Životinje mogu biti smeštene u standardnim uslovima bez patogena sa hranom i vodom po želji.

[0371] Jedinjenja se administriraju subkutano, na primer 0.25 mg/kg.

[0372] Životinje se mere pre administriranja test proizvoda. Jedinjenja su formulisana tako da se administriraju 1X BW u µL. Subkutano administriranje test proizvoda je ubrizgavanje u region leđnih lopatica. Životinje mogu primiti jednu injekciju test proizvoda (vreme=0). U odabranim vremenskim tačkama, iz životinja se može uzeti celokupna krv, sakupljena u SST microtainer epruvete za sakupljanje. Može se pustiti da se serum zgruša 30 minuta pre centrifugiranja. Serum se može preneti u epruvete od polipropilenskog titra, zapušiti sa mikrotrakama, i čuvati na -80 stepeni C do analize ELISA testom da bi se odredile koncentracije nemodifikovanih ili modifikovanih FGF-21 u serumu.

[0373] Svaka životinja se može primeniti u kompletnom PK vremenskom intervalu. Približno 0.25 mL celokupne krvi se može uzeti iz katetera vratne vene. Odmah nakon sakupljanja krvi, kateteri se mogu isprati sa 0.1 mL fiziološkog rastvora. Naredne vremenske tačke sakupljanja za životinje koje primaju materijal test proizvoda su odabrane, ali se mogu modifikovati na osnovu očekivanog farmakokinetičkog profila test proizvoda:

[0374] Pre uzimanja krvi, 1, 2, 4, 8, 24, 3248, 56, 72, i 96 sati posle doziranja. Farmakokinetički parametri se utvrđuju za svako testirano jedinjenje, koji uključuju Lambda_z, Lambda_z_lower, Lambda_z_upper, HL_Lambda_z, Tmax, Cmax, C0, AUCINF_obs, Vz_obs, Cl obs, MRTINF_obs, and/or Vss_obs.

In vivo studije modifikovanih FGF-21 kod ZDF pacova

[0375] Modifikovani FGF-21, nemodifikovani FGF-21, i puferski rastvor se administrira miševima ili pacovima. Rezultati pokazuju aktivnost i poluživot modifikovanih FGF-21 polipeptida predmetnog otkrića u poređenju sa nemodifikovanim FGF-21.

[0376] WO 2005/091944 opisuje farmakokinetičke studije koje se mogu izvesti sa FGF-21 jedinjenjima, kao što su jedinjenja predmetnog otkrića. Modifikovani FGF-21 polipeptid predmetnog otkrića se administrira miševima intravenskom ili subkutanom rutom. Životinjama je uzeta krv u vremenskim tačkama pre i posle doziranja. Plazma je sakupljena iz svakog uzorka i analizirana radioimunološkim testom. Poluvreme eliminacije se može izračunati i uporediti između modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže internu deleciju i/ili neprirodnu kodiranu aminokiselinu ili fuzioni partner, i divlji tip FGF-21 ili različite oblike FGF-21 polipeptida predmetnog otkrića. Slično tome, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se administrirati cinomolgus majmunima. Životinjama je uzeta krv u vremenskim tačkama pre i posle doziranja. Plazma je sakupljena iz svakog uzorka i analizirana radioimunološkim testom.

[0377] Polipeptidi predmetnog otkrića mogu se administrirati ZDF pacovima mužjacima (dijabetski, debeli pacovi; 8 nedelja starosti na početku studije, Charles River-GMI). Pacovi se hrane Purina 5008 hranom po želji. Postavljene su sledeće test grupe: fiziološki rastvor; insulin 4U/dan; nemodifikovni ili modifikovani FGF-21, 500 ug/dan akutne doze (Akutna grupa za doziranje se dozira jednom i uzima se krv na T=0, 2, 4, 8, i 24 sata nakon doziranja); nemodifikovni ili modifikovani FGF-21, 100 ug/dan; nemodifikovni ili modifikovani FGF-21, 250 ug/dan; nemodifikovni ili modifikovani FGF-21, 500 ug/dan; nemodifikovni ili modifikovani FGF-21(jednom/dan) 500 ug/ml; bezmasni fiziološki rastvor; bezmasni insulin 4U/dan; bezmasni nemodifikovni ili modifikovani FGF-21500ug/dan. Bezmasnu grupu predstavljaju nedijabetski, bezmasni, ZDF pacovi.

[0378] Jedinjenja se ubrizgavaju s.c. (b.i.d.), izuzev druge grupe od 500 ug/dan koja prima jednu injekciju dnevno tokom trajanja studije (7 dana). Kontrolnim pacovima su ubrizgana sa transporterom (PBS; 0.1 ml). Nakon 7 dana doziranja, životinje su podvrgnute oralnom testu tolerancije na glukozu. Krv za glukozu i trigliceride se sakuplja krvarenjem iz repa bez anestetika. Modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu smanjiti nivoe glukoze u plazmi na način zavisno od doze. Takođe nemasni ZDF pacovi možda neće postati hipoglikemijski nakon izlaganja modifikovanim FGF-21 polipeptidima predmetnog otkrića u poređenju sa pacovima koji su dozirani insulinom.

In Vivo studije modifikovanog FGF-21 u ob/ob modelu gojaznosti

[0379] Mišiji ob/ob model je životinjski model za hiperglikemiju, insulinsku rezistenciju, i gojaznost. Nivoi glukoze u plazmi mogu se meriti kod ob/ob miševa nakon tretmana sa nemodifikovanim ili modifikovanim FGF-21 polipeptidom u poređenju sa kontrolnim grupama sa transporterom i insulinom. U ovom modelu gojaznosti, test grupama ob/ob miševa mužjaka (7 nedelja starosti) ubrizgava se samo transporter (PBS), insulin (4 U/dan), ili nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 polipeptid (5 µg/dan i 25 µg/dan), subkutano (0.1 ml, b.i.d) tokom sedam dana. Krv se sakuplja krvarenjem iz repa na dane 1, 3, i 7, jedan sat nakon prve injekcije jedinjenja, i nivoi glukoze u plazmi su mereni primenom standardnog protokola. Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića stimulišu unos glukoze ukoliko smanjuju nivoe glukoze u plazmi u poređenju sa kontrolnom grupom transportera. Nivoi triglicerida mogu se uporediti nakon tretmana sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima pedmetnog otkrića u poređenju sa drugim molekulima. Polipeptid se može administrirati miševima u više doza, kontinuiranom infuzijom, ili pojedinačnom dozom, itd.

Farmakokinetička procena modifikovanih FGF21 polipeptida:

[0380] Farmakokinetička svojstva modifikovanog FGF-21 sa različitim mestima PEG konjugacije su procenjivana kod pacova. Ostali parametri ispitivani su PEG MW, kao i doza administriranog jedinjenja. Određen je procenat bioraspoloživosti.

[0381] Sva eksperimentisanja na životinjama se sprovode se prema protokolima odobrenim od strane Institucionalnog odbora za negu i primenu životinja. Mužjaci (175-300 g) Sprague-Dawley pacova se dobijaju iz Charles River laboratorije. Pacovi su smešteni pojedinačno u kavezima u sobama sa 12-časovnim ciklusom svetlo/mrak i aklimatizovani u vivarijumu najmanje 3 dana pre eksperimentisanja. Životinjama je omogućen pristup sertifikovanoj hrani za glodare Purina 5001 i vodi po želji.

[0382] Kateteri se hirurški ugrađuju u vratnu venu za sakupljanje krvi. Nakon uspešne prohodnosti katetera, životinje su dodeljene grupama za lečenje pre doziranja. Jedna doza jedinjenja se administrira intravenski ili subkutano u zapremini doze od 1 mL/kg. Koncentracije doze jedinjenja se dobijaju razblaživanjem u PBS primenom stock koncentracije kako je određeno u Sertifikatu o oslobađanju. Uzorci krvi se sakupljaju u različitim vremenskim tačkama preko postavljenog katetera i smeštaju se u SST epruvete za mikrofugu. Serum se sakuplja nakon centrifugiranja, i čuva na -80°C do analize.

[0383] Test za kvantifikaciju modifikovanog FGF-21 u serumu Sprague- Dawley pacova se izvodi na sledeći način. Otvori mikroploče su obloženi sa kozijim anti-humanim FGF-21 IgG poliklonalnim antitelom (PAb; RnD Systems, klon AF2539) koji se primenjuje kao reagens za hvatanje. Standard (STD) uzorci za kontrolu kvaliteta (QC), oba napravljena dodavanjem nemodifikovanog ili modifikovanog FGF-21 u 100% serum Sprague Dawley pacova, i uzorci studije se ubacuju u otvore nakon prethodne obrade 1:100 sa I-Block puferom. Nemodifikovani ili modifikovani FGF-21 u STD, QC i uzorcima studije je uhvaćen imobilizovanim PAb. Nevezani materijali se uklone pranjem otvora. Biotin koziji anti-humani FGF-21 IgG PAb (RnD Systems, klon BAF2539) se dodaje u otvore nakon čega sledi korak pranja i dodavanje streptavidin peroksidaze rena (SA-HRP; RnD Systems, katalog # DY998) za detekciju uhvaćenog nemodifikovanog ili modifikovanog FGF-21. Nakon drugog koraka pranja, rastvor supstrata tetrametilbenzidin (TMB, Kirkegaard Perry Laboratories) se dodaje u otvore. TMB reaguje sa peroksidom u prisustvu HRP i proizvodi kolorimetrijski signal koji je proporcionalan količini FGF-21 (divlji tip ili modifikovani FGF-21) vezan reagensom za hvatanje u početnom koraku. Razvoj boje se zaustavlja dodavanjem 2N sumporne kiseline i meri se intenzitet boje (optička gustina, OD) na 450 nm. Konverzija OD jedinica za uzorke studije i QC do koncentracija se postiže računarskim softverom posredovanim poređenjem sa standardnom krivom na istoj ploči, koja je regresirana prema modelu logističke regresije od 5 parametara primenom paketa SOFTmax Pro v5 redukcije podataka. Rezultati su navedeni u koncentracijskim jedinicama ng/mL.

[0384] Koncentracije se takođe mogu meriti testom antitela zasnovanim na principu dvostrukog sendviča ili drugim metodama poznatim u stanju tehnike. Koncentracije se izračunavaju primenom standardne krive generisane iz odgovarajućeg doziranog jedinjenja. Farmakokinetički parametri se procenjuju primenom programa za modelovanje WinNonlin (Pharsight, verzija 4.1). Primenjuje se nekompartmentalna analiza za pojedinačne podatke životinje sa linear-up/log-down trapezoidalnom integracijom, i podaci o koncentraciji su ujednačeni.

XV. Administriranje i farmaceutske kompozicije

[0385] Otkriće takođe obezbeđuje kompozicije koje obuhvataju terapijski efikasnu količinu modifikovanog FGF-21 polipeptida, ovde opisanu, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. Takav nosač ili eksipijens uključuje, ali nije ograničen na, fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i/ili njihove kombinacije. Formulacija je napravljena da odgovara načinu administriranja. Generalno, postupci administriranja proteina su poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike i mogu se primeniti na administriranje polipeptida predmetnog otkrića.

[0386] U jednom tehničkom rešenju pronalaska, modifikovani FGF-21 polipeptid se administrira pacijentu u koncentraciji između oko 0.1 i 100 mg/kg telesne težine pacijenta primaoca. U jednom tehničkom rešenju pronalaska, ovde opisani modifikovani FGF-21 polipeptid može se administrirati pacijentu u koncentraciji od oko 0.5-5 mg/kg telesne težine pacijenta primaoca. U drugom tehničkom rešenju pronalaska, ovde opisani modifikovani FGF-21 polipeptid može se administrirati pacijentu primaocu sa frekvencijom između jednom dnevno i jednom u dve nedelje, kao što je oko jednom ili dva puta nedeljno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom u četiri dana, jednom u pet dana, ili jednom u šest dana.

[0387] Podrazumeva se da koncentracija modifikovanog FGF-21 polipeptida administrirana datom pacijentu može biti veća ili manja nego primerno administrirane koncentracije navedene gore.

[0388] Na osnovu informacija datih u predmetnom otkriću, stručnjak u ovoj oblasti bio bi u stanju da odredi efikasnu dozu i frekvenciju administracije rutinskim eksperimentisanjem, na primer vođenim ovim otkrićem i učenjima u Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., & Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman-ova farmakološka osnova terapije. Njujork: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., & Mycek, M. J. (2006). Farmakologija. Lippincott-ovi ilustrativni pregledi. Filadelfija: Lippincott Williams & Wilkins; i Golan, D. E. (2008). Principi farmakologije: patofiziološke osnove terapije lekovima. Philadelphia, Pa., (itd.): Lippincott Williams & Wilkins.

[0389] Prosečne količine modifikovanog FGF-21 mogu da se razlikuju i posebno treba da se zasnivaju na preporukama i receptima kvalifikovanog lekara. Tačna količina modifikovanog FGF-21 je stvar preferencije subjekta koja zavisi od faktora kao što su tačan tip stanja koje se leči, stanje pacijenta koji se leči, kao i ostali sastojci u kompoziciji. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje za administraciju terpijski efikasnu količinu drugog aktivnog sredstva. Količinu koja se daje, može lako odrediti neko ko je stručan u datoj oblasti tehnike.

[0390] "Farmaceutska kompozicija" se odnosi na hemijske i biološke kompozicije pogodne za administriranje sisaru. Takve kompozicije mogu biti posebno formulisane za administraciju putem jedne ili više ruta, uključujući ali bez ograničenja na bukalnu, epikutanu, epiduralnu, inhalacionu, intraarterijsku, intrakardijalnu, intracerebroventrikularnu, intradermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, intraokularnu, intraperitonealnu, intraspinalnu, intratekalnu, intravensku, oralnu, parenteralnu, rektalnu putem klistira ili supozitorije, subkutanu, subdermalnu, sublingvalnu, transdermalnu, i transmukoznu. Pored toga, administracija se može izvršiti injekcijom, praškom, tečnošću, gelom, kapima ili drugim načinima administracije.

[0391] Kako se ovde koristi "farmaceutski prihvatljiv nosač" ili "ekscipijens" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odloženu apsorpciju koja su fiziološki kompatibilna. U jednom tehničkom rešenju ovog otkrića, nosač je pogodan za parenteralnu administraciju. Alternativno, nosač može biti pogodan za intravensku, intraperitonealnu, intramuskularnu ili sublingvalnu administraciju. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija.

[0392] U nekim tehničkim rešenjima, farmaceutska kompozicija može biti prisutna u liofiliziranom obliku. Kompzicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za veću koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzijski medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol), i njihove odgovarajuće smeše. Otkriće dalje razmatra uključivanje stabilizatora u farmaceutsku kompoziciju. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i primenom površinski aktivnih sredstava.

[0393] U mnogim slučajevima može biti poželjno da kompozicije uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Uključivanjem sredstava kao što su, soli monostearata i želatin, apsorpcija injektibilnih kompozicija može se produžiti. Štaviše, polipeptid se može formulisati u formulaciji sa vremenskim oslobađanjem, na primer u kompoziciji koja uključuje polimer sa usporenim oslobađanjem. Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji mogu zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se primeniti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliorthoesteri, polilaktična kiselina i polilaktički, poliglikolni kopolimeri (PLG). Mnogi postupci pripreme takvih formulacija poznati su stručnjacima u ovoj oblasti tehnike.

[0394] Modifikovani FGF-21 polipeptidi i kompozicije predmetnog otkrića se mogu administrirati bilo kojom konvencionalnom rutom pogodnom za proteine ili peptide, uključujući, ali bez ograničenja na parenteralnu, npr. injekcije uključujući, ali bez ograničenja na, subkutani ili intravenski ili bilo koji drugi oblik injekcija ili infuzija. Polipeptidne kompozicije se mogu administrirati brojnim rutama uključujući, ali bez ograničenja na oralne, intravenske, intraperitonealne, intramuskularne, transdermalne, subkutane, topikalne, sublingualne, ili rektalne načine. Kompozicije koje obuhvataju modifikovani FGF-21 mogu se takođe administrirati putem lipozoma. Modifikovani FGF-21 polipeptid se može primeniti sam ili u kombinaciji sa drugim pogodnim komponentama kao što je farmaceutski nosač. Modifikovani FGF-21 polipeptid se može primeniti u kombinaciji sa drugim sredstvima, uključujući ali bez ograničenja na, oralno antidijabetsko sredstvo.

[0395] Termin "antidijabetsko sredstvo" podrazumeva bilo koji lek koji je koristan u lečenju, prevenciji, ili na drugi način smanjuje teži poremećaj metabolizma glukoze ili bilo koje njegove komplikacije, uključujući bilo koje od ovde opisanih stanja, bolest, ili ovde opisane komplikacije.

Antidijabetska sredstva uključuju insulin, tiazolidindione, sulfonilureje, derivate benzojeve kiseline, inhibitore α -glukozidaze, ili slično.

[0396] Aktuelni lekovi ili antidijabetska sredstva koja se primenjuju za upravljenje dijabetesom i njegovim sindromima prekursora, kao što su insulinska rezistencija, koji su dobro poznati u stanju tehnike uključuju pet klasa jedinjenja: bigvanidine, npr., metformin; tiazolidindione, npr., troglitazon; sulfonilureje, npr., tolbutamid i gliburid; derivate benzijeve kiseline, npr. repaglinid; i inhibitore glukozidaze. Pored ovih sredstava, niz drugih terapija može se primeniti u kombinaciji sa FGF-21 polipeptidima predmetnog otkrića za poboljšanje kontrole glukoze, uključujući, ali bez ograničenja na DPP-4 inhibitore. Vodeća DPP-4 jedinjenja testirana kliničkim ispitivanjima uključuju vildagliptin (Galvus) (LAF237), sitagliptin (Januvia), saksagliptin i alogliptin, Novartisovo jedinjenje 1-[[[2-[(5-cijanopiridin-2-il)amino]etiljaminojacetil]-2-cijano-(S)- pirolidin (NVP DPP728)

[0397] Druga kategorija antidijabetskih sredstava koja su inhibitori karnitin palmitoil-transferaze I (CPT-I), kao što je etomoksir.

[0398] Druga poznata antidijabetska sredstva uključuju preparate insulina (npr., preparati životinjskog insulina ekstrahovani iz goveđeg i svinjskog pankreasa; preparati humanog insulina genetski sintetizovani primenom Escherichia coli, kvasca; cink insulina; protamin cink insulina; fragmenta ili derivata insulina (npr., INS-1), oralnog preparata insulina), insulinski sensitizere (npr., pioglitazon ili njegovu so (poželjno hidrohloridna), rosiglitazon ili njegovu so (poželjno maleatnu), netoglitazon, rivoglitazon (CS-011), FK-614, jedinjenje opisano u WO01/38325, tesaglitazar (AZ-242), ragaglitazar (N,N-622), muraglitazar (BMS-298585), edaglitazon (BM-13-1258), metaglidasen

[0399] (MBX-102), naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131(T-131), THR-0921), inhibitore α-glukozidaze (npr., vogliboza, akarboza, miglitol, emiglitat itd.), bigvanidine (npr., fenformin, metformin, buformin ili njegovu so (npr., hidrohloridnu, fumaratnu, sukcinatnu)), insulinske sekretagoge [sulfonilureja (npr., tolbutamid, glibenklamid, gliklazid, hlorpropamid, tolazamid, acetoheksamid, gliklopiramid, glimepirid, glipizid, glibuzol), repaglinid, nateglinid, mitiglinid ili njegova kalcijum hidratna so], dipeptidil peptidaza IV inhibitore (npr., vidagliptin (LAF237), P32/98, sitagliptin (MK-431), P93/01, PT-100, saksagliptin (BMS-477118), T-6666, TS-021), β3 agoniste (npr., AJ-9677), GPR40 agoniste, polipeptide slični glukagonu (I) (glp I), (glp2), ili druge dijabetogene peptidne hormone, GLP-1 receptor agoniste [npr., GLP-1, GLP-1MR sredstvo, N,N-2211, AC-2993 (eksendin-4), BIM-51077, Aib(8,35)hGLP-1 (7,37)NH2, CJC-[131], agoniste amilina (npr., pramlintid), inhibitore fosfotirozin fosfataze npr., natrijum vanadat), inhibitore glukoneogeneze (npr., inhibitori glikogen fosforilaze, inhibitori glukoza-6-fosfataze, antagonisti glukagona), SGLT2 (natrijum-glukoza kotransporter) inhibitore (npr., T-1095), inhibitore 11β-hidroksisteroidne dehidrogenaze (npr., BVT-3498), adiponektin ili njegove agoniste, IKK inhibitore (npr., AS-2868), lekove za poboljšanje rezistencije na leptin, agoniste somatostatinskih receptora (jedinjenja opisana u WO01/25228, WO03/42204, WO98/44921, WO98/45285, WO99/22735 itd.), aktivatore glukokinaze (npr., Ro-28-1675), GIP ((insulinotropni peptid zavistan od glukoze) i slično.

[0400] Modifikovani FGF-21 takođe se može napraviti u obliku aerosolne formulacije (tj., mogu se "raspršiti") da bi se administrirao putem inhalacije. Aerosolne formulacije se mogu staviti pod pritiskom u prihvatljive propelante, kao što su dihlorodifluorometan, propan, azot, i slično.

[0401] Formulacije pogodne za parenteralnu administraciju, kao što su, na primer, intraartikularne (u zglobovima), intravenske, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, i subkutane rute, uključuju vodene i nevodene, izotonične sterilne injekcione rastvore, koji mogu sadržati antioksidanse, pufere, bakteriostate, i rastvorne supstance koje čine formulaciju izotoničnom sa krvi željenog primaoca, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da sadrže sredstva za suspendovanje, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore, i konzervanse. Formulacije modifikovanog FGF-21 mogu biti prisutne u jediničnim doznim ili višedoznim zatvorenim kontejnerima, kao što su ampule i bočice.

[0402] Doze koje se administriraju pacijentu, u kontekstu predmetnog otkrića, dovoljno je da imaju blagotvorni terapijski odgovor kod pacijenta tokom vremena, ili druge odgovarajuće aktivnosti, u zavisnosti od aplikacije. Doza je određena efikasnošću formulacije, i aktivnošću, stabilnošću ili poluživotom modifikovanog FGF-21 polipeptida u serumu koji se koristi i stanjem pacijenta, kao i telesnom težinom ili površinom pacijenta koja se leči.

[0403] Administrirana doza, na primer, pacijentu od 70 kilograma, je tipično u opsegu koji je ekvivalentan doziranju trenutno primenjenih proteina, prilagođenih izmenjenoj aktivnosti ili poluživotu relevantne kompozicije u serumu.

[0404] Za administraciju, formulacije predmetnog otkrića se administriraju brzinom određenom LD-50 ili ED-50 relevantne formulacije, i/ili praćenjem bilo kakvih neželjenih efekata modifikovanih FGF-21 polipeptida u različitim koncentracijama, uključujući ali bez ograničenja na, kako se primenjuje na masu i opšte zdravlje pacijenta. Administracija se može postići jednom ili podeljenim dozama.

[0405] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se administrirati direktno subjektu sisaru. Administriranje bilo kojom rutom se normalno primenjuje za uvođenje FGF-21 polipeptida subjektu. Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se pripremiti u smeši u injektibilnom obliku jedinične doze (uključujući, ali bez ograničenja na, rastvor, suspenziju, ili emulziju) sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu se takođe administrirati kontinuiranom infuzijom (primenjujući, uključujući ali bez ograničenja na, mini pumpe kao što su osmotske pumpe), pojedinačnim bolusom ili depo formulacijama sa usporenim oslobađanjem.

[0406] Formulacuje pogodne za administriranje uključuju vodene i nevodene rastvore, izotonične sterilne rastvore, koji mogu sadržati antioksidanse, pufere, bakteriostate, i rastvorene supstance koje čine formulaciju izotoničnom, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu uključiti sredstva za suspendovanje, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore, i konzervanse. Rastvori i suspenzije se mogu pripremiti iz sterilnog praška, granula, i tableta prethodno opisanih vrsta.

[0407] Farmaceutske kompozicije i formulacije predmetnog otkrića mogu da obuhvate farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens, ili stabilizator.

[0408] Pogodni nosači uključuju, ali bez ograničenja na pufere koji sadrže sukcinat, fosfat, borat, HEPES, citrat, histidin, imidazol, acetat, bikarbonat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući, ali nisu ograničeni na askorbinsku kiselinu; polipeptide male molekulske težine uključujući, ali bez ograničenja one manje od oko 10 ostataka; proteine uključujući, ali bez ograničenja na serum albumina, želatin, ili imunoglobuline; hidrofilne polimere uključujući, ali bez ograničenja na polivinilpirolidon; amino kiseline uključujući, ali bez ograničenja na glicin, glutamin, asparagin, arginin, histidin ili derivate histidina, metionin, glutamat, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući, ali bez ograničenja na trehalozu, saharozu, glukozu, manozu, ili dekstrine; helatna sredstva uključujući, ali nisu ograničeni na EDTA i dinatrijum edentat; jone dvovalentnih metala uključujući, ali bez ograničenja cink kobalt, ili bakar; šećerne alkohole uključujući, ali bez ograničenja manitol ili sorbitol; protivjone za formiranje soli uključujući, ali bez ograničenja natrijum i natrijum hlorid; i/ili nejonski površinski aktivne supstance uključujući, ali bez ograničenja na Tween™ (uključujući, ali bez ograničenja Tween 80 (polisorbat 80) i Tween 20 (polisorbat 20), Pluronics™ i druge pluronske kiseline, uključujući, ali bez ograničenja, i druge pluronske kiseline uključujući, ali bez ograničenja na pluronsku kiselinu F68 (poloksamer 188), ili PEG. Pogodne površinski aktivne supstance uključuju na primer, ali nisu ograničene na polietre na bazi poli(etilen oksid)-poli(propilen oksid)-poli(etilen oksid), tj., (PEO-PPO-PEO), ili poli(propilen oksid)-poli(etilen oksid)-poli(propilen oksid), tj., (PPO-PEO-PPO), ili njihova kombinacija. PEO-PPO-PEO i PPO-PEO-PPO su komercijalno dostupni pod trgovačkim imenima Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ i R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) i dalje su opisani u U.S. patentu br.

4,820,352. Ostali etilen/polipropilen blok polimeri mogu biti pogodne površinski aktivne supstance. Površinski aktivna supstanca ili kombinacija površinski aktivnih supstanci može se primeniti za stabilizaciju PEGilovanog modifikovanog FGF-21 protiv jednog ili više naprezanja uključujući, ali bez ograničenja na naprezanje koji je rezultat mešanja. Neka od gore navedenih mogu se nazvati "sredstva za punjenje." Neka se takođe mogu nazvati "modikatori toničnosti." Antimikrobiološki konzervansi mogu se takođe primeniti za stabilnost proizvoda i mikrobiološku efikasnost; pogodni konzervansi uključuju, ali bez ograničenja na benziol alkohol, benzalkonijum hlorid, metakrezol, metil/propil paraben, krezol, i fenol, ili njihovu kombinaciju.

[0409] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića, uključujući one koji su povezani sa vodorastvornim polimerima, kao što je PEG takođe mogu da se administriraju od ili kao deo sistemi sa odloženim oslobađanje. Komozicije sa odloženim oslobađanjem uključuju, uključujući, ali bez ograničenja na, polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, uključujući, ali bez ograničenja, filmove, ili mikrokapsule. Matrice sa odloženim oslobađanjem uključuju biokompatibilne materijale kao što su poli(2-hidroksietil metakrilat), etilen vinil acetat (ili poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina, polilaktide (polimlečna kiselina), poliglikolid (polimer glikolne kiseline), polilaktidni ko-glikolid (kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline) polianhidride, kopolimere L-glutaminske kiseline i gama-etil-L-glutamata, poli(orto)estre, polipeptide, hijaluronsku kiselinu, kolagen, hondroitin sulfat, karboksilne kiseline, masne kiseline, fosfolipide, polisaharide, nukleinske kiseline, poliamino kiseline, aminokiseline kao što je fenilalanin, tirozin, izoleucin, polinukleotide, polivinil propilen, polivinilpirolidon i silikon. Komozicije sa odloženim oslobađanjem takođe uključuju lipozomalno uhvaćeno jedinjenje. Liposomi koji sadrže jedinjenje su pripremljeni poznatim postupcima.

[0410] Doza koja se administrira pacijentu u kontekstu predmetnog otkrića treba da bude dovoljna da vremenom izazove blagotvorni odgovor kod subjekta. Generalno, ukupna farmaceutski efikasna količina modifikovanog FGF-21 polipeptida predmetnog otkrića administrirana parenteralno po dozi je u opsegu od oko 0.01 µg/kg/dan do oko 100 µg/kg, ili oko 0.05 mg/kg do oko 1 mg/kg, telesne težine pacijenta, mada je ovo predmet terapijske diskrecije.

[0411] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića moduliraju efekat antidijabetskog sredstva. U drugom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu se koadministrirati sa antidijabetskim sredstvom. U drugom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu se administrirati pre lečenja sa antidijabetskim sredstvom. U drugom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi mogu se administrirati nakon lečenja antidijabetskim sredstvom. U drugom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi se koadministriraju sa metforminom. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se koadministriraju sa Klotho beta. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se koadministriraju sa Klotho beta koji uključuje jednu ili više neprirodnih kodiranih aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se koadministriraju sa Klotho beta i antidijabetskim sredstvom. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se koadministriraju sa antidijabetskim sredstvom. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se primenjuju u kombinaciji sa jednim ili više sledećih: taurin, alfa lipoinska kiselina, ekstrakt duda, hrom, glutamin, Enicostemma littorale blume, Scoparia dulcis, ekstrakt estragona i Andrographis paniculata. U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se primenjuju u kombinaciji sa jednim ili više sledećih: preparati insulina (npr., preparati životinjskog insulina ekstrahovani iz goveđeg i svinjskog pankreasa; preparati humanog insulina genetski sintetizovani primenom Escherichia coli, kvasca; cink insulina; protamin cink insulina; fragmenta ili derivata insulina (npr., INS-1), oralni preparat insulina), insulinski sensitizeri (npr., pioglitazon ili njegova so (ppoželjno hidrohloridna), rosiglitazon ili njegova so (poželjno maleatna), netoglitazon, rivoglitazon (CS-011), FK-614, jedinjenje opisano u WO01/38325, tesaglitazar (AZ-242), ragaglitazar (N,N-622), muraglitazar (BMS-298585), edaglitazon (BM-13-1258), metaglidasen (MBX-102), naveglitazar (LY-519818), MX-6054, LY-510929, AMG-131(T-131), THR-0921), inhibitori α-glukozidaze (npr., vogliboza, akarboza, miglitol, emiglitat itd.), bigvanidini (npr., fenformin, metformin, buformin ili njegova so (npr., hidrohloridna, fumaratnana, sukcinatna)), sekretagogi insulina [sulfonilureja (npr., tolbutamid, glibenklamid, gliklazid, hlorpropamid, tolazamid, acetoheksamid, gliklopiramid, glimepirid, glipizid, glibuzol), repaglinid, nateglinid, mitiglinid ili ili njegova kalcijum hidratna so], inhibitori dipeptidil peptidaza IV (npr., vidagliptin (LAF237), P32/98, sitagliptin (MK-431), P93/01, PT-100, saksagliptin (BMS-477118), T-6666, TS-021), β3 agonisti (npr., AJ-9677), GPR40 agonisti, polipeptidi slični glukagonu (I) (glp I), (glp2), ili drugi dijabetogeni peptidni hormoni, GLP-1 receptor agonisti [npr., GLP-1, GLP-1MR sredstvo, N,N-2211, AC-2993 (eksendin-4), BIM-51077, Aib(8,35)hGLP-1 (7,37)NH2, CJC-[131], agonisti amilina (npr., pramlintid), inhibitori fosfotirozin fosfataze (npr., natrijum vanadat), inhibitori glukoneogeneze (npr., inhibitori glikogen fosforilaze, inhibitori glukoza-6-fosfataze, antagonisti glukagona), SGLUT (natrijum-glukoza kotransporter) inhibitori (npr., T-1095), inhibitori 11β-hidroksisteroidne dehidrogenaze (npr., BVT-3498), adiponektin ili njegove agonisti, IKK inhibitori (npr., AS-2868), lekove za poboljšanje rezistencije na leptin, agonisti somatostatinskih receptora (jedinjenja opisana u WO01/25228, WO03/42204, WO98/44921, WO98/45285, WO99/22735 itd.), aktivatori glukokinaze (npr., Ro-28-1675), GIP (insulinotropni peptid zavistan od glukoze).

[0412] Jedan od načina na koji se terapijska efikasnost polipeptida i kombinovanih terapija, uključujući polipeptide ovog otkrića, može odrediti je kroz smanjenje nivoa HbAlc kod pacijenta. U jednom tehničkom rešenju ovog otkrića, polipeptidi predmetnog otkrića smanjuju HbAlc nivoe za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ili najmanje 50% promene u odnosu na HbAlc nivoe dva meseca pre početka terapije modifikovanim FGF-21 polipeptidima, u odnosu na tri meseca pre početka terapije modifikovanim FGF-21 polipeptidima, ili procentualnim promenama u odnosu na početne vrednosti. U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, polipeptidi predmetnog otkrića koji se administriraju pacijentu koji se takođe leči antidijabetskim sredstvom moduliraju sposobnost antidijabetskog sredstva da snižava glukozu u krvi.

[0413] U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića moduliraju sposobnost troglitazona da smanji potrebe za insulinom. Troglitazon koji se primenjuje u kombinaciji sa polipeptidom predmetnog otkrića može se primeniti za odlaganje ili prevenciju dijabetesa tipa 2 u određenim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića.

[0414] U jednom tehničkom rešenju predmetnog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi se koadministriraju sa, ili administriraju pre ili nakon lečenja sa, sulfonilurejom. U nekim tehničkim rešenjima predmetnog otkrića, lečenje sa terapijskom dozom modifikovanih FGF-21 polipeptida modulira serumsku glukozu. U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se administriraju sa Klotho beta koji modulira efekte polipeptida na glukozu u krvi. U drugom tehničkom rešenju ovog otkrića, modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića se administriraju sa Klotho beta koji smanjuje glukozu u krvi više nego kada se primenjuju sami modifikovani FGF-21 polipeptidi.

XVI. Terapijske primene modifikovanih FGF-21 polipeptida predmetnog otkrića

[0415] Modifikovani FGF-21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu se primeniti za lečenje sisara koji pate od insulin nezavisnog dijabetes melitusa (NIDDM: tip 2), insulin zavisnog dijabetesa (tip 1), kao i gojaznosti, neadekvatnog klirensa glukoze, hiperglikemije, hiperinsulinemije, i bilo koje druge bolesti ili stanja koja mogu biti posredovana FGF-21.

[0416] Prader-Willi-jev sindrom (P.W.S. ili PWS) je retki genetski poremećaj u kojem sedam gena (ili neki njihov podskup) na hromozomu 15 (q 11-13) se briše ili neekspresuje (delimično brisanje hromozoma 15q) na očinskom hromozomu. Karakteristika PWS je nizak tonus mišića, nizak rast, nepotpun seksualni razvoj, kognitivni poremećaji, problematično ponašanje i hronični osećaj gladi koji može dovesti do prekomerne ishrane i gojaznosti opasne po život.

[0417] Predmetno otkriće obezbeđuje postupak za lečenje sisara koji pokazuje jedan ili više dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, gojaznost, insulinsku rezistenciju, hiperinsulinemiju, intoleranciju na glukozu, ili hiperglikemiju, koji obuhvata administriranje navedenom sisaru kome je takvo lečenje potrebno terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21 polipeptida predmetnog otkrića.

[0418] Postupak lečenja može biti dovoljan da se kod navedenog sisara postigne najmanje jedna od sledećih modifikacija: smanjenje zaliha telesne masti, smanjenje insulinske rezistencije, smanjenje hiperinsulinemije, povećanje tolerancije na glukozu, i smanjenje hiperglikemije.

[0419] Predmetna objava takođe obuhvata postupak smanjenja mortaliteta i morbiditeta kod kritično obolelih pacijenata koji pate od sindroma sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS -systemic inflammatory response syndrome) povezanog sa infektivnim insultima, poput sepse, pankreatitisa, ishemije, višestruke traume i povrede tkiva, hemoragičnog šoka, imunološki posredovane povrede organa, respiratornog distresa, šoka, bubrežne insuficijencije, i sindrom višestruke disfunkcije organa (MODS - multiple organ dysfunction syndrome), kao i neinfektivnim patološkim uzrocima koji uključuju administriranje kritično obolelim pacijentima terapijski efikasne količine modifikovanog FGF-21.

[0420] U jednom tehničkom rešenju objave, objava obezbeđuje kompozicije i postupke sa modifikovanim FGF-21 polipeptidima stavljenim na uvid javnosti ovde u kombinaciji sa drugim agensom za lečenje poremećenog metabolizma glukoze, poput insulinske rezistencije, poremećene insulinske sekrecije ili hiperglikemije. Takvi drugi agensi uključuju, na primer, jedan ili više od sulfoniluree, PPAR-gama agonista, agonista GPL-1 receptora, inhibitora dipeptidil peptidaze IV, analoga amilina, bigvanida, agonista dopaminskog D2 receptora, meglitinida, inhibitor alfaglukozidaze, antidilipidemičnog sekvestranta žučne kiseline, insulina, terapije citokinima, genske terapija, i terapije antitelima. U nekom tehničkom rešenju, ovde stavljeni na uvid javnosti modifikovani polipeptid FGF-21 može se administrirati pacijentu koji ne postigne normoglikemiju primenom drugog tretmana, npr., lečenjem metforminom, pioglitazonom, sulfonilureeom, glinidom, oralnim tiazolidindionom (TZD) kao što je pioglitazon, agonist receptora za glukagonusličan peptid 1 (GLP-1) kao što je eksenatid, DPP4 inhibitor kao što su sitagliptin, vildagliptin, saksagliptin, alogliptin, linagliptin, ili teneligliptin, ili kombinovana terapija kao što su metformin pioglitazon, metformin i sulfonilurea, metformin i glinid, metformin i TZD, metformin i pioglitazon, metformin i agonist receptora GLP-1, metformin i eksenatid, sitagliptin i metformin, sitagliptin i simvastatin, vildagliptin i metformin, saksagliptin i metformina, alogliptin i pioglitazon, ili linagliptin i metformin, ili SGLT2 inhibitori kao što su dapagliflozin, kanagliflozin, empagliflozin, ipragliflozin ili tofogliflozin.

[0421] U nekin tehničkim rešenjima objave, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti može se administrirati za prevenciju ili lečenje gojaznosti (npr., indeks telesne mase od najmanje 25). Rečeno je da se modifikovani FGF-21 polipeptid može administrirati u kombinaciji sa agensom protiv gojaznosti kao što su orlistat, rimonabant, sibutramin, peptid YY (PYY, peptid od 36 aminokiselina koji smanjuje apetit), PYY analog, CB-1 antagonist, rimonabant, leptin, analog leptina, ili fentermin.

[0422] U nekim tehničkim rešenjima, modifikovani FGF-21 polipeptid ovde stavljen na uvid javnosti može se administrirati za prevenciju ili lečenje Prader-Willi sindroma.

[0423] Podrazumeva se da su primeri i tehnička rešenja koji su ovde opisani samo u ilustrativne svrhe i da će se razne modifikacije ili promene u svetlu istih predložiti prosečnim poznavaocima u oblasti. Takođe treba razumeti da je ovde korišćena terminologija u svrhu opisivanja samo primera tehničkih rešenja, i da nije namenjena ograničavanju obima predmetne objave, koji su ograničeni samo priloženim patentnim zahtevima.

PRIMERI

[0424] Sledeći primeri su ponuđeni za ilustraciju, ali ne ograničavaju pronalazak za koji se traži zaštita.

PRIMER 1

Eksprimiranje i prečišćavanje FGF-21 u E. Coli

[0425] Plazmidi koji sadrže nemodifikovane ili modifikovane ekspresijske konstrukte FGF-21 pod kontrolom T7 promotera transformišu se u soj E. coli kao što je W3110 B2 soj E. coli u kome je ekspresija T7 polimeraze pod kontrolom promotera induciranog arabinozom. Bakterijske kulture preko noći mogu se razblažiti 1:100 u bocama za mućkanje koje sadrže 2X YT medijum za kulturu i uzgajati na 37°C do OD600od ∼ 0.8. Ekspresija proteina može se indukovati dodavanjem arabinoze (0.2% konačnih), i para-acetil-fenilalanina (pAcF) do krajnje koncentracije od 4 mM. Kulture se mogu inkubirati u odgovarajućem trajanju i na temperaturi, npr., na 37 stepeni C tokom 4 sata. Ćelije se mogu peletirati i resuspendovati u B-PER puferu za lizu (Pierce) 100 ul/OD ml 10 ug/ml DNaze i inkubirati na 37°C tokom 30 minuta. Ćelijski materijal se može ukloniti centrifugiranjem a supernatant se može ukloniti. Peleta se može resuspendovati u jednakoj količini SDS-PAGE proteinskog pufera za punjenje. Uzorci se mogu napuniti na 4-12% PAGE gela sa MES i DTT. Postupci za prečišćavanje FGF-21 su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti i prečišćavanje može da se potvrdi pomoću SDS-PAGE, Western Blot analize, masene spektrometrija na konceptu jonske zamke sa elektrosprej-jonizacijom i slično.

[0426] Ćelijska pasta se resuspenduje mešanjem do konačnih 10% čvrste supstance u puferu I od 4°C za inkluzino telo (IB) (50mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4°C). Ćelije se liziraju propuštanjem resuspendovanog materijala kroz mikro fluidizator ukupno dva puta, zatim se centrifugira (10,000g; 15 min; 4°C) i supernatant se dekantuje. IB pelet se ispere resuspendovanjem u dodatnoj zapremini IB pufera I (50mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 4°C) a resuspendovani materijal se propušta kroz mikro fluidizator ukupno dva puta, zatim se centrifugira (10,000g; 15 min; 4°C) i supernatant se dekantuje. IB pelet se resuspenduje u jednoj zapremini pufera II (50mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4°C), zatim se centrifugira (10,000g; 15 min; 4°C) i supernatant se dekantuje. IB pellet se zatim resuspenduje u 1⁄2 zapremine pufera II (50mM Tris pH 8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4°C). IB se alikvotira u odgovarajuće kontejnere, zatim se centrifugira (10,000g; 15 min; 4°C) i supernatant se dekantuje. Inkluziona tela su solubilizovana (ovo je tačka u kojoj bi se inače mogla čuvati na -80°C do dalje upotrebe.)

[0427] Inkluziona tela su solubilizovana do konačne koncentracije između 10-15mg/mL u puferu za solubizaciju (20mM Tris, pH 8.0; 8M Urea; 10mM β-ME) i solubizovana IB inkubirana na sobnoj temperaturi uz stalno mešanje tokom 1 sata. Nerastvoran materijal se uklonja filtracijom (0.45µm PES filter) i koncentracija proteina se podešava (nije uvek potrebno) razblaživanjem dodatnim puferom za solubizaciju (kada je koncentracija proteina visoka).

[0428] Ponovno savijanje se može izvesti razblaživanjem do krajnje koncentracije proteina od 0.5mg/ml u 20mM Tris, pH 8.0; 4°C. Dozvoljeno je ponovno savijanje tokom 18 do 24 sata na 4°C.

[0429] Za prečišćavanje, filtrirana reakcija ponovnog savijanja može se propustiti kroz 0.45µM PES filter. Napunjeni materijal Q HP kolone (GE Healthcare) uravnotežen u puferu A (20mM Tris, pH 7.5). Eluiranje nemodifikovanog ili modifikovanog FGF-21 sa linearnim gradijentom preko 20CV do 100% pufera B (20mMTris, pH 7.5; 250mM NaCl). Monomerni FGF-21 može se tako proizvesti iz sakupljenih eluiranih frakcija. Q HP skupina je uzeta i puferski izmenjena u 20mM Tris, pH 8.0; 2M uree; 1mM EDTA. pH je spuštena na 4.0 sa 50% glacijalnom sirćetnom kiselinom. Uzorci su koncentrovani naniže do 4.0±1.0mg/mL. U uzorak dodat je 12:1 molarni višak PEG-s i konačna koncentracija 1% hidrazida sirćetne kiseline, pH 4.0. Uzorak je inkubiran na 28°C tokom 48-72 sati. U PEG reakcijuse zatim dodaje završni deo 50mM Tris base, i razblaži 10 puta sa RO vodom. Provodljivost je verifikovana da bude <1mS/cm i pH je između 8.0-9.0. Materijal se nanosi preko Source 30Q kolone (GE Healthcare) uravnotežene u puferu A A (20mM Tris, pH 8.0). PEG-FGF-21 eluira linearnim gradijentom preko 20CV do 100%B (20mM Tris, pH 8.0; 100mM NaCl). PEG-FGF-21 se sakuplja i pufer zamenjuje sa 20mM Tris, pH 7.4; 150mM NaCl. PEG materijal se koncentriše na između 1-2mg/mL i filtrira se sterilisanjem pomoću 0.22µm PES filtera. Materijal se čuva na 4°C. Za duže čuvanje, brzo zamrzniti i čuvati na -80°C.

PRIMER 2

Postupci za proizvodnju modifikovanog FGF-21 polipeptida koji sadrže neprirodno kodiranu aminokiselinu

[0430] Uvedeni translacioni sistem koji sadrži ortogonalnu tRNK (O-tRNK) i ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) može se koristiti za ekspresiju modifikovanog FGF-21 koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu. O-RS preferirano aminoaciluje O-tRNK sa neprirodno kodiranom aminokiselinom. Zauzvrat translacioni sistem umeće neprirodno kodiranu aminokiselinu u FGF-21, kao odgovor na kodirani selektorski kodon. Pogodne O-RS i O-tRNA sekvence opisane su u WO 2006/068802 sa naslovom "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof" (E9; SEQ ID NO: 15) i WO 2007/021297 sa naslovom "Compositions of tRNA and Uses Thereof" (F13; SEQ ID NO: 16). O-RS i O-tRNA sekvence uzete kao primer su uključene u tabelu 2 ispod.

[0431] Tabela 2: Identifikatori sekvence polipeptidnih i polinukleotidnih sekvenci ortogonalne tRNK (O-tRNK) i ortogonalne aminoacil tRNK (O-RS) sintetaze

[0432] Tabela 3: Peptidne i polinukleotidne sekvence FGF-21, ortogonalne tRNK (O-tRNK) i ortogonalne aminoacil tRNK sintetaze (O-RS) uzete kao primer

[0433] Transformacija E. coli sa plazmidima koji sadrže modifikovani FGF-21 gen i ortogonalni aminoacil tRNK sintetaza/tRNK par (specifičan za željenu neprirodno kodiranu aminokiselinu) omogućava inkorporiranje neprirodno kodirane aminokiseline u određeno mesto u modifikovani FGF-21 polipeptid.

[0434] Zreli FGF-21 divljeg tipa može se pojačati PCR-om iz reakcije sinteze cDNK, npr., izvedene iz zdrave poliA+ mRNK ljudske jetre (Biochain) koristeći standardne protokole i klonirane u vektor kao što je pET30 (npr., korišćenjem NcoI-BamHI mesta cepanja). Nakon opciono potvrđene sekvence, FGF-21 (koji može sadržati oznaku za prečišćavanje kao što je N-terminalna HHHHHHSGG sekvenca) može se subklonirati. Na primer, FGF-21 se može subklonirati u supresijski vektor koji sadrži amber supresorsku tirozil tRNK<Tyr/CUA>iz Methanococcus jannaschii (Mj tRNK<Tyr/CUA>) i povezati sa pogodnim promoterom, npr., pod konstitutivnom kontrolom sintetičkog promotera izvedenog iz promoterske sekvence lipoproteina E. coli (Miller, J.H., Gene, 1986), kao i ortogonalna tirozil-tRNA-sintetaza (MjTyrRS) pod kontrolom GlnRS promotera E. coli. Eksprimiranje nemodifikovanog ili modifikovanog FGF-21 može biti pod kontrolom T7 promotera. Amber mutacije mogu se uvesti pomoću standardnih protokola mutacija sa brzom promenom (Stratagene; La Jolla, Kalifornija). Konstrukti mogu biti verifikovani sekvencom.

[0435] Dve različite neprirodno kodirane aminokiseline mogu se uvesti u modifikovane FGF-21 polipeptide, uvođenjem selektorskog kodona na dva različita mesta u nukleinskoj kiselini.

Supresija sa para-acetil-fenilalaninom (pAcF)

[0436] Plazmidi koji sadrže modifikovane FGF-21 ekspresijske konstrukte i O-tRNK i O-RS ekspresijske konstrukte (koji mogu biti u istom ili različitim plazmidima ili stabilno transfektovani u soj) mogu se transformisati u W3110 B2 soj E. coli u kome je ekspresija polimeraze T7 pod kontrolom promotera koji indukuje arabinozu. Bakterijske kulture preko noći mogu se razblažiti 1:100 u bocama za mućkanje koje sadrže 2X YT medijuma za kulturu i uzgajati na 37°C do OD600od ∼ 0.8. Ekspresija proteina može se indukovati dodavanjem arabinoze (0.2% konačnih) i paraacetil-fenilalanina (pAcF) do krajnje koncentracije od 4 mM. Kulture se mogu inkubirati u odgovarajućem trajanju i na temperaturi, npr., na 37 stepeni C tokom 4 sata. Ćelije se mogu peletirati i resuspendovati u B-PER puferu za lizu (Pierce) 100ul/OD/ml 10 ug/ml DNaze i inkubirati na 37°C tokom 30 minuta. Ćelijski materijal se može ukloniti centrifugiranjem a supernatant se može ukloniti. Peleta se može resuspendovati u jednakoj količini pufera za punjenje proteina za SDS-PAGE. Uzorci se mogu napuniti na 4-12% PAGE gela sa MES i DTT. Postupci za prečišćavanje FGF-21 poznati su prosečnom poznavaocu a prečišćavanje može biti potvrđeno sa SDS-PAGE, Western Blot analizama, masene spektrometrija na konceptu jonske zamke sa elektrosprej-jonizacijom i slično.

[0437] Mutirani FGF-21 proteini sa His-oznakom ili oni koji nisu sa His-oznakom mogu se prečistiti korišćenjem postupaka koji su poznate prosečnom poznavaocu iz oblasti. Na primer, ProBond nikl-helatna smola (Invitrogen, Carlsbad, CA) može se koristiti putem standardnih procedura prečišćavanja proteina sa His-oznakama koje obezbeđuje proizvođač.

PRIMER 3

Uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil u modifikovani FGF-21 polipeptid i naknadna reakcija sa PEG koji sadrži aminooksi

[0438] Sledeći postupak uzet kao primer može se koristiti za generisanje modifikovanog FGF-21 polipeptida vezanog za segment koji produžava poluživot. Postupak uključuje neprirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton koja zatim reaguje sa segmentom koji produžava poluživot kao što je PEG koji sadrži aminooksi koji ima molekulsku masu od približno 30,000 Da. Odabrani ostatak FGF-21 je supstituisan sa neprirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:

[0439] Sekvence korišćene za inkorporaciju specifičnu za mesto p-acetil-fenilalanina u FGF-21

mogu biti SEQ ID NO: 1 (FGF-21), SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii mtRNK ), 15, 29, 30 ili 31 (TyrRS LW1, 5, ili 6), ili bilo koji modifikovani FGF-21 polipeptid opisan ovde.

[0440] Jednom modifikovan, FGF-21 polipeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:

R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2

[0441] gde R je metil, n je 3 a N je odabrana molekulska masa, npr., približno 30,000 Da.

[0442] Alternativno, neprirodno kodirana aminokiselina koja sadrži keton može biti povezana za PEG reagens koji ima sledeću strukturu:

R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2

[0443] gde R = metil, n=4 a N je odabrana molekulska masa, npr., približno 30,000 Da.

[0444] Prečišćeni modifikovani FGF-21 koji sasrži p-acetilfenilalanin rastvoren pri 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-strukim viškom PEG koji sadrži aminooksi, a zatim se meša 10 - 16 sati na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, pp 475). PEG- FGF-21 se zatim razblaži u odgovarajućem puferu za trenutno prečišćavanje i analizu.

PRIMER 4

Proizvodnja modifikovanih FGF-21 polipeptida

[0445] Polinukleotidi koji kodiraju svaki od modifikovanih FGF-21 polipeptida prikazanih na Sl.

1A-B su proizvedeni. Upotreba DNK kodona u polinukleotidnim sekvencama optimizovana je za ekspresiju E. coli korišćenjem standardnih postupaka poznatih u oblasti (SEQ ID NO: 317 i 318 su primer polinukleotidnih sekvenci koje kodirajuju jedinjenje 2, odnosno pegilovano jedinjenje 2, redom). Ako je prisutan peptidni konektor, njegova kodirajuća sekvenca je odabrana na osnovu standardnog genetskog koda, npr., GGU, GGC, GGA ili GGG za glicin, UCU, UCC, UCA, UCG, AGU ili AGC za serin, CAU ili CAC za histidin, itd. Modifikovani FGF-21 polipeptidi su eksprimirani u E. coli i prečišćeni (postupci uzeti kao primer su opisani ovde). Proizvedeni su modifikovani FGF-21 polipeptidi koji sadrže neprirodno kodiranu aminokiselinu para-acetilfenilalanin (skraćeno pACF ili pAF) (postupci uzeti kao primer su dati u primeru 2). Ukratko, polinukleotid za kodiranje je dalje modifikovan da uključuje selektor kodon na odgovarajućem položaju u polinukleotidnoj sekvenci kako bi se kodirao pACF, a eksprimirani su u ćeliji koja je stvorena inženjeringom da izrazi ortogonalnu tRNK (O-tRNK) i ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS), tako da je selektor kodon usmerio uključivanje pACF na izabrani položaj. PACF je zatim povezan sa poli (etilen glikolom) (PEG) koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 30 kDa (postupci uzeti kao primer su dati u primeru 3).

Sekvence kodiranja jedinjenja 2 (SEQ ID NO:317)

[0446]

Ċ

[0447] Sekvence kodiranja PEGilovanog-jedinjena 2 (SEQ ID NO:318)

[0448] Kao što je detaljno opisano u primerima koji slede, modifikovani FGF-21 polipeptidi su dalje okarakterisani, uključujući ispitivanje in vitro biološke aktivnosti, stabilnosti, sklonosti deamidaciji i stvaranju agregata, otpornosti na proteolizu in vivo, imunogenosti, farmakokinetike, i biološke aktivnosti in vivo u modelu dijabetesa.

[0449] Kompletne polipeptidne sekvence proizvedenih modifikovanih FGF-21 polipeptida (čije su delimične sekvence prikazane na sl.1A-B) su sledeće:

Jedinjenje 1

Jedinjenje 4

Jedinjenje 7

Jedinjenje 10

Jedinjenje 11

Jedinjenje 14

Jedinjenje 17

Jedinjenje 19

Jedinjenje 22

Jedinjenje 25

Jedinjenje 27

Jedinjenje 30

Pegilovano jedinjenje 1

Pegilovano jedinjenje 2

Pegilovano jedinjenje 6

Pegilovano jedinjenje 11

Pegilovano jedinjenje 19

Pegilovano jedinjenje 20

Pegilovano jedinjenje 22

[0450] Dodatni modifikovani FGF-21 polipeptidi su proizvedeni kao fuzijski proteini. Neki od modifikovanih FGF-21 polipeptida sadržali su sekvencu jedinjenja 2 (SEQ ID NO: 102), sa ili bez N-terminalnog metionina, fuzionisanu sa jednim ili više fuzijskih partnera, kao što su Fc domen ili njegov fragment, PKE adnektin ("PKE"), ili sekvenca modifikovanog ili nemodifikovanog humanog serumskog albumina ("HSA") i opciono vezujući peptid. Drugi modifikovani FGF-21 polipeptidi su zasnovani na sekvenci divljeg tipa jedinjenja 1 (sa ili bez N-terminalnog metionina). Različit oblici sekvence PKE adnektina su uključeni. Oni se nazivaju "PKE(1)" ili "PKEI" i "PKE(2)" ili PKEII. Aminokiselinska sekvenca od PKE(1) bila je GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISVHSIIEKNSIIRITIGETGGNSPVKEFTVPISKTTATISGLK P GVDITITVIAVIGSKIIIPISINIRTEIEKPSK (SEQ ID NO:319). Aminokiselinska sekvenca PKE(2) bila je GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISVDAPAVTVRIIRITIGREVKKISDLGPLIIIKEFTVPGSKST A TISGLKPGVDITITVIAVTGSGESPASSKPISINIRTP (SEQ ID NO:320). Kada su PKE(1) ili PKE(2) uključeni na N-terminusu fuzijskog proteina, sekvenca eksprimirana u E. coli obuhvatala je N-terminalni metionin, za koji se očekivalo da cepa met-egzopeptidaza kada se eksprimira u E.

coli, što rezultira zrelom sekvencom bez N-terminalnog metionina; očekivani zreli oblik fuzijskih proteina PKE bez N-terminalnog metionina prikazan je na listi ispod.

[0451] Sekvenca humanog serumskog albumina sadržana u nekim fuzijskim proteinima bila je HuSA(C34A). Njegova aminokiselinska sekvenca je:

[0452] Druga sekvenca humanog serumskog albumina sadržana u nekim fuzijskim proteinima bila je HSA (C34A, des Leu-585). Njegova aminokiselinska sekvenca je:

[0453] G4Sx3 se odnosi na sekvencu GGGGS ponovljenu 3 puta, tj., GGGGSGGGGSGGGGS.

[0454] Fuzijski proteini uzeti kao primer sadržali su više od jednog modifikovanog FGF-21 polipeptida, npr., jedinjenja 141-146.

[0455] Sekvence jedinjenja fuzijskih proteina su prikazane ispod, a karakteristike ovih fuzijskih proteina su sumirane na sl.40A-C.

Jedinjenje 101: PKE(2)-L1-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 105: PKE(2)-L5-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 109: PKE(2)-L9-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 113: PKE(2)-L13-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 118: PKE(2)-L18-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 122: PKE(2)-L22-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 125: HuSA(C34A)-L202-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 127: HuSA(C34A)-L204-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 129: HuSA(C34A)-L206-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 131: HuSA(C34A)-L208-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 133: HuSA(C34A, des Leu-585)-L211-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 135: HuSA(C34A, des Leu-585)-L211-FGF21 (Jedinjenje 1)

Jedinjenje 137: FGF21 (Jedinjenje 2)-L205-HuSA(C34A)

Jedinjenje 139: FGF21 (Jedinjenje 2)-L210-HuSA(C34A)

Jedinjenje 141: FGF21 (Jedinjenje 2)-L209-HuSA(C34A)-G4Sx3-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 143: FGF21 (Jedinjenje 2)-L209-HuSA(C34A, des Leu-585)-G4Sx3-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 144: FGF21 (Jedinjenje 1)-L209-HuSA(C34A, des Leu-585)-G4Sx3-FGF21 (Jedinjenje 1)

Jedinjenje 146: FGF21 (Jedinjenje 1)-L210-HuSA(C34A)-G4Sx3-FGF21 (Jedinjenje 1)

Jedinjenje 149: PKE(1)-L3-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 154: PKE(1)-L8-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 159: PKE(1)-L13-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 163: PKE(1)-L17-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 168: PKE(1)-L22-FGF21 (Jedinjenje 2)

Jedinjenje 172 [Fc(hIgG1a_191)-L12-FGF21(Jed.2)]

Jedinjenje 176 [Fc(hIgG1a_190)-L253-FGF21(Jed.2)]

Jedinjenje 179 [Fc(hIgG1a_191)-L7-FGF21-1aa(Jed.2 sa obrisanom C-terminalnom aminokiselinom)

Jedinjenje 180 [Fc(hIgG1a_191)-L7-FGF21-3aa(Jed.2 sa tri obrisane C-terminalne aminokiseline)

Jedinjenje 182 [Fc(hIgG1a_191b)-L7-FGF21(Jed.2)]

PRIMER 5

In vitro potencija FGF-21 molekula delecije

[0456] U ovom primeru, ispituje se potencija nekoliko modifikovanih FGF-21 polipeptida i upoređuje sa potencijom pegilovanog jedinjenja 1 u ćelijski-zasnovanom eseju in vitro aktivacije receptora. Pokazano je da je nekoliko modifikovanih FGF-21 polipeptida, uključujući pegilovano jedinjenje 2 imaju uporedivu potenciju sa pegilovanim jedinjenjem 1.

Metode

[0457] Klonalna ćelijska linija humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293 koja stabilno eksprimira humani β b-klotho stvorena je da bi se okarakterisale FGF21 varijante u primarnom in vitro eseju. HEK-293 ćelije su transfektovane prateći proizvođački protokol za reagens za transfekciju Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i korišćenjem linearizovanog plazmida koji kodira humani b-klotho sa C-terminalnom FLAG oznakom (N-DIKDDDDK-C u aminokiselinskom kodu prikazanim jednim slovom) pod kontrolom promotera citomegalovirusa. Pozitivni klonovi su izolovani nakon 14 dana rasta u selekcionom medijumu [600 µg/mL Geneticina (Invitrogen) u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagle-ovom medijumu (DMEM) sa 4.5 g/l D-glukoze koja sadrži L-glutamin, Hepes (Invitrogen) i 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS)].

[0458] Primarnim esejem izmerena je FGF21 varijantom-zavisna fosforilacija ekstracelularne kinaze regulisane signalom 1/2 (pERK1/2) u klonalnoj HEK-293 ćelijskoj liniji koja stabilno eksprimira humani β-klotho. Za analize, ćelije su posejane u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarića (Falcon) sa 40,000 ćelija po bunariću u 200 µL medijuma za selekciju i održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2. Posle 48 sati, medijum za potpunu selekciju zamenjen je medijumom bez seruma (DMEM sa 4.5 g/l D-glukoze i 0.1% goveđeg serumskog albumina bez masnih kiselina), a ćelije su održavane tokom 6 sati na 37°C u vlažnoj atmosferi od 5% CO2. Jedinjenja koja će se testirati su serijski razređena u medijumu bez seruma. Esej je započet zamenom medijuma bez seruma na ćelijama sa razblaženim jedinjenjima, inkubacija je ostavljena da traje 7 minuta na sobnoj temperaturi, a reakcija je prekinuta uklanjanjem jedinjenja i dodavanjem 100 µL pufera za lizu (Perkin Elmer AlphaScreen kit) u svaki bunarić. Ploče su mućkane na ~ 80 ob/min približno 10 minuta na sobnoj temperaturi i čuvane smrznute na -80°C. Alikvot (4 µl) iz svakog bunarića odmrznutog ćelijskog lizata analiziran je na pERK1/2 u skladu sa proizvođačkim protokolom za Surefire AlphaScreen pERK1/2 kit i AlphaScreen IgG detekcioni kit, protein A, (Perkin Elmer) korišćenjem belih Proxi ploča sa 384 bunarića (Perkin Elmer). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom dva sata u mraku a zatim su pročitane na čitaču Envision 2103 Multiplate (Perkin Elmer) koristeći protokol AlphaScreen. Podaci su uklapani u 4 parametarsku jednačinu log(agonist) u odnosu na odgovor nelinearnom regresijom pomoću GraphPad Prism 5 softvera.

Rezultati

[0459] In vitro potencija je određena merenjem FGF21-zavisne fosforilacije ekstracelularne kinaze regulisane signalom (ERK) 1/2 u ćelijskoj liniji humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293 u kojoj je humani β -Klotho stabilno uveden da funkcioniše kao ko-receptor sa endogeno eksprimiranim FGFR splajs varijantama. Potencija je procenjena određivanjem srednje vrednosti EC50ili pEC50(negativna baza 10 log od EC50koncentracije izražena u molovima po litru) za svako ispitivano jedinjenje. Primer krive doza-odgovor je prikazan na sl. 2 za pegilovano jedinjenje 1 i pegilovano jedinjenje 2. Rezultati za dodatna ispitivana jedinjenja su prikazani u tabelama 4 i 5.

Tabela 4. EC50 vrednosti za in vitro modifikovanu FGF-21 aktivnost u pERK eseju.

Tabela 5. EC50 vrednosti za in vitro modifikovanu FGF-21 aktivnost u pERK eseju.

Primer 6

Ispitivanje termalne stabilnosti modifikovanih FGF-21 polipeptida

[0460] U ovom primeru, termalna stabilnost modifikovanih FGF-21 polipeptida je merena korišćenjem termalne skenirajuće fluorescencije (TSF - Thermal Scanning Fluorescence ) i diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC - Differential Scanning Calorimetry). Termalna stabilnost je prepoznata u literaturi da ima predvidivu vrednost za utvrđivanje sklonosti formiranju agregata (videti, npr., Webster, "Predicting Long-Term Storage Stability of Therapeutic Proteins," Pharmaceutical Technology, tom 37, izdanje 11, str.42-48, 2. novembar 2013).

Metode

[0461] Termičke srednje tačke denaturacije izmerene su diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom u MicroCal (Malvern Instruments) auto VP-DSC. Za DSC analizu, uzorci proteina formulisani su u 250mM saharoze, 20mm histidina pH .,0 pri približno 2 mg/ml sa brzinom skeniranja od 90°C na sat. Referentna ćelija je napunjena identičnim puferom bez proteina. Prelazne srednje tačke (Tm) promene faze između savijenih i termički odvijenih proteinskih domena pod uslovima rastvora i primenjene brzine skeniranja određene su iz maksimuma pikova viđenih na tragu termograma (strelice).

[0462] Za termalnu skenirajuću fluorescenciju (TSF), protein se razblaži na 0.2 mg/ml u puferu od interesa i dodaje se mala količina fluorescentne fluoroforne anilinonaftalen sulfonske kiseline (ANS). Uzorci se stavljaju u PCR tankozidnu ploču sa 96 bunarića i povećava se temperatura uzorka proteina u prisustvu spoljnjeg fluorofora dok se fluorescencija uzorka nadgleda na Bio-Rad CT1000-RT PCR instrumentu. Srednja tačka termičkog odvijanja proteina određuje se praćenjem porasta fluorescentnog signala sonde u interakciji sa novootkrivenim hidrofobnim jezgrom termički denaturirajućeg proteina. Temperatura u srednjoj tački odvijanja (Tm) u ispitivanim uslovima pufera i brzine skeniranja definisana je kao tačka infleksije temperature krive porasta fluorescentnog signala.

Rezultati

[0463] Reprezentativni rezultati DSC skeniranja prikazani su na sl.3. Primećeno je da pegilovano jedinjenje 2 ima temperaturu prelazne srednje tačke ("Tm") približno 8 stepeni C višu od pegilovanog jedinjenja 1. Termička reverzibilnost je bila> 95% (podaci nisu prikazani).

[0464] SL.4 prikazuje reprezentativne rezultate za TSF. Jedinjenje 10 je pokazalo porast Tm za približno 8 stepeni C u odnosu na jedinjenje 1 (koje ima FGF-21 sekvencu divljeg tipa osim što je N-terminalni metionin uključen za ekspresiju u E. coli). Rezultati za dodatna jedinjenja prikazani su u tabeli 6, dole.

[0465] Zajedno, ovi rezultati pokazuju da bi se razumno očekivalo da primerna jedinjenja imaju smanjenu sklonost ka stvaranju agregata, na primer, jedinjenja 2, 10 i 16. Očekuje se da smanjena sklonost stvaranja agregata daje duži poluživot i/ili sposobnost formulisanja do veće koncentracije.

[0466] Tabela 6. Rezultati termalne stabilnosti utvrđeni termalnom skenirajućom fluorescencijom za modifikovane FGF-21 polipeptide u poređenju sa jedinjenjem 1. Povećana termalna stabilnost primećena je do približno 7-8 stepeni C za neka jedinjenja.

Primer 7

Deamidacija i formiranje agregata

[0467] Ovaj primer opisuje procenu deamidacije i formiranja agregata za modifikovane FGF-21 polipeptide.

Metode

Testovi termičkog stresa:

[0468] Uzorci proteina od interesa su pripremljeni u test puferu 250mM saharoza, 20 mM histidin, pH 6.5, i pH 7 ili 20 mM TRIS pH 7.5) pri koncentraciji od 7.5 mg proteina/mL. Uzorci su ispitivani analitičkom hromatografijom isključivanja veličine (aSEC - size exclusion chromatography) i analizom varijante naboja snimljenim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (icIEF - imaged capillary isoelectric focusing) u trenutku = 0. Uzorci su zatim testirani na stres stavljanjem u inkubator na 25 °C tokom 1 nedelje a zatim na 40 °C tokom 5 nedelja. Alikvoti su povučeni i ispitivani sa icIEF i aSEC u raznim vremenskim tačkama S tokom sledećih 4 do 5 nedelja kada su povučeni i dalje ispitivali sa aSEC i icIEF kako bi se pratila stabilnost.

aSEC

[0469] Hromatografija isključivanja veličine (aSEC - size exclusion chromatography) je izvedena korišćenjem Agilent 1100 HPLC sistema (Agilent Technologies, Santa Klara, CA USA) na Zenix-C 300 SEC koloni (Sepax Technologies, Newark, DE USA) sa dimenzijom od 300 x 4.6 mm. Koriščena mobilna faza bila je 200 mM kalijum fosfat i 150 mM natrijum hlorid podešena na pH 6.9, pri brzini protoka od 0.35 mL/min. Približno 20 µg uzorka je ubrizgano za svaku analizu. Separacija je praćena na UV 280 nm. Kvantifikacija monomera u odnosu na HMW vrste je izvedena integracijom površine ispod krive pri vremenu zadržavanja odgovarajućem za svaku vrstu.

icIEF

[0470] Deamidacija je otkrivena analizom varijante naboja (deamidacija povećava neto negativni naboj proteina i stvaranje kiselih varijanti) sprovedenom snimljenim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (icIEF), koje je izvedeno na iCE280 instrumentu (ProteinSimple, Santa Clara, CA USA) korišćenjem kapilare presvučene fluorougljenikom, 100 µm x 50 mm. Uzorak je razblažen do 0.3 mg/ml rastvorom koji sadrži 0.35% metil celuloze, 4% pH3-10 Pharmalytes, 4M uree, i 2% pI markera. Anolit i katolit su 0.08 M fosforna kiselina i 0.1 M natrijum hidroksid, redom. Fokusiranje je postignuto primenom 1.5 kV tokom 2 min a zatim 3.0 kV tokom 11 min. Kvantifikacija (-) naelektrisanih modifikovanih vrsta u odnosu na matične vrste izvršena je integracijom odgovarajuće površine ispod krive.

Rezultati

[0471] Biofizička svojstva pegilovanog jedinjenja 2 pokazala su superiornost nad pegilovanim jedinjenjem 1. Tokom 5 nedelja nije primećena degradacija na 2-8°C zajedno sa malim brzinama degradacije primećenim pod ubrzanim uslovima na 40°C u odnosu na pegilovano jedinjenje 1 (sl.

5). Osmonedeljne ubrzane studije ukazuju na to da je pegilovano jedinjenje 2 superiornije od pegilovanog jedinjenja 1 u ispitivanoj formulaciji (histidin/saharoza pH 7.0). Pod ovim uslovima ekscipijenta, deamidacija se ukida i pegilovano jedinjenje 2 ima smanjenu sklonost ka formiranju rastvorljivih agregata visoke molekulske mase (HMW - high molecular weight). Ovi rezultati ukazuju na to da pegilovano jedinjenje 2 ima širi pH opseg za mogućnosti formulacije sa smanjenim sklonostima agregaciji u odnosu na pegilovano jedinjenje 1.

[0472] Takođe je procenjeno formiranje HMW agregata. Niže formiranje HMW agregata pri datoj koncentraciji ukazuje na veću rastvorljivost, što bi rezultiralo sposobnošću da se formulišu u većoj koncentraciji. Sl. 6 ilustruje formiranje HMW agregata za nekoliko modifikovanih FGF-21 polipeptida i jedinjenja 1. Za većinu testiranih jedinjenja, formiranje agregata je smanjeno u odnosu na pegilovano jedinjenje 1 (npr. pegilovano jedinjenje 2 i pegilovano jedinjenje 10). Za nekoliko jedinjenja, formiranje HMW agregata bilo je slično ili veće nego za pegilovano jedinjenje 1.

[0473] Takođe je procenjena deamidacija. Sl.7 ilustruje detektovani nivo deamidacije (naznačen formiranjem kiselih varijanti tokom vremena) za nekoliko modifikovanih FGF-21 polipeptida i pegilovano jedinjenje 1. Za sve prikazane modifikovane FGF-21 polipeptide, otkriveni nivo deamidacije je smanjen u odnosu na pegilovano jedinjenje 1.

Primer 8

Procena rastvorljivosti modifikovanih FGF-21 polipeptida

[0474] Ovaj primer opisuje merenje relativne rastvorljivosti modifikovanih FGF-21 polipeptida. Rezultati ukazuju na sposobnost jedinjenja da se formuliše do relativno veće koncentracije, što bi omogućilo laganije administranje efikasne doze.

Metode

[0475] Procene relativne rastvorljivosti izvedene su sekvencijalnim koncentracionim ciklusima sa protočnim čepom praćene analizom hromatografije isključivanja veličine. Uzorci, formulisani u PBS pH 7.2 pri sličnim ali ne identičnim početnim koncentracijama, pipetirani su u „cut-off“ centifugalne koncentratore za molekulske težine od 3 kDa i zavrteni pri 4.750 ob/min u ciklusima od 10 minuta, 15 minuta, i 30 minuta na 4°C. Između ciklusa centrifugiranja, alikvoti su uklonjeni iz aparata za koncentraciju i izvršena je analitička analiza hromatografije isključivanje veličine (aSEC) (na GE Healthcare Superdex S-7510/300 GL koloni uravnoteženoj u PBS pH 7.2 puferu) da bi se utvrdila koncentracija HMW i vrste monomera u rastvoru.

[0476] Ukupne koncentracije određene su apsorbancijom na 280nm pomoću NanoDrop spektrofotometra. Procenat velike molekulske mase određen je površinom ispod izračunavanja krive pikova visoke molekulske mase u odnosu na pikove monomera u tragu SEC hromatograma. Dobijene tačke podataka su ucrtane kako bi se vizuelizovao redosled rangiranja najmanje rastvorljivih konstrukcija do najviše rastvorljivih u testiranim uslovima, što je niži nagib stvoren tačkama podataka to je stabilnija varijanta proteina pod ispitanim uslovima.

Rezultati

[0477] Relativna rastvorljivost modifikovanih FGF-21 polipeptida određena je merenjem formiranja agregata visoke molekulske mase (HMW) u zavisnosti od koncentracije proteina. Niže formiranje HMW agregata pri datoj koncentraciji ukazuje na veću rastvorljivost, što bi rezultovalo sposobnošću da se formulišu u većoj koncentraciji.

[0478] Nagib krive rastvorljivosti u modelu sa protočnim čepom za ispitivana jedinjenja prikazan je ispod u tabeli 7 (niže vrednosti ukazuju na manje formiranje agregata a time i na sposobnost formiranja do veće koncentracije). Relativno niski nivoi formiranja agregata primećeni su za nekoliko jedinjenja (npr. jedinjenje 2 i jedinjenje 10), što ukazuje na niže formiranje agregata i veću rastvorljivost (Sl.8 i tabela 7). Najveći nagib rastvorljivosti u modelu sa protočnim čepom primećen je za jedinjenje 1.

Tabela 7. Rezultati rastvorljivosti u modelu sa protočnim čepom za modifikovane FGF-21 polipeptide.

Je

Jed

Primer 9

Ispitivanje imunogenosti FGF-21 delecionih molekula

[0479] Izvršene su studije odgovora na aktivaciju T-ćelija, i koje ukazuju na sekvencu proteina koriščenu u većini jedinjenja koja predstavljaju ekvivalentan odgovor na sekvencu proteina korišćenu u pegilovanom jedinjenju 1.

Metode

[0480] Imunogenost je procenjena testom proliferacije CD4+ T ćelija. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC - peripheral blood mononuclear cell ) iz različitih grupa davalaca ljudske krvi izolovane su pomoću Ficoll gradijenta. Donori su HLA tipizirani kako bi se osigurala pokrivenost varijabilnosti u MHC klasi II alela prisutne u ljudskoj populaciji. Nakon obeležavanja, PBMC sa karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE) su postavljeni u format sa 96 bunarića pri 200,000 ćelija po bunariću u standardni medijum za ćelijske kulture u prisustvu testiranog jedinjenja tokom 7 dana. Proliferacija CD4+ T ćelija je analizirana obeležavanjem anti CD4 antitelom i protočnom citometrijom. Procenat antigenosti proteina izračunava se kao procenat donora koji pokazuju značajan odgovor na proliferaciju CD4+ T ćelija u odnosu na kontrolu sa medijom.

Rezultati

[0481] U proceni rizika in vitro imunogenosti korišćenjem testa proliferacije humanih T ćelija 13 od 40 donora (32.5%) pokazalo je CD4+ proliferativni odgovor nakon 7 dana izlaganja jedinjenju 2 u poređenju sa 15 od 40 donora koji su pokazali pozitivan signal iz jedinjenja 1 (koji ima FGF-21sekvencu divljeg tipa osim što je N-terminalni metionin uključen za ekspresiju u E. coli) (Sl.9). Iako ovaj eksperiment zasnovan na ćelijama ne zamenjuje zapažanja realnog humanog imunološkog odgovora ova analiza sugeriše da ne postoji povećani rizik za humanu imunogenost za jedinjenje 2 u poređenju sa divljim tipom FGF21.

[0482] Dalje modifikovani FGF-21 polipeptidi su testirani u testu proliferacije CD4+ u odnosu na jedinjenje 1 (sl. 9). Imunogenost je generalno bila slična onoj koja je primećena za kontrolnu FGF21 sekvencu (jedinjenje 1), sa izuzetkom jedinjenja 10 koje je pokazalo relativno veći imunološki odgovor, što ukazuje da jedinjenje može biti nepoželjno imunogeno ako se administrira ljudskim pacijentima.

Primer 10

In vivo stabilnost C-terminalno intaktnih (aktivnih) modifikovanih FGF-21 polipeptida [0483] Ova studija je procenila nivo C-terminalno intaktnih (tj., aktivnih) modifikovanih FGF-21 polipeptida in vivo. Pegilovano jedinjenje 2 je pokazalo znatno povećan udeo C-terminalno intaktnog, aktivnog polipeptida u poređenju sa pegilovanim jedinjenjem 1, uključujući veće trajanje in vivo aktivnosti.

Metode

[0484] Farmakokinetika pegilovanog jedinjenja 2 i pegilovanog jedinjenja 1 procenjena je kod Cinomolgus majmuna nakon subkutane (SC) doze od 0.25 mg/kg, odnosno 0.225 mg/kg. Uzorci krvi (0.2 ml) sakupljani su na 0, 0.25, 0.5, 1, 3, 7, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h nakon administriranja leka i čuvani na - 80° C do bioanalize.

[0485] PK parametri ukupnog i C-terminalnog intaktnog pegilovanog jedinjenja 1 i pegilovanog jedinjenja 2 dobijeni su nekompartmentalnom analizom podataka o koncentraciji u serumu ili plazmi u odnosu na vreme (Phoenik ™ WinNonlin®, 6.3, Pharsight Corporation, St. Louis, MO). Površina ispod krive od nultog vremena do beskonačnosti [AUC(tot)] izračunata je korišćenjem kombinacije linearnih i log trapezoidnih sumacija. Procene AUC i poluživota (t 1/2) su napravljene korišćenjem najmanje 3 vremenske tačke sa merljivim koncentracijama.

[0486] Koncentracije ukupnog pegilovanog jedinjenja 1 u PK studijama sa jednom dozom izmerene su korišćenjem nevalidiranog, Meso Scale Discovery (MSD)-zasnovanog elektrohemiluminescentnog imunosorbentnog eseja (ECLIA - electrochemiluminescent immunosorbent assay). Za hvatanje pegilovanog jedinjenja 1 korišćeno je PEG-specifično monoklonsko antitelo (mAb), praćeno upotrebom zečjeg anti-FGF21 poliklonskog antitela (pAb) za detekciju ukupnog pegilovanog jedinjenja 1.

[0487] Subkutana (SC) farmakokinetika (PK) pegilovanog jedinjenja 2 i pegilovanog jedinjenja 1 takođe je procenjena na muškim Ob/Ob miševima. Pegilovano jedinjenje 2 je administrirano miševima (n =3/vremenska tačka/put) u obliku pojedinačne SC injekcije od 0.1 mg/kg. Pegilovano jedinjenje 1 je administrirano u obliku pojedinačne SC doze od 0.05 mg/kg. Uzorci krvi su sakupljani u različitim vremenskim tačkama nakon administriranja leka i obrađivani u osnovi kao što je opisano za cinomolgus majmune.

[0488] Očitavanje je izvršeno elektrohemiluminescencijom, izraženo u relativnim svetlosnim jedinicama (RLU), što je proporcionalno količini ukupnog pegilovanog jedinjenja 1 vezanog reagensima za hvatanje i detekciju. Standardne krive su bile između 0.2 i 154 ng/ml. Ispitni uzorci su kvantifikovani pomoću 4-parametarskog logističkog odgovarajućeg regresionog modela sa masenim faktorom 1/Y. Isti esej je korišćen za merenje koncentracija C-terminalnog inknutog pegilovanog jedinjenja 1 u serumu ZDF pacova i cinomolgus majmuna osim zečjeg anti-FGF21 pAb specifičnog za C-terminus pegilovanog jedinjenja 1 koji je korišćen za detekciju. Standardne krive su bile između 0.2 i 154 ng/ml. Test uzorci su kvantifikovana pomoću 4-parametarskog logističkog odgovarajućeg regresionog modela sa masenim faktorom od 1/Y.

Rezultati

[0489] Pegilovano jedinjenje 1 prolazi kroz proteolizu in vivo, tako da tokom vremena većina jedinjenja postaje skraćeni, neaktivni oblik. In vivo proteolitička stabilnost pegilovanih jedinjenja 1 i 2 upoređena je međusobno kod ob/ob miševa (sl. 10) i cinomolgus majmuna (sl. 11). Ovi rezultati pokazuju da se AUC aktivnog C-terminal intaktnog oblika povećala za 7- do 8-puta za modifikovano jedinjenje FGF-21 koje sadrži deleciju (pegilovano jedinjenje 2) u poređenju sa pegilovanim jedinjenjem 1, što ukazuje da je pegilovano jedinjenje 2 povećalo in vivo proteolitičku stabilnost.

Primer 11

Farmakokinetičke studije modifikovanih FGF-21 polipeptida

[0490] Ovaj primer predstavlja rezultate farmakokinetičkih studija korišćenjem modifikovanih FGF-21 polipeptidima kod miševa, pacova, i cinomolgus majmuna (videti tabelu 8, ispod).

[0491] Ukratko, klirens pegilovanog jedinjenja 2 bio je nizak kod miševa, pacova, i majmuna (raspon: 0.94 – 2.6 ml/h/kg). Zapremina raspodele (Vss), na ~ 0.04 – 0.05 l kg, bila je blizu zapremine plazme i ukazivala je na minimalnu distribuciju u ekstravaskularni prostor. Subkutana (SC) bioraspoloživost bila je prihvatljiva kod miševa (40%) i majmuna (58%), dok je bila relativno niska kod pacova (16%). Ova niska SC bioraspoloživost može biti specifična za pacove, jer je primećeno da i drugi PEGilovani molekuli imaju sličan fenomen (niska SC bioraspoloživost kod pacova sa dobrom bioraspoloživošću kod miševa, majmuna, i ljudi). Još važnije, SC bioraspoloživost za pegilovano jedinjenje 2 kod ovih vrsta (uključujući pacove) bila je 2 – 3.4 puta veća u odnosu na pegilovano jedinjenje 1.

[0492] Nakon SC administriranja pegilovanog jedinjenja 2 miševima, pacovima, i majmunima, došlo je do konstantnog (7-8 puta) povećanja izloženosti normalizovane dozom (AUC) intaktnog proteina, u odnosu na pegilovano jedinjenje 1. Povećana izloženost intaktnog pegilovanog jedinjenja 2 nakon subkutane administracije može se pripisati nižem sistemskom klirensu (2 - 5 puta) zajedno sa poboljšanjem (2 – 3.4 puta) u subkutanoj bioraspoloživosti kod sve tri vrste u odnosu na pegilovano jedinjenje 1.

[0493] Ukupno pegilovano jedinjenje 2, sastavljeno od mešavine proteolitičkih fragmenata i intakntog pegilovanog jedinjenja 2, takođe je izmereno u ovim farmakokinetičkim studijama. Odnos AUC intaktnog pegilovanog jedinjenja 2 u odnosu na ukupno pegilovano jedinjenje 2 kod miševa i pacova bio je blizu 1 posle IV administracije ukazujući na minimalnu sistemsku proteolizu. Međutim, nakon SC administracije, odnos je bio 0.6 – 0.86 kod ovih vrsta ukazujući na određenu proteolizu na SC mestu. Sličan trend primećen je kod majmuna gde je AUC odnos intaktnog pegilovanog jedinjenja 2 u odnosu na ukupno pegilovano jedinjenje 2 bio umereno niži posle SC administriranja u poređenju sa IV (0.7 posle SC u odnosu na 0.8 nakon IV doziranja).

[0494] Sve u svemu, pegilovano jedinjenje 2 pokazalo je povoljna in vitro i in vivo farmakokinetička svojstva uključujući povećanu bioraspoloživost, opadajući klirens i povećanu AUC (površina ispod krive koncentracije u plazmi-vreme).

Tabela 8. IV & SC farmakokinetika intaktnog modifikovanog FGF-21 proteina kod miševa, pacova, i majmuna.

[0495] Skraćenice: CL: Prividni ukupni telesni klirens leka iz plazme; Vss: Prividni volumen raspodele u stabilnom stanju; MRT: srednje vreme boravka; SC BA: subkutana bioraspoloživost; SC AUC: subkutana površina ispod krive koncentracije u plazmi-vreme.

] Primer 12

In vivo studija ponovljenog doziranja modifikovanih FGF-21 polipeptida u mišjem modelu dijabetesa

[0496] Pegilovano jedinjenje 2 and Pegilovano jedinjenje 1 su procenjeni međusobno u 21-dnevnoj studiji ponovljenog doziranja. Rezultati pokazuju da iako su oba jedinjenja bila efikasna za ublažavanje metaboličkih simptoma, duži poluživot aktivnog pegilovanog jedinjenja 2 in vivo rezultirao je većim terapijskim efektima, naročito pri upoređivanju efekata nedeljnog doziranja.

Metode

[0497] Muški ob/ob miševi (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) su na početku studije bili starosti 8 nedelja. Miševi su randomizirani u grupe za tretiranje na osnovu telesne mase i nivoa glukoze. Sve grupe su tretirane subkutanom (s.c.) administracijom rastvora za doziranje od 1 ml/kg. Tretirane grupe su bile sledeće: 1) transporter (250 mM saharoza/20 mM Tris, pH 8.3) dva puta nedeljno (BIW), 2) pegilovano jedinjenje 1, 0.15 mg kg BIW, 3) pegilovano jedinjenje 2, 0.15 mg/kg BIW, 4) pegilovano jedinjenje 1, 0.3 mg/kg jednom nedeljno (QW), ili 5) pegilovano jedinjenje 2, 0.3 mg/kg QW. Miševima kojima je jedinjenje administrirano samo jednom nedeljno administriran je transporter u danima kada su je BIW grupama administrirana druga nedeljna injekcija jedinjenja. Telesna masa, glukoza u plazmi, trigliceridi (Olympus-ov klinički hemijski analizator, AU680), i insulin (ELISA, Mercodia Inc.) određivani su tokom 21-dnevnog perioda doziranja u stanju hranjenja. Glikovani hemoglobin (HbA1c) određen je u punoj krvi na početku i završetku studije, takođe pomoću Olympus analizatora.

Rezultati

[0498] I pegilovano jedinjenje 1 i pegilovano jedinjenje 2 administrirano je subkutano primenom doze od 0.15 mg/kg dva puta nedeljno (BIW) i 0.3 mg/kg QW. Koncentracije u plazmi izmerene pri minimumu 21. dana pokazuju da je izloženost ukupnom (intaktnom i proteolizovanom) FGF21 bila slična za obe varijante, ali je izloženost aktivnog, C-terminalnog intaktnog pegilovanog jedinjenja 2 bila 12- do 25-puta veća od one od pegilovanog jedinjenja 1 nakon QW ili BIW administracije, redom (tabela 9).

[0499] Tabela 9: Izloženost C-terminalnog intaktnog pegilovanog jedinjenja 1 i pegilovanog jedinjenja 2 pri minimumu nakon 21 dana ponovljenog doziranja kod ob/ob miševa (srednja vrednost ± s.e.m.)

[0500] * Projektovano na osnovu farmakokinetičkih podataka za jednu dozu kod ob/ob miševa [0501] Glikoziliorani hemoglobin (HbA1c) generiše se in vivo iz neenzimatskog dodavanja glukoze specifičnim aminokiselinama unutar ovog proteina, a izmereni procenat HbAlc odgovara prosečnoj glukozi u krvi integrisanoj tokom života cirkulišućih eritrocita. Vrednost HbAlc veća od 6.5% je dijagnostički kriterijum za dijabetes. Promene HbAlc korigovane transporterom 21 dana ponovljene studije doziranja prikazane su na Sl. 12. BIW administriranje 0.15 mg/kg bilo kog FGF21 polipeptida normalizovalo je HbAlc na vrednosti manje od 5% nakon 21 dana administriranja. Međutim, samo pegilovano jedinjenje 2 je statistički značajno smanjilo ΔHbA1c u odnosu na transporter sa QW administracijom 0.3 mg/kg, u skladu sa značajnim povećanjem funkcionalne izloženosti aktivnom C-terminalnom intaktnom proteinu. Ovi rezultati pokazuju da održavanje ciljne minimalne koncentracije (Ctrough) može biti dovoljno za efikasnost (Tabela 9).

[0502] U skladu sa smanjenim HbAlc rezultatima, nivoi glukoze u plazmi takođe su značajno smanjeni tokom studije (sve grupe p <0.01 za dane od 2 do 21 naspram transportera osim QW doza 14. dana, za koje je pegilovano jedinjenje 2 postiglo statističku značajnost (p<0.05) i pegilovano jedinjenje 1 nije bilo značajno) (Sl. 16). Sve u svemu, promena u AUC glukoze (procentualna razlika u odnosu na transporter) značajno je smanjena svim tretmanima tokom studije (p<0.001 u odnosu na transporter) (Sl.17).

[0503] Pored toga, nivoi triglicerida u plazmi su značajno smanjeni u grupi pegilovanog jedinjenja 2 u odnosu na transporter, 2. i 4. dana za BIW grupu (p <0.01) i 2, 4. i 10. i 17. dana za QW grupu (p <0.01 ), kao i dana 2. i 17. dana za pegilovano jedinjenje 1 QW grupe (p<0.05) (Sl.18).

[0504] Pegilovano jedinjenje 2 značajno je smanjilo procenat povećanja telesne mase u odnosu na transporter ili pegilovano jedinjenje 1 tokom cele 21-dnevne studije na ob/ob miševima (Sl.13 i sl. 14). QW administriranje 0.3 mg/kg pegilovanog jedinjenja 2 pokazuje smanjenu efikasnost 7, 14. i 21. dana kada je telesna masa izmerena pri minimumu, što opet ukazuje da održavanje ciljne minimalne koncentracije (Ctrough) može biti dovoljno za efikasnost.

[0505] BIW administriranje 0.15 mg/kg pegilovanog jedinjenja 2 statistički je značajno smanjilo nivo insulina u plazmi tokom 21-dnevne ponovljene studije doziranja na ob/ob miševima (sl.15); BIW pegilovano jedinjenje 1 nije uspelo da značajno smanji insulin u plazmi nakon 10. dana. QW administracija 0.3 mg/kg pegilovanog jedinjenja 2 dala je očigledan "testerasti" profil sa trendom premašivanja vrednosti u grupi transportera 14. i 21. dana kada je meren insulin pri minimumu jedinjenja. Ovaj obrazac sugeriše da pegilovano jedinjenje 2 može da sačuva sadržaj insulina u pankreasu hroničnim doziranjem.

[0506] Ovi rezultati pokazuju da je održavanje najniže koncentracije od 175 ng/ml (tabela 9) za pegilovano jedinjenje 2 u BIW delu pri 0.15 mg/kg BIW rezultovalo značajnim poboljšanjima u merilima glikemije i promenama telesne mase.

[0507] U odnosu na pegilovano jedinjenje 1, povećana izloženost aktivnom C-terminalnom intaktnom pegilovanom jedinjenju 2 u modelu ob/ob miša rezultovala je pojačanom in vivo potencijom na osnovu doze i produženim trajanjem delovanja sa QW administracijom što je dovelo do superiornih smanjenja HbA1c, povećanja telesne mase, i insulina u plazmi.

Primer 13

[0508] Progresija iz masne jetre u bezalkoholni steatohepatitis (NASH - nonalcoholic steatohepatitis) može na kraju rezultovati fibrozom jetre. Ovaj primer opisuje primenu FGF-21 polipeptida koji sadrži humani FGF-21 polipeptid modifikovan da sadrži supstituciju para-acetil-L-fenilalanina za glutamin na položaju 108 i povezanim sa 30 kDa poli(etilen glikol) (pegilovanim jedinjenjem 1 ili "PEG-jedinjenjem 1," SEQ ID NO:201) u modelu fibroze. Tačnije, PEG-jedinjenje 1 je testirano u modelu sa 2 pogotka Stelic Instituta za NASH, u kojem su C57BL6 miševi lečeni streptozotocinom ubrzo nakon rođenja da bi indukovali dijabetes, a zatim su stavljeni na ishranu sa visokim sadržajem masti u starosti od 4 nedelje. Ovi miševi razvijaju masnu jetru (5-nedelje), NASH (7-nedelja), fibrozu jetre (9-nedelja), i na kraju hepatocelularni karcinom (16 nedelja) tokom reproduktivnog vremenskog toka. PEG-jedinjenje 1 sprečilo je ili efikasno preokrenulo razvoj NASH u Stelic modelu kada su miševi tretirani u dobi od 5- do 9- nedelja (preventivni model) ili dobi od 7- do 9- nedelja (terapijski model). PEG-jedinjenje 1 je takođe smanjio fibrozu jetre u 9-nedeljnom vremenskom periodu u ovoj studiji.

[0509] Sekvenca PEG-Jedinjenja 1 je kao što sledi:

MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKAL KPGVI QILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPG NKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS

(SEQ ID NO: 201), gde je pAF vezan za 30 kDa PEG.

Materijali i metode

[0510] C57BL/6 miševi (15-dana-trudne ženke) su dobijeni od Charles River Laboratories Japan, Inc. (Kanagava, Japan). Sve životinje korišćene u studiji bile su smeštene i zbrinute u skladu sa smernice Japanskog farmakološkog društva za upotrebu na životinjama.

[0511] Životinje su držane u SPF objektu u kontrolisanim uslovima temperature (23 ± 2°C), vlažnosti (45 ± 10%), osvetljenja (12-časovni ciklusi veštačkog svetla i mraka; svetlo od 8:00 do 20:00) i razmene vazduha. U eksperimentalnoj sobi održan je visok pritisak (20 ± 4 Pa) kako bi se sprečilo zagađenje objekta. Životinje su bile smeštene u polikarbonatnim kavezima KN-600 (Natsume Seisakusho, Japan) sa najviše 4 miša po kavezu. Sterilizovani PULMASµ (Material Research Center, Japan) korišćen je za smeštaj i zamenjivan jednom nedeljno.

[0512] Ishrana sa visokim sadržajem čvrste sterilisane masti (HFD) obezbeđena je ad libitum, koja je smeštena u metalni poklopac na vrhu kaveza. Čista voda je obezbeđena ad libitum iz bočice za vodu opremljene gumenim čepom i cevčicom. Boce sa vodom zamenjene su jednom nedeljno, očišćene i sterilisane u autoklavu i ponovo upotrebljene.

[0513] NASH je indukovan u 40 muških miševa pojedinačnom subkutanom injekcijom od 200 µg rastvora streptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich Co. LLC., SAD) 2 dana nakon rođenja i koji su hranjeni sa ishranom sa visokim sadržajem masti (HFD, 57 kcal% fat, cat#: HFD32, CLEA Japan, Inc., Japan) nakon 4 nedelje starosti ("STAM miševi"). Utrošak hrane je meren svakodnevno u toku nedelje tokom perioda tretmana.

[0514] PEG-Jedinjenje 1 i transporter (20 mM Tris/250 mM saharoza, pH 8.3) su administrirani subkutanim putem u zapremini od 1 mL/kg. PEG-Jedinjenje 1 je administrirano pri dozama od 1 i 3 mg/kg dvaput nedeljno.

[0515] Glukoza u krvi u nahranjenom stanju izmerena je u punoj krvi pomoću LIFE CHECK (EIDIA Co. Ltd., Japan). Za biohemiju plazme, krv je sakupljana u polipropilenskim epruvetama sa antikoagulantom (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japan) i centrifugirana na 1,000xg tokom 15 minuta na 4°C. Supernatant je sakupljen i čuvan na -80°C do upotrebe. Alanin aminotransferaza u plazmi (ALT), trigliceridi i nivoi ukupnog holesterola izmereni su pomoću FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation, Japan).

[0516] Ekstrakti ukupnih lipida u jetri su dobijeni Folch-ovom metodom (Folch J. I sar., J. Biol. Chem. 1957;226: 497). Uzorci jetre su homogenizovani u hloroform-metanolu (2:1, v/v) i inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja sa hloroform-metanol-vodom (8:4:3, v/v/v), ekstrakti su upareni do suva, i rastvoreni u izopropanolu. Sadržaj triglicerida u jetri i holesterola su izmereni E-testom za trigliceride, odnosno E-testom za holesterol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan).

[0517] Za bojenje hematoksilinom i eozinom (HE), isečci su isečeni od parafinskih blokova jetrenog tkiva prefiksiranih u Bouin-ovom rastvoru i obojeni sa Lillie-Mayer hematoksilinom (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japan) i rastvorom eozina (Wako Pure Chemical Industries). Ocena aktivnosti (NAS) bolesti nealkoholne masne jetre (NAFLD - nonalcoholic fatty liver disease) izračunata je prema kriterijumima Kleiner-a (Kleiner DE. i sar., Hepatology, 2005;41: 1313). Da bi se vizuelizovale makro- i mikrovezikularne masti, isčci krioze iz zamrznutog tkiva jetre, prefiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu, ugrađenom u Tissue-Tek O.C.T. jedinjenje (Sakura Finetek Japan Co. Ltd., Japan) i obojeni sa Oil Red O (Sigma-Aldrich). Za imunohistohemiju, isečeni su isečeni iz smrznutih tkiva jetre ugrađenih u Tissue-Tek O.C.T. jedinjenje i fiksiranih u acetonu. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana upotrebom 0.03% H2O2 tokom 5 minuta, praćeno inkubacijom sa Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Japan) tokom 10 minuta. Isečci su inkubirani sa 200-puta razblaženim snti-F4/80 antitelom (BMA Biomedicals, Švajcarska) tokom noći na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije sa sekundarnim antitelom (HRP-kozje anti-pacovsko antitelo, Invitrogen, SAD), izvršene su enzimsupstrat reakcije korišćenjem rastvora 3,3'-diaminobenzidin/H2O2 (Nichirei Bioscience Inc., Japan).

[0518] Za kvantitativnu analizu fibroze, taloženja masti i oblasti inflamacije, slike sa svetlim poljem Sirius crveno-obojenih, oil red-obojenih i F4/80-imunoobojenih isečaka su zabeležene oko centralne vene korišćenjem digitalne kamere. (DFC280; Leica, Nemačka) pri uvećanju od-200 puta, a pozitivne oblasti u 5 polja/isečka su izmerena korišćenjem ImageJ softvera (National Institute of Health, SAD).

[0519] Za kvantitativnu PCR, ukupna RNK je ekstrahovana iz uzoraka jetre korišćenjem RNAiso (Takara Bio Inc., Japan) prema instrukcijama proizvođača. Jedan µg RNK RNK je reverznotranskribovan, korišćenjem reakcione smeše koja sadrži 4.4 mM MgC12 (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Švajcarska), 40 U RNaze inhibitora (Toyobo Co., Ltd., Japan), 0.5 mM dNTP (Promega Corporation, SAD), 6.28 µM nasumičnog heksamera (Promega Corporation), 5 x first strand pufera (Promega), 10 mM ditiotreitola (Invitrogen) i 200 U MMLV-RT (Invitrogen) u konačnoj zapremini od 2 µL. Reakcija je izvedena tokom 1 sata na 37°C, zatim 5 minuta na 99°C. PCR u realnom vremenu je izvršena korišćenjem PCR DICE u realnom vremenu i SYBR premix Taq (Takara Bio). Kako bi se izračunao relativni mRNK nivo ekspresije, ekspresija svakog gena je normalizovana onoj od referentnog gena 36B4 (simbol gena: Rp1p0). Sekvence PCR-prajmera su bile kao što sledi: 36B4: napred (forward) 5'-TTCCAGGCTTTGGGCATCA-3'; obrnuta (reverse) 5'-ATGTTCAGCATGTTCAGCAGTGTG-3'; Alpha-SMA: napred 5'-AAGAGCATCCGACACTGCTGAC-3'; obrnuta 5'-AGCACAGCCTGAATAGCCACATAC-3'; TIMP-1: napred 5'-TGAGCCCTGCTCAGCAAAGA-3'; obrnuta 5'-GAGGACCTGATCCGTCCACAA-3'; Kolagen tip 1: napred 5'-CCAACAAGCATGTCTGGTTAGGAG-3'; obrnuta 5'-GCAATGCTGTTCTTGCAGTGGTA-3'; TGF-beta: MA030397 napred 5'-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3'; obrnuta 5'-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3'. Identiteti gena su kao što sledi: 36B4 : Ribozomski protein, veliki, P0, Alfa-SMA: mišićni aktin, alfa 2, glatki mišić, aorta (Acta2), Timp-1: inhibitor metaloproteinaze 1 mišićnog tkiva (Timp1), varijanta transkripta 1, Kolagen tip 1: mišićni kolagen, tip I, alfa 2 (Col1a2), TGF-beta: transformišući faktor rasta beta.

Za period tretmana od 5-9 nedelja, statističke analize su izvedene pomoću

[0520] Bonferroni testa višestrukog upoređivanja pomoću GraphPad Prism 4 (GraphPad Software Inc., SAD). Za tretman lečenja od 7-9 nedelja, statističke analize su izvedene pomoću Studentovog t-testa pomoću GraphPad Prism 4. P vrednosti < 0.05 su smatrane statistički značajnim. Trend ili tendencija ka statističkoj značajnosti je identifikovana kada je jednostrani t-test vratio P vrednosti <0.10. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD).

[0521] Svaka ispitivana grupa sadržala je 8 STAM miševa tretiranih subkutano sa ili transporterom ili PEG-jedinjenjem 1 u zapremini od 1 ml/kg dva puta nedeljno. Životinje su žrtvovane u 9 nedelji. Studijske grupe su bile kao što sledi:

Grupa 1: Transporter. Osam NASH miševa je subkutano administrirano transporterom u količini od 1 ml/kg dva puta nedeljno od 5 do 9 nedelje starosti.

Grupa 2: PEG-jedinjenje 1-niska doza. Osam NASH miševa je subkutano administrirano transporterom obogaćenim sa PEG-jedinjenjem 1 u dozi od 1 mg/kg dva puta nedeljno od 5 do 9 nedelja starosti.

Grupa 3: PEG-jedinjenje 1-visoka doza. Osam NASH miševa je subkutano administrirano transporterom obogaćenim sa PEG-jedinjenjem 1 u dozi od 3 mg/kg dva puta nedeljno od 5 do 9 nedelja starosti.

Grupa 4: Transporter. Osam NASH miševa je subkutano administrirano transporterom u zapremini od 1 ml/kg dva puta po nedelja od 7 do 9 nedelja starosti.

Grupa 5: PEG-jedinjenje 1-visoka doza. Osam NASH miševa je subkutano administrirano transporterom obogaćenim sa PEG-Jedinjenjem 1 u dozi od 3 mg/kg dva puta nedeljno od 7 do 9 nedelja starosti.

[0522] Izvodljivost, klinički znaci i ponašanje su praćeni svakodnevno. Pre tretmana zabeležena je telesna masa. Miševi su posmatrani radi značajnih kliničkih znakova toksičnosti, smrtnosti i mortaliteta približno 60 minuta nakon svakog administriranja. Na kraju studije, životinje su žrtvovane eksanguinacijom direktnom srčanom punkcijom pod etarskom anestezijom (Wako Pure Chemical Industries).

Rezultati

Promene telesne mase su prikazane na sl.19.

[0523] Tokom perioda tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), telesna masa se postepeno povećavala tokom perioda tretmana. Srednja telesna masa grupe sa niskom dozom PEG-jedinjenja 1 bila je značajno niža od one od grupe sa transporterom 11, 13, 15, 16, 18, 19, 20. dana i od 22.

do 28. dana. Srednja telesna masa grupe sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 bila je značajno niža od one sa transporterom od 10. do 28. dana. Nijedna životinja nije pokazala pogoršanje opšteg stanja.

[0524] Tokom perioda tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5) telesna masa se postepeno povećavala tokom perioda tretmana. Srednja telesna masa grupe sa visokom dozom PEG-jedinjenje 1 bila je značajno niža od one od grupe sa transporterom 5, 6, 9 dana i od 11. do 14. dana. Nijedna životinja nije pokazala pogoršanje opšteg stanja.

Ukupna potrošnja hrane prikazana je na sl.20.

[0525] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), nije bilo značajnih razlika u ukupnoj potrošnji hrane između grupe sa transporterom i grupa za tretman PEG-jedinjenjem 1 (transporter: 130 ± 4 g/miša, PEG-jedinjenje 1-niska: 130 ± 3 g/miša, PEG-jedinjenje 1-visoka: 131 ± 3 g/mišu).

[0526] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), ukupna potrošnja hrane je imala tendenciju rasta u grupi sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 62 ± 3 g/mišu, PEG-jedinjenje 1 -visoka: 68 ± 2 g/mišu).

[0527] Telesna masa u vreme žrtvovanja prikazana je na sl.21 i tabeli 10.

[0528] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), u vreme žrtvovanja grupe za tretman PEG-jedinjenjem 1 su pokazale značajno smanjenje srednje telesne mase u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 21.7 ± 1.4 g, PEG-jedinjenje 1-niska: 19.5 ± 1.4 g, PEG-jedinjenje 1-visoka: 18.9 ± 1.6 g).

[0529] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), u vreme žrtvovanja grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje srednje telesne mase u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 21.5 ± 1.4 g, PEG-jedinjenje 1-visoka: 19.8 ± 1.0 g).

[0530] Masa jetre i odnos mase jetre i tela prikazani su na sl.22 i sl.23 i tabeli 10).

[0531] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), grupe za tretman sa PEG-jedinjenjem 1 pokazale su značajno smanjenje srednje mase jetre u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 1511 ± 66 mg, PEG -Jedinjenje 1- niska: 1163 ± 117 mg, PEG-jedinjenje 1-visoka: 970 ± 237 mg). Grupe za tretman sa PEG-jedinjenjem 1 pokazale su značajno smanjenje odnosa srednje mase jetre i tela u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 7.0 ± 0.4%, PEG-jedinjenje 1-niska: 6.0 ± 0.5%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 5.1 ± 0.9%).

[0532] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje srednje mase jetre u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 1364 ± 126 mg, PEG-jedinjenje 1-visoka: 1008 ± 135 mg). Grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje odnosa srednje mase jetre i tela u odnosu na grupu sa transporterom (transporter: 6.4 ± 0.5%, PEG-jedinjenje 1-visoko: 5.1 ± 0.8%).

Tabela 10. Telesna masa i masa jetre

[0533] Glukoza u punoj krvi prikazana je na sl.24 i tabeli 11.

[0534] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje srednje vrednosti glukoze u punoj krvi u poređenju sa grupom sa transporterom. Nivoi glukoze u krvi imali su tendenciju smanjenja u grupi sa niskom dozom PEG-jedinjenjem 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 691 ± 114 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-niska: 566 ± 119 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-visoka: 493 ± 136 mg/dl).

[0535] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje srednje vrednosti glukoze u punoj krvi u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 656 ± 85 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-visoka: 454 ± 104 mg/dl).

[0536] ALT u plazmi je prikazan na sl. 25 i tabeli 11.

[0537] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), nije bilo značajnih razlika u nivoima ALT u plazmi između grupe sa transporterom i grupa za tretman sa PEG-jedinjenjem 1 (transporter: 82 ± 66 U/L, PEG-jedinjenje 1-niska: 64 ± 36 U/L, PEG-jedinjenje 1-visoka: 108 ± 78 U/L).

[0538] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), nivoi ALT u plazmi imaju tendenciju smanjenja u grupi sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 229 ± 285 U/L, PEG-jedinjenje 1-visoka: 36 ± 8 U/L).

[0539] Nivoi triglicerida u plazmi prikazani su na sl.26 i tabeli 11.

[0540] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2 i 3), grupe za lečenje PEG-jedinjenjem 1 pokazale su značajno smanjenje nivoa triglicerida u plazmi u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 322 ± 341 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-niska: 75 ± 39 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-visoka: 64 ± 22 mg/dl).

[0541] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje nivoa triglicerida u plazmi u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 139 ± 39 mg/dl, PEG -jedinjenje 1 -visoka: 59 ± 51 mg/dl).

[0542] Nivoi ukupnog holesterola u plazmi prikazani su na sl.27 i tabeli 11.

[0543] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2 i 3), nivoi ukupnog holesterola u plazmi su se smanjivali u grupi sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 u poređenju sa grupom sa transporterom. Nije bilo značajnih razlika u nivoima ukupnog holesterola u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa nsikom dozom PEG-jedinjenja 1 (transporter: 121 ± 20 mg/dL, PEG-jedinjenje 1-niska: 114 ± 19 mg/dl, PEG-jedinjenje 1-visoka: 98 ± 31 mg/dl).

[0544] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), nije bilo značajnih razlika u nivoima ukupnog holesterola u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 (transporter: 121 ± 19 mg/dl, PEG-jedinjenje 1 -visoka: 115 ± 29 mg/dl).

[0545] Sadržaj triglicerida u jetri prikazan je na sl. 28 i tabeli 11.

[0546] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), grupe za tretman PEG-jedinjenjem 1 pokazale su značajno smanjenje sadržaja triglicerida u jetri u poređenju sa grupom transporterom (transporter: 54 ± 3 mg/g jetra, PEG-jedinjenje 1-niska: 25 ± 7 mg/g jetre, PEG-jedinjenje 1-visoka: 22 ± 9 mg/g jetre).

[0547] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajno smanjenje sadržaja triglicerida u jetri u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 53 ± 11 mg/g jetre, PEG-jedinjenje 1-visoka: 17 ± 6 mg/g jetre).

[0548] Sadržaj holesterola u jetri prikazan je na sl.29 i tabeli 11.

[0549] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), nije bilo značajnih razlika u sadržaju holesterola u jetri između grupe sa transporterom i grupe za tretman PEG-jedinjenjem 1 (transporter: 2.9 ± 0.7 mg/g jetre, PEG-jedinjenje 1-niska: 2.9 ± 0.6 mg/g jetre, PEG-jedinjenje 1-visoka: 3.1 ± 0.4 mg/g jetre).

[0550] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), nije bilo značajnih razlika u sadržaju holesterola u jetri između grupe sa transporterom i grupa za tretman PEG-jedinjenjem 1 (transporter: 3.1 ± 0.8 mg/g jetre, PEG-jedinjenje 1-visoka: 3.6 ± 1.5 mg/g jetre)

Tabela 11. Biohemija krvi i jetre.

Parametar Transporter PEG-jedinjenje PEG-jedinjenje Transporter PEG-jedinjenje (srednja vrednost (tretman 5-9 1-niska (tretman 1-visoka (tretman (tretman 7-9 1-visoka (tretman ± SD) ned) (n=8) 5-9 ned) (n=8) 5-9 ned) (n=8) ned) (n=8) 7-9 ned) (n=8)

Histološke analize: HE bojenje i ocena NAFLD aktivnosti

[0551] Reprezentativne fotomikrografije HE-obojenih isečaka prikazani su na sl. 30A-B, a rezultati ocene NAFLD aktivnosti prikazani su na sl. 31, sl. 32A-C i tabeli 12. (ocena NALFD aktivnosti (Sl. 31) je mešavina ocene steatoze, baloniranja hepatocita, i lobularne inflamacije). Rezultati prikazani u tabeli 12 zasnovani su na kriterijumu bodovanja prikazanim u tabeli 13.

Tabela 12. Ocena NAFLD aktivnosti.

Tabela 13. Definicija NAS komponenti

[0552] Za period tretiranja od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), isečci jetre iz grupe sa transporterom pokazali su ozbiljno taloženje mikro- i makrovezikularne masti, hepatocelularno baloniranje i inflamatornu infiltraciju ćelija. Grupe za tretman PEG-jedinjenjem 1 pokazale su značajna poboljšanja (smanjenja) taloženja masti, hepatocelularnog baloniranja i infiltracije inflamatornih ćelija, uz značajno smanjenje ocene NAFLD activiti (NAS) u poređenju sa grupom sa nosačem (transporter: 5.6 ± 0.7, PEG-jedinjenje 1-niska: 4.0 ± 1.2, PEG-jedinjenje 1-visoka: 2.9 ± 1.2).

[0553] Za period tretiranja od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), grupa sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 pokazala je značajna poboljšanja (smanjenja) taloženja masti, hepatocelularnog baloniranja i infiltracije inflamatornih ćelija, sa značajnim smanjenjem NAS u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 5.6 ± 0.7, PEG-jedinjenje 1-visoka: 2.4 ± 1.3).

Histološke analize: Sirius crveno bojenje

[0554] Rezultati Sirius crveno bojenja prikazani su na sl. 33A-B, sl. 34 (prikazujući reprezentativno bojenje) i tabeli 14.

[0555] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), isečci jetre iz grupe sa transporterom pokazali su taloženje kolagena u pericentralnom regionu lobule jetre. Oblast fibroze (Sirius crveno-pozitivna oblast) značajno se smanjila u grupama za tretman sa PEG-jedinjenjem 1 u poređenju sa grupama sa transporterom (transporter: 1.10 ± 0.24%, PEG-jedinjenje 1-niska: 0.71 ± 0.17%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 0.71 ± 0.19%).

[0556] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), oblasti fibroze se značajno smanjilo u grupi sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 1.25 ± 0.29%, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.75 ± 0.21%).

Histološke analize F4/80 imunohistohemija

[0557] Rezultati F4/80 imunohistohemije su prikazani na sl. 35A-B, sl. (prikazujući reprezentativno bojenje) i tabeli 14.

[0558] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), F4/80 imunobojenje isečaka jetre grupe sa transporterom demonstriralo je akumulaciju F4/80+ ćelije u lobuli jetre. Nije bilo značajnih razlika u broju i veličini F4/80+ ćelija između grupe sa transporterom i grupa za tretman PEG-jedinjenjem 1, kao ni u procentu oblasti inflamacije (F4/80-pozitivna oblast (transporter: 6.9 ± 0.9%, PEG-jedinjenje 1-niska: 7.6 ± 1.5%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 7.1 ± 0.7%).

[0559] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), nije bilo značajnih razlika u broju i veličini F4/80+ ćelija između grupe sa transporterom i grupe za tretman visokom dozom PEG-jedinjenja 1, kao ni u procentu oblasti inflamacije (transporter: 7.1 ± 0.7%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 6.3 ± 1.1%).

Histološka analiza: Oil red bojenje

[0560] Rezultati oil red bojenja su prikazani na sl.37A-B, (prikazujući reprezentativno bojenje), sl. 38 i tabeli 14.

[0561] Za period tretmana od 5-9 nedelja (grupe 1, 2, i 3), isečci jetre iz grupe sa transporterom pokazali su mikro- i makrovezikularno taloženje masti u hepatocitima. Procenat oblasti taloženja masti (oil red-pozitivna oblast) značajno je smanjen u grupama sa tretman PEG-medinjenjem 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 30.4 ± 4.8%, PEG-jedinjenje 1-niska: 20.5 ± 8.8%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 16.2 ± 6.1%).

[0562] Za period tretmana od 7-9 nedelja (grupe 4 i 5), procenat oblasti taloženja masti značajno se smanjio u grupi sa visokom dozom PEG-jedinjenja 1u poređenju sa grupom sa transporterom (transporter: 30.7 ± 5.6%, PEG-jedinjenje 1-visoka: 13.9 ± 7.7%).

Tabela 14. Histološke analize

Analize genskog eksprimiranja

[0563] Rezultati analize genskog eksprimiranja su prikazani na SL. 39A-D i Tabeli 15 za alfa-SMA, TIMP-1, Kolagen tipa 1, i TGF-beta.

[0564] Za period lečenja 5-9. nedelja (grupe 1, 2, i 3), nivoi eksprimiranja za alfa-SMA iRNK su imali tendenciju da se smanje u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka u poređenju sa grupom sa transporterom. Nije bilo značajnih razlika u nivoima eksprimiranja za α-SMA iRNK između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1-niska (Transporter: 1.00 ± 1.14, PEG-Jedinjenje 1-niska: 0.52 ± 0.60, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.39 ± 0.30).

[0565] Za period lečenja 7-9. nedelja (grupe 4 i 5), nije bilo značajnih razlika u nivoima eksprimiranja za α-SMA iRNK između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka (Transporter: 1.00 ± 0.88, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 1.14 ± 1.01).

[0566] Za period lečenja 5-9. nedelja (grupe 1, 2, i 3), nivoi eksprimiranja za TIMP-1 iRNK su imali tendenciju da se smanje u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-niska u poređenju sa grupom sa transporterom. Nije bilo značajnih razlika u nivoima eksprimiranja za TIMP-1 iRNK između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka (Transporter: 1.00 ± 0.39, PEG-Jedinjenje 1-niska: 0.73 ± 0.28, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.88 ± 0.31).

[0567] Za period lečenja 7-9. nedelja (grupe 4 i 5), nivoi eksprimiranja za TIMP-1 iRNK su imali tendenciju da se smanje u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka u poređenju sa grupom sa transporterom (Transporter: 1.00 ± 0.57, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.65 ± 0.34).

[0568] Za period lečenja 5-9. nedelja (grupe 1, 2, i 3), nije bilo značajnih razlika u nivoima eksprimiranja za Kolagen tipa 1 iRNK između grupe sa transporterom i grupe lečene PEG-Jedinjenjem 1 (Transporter: 1.00 ± 0.22, PEG-Jedinjenje 1-niska: 0.88 ± 0.24, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.89 ± 0.34).

[0569] Za period lečenja 7-9. nedelja (grupe 4 i 5), eksprimiranje Kolagen tipa 1 iRNK značajno se smanjilo u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka u poređenju sa grupom sa transporterom (Transporter: 1.00 ± 0.29, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.69 ± 0.20).

[0570] Za period lečenja 5-9. nedelja (grupe 1, 2, i 3), nivoi eksprimiranja za TGF-β iRNK su imali tendenciju da se smanje u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-niska u poređenju sa grupom sa transporterom. Nije bilo značajnih razlika u nivoima eksprimiranja za TGF-β iRNK između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka (Transporter: 1.00 ± 0.24, PEG-Jedinjenje 1-niska: 1.07 ± 0.60, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.90 ± 0.26).

[0571] Za period lečenja 7-9. nedelja (grupe 4 i 5), nivoi eksprimiranja za TGF-β iRNK su imali tendenciju da se smanje u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1-visoka u poređenju sa grupom sa transporterom (Transporter: 1.00 ± 0.45, PEG-Jedinjenje 1-visoka: 0.77 ± 0.22).

Tabala 15. Analize genskog eksprimiranja

[0572] Kao što je iznad uočeno, PEG-Jedinjenje 1 je smanjilo nagomilavanje masti u jetri kao što je procenjeno pomoću biohemijskog eseja merenjem sadržaja triglicerida jetre i histološki nakon bojenja preseka jetre hematoksilinom i eozinom ili Oil red O. Zabeleženo je u literaturi da ova anti-steatotička aktivnost nativnog FGF21 zavisi od adiponektina kod miša (videti Lin i sarad., Cell Metab. 17: 779-789 (2013); Holland i sarad., Cell Metab 17: 790-797 (2013)). Stoga, koncentracije ukupnog adiponektina su merene u terminalnim uzorcima seruma pripremljenim iz lečenih miševa. Serumski adiponektin je izmeren prećenjem proizvođačkog protokola primenom komercijalno dostupnog ELISA kita (Alpco kataloški broj 47-ADPMS-E01).

[0573] Administracija dva puta nedeljno 3 mg/kg PEG-Jedinjenja 1 statistički značajno je povećala serumski ukupni adiponektin, u poređenju sa odgovarajućom grupom sa transporterom, u svim testiranim terminalnim vremenskim tačkama (SL. 61). Ovaj rezultat je u skladu sa hipotezom da adiponektin doprinosi efikasnosti PEG-Jedinjenja 1 u Stelic NASH modelu.

Diskusija

[0574] Ovaj primer je pokazao rezultate eksperimenata kojim je ispitana efikasnost PEG-Jedinjenja 1 i u preventivnom i terapijskom modelu NASH-a. U preventivnom modelu, lečenje je započeto u vreme kada je masna jetra bila očigledna u ovom modelu (počev od 5. nedelje, tj., grupe od 5-9. nedelje). U terapijskom modelu, lečenje je započeto u vreme kada je NASH bio očigledan u ovom modelu (počev od 7. nedelje, tj., grupe od 7-9. nedelje). Tako, terapijska efikasnost PEG-Jedinjenja 1 je demonstrirana i u preventivnom i terapijskom modelu.

[0575] Lečenje PEG-Jedinjenjem 1 značajno je smanjio oblasti fibroze (detektovano pomoću bojenja pomoću Sirijus crvene) u oba modela lečenja, demonstrirajući anti-fibrotički efekat PEG-Jedinjenja 1. Lečenje PEG-Jedinjenjem 1 je takođe smanjilo nivoe eksprimiranja iRNK-a za α-SMA, TIMP-1 i kolagen tipa 1, dalje podržavajući anti-fibrotička svojstva PEG-Jedinjenja 1. Lečenje PEG-Jedinjenjem 1 takođe je izazvašlo statistički značajna smanjenja težine tela i jetre, odnosa težine jetre i tela, glukoze u krvi, triglicerida u plazmi i jetri, rezultata NAFLD aktivnosti, oblasti nagomilavanja masti (detektovano pomoću bojenja sa Oil red).

[0576] Sve grupe lečene PEG-Jedinjenjem 1 su pokazale smanjenje NAS, što je jedna od kliničkih završnih tačaka za procenjivanje aktivnosti NASH-a (Sanyal AJ. i sarad., Hepatology, 2011;54:344).

[0577] Pored toga, lečenje sa PEG-Jedinjenjem 1 je poboljšalo lipidni i glukozni metabolizam što je dokazano smanjenjem nivoa glukoze u punoj krvi, nivoa triglicerida u plazmi i sadržaja triglicerida u jetri.

[0578] U zaključku, PEG-Jedinjenje 1 je prikazalo anti-NASH, anti-fibrotičke efekte koji su u vezi sa poboljšanim lipidnim i glukoznim metabolizmom u predmetnoj studiji.

Primer 14

Procena rastvorljivosti modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže fuzionog partnera [0579] Ovaj primer opisuje merenje relativne rastvorljivosti modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže fuzionog partnera. Rezultati ukazuju na sposobnost Jedinjenja da se formuliše na relativno višu koncentraciju, što bi dozvolilo lakšu administraciju efikasne doze.

Postupci

[0580] Procene relativne rastvorljivosti su sprovedene sekvencijalnim ciklusima koncentracija protočnog čepa (eng. plug-flow) praćeno analizom ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine. Uzorci, formulisani u 20mM Histidinskom puferu pH 7.0 pri sličnim ali ne identičnim polaznim koncentracijama, su pipetirani u centrifugalne koncentratore sa graničnom molekulskom masom 3 kDa i centrifugirani pri 4,750 OPM tokom 15-minutnog, 15-minutnog, i 40-minutnog ciklusa na 4°C. Između ciklusa okretanja, alikvoti su uklonjeni iz aparata za koncentrovanje i analiza analitičkom ekskluzionom hromatografijom po veličini (aSEC) je izvedena (na GE Healthcare Superdex S-7510/300 GL koloni uravnoteženoj u PBS pH 7.2 puferu) da se odredi koncentracija HMW i monomernih vrsta u rastvoru.

[0581] Ukupne koncentracije su određene pomoću apsorbance na 280nm NanoDrop spektrofotometrom. Procenat visokih molekulskih masa je određen pomoću izračunavanja oblasti ispod krive pikova visokih molekulskih masa u odnosu na monomerne pikove u SEC hromatogramskom tragu. Tačke za dobijene podatke su ucrtane grafički da se vizuelizuje redosled redova najmanje rastvorljivih konstrukata do najrastvorljivijih pod testiranim uslovima, što je niži nagib stvoren tačkama podataka, to je stabilnija varijanta proteina pod testiranim uslovima Rezultati

[0582] Relativna rastvorljivost modifikovanih FGF-21 polipeptida koji sadrže fuzijskog partnera je određena merenjem formacije agregata visoke molekulske mase (HMW) kao funkcija koncentracije proteina. Formacija agregata niže HMW pri datoj koncentraciji ukazuje na veću rastvorljivost, što bi rezultiralo sposobnošću da se formuliše na višoj koncentraciji.

[0583] Rezultati su dati grafički na SL. 41. Nagib krive rastvorljivosti u modelu sa protočnim čepom za testirana jedinjenja je prikazan ispod u Tabeli 16 (niže vrednosti ukazuju na manju formaciju agregata i stoga sposobnost za formulisanje na višoj koncentraciji).

Tabela 16. Rezultati rastvorljivosti u modelu sa protočnim čepom za modifikovane FGF-21 polipeptide koji sadrže fuzionog partnera

FGF21- PKE Adnektin(2) fuzijsko Nagib rastvorljivosti u modelu sa

Primer 15 Nasumična, dvostruko slepa, placebo-kontrolisana, sa paralelnom grupom, sa višestrukim dozama studija za procenu bezbednosti, farmakokinetike i farmakodinamičkih efekata PEG-Jedinjenja 1 kod odraslih sa bezalkoholnim steatohepatitisom

[0584] U Sjedinjenim Američkim Državama, NASH je jedan od vodećih uzroka ciroze kod odraslih; do 20% odraslih sa NASH razvije cirozu. Histološki nalazi NASH-a uključuju steatozu, inflamaciju i balonirane degeneracije sa raznim količinama pericelularne fibroze u jetri, i javljaju se u odsustvu značajne primene alkohola. Pacijenti sa NASH ispoljavaju povećane stope smrtnosti od kardiovaskularnih-, smrti u vezi sa jetrom i kancerom. Nisu dostupne posebne mogućnosti medicinskog lečenja.

[0585] Ovaj primer opisuje nasumično, dvostruko-slepo i placebo-kontrolisano kliničko ispitivanje na ljudima za procenu bezbednosti, farmakokinetike i farmakodinamičkih efekata PEG-Jedinjenja 1 (polipeptid sa SEQ ID NO: 201, pri čemu je pAF povezan sa PEG od 30 kDa) kod odraslih sa NASH, uključujući procenu stabilnosti, tolerancije i promene u frakciji masti u jetri (%) pomoću MRI.

[0586] Populacija studije: Uključeno je približno 90 muškaraca i žena u dobi od 21 do 75 godina koji zadovoljavaju sve sledeće kriterijume: biopsija jetre izvedena unutar 1 godine od skrininga sa dokumentovanim rezultatima NASH-a sa NASH CRN fibrozom stadijuma 1-3 ili ekvivalentnom primenom drugog sistema bodovanja; BMI od ≥ 30 (težina (kg) / [visina (m)]<2>); indeks masne jetre ≥ 60; frakcija masti u jetri (%) ≥ 10% pomoću MRI izvedene tokom perioda skrininga. Ispitanici se podvrgavaju sktining procenama da se odredi podobnost unutar 42 dana pre randomizacije.

[0587] Ispitanici se isključuju iz studije ukoliko postoji dokaz istovremene bolesti uključujući hroničnu bolest jetre (osim NASH), cirozu, dekompenzovanu bolest jetre, nekontrolisani dijabetes, i određena druga medicinska stanja ili istoriju.

[0588] Početna snimanja se sprovode otprilike 14 do 35 dana pre doze aktivnog leka ili placeba 1. dana, uključujući sadržaj masti u jetri magnetnim rezonantnim snimanjem (MRI), tvrdoću jetre magnetnom rezonantnom elastografijom (MRE) i telesni sastav dvostrukoenergetskom rendgenskom apsorpciometrijom (DXA). Dodatna osnovna procena pacijenta uključuje određivanje težine, BMI i obima struka.

[0589] Režim lečenja: PEG-Jedinjenje 1 se daje svakodnevno ili nedeljno tokom 16 nedelja odraslima sa NASH. Lečenje se samoprimenjuje subkutano nakon 7-dnevne obuke pacijenta o pravilnoj upotrebi injektora sa placebom. Otprilike 90 ispitanika koji ispunjavaju uslove nasumično se odabiraju 1. dana u jednu od tri grupe za lečenje (30 po grupi), koji se zatim leče (počev od 1. dana), kako sledi: Lečenje A: 10 mg PEG-jedinjenja 1 dnevno; Lečenje B: 20 mg PEG-jedinjenja 1 nedeljno; Lečenje C: Placebo svakodnevno. Subjekti su stratifikovani pomoću dijagnoze dijabetes melitusa tipa 2 (da prema ne) na osnovu trenutnih kriterijuma Američkog udruženja za dijabetes.

[0590] Svi ispitanici sami sebi daju PEG-jedinjenje 1 ili placebo jednom dnevno. PEG-jedinjenje 1 je dato u rastvoru od 10 mg/ml. Za grupu sa lečenjem B (20 mg/nedeljno), istovremeno se daju 2 injekcije od po 1 mL 1. dana (D 1), a 2-7. dana, injekcija je placebo. Da bi održali slepost, druge dve grupe takođe imaju dve injekcije 1. dana, od kojih jedna ili obe sadrže placebo. Na dan 2-7, injekcija je 1 mL PEG-jedinjenja 1 (grupa sa lečenjem A) ili 1 mL placeba (grupa sa lečenjem C). Lečenje se nastavlja do 112. dana (D 112) (tj.16 nedelja).

[0591] Procena pacijenata: Procena pacijenata vrši se na D -7 (početak uvodjenja samo sa placebom), D 1, D 15, D 29, D 43, D 57, D 86 i D 112. Fizički pregledi, merenja vitalnih znakova, 12-kanalni elektrokardiogrami (EKG), kliničke laboratorijske procene i MRI, MRE i DXA snimanja se izvode. MRI, MRE i DXA snimci završetka lečenja vrše se na 112. dan (+/- 1 nedelja). Kontrolne posete vrše se oko D 142 i D 292, dok se DXA kontrolno skeniranje vrši 6 meseci (+/-2 nedelje) nakon poslednje doze. Krv se prikuplja za farmakokinetičku (FK) i farmakodinamičku (FD) analizu. Koncentracija PEG-jedinjenja 1 (ukupnog i intaktnog C-terminala) u serumu mere se validiranim testom. Svi PK podaci prikupljeni u studiji procenjuju se razvijenim populacijskim PK modelom za procenu parametara zasnovanih na modelu kao što su CL/F, Vc/ F, Ka itd. Pored toga, procene parametara pojedinačnih izloženosti (kao što su Cavg, Cmin, Cmax i AUC u stanju ravnoteže) izvedeni su iz parametara zasnovanih na modelu. Ispitanici se pažljivo prate zbog neželjenih događaja tokom cele studije.

[0592] Primarne krajnje tačke: Primarni cilj je procena efekta dnevnih ili nedeljnih doza PEG-jedinjenja 1 na sigurnost, toleranciju i frakciju masti u jetri (%) pomoću MRI kod pacijenata sa NASH dokazanim biopsijom. Ovo će se proceniti primarnom krajnjom tačkom promene procenta frakcije masti u jetri (%) od početne do 16. nedelje, utvrđeno pomoću MRI jetre protonske gustine frakcije masti. Polazna linija je definisana kao poslednje neizostavljajuće pre dozno merenje za sve krajnje tačke. Predviđa se da PEG-jedinjenje 1, koje se daje svakodnevno ili nedeljno tokom 16 nedelja pacijentima sa NASH, smanjuje frakciju masti u jetri (%) u većoj meri od placeba. Primarne krajnje tačke takođe uključuju krajnje tačke bezbednosti, uključujući incidencu AE, ozbiljnih AE i događaje od posebnog interesa, uključujući procenu mesta ubrizgavanja, AE koji dovode do prekida i smrti, kao i izražene abnormalnosti u kliničkim laboratorijskim testovima, merenjima vitalnih znakova, EKG-ovima, fizičkim pregledima i mineralnoj gustini kostiju (BMD) prikupljene DXA skeniranjem u određenim vremenskim tačkama.

[0593] Sekundarne krajnje tačke: Sekundarne krajnje tačke uključuju farmakokinetičke krajnje tačke i krajnje tačke imunogenosti. Farmakokinetičke krajnje tačke će se procenjivati na osnovu farmakokinetičkih parametara zasnovanih na modelu za serumsku koncentraciju PEG-jedinjenja 1 (ukupnog i intaktnog C-terminala): Cavg, Cmin, Cmax i AUC(TAU) određenih iz merenja izvršenih u odabranim vremenskim tačkama. Krajnje tačke imunogenosti procenjuju se nivoom antitela na PEG-jedinjenje 1 i antitela na FGF21 kod pacijenta. Određeni su farmakokinetički parametri zasnovani na modelu za serumsku koncentraciju PEG-jedinjenja 1 (ukupnog i intaktnog C-terminala). Primarni PK parametri uključuju: CL/F (prividni klirens nakon ekstravenske primene); V/F (prividni volumen raspodele nakon ekstravenske primene); i Ka (konstanta brzine apsorpcije sa mesta ubrizgavanja u cirkulaciju krvi). Iz primarnih PK parametara izvedeni su sekundarni PK parametri, uključujući Cmax (maksimalna izračunata koncentracija u serumu); T1/2 (poluvreme eliminacije); AUC(TAU) (površina ispod krive koncentracija-vreme u jednom intervalu doziranja); Cmin (minimalna koncentracija u intervalu doziranja); i Cavg (prosečna koncentracija u intervalu doziranja).

[0594] Analiza: Longitudinalna analiza ponovljenih merenja koristi se za analizu promene frakcije masti u jetri (%) u 16. nedelji od početne vrednosti kod lečene populacije koja ima i osnovno i najmanje jedno merenje nakon početne vrednosti. Model uključuje interakcije između grupa lečenja, nedelja i Lečenja po nedeljama kao glavne efekte a osnovnu frakciju masti u jetri (%) i početni dijabetički status kao kovarijante. Nestrukturirana kovarijantna matrica koristi se za predstavljanje korelacije ponovljenih mera unutar svakog subjekta. Model daje procene tačaka, standardne greške i 2-strane intervale pouzdanosti od 90% za srednju promenu u odnosu na početnu vrednost unutar i između lečenja. P-vrednosti su izračunate kako bi se uporedio efekat lečenja u svakoj od dve grupe za lečenje PEG-jedinjenjem 1 (10 mg dnevno i 20 mg nedeljno) sa onim u grupi koja je lečena placebom u 16. nedelji. Svako poređenje grupe za lečenje vrši se pri jednostranom nivou značaja od 0.05. Ne vrše se prilagođavanja za višestrukost.

[0595] Istražuje se veza između izloženosti PEG-jedinjenju 1 (ukupni i intaktni C-terminal) i drugih biomarkera ili krajnjih tačaka kako bi se pokazali odnosi doze i odgovora. Ova merenja se takođe analiziraju kako bi se pokazao njihov odnos sa promenom frakcije masti jetre i kako ovi biomarkeri predviđaju ili se odnose na tu promenu. Ove krajnje tačke i biomarkeri uključuju promene tvrdoće jetre MRE, telesne težine, BMI, obima struka, telesnog sastava pomoću DXA, homeostaze glukoze, osetljivosti na insulin, lipida natašte, homeostaze kostiju, ALT i AST, kao i biomarkere povezane sa rizikom od napredovanje bolesti i komplikacija. NASH je tipično povezan sa smanjenim nivoima adiponektina (hipoadiponektinemija), a smanjeni nivoi su povezani sa opsežnijom nekroinflamacijom. Veruje se da adiponektin povećava osetljivost na insulin povećavajući oksidaciju masti i smanjujući skladištenje lipida u jetri. Očekuje se da se nivoi ukupnog adiponektina u serumu povećaju Lečenjom PEG-jedinjenjem 1. Takođe se očekuje da će lečenje PEG-jedinjenjem 1 smanjiti trigliceride natašte, LDL, ApoB, ApoC3 i povećati HDL kod pacijenata sa NASH.

[0596] Analiza rezultata studije, koristeći nestrukturiranu kovarijantnu matricu kako je gore opisano, sprovedena je kako bi se pokazalo statistički značajno (p <0.05) smanjenje frakcije masti u jetri kod pacijenata koji su lečeni PEG-jedinjenjem 1 (u ispitivanim grupama i za dnevnu i nedeljnu primenu ) u poređenju sa placebo kontrolama.

Primer 16

[0597] Ovaj primer dalje istražuje efikasnost PEG-jedinjenja 1 u STAM modelu bezalkoholnog steatohepatitisa (NASH). Miševi su lečeni u dobi između 9 i 12 nedelja ili do 15 nedelja

Postupci

[0598] PEG-Jedinjenje 1 i Transporter (20 mM Tris/250 mM sukroza, pH 8.3) su obezbeđeni. Da bi se pripremio rastvor za doziranje, rastvor PEG-jedinjenja 1 je pripremljen odgovarajućim razblaživanjem uz obezbeđeni nosač.

[0599] C57BL/6 miševi (ženke 15-dana trudnoće) su dobijene od Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japan). Sve životinje korišćene u studiji bile su smeštene i zbrinute u skladu sa Smernicama Japanskog farmakološkog društva za primenu na životinjama. NASH je indukovan kod 60 muških miševa jednom potkožnom injekcijom rastvora od 200 µg streptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich, SAD) 2 dana nakon rođenja i hranjenjem hranom sa visokim udelom masti (HFD, 57 kcal% masti, kat#: HFD32, CLEA Japan, Inc., Japan) nakon 4 nedelje starosti.

[0600] PEG-jedinjenje 1 i transporter davani su supkutano u zapremini od 1 ml/kg u dozi od 3 mg/kg dva puta nedeljno. Životinje su držane u SPF objektu u kontrolisanim uslovima temperature (23 ± 2°C), vlažnosti (45 ± 10%), osvetljenja (12-časovni ciklusi veštačkog svetla i mraka; svetlo od 8:00 do 20:00) i razmene vazduha. U eksperimentalnoj sobi se održavao visok pritisak (20 ± 4 Pa) kako bi se sprečilo zagađenje objekta. Životinje su bile smeštene u polikarbonatnim kavezima KN-600 (Natsume Seisakusho, Japan) sa najviše 4 miša po kavezu. Sterilizovani Paper-Clean (Japan SLC) koristilo se za posteljinu i zamenjivalo jednom nedeljno. Sterilizovani čvrsti HFD obezbeđen je ad libitum, postavljen u metalni poklopac na vrhu kaveza. Čista voda je obezbeđena ad libitum iz bočice za vodu opremljene gumenim čepom i cevčicom. Boce sa vodom zamenjivane su jednom nedeljno, čišćene i sterilisane u autoklavu i ponovo upotrebljavane. Miševi su identifikovani brojevima urezanim na minđušama. Svaki kavez je bio označen posebnim identifikacionim kodom.

[0601] Glukoza u krvi bez gladovanja izmerena je u punoj krvi pomoću LIFE CHECK (EIDIA Co. Ltd., Japan). Za biohemiju plazme, krv je sakupljana u polipropilenskim epruvetama sa antikoagulansom (Novo-Heparin, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Japan) i centrifugirana na 1,000xg tokom 15 minuta na 4°C. Supernatant se sakuplja i čuva na -80°C do upotrebe. Nivoi ALT u plazmi, triglicerida i ukupnog holesterola izmereni su pomoću FUJI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm Corporation, Japan).

[0602] Ekstrakti ukupnih lipida iz jetre dobijeni su Folch-ovim postupkkom (Folch J. et al., J. Biol. Chem. 1957; 226: 497). Uzorci jetre su homogenizovani u smeši hloroform-metanol (2:1, v/v) i inkubirani preko noći na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja smešom hloroform-metanol-voda (8: 4: 3, v/v/v), ekstrakti su upareni do suva i rastvoreni u izopropanolu. Sadržaji triglicerida i holesterola u jetri izmereni su pomoću E-testa za trigliceride, odnosno E-testa za holesterol (Vako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan).

[0603] Za HE bojenje preseci su odsečeni od parafinskih blokova tkiva jetre prefiksiranih u Bouinovom rastvoru i obojeni Hematoksilinom od Lillie-Maier (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Japan) i rastvorom eozina (Wako Pure Chemical Industries). Ocena aktivnosti NAFLD (NAS) izračunata je prema kriterijumima Kleinera (Kleiner DE. i sar., Hepatology, 2005; 41:1313). Da bi se vizualizovalo taloženje kolagena, Bouinovi fiksirani preseci jetre su obojeni rastvorom pikro-Sirijus crvene boje (Valdek, Nemačka). Da bi se vizuelizovale makro- i mikrovezikularne masti, izrezani su kriopreseci iz zamrznutih tkiva jetre, prefiksiranih u 10% neutralnom puferskom formalinu, ugrađenih u Tissue-Tek O.C.T. jedinjenje (Sakura Finetek Japan Co. Ltd., Japan) i obojeni sa Oil red O (Sigma-Aldrich). Za imunohistohemiju preseci su odsečeni iz smrznutih tkiva jetre ugrađenih u Tissue-Tek O.C.T. jedinjenje i fiksirani u acetonu. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana upotrebom 0.03% H2O2 tokom 5 minuta, praćeno inkubacijom sa Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd., Japan) tokom 10 minuta. Preseci su inkubirani sa 200 puta razblaženim antitelom protiv F4/80 (BMA Biomedicals, Švajcarska) tokom noći na 4°C. Posle inkubacije sa sekundarnim antitelom (HRP-kozje anti-pacovsko antitelo, Invitrogen, SAD), izvedene su reakcije enzima i supstrata korišćenjem 3, 3'-diaminobenzidin/H2O2 rastvora (Nichirei Bioscience Inc., Japan).

[0604] Bubreg je fiksiran u Bouin-ovom rastvoru. Glomerularna arhitektura je primećena primenom PAS bojenja sa presecima oksidisanim 0.5% periodičnom kiselinom i obojenim Schiffovim reagensom (oba iz kompanije Wako Pure Chemical Industries). Da bi se vizuelizovalo taloženje kolagena, preseci bubrega su obojeni rastvorom pikro-Sirijus crvene boje (Valdek).

[0605] Za kvantitativnu analizu područja fibroze, taloženja masti i upale, digitalnim fotoaparatom su snimljene slike svetlih polja Sirijus crvenom bojom obojenih, Oil red bojom obojenih i F4/80-imuno obojenih preseka oko centralne vene za jetre ili intersticijskog regiona za bubrege (DFC280 ; Leica, Nemačka) pri uvećanju od 200 puta, a pozitivna područja u 5 polja/presek izmerena su pomoću softvera ImageJ (Nacionalni institut za zdravlje, SAD).

[0606] Statističke analize izvršene su primenom Bonferroni-jevog višestrukog testa poređenje na GraphPad Prism 4 (GraphPad Softvare Inc., SAD). Vrednosti P <0.05 smatrane su statistički značajnim. Pretpostavljen je trend ili tendencija kada je jednostrani t-test vratio vrednosti P <0.05. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD.

Rezultati

Studijske grupe su bile kao što sledi (rezimirano u Tabeli 17 ispod).

[0607] Grupa 1: Transporter. Dvadeset NASH miševa je supkutano primilo transporter u zapremini od 1 ml/kg dva puta nedeljno u dobi od 9 do 12 nedelja ili do 15 nedelja.

[0608] Grupa 2: PEG-Jedinjenje 1. Dvadeset NASH miševa je supkutano primilo transporter dopunjen sa PEG-Jedinjenjem 1 u dozi od 3 mg/kg dva puta nedeljno u dobi od 9 do 12 nedelja ili do 15 nedelja.

Tabela 17. Rezime lečenja.

Grupa Br. Miševi Ispitna Doza Zapremina Režimi Žrtvovanje

[0609] Vijabilnost, klinički znaci i ponašanje su praćeni svakodnevno. Pre tretmana zabeležena je telesna težina. Miševi su posmatrani na značajne kliničke znake toksičnosti, odumiranja i mortaliteta približno 60 minuta nakon svake primene. Životinje su žrtvovane ispuštanjem krvi direktnom srčanom punkcijom pod etarskom anestezijom (Wako Pure Chemical Industries). Šest životinja u svim grupama žrtvovano je u dobi od 12 nedelja za sledeće testove, a preostale životinje su držane do dana žrtvovanja u 15. nedelji starosti.

[0610] Telesna težina u svim grupama se očigledno nije promenila tokom perioda lečenja. Nije bilo značajnih razlika u srednjoj telesnoj težini između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1.

[0611] Tokom perioda lečenja, miševi su umrli pre nego što su dostigli 40. dan kako sledi: osam od 20 miševa je umrlo u grupi sa transporterom. U grupi sa PEG-jedinjenjem 1 nisu pronađene mrtve životinje. Uzrok smrti ostao je nejasan i mogao bi biti povezan sa napredovanjem bolesti u grupi sa transporterom. Dani smrti pojedinih miševa bili su dani 7, 17 (dva miša), 20 (dva miša), 34, 38 i 40. Nakon što je 5 miševa umrlo u grupi sa transporterom, doneta je odluka da se izmeni originalni protokol studije i smanji broj miševa žrtvovanih u 12. nedelji sa 8 na 6 po grupi u pokušaju da se osigura da najmanje 6 miševa u svakoj grupi preživi do 15. nedelje.

[0612] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, nije bilo značajnih razlika u srednjoj telesnoj težini na dan žrtvovanja između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1 (slika 42A). Isto tako, kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nije bilo značajnih razlika u srednjoj telesnoj težini na dan žrtvovanja između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1 (slika 42B).

[0613] Težina organa i odnos težine jetre i tela su prikazani na SLIKAMA 43-46 i rezimirani u Tabeli 18.

[0614] Kod životinja koje su lečene između 9. i 12. nedelje, grupa sa PEG-jedinjenjem 1 pokazala je tendencije smanjenja srednje težine jetre u poređenju sa grupom sa transporterom (slika 43A). Srednji odnos težine jetre i tela značajno se smanjio u grupi sa PEG-jedinjenjem 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (p <0.01) (SL.44A). Nije bilo značajnih razlika u srednjoj težini desnog bubrega između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1 (SL. 45A). Srednja težina levog bubrega imala je tendenciju smanjenja u grupi sa PEG-jedinjenjem 1 u poređenju sa grupom sa transporterom (SL.46A).

[0615] Kod životinja koje su lečene između 9. i 15. nedelje, u grupi sa PEG-jedinjenjem 1 značajno se smanjila srednja težina jetre (p <0.001) (slika 43B) i srednji odnos težine jetre i tela (p <0.001) (SL. 44B) u poređenju sa grupom sa transporterom. Nije bilo značajnih razlika u srednjoj težini desnog bubrega (SL. 45B) i srednjoj težini levog bubrega (SL. 46B) između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1.

Tabela 18. Rezultati telesne težine i težine organa.

Parametar (srednja 12 nedelja 12 nedelja PEG-

[0616] Rezultati biohemijskih merenja su prikazani na SLIKAMA 47-52 i rezimirani u Tabeli 19, ispod.

[0617] Kod životinja koje su lečene između 9. i 12. nedelje, nije bilo značajnih razlika u nivoima glukoze u punoj krvi između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1 (SL.47A).

[0618] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nivo glukoze u punoj krvi u grupi sa PEG-jedinjenjem 1 značajno se smanjio u poređenju sa grupom sa transporterom (p <0.05) (SL.47B).

[0619] Kod životinja koje su lečene između 9. i 12. nedelje, nije bilo značajne razlike u nivoima ALT u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-jedinjenjem 1 (SL.48A).

[0620] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nivoi ALT-a u plazni u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 snačajno su se smanjili u poređenju sa grupom sa transporteroma (p<0.01) (SL.

48B).

[0621] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, grupa sa PEG-Jedinjenjem 1 pokazala je tendenciju ka smanjenju nivoa triglicerida u plazmi u poređenju sa grupom sa transporterom (SL.

49A).

[0622] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nije bilo značajne razlike u nivoima triglicerida u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.49B).

[0623] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, nije bilo značajnih razlika u ukupnom holesterolu u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.50A).

[0624] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nije bilo značajnih razlika u ukupnom holesterolu u plazmi između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.50B).

[0625] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, sadržaji triglicerida u jetri u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 značajno su smanjeni u poređenju sa grupom sa transporterom (p<0.01) (SL.51A).

[0626] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, sadržaji triglicerida u jetri u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 značajno su smanjeni u poređenju sa grupom sa transporterom (p<0.001) (SL.51B).

[0627] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, sadržaji holesterola u jetri u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 značajno su smanjeni u poređenju sa grupom sa transporterom (p<0.01) (SL.52A).

[0628] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, sadržaji holesterola u jetri u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 značajno su smanjeni u poređenju sa grupom sa transporterom (p<0.001) (SL.52B). Tabela 19. Rezultati biohemijskih testova.

Parametar (srednja 12 nedelja 12 nedelja PEG-

[0629] Reprezentativne mikrografije koje prikazuju histološku analizu uzoraka jetre su prikazane na SLIKAMA 53, 55, 57, i 59. Sažeci histoloških rezultata su prikazani grafički na SLIKAMA 54, 56, 58, i 60, i tabelarno su prikazani u Tabeli 22, ispod.

[0630] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, HE obojeni preseci (sekcije) jetre iz grupe sa transporterom su ispoljili ozbiljno mikro- and makrovezikularno taloženje masti, hepatocelularno baloniranje i inflamatornu ćelijsku infiltraciju (SL. 53A-B). Grupa sa PEG-Jedinjenjem 1 je prikazala značajna poboljšanja u taloženju masti, hepatocelularnom baloniranju i inflamatornoj ćelijskoj infiltraciji, sa značajnim smanjenjem NAS u poređenju sa grupom sa transporterom (SL.

53C-D).

[0631] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, grupa sa PEG-Jedinjenjem 1 je prikazala značajna poboljšanja u taloženju masti, hepatocelularnom baloniranju i inflamatornoj ćelijskoj infiltraciji (SL. 53E-F), sa značajnim smanjenjem NAS u poređenju sa grupom sa transporterom (SL. 53G-H).

[0632] Rezultati ocene NALFD aktivnosti su prikazani grafički na SL.54A-B za životinje lečene između nedelja 9-12 i 9-13, redom, i rezimirani u Tabeli 20. Ocena NALFD aktivnosti je značajno smanjena i u obe grupe za tretman (p<0.01 i p<0.001 za životinje lečene između nedelja 9-12 i 9-15, redom).

Tabela 20. Sažetak rezultata ocena NALFD aktivnosti. Komponente ocena su kao što je prikazano u Tabeli 21, ispod.

Tabela 21. Komponente ocena NALFD aktivnosti.

[0633] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, preseci jetre iz grupe sa transporterom obojeni sa Seriujs crvenom su pokazali taloženje kolagena u pericentralnoj regiji lobusa jetre (SL.

55A-B). Nije bilo značajnih razlika u oblasti fibroze između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.55C-D), kako je rezimirano na SL.56A.

[0634] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, oblast fibroze je značajno smanjena u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.55E-F) u poređenju sa grupom sa transporterom (SL.55G-H), kako je rezimirano na SL. 56B (p<0.05).

[0635] Reprezentativne fotomikrografije preseka imuno obojenih sa F4/80 su prikazane na SL.57.

[0636] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, imunobojenje sa F4/80 preseka jetre iz grupe sa transporterom je prikazalo akumulaciju F4/80+ ćelija u lobusu jetre (SL. 57A-B). Nije bilo značajnih razlika u broju i veličini F4/80+ ćelija između grupe sa transporterom i grupe sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.57C-D), kako je rezimirano na SL.58A.

[0637] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, nije bilo značajnih razlika u broju i veličini F4/80+ ćelija između grupe sa transporterom (SL. 57E-F) i grupe sa sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.

57G-H), kako je rezimirano na SL.58B.

[0638] Reprezentativne fotomikrografije preseka obojenih sa oil red su prikazane na SL.59A-H [0639] Kod životinja lečenih između 9. i 12. nedelje, preseci jetre obojeni sa oil red iz grupe sa transporterom su ispoljili mikro- i makrovezikularno deponovanje masti u hepatocitima (SL.59A-B). Procenat oblasti taloženja masnoće (oil red-pozitivna oblast) je značajno smanjen u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL.59C-D) u poređenju sa grupom sa transporterom, kako je rezimirano na SL. 60A (p<0.001).

[0640] Kod životinja lečenih između 9. i 15. nedelje, procenat oblasti taloženja masnoće značajno je smanjen u grupi sa PEG-Jedinjenjem 1 (SL. 59E-F) u poređenju sa grupom sa transporterom (SL. 59G-H), kako je rezimirano na SL.60B (p<0.001).

Tabela 22. Rezime histoloških nalaza

[0641] Kao što je gore pomenuto, PEG-Jedinjenje 1 je smanjilo akumulaciju masti u jetri, što je procenjeno biohemijskim testom kojim se meri sadržaj triglicerida u jetri i histologijom nakon bojenja preseka jetre hematoksilinom i eozinom ili sa oil red O. U literaturi je zabeleženo da ova antisteatotička aktivnost nativnog FGF21 zavisi od adiponektina kod miša (videti Lin i sar., Cell Metab. 17: 779-789 (2013); Holland i sarad., Cell Metab 17: 790-797 (2013),). Zbog toga su koncentracije ukupnog adiponektina izmerene u terminalnim uzorcima seruma pripremljenim od tretiranih miševa. Adiponektin u serumu meren je prema protokolu proizvođača koristeći komercijalno dostupan ELISA komplet (Alpco kataloški broj 47-ADPMS-E01).

[0642] Dva puta nedeljno davanje 3 mg/kg PEG-Jedinjenja 1 statistički je značajno povećalo serumski ukupni adiponektin, u poređenju sa odgovarajućom grupom sa transporterom, u svim ispitanim terminalnim vremenskim tačkama (Slika 62). Ovaj rezultat je u skladu sa hipotezom da adiponektin doprinosi efikasnosti PEG-jedinjenja 1 u Stelic NASH modelu.

[0643] Ukratko, lečenje tokom tri nedelje PEG-jedinjenjem 1 značajno je smanjilo odnos težine jetre i tela, sadržaj lipida u jetri (triglicerida i holesterola), oblast taloženja masti i NAS. Pored ovih efekata, lečenje u trajanju od 6 nedelja PEG-jedinjenjem 1 značajno je smanjilo glukozu u punoj krvi, ALT u plazmi i oblast fibroze. Štaviše, lečenje PEG-jedinjenjem 1 poboljšalo je stopu preživljavanja u poređenju sa grupom sa transporterom.

[0644] U zaključku, PEG-Jedinjenje 1 pokazalo je anti-NASH i anti-fibrotičke efekte, uključujući poboljšani metabolizam lipida i glukoze.

Primer 17

In Vitro karakterizacija pegilovanog jedinjenja 2 ćelijama humanog embrionalnog bubrega koje stabilno eksprimiraju Beta-Klotho.

[0645] FGF21 koristi β-klotho kao ko-receptor zajedno sa FGF receptorima za svoju tkivnospecifičnu signalnu aktivnost (videti, npr. Kurosu i sar., 2007, J. Biol. Chem.282: 26687-26695; Ogava i sar., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., SAD 104: 7432-7437). FGF21 se prvo vezuje za βklotho i kompleks tada može da aktivira FGF receptore da pokrenu intracelularnu signalnu kaskadu koja brzo aktivira vanćelijskim signalima regulisane kinaze 1/2 (ERK1 / 2) tokom minuta. Tokom dužeg vremena, aktivirani, fosforilisana ERK (pERK) može se translocirati u ćelijsko jezgro i fosforilisati i aktivirati brojne regulatore transkripcije, uključujući ternarni kompleksni faktor koji se naziva E Twenty-Six (ETS) protein poput proteina 1 (Elkl). Aktivirani Elkl formira kompleks sa serumskim faktorom odgovora koji se vezuje za određene sekvence DNK da bi regulisao ekspresiju određenih gena.

Stvaranje ćelijske linije koja stabilno ko-eksprimira humani β-klotho i Elk1-luciferaza trans-reporterski konstrukt

[0646] Elkl-luciferaza trans-reporterska ćelijska linija je generisana sa HEK293 ćelijama koristeći Agilent Technologies 'PathDetect Elk1 trans-reporterski sistem. Ovaj sistem ima transaktivacijski fuzioni plazmid koji eksprimira fuzioni protein DNK vezujućeg domena iz transkripcionog aktivator proteina kvasca, Gal4, praćen domenom aktivacije Elk1. Kada se transkripcioni aktivator, Elk1, fosforiluje i aktivira kinazom regulisanom vanćelijskim signalima (ERK) nakon stimulacije FGF21, fuzioni-aktivator protein vezuje se kao dimer za GAL4 uzvodnu aktivacionu sekvencu i aktivira transkripciju luciferaza reporterskog enzima. Ekspresija luciferaze iz reporter plazmida ukazuje na aktivaciju fuzijskog trans-aktivatorskog proteina i, prema tome, prisustvo endogene protein kinaze. Shodno tome, aktivnost luciferaze odražava aktivaciju ERK u ćeliji i odgovarajuće puteve transdukcije signala, u ovom slučaju, aktivaciju Elk1.

[0647] HEK293 ćelije su ko-transfektovane fuzionim trans-aktivatorskim plazmidom, reporter plazmidom i plazmidom koji kodira humani β-klotho. Transfektovane ćelije su bile pod selekcijom G-418 (500 µg/ml) i blasticidina (10 µg/ml). Klonovi koji su preživeli dvostruku selekciju antibiotika analizirani su stimulisanjem sa konstruktom FGF21 i praćenjem aktivnosti Elk1-luciferaze. HEK Luc Clone2 je izabran kao ćelijska linija za sve buduće testove.

Esej Elk1-luciferaze zasnovan na ćelijama

[0648] HEK293 Luc Clone2 ćelije su posejane u ploče sa 96 bunarića sa gustinom od 25,000 ćelija po bunariću. Ploče su inkubirane u inkubatoru za kulturu tkiva na 37°C sa 5% CO2 tokom dva dana. Na dan testa, pripremljena je serija 3-strukog serijskog razblaženja proteina FGF21 u DMEM medijumu bez fenol crvene boje, dopunjenom sa 1x L-glutaminom, 10 mM Hepes, pH 7.2 – 7.5 i 10% FBS. Uklonjen je stari medijum za rast ćelijske kulture. Za započinjanje tretmana, u svaki bunarić je dodato 50 µl DMEM medijuma bez fenol crvene boje sa ispitnim jedinjenjima i ploče su vraćene u inkubator za ćelijske kulture. Na isteku 5 sati inkubacije, u svaki bunarić je dodata jednaka zapremina smeše luciferaza supstrat reagensa. Ploče su pokrivene i stavljene na orbitalni šejker tokom 3 min pri 600 o/min. Luminiscencija je izmerena na Perkin Elmerovom Envision 2103 Multiplate čitaču.

Analiza podataka

[0649] Neobrađeni podaci iz svih tačaka podataka pojedinačnih replikata analizirani su pomoću softvera GraphPad Prism 5 (GraphPad Softvare Inc., CA) korišćenjem nelinearne regresione analize. Podaci su podešeni pomoću log(agonista) prema jednačini odgovora sa 4 parametra: dno (minimum), vrh (maksimum), log EC50 (mera potencije) i promenljivi Hill-ov nagib. Potencija (EC50) je definisana kao koncentracija koja je polu-maksimalno povećala odgovor iznad osnovne vrednosti i izračunata je programom podešavanja krive

Rezultati

[0650] Reprezentativne krive koncentracija-odgovor za tri varijante FGF21 (N-terminalno Hisoznačeno jedinjenje 1 (His-jedinjenje 1), PEG-jedinjenje 1 i PEG-jedinjenje 2) i izračunate vrednosti potencije i efikasnosti u 5-satnom testu Elk1-luciferaze su prikazani na SL.63 i u tabeli 23. Potencije tri varijante bile su slične u 5-satnom testu Elk1-luciferaze (tabela 23).

Tabela 23. Potencija i efikasnost FGF21 varijanti u 5 satnom eseju Elk1-luciferaze

[0651] Razni fuzioni molekuli Fc-FGF-21 upoređivani su u testu Elk1-luciferaze na bazi ćelija. Svi molekuli, osim Jedinjenja 180 i Jedinjenja 175, pokazali su jednocifrene nM potencije ili niže i bili su uporedivi sa ili niži od izmerene potencije PEG-Jedinjenja 2 (Slika 64 i Tabela 24 dole).

[0652] Tabela 24. Geometrijske srednje vrednosti EC50 sa 95% intervalom pouzdanosti (CI).

Primer 18: Efekti jedinjenja varijante FGF-21 na nivoe Adiponektina kod C57BL/6J miševa [0653] FGF21 stimuliše lučenje adiponektina iz adipocita, a široka distribucija adiponektinskih receptora pruža potencijalni put kojim se delovanje FGF21 može proširiti na druga tkiva. Prijavljeno je da za mnoge metaboličke efekte nativnog FGF21, uključujući njegovu antisteatotičku aktivnost, kod miša je potreban adiponektin (Lin, Z. i sar., Cell Metab.17: 779-789 (2013); Holland i sar., Cell Metab 17: 790-797 (2013))). Ovaj primer izveštava o efektima pojedinačnih rastućih doza PEG-Jedinjenja 2 na odabrane farmakodinamičke markere aktivnosti FGF21 kod normalnih, nedijabetičnih miševa C57BL/6J.

[0654] Mužjaci C57BL/6J miševa stari 8 nedelja nasumično su podeljeni u sledeće grupe za lečenje (veličina uzorka n = 10/grupi): 1) transporter, 2) PEG-jedinjenje 2, 0.03 mg / kg, 3) PEG-jedinjenje 2, 0.1 mg / kg, 4) PEG-jedinjenja 2, 0.3 mg/kg, ili 5) PEG-jedinjenja 2, 1.0 mg / kg, i supkutano im se dozira odgovarajući tretman od 5 ml/kg. Nakon doziranja u stanju koje nije post, uzorci krvi su centrifugirani i 20 µl plazme je alikvotirano za kvantitativno određivanje ukupnog adiponektina i adiponektina visoke molekulske mase (HMW) (Alpco Diagnostics, Salem, NH, kat # 47-ADPMS-E01). Miševima je ponovo uzeta krv u stanju koje nije post 24, 48, 72 i 144 sata nakon pojedinačne akutne doze za analize glukoze u plazmi i adiponektina, a telesna težina je merena pre svakog uzimanja krvi.

[0655] Koncentracije u plazmi ukupnog adiponektina i adiponektina visoke molekulske mase (HMW) izmerene su prateći protokol proizvođača za Mouse Total i HMV ELISA kit (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Izloženosti PEG-jedinjenja 2 u plazmi su određene pomoću ELISA. Statistička analiza svih podataka izvršena je korišćenjem jednosmernog ANOVA praćenog Dunnett-ovim t-testom koristeći grupu sa transporterom kao kontrolu (JMP iz SAS, Cari, NC). Statistička značajnost je utvrđena pri verovatnoći (P) <0.05.

[0656] Telesna težina je određena na početku (0), 24, 48, 72 i 144 sata nakon tretmana. Kada se pretvori u procentualnu promenu u odnosu na početnu vrednost (dan 0) telesne težine, primećeno je značajno smanjenje zavisno od doze kao odgovor na pojedinačne SC doze PEG-jedinjenja 2 (slika 65). Procenat efekta gubitka težine bio je maksimalan 72 sata nakon doze i počeo se vraćati na početne vrednosti do 6. dana, s tim što je odgovor na dozu od 1.0 mg/kg PEG-jedinjenja 2 ostajao značajno smanjen u poređenju sa onim u grupi sa transporterom. Telesna težina je značajno smanjena u poređenju sa grupom za lečenje transporterom za grupu koja je uzimala 0.3 mg/kg u 72 sata (P <0.001) i za grupu koja je uzimala 1.0 mg/kg u 48 sati (P <0,05), 72 sata (P < 0.0001) i 144 sata (P <0.001).

[0657] Koncentracije ukupnog adiponektina u plazmi su značajno povećane u odnosu na transporter lečenjem sa dozama od 0.1, 0.3 i 1.0 mg/kg PEG-jedinjenja 2 u 72 i 144 sata nakon doze (SL. 66A). Testirana doza od 0.03 mg/kg PEG-jedinjenja 2 nije značajno povećala efekte ukupnog adiponektina u poređenju sa transporterom u bilo kojoj izmerenoj tački. Ukupni adiponektin u plazmi je značajno povećan u grupi koja je lečena sa 0.1 mg/kg u 72 sata (P <0.001) i 144 sata (P <0.01), u grupi koja je lečena sa 0.3 mg/kg u 72 sata (P <0.01) i 144 sata (P <0.01), i u grupi koja je lečena sa 1 mg/kg u 72 sata (P <0.0001) i 144 sata (P <0.0001).

[0658] Kada se izrazi kao procenat promene u odnosu na početno stanje, koncentracije ukupnog adiponektina u plazmi su značajno povećane u poređenju sa transporterom, tretmanom sa svim dozama PEG-jedinjenja 2 u nekim vremenskim tačkama (SL. 66B). Nije bilo značajne razlike u procentima promene u odnosu na početnu vrednost ukupnog adiponektina u poređenju sa transporterom 24 sata posle tretmana bilo kojom dozom PEG-jedinjenja 2, a 72 sata nakon doze, sve doze PEG-jedinjenja 2 su dovele do statistički značajnog povećanja u poređenju sa transporterom. Maksimalna primećena promena je 75% povećanje promene u odnosu na početni adiponektin 144 sata posle doze sa 1 mg/kg PEG-jedinjenja 2. Procentualna promena ukupnog adiponektina u plazmi je značajno povećana u grupi koja je lečena sa 0.03 mg/kg u 72 sata ( P <0.01), u grupi koja je lečena sa 0.1 mg/kg u 48 sati (P <0.01), 72 sata (P <0.0001) i 144 sata (P <0.001), u grupi koja je lečena sa 0.3 mg/kg za 72 sata ( P <0.0001) i 144 sata (P <0.0001), i u grupi koja je lečena sa 1.0 mg/kg 48 sati (P <0.01), 72 sata (P <0.0001) i 144 sata (P <0.0001).

[0659] Koncentracije HMW adiponektina u plazmi su značajno povećane u poređenju sa transporterom lečenjem sa dozama od 0.1 i 1.0 mg/kg PEG-Jedinjenja 2, dok doze od 0.03 i 0.3 mg/kg PEG-Jedinjenja 2 nisu značajno povećale HMW adiponektin u poređenju sa transporterom u bilo kojoj izmerenoj tački (podaci nisu prikazani).

[0660] Kada je mereno na kraju studije 144 sata nakon lečenja, koncentracije PEG-Jedinjenja 2 u plazmi su porasle dozno-zavisno i za aktivni, karboksi (C)-terminal intaktni i ukupni (intaktni i proteolizovan) oblik molekula Tabela 25.

Tabela 25. Koncentracije u plazmi ukupnog i C-terminal intaktnog PEG-Jedinjenja 2 nakon pojedinačnih SC doza

[0661] Ukupno i PEG-Jedinjenje 2 intaktnog C-terminala u plazmi C57BL/6J miša 144 sati nakon SC doze.

[0662] Sve vrednosti su srednja vrednost ± S.E.M.

[0663] Slični protokol je praćen sa molekulima PEG-Jedinjenje 20 Jedinjenje 105, Jedinjenje 112, Jedinjenje 182, Jedinjenje 171, Jedinjenje 170, Jedinjenje 181, i PEG-Jedinjenje 1, sa 9-11 nedelja starim C58BL/6J miševima, sem što je ukupni adiponektin samo meren na početku, 3 dana (72 sata) i 6 dana (144 sata) nakon doze. Jedinjenja su eksprimirana u E. coli sem Jedinjenja 181, koje je eksprimirano u HEK ćelijama. Sva jedinjenja su značajno povećala ukupni adiponektin u plazmi u poređenju sa transporterom na Dan 3 i/ili Dan 6 pri određenim dozama testiranim (videti SL.

67A-E).

[0664] Pri dozama od 0.3 mg/kg i 1 mg/kg, svako od PEG-Jedinjenja 2 i PEG-Jedinjenja 20 je dovelo do značajnog povećanja ukupnog adiponektina u plazmi 6 dana nakon doze (P<0.001 za 1 mg/kg bilo kog jedinjenja, P<0.01 za 0.3 mg/kg PEG-Jedinjenja 2, i P<0.05 za 0.3 mg/kg PEG-Jedinjenja 20) (SL.67A).

[0665] Pri dozi od 54.3 nmol/kg, procentualna promena ukupnog adiponektina u plazmi od početne vrednosti je značajno porasla pomoću PEG-Jedinjenja 2, Jedinjenja 105, i Jedinjenja 112 (u poređenju sa kontrolama tretiranim transporterom) na Dane 3 i 6 (P<0.001 za sve tačke podataka izuzev PEG-Jedinjenja 2 na dan 3, P<0.05) (SL.67B). Pored toga, doza od 5.43 nmol/kg Jedinjenja 112 značajno je povećala procentualnu promenu ukupnog adiponektina u plazmi, u poređenju sa kontrolama tretiranim transporterom, na Dan 3 samo (P<0.05) (SL.67B).

[0666] Procenat promene u odnosu na početnu vrednost za ukupni adiponektin u plazmi značajno je povećan za jedinjenje 182 pri dozi od 18.1 nmol/kg (P <0.01 i 3. i 6. dana) i od 54.3 nmol/kg (P <0.001 i P <0.05, redom, na dan 3 i 6) (SL. 67C). Povećanje procenta promene ukupnog adiponektina u plazmi za dozu od 5.43 nmol/kg Jedinjenja 182 bilo je značajno samo 6. dana (P <0.05). Pored toga, PEG-Jedinjenje 2 (doza 54.3 nmol/kg) značajno je povećalo procenat promene ukupnog adiponektina u plazmi i 3. i 6. dana (P <0.001 oba dana) (SL.67C).

[0667] Procenat promene od polazne vrednosti ukupnog adiponektina u plazmi je značajno povećan i pomoću Jedinjenja 171 i Jedinjenja 181 na oba i dan 3 i dan 6 na dozno-zavisan način, u poređenju sa kontrolom tretiranom transporterom (P<0.001 za sve tačke podataka sem P<0.01 za dozu od 5.43 nmol/kg Jedinjenja 181 na dan 6) (SL. 67D). Dodatno, PEG-Jedinjenje 2 (54.3 nmol/kg dose) značajno je povećalo procenat promene ukupnog adiponektina u plazmi i na dan 3 i dan 6 (P<0.001 na oba dana) (SL.67D).

[0668] Procentualna promena ukupnog adiponektina u plazmi od osnovne vrednosti je značajno povećana pomoću Jedinjenja 170 na Dane 3 i 6 pri 18.1 nmol/kg (P<0.01, oba dana) i 54.3 nmol/kg (P<0.05 na dan 3 i P<0.001 na dan 6); porast procentualne promene ukupnog adiponektina u plazmi za dozu od 5.43 nmol/kg je bio značajan na dan 6 samo (P<0.05) (SL. 67E). Pored toga, PEG-Jedinjenje 2 (54.3 nmol/kg dose) je značajno povećalo procenat promene ukupnog adiponektina u plazmi i na dan 3 i dan 6 (P<0.001 na oba dana) (SL.67E).

[0669] Procentualna promena ukupnog adiponektina u plazmi od osnovne vrednosti je značajno povećana pomoću Jedinjenja 1 na dane 3 i 6 pri dozi od 10 mg/kg (P<0.001, oba dana). Pored toga, PEG-Jedinjenje 2 (1mg/kg) značajno je povećalo procenat promene ukupnog adiponektina u plazmi na dan 6 (P<0.001) (SL.67F).

Primer 19: Efekti na dijabetičnu bolest bubrega kod db/db miševa

[0670] Uninefrektomizovani (unix) db/db miševi su model glodara za dijabetičnu bolest bubrega (DKD - diabetic kidney disease) u kome hirurško uklanjanje jednog bubrega pogoršava i ubrzava povredu bubrega i disfunkciju koja je posledica dijabetesa tipa 2 (Ninichuk i sarad., Eur J Med Res 12:351-355 (2007)).

4-nedeljna studija

[0671] U ovoj studiji, db/db miševi u dobi od 8 nedelja bili su podvrgnuti levoj nefrektomiji u anesteziji sa 5% izoflurana da bi se ubrzao razvoj dijabetičke nefropatije. Tri nedelje nakon uninefrektomije, grupe od četrnaest uninefrektomiranih miševa raspoređene su ili na PEG-jedinjenje 2 ili na tretman transporteerom, na osnovu nasumičnog odabira odnosa albumina i kreatinina u urinu (uACR), glukoze u krvi i telesne težine u tom redosledu. Grupa db/m mršavih miševa (n = 12) dodeljena je kao normalna kontrola bez dijabetesa. Tretman ili PEG-jedinjenjem 2 ili transporterom kod neinefrektomizovanih db/db miševa započeo je tri nedelje posle operacije.

0.15 mg/kg PEG-jedinjenja 2 primenjivano je dva puta nedeljno (BIV) supkutanom (SC) injekcijom u transporteru koji sadrži 250 mM saharoze, 20 mM Tris, pH 8.3. Početni uzorci krvi prikupljeni su retro-orbitalnim krvarenjem pod anestezijom sa 5% izoflurana. Višestruke trosatne kolekcije spot urina za merenje glukoze u urinu, albumina i kreatinina dobijene su od svakog miša na početku i nakon 2, 3 i 4 nedelje tretmana.

[0672] Miševi su žrtvovani u anesteziji izofluranom nakon četiri nedelje lečenja. Statistička analiza podataka izvršena je korišćenjem jednosmerne analize varijanse (ANOVA) praćene Dunnett-ovim testom, ukoliko nije drugačije naznačeno (JMP softver za statističku analizu, SAS, Cary, NC). Statistička značajnost je utvrđena pri verovatnoći (P) <0.05. Četiri miša u grupi unix db/db sa transporterom izuzeta su iz analiza podataka (osim za potrošnju hrane i vode) jer su imali teški pijelonefritis.

[0673] Grupa sa PEG-Jedinjenjem 2 i grupa sa transporterom su prikazale slične nivoe glukoze u plazmi (765 ± 42 naspram 815 ± 46, P > 0.05) na početku pre tretmana. Nakon četiri nedelje lečenja na kraju studije, glukoza u plazmi u grupi sa PEG-Jedinjenjem 2 je bila 23% niža ona od grupe sa transporterom (485 ± 39 naspram 629 ± 43, P < 0.05) (videti Tabelu 26).

Tabela 26. Lečenje PEG-Jedinjenjem 2 smanjilo je glukozu u krvi (mg/dL)<a>.

Grupa Početna glukoza u Terminalna glukoza u krvi

[0674] Nakon započinjanja lečenja sa PEG-Jedinjenjem 2, nivoi glukoze u krvi progresivno su se smanjili. Nivoi glukoze u urinu grupe sa PEG-Jedinjenjem 2 su prikazali značajna smanjenja od 71%, 73%, i 84% sa 2, 3 i 4 nedelje tretmana, redom, kada se poredi sa grupom sa transporterom (svi P < 0.05; Tabela 5).

Tabela 27. PEG-Jedinjenje 2 je smanjilo glukozu u urinu (mg/dL)<a>.

[0675] Mikroalbuminurija (Odnos albumina prema kreatininu u urinu (Urine Albumin to Creatinine Ratio - uACR) > 30 µg/mg) je prijavljena u literaturi kao jedan od najosetljivijih i specifičnih indikatora rane nefropatije kod pacijenata sa dijabetesom (videti Chae i sarad., J Korean Med Sci. 2012; 27: 784-787). Mikroalbumin je meren od 3 h od kolekcije spot urina i vrednosti su normalizovane na kreatinin urina. Nedijabetesni db/m mršavi miševi su imali srednje uACR vrednosti u opsegu od 21 do 37 µg/mg tokom trajanja studije (SL.68 i Tabela 28).

[0676] Tokom studije, uACR kod unix db/db miševa značajno je povećan od 23- do 62-struko (svi P < 0.05) u poređenju sa nedijabetesnim, mršavim db/m miševima (SL. 68 i Tabela 28). uACR grupe tretirane transporterom progresirao je od 838 ± 159 µg/mg na početku do 1341 ± 284 µg/mg nakon 4 nedelja (Tabela 28), u skladu sa progresivnom renalnom ozledom.

[0677] U poređenju sa grupom sa transporterom, PEG-Jedinjenjem 2-tretirani unix db/db miševi su prikazali značajna smanjenja uACR vrednosti od 49%, 53% i 66% sa 2, 3, i 4 nedelje tretmana, redom (svi P < 0.05; SL.68). uACR vrednosti nakon lečenja PEG-Jedinjenjem 2 su niže od onih merenih na početku pre tretmana (Tabela 28).

Tabela 28. PEG-Jedinjenje 2 je smanjilo uACR (µg/mg)<a>.

G

M

U ±

T U

J

[0678] Mokra težina bubrega odražava status renalne hipertrofije usled hiper-filtracije kod dijabetes melitusa. Srednja vrednost težine bubrega je bila značajno veća kod unix db/db miševa u poređenju sa nedijabetičnim mršavim miševima, sa 59% porastom težine bubrega unix db/db miševa tretiranih sa transporterom. Lečenje sa PEG-Jedinjenjem 2 tokom četiri nedelje značajno je inhibiralo porast težine bubrega kod dijabetičnih miševa (286 ± 6.3 naspram 253 ± 7.4, Transporter naspram PEG-Jedinjenja 2, P < 0.05).

8-nedeljna studija

[0679] U 8 nedelja starosti, db/db miševi su podvrgnuti levoj nefrektomiji pod 3% izofluranom u kiseoniku da se ubrza razvoj dijabetesne nefropatije. Tri nedelje nakon uninefrektomije, grupe od četrnaest uninefroktomizovanih miševe su blokirane, randomizovane, i distribuirane ili lečenju sa PEG-Jedinjenjem 2 pri 0.15 mg/kg ili 0.015 mg/kg ili transporterom, zasnovano na odnosu albumina ka kreatininu u urinu (uACR), glukozi u krvi, i težinama tela tim redom. A Grupa db/m mršavih miševa (n=11) je dodeljena kao nedijabetična normalna kontrola. Dva puta nedeljno subkutano lečenje sa PEG-Jedinjenjem 2 bilo pri 0.15 bilo 0.015 mg/kg ili transporterom kod unix db/db miševa je započeto tri nedelje nakon operacije. Miševi su žrtvovani pod 3% izofluranom u kiseoniku praćeno cervikalnom dislokacijom nakon osam nedelja lečenja. Bubrezi su izrezani, dekapsulirani, i odmereni.

[0680] Grupa sa dozom od 0.015 mg/kg nije pokazala bilo kakvo značajno smanjenje glukoze u krvi ili poboljšanje renalnih parametara. Doza PEG-Jedinjenja 2 od 0.15 mg/kg je značajno smanjila nivoe glukoze u krvi i urinu, i smanjila je albuminuriju za ∼50%, u poređenju sa onom kod miševa tretiranih sa transporterom (svi P < 0.05). Klaster inflamatornih i fibrotičnih gena je značajno povećana u bubrezima uninefrektomizovanih db/db miševa naspram mršavih miševa, i lečenje sa PEG-Jedinjenjem 2 pri 0.15 mg/kg značajno je smanjilo eksprimiranje ovih gena prema nivoima viđenim kod mršavih db/m kontrolnih miševa. Srednja vrednost mokre težine bubrega je bila takođe značajno viša kod uninefrektomizovanih db/db miševa u poređenju sa onom kod mršavih mišeava, i lečenje sa PEG-Jedinjenjem 2 pri 0.15 mg/kg tokom 57 dana značajno je smanjilo srednju vrednost mokre težine bubrega u poređenju sa transporterom.

[0681] Isečci iz srednje 1/3 bubrega su obojeni hematoksilinom i eozinom za histološku analizu. Lezije bubrega su ocenjene prema kriterijumima definisanim u napomenama uz Tabelu 29. Svi unix db/db miševi su eksprimirali mezangijalnu glomerulopatiju, što je očekivani fenotip ovog modela (Tabela 29). Ispostavilo se da lečenje PEG-Jedinjenjem 2 pri 0.15 mg/kg, ali ne pri 0.015 mg/kg, smanjuje težinu mezangijalne glomerulopatije. Nekoliko unix db/db miševa je ispoljilo tubularno-intersticijalne lezije sekundarno na glomerulopatiju, što je u skladu sa osnovnom patogenezom modela.

[0682] Ova zapažanja obezbeđuju dokaz da je PEG-Jedinjenje 2 pri 0.15 mg/kg renoprotektivno u uslovima hroničnog dijabetesa tipa 2.

Tabela 29. PEG-Jedinjenje 2: Incidenca i stepen bubrežnih lezija.

Primer 20. Efekti na kardijalnu hipertrofiju i kardijalnu fibrozu kod Balb/C miša kome je data infuzija izoproterenola

[0683] Balb/c miš kome je data infuzija izoproterenola (Izo) je model glodara za kardijalnu fibrozu i hipertrofiju.

[0684] Mužjaci Balb/c miševa u 10 do 12 nedelja su randomizovani na osnovu telesne težine pre administracije leka. Izo ili transporter (0.02 % askorbinaska kiselina u fiziološkom rastvoru) je administriran subkutano putem osmotske mini-pumpe tokom 3 nedelje. Miševi su istovremeno dozirani dva puta nedljno (BIW) sa 0.5 mg/kg PEG-Jedinjenja 2 ili transportera tokom 3 nedelje. Životinje su zatim eutanazirane i srca su im uklonjena na velikim sudovima i lagano sušena upijanjem da bi se uklonila bilo kakva krv u komorama i potom izmereni. Od preostala 24 miša u svakoj grupi, celo srce je zamrznuto na suvom ledu i čuvano na ≤ -70°C za analizu hidroksiprolinom (HP).

[0685] Analiza HP sadržaja u srcu (krajnja tačka srčane fibroze) je izvedena primenom test kita za ukupni kolagen prema uputstvima proizvođača (Quickzyme Biosciences, Holandija).

[0686] Na kraju 3-nedelje faze života, sadržaj HP u celom srcu je izmeren. Normalizovan HP sadržaj je porastao 114% (P<0.05) u grupi sa Izo Transporterom (21.35 ± 0.81 µg/mg) u poređenju sa grupom sa Sham Transporterom (9.96 ± 0.38 µg/mg). Ovo je ukazalo da je srčana fibroza uspostavljena kao odgovor na Izo infuziju kod Balb/c miševa. Sadržaj HP u srcu kod miševa koji primaju Izo+ PEG-Jedinjenje 2 (0.5 mg/kg) (15.91 ± 0.49 µg/mg) je bio značajno manji nego kod životinja sa Izo Transporterom (SL. 69 i Tabela 30). Stoga, kada je administrirano u preventivnom režimu, PEG-Jedinjenje 2 (0.5 mg/kg) je smanjilo stopu srčane hipertrofije i fibroze.

[0687] Tabela 30. Sadržaj HP u srcu u nedelji 3 lečenja izoproterenolom i PEG-Jedinjenjem 2. Podaci predstavljaju sadržaj HP u celom srcu normalizovan na protein. Sve vrednosti su srednja vrednost ± S.E.M. *: P < 0.05, naspram Sham Transporter, **: P < 0.05, naspram Izo Transporter (jednosmerni ANOVA praćen Bonferroni-jevim testom).

[0688] Interventna studija je izvedena da se odredi da li 0.5 mg/kg PEG-Jedinjenja 2 može da odloži napredak ili preokrene prethodno uspostavljenu srčanu hipertrofiju i fibrozu kod Balb/c miševa koji su već primali infuziju Izo tokom 1 nedelje pre započinjanja 3 nedelje lečenja PEG-FGF21 varijantom. Intervencija PEG-Jedinjenjem 2 (0.5 mg/kg) je dovela do 24% smanjenja mase leve komore (LV) (krajnja tačka srčane hipertrofije procenjena ehookardiografijom). Ovo zapažanje je povezano sa značajnim, 14% gubitkom telesne težine i 23% povećanjem nivoa adiponektina u cirkulaciji. Nije primećena značajna razlika između grupa sa Izo Transporterom i Izo PEG-Jedinjenjem 2 u srčanoj fibrozi (sadržaju HP) ili sistolnoj srčanoj funkciji (mereno ehokardiografom).

Primer 21: Randomizovana, placebo-kontrolisana, studija pojedinačne i višestruke uzlazne doze za procenu bezbednosti, tolerancije, farmakokinetike i farmakodinamike PEG-Jedinjenja 2 kod zdravih subjekata

[0689] Studija se sastoji od tri dela: Deo A: Pojedinačna uzlazna doza (SAD; Deo B: Višestruka uzlazna dozau (MAD); i Deo C: Višestruko uzlazna doza kod japanskih ispitanika (J-MAD). PEGJedinjenje 2 ili placebo se administrira subkutanom injekcijom kao „slepo“ lečenje. Ispitanici u Delut A primaju jednu dozu „slepog“ lečenja a ispitanici u Delovima B i C primaju višestruke doze „slepog“ lečenja.

[0690] Početna doza od 0.6 mg PEG-Jedinjenja 2 u SAD je odabrana. Najviša doza od 60 mg u SAD i 60 mg nedeljno doziranje za MAD su takođe odabrane da se ispita viši kraj prognoziranog efikasnog doznog opsega. Ispitanik može da primi dozu od 0.6 mg, 2 mg, 6 mg, 20 mg, 40 mg, ili do 60 mg PEG-Jedinjenja 2 u SAD grupi. U MAD grupama, ispitanik može da primi nedeljnu dozu od 2 mg, 6 mg, 20 mg, 40 mg, ili 60 mg (QW ili BIW).

[0691] Zdravi muški i ženski ispitanici starosti 21-55 godina sa BMI između 30 i 40 (Delovi A i B) ili između 20 i 35 (Deo C) mogu biti uključeni.

Primarne krajnje tačke:

[0692] Cilj (procena bezbednosti i podnošljivosti pojedinačnih i višestrukih potkožnih doza PEG-Jedinjenja 2 kod zdravih ispitanika) meriće se sledećim bezbednosnim krajnjim tačkama: incidencija AE (neželjenih događaja), ozbiljni AE i događaji od posebnog interesa, uključujući procenu mesta ubrizgavanja, AE koji dovode do prekida i smrti, kao i izražene abnormalnosti u kliničkim laboratorijskim testovima, merenja vitalnih znakova, EKG-ovi, fizički pregledi koji počinju do 30 dana nakon poslednje doze ispitivanog leka.

Sekundarne krajnje tačke:

[0693] Deo A: Farmakokinetički parametri pojedinačne doze (Cmax, Tmax, AUC(0-T), AUC(INF), T-POLU, i CLT/F) izvedeni iz podataka o serumskoj koncentraciji C-Terminalno intaktnog PEG-Jedinjenja 2 naspram vremena, na dan pojedinačne doze lečenja i za do 4 nedelje ispiranja nakon pojedinačne doze.

[0694] Deo B i C: Farmakokinetički parametri višestruke doze (Cmax, Tmax, AUC(TAU) i indeks akumulacije (AI)) izvedeni iz podataka serumske koncentracije PEG-Jedinjenja 2 naspram vremena nakon prve doze i poslednje doze. T-POLU će se računati samo za poslednju dozu. Kocentracija u serumu na kraju doznog intervala (Ctrough) za PEG-Jedinjenje 2 će se dobiti na odabrane dane tokom vremena od 22 dana lečenja i za do 4 nedelje nakon poslednje doze.

Primer 22. Procena PEG-Jedinjenja 1, PEG-Jedinjenja 2, i Jedinjenja 170 u mišjem modelu NASH

[0695] Tri FGF-21 varijante, PEG-Jedinjenje 1, PEG-Jedinjenje 2, i Jedinjenje 170, testirane su u modelu za NASH sa 2 pogotka Stelic Instituta, opisanom iznad u Primeru 13. NASH je indukovan kod 40 mužjaka miševa jednom potkožnom injekcijom 200 µg streptozotocin rastvora 2 dana nakon rođenja i ishranom sa visokim sadržajem masti (HFD – high fat diet; 57% masti po kcal) nakon 4 nedelje starosti ("STAM miševi"). Miševima je administrirano 3 mg/kg PEG-Jedinjenja 1 (n=8), 0.5 mg/kg PEG-Jedinjenja 2 (n=8), 2.5 mg/kg Jedinjenja 170 (n=8), ili Transportera (20 mM Tris/250 mM sukroza, pH 8.3) (n=8), subkutanim putem dva puta nedeljno od 7- do 9-nedelje starosti. Ovi miševi su žrtvovani u 9-nedelja starosti radi raznih analiza. Druga grupa od osam miševa služila je kao osnovna kontrola i žrtvovana je u 7-nedelja starosti.

[0696] Koncentracije ukupnog i adiponektina visoke molekulske mase (HMW) su merene u terminalnim uzorcima seruma pripremljenim iz miševa primenom komercijalno dostupnog ELISA kita (Alpco kataloški broj 47-ADPMS-E01) prateći protokol proizvođača. U poređenju sa grupom sa transporterom, sve 3 FGF21 varijante značajno su povećale serumski ukupni adiponektin (SL.

70A) (p<0.0001 za PEG-Jedinjenje 1, PEG-Jedinjenje 2, i Jedinjenje 170), serumski HMW adiponektin (SL. 70B) (p<0.005, PEG-Jedinjenje 1; i p<0.0001, PEG-Jedinjenje 2, i Jedinjenje 170), i odnos HMW/ukupni adiponektin (SL. 70C) (p<0.05, PEG-Jedinjenje 1; i p<0.01, PEG-Jedinjenje 2, i Jedinjenje 170).

[0697] Telesna težina, težina jetre, trigliceridi u jetri, holesterol u jetri, i glukoza u plazmi, trigliceridi, i ALT nivoi su određeni. Sve tri FGF21 varijante značajno su smanjile telesnu težinu (SL. 72A), težinu jetre (SL.72B), odnos težine jetre i tela (SL.72C), trigliceride u jetri (SL.72D), i ALT u plazmi (SL. 72E). PEG-Jedinjenje 2 i Jedinjenje 170 značajno su smanjili holesterol u jetri (SL.72F), i PEG-Jedinjenje 2 značajno je smanjilo trigliceride u plazmi (SL.72G). Nijedno jedinjenje nije značajno smanjilo holesterol ili glukozu u plazmi (podaci nisu prikazani) u ovoj studiji.

Primer 23. Procena PEG-Jedinjenja 2 i Jedinjenja 170 tokom 3 nedelje BIW doziranja kod ob/ob miševa

[0698] Pegilovano jedinjenje 2 i Jedinjenje 170 su procenjeni u 21-dnevnoj studiji ponovljenog doziranja. Rezultati prikazuju da su oba jedinjenja izazvala smanjenja u težini jetre i dozno-zavisna smanjenja steatoze hepatocita u levom bočnom lobusu jetre, u poređenju sa transporterom.

[0699] Mužjaci ob/ob miševa (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) u 8. nedelji starosti su randomizirani u 5 grupa kao što je opisano u Primeru 12. Miševima su administrirani Transporter, Pegilovano jedinjenje 2 i Jedinjenje 170 subkutano dva puta nedeljno (BIW) kao što sledi (n=12 za svaku grupu): 1) Transporter (250 mM sukroza/20 mM Tris, pH 8.3); 2) Pegilovano jedinjenje 2, 8.14 nmol/kg (0.15 mg/kg); 3) Jedinjenje 170, 8.14 nmol/kg; 4) Pegilovano jedinjenje 2, 81.45 nmol/kg (1.5 mg/kg); i 5) Jedinjenje 170, 81.45 nmol/kg. Telesna težina, glukoza u plazmi, trigliceridi, insulin , neesterifikovane masne kiseline (NEFA), P-OH-butirat, ukupni adiponektin, i adiponektin visoke molekulske mase (HMW) su određeni tokom 21-dnevnog perioda doziranja u stanju nakon obroka. Glikozilirani hemoglobin (HbA1c) u punoj krvi je određen na početku i završetku studije. Težina jetre i trigliceridi u jetri su određeni na završetku studije. Histologija jetre je izvedena sa levim bočnim lobusom jetre da se proceni steatoza hepatocita. Tkivo je fiksirano u 10% puferovanom formalinu i obrađeno za histologiju. Preseci tkiva ugrađenih u parafin su obojeni hematoksilinom i eozinom primenom standardnih metoda. Prvih 6 miševa u svakoj grupi za lečenje je procenjeno (ukupno =30 miševa. Steatoza hepatocita (mikro- i makro-vezikularne masna promena) je uglavnom ograničena na zone II/III kod kontrolnih miševa; ovom stepenu steatoze je proizvoljno dodeljen stepen (ocena) 2. Drugi uzorci su ocenjeni slepo (ocena 0 dodeljena najnižem stepenu primećene steatoze). Dodatno, lipidno-opterećene perisinusoidne ćelije, verovatno zvezdaste (Ito) ćelije, su primećene kod miševa tretiranih bilo sa PEG-Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 170, ali ne Transporterom kod kojih su Ito ćelije zamaskirane steatozom hepatocita. Obilje Ito ćelija je procenjeno slopo (bez brojanja) i svaki uzorak je proizvoljno ocenjen da bi se obezbedila polu-kvantitativna procena (sa ocenom 3 koja ukazuje najveće obilje).

[0700] Obe doze oba jedinjenja značajno su smanjile glukozu nakon obroka na normoglikemijske nivoe (podaci nisu prikazani) i značajno smanjili insulin u plazmi i HbAlc (podaci nisu prikazani). Značajna povećanja adiponektina visoke molekulske mase (HMV) u odnosu na transporter primećena su od 8. do 21. dana, sa trendom zavisnosti od doze, dok je ukupni adiponektin u plazmi pokazao neka mala, ali nedosledna povećanja u odnosu na transporter (podaci nisu prikazani). NEFA u plazmi i β-OH-butirat su se povećali sa oba jedinjenja (posebno u velikoj dozi) u odnosu na transporter (podaci nisu prikazani), što ukazuje na povećanu oksidaciju masnih kiselina. Značajna smanjenja apsolutne težine jetre i težine jetre korigovane za telesnu težinu primećena su 21. dana u svim lečenim grupama (slike 71A i 71B). Konkretno, u sve četiri grupe koje su lečene varijantama FGF-21, apsolutna težina jetre je značajno smanjena (p <0.0001) u odnosu na transportersku kontrolu, a veća doza PEG-Jedinjenja 2 značajno je smanjila apsolutnu težinu jetre u odnosu na nižu dozu tog jedinjenja (p <0.05) (slika 71A). Pored toga, u sve četiri grupe lečene varijantama FGF-21, odnos težine jetre i telesne težine je značajno smanjen (p <0.0001) u odnosu na transportersku kontrolu (slika 71B). Smanjenje ozbiljnosti steatoze hepatocita zavisno od doze primećeno je kod miševa lečenih bilo PEG-jedinjenjem 2 ili jedinjenjem 170 u poređenju sa transporterom (tabela 31). Lipidno opterećene perisinusoidne ćelije (verovatno Ito ili hepatične zvezdaste ćelije) primećene su u presecima iz miševa tretiranih PEG-jedinjenjem 2 i jedinjenjem 170 (tabela 32), ali nisu mogle biti vizuelno prikazane u presecima iz miševa tretiranih transporterom zbog ometanja usled steatoze hepatocita. Smanjivanje jačine istaknutosti Ito ćelija zavisno od doze primećeno je u presecima iz miševa tretiranih ili PEG-jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 170.

Tabela 31. Ocene incidence steatoze hepatocita (masna promena) i histologije kod ob/ob miševa

Tabela 32. Ocene incidence perisinusoidnih lipidno opterećenih ćelija i histoligije kod ob/ob miševa.

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid sa SEQ ID NO:201 pri čemu je njegov paraacetil-fenilalanin ostatak povezan sa poli(etilen glikol) segmentom, za primenu u postupku lečenja bolesti koja je u vezi sa fibrozom odabranom od bezalkoholnog steatohepatitisa (NASH), fibroze jetre, i ciroze kod pacijenta.

2. Modifikovani FGF-21 polipeptid koji sadrži polipeptid sa SEQ ID NO:201 pri čemu je njegov paraacetil-fenilalanin ostatak povezan sa poli(etilen glikol) segmentom, za primenu u postupku lečenja ili sprečavanja NASH kod pacijenta.

3. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 2, pri čemu se leči NASH.

4. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 1, pri čemu navedena bolest koja je povezana sa fibrozom je ciroza.

5. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 1, pri čemu navedena bolest koja je povezana sa fibrozom je fibroza jetre.

6. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, pri čemu navedeni poli(etilen glikol) ima molekulsku masu između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa.

7. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 6, pri čemu navedeni poli(etilen glikol) ima molekulsku masu između oko 10 kDa i 40 kDa.

8. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 7, pri čemu navedeni poli(etilen glikol) ima molekulsku masu od oko 30 kDa.

9. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, koji dovodi do jedne ili više smanjenih frakcija masti u jetri i povećanih nivoa adiponektina kod navedenog pacijenta.

10. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava indeks masne jetre od najmanje oko 60.

11. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava procenat frakcije masti u jetri od najmanje 10%, što se po izboru određuje pomoću magnetnog rezonantnog snimanja.

12. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-8, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava NASH CRN fibrozni stadijum 1-3, što je po izboru NASH CRN fibrozni stadijum 1-3 određen pomoću biopsije jetre.

13. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, pri čemu je navedeni modifikovani FGF-21 polipeptid namenjen za administriranje subkutanom injekcijom.

14. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-13, pri čemu je navedeni modifikovani FGF-21 polipeptid namenjen za administriranje pri učestalosti od oko jednom dnevno; oko jednom nedeljno; oko dva puta nedeljno; oko jednom na dve nedelje; oko jednom na tri nedelje; ili jednom na četiri nedelje.

15. Polipeptid za primenu iz bilo kog od patentnih zahteva 1-14, pri čemu je navedeni modifikovani FGF-21 polipeptid namenjen za administriranje u dozi od između oko 0.05 mg/kg i oko 1 mg/kg telesne težine pacijenta.

16. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 3, pri čemu navedeni poli(etilen glikol) ima molekulsku masu od oko 30 kDa, i navedeni modifikovani FGF-21 polipeptid je namenjen za administriranje subkutanom injekcijom pri učestalosti od oko jednom dnevno; oko jednom nedeljno; oko dva puta nedeljno; oko jednom na dve nedelje; oko jednom na tri nedelje; ili jednom na četiri nedelje u dozi od između oko 0.05 mg/kg i oko 1 mg/kg telesne težine pacijenta.

17. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 16, koji dovodi do jedne ili više smanjenih frakcija masti u jetri i povećanih nivoa adiponektina kod navedenog pacijenta.

18. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 16, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava indeks masne jetre od najmanje oko 60.

19. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 16, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava procenat frakcije masti u jetri od najmanjet 10%, što se po izboru određuje magnetnim rezonantnim snimanjem.

20. Polipeptid za primenu iz patentnog zahteva 16, pri čemu pre lečenja pacijent ispoljava NASH CRN fibrozni stadijum 1-3, koji je po izboru NASH CRN fibrozni stadijum 1-3 određen biopsijom jetre.