DE69935220T2

DE69935220T2 - Von menschlichem tumor stammendes polypeptidhormon phosphatonin

Info

Publication number: DE69935220T2
Application number: DE69935220T
Authority: DE
Inventors: Peter Rowe
Original assignee: University College London
Current assignee: University College London
Priority date: 1998-05-18
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2019-05-19
Also published as: TWI227734B; CN1308677A; AU4362499A; US20070184461A1; DK1086225T3; JP4424575B2; JP2002515232A; AU765349B2; US20070185010A1; DE69935220D1; ES2281964T3; US20080097082A1; US7271151B2; US20080113428A1; US7459300B2; EP1086225B1; EP1086225A2; US7655760B2; CA2329054A1; MXPA00011272A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das an der Regulation des Phosphatstoffwechsels, insbesondere an der Hochregulation des Natriumabhängigen Phosphat-Cotransports, beteiligt ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein neues Polypeptid, das durch einen metastatischen Tumor ausgeschiedene phosphaturische Element („Metastatic-Tumour Excreted Phosphaturic Element", MEPE) oder „Phosphatonin". Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Gene und Polynucleotide, welche Phosphatonin-Polypeptide codieren, sowie Vektoren, Wirtszellen, Antikörper, die gegen Phosphatonin-Polypeptide gerichtet sind, und die Rekombinationsverfahren zu ihrer Herstellung. Ferner werden diagnostische Verfahren zum Nachweisen von mit dem Phosphatstoffwechsel zusammenhängenden Störungen und therapeutische Verfahren zum Behandeln solcher Störungen beschrieben. Weiterhin werden hier Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten der Phosphatonin-Aktivität beschrieben.
Mehrere Dokumente werden im Text dieser Beschreibung zitiert. Es handelt sich jedoch um kein Eingeständnis, dass ein beliebiges zitiertes Dokument tatsächlich einen bekannten Stand der Technik bezüglich der vorliegenden Erfindung darstellt.
Hintergrund der Erfindung
Phosphat spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen grundlegenden Prozessen, die für die Zelle und die Mineralisation des Knochens essentiell sind. Insbesondere ist die Mineralisation des Skeletts von der Regulation von Phosphat und Calcium im Körper abhängig, und irgendwelche Störungen in der Phosphat-Calcium-Homöostase können gravierende Auswirkungen auf den Aufbau des Knochens haben. In der Niere geht das Phosphat passiv in das Glomerulumfiltrat verloren und wird über einen Natrium-(Na⁺) abhängigen Phosphat-Cotransporter aktiv resorbiert. Im Darm wird Phosphat aus Nahrungsmitteln absorbiert. Es wurde gefunden, dass ein Natrium-(Na⁺) abhängiger Phosphat-Cotransporter im Darm exprimiert wird, und kürzlich wurde er cloniert (Hilfiker, PNAS 95 (24), (1998), 14564–14569). Leber, Haut und Niere sind an der Umwandlung von Vitamin D₃ zu seinem aktiven Stoffwechselprodukt Calcitriol beteiligt, das eine aktive Rolle in der Aufrechterhaltung des Phosphatgleichgewichts und der Knochenmineralisation spielt.
Vitamin-D-Mangel bewirkt bei Kindern Rachitis und bei Erwachsenen Osteomalazie. Beide Leiden sind durch eine gestörte Calcifikation des Osteoids gekennzeichnet, das die Matrix des Knochens darstellt. Es gibt auch verschiedene, nicht mit der Ernährung zusammenhängende Zustände, die zu Rachitis führen können, umfassend X-gebundene Vitamin-D-resistente hypophosphatämische Rachitis (HYP), hereditäre Hypercalcurie mit hypophosphatämischer Rachitis (HHRH), Dent-Krankheit, einschließlich bestimmter Typen des renalen Fanconi-Syndroms, renalen 1-α-Hydroxylase-Mangel (VDDR I), Defekte im 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D3-Rezeptor (Endorgan-Resistenz, VDDR II) und onkogene hypophosphatämische Osteomalazie (OHO). Somit wurden verschiedene familiäre Krankheiten charakterisiert, die zu Störungen der Phosphataufnahme, des Vitamin-D-Stoffwechsels und der Knochenmineralisation führen. Kürzlich wurde ein Gen cloniert und charakterisiert, das in Patienten mit X-gebundener hypophosphatämischer Rachitis (PHEX) defekt ist (Francis, Nat. Genet. 11 (1995), 130–136; Rowe, Hum. Genet. 97 (1996), 345–352; Rowe, Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 539–549). Das PHEX-Gen ist ein Typ-II-Glycoprotein und ein Mitglied einer Familie (M13) von Zn-Metalloendopeptidasen. Es wurde vorgeschlagen, dass PHEX wirkt, indem es einen Faktor prozessiert, der in der Phosphat-Homöostase und Skelettmineralisation eine Rolle spielt (Rowe, Exp. Nephrol. 5 (1997), 355–363; Rowe, Current Opinion in Nephrology & Hypertension 7 (4) (1998), 367–376). Die onkogene hypophosphatämische Osteomalazie (OHO) ist in zahlreichen Punkten der HYP ähnlich, wobei eine überlappende Pathophysiologie vorliegt, jedoch unterschiedliche primäre Defekte zu sehen sind (Rowe, Exp. Nephrol. 5 (1997), 355–363; Rowe, Current Opinion in Nephrology & Hypertension 7 (4) (1998), 367–376; Drezner in: Primer on Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolismus (Hrsg. Favus, M. J.), 184–188 (Am. Soc. Bone and Min. Res., Kelseyville, CA, 1990). Osteomalazie ist das adulte Äquivalent von Rachitis, wobei ein entscheidendes Merkmal der durch Tumor erworbenen Osteomalazie die Erweichung der Knochen ist. Die erweichten Knochen verbiegen sich, dies führt zu O-Beinen und anderen damit zusammenhängenden Veränderungen, die an die familiäre Rachitis erinnern. Auch ein niedriges Serumphosphat und ein abnormer Vitamin-D-Stoffwechsel sind entscheidende Markmale, die dieses Krankheitsbild mit der HYP gemeinsam hat. Die durch Tumor erworbene Osteomalazie ist selten, und die Tumoren sind hauptsächlich mesenchymalen Ursprungs, wobei jedoch auch über eine Reihe anderer Tumortypen berichtet wurde (Rowe, Exp. Nephrol. 5 (1997), 355–363; Francis, Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism 11 (1997), 145–163; loakimidis, The J. Rheumatology 21 (6) (1994), 1162–1164; Lyles, Ann. Intern. Med. 93 (1980), 275–278; Rowe, Hum. Genet. 94 (1994), 457–467; Shane, Journal of Bone and Mineral Research 12 (1997), 1502–1511; Weidner, Cancer 59 (1987), 1442–1442). Die chirurgische Entfernung des Tumors (der Tumoren), sofern dies möglich ist, führt zum Verschwinden der Krankheitssymptome und zur Heilung der Knochen; dies legt nahe, dass (ein) zirkulierender) phosphaturische(r) Faktor (Faktoren) in der Pathogenese der Krankheit eine Rolle spielt (spielen). Außerdem bestätigen eine Hetero-Transplantation von Tumoren in Nacktmäuse (Miyauchi, J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (1988), 46–53), die Infusion von Kochsalzlösung-Extrakten in Ratten und Hunde (Aschinberg, J., Paediatr. 91 (1977), 56–60; Popovtzer, Clin. Res. 29 (1981), 418A (Zusammenfassung)) und die Verwendung von Tumor-konditioniertem Medium (TCM) von menschlichen und tierischen Nierenzelllinien alle, dass durch diese Tumoren ein zirkulierender phosphaturischer Faktor ausgeschieden wird.
Obwohl bestätigt wurde, dass es sich bei dem primären Defekt in der X-gebundenen Rachitis um eine mutierte Zn-Metalloendopeptidase handelt (PHEX), gibt es deutliche Hinweise darauf, dass (ein) zirkulierender) phosphaturische(r) Faktor (Faktoren) beteiligt ist (sind) (Ecarot, J. Bone Miner. Res. 7 (1992), 215–220; Ecarot, J. Bone Miner. Res. 10 (1995), 424–431; Morgan, Arch. Intern. Med. 134 (1974), 549–552; Nesbitt, J. Clin. Invest. 89 (1992), 1453–1459; Nesbitt, J. Bone Miner. Res. 10 (1995), 1327–1333; Nesbitt, Endocrinology 137 (1996), 943–948; Qiu, Genet. Res. Camb. 62 (1993), 39–43; Lajeunesse, Kidney Int. 50 (1996), 1531–1538; Meyer, J. Bone. Minen. Res. 4 (4) (1989), 523–532; Meyer, J. Bone. Minen. Res. 4 (1989), 493–500). Die überlappende Pathophysiologie von HYP und OHO spricht für die faszinierende Möglichkeit, dass es sein könnte; dass der Tumorfaktor bei normalen Personen durch das Produkt des PHEX-Gens prozessiert wird. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass eine proteolytische Prozessierung durch PHEX möglicherweise wirkt, indem entweder diese(r) nicht-definierte(n) phosphaturische(n) Faktor (Faktoren) abgebaut wird (werden) oder indem eine Phosphat-konservierende Kaskade aktiviert wird (Carpenter, Pediatric Clinics of North America 44 (1997), 443–466; Econs, Am. J. Physiol. 273 (1997), F489-F498; Glorieux, Arch. Pediatr. 4 (1997), 102s–105s; Grieff, Current Opinion in Nephrology & Hypertension 6 (1997), 15–19; Hanna, Current Therapy in Endocrinology & Metabolism 6 (1997), 533–540; Kumar, Nephrol. Dial. Transplant. 12 (1997), 11–13; Takeda, Ryoikibetsu Shokogun Shirizu (1997), 656–659). Somit ist die Clonierung und Charakterisierung des phosphaturischen Tumorfaktors unbedingt erforderlich, um irgendwelche Verbindungen zwischen der Tumor-Osteomalazie und der familiären X-gebundenen Rachitis und außerdem anderen Störungen im Phosphatstoffwechsel nachzuweisen.
Rowe et al. (1996) haben über Kandidaten-Protein(e) mit 56 und 58 kDa berichtet, die für die Vermittlung von renalen Defekten bei OHO verantwortlich sind (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Ein Patient mit OHO wurde durch Tumorentfernung behandelt, und außerdem wurden prä- und postoperative Antiseren des Patienten zur Identifizierung von Proteinen aus Tumor-konditionierten Medien mittels Western-Blotting eingesetzt. Jedoch wurden weder die Tumorzellen noch die Antiseren für die Öffentlichkeit verfügbar gemacht.
In einem Übersichtsartikel in Exp. Nephrol. 5 (1997), 335–363, diskutiert Rowe (1997) die vorstehenden Krankheiten und die Rolle des PHEX-Gens (das früher als das PEX-Gen bekannt war). Das Produkt des PHEX-Gens wurde als eine Zink-Metalloproteinase identifiziert. Bei Krankheitszuständen wie der familiären Rachitis führt ein defektes PHEX zu ungespaltenem Phosphatonin, dies würde eine Niederregulation des Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransporters und eine Hochregulation der renalen mitochondrialen 24-Hydroxylase zur Folge haben. Jedoch berichtete Rowe (1997) nicht über eine Reinigung von Phosphatonin. Somit wurde der Öffentlichkeit kein Quellenmaterial für Phosphatonin zur Verfügung gestellt. Außerdem war weder eine Reinigung noch eine Identifizierung und Charakterisierung von Phosphatonin möglich.
Somit besteht ein Bedarf für Polypeptide, welche den Phosphatstoffwechsel regulieren, da Störungen einer solchen Regulation möglicherweise an hypo- und hyperphosphatämischen Krankheiten, einschließlich Osteomalazie, insbesondere Osteoporose und Nierenversagen, beteiligt sind. Weiterhin besteht ein Bedarf, solche Polypeptide zu identifizieren und zu charakterisieren, die möglicherweise beim Nachweis, bei der Prävention und/oder bei der Korrektur solcher Krankheiten eine Rolle spielen und die möglicherweise zum Diagnostizieren solcher Krankheiten eingesetzt werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das den Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert und das von einem Polynucleotid codiert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) Polynucleotiden, die mindestens die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codieren, das die in SEQ ID NO: 2 (8) dargestellte Aminosäuresequenz umfasst;
(b) Polynucleotiden, die die in SEQ ID NO: 1 (8) dargestellte codierenden Sequenz umfassen, die mindestens die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codiert;
(c) Polynucleotiden, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) hybridisieren und die ein Polypeptid codieren, das Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, dessen Sequenz eine Identität von 60 % oder mehr zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) codiert wird, wobei das Polypeptid Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(e) Polynucleotiden, die ein Fragment eines Polypeptids codieren, das von dem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(f) Polynucleotiden, die einen Epitop-tragenden Teil eines Phosphatonin-Polypeptids codieren, umfassend die Aminosäurereste von 1 bis 40, 141 bis 180 und/oder 401 bis 429 von SEQ ID NO: 2 (8); und
(g) Polynucleotiden, deren Nucleotidsequenz aufgrund des genetischen Codes zu einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids gemäß einem der Teile (a), (b), (e) oder (f) degeneriert ist;

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: 1(a) und (b) zeigen Chromatogramme mit Niederaffinitäts- bzw. Hochaffinitäts-Protein-enthaltenden Peaks aus einer Concanavalin-A-Säule.
2: Kationenaustausch-Chromatogramm von Fraktionen aus der Concanavalin-A-Säule.
3: Computer-Voraussage von Hydrophilie und Hydrophobie von Phosphatonin.
4: Computer-Voraussage von Antigenität von Phosphatonin.
5: Computer-Voraussage von Flexibilität von Phosphatonin.
6: Computer-Voraussage von Oberflächen-Wahrscheinlichkeit der Sekundärstruktur von Phosphatonin.
7: Computer-Voraussage der Sekundärstruktur von Phosphatonin.
8: Vollständige cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) und Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) des größten isolierten MEPE-Clons (pHO 11.1). Die fünf anderen isolierten Clone sind in diesem großen Clon enthalten, und alle Clone liegen im Raster mit dem Clonierungsvehikel pBSCPT SK II-. Die für die PCR eingesetzten Primer sind hervorgehoben, und die Gesamtzahl der Reste beträgt 430 bzw. 1655 bp. Der prokaryontische Expressionsvektor pCaI-n-EK enthielt alle im Raster liegenden Reste vom MEPE-Rest V bis zum MEPE-Stoppcodon (TAG) bei 1291-93 bp. Die einzelne Polyadenylierungssequenz AA{T/U}AAA ist doppelt unterstrichen. Die Region einer gemeinsamen lokalisierten Homologie mit DMA-1, DSSP und OPN ist mit Wellenlinie unterstrichen (MEPE-Motiv C-Terminus), RGD-Reste sind von einem Ellipsoid umschlossen, die Glycosaminoglycan-Anheftungsstelle ist mit einem Kästchen versehen (durchgezogene Linie), die Tyrosinkinase-Stelle ist einmal unterstrichen, N-Glycosylierungsmotive sind durch ein Kästchen mit einer gepunkteten Linie gekennzeichnet. Eine vollständige Liste von Motiven, einschließlich Caseinkinase II, Proteinkinase C usw., findet sich in Prosite Screen, Tabelle 1.
9: Voraussage der Sekundärstruktur der GCG-Peptidstruktur für MEPE. Das primäre Aminosäuregrundgerüst ist als zentrale Linie mit Kurven dargestellt, welche Regionen mit vorausgesagten Schleifen anzeigen. Hydrophilie/Hydrophobie-Regionen sind als Ellipsoide bzw. Rauten dargestellt, und das RGD-Motiv ist angegeben. Die N-Glycosylierungsstellen sind als Ellipsoide auf Stielen (C-Terminus) dargestellt, und die alpha-Helix ist durch wellenförmige Regionen auf dem primären Grundgerüst dargestellt.
10: Säulendiagramme, die die Phosphataufnahme in Gegenwart unterschiedlicher Mengen von MEPE zeigen: A: 92 ng/ml, B: 300 ng/ml, C: 500 ng/ml und D: 1000 ng/ml. Cholin-Kästchen beziehen sich auf die Kontrolle von Naunabhängigen Ergebnissen, wobei NaCl durch Cholinchlorid ersetzt ist. Fehlerbalken sind SEM, und die P-Werte für den Unterschied zwischen MEPE und der Kontrolle in C und D sind < 0,001. In Experiment A (92 ng/ml) P < 0,05, und in B (300 ng/ml) P, 0,01. Die N-Werte für A und B sind 4 und für C und D 5 bzw. 6. ANOVA wurde verwendet, gefolgt von dem Vergleichstest Newman-Keuls Multiple Comparison Test.
11: Dosiskurve von MEPE-Verabreichung und Phosphataufnahme mit SEM-Fehlerbalken.
12: Sequenz-Ähnlichkeitsanalyse unter Verwendung der mathematischen und Software-Werkzeuge „Sim" und Llanview (Duret, Comput. Appl. Biosci. 12 (1996), 507–510). In jeder Berechnung wurde der gap-open-Strafpunkt auf 12 und der gap-extension-Strafpunkt auf 4 gesetzt. Die Vergleichsmatrix für A war „PAM40" bzw. für B und C BLOSUM62 (vgl. Duret, Comput. Appl Biosci. 12 (1996), 507–510; Huang, Comput. Appl. Biosci. 8 (1992), 155–165; Huang, Comput. Appl. Biosci. 6 (1990), 373–381). Der Ähnlichkeits-Schwellenwert betrug in A 70 % bzw. in B und C 40 %. Die hervorgehobenen Blöcke, die auf jedem Proteinschema dargestellt sind, bedeuten Sequenzhomologien in A von > 80 % und in B und C von > 62 %. Es ist zu beachten, dass bei Vergleich von MEPE mit DSSP (A) in DSSP fünf Homologieblöcke mit einer Sequenzähnlichkeit von > 80 % zu einem einzelnen Motiv in MEPE (DSSESSDSGSSSES) vorliegen. Eine ähnliche Sequenzhomologie ist auch für DMA-1 und OPN im Vergleich mit MEPE (B und C) zu sehen, und das MEPE ist ein Merkmal aller drei Proteine.
13: Punktmatrix-Vergleich von DSSP und MEPE unter Verwendung der statistischen Analyse Antheprot (Deleague, G., Software for Protein Analysis: Antheroplot V2.5e. Microsoft Group (7 Passage du Vercours 69-367, Vercors Lyon Cedex 07, 1997)). In (A) wird ein Vergleich mit niedrigerer Stringenz mit einer Fenstereinstellung von 13 als Durchmusterungs-Parameter verwendet, und in (B) wird ein größeres Fenster von 15 verwendet. Die Farben geben Einheits-Matrix-Werte, wie auf dem Diagramm gezeigt, an. C-terminale Reste des MEPE-Motivs haben eine Sequenzhomologie von > 80 %, und die Wiederholungs-Natur des Motivs ist durch das Streifenmuster angegeben.
14: p1BL21 und auch p6XL1 sind rekombinante Plasmide, die ein Phosphatonin-Fusionskonstrukt enthalten. LacI: (lac-Promotor); LIC: (Ligierungsunabhängige Clonierungssequenz); EK: Enterokinase-Spaltstelle; Thrombin: Thrombin-Zielsequenz; Amp: Ampicillinresistenz; Cal-Peptid: Calmodulin-Peptidsequenz; Phosphatonin: Phosphatonin-codierende Sequenz.
Genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Hinsichtlich des Bedarfs von diagnostischen und therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Krankheiten, die mit Störungen im Phosphatstoffwechsel im menschlichen Körper zusammenhängen, besteht das technische Problem der Erfindung darin, Mittel und Verfahren für die Modulation des Phosphatstoffwechsels bereitzustellen, die insbesondere für die Behandlung von Knochenmineral- und Nierenkrankheiten eingesetzt werden können.
Das vorstehend definierte technische Problem wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, indem sie die in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitstellt. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein isoliertes Polypeptid, das eine Phosphatonin-Aktivität wie hier beschrieben besitzt.
Sofern nichts anderes angegeben ist, sind die hier verwendeten Begriffe definiert, wie in „A multilingual glossary of biotechnological terms; (IUPAC Racommendations)", Leuenberger, H. G. W., Nagel, B., und Kölbl, H., Hrsg., (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Schweiz, ISBN 3-906 390-13-6, beschrieben. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um bestimmte, in dieser Beschreibung verwendete Begriffe besser verständlich zu machen.
Die Begriffe „Behandlung", „Behandeln" und dergleichen werden hier so verwendet, dass sie im Allgemeinen bedeuten, dass eine gewünschte pharmakologische und/oder physiologische Wirkung erhalten wird. Die Wirkung kann prophylaktisch sein in dem Sinn, dass eine Krankheit oder ein Symptom davon vollständig oder teilweise verhindert wird, und/oder sie kann therapeutisch sein in dem Sinn, dass eine Krankheit und/oder ein der Krankheit zuzuschreibender nachteiliger Effekt teilweise oder vollständig geheilt wird. Der hier verwendete Begriff „Behandlung" deckt eine beliebige Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, insbesondere einem Menschen, ab und schließt ein: (a) Verhindern, dass die Krankheit in einem Individuum auftritt, das möglicherweise für die Krankheit prädisponiert ist, bei dem jedoch noch nicht diagnostiziert wurde, dass es die Krankheit hat; (b) Hemmen der Krankheit, d.h. Aufhalten ihrer Entwicklung; oder (c) Heilen der Krankheit, d.h. Bewirken des Zurückgehens der Krankheit. Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Patienten mit medizinischen Zuständen, die sich auf eine Störung des Phosphatstoffwechsels beziehen. Demgemäß würde eine Behandlung der Erfindung das Verhindern, Hemmen oder Heilen eines beliebigen medizinischen Zustands, der mit Störungen des Phosphatstoffwechsels zusammenhängt, umfassen.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich „isoliert" auf einen Stoff, der aus seiner ursprünglichen Umgebung (z.B. der natürlichen Umgebung, sofern er in der Natur vorkommt) entfernt wurde und der somit „durch die Hand des Menschen" aus seinem natürlichen Zustand verändert wurde. Z.B. könnte ein isoliertes Polynucleotid Teil eines Vektors oder einer Zusammensetzung von Stoffen sein, oder es könnte in einer Zelle enthalten sein und immer noch „isoliert" sein, da dieser Vektor, diese Zusammensetzung von Stoffen oder diese bestimmte Zelle nicht die ursprüngliche Umgebung des Polynucleotids darstellt.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung isolierte Phosphatonin-Polypeptid hat typischerweise ein ungefähres Molekulargewicht von 53 bis 60 kDa, stärker bevorzugt von 58 bis 60 kDa, bestimmt durch eine SDS-PAGE, insbesondere durch ein 12,5 % Gel bei pH 8,6 in Tris-Glycin-SDS-Puffer, vgl. Beispiel 1. Das ungefähre Molekulargewicht von 200 kDa kann durch eine Bis-Tris-SDS-PAGE bei pH 7 unter Verwendung eines 4–12 % Gradienten-Gels mit MOPS-Laufpuffer bestimmt werden. Auf einem solchen Gel kann man auch Banden mit niedrigerem Molekulargewicht von 53 bis 60 kDa sehen. Das Polypeptid ist im Allgemeinen glycosyliert und umfasst vorzugsweise Phosphatonin in einer im Wesentlichen reinen Form.
Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass das Phosphatonin unter Durchführung einer Reinigung gemäß dem in Beispiel 1 angegebenen Protokoll aus Saos2-Zellen erhalten werden kann, die von der European Collection of Cell Culture unter der Hinterlegungsnummer ECACC 89050205 verfügbar sind. Demgemäß wird hier die Verwendung von Saos2-Zellen oder HTB-96-Zellen für die Herstellung von Phosphatonin bereitgestellt. Auch andere transformierte oder immortalisierte Zelllinien wie transformierte Osteoblasten- oder Knochenzelllinien können in der Lage sein, Phosphatonin zu überexprimieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Charakterisierung und Clonierung eines Gens, das ein Kandidat für den vorstehend beschriebenen, von einem Tumor stammenden phosphaturischen Faktor ist und das mit Phosphatonin oder MEPE („Metastatic-Tumour Excreted Phosphaturic Element") bezeichnet wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine Expressions-Durchmusterung einer λ-ZAPII-cDNA-Bank verwendet wurde, die aus mRNA konstruiert wurde, welche aus einem OHO-Tumor extrahiert worden war, wobei Antiseren verwendet wurden, die für den phosphaturischen Faktor aus Tumor-konditionierten Medien (TCM) spezifisch waren. Das Protein ist glycosyliert und trennt sich auf einer SDS-PAGE-Elektrophorese in zwei Banden auf (58–60 kDa), wobei Hinweise für eine mögliche Spleißung oder posttranslationale Spaltung vorliegen. Die clonierte cDNA codiert ein Protein mit 430 Resten (SEQ ID NO: 2) und hat eine Länge von 1655 bp (SEQ ID NO: 1). Das gesamte 3'-Ende des Gens liegt vor, wobei ein Teil des 5'-Endes fehlt. Das Fusionsprotein, das zehn Reste von β-Galactosidase enthält, hemmt in einer menschlichen Nierenzelllinie (CL8) hochwirksam den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport. Die Voraussage der Sekundärstruktur bestätigt, dass das Protein stark hydrophil ist und dass kleine lokalisierte Regionen von Hydrophobie und keine Cysteinreste vorliegen. Eine Reihe von helikalen Regionen liegen vor, und zwei einzelne N-Glycosylierungsmotive sind am Carboxyterminus zu sehen. Ein wesentliches Merkmal ist das Vorliegen einer Zellanheftungssequenz im gleichen strukurellen Zusammenhang wie demjenigen, der im Osteopontin gefunden wird. Proteolytische Stellen in der Nachbarschaft dieses Motivs führen möglicherweise zu einer veränderten Rezeptorspezifität für spezifische Integrine, wie sie im Osteopontin gefunden wird. Die Durchmusterung der TrEMBL-Datenbank mit der MEPE-Sequenz zeigte außerdem eine Sequenzhomologie mit Dentin-Phosphoryn (DPP). Insbesondere liegt eine deutliche lokalisierte Reste-Sequenzhomologie am C-Terminus von MEPE mit DPP, Dentinmatrix-Protein-1 (DMA-1) und Osteopontin (OPN) vor. Diese Region von MEPE enthält eine sich wiederholende Reihe von Aspartat- und Serinresten (DDSSESSDSGSSSESD), mit einer Homologie von 80 %, 65 % und 62 % mit DSP, DMA-1 bzw. OPN. Wenn man außerdem den physikalisch-chemischen Charakter der Reste in Betracht zieht, steigt diese Homologie sogar auf 93 %, dies legt eine gemeinsame oder verwandte biologische Funktionalität nahe. Außerdem ist anzumerken, dass dieses Strukturmotiv sich mit einem Caseinkinase-II-Phosphorylierungsmotiv in MEPE überlappt. Bei Rachitis ist die Aktivität der Skelett-Caseinkinase-II defekt, und dies führt zu einer Unter-Phosphorylierung von Osteopontin (Rifas, Calcif. Tissue Int. 61 (1997), 256–259). Deshalb wurde vorgeschlagen, dass der Caseinkinase-II-Defekt bei der Unter-Mineralisierung von Knochenmatrix eine Rolle spielt (Rifas, loc. cit.).
Dentin-Phosphoryn (DPP) ist ein Teil eines Spaltprodukts, das von Dentin-Sialophosphoprotein (DSSP) stammt, wobei der andere Teil als Dentin-Sialoprotein (DSP) bekannt ist (MacDougall, J. Biol. Chem. 272 (1997), 835–842). Es ist von besonderem Interesse, dass DSSP, DMA-1, OPN und MEPE RGD-enthaltende Phosphoglycoproteine mit bestimmten Strukturähnlichkeiten und Hauptrollen in der Knochen/Zahn-Mineralisation sind (Linde, Crit. Rev. Oral Biol. Med. 4 (1993), 679–728).
Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene neue, von einem OHO-Tumor stammende phosphaturische Faktor, der mit Phosphatonin oder MEPE bezeichnet wird, bewirkt die Knochenmineral-Homöostase durch Regulieren von Na⁺-abhängigem Phosphat-Cotransport, Vitamin-D-Stoffwechsel und Knochenmineralisation.
Wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben wird, wurde ein Polynucleotid isoliert, das Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung codiert; vgl. Beispiel 2. Die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von Phosphatonin sind in 8 angegeben (SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2). Demgemäß umfasst das Polypeptid der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz von 8, gegebenenfalls einschließlich Mutationen oder Deletionen, welche die Aktivität davon im Wesentlichen nicht beeinflussen. Solche Mutationen umfassen Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren, insbesondere durch deren Homologe, und außerdem Additionen von einer oder mehreren Aminosäuren, insbesondere an den N- oder C-Termini. Deletionen umfassen Deletionen von den N- oder C-Termini. Substitutionen sind sowohl durch natürlich vorkommende als auch durch synthetische Aminosäuren möglich. Außerdem sind Polypeptide eingeschlossen, die durch chemische Modifikation oder enzymatische Modifikation modifiziert sind. Weiterhin sind im Umfang der vorliegenden Erfindung Fragmentpeptide eingeschlossen, die chemisch synthetisiert oder durch ein biologisches Verfahren hergestellt werden können und die modifiziert oder nicht-modifiziert sein können.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, das Natriumabhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert und das durch ein Polynucleotid codiert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) Polynucleotiden, die mindestens die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codieren, das die in SEQ ID NO: 2 (8) dargestellte Aminosäuresequenz umfasst;
(b) Polynucleotiden, die die in SEQ ID NO: 1 (8) dargestellte codierenden Sequenz umfassen, die mindestens die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codiert;
(c) Polynucleotiden, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) hybridisieren und die ein Polypeptid codieren, das Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, dessen Sequenz eine Identität von 60 % oder mehr zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) codiert wird, wobei das Polypeptid Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(e) Polynucleotiden, die ein Fragment eines Polypeptids codieren, das von dem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert;
(f) Polynucleotiden, die einen Epitop-tragenden Teil eines Phosphatonin-Polypeptids codieren, umfassend die Aminosäurereste von 1 bis 40, 141 bis 180 und/oder 401 bis 429 von SEQ ID NO: 2 (8); und
(g) Polynucleotiden, deren Nucleotidsequenz aufgrund des genetischen Codes zu einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids gemäß einem der Teile (a), (b), (e) oder (f) degeneriert ist.

In der Verwendung hier bezieht sich ein Phosphatonin-„Polynucleotid" auf ein Molekül mit einer Nucleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 enthalten ist oder die das Phosphatonin-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Z.B. kann das Phosphatonin-Polynucleotid die Nucleotidsequenz der vollständigen cDNA-Sequenz, einschließlich der 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen, die codierende Region, außerdem Fragmente, Epitope, Domänen und Varianten der Nucleinsäuresequenz enthalten.
Außerdem bezieht sich das hier verwendete Phosphatonin-„Polypeptid" auf ein Molekül, das die translatierte Aminosäuresequenz aufweist, die aus dem Polynucleotid, wie herkömmlich definiert, erzeugt wird.
Ein Phosphatonin-„Polynucleotid" schließt auch diejenigen Polynucleotide ein, die in der Lage sind, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Sequenzen zu hybridisieren, die in SEQ ID NO: 1 oder dem Komplement davon enthalten sind.
Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf eine Übernacht-Inkubation bei 42°C in einer Lösung, umfassend 50 % Formamid, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5x Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1x SSC bei etwa 65°C. Weitere geeignete Hybridisierungsbedingungen sind in den Beispielen beschrieben.
Änderungen in der Stringenz der Hybridisierung und Signalnachweis werden hauptsächlich erreicht durch die Manipulation der Formamid-Konzentration (niedrigere prozentuale Anteile von Formamid führen zu einer erniedrigten Stringenz); der Salzbedingungen oder der Temperatur. Z.B. schließen Bedingungen niedrigerer Stringenz eine Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung ein, umfassend 6x SSPE (20x SSPE = 3 M NaCl; 0,2 M NaH₂PO₄; 0,02 M EDTA, pH 7,4), 0,5 % SDS, 30 % Formamid, 100 μg/ml Lachssperma-Blockieungs-DNA,; gefolgt von Waschgängen bei 50°C mit 1x SSPE, 0,1 % SDS. Um außerdem eine noch niedrigere Stringenz zu erreichen, können Waschgänge nach der stringenten Hybridisierung bei höheren Salzkonzentrationen (z.B. 5x SSC) durchgeführt werden. Es ist anzumerken, dass Variationen in den vorstehenden Bedingungen durch die Zugabe und/oder Substitution anderer Blockierungsmittel, die zum Unterdrücken des Hintergrunds in Hybridisierungsexperimenten verwendet werden, erreicht werden können. Typische Blockierungsreagenzien schließen Denhardt-Reagens, BLOTTO, Heparin, denaturierte Lachssperma-DNA und kommerziell verfügbare, urheberrechtlich geschützte Formulierungen ein. Durch die Zugabe spezifischer Blockierungsreagenzien kann aufgrund von Problemen mit der Kompatibilität eine Modifikation der vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen erforderlich werden. Natürlich wäre ein Polynucleotid, das nur mit Poly-A⁺-Sequenzen (wie einer beliebigen 3'-terminalen Poly-A⁺-Region einer im Sequenzprotokoll dargestellten cDNA) oder mit einem komplementären Bereich von T- (oder U-) Resten hybridisiert, nicht in der Definition „Polynucleotid" eingeschlossen, da ein solches Polynucleotid mit einem beliebigen Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das einen Poly(A)-Bereich oder das Komplement davon enthält (z.B. praktisch jedem beliebigen doppelsträngigen cDNA-Clon).
Das Phosphatonin-Polynucleotid kann aus einem beliebigen Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid bestehen, das nicht-modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. Z.B. können Phosphatonin-Polynucleotide aus einzel- und doppelsträngiger DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngiger RNA, RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybridmolekülen, umfassend DNA und RNA, die einzelsträngig oder typischerweise eher doppelsträngig oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein können, bestehen. Außerdem können die Phosphatonin-Polynucleotide aus dreifachsträngigen Regionen bestehen, umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Phosphatonin-Polynucleotide können auch eine oder mehrere modifizierte Basen oder DNA- oder RNA-Grundgerüste enthalten, die aufgrund der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurden. „Modifizierte" Basen schließen z.B. tritylierte Basen und unübliche Basen wie Inosin ein. Eine Vielzahl von Modifikationen kann an DNA und RNA durchgeführt werden; somit schließt „Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen ein.
Phosphatonin-Polypeptide können aus Aminosäuren bestehen, die miteinander durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen verbunden sind, d.h. Peptid-Isostere, und können andere Aminosäuren als die 20 Gen-codierten Aminosäuren umfassen. Die Phosphatonin-Polypeptide können entweder durch natürliche Prozesse wie posttranslationale Prozessierung oder durch chemische Modifikationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, modifiziert werden. Solche Modifikationen sind in der Grundlagenliteratur und in ausführlicheren Abhandlungen sowie in einer umfangreichen Fachliteratur über Forschungsprojekte genau beschrieben. Modifikationen können an einer beliebigen Stelle im Phosphatonin-Polypeptid vorkommen, einschließlich des Peptidgrundgerüsts, der Aminosäureseitenketten und der Amino- oder Carboxytermini. Es ist so zu verstehen, dass der gleiche Typ von Modifikation in gleichen oder in verschiedenen Ausmaßen an mehreren Stellen in einem bestimmten Phosphatonin-Polypeptid vorliegen kann. Auch kann ein bestimmtes Phosphatonin-Polypeptid viele Arten von Modifikationen enthalten. Phosphatonin-Polypeptide können verzweigt sein, z.B. als Folge einer Ubiquitinierung, oder sie können ringförmig sein, mit oder ohne Verzweigung. Ringförmige, verzweigte oder verzweigte ringförmige Phosphatonin-Polypeptide können durch posttranslationale natürliche Prozesse zustande kommen, oder sie können durch synthetische Methoden erzeugt werden. Modifikationen schließen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Kopplung von Flavin, kovalente Kopplung einer Hämeinheit, kovalente Kopplung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente Kopplung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Kopplung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Ringbildung, Bildung von Disulfidbindung, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formulierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, Pegylierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Razemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermitteltes Anfügen von Aminosäuren an Proteine wie Arginylierung, und Ubiquitinierung ein; vgl. z.B. PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Aufl., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York (1983), Seiten 1–12; Seiften, Meth. Enzymol. 182 (1990), 626–646; Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992), 48–62. Z.B. ist es möglich, dass Phosphatonin als ein Präpro-Protein exprimiert wird und nach der Prozessierung der Prä-Sequenz und gegebenenfalls der Pro-Sequenz in zwei oder mehr Fragmente gespalten wird, die aufgrund der Bildung von z.B. Wasserstoffbindungen zusammen bleiben. Bei der Prozessierung und/oder Spaltung der Präpro- und sogar der reifen Form des Phosphatonin-Polypeptids kann es zum Verlust von einer oder mehreren Aminosäuren an der Spaltstelle kommen. Es ist so zu verstehen, dass alle solchen Formen des Phosphatonin-Proteins im Begriff „Phosphatonin-Polypeptid", „Polypeptid" oder „Protein" enthalten sind.
„SEQ ID NO: 1" bezieht sich auf eine Phosphatonin-Polynucleotidsequenz, während sich „SEQ ID NO: 2" auf eine Phosphatonin-Polypeptidsequenz bezieht.
Ein Phosphatonin-Polypeptid, „das eine biologische Aktivität besitzt", bezieht sich auf Polypeptide, die eine Aktivität zeigen, die zu einer Aktivität eines Phosphatonin-Polypeptids ähnlich ist, die jedoch nicht notwendigerweise damit identisch ist, wobei die Aktivität in einem bestimmten biologischen Test wie nachstehend beschrieben gemessen wird, wobei eine Dosisabhängigkeit vorliegen kann, jedoch nicht muss. In dem Fall, wenn eine Dosisabhängigkeit vorliegt, muss sie nicht zu derjenigen des Phosphatonin-Polypeptids identisch sein, sondern sie wird im Vergleich zu dem Phosphatonin-Polypeptid eher im Wesentlichen ähnlich sein im Hinblick auf die Dosisabhängigkeit bei einer bestimmten Aktvität (d.h. das Kandidat-Polypeptid wird eine größere Aktivität oder nicht mehr als eine etwa 25-fach geringere Aktivität und vorzugsweise nicht mehr als eine etwa zehnfach geringere Aktivität und am stärksten bevorzugt nicht mehr als eine etwa dreifach geringere Aktivität im Vergleich zu dem Phosphatonin-Polypeptid zeigen).
Der Begriff „immunologisch aktiv" oder „immunologische Aktivität" bezieht sich auf Fragmente, Analoga und Derivate des Phosphatonin-Polypeptids der Erfindung, dessen wesentliche charakteristische immunologische Eigenschaften in der Art unbeeinflusst bleiben, d.h. dass die Polynucleotide der Erfindung alle Nucleotidsequenzen einschließen, die Proteine oder Peptide codieren, die mindestens einen Teil der Primär- und/oder Sekundärstruktur-Konformation für ein oder mehrere Epitope aufweisen, die in der Lage sind, spezifisch mit Antikörpern zu reagieren, die für die Phosphatonin-Proteine einzigartig sind, welche durch ein Polynucleotid, wie vorstehend beschrieben, codiert werden. Vorzugsweise werden die durch ein Polynucleotid der Erfindung codierten Peptide und Proteine durch einen Antikörper erkannt, der spezifisch mit einem Epitop des Phosphatonin-Polypeptids, umfassend die Aminosäurereste von etwa 20 bis 30, 100 bis 130, 145 bis 160, 300 bis 310, 320 bis 340 oder 380 bis 430 von SEQ ID NO: 2, oder mit einem Epitop der hier nachstehend beschriebenen Phosphatonin-Polypeptide reagiert. Peptide/Antikörper der Reste 380 bis 430 sind besonders gut geeignet für die Untersuchung von Mineralisationsprozessen, Peptide/Antikörper der Reste 145 bis 160 für die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen (Intergins usw.), und die Reste 20 bis 30 und 100 bis 130 sind von besonderem Interesse für Untersuchungen der Phosphatregulation.
Vorzugsweise sind die immunologisch aktiven Phosphatonin-Peptidfragmente, Analoga und Derivate des Phosphatonin-Polypeptids der Erfindung in der Lage, in einem Säuger, vorzugsweise einer Maus oder Ratte, eine Immunantwort hervorzurufen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Phosphatonin-Polypeptid insofern biologisch aktiv, als es in der Lage ist, den Phosphatstoffwechsel zu regulieren oder modulieren, insbesondere reguliert es den Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hoch.
Phosphatonin-Aktivität
Der hier verwendete Begriff „in der Lage sein, den Phosphatstoffwechsel zu regulieren oder zu modulieren", bedeutet, dass das Vorliegen oder die Abwesenheit, d.h. der Spiegel, des Phosphatonin-Polypeptids der Erfindung in einem Individuum den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport, den Vitamin-D-Stoffwechsel und/oder die Knochenmineralisation moduliert. Insbesondere reguliert das Polypeptid der vorliegenden Erfindung den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport hoch, reguliert die 25-Hydroxy-Vitamin-D3-24-Hydroxylase nach unten und/oder reguliert die 25-Hydroxy-D-1-α-Hydroxylase hoch. Abhängig davon, ob die erwähnten Aktivitäten durch das Polypeptid der Erfindung hoch- oder herunterreguliert werden, wird die „Fähigkeit zum Regulieren oder Modulieren des Phosphatstoffwechsels" als „Phosphatonin-Aktivität" bzw. als „anti-Phosphatonin-Aktivität" bezeichnet.
Die Phosphatonin-Aktivität kann durch einen Routinetest gemessen werden, insbesondere als die Fähigkeit, den Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport herunterzuregulieren und/oder die renale 25-Hydroxy-Vitamin-D3-24-Hydroxylase hochzuregulieren und/oder die renale 25-Hydroxy-D-1-α-Hydroxylase herunterzuregulieren. In jedem Fall kann die Regulation der relevanten Enzymaktivität durch das Phosphatonin direkt oder indirekt bewirkt werden; z.B. durch Messung der radioaktiven Na-abhängigen Aufnahme von Phosphat. Diese Aktivitäten können unter Verwendung einer geeigneten renalen Zelllinie wie CL8 oder OK getestet werden (hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures unter ECACC 91021202). Ein geeignetes Testverfahren findet sich in Rowe et al. (1996). Die Phosphatonin-Aktivität kann weiterhin durch die Fähigkeit bestimmt werden, die Osteoblasten-vermittelte Mineralisation in Gewebekultur zu fördern; vgl. z.B. Santibanez, Br. J. Cancer 74 (1996), 418–422; Stringa, Bone 16 (1995), 663–670; Aronow, J. Cell. Physiol. 143 (1990), 213–221; oder wie in den beigefügten Beispielen beschrieben. Aus dem oben Gesagten folgt, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung „anti-Phosphatonin-Aktivität" hat.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das ein bioaktives Fragment des vorstehend beschriebenen Polypeptids umfasst. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass Phosphatonin möglicherweise als ein Polyhormon wirkt, welches in vivo gespalten werden kann, so dass ein oder mehrere Fragmente entstehen, von denen mindestens einige eine biologische Aktivität wie eine Hormonaktivität besitzen. Man nimmt an, dass Phosphatonin in vivo möglicherweise proteolytisch gespalten wird, z.B. durch das Produkt des PHEX-Gens, wodurch mindestens ein funktionelles Fragment produziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid, welches das bioaktive Fragment umfasst, in der Lage, den Phosphatstoffwechsel zu regulieren, indem es das Gegenteil der Phosphatonin-Aktivität besitzt, wie nachstehend noch genauer erörtert wird. Das bioaktive Fragment kann ein N-terminales, C-terminales oder inneres Fragment sein. Das Polypeptid, welches das bioaktive Fragment umfasst, kann weiterhin zusätzlich eine Aminosäuresequenz umfassen, mit der Maßgabe, dass die Aktivität des bioaktiven Fragments nicht wesentlich beeinflusst wird.
Es ist von Vorteil, wenn das bioaktive Fragment ein Zellanheftungsmotiv aufweist, welches vorzugsweise RGD umfasst. Wie nachstehend noch genauer besprochen wird, kann es sein, dass dieses Motiv an der Rezeptor- und/oder Knochenmineral-Matrix-Wechselwirkung beteiligt ist. Es ist von Vorteil, wenn das bioaktive Fragment ein Glycosaminoglycan-Anheftungsmotiv aufweist, das vorzugsweise SGDG (SEQ ID NO: 3) umfasst. Man geht davon aus, dass die Anheftung von Glycosaminoglycan es möglich macht, dass das Fragment einem Proteoglycan ähnelt. Proteoglycane sind dafür bekannt, dass sie an der Bioaktivität des Knochens, insbesondere an der Signalgebung der Zelle, beteiligt sind. Diese Motive werden nachstehend noch genauer erörtert.
Die Phosphatonin-Aktivität ist, ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, eine Aktivität, welche man in Phosphatonin, das nicht durch PHEX-Metalloproteinase gespalten wurde, und in einigen bioaktiven Fragmenten erwartet, welche eine PHEX-Metalloproteinase-Spaltstelle tragen, wie die Stelle ADAVDVS (SEQ ID NO: 4), wobei vorgeschlagen wird, dass die Spaltung zwischen den Resten VD (Reste 235 und 236) erfolgt. Das bioaktive Fragment kann mindestens die ersten 236 Reste der Aminosäuresequenz von 8 umfassen, so dass diese PHEX-Metalloproteinase-Spaltstelle ein Teil des Fragments ist.
Verwandte Proteine
Weitere Untersuchungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigten eine Reihe von deutlichen Ähnlichkeiten zwischen Phosphatonin (MEPE), Dentinmatrix-Protein-1 (DMP-1), Dentin-Sialo-Phosphoprotein (DSSP; insbesondere dem Dentin-Phosphoryn-C-Terminus), Knochen-Sialoprotein (BSP) und Osteopontin (OPN). Insbesondere haben alle vorstehend erwähnten Matrixproteine RGD-Motive, sind glycosyliert, wobei sie ungewöhnlich hohe Aspartat- und Serin-Gehalte aufweisen. Caseinkinase-II-Phosphorylierungsmotive sind ein gemeinsames Merkmal, und es gibt lokalisierte Regionen mit Homologie, die in jedem der Proteine vorliegen. Die Lanview-Sim-Analysen-SwissProt-Software (Duret; LANVIEW: A graphical viewer for pairwise sequence alignments; Comput. Biosci. 12 (1996), 507–510) erläutern grafisch die Regionen mit hoher Homologie als Punktmatrix-Vergleiche zwischen Phosphatonin und DSSP. Das Motiv wird in dem Dentin-Phosphoryn-(DP-) Teil von DSSP fünfmal wiederholt (12a), und dieses Motiv hat eine Homologie von 80 % zu einem C-terminalen Rest in Phosphatonin. Aufgrund von physikalisch-chemischen Parametern kann eine Homologie von 93 % hergeleitet werden, und diese Sequenzhomologie liegt in den anderen Knochen/Dentin-Molekülen vor, bei denen eine Sequenzähnlichkeit von 60 % bis 65 beschrieben wird. Außerdem liegt in der gleichen Region eine erweiterte Sequenzhomologie mit einer Abfolge von Resten zwischen DMA-1 und Phosphatonin vor, wie in Tabelle 2 und im nachstehenden Sequenzvergleich dargestellt:
Dentin-Sialo-Phosphoprotein (DSSP) ist ein großes RGD-enthaltendes Glycoprotein, das in vivo gespalten wird, wodurch zwei Proteine entstehen, die als Dentin-Sialoprotein (DSP) bzw. Dentin-Phosphoryn (DP) bekannt sind (MacDougall, J. Biol. Chem. 272 (1997), 835–842). DSP ist das N-terminale Peptid und DP das C-terminale Peptid, wobei man ursprünglich angenommen hat, dass beide von unterschiedlichen Genen stammen. In 13 ist ein statistischer Punktmatrix-Vergleich von Phosphatonin und DSSP bei Vergleich mit hoher und niedriger Stringenz dargestellt. Die Wiederholungs-Natur des „Motiv-Homologs" (DSSESSDSGSSSES (SEQ ID NO: 7)) in DSSP und seine frappierende Homologie wird in beiden grafischen Darstellungen deutlich gezeigt. Das Motiv liegt in MEPE nur einmal am C-Terminus vor. Außerdem wird eine Gesamt-Sequenzähnlichkeit auf niedrigem Niveau zu dem C-terminalen Teil von DSSP (oder der DP-Komponente) deutlich gezeigt. Somit kann man davon ausgehen, dass nun ein neues „einmaliges" Merkmal entdeckt wurde, das wahrscheinlich in Knochenmineral-Wechselwirkungen in der Knochen/Zahn-Matrix-Klasse von Proteinen eine Rolle spielt.
Folglich kann gesagt werden, dass alle besprochenen Proteine mit der extrazellulären Knochenmineral- oder Zahn-Matrix eine Einheit bildende Assoziationen zu erzeugen scheinen, und man geht davon aus, dass die Wechselwirkungen über Integrin/RGD-Assoziationen vermittelt werden. Außerdem wäre das neue regionale Motiv (reich an Serinen und Aspartat) ideal für Phosphat-Calcium-Wechselwirkungen. Hierdurch wird somit die Hypothese gestützt, dass der C-Terminus von Phosphatonin in der Knochenmineral-Homöostase und der N-Terminus in der renalen Phosphatregulation eine Rolle spielt. Zusammenfassend umfassen die gemeinsamen Merkmale der Proteine:

1. RGD-Motiv in einem ähnlichen strukturellen Zusammenhang;
2. Glycoproteine;
3. Reich an Aspartat und Serin;
4. Caseinkinase- und Proteinkinase-Motive;
5. Charakteristisches Aspartat-Serin-reiches MEPE-Motiv (wiederholt in DPP);
6. Große Zahl von Phosphorylierungsmotiven und Myristoylierungsmotiven;
7. Hinweise auf Spaltung und/oder alternatives Spleißen;
8. Alle assoziiert mit extrazellulärer Knochen- oder Zahn-Matrix.

Somit umfasst das Phosphatonin-Polypeptid in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das vorstehend beschriebene Knochenmineral-Motiv, vorzugsweise die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 oder 7 oder eine Aminosäuresequenz, die dieser entspricht, wie diejenigen aus den erwähnten Proteinen DMP-1, DSSP, BSP, OPN oder DMA-1.
Bioaktive Fragmente
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, welches das bioaktive Fragment umfasst, besitzt das Gegenteil der Phosphatonin-Aktivität und ist möglicherweise für die Behandlung von hypophosphatämischen Zuständen geeignet. In dieser Ausführungsform ist das Polypeptid direkt oder indirekt in der Lage, den Natriumabhängigen Phosphat-Cotransport hochzuregulieren und/oder die 25-Hydroxy-Vitamin-D3-24-Hydroxylase herunterzuregulieren und/oder die renale 25-Hydroxy-D- 1-Hydroxylase hochzuregulieren. Die erwähnten Aktivitäten werden hier auch als „anti-Phosphatonin"-Aktivität bezeichnet. Jedoch schließt die Verwendung des Begriffs „anti-Phosphatonin"-Aktivität nicht die Möglichkeit aus, dass es sich bei der Aktivität um diejenige handelt, die beim echten Phosphatonin im Phosphatstoffwechsel überwiegend vorliegt. Diese „anti-Phosphatonin"-Aktivitäten können auch einfach durch einen Test bestimmt werden, wobei das Verfahren von Rowe et al. (1996) verwendet wird, in welchem eine geeignete Nierenzelllinie eingesetzt wird, wie CL8 oder OK (hinterlegt bei European Collection of Cell Cultures unter ECACC 91021202); vgl. auch die vorstehend und in den beigefügten Beispielen angesprochenen Verfahren. Somit können die Phosphatonin-Polypeptide der Erfindung einfach auf Phosphatonin- oder „anti-Phosphatonin"-Aktivität gemäß den vorstehend angesprochenen oder hier noch weiter, z.B. in den angefügten Beispielen, beschriebenen Verfahren getestet werden. Vorzugsweise kann das Fragment durch proteolytische Spaltung von Phosphatonin durch eine PHEX-Metallopeptidase erhalten werden. Ein PHEX-Gen wurde cloniert, und es wurde gefunden, dass es eine Zink-Metallopeptidase codiert, wie in Rowe (1997) erörtert wird. Wieder wird angenommen, ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, dass, bezogen auf die Struktur, den bioaktiven Fragmenten, die diese Aktivitäten besitzen, mindestens ein Teil des N- oder C-terminalen Teils der Aminosäuresequenz von 8 fehlt, wobei vorzugsweise der C-terminale Teil bis zu mindestens der mutmaßlichen PHEX-Metalloproteinase-Spaltstelle an den Resten 235/236 fehlt. Dieses Polypeptid umfasst somit vorzugsweise nicht mehr als etwa die ersten 235 Reste der Aminosäuresequenz von 8.
Wie in Beispiel 4 erklärt wird, wurde das Phosphatonin-Polypeptid der Erfindung unter Verwendung einer Expressionsbank cloniert, in der die Ziel-cDNA mit einem Teil des β-Galactosidase-Enzyms fusioniert ist. In den auf diese Weise erhaltenen cDNAs war das N-terminale Methionin nicht enthalten. Jedoch verlockt dies zu der Voraussage, dass das echte Phosphatonin in seiner Aminosäuresequenz ein N-terminates Methionin aufweist. Deshalb schließt die Aminosäuresequenz des Polypeptids in einer Ausführungsform des Phosphatonin-Polypeptids der Erfindung die Aminosäure Met ein, die am N-Terminus angefügt ist.
In einer anderen Ausführungsform kann das Polypeptid der Erfindung Teil eines Fusionsproteins sein. Diese Ausführungsform wird nachstehend noch weiter erläutert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das ein Phosphatonin-Polypeptid, wie hier beschrieben, codiert. Ein solches Polynucleotid kann eine DNA wie eine cDNA oder eine RNA wie eine mRNA oder eine beliebige andere Form von Nucleinsäure, einschließlich synthetischer oder modifizierter Derivate, sein, und es kann das Polypeptid in einer fortlaufenden Sequenz oder in einer Reihe von Sequenzen, die durch dazwischen liegende Sequenzen („intervening sequences") unterbrochen sind, codieren. In welcher Form das Polynucleotid auch vorliegt, es ist ein isoliertes Polynucleotid, da es aus seinem natürlich-vorkommenden Zustand entfernt wurde. Dieser Aspekt der Erfindung beruht auf der Clonierung des Gens für menschliches Phosphatonin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynucleotid die Nucleotidsequenz von 8, gegebenenfalls einschließlich einer oder mehrerer Mutationen oder Deletionen, welche die Aktivität des dadurch codierten Polypeptids nicht wesentlich beeinflussen. Solche Mutationen schließen diejenigen ein, die durch die Degeneration des genetischen Codes zustande kommen, und außerdem diejenigen, aus denen irgendwelche der vorstehend angesprochenen Aminosäure-Mutationen oder -Deletionen hervorgehen. Demgemäß kann der Fachmann der Molekularbiologie unter Verwendung von Routineverfahren die Nucleotidsequenz von 8 einsetzen, um geeignete Polynucleotidsequenzen zu erzeugen, welche Polypeptide codieren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Wie vorstehend erwähnt, umfasst die vorliegende Erfindung auch Phosphatonin-Polynucleotide, in denen die Nucleotidsequenz aufeinanderfolgende Nucleotid-Deletionen entweder vom C-Terminus oder vom N-Terminus einschließen, etwa diejenigen, die nachstehend noch genauer beschrieben werden.
Verlängern der Polynucleotidsequenz der Erfindung
Wie in Beispiel 4 diskutiert wird, kann es sein, dass das durch die Expressionsbank erhaltene Phosphatonin-Polynucleotid am 5'-Ende nicht die volle Länge aufweist. Die Polynucleotidsequenzen, welche die Phosphatonin-Polypeptide codieren, können somit verlängert werden, indem eine partielle Nucleotidsequenz und verschiedene Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zum Nachweisen von stromaufwärts liegenden Sequenzen wie Promotoren und regulatorischen Elementen eingesetzt werden. Gobinda (PCR Methods Applic. 2 (1993), 318–322) beschreibt eine „Restriktionsstellen"-Polymerasekettenreaktion (PCR) als ein direktes Verfahren, bei dem universelle Primer eingesetzt werden, um eine an einen bekannten Locus angrenzende unbekannte Sequenz zu erlangen. Zuerst wird genomische DNA in Gegenwart eines Primers für eine Linkersequenz und eines Primers, der für die bekannte Region spezifisch ist, amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden einer zweiten Runde PCR mit dem gleichen Linker-Primer und einem anderen spezifischen Primer, der im Vergleich zum ersten weiter innen liegt, unterworfen. Die Produkte jeder PCR-Runde werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und unter Verwendung einer reversen Transkiptase sequenziert.
Die inverse PCR kann eingesetzt werden, um Sequenzen zu amplifizieren oder zu verlängern, wobei divergierende Primer verwendet werden, die auf einer bekannten Region beruhen (Triglia, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 8186). Die Primer können unter Verwendung von OLIGO^® 4.06 Primer Analysis Software (1992, National Biosciences Inc., Plymouth MN) oder eines anderen geeigneten Programms so entworfen werden, dass sie eine Länge von vorzugsweise 22 bis 30 Nucleotiden aufweisen, einen GC-Gehalt von vorzugsweise 50 % oder mehr zeigen und sich an die Zielsequenz bei Temperaturen von vorzugsweise etwa 68°C bis 72°C anlagern. In dem Verfahren werden verschiedene Restriktionsenzyme verwendet, um in der bekannten Region eines Gens ein geeignetes Fragment zu erzeugen. Danach wird das Fragment durch eine intramolekulare Ligierung zirkularisiert und als PCR-Matrize verwendet.
Die Einfang-PCR (Lagerstrom, PCR Methods Applic. 1 (1991), 111–119) ist ein Verfahren zur PCR-Amplifikation von DNA-Fragmenten, die an eine bekannte Sequenz angrenzen, z.B. in menschlicher künstlicher Hefechromosomen-DNA. Für die Einfang-PCR sind auch mehrere Restriktionsenzym-Spaltungen und Ligierungen erforderlich, um vor der PCR eine veränderte doppelsträngige Sequenz in einen unbekannten Teil des DNA-Moleküls einzufügen.
Ein weiteres Verfahren, das zur Gewinnung unbekannter Sequenzen eingesetzt werden kann, ist das Verfahren von Parker (Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055–3060). Außerdem kann man eine PCR, ineinander geschachtelte Primer und PromoterFinder-Banken einsetzen, um Walking in der genomischen DNA durchzuführen (PromotorFinder^TM Clontech (Palo Alto CA)). Durch diesen Prozess wird vermieden, dass Banken durchgemustert werden müssen, und außerdem ist dieser Prozess dafür geeignet, Intron/Exon-Übergänge zu finden. Bevorzugte Banken für die Durchmusterung von vollständigen cDNAs sind solche, die Größenselektiert wurden, so dass sie größere cDNAs enthalten. Außerdem sind mit Zufallsprimern hergestellte Banken deshalb bevorzugt, da sie mehr Sequenzen enthalten, welche die 5'- und stromaufwärts liegenden Regionen von Genen enthalten. Eine mit Zufallsprimern hergestellte Bank kann besonders dann geeignet sein, wenn eine Oligo-d(T)-Bank keine vollständige cDNA ergibt. Weiterhin kann eine direkte Sequenzierung von Primerverlängerungsprodukten eingesetzt werden. Genomische Banken eignen sich für die Verlängerung in die 5'-nicht-translatierte regulatorische Region. Kapillarelektrophorese kann eingesetzt werden, um die Größe zu analysieren oder die Nucleotidsequenz der Sequenzierung oder PCR-Produkte zu bestätigen; vgl. z.B. Sambrook, a.a.O.. Systeme für eine schnelle Sequenzierung sind von Perkin Elmer, Beckmann Instruments (Fullerton CA) und anderen Firmen verfügbar.
Computerunterstütze Identifizierung von Phosghatonin-Polypegtiden und ihren codierenden Genen
BLAST2, das für Basic Local Alignment Search Tool steht (Altschul, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 3389–3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290–300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403–410), kann eingesetzt werden, um nach lokalen Sequenz-Alignments zu suchen. BLAST erzeugt Alignments von sowohl Nucleotid- als auch Aminosäuresequenzen, um eine Sequenzähnlichkeit zu bestimmen. Aufgrund der lokalen Natur der Alignments ist BLAST besonders dafür geeignet, exakte Übereinstimmungen zu bestimmen oder Homologe zu identifizieren. Die zugrundeliegende Einheit für die Ausgabe des BLAST-Algorithmus ist das Segmentpaar mit hohen Werten („High Scoring Segment Pair", HSP). Ein HSP besteht aus zwei Sequenzfragmenten von beliebigen, jedoch gleichen Längen, deren Alignment lokal maximal ist und für die der Alignment-Wert einen durch den Anwender festgelegten Schwellenwert oder Ausschlusswert erfüllt oder übertrifft. Die Vorgehensweise von BLAST besteht darin, nach HSPs zwischen einer Abfrage-Sequenz und einer Datenbank-Sequenz zu suchen, die statistische Signifikanz von gefundenen Übereinstimmungen zu ermitteln und nur diejenigen Übereinstimmungen zu melden, die den vom Anwender gewählten Signifikanz-Schwellenwert erfüllen. Der Parameter E setzt den statistisch signifikanten Schwellenwert für das Melden von Datenbanksequenz-Übereinstimmungen fest. E wird als die obere Grenze der erwarteten Häufigkeit des zufälligen Auftretens eines HSP (oder eines Satzes von HSPs) im Zusammenhang der gesamten Datenbanksuche interpretiert. Eine beliebige Datenbank-Sequenz, deren Übereinstimmung E erfüllt, wird in der Ausgabe des Programms gemeldet.
Analoge Computerverfahren unter Verwendung von BLAST (Altschul, 1997, 1993 und 1990, vorstehend) werden eingesetzt, um in Nucleotid-Datenbanken wie GenBank oder EMBL nach identischen oder verwandten Molekülen zu suchen. Diese Analyse ist viel schneller als mehrere Membran-basierte Hybridisierungen. Außerdem kann die Empfindlichkeit der Computersuche modifiziert werden, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Übereinstimmung als exakt oder homolog einzustufen ist. Die Basis der Suche ist der Produkt-Wert, der definiert ist als
und berücksichtigt sowohl das Ausmaß an Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen als auch die Länge der Sequenzübereinstimmung. Z.B. wird die Übereinstimmung mit einem Produkt-Wert von 40 mit einem Fehler von 1 bis 2 % exakt sein; und bei 70 wird die Übereinstimmung exakt sein. Homologe Moleküle werden üblicherweise identifiziert, indem diejenigen ausgewählt werden, die Produkt-Werte zwischen 15 und 40 zeigen, wobei jedoch auch durch niedrigere Werte möglicherweise verwandte Moleküle identifizierten werden können.
Beispiele der verschiedenen möglichen Anwendungen der Phosphatonin-Polynucleotide und -Polypeptide gemäß der Erfindung und außerdem von Molekülen, die von ihren hergeleitet sind, werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
Phosphatonin-Polynucleotide und Polypeptide
Das Phosphatonin wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die aus mRNA konstruiert wurde, welche aus einem phosphaturischen mesenchymalen Tumor der Hirnhaut extrahiert worden war, der aus einem an onkogener hypophosphatämischer Osteomalazie leidenden Patienten reseziert worden war; vgl. Beispiel 4.
Die als SEQ ID NO: 1 identifizierte Phosphatonin-Nucleotidsequenz wurde aus teilweise homologen („überlappenden") Sequenzen zusammengesetzt, die aus verwandten DNA-Clonen erhalten wurden. Die überlappenden Sequenzen wurden zu einer einzelnen fortlaufenden Sequenz mit hoher Redundanz zusammengesetzt (üblicherweise drei bis fünf überlappende Sequenzen an jeder Nucleotidposition), dies führte zu einer endgültigen Sequenz, die als SEQ ID NO: 1 identifiziert wurde. Deshalb sind SEQ ID NO: 1 und die translatierte SEQ ID NO: 2 ausreichend genau und auf andere Weise geeignet für eine Vielzahl von Verwendungen, die dem Fachmann bekannt sind und nachstehend noch weiter beschrieben werden. Z.B. kann SEQ ID NO: 1 eingesetzt werden, um Nucleinsäure-Hybridisierungssonden zu entwerten, die in SEQ ID NO: 1 enthaltene Nucleinsäuresequenzen nachweisen können. Diese Sonden werden auch mit Nucleinsäuremolekülen in biologischen Proben hybridisieren, so dass es möglich wird, damit eine Vielzahl forensischer und diagnostischer Verfahren der Erfindung durchzuführen. Genauso können aus SEQ ID NO: 2 identifizierte Polypeptide eingesetzt werden, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an Phosphatonin binden. Trotzdem können die durch Sequenzierreaktionen erzeugten DNA-Sequenzen Sequenzierfehler enthalten. Die Fehler liegen als falsch definierte Nucleotide oder als Insertionen oder Deletionen von Nucleotiden in der erzeugten DNA-Sequenz vor. Die fehlerhaft inserierten oder deletierten Nucleotide bewirken Rasterverschiebungen in den Leserastern der vorausgesagten Aminosäuresequenz. In diesen Fällen unterscheidet sich die vorausgesagte Aminosäuresequenz von der tatsächlichen Aminosäuresequenz, auch wenn die erzeugte DNA-Sequenz zu der tatsächlichen DNA-Sequenz zu mehr als 99,9 % identisch ist (z.B. eine einzelne Basen-Insertion oder -Deletion in einem offenen Leseraster von über 1000 Basen).
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung für diejenigen Anwendungen, für die Genauigkeit in der Nucleotidsequenz oder der Aminosäuresequenz erforderlich ist, nicht nur die als SEQ ID NO: 1 identifizierte, erzeugte Nucleotidsequenz und die als SEQ ID NO: 2 identifizierte, vorausgesagte, translatierte Aminosäuresequenz bereit, sondern auch Mittel zur Clonierung der cDNA und genomischen DNA, die der Nucleotidsequenz in SEQ ID NO: 1 entsprechen. Die Nucleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen Phosphatonin-Clone kann einfach bestimmt werden, indem der Clon gemäß bekannten Verfahren sequenziert wird. Sodann kann die vorausgesagte Phosphatonin-Aminosäuresequenz aus solchen cDNA- oder genomischen Clonen verifiziert werden. Außerdem kann die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die erhaltenen Clone codiert wird, auch direkt bestimmt werden, indem das Peptid sequenziert oder das Protein in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird, das Protein gewonnen wird und seine Sequenz und Funktion gemäß den hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung das Phosphatonin-Gen, das SEQ ID NO: 1 entspricht. Das Phosphatonin-Gen kann gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung der hier offenbarten Sequenzinformationen isoliert werden. Solche Verfahren umfassen das Herstellen von Sonden oder Primern aus der offenbarten Sequenz und das Identifizieren oder Amplifizieren des Phosphatonin-Gens aus geeigneten Quellen genomischen Materials.
Außerdem werden in der vorliegenden Erfindung Art-Homologe von Phosphatonin bereitgestellt. Art-Homologe können isoliert und identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer aus den hier bereitgestellten Sequenzen hergestellt werden und eine geeignete Nucleinsäurequelle nach dem gewünschten Homolog durchgemustert wird.
Somit ist es durch Bereitstellung der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 und außerdem derjenigen Sequenzen, welche die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz codieren, möglich, identische oder ähnliche Nucleinsäuremoleküle, welche Phosphatonin-Proteine codieren, aus anderen Arten oder Organismen zu isolieren, insbesondere orthologe Phosphatonin-Gene aus Säugern, die keine Menschen sind. Der hier verwendete Begriff „ortholog" bedeutet homologe Sequenzen in unterschiedlichen Arten, die während der Artbildung aus einem gemeinsamen Vorfahren-Gen hervorgegangen sind. Orthologische Gene können für eine ähnliche Funktion verantwortlich sein, dies muss jedoch nicht so sein; vgl. z.B. das Glossar von „Trends Guide to Bioinformatics", Trends Ergänzung 1998, Elsevier Science.
Die Phosphatonin-Polypeptide können in einer beliebigen geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide umfassen isolierte, natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant hergestellte Polypeptide, synthetisch hergestellte Polypeptide oder Polypeptide, die durch eine Kombination dieser Verfahren produziert wurden. Verfahren zum Herstellen solcher Polypeptide sind dem Fachmann bekannt.
Phosphatonin-Polypeptide werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise im Wesentlichen rein. Eine rekombinant produzierte Version eines Phosphatonin-Polypeptids, einschließlich des ausgeschiedenen Polypeptids, kann durch das einstufige Verfahren, das in Smith und Johnson, Gene 67 (1988), 31–40, beschrieben ist, im Wesentlichen gereinigt werden. Phosphatonin-Polypeptide können auch aus natürlichen oder rekombinanten Quellen gereinigt werden, indem die gegen das Phosphatonin-Protein hervorgebrachten Antikörper der Erfindung eingesetzt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Polynucleotid- und Polypeptid-Varianten
„Variante" bezieht sich auf ein Polynucleotid oder Polypeptid, das sich vom Phosphatonin-Polynucleotid oder -Polypeptid unterscheidet, das jedoch wesentliche Eigenschaften davon beibehält, wie die immunologische und vorzugsweise die vorstehend angesprochene biologische Aktivität. Im Allgemeinen sind Varianten insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen mit dem Phosphatonin-Polynucleotid oder -Polypeptid identisch.
Solche Polynucleotide umfassen diejenigen, welche Fragmente und insbesondere Orthologe der vorstehend beschriebenen Phosphatonin-Proteine codieren, und unterscheiden sich z.B. anhand von Aminosäure- und/oder Nucleotid-Deletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Addition(en) und/oder Rekombination(en) oder beliebigen anderen dem Fachmann bekannten Modifikation(en), die entweder alleine oder in Kombination vorliegen, von den vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenzen oder der (den) ihnen zugrundeliegenden Nucleotidsequenz(en). Verfahren zum Einführen solcher Modifikationen in die Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung sind dem Fachmann bekannt. Alle solchen Fragmente, Analoge und Derivate des Proteins der Erfindung sind im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, so lange die wesentlichen charakteristischen immunologischen und/oder biologischen Eigenschaften, wie vorstehend definiert, in der Art unbeeinflusst bleiben.
Der Begriff „Variante" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich die Nucleotidsequenz dieser Polynucleotide bzw. die dadurch codierte Aminosäuresequenz von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Phosphatonin-Polynucleotide und -Polypeptide in einer oder mehreren Nucleotidpositionen unterscheiden und dass sie zu den Nucleinsäuremolekülen hoch-homolog sind. Homologie ist so zu verstehen, dass sie sich auf eine Sequenzidentität von mindestens 60 % bezieht, noch stärker bevorzugt von 70 %, insbesondere eine Identität von mindestens 80 %, vorzugsweise von mehr als 90 % und noch stärker bevorzugt von mehr als 95 %. Die Abweichungen von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle können z.B. das Ergebnis von Nucleotidsubstitution(en), Deletion(en), Addition(en), Insertion(en) und/oder Rekombination(en) sein; vgl. vorstehend. Weiterhin kann Homologie bedeuten, dass die entsprechenden Nucleinsäuremoleküle oder codierten Proteine in Funktion und/oder Struktur äquivalent sind. Die Nucleinsäuremoleküle, die zu den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen homolog sind und die Derivate der Nucleinsäuremoleküle sind, sind z.B. Variationen der Nucleinsäuremoleküle, die Modifikationen darstellen, welche die gleiche biologische Funktion aufweisen, wobei sie insbesondere Proteine mit der gleichen oder im Wesentlichen gleichen biologischen Funktion codieren. Es kann sich um natürlich vorkommende Variationen wie Sequenzen aus anderen Säugern oder um Mutationen handeln. Diese Mutationen können natürlich vorkommen, oder sie können durch Mutageneseverfahren erhalten werden. Die Allelvariationen können sowohl natürlich vorkommende Allelvarianten als auch synthetisch produzierte oder genetisch veränderte Varianten sein; vgl. vorstehend.
Mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens z.B. zu 95 % „identisch" ist zu einer Referenz-Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids zu der Referenzsequenz identisch ist, außer dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nucleotide der das Phosphatonin-Polypeptid codierenden Referenz-Nucleotidsequenz enthalten kann. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer Referenz-Nucleotidsequenz mindestens zu 95 % identisch ist, zu erhalten, können bis zu 5 % der Nucleotide der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nucleotid substituiert sein, oder eine Anzahl von Nucleotiden von bis zu 5 % der gesamten Nucleotide in der Referenzsequenz kann in die Referenzsequenz eingefügt sein. Die Abfrage-Sequenz kann eine vollständige Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, der ORF (offene Leseraster) oder ein beliebiges Fragment sein, das, wie hier beschrieben, spezifiziert ist.
In der Praxis kann die Frage, ob ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül oder Polypeptid zu einer Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung mindestens zu 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch ist, herkömmlicherweise durch Verwendung bekannter Computerprogramme geklärt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der besten Gesamt-Übereinstimmung zwischen einer Abfrage-Sequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer vorliegenden Sequenz, das auch als globales Sequenz- Alignment bezeichnet wird, kann unter Verwendung des Computerprogramms FASTDB erfolgen, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237–245) basiert. Bei einem Sequenz-Alignment sind die Abfrage- und vorliegenden Sequenzen jeweils DNA-Sequenzen. Eine RNA-Sequenz kann verglichen werden, indem Us zu Ts umgewandelt werden. Das Ergebnis des globalen Sequenz-Alignments liegt als prozentuale Identität vor. Bevorzugte Parameter, die in einem FASTDB-Alignment von DNA-Sequenzen verwendet werden, um die prozentuale Identität zu berechnen, sind: Matrix = Einheitsmatrix, „k-Tuple" = 4, Nicht-Übereinstimmungs-Strafpunkt („Mismatch Penalty") = 1, Verbindungs-Strafpunkt („Joining Penalty") = 30, Randomisierungs-Gruppen-Länge („Randomization Group Length") = 0, Ausschlusswert („Cutoff Score") = 1, Lücken-Strafpunkt („Gap Penalty") = 5, Lückengröße-Strafpunkt („Gap Size Penalty") = 0,5, Fenstergröße = 500 oder Länge der vorliegenden Nucleotidsequenz, je nachdem, welche kürzer ist.
Wenn die vorliegende Sequenz aufgrund von 5'- oder 3'-Deletionen, nicht aufgrund von inneren Deletionen, kürzer als die Abfrage-Sequenz ist, muss eine manuelle Korrektur der Ergebnisse durchgeführt werden. Dies ist deswegen, da das FASTDB-Programm keine 5'- und 3'-Verkürzungen der vorliegenden Sequenz berücksichtigt, wenn es die prozentuale Identität berechnet. Bei vorliegenden Sequenzen, die im Vergleich zur Abfrage-Sequenz an den 5'- oder 3'-Enden verkürzt sind, wird die prozentuale Identität korrigiert, indem die Anzahl der Basen der Abfrage-Sequenz, die 5' und 3' der vorliegenden Sequenz liegen und die nicht übereinstimmen/ausgerichtet („aligned") sind, als prozentualer Anteil der Gesamtbasen der Abfrage-Sequenz berechnet wird. Ob ein Nucleotid übereinstimmt/ausgerichtet ist, wird durch Ergebnisse des FASTDB-Sequenz-Alignment bestimmt. Anschließend wird dieser Prozentsatz von der prozentualen Identität subtrahiert, die durch das vorstehende FASTDB-Programm unter Verwendung der angegebenen Parameter berechnet wurde, wodurch ein endgültiger prozentualer Identitäts-Wert erhalten wird. Dieser korrigierte Wert ist derjenige Wert, der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Nur Basen außerhalb der 5'- und 3'-Basen der vorliegenden Sequenz, wie durch das FASTDB-Alignment dargestellt, die mit der Abfrage-Sequenz nicht übereinstimmen/ausgerichtet sind, werden zum Zweck der manuellen Anpassung des prozentualen Identitäts-Werts berechnet.
Z.B. wird eine aus 90 Basen bestehende vorliegende Sequenz an einer aus 100 Basen bestehende Abfrage-Sequenz ausgerichtet, um die prozentuale Identität zu bestimmen. Die Deletionen liegen am 5'-Ende der vorliegenden Sequenz vor, und deshalb zeigt das FASTDB-Alignment keine/kein Übereinstimmung/Alignment der ersten zehn Basen am 5'-Ende. Die zehn ungepaarten Basen stellen 10 % der Sequenz dar (Anzahl der Basen an den 5'- und 3'-Enden, die nicht übereinstimmen/Gesamtzahl der Basen in der Abfrage-Sequenz), deshalb werden 10 % von dem durch das FASTDB-Programm berechneten prozentualen Identitäts-Wert abgezogen. Wenn die restlichen 90 Basen perfekt übereinstimmen, würde die endgültige prozentuale Identität 90 % betragen. In einem anderen Beispiel wird eine aus 90 Basen bestehende vorliegende Sequenz mit einer aus 100 Basen bestehenden Abfrage-Sequenz verglichen. Dieses Mal sind die Deletionen innere Deletionen, so dass an den 5'- und 3'-Enden der vorliegenden Sequenz keine Basen vorliegen, die mit der Abfrage-Sequenz nicht übereinstimmen/daran ausgerichtet sind. In diesem Fall wird die durch FASTDB berechnete prozentuale Identität nicht manuell korrigiert. Wieder erfolgt die manuelle Korrektur nur für Basen 5' und 3' der vorliegenden Sequenz, die mit der Abfrage-Sequenz nicht übereinstimmen/daran ausgerichtet sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden keine anderen manuellen Korrekturen durchgeführt.
Mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu einer Abfrage-Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung mindestens z.B. zu 95 % „identisch" ist, ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des vorliegenden Polypeptids zu der Abfrage-Sequenz identisch ist, außer dass die vorliegende Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureänderungen pro jeweils 100 Aminosäuren der Abfrage-Aminosäuresequenz enthalten kann. Mit anderen Worten, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zu erhalten, die zu einer Abfrage-Aminosäuresequenz mindestens zu 95 % identisch ist, können bis zu 5 % der Aminosäurereste in der vorliegenden Sequenz eingefügt, deletiert, angefügt oder durch eine andere Aminosäure substituiert sein. Diese Änderungen der Referenzsequenz können an den amino- oder carboxyterminalen Positionen der Referenz-Aminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, wobei sie entweder einzeln unter Resten in der Referenzsequenz verstreut liegen können oder in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz vorliegen können.
In der Praxis kann die Frage, ob ein bestimmtes Polypeptid zu z.B. den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen mindestens zu 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch ist, üblicherweise durch Verwendung bekannter Computerprogramme geklärt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der besten Gesamt-Übereinstimmung zwischen einer Abfrage-Sequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer vorliegenden Sequenz, das auch als globales Sequenz-Alignment bezeichnet wird, kann unter Verwendung des Computerprogramms FASTDB erfolgen, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237–245) basiert. Bei einem Sequenz-Alignment sind die Abfrage- und vorliegenden Sequenzen beide Nucleotidsequenzen oder beide Aminosäuresequenzen. Das Ergebnis des globalen Sequenz-Alignments liegt als prozentuale Identität vor. Bevorzugte Parameter, die in einem FASTDB-Alignment von Aminosäuren verwendet werden, sind: Matrix = PAMO, „k-Tuple" = 2, Nicht-Übereinstimmungs-Strafpunkt („Mismatch Penalty") = 1, Verbindungs-Strafpunkt („Joining Penalty") = 20, Randomisierungs-Gruppen-Länge („Randomization Group Length") = 0, Ausschlusswert („Cutoff Score") = 1, Fenstergröße = Sequenzlänge, Lücken-Strafpunkt („Gap Penalty") = 5, Lückengröße-Strafpunkt („Gap Size Penalty") = 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der vorliegenden Aminosäuresequenz, je nachdem, welche kürzer ist.
Wenn die vorliegende Sequenz aufgrund von N- oder C-terminalen Deletionen, nicht aufgrund von inneren Deletionen, kürzer als die Abfrage-Sequenz ist, muss eine manuelle Korrektur der Ergebnisse durchgeführt werden. Dies ist der Fall, da das FASTDB-Programm keine N- und C-terminale Verkürzungen der vorliegenden Sequenz berücksichtigt, wenn es die prozentuale globale Identität berechnet. Bei vorliegenden Sequenzen, die im Vergleich zur Abfrage-Sequenz an den N- und C-Termini verkürzt sind, wird die prozentuale Identität korrigiert, indem die Anzahl der Reste der Abfrage-Sequenz, die N- und C-terminal der vorliegenden Sequenz liegen und die mit dem entsprechenden vorliegenden Rest nicht übereinstimmen/daran ausgerichtet sind, als prozentualer Anteil der Gesamtbasen der Abfrage-Sequenz berechnet wird. Ob ein Rest übereinstimmt/ausgerichtet ist, wird durch die Ergebnisse des FASTDB-Sequenz-Alignment bestimmt. Anschließend wird dieser Prozentsatz von der prozentualen Identität subtrahiert, die durch das vorstehende FASTDB-Programm unter Verwendung der angegebenen Parameter berechnet wurde, wodurch ein endgültiger prozentualer Identitäts-Wert erhalten wird. Dieser endgültige prozentuale Identitäts-Wert ist derjenige Wert, der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Nur Reste der N- und C-Termini der vorliegenden Sequenz, die nicht mit der Abfrage-Sequenz übereinstimmen/daran ausgerichtet sind, werden zum Zweck der manuellen Anpassung des prozentualen Identitäts-Werts berücksichtigt. D.h., nur Abfrage-Restepositionen außerhalb der weitesten N- und C-terminalen Reste der vorliegenden Sequenz.
Z.B. wird eine aus 90 Aminosäureresten bestehende vorliegende Sequenz an eine aus 100 Resten bestehende Abfrage-Sequenz ausgerichtet, um die prozentuale Identität zu bestimmen. Die Deletion finden am N-Terminus der vorliegenden Sequenz statt, und deshalb zeigt das FASTDB-Alignment keine Übereinstimmung/kein Alignment der ersten zehn Reste am N-Terminus. Die zehn ungepaarten Reste stellen 10 % der Sequenz dar (Anzahl der Reste an den N- und C-Termini, die nicht übereinstimmen / Gesamtzahl der Reste in der Abfrage-Sequenz), deshalb werden 10 % von dem durch das FASTDB-Programm berechneten prozentualen Identitäts-Wert abgezogen. Wenn die restlichen 90 Reste perfekt übereinstimmen, würde die endgültige prozentuale Identität 90 % betragen. In einem anderen Beispiel wird eine aus 90 Resten bestehende vorliegende Sequenz mit einer aus 100 Resten bestehenden Abfrage-Sequenz verglichen. Dieses Mal sind die Deletionen innere Deletionen, so dass an den N- und C-Termini der vorliegenden Sequenz keine Reste vorliegen, die mit der Abfrage-Sequenz nicht übereinstimmen/daran ausgerichtet sind. In diesem Fall wird die durch FASTDB berechnete prozentuale Identität nicht manuell korrigiert. Wieder erfolgt die manuelle Korrektur nur für Restepositionen außerhalb der N- und C-terminalen Enden der vorliegenden Sequenz, wie in dem FASTDB-Alignment dargestellt, die mit der Abfrage-Sequenz nicht übereinstimmen/daran ausgerichtet sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden keine anderen manuellen Korrekturen durchgeführt.
Die Phosphatonin-Varianten können Änderungen in den codierenden Regionen, nicht-codierenden Regionen oder in beiden enthalten. Insbesondere bevorzugt sind Polynucleotid-Varianten, die Änderungen enthalten, welche stumme Substitutionen, Additionen oder Deletionen produzieren, nicht jedoch die Eigenschaften oder Aktivitäten des codierten Polypeptids verändern. Nucleotidvarianten, die durch stumme Substitutionen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes erzeugt werden, sind bevorzugt. Außerdem sind Varianten bevorzugt, in denen 5 bis 10, 1 bis 5 oder 1 bis 2 Aminosäuren in einer beliebigen Kombination substituiert, deletiert oder angefügt sind. Phosphatonin-Polynucleotidvarianten können aus einer Vielzahl von Gründen hergestellt werden, z.B. um die Codonexpression für einen bestimmten Wirt zu optimieren (Ändern von Codons in der menschlichen mRNA zu denjenigen Codons, die von einem bakteriellen Wirt wie E. coli bevorzugt werden).
Natürlich vorkommende Phosphatonin-Varianten werden „Allelvarianten" genannt und beziehen sich auf eine von verschiedenen alternierende Formen eines Gens, das einen bestimmten Locus auf einem Chromosom eines Organismus besetzt. (Genes II, Lewin, B., Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985) und aktualisierte Versionen). Diese Allelvarianten können entweder auf Polynucleotid- und/oder Polypeptidebene variieren. Alternativ können nicht-natürlich-vorkommende Varianten durch Mutageneseverfahren oder durch direkte Synthese erzeugt werden.
Unter Verwendung bekannter Verfahren zur gezielten Veränderung von Proteinen und der DNA-Rekombinationstechnik können Varianten erzeugt werden, um die Eigenschaften der Phosphatonin-Polypeptide zu verbessern oder zu verändern. Z.B. können eine oder mehrere Aminosäuren vom N-Terminus oder C- Terminus des Proteins ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion deletiert werden. Die Autoren von Ron, J. Biol. Chem. 268 (1993), 2984–2988, berichteten über KGF-Proteinvarianten, die auch noch nach Deletion von 3, 8 oder 27 aminoterminalen Aminosäureresten eine Heparin-Bindungsaktivität aufwiesen. Genauso zeigte Interferon-gamma eine bis zu zehnmal höhere Aktivität, nachdem 8 bis 10 Aminosäurereste von dem Carboxyterminus dieses Proteins deletiert wurden (Dobeli, J. Biotechnology 7 (1988), 199–216).
Außerdem gibt es zahlreichen Hinweise darauf, dass Varianten häufig eine biologische Aktivität beibehalten, die zu derjenigen des natürlich vorkommenden Proteins ähnlich ist. Z.B. führten Gayle und Mitarbeiter (J. Biol. Chem. 268 (1993), 22105–22111) umfangreiche Mutationsanalysen des menschlichen Cytokins IL-1a durch. Sie verwendeten die Zufallsmutagenese, um über 3500 einzelne IL-1a-Mutanten zu erzeugen, die im Durchschnitt 2,5 Aminosäureänderungen pro Variante über die ganze Länge des Moleküls aufwiesen. Zahlreiche Mutationen wurden an jeder möglichen Aminosäureposition untersucht. Die Forscher fanden, dass „[d]er Großteil des Moleküls mit einem geringen Effekt entweder auf [die Bindung oder auf die biologische Aktivität] verändert werden konnte"; vgl. Zusammenfassung. Tatsächlich erzeugten nur 23 einmalige Aminosäuresequenzen aus den mehr als 3500 untersuchten Nucleotidsequenzen ein Protein, das sich in der Aktivität signifikant vom Wildtyp unterschied.
Außerdem kann es sein, selbst wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren von dem N-Terminus oder C-Terminus eines Polypeptids zu einer Modifikation oder zum Verlust von einer oder mehreren biologischen Funktionen führt, dass dann andere biologische Aktivitäten noch bestehen bleiben. Z.B. ist es wahrscheinlich, dass die Fähigkeit einer Deletionsvariante, Antikörper zu induzieren und/oder zu binden, welche das Protein erkennen, erhalten bleibt, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des Proteins vom N-Terminus oder C-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem N- oder C-terminate Reste eines Proteins fehlen, solche immunogene Aktivitäten beibehält, kann einfach durch Routineverfahren bestimmt werden, die hier beschrieben werden oder die dem Fachmann bekannt sind. Weiterhin können unter Verwendung des Programms PESTFIND (Rogers, Science 234 (1986), 364–368) PEST-Sequenzen (reich an Prolin, Glutaminsäure, Serin und Threonin) identifiziert werden, die charakteristischerweise in instabilen Proteinen vorliegen. Solche Sequenzen können aus den Phosphatonin-Proteinen entfernt werden, um die Stabilität und gegebenenfalls die Aktvität der Proteine zu erhöhen. Verfahren zum Einführen solcher Modifikationen in die Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung sind dem Fachmann bekannt.
Somit schließt die Erfindung ferner Phosphatonin-Polypeptidvarianten ein, die eine wesentliche biologische Aktivität zeigen. Solche Varianten schließen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Substitutionen ein, die gemäß den allgemeinen, dem Fachmann bekannten Regeln so ausgewählt sind, dass sie eine geringe Wirkung auf die Aktivität haben. Z.B. wird eine Anleitung bezüglich der Frage, wie man phänotypisch stumme Aminosäuresubstitutionen herstellt, in Bowie, Science 247 (1990), 1306–1310, bereitgestellt, worin die Autoren zeigen, dass es zwei Hauptstrategien gibt, um die Toleranz einer Aminosäuresequenz gegenüber einer Änderung zu untersuchen.
Die erste Strategie bewertet die Toleranz von Aminosäuresubstitutionen anhand der natürlichen Selektion während des Evolutionsprozesses. Durch Vergleich von Aminosäuresequenzen in unterschiedlichen Arten können konservierte Aminosäuren identifiziert werden. Diese konservierten Aminosäuren sind wahrscheinlich für die Funktion des Proteins wichtig. Im Gegensatz dazu zeigen die Aminosäurepositionen, an denen Substitutionen durch die natürliche Selektion toleriert wurden, dass diese Positionen für die Funktion des Proteins nicht kritisch sind. Somit könnten Positionen, die Aminosäuresubstitutionen tolerieren, modifiziert werden, während immer noch die biologische Aktivität des Proteins beibehalten wird.
Die zweite Strategie nutzt die Gentechnik, um Aminosäureänderungen an spezifischen Positionen eines clonierten Gens einzuführen, so dass auf diese Weise Regionen identifiziert werden können, die für die Funktion des Proteins kritisch sind. Z.B. kann eine positionsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Einführen von einzelnen Alanin-Mutationen an jedem Rest im Molekül) eingesetzt werden (Cunningham und Wells, Science 244 (1989), 1081–1085). Anschließend können die resultierenden mutierten Moleküle auf die biologische Aktivität getestet werden.
Wie die Autoren feststellen, haben diese zwei Strategien gezeigt, dass Proteine gegenüber Aminosäuresubstitutionen erstaunlich tolerant sind. Weiterhin zeigen die Autoren, bei welchen Aminosäureänderungen es wahrscheinlich ist, dass sie an bestimmten Aminosäurepositionen in dem Protein erlaubt sind. Z.B. benötigen die meisten eingegrabenen (innerhalb der Tertiärstruktur des Proteins) Aminosäurereste nicht-polare Seitenketten, wohingegen wenige Merkmale von Oberflächen-Seitenketten im Allgemeinen konserviert sind. Außerdem umfassen konservative Aminosäuresubstitutionen das Austauschen der aliphatischen oder hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Leu und IIe; das Austauschen der Hydroxylreste Ser und Thr; das Austauschen der sauren Reste Asp und Glu; das Austauschen der Amidreste Asn und Gln, das Austauschen der basischen Reste Lys, Arg und His; das Austauschen der aromatischen Reste Phe, Tyr und Trp und das Austauschen der kleine Aminosäuren Ala, Ser, Thr, Met und Gly.
Neben der konservativen Aminosäuresubstitution umfassen Varianten von Phosphatonin (i) Substitutionen mit einem oder mehreren der nicht-konservierten Aminosäurereste, wobei die substituierten Aminosäurereste einen Rest darstellen können, der durch den genetischen Code codiert wird, dies muss jedoch nicht der Fall sein, oder (ii) Substitutionen mit einem oder mehreren Aminosäureresten, die eine Substituentengruppe aufweisen, oder (iii) Fusion des reifen Polypeptids mit einer anderen Verbindung wie einer Verbindung, um die Stabilität und/oder Löslichkeit des Polypeptids zu erhöhen (z.B. Polyethylenglykol), oder (iv) Fusion des Polypeptids mit weiteren Aminosäuren wie einem IgG-Fc-Fusionsregion-Peptid oder einer Leader- oder sekretorischen Sequenz oder einer Sequenz, welche die Reinigung erleichtert. Solche Polypeptidvarianten sollten dem Fachmann anhand der hier gemachten Angaben geläufig sein.
Z.B. können Phosphatonin-Polypeptidvarianten, die Aminosäuresubstitutionen von geladenen Aminosäuren mit anderen geladenen oder neutralen Aminosäuren enthalten, Proteine mit verbesserten Eigenschaften wie weniger Aggregation produzieren. Die Aggregation von pharmazeutischen Formulierungen reduziert die Aktivität und erhöht außerdem aufgrund der immunogenen Aktivität des Aggregats die Clearance; vgl. z.B. Pinckard, Clin. Exp. Immunol. 2 (1967), 331–340; Robbins, Diabetes 36 (1987), 838–845; Cleland, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10 (1993), 307–377.
Polynucleotid- und Polypeptidfragmente
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein „Polynucleotidfragment" auf ein kurzes Polynucleotid, das eine in SEQ ID NO: 1 enthaltene Nucleinsäuresequenz aufweist. Die kurzen Nucleotidfragmente weisen vorzugsweise eine Länge von mindestens etwa 15 Nt. und stärker bevorzugt von mindestens etwa 20 Nt., noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 30 Nt. und sogar noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 40 Nt. auf. Ein Fragment mit „einer Länge von mindestens 20 Nt." soll z.B. 20 oder mehr aufeinander folgende Basen aus der cDNA-Sequenz einschließen, die in der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz enthalten ist. Diese Nucleotidfragmente eigenen sich als diagnostische Sonden und Primer, wie hier erörtert wird. Natürlich sind größere Fragmente (z.B. 50, 150, 500, 600, 1000 Nucleotide) bevorzugt.
Außerdem schließen repräsentative Beispiele von Phosphatonin-Polynucleotidfragmenten z.B. Fragmente mit einer Sequenz von etwa Nucleotid-Nr. 1 bis 50, 51 bis 100, 101 bis 150, 151 bis 200, 201 bis 250, 251 bis 300, 301 bis 350, 351 bis 400, 401 bis 450, 451 bis 500, 501 bis 550, 551 bis 600, 651 bis 700, 701 bis 750, 751 bis 800, 800 bis 850, 851 bis 900, 901 bis 950, 951 bis 1000, 1001 bis 1050, 1051 bis 1100, 1101 bis 1150, 1151 bis 1200, 1201 bis 1250, 1251 bis 1300 oder 1301 bis 1350 von SEQ ID NO: 1 ein. In diesem Zusammenhang schließt „etwa" die spezifisch angegebenen Bereiche ein, die entweder an einem Terminus oder an beiden Termini um einige (5, 4, 3, 2 oder 1) Nucleotide größer oder kleiner sein können. Vorzugsweise codieren diese Fragmente ein Polypeptid, das eine biologische Aktivität besitzt. Stärker bevorzugt können diese Polynucleotide als Sonden oder Primer, wie hier erörtert, eingesetzt werden.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich ein „Polypeptidfragment" auf eine kurze Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 enthalten ist. Proteinfragmente können „freistehend" sein, oder sie können in einem größeren Polypeptid enthalten sein, wobei das Fragment einen Teil oder eine Region davon darstellt, am stärksten bevorzugt können sie als eine einzelne fortlaufende Region vorliegen. Repräsenative Beispiel von Polypeptidfragmenten der Erfindung umfassen z.B. Fragmente von etwa Aminosäure-Nr. 1 bis 20, 21 bis 40, 41 bis 60, 61 bis 80, 81 bis 100, 101 bis 120, 121 bis 140, 141 bis 160, 161 bis 180, 181 bis 200, 201 bis 220, 221 bis 240, 241 bis 260, 261 bis 280, 281 bis 300, 301 bis 320 oder 321 bis 340, 341 bis 360, 361 bis 380, 381 bis 400 und 401 bis 421 bis zum Ende der codierenden Region. Außerdem können Polypeptidfragmente eine Länge von etwa 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 Aminosäuren aufweisen. In diesem Zusammenhang schließt „etwa" die spezifisch angegebenen Bereiche ein, die an einem der Enden oder an beiden Enden um einige (5, 4, 3, 2 oder 1) Aminosäuren größer oder kleiner sein können.
Bevorzugte Polypeptidfragmente schließen das Phosphatonin-Protein ein, das eine fortlaufende Reihe von deletierten Resten vom Amino- oder vom Carboxyterminus oder von beiden aufweist. Z.B. kann eine beliebige Zahl von Aminosäuren im Bereich von 1 bis 60 vom Aminoterminus des Phosphatonin-Polypeptids deletiert sein. Genauso kann eine beliebige Zahl von Aminosäuren im Bereich von 1 bis 30 vom Carboxyterminus des Phosphatonin-Proteins deletiert sein. Weiterhin ist eine beliebige Kombination der vorstehenden Amino- und Carboxyterminus-Deletionen bevorzugt. Genauso sind auch Polynucleotidfragmente bevorzugt, welche diese Phosphatonin-Polypeptidfragmente codieren.
Insbesondere können N-terminale Deletionen des Phosphatonin-Polypeptids durch die allgemeine Formel m-430 beschrieben werden, wobei m eine Zahl von 2 bis 416 ist und m der Position des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäurerestes entspricht.
Außerdem sind Phosphatonin-Polypeptid- und -Polynucleotidfragmente bevorzugt, die durch strukturelle und funktionelle Domänen gekennzeichnet sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung schließen Fragmente ein, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen („alpha-Regionen"), beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen („beta-Regionen"), Schleifen- und Schleifenbildende Regionen („Schleifen-Regionen"), Spirale- und Spirale-bildende Regionen („Spirale-Regionen"), hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen, Substrat-bindende Regionen und Regionen mit hohem antigenen Index umfassen. Wie in den Figuren angegeben, umfassen solche bevorzugten Regionen Garnier-Robson-alpha-Regionen, -beta-Regionen, -Schleifen-Regionen und -Spirale-Regionen, Chou-Fasman-alpha-Regionen, -beta-Regionen und -Schleifen-Regionen, Kyte-Doolittle-hydrophile Regionen und -hydrophobe Regionen, Eisenberg-alpha- und -beta-amphipathische Regionen, Karplus-Schulzflexible Regionen, Emini-oberflächenbildende Regionen und Jameson-Wolf-Regionen mit hohem Antigenindex. Die vorliegende Erfindung betrifft spezifisch Polypeptidfragmente von SEQ ID NO: 2, die in konservierte Domänen fallen, und diese sind in den Figuren dargestellt. Außerdem betrifft sie auch Polynucleotidfragmente, die diese Domänen codieren.
Andere bevorzugte Fragmente sind biologisch aktive Phosphatonin-Fragmente. Biologisch aktive Fragmente sind diejenigen, welche eine Aktivität aufweisen, die ähnlich, jedoch nicht notwendigerweise gleich ist wie eine Aktivität des Phosphatonin-Polypeptids. Die biologische Aktivität der Fragmente kann eine verbesserte, gewünschte Aktivität oder eine herabgesetzte, unerwünschte Aktivität einschließen.
Jedoch sind zahlreiche Polynucleotidsequenzen wie EST-Sequenzen für die Öffentlichkeit verfügbar und über Sequenz-Datenbanken zugänglich. Einige dieser Sequenzen können mit SEQ ID NO: 1 verwandt sein und sind möglicherweise schon vor der Erstellung der vorliegenden Erfindung der Öffentlichkeit zugänglich gemacht worden. Vorzugsweise sind solche verwandten Polynucleotide vom Umfang der vorliegenden Erfindung spezifisch ausgeschlossen. Es wäre jedoch zu aufwändig, jede verwandte Sequenz aufzulisten.
Demgemäß sind ein oder mehrere Polynucleotide aus der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ausgeschlossen, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die durch die allgemeine Formel a-b beschrieben wird, wobei a eine Zahl zwischen 1 und 1655 von SEQ ID NO: 1 darstellt, b eine Zahl von 15 bis 1655 bedeutet, wobei sowohl a als auch b den Positionen von in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nucleotidresten entsprechen und wobei b größer oder gleich a + 14 ist.
Epitope und Antikörper
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich „Epitope" auf Phosphatonin-Polypeptidfragmente, die in einem Tier, z.B. einer Ratte, einem Kaninchen, einem Menschen, einer Maus (einschließlich einer transgenen Maus, die menschliche Immunglobulin-Gene trägt und menschliche Antikörpermoleküle produziert) usw., eine antigene oder immunogene Aktivität aufweist. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Phosphatonin-Polypeptidfragment, das ein Epitop umfasst, und außerdem das Polynucleotid, welches dieses Fragment codiert. Eine Region eines Proteinmoleküls, an welche ein Antikörper binden kann, ist als ein „antigenes Epitop" definiert. Im Gegensatz dazu ist ein „immunogenes Epitop" als ein Teil eines Proteins definiert, der eine Antikörperantwort induziert; vgl. z.B. Geysen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1983), 3998–4002. Fragmente, die als Epitope wirken, können durch beliebige herkömmliche Verfahren hergestellt werden; vgl. z.B. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 5131–5135, weiterhin beschrieben in US-Patent Nr. 4 631 211.
In der vorliegenden Erfindung enthalten antigene Epitope vorzugsweise eine Sequenz von mindestens sieben, stärker bevorzugt mindestens neun und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 15 und etwa 30 Aminosäuren. Antigene Epitope können zum Induzieren von Antikörpern, einschließlich monoclonalen Antikörpern, eingesetzt werden, die spezifisch an das Epitop binden; vgl. z.B. Wilson, Cell 37 (1984), 767–778; Sutcliffe, Science 219 (1983), 660–666).
Genauso können immunogene Epitope verwendet werden, um Antikörper gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zu induzieren; vgl. z.B. Sutcliffe, vorstehend; Wilson, vorstehend; Chow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 910–914; und Bittle, J. Gen. Virol. 66 (1985), 2347–2354. Ein bevorzugtes immunogenes Epitop schließt das lösliche Protein ein. Die immunogenen Epitope können zusammen mit einem Trägerprotein wie einem Albumin, einem tierischen System (wie einem Kaninchen oder einer Maus) oder, wenn ein solches lang genug ist (mindestens etwa 25 Aminosäuren), auch ohne einen Träger dargeboten werden. Jedoch wurde gezeigt, dass immunogene Epitope, die so wenig wie 8 bis 10 Aminosäuren umfassen, ausreichend sind, um Antikörper hervorzubringen, die in der Lage sind, an mindestens lineare Epitope in einem denaturierten Polypeptid zu binden (z.B. in Western-Blot-Verfahren).
Unter Verwendung des Computerprogramms GCG Peptide Structure (Rice, Programme Manual for the EGCG Package, Cambridge, CB10 1RQ England; Hinxton Hall; 1995), verfügbar von dem Human Genome Resource Centre (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepage.html), wurde gefunden, dass die SEQ ID NO: 2 an den in 4 dargestellten Aminosäureregionen antigen ist. Somit könnten diese Regionen als Epitope zum Herstellen von Antikörpern gegen das durch SEQ ID NO: 1 codierte Protein eingesetzt werden.
Der hier verwendete Begriff „Antikörper" (Ab) oder „monoclonaler Antikörper" (mAb) ist so gemeint, dass er intakte Moleküle und außerdem Antikörperfragmente (wie z.B. Fab- und F(ab')₂-Fragmente) einschließt, die spezifisch an ein Protein binden können. Den Fab- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Kreislauf ausgeschieden und sie haben möglicherweise eine geringere unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper; vgl. z.B. Wahl, J. Nucl. Med. 24 (1983), 316–325. Somit sind diese Fragmente und außerdem die Produkte einer Fab- oder einer anderen Immunglobulin-Expressionsbank bevorzugt. Weiterhin schließen Antikörper der vorliegenden Erfindung chimäre einzelkettige humanisierte Antikörper, menschliche Antikörper, die durch oder aus Phagen-Display erhalten werden können, eine transgene Maus, die menschliche Immunglobulin-Gene und/oder menschliche Chromosomen trägt, isolierte Immunzellen aus einem menschlichen Körper, eine in vitro- oder ex vivo-Immunisierung von menschlichen Immunzellen oder beliebige andere verfügbare Verfahren ein.
Hier wird ein Nucleinsäuremolekül beschrieben, welches mit dem komplementären Strang des Phosphatonin-Polynucleotids der Erfindung hybridisiert und welches eine mutierte Version des wie vorstehend definierten Proteins codiert, die ihre immunologische, vorzugsweise biologische Aktivität verloren hat. Ein solches Nucleinsäuremolekül kann sich als nützlich erweisen, um z.B. dominante mutierte Allele der vorstehend beschriebenen Phosphatonin-Proteine zu erzeugen. Die mutierte Version wird vorzugsweise durch Substitution, Deletion und/oder Addition von 1 bis 5 oder 5 bis 10 Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz der vorstehend beschriebenen Wildtyp-Proteine erzeugt.
Vektoren, Wirtszellen und Produktion von Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, welche das Phosphatonin-Polynucleotid enthalten, Wirtszellen und die Produktion von Polypeptiden durch Rekombinationsverfahren. Der Vektor kann z.B. ein Phage, Plasmid, viraler oder retroviraler Vektor sein. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letzteren Fall wird eine Virusvermehrung im Allgemeinen nur in komplementierenden Wirtszellen erfolgen.
Phosphatonin-Polynucleotide können für die Vermehrung in einem Wirt mit einem Vektor verknüpft werden, der einen selektierbaren Marken enthält. Im Allgemeinen wird ein Plasmidvektor in einen Niederschlag wie einen Calciumphosphat-Niederschlag oder in einen Komplex mit einem geladenen Lipid eingeführt. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann er in vitro unter Verwendung einer geeigneten Verpackungs-Zelllinie verpackt und danach in Wirtszellen transduziert werden.
Die Phosphatonin-Polynucleotid-Insertion sollte mit einem geeigneten Promotor funktionell verknüpft sein, wie dem PL-Promotor des Lambda-Phagen, den lac-, trp-, phoA- und tac-Promotoren von E. coli, den frühen und späten SV40-Promotoren und Promotoren von retroviralen LTRs, um nur einige wenige zu nennen. Der Fachmann kennt noch andere geeignete Promotoren. Die Expressionskonstrukte enthalten weiterhin Stellen für die Transkriptions-Initiation, Termination und, in der transkribierten Region, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation. Der codierende Teil der durch die Konstrukte exprimierten Transkripte schließt vorzugsweise ein Translations-Initiationscodon am Beginn und ein Terminationscodon (UAA, UGA oder UAG), geeignet positioniert am Ende des zu translatierenden Polypeptids, ein.
Wie angegeben, schließen die Expressionsvektoren vorzugsweise mindestens einen selektierbaren Marken ein. Solche Marker schließen Dihydrofolat-Reduktase-, G418- oder Neomycin-Resistenz- für eukaryontische Zellkultur und Tetracyclin-, Kanamycin- oder Ampicillin-Resistenz-Gene für die Kultur in E. coli oder anderen Bakterien ein. Repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Bakterienzellen wie E. coli-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen; Insektenzellen wie Drosophila-S2- und Spodoptera-Sf9-Zellen; tierische Zellen wie CHO-, COS-, 293- und Bowes-Melanom-Zellen; und Pflanzenzellen. Geeignete Kulturmedien und Bedingungen für die vorstehend beschriebenen Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt. Zu den Vektoren, welche zur Verwendung in Bakterien bevorzugt sind, zählen pQE70, pQE60 und pQE-9, die von QIAGEN, Inc., verfügbar sind; pBluescript-Vektoren, Phagescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, die von Stratagene Cloning Systems, Inc., verfügbar sind; und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS, die von Pharmacia Biotech, Inc., verfügbar sind. Zu bevorzugten eukaryontischen Vektoren zählen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI und pSG, die von Stratagene verfügbar sind; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, die von Pharmacia verfügbar sind. Für den Fachmann werden noch andere geeignete Vektoren offensichtlich sein.
Weiterhin könnte man z.B. eine Säugerzelle verwenden, die in ihrem Genom bereits ein Nucleinsäuremolekül umfasst, welches ein Phosphatonin-Polypeptid, wie vorstehend beschrieben, codiert, die jedoch dieses z.B. aufgrund eines schwachen Promotors nicht oder nicht in einer geeigneten Weise exprimiert, und man könnte in die Säugerzelle eine Expressionskontrollsequenz, wie einen starken Promotor in naher Nachbarschaft zu dem endogenen Nucleinsäuremolekül einführen, welches das Phosphatonin-Polypeptid codiert, so dass dessen Expression induziert wird.
In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „Expressionskontrollsequenz" ein Nucleinsäuremolekül, das eingesetzt werden kann, um die Expression des Phosphatonin-Polypeptids zu steigern, und zwar aufgrund des Einbaus in das Genom einer Zelle in naher Nachbarschaft zu dem Phosphatonin-codierenden Gen. Solche regulatorischen Sequenzen umfassen Promotoren, Enhancer, inaktivierte Silencer-Intronsequenzen, 3'-UTR- und/oder 5'-UTR-codierende Regionen, Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente, Nucleinsäuremoleküle, die ein regulatorisches Protein codieren, z.B. einen Transkriptionsfaktor, der in der Lage ist, die Expression des Phosphatonin-Gens zu induzieren oder auszulösen, oder andere Genexpressionskontrollelemente, die dafür bekannt sind, dass sie die Genexpression aktivieren und/oder die Menge des Genprodukts steigern. Die Einführung der Expressionskontrollsequenz führt dazu, dass die Expression von Phosphatonin-Polypeptiden gesteigert und/oder induziert wird, und dies hat schließlich eine gesteigerte Menge von Phosphatonin-Polypeptiden in der Zelle zur Folge. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer de novo- und/oder einer erhöhten Expression von Phosphatonin-Polypeptiden.
Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch eine Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationische Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Verfahren erreicht werden. Solche Verfahren sind in zahlreichen Standard-Laborhandbüchern beschrieben, wie Davis, Basic Methods in Molecular Biology (1986). Spezifisch ist es so gemeint, dass Phosphatonin-Polypeptide tatsächlich durch eine Wirtszelle exprimiert werden können, der ein rekombinanter Vektor fehlt.
Phosphatonin-Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Fällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie. Am stärksten bevorzugt wird für die Reinigung eine Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie („HPLC") eingesetzt.
Phosphatonin-Polypeptide können auch gewonnen werden aus: Produkten, die aus natürlichen Quellen gereinigt wurden, einschließlich Körperflüssigkeiten, Gewebe und Zellen, entweder direkt isoliert oder gezüchtet; Produkten von chemischen Syntheseverfahren; und Produkten, die durch Rekombinationstechniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt wurden, einschließlich z.B. Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen.
Abhängig von dem Wirt, der in einem Rekombinations-Produktionsverfahren verwendet wird, können die Phosphatonin-Polypeptide glycosyliert oder nicht-glycosyliert sein. Außerdem können Phosphatonin-Polypeptide auch einen am Anfang stehenden (modifizierten) Methioninrest einschließen, und zwar in einigen Fällen als Folge von durch den Wirt vermittelten Prozessen. So ist dem Fachmann bekannt, dass das N-terminale Methionin, das durch das Translations-Initiationscodon codiert wird, nach der Translation in allen eukaryontischen Zellen im Allgemeinen mit einer hohen Effizienz aus jedem beliebigen Protein entfernt wird. Während das N-terminale Methionin aus den meisten Proteinen auch in den meisten Prokaryonten wirksam entfernt wird, ist dieser prokaryontische Entfernungs-Prozess bei einigen Proteinen unwirksam, abhängig von der Natur der Aminosäure, an welche das N-terminale Methionin kovalent gebunden ist.
Demgemäß wird hier ein Verfahren zum Isolieren eines Phosphatonin-Polypeptids beschrieben, das die Schritte umfasst:

(a) Züchten von tumor-konditionierten Medien oder Osteosarkom-Zellen bis zur Konfluenz in Serum-angereicherten Medien (DMEM-Eagle/10 FCS/Glutamin/Antimykotikum (DMFCS);
(b) Inkubieren der Zellen an jedem zweiten Tag in serumfreien Medien DMEM-Eagle/Glutamin/Antimykotikum-Antibiotikum (DM) bis zu fünf Stunden;
(c) Gewinnen von konditionierten serumfreien Medien von den Zellen und Äquilibrieren der konditionierten Medien auf 0,06 M Natriumphosphat, pH 7,2, und 0,5 M NaCl (PBS);
(d) Auftragen der Medien aus (c) auf eine äquilibrierte Säule von Concanavalin-A-Sepharose;
(e) gründliches Waschen der Säule mit PBS;
(f) Eluieren der Concanavalin-A-Säule mit PBS, angereichert mit 0,5 M α-Methyl-D-glucopyranosid;
(g) Unterwerfen des eluierten Materials aus (f) einer Kationen-Austausch-Chromatographie; und
(h) Eluieren von Phosphatonin-Polypeptid-enthaltenden Fraktionen mit 0,5 M NaCl.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird in Beispiel 1 erläutert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen von Phosphatonin-Polypeptiden, umfassend das Züchten von Wirtszellen gemäß der Erfindung, die aufgrund des Vorliegens eines Vektors oder eines Polynucleotids gemäß der Erfindung oder einer exogenen Expressionskontrollsequenz in der Lage sind, ein solches Polypeptid zu exprimieren, unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids und die Gewinnung des auf diese Weise produzierten Polypeptids aus der Kultur erlauben. Außerdem ist es so zu verstehen, dass die Proteine in einem zellfreien System exprimiert werden können, indem z.B. in vitro-Translationstests verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer noch weiteren Ausführungsform ein Phosphatonin-Polypeptid oder ein immunologisch und/oder biologisch aktives Fragment davon, codiert durch das Polynucleotid der Erfindung oder produziert durch ein Verfahren, wie vorstehend beschrieben. Genauso liegen Phosphatonin-Polypeptide im Umfang der vorliegenden Erfindung, die durch proteolytische Spaltung der vorstehend beschriebenen Phosphatonin-Polypeptide durch eine PHEX-Metallopeptidase erhalten werden können.
Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass das Protein der Erfindung weiterhin an andere Einheiten, wie vorstehend beschrieben, gekoppelt werden kann, z.B. für Anwendungen zur gezielten Anlieferung von Arzneimitteln und für bildgebende Verfahren. Eine solche Kopplung kann nach der Expression des Proteins an der Stelle der Anheftung chemisch durchgeführt werden, oder das Kopplungsprodukt kann auf der DNA-Ebene in das Protein der Erfindung eingebaut werden. Danach werden die DNAs in einem geeigneten Wirtssystem exprimiert, und die exprimierten Proteine werden gewonnen und gegebenenfalls renaturiert.
Regulation eines Phosphatstoffwechsels
Wie vorstehend erwähnt, ist das Phosphatonin-Polypeptid der vorliegenden Erfindung in der Lage, Phosphatstoffwechsel zu regulieren.
Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung ein Phosphatonin-Polypeptid, das eine anti-Phosphatonin-Aktivität besitzt, wobei es mindestens eine der folgenden Aktivitäten aufweist:

(a) es ist in der Lage, den Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochzuregulieren;
(b) es ist in der Lage, die renale 25-Hydroxy-Vitamin-D3-24-Hydroxylase herunterzuregulieren; und/oder
(c) es ist in der Lage, die renale 25-Hydroxy-D-1-α-Hydroxylase hochzuregulieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Phosphatonin-Polypeptid ein Knochenmineralmotiv, wie vorstehend beschrieben, und reguliert die Knochenmineralisation positiv.
Außerdem sind hier Polypeptide beschrieben, die mindestens eine der vorstehend beschriebenen Aktivitäten verloren haben. Solche Polypeptide können mutierte Formen des Phosphatonin-Polypeptids der vorliegenden Erfindung sein und z.B. verwendet werden, um den Effekt von Mutationen im Phosphatonin-codierenden Gen zu untersuchen. Insbesondere können sich solche Mutanten für die Entwicklung von Arzneistoffen als nützlich erweisen, die in der Lage sind, einen Mangel zu kompensieren, der durch den Verlust von einer der biologischen Aktivitäten des Wildtyp-Phosphatonin verursacht wird. Solche mutierten Formen von Phosphatonin-Polypeptiden können am besten in den Durchmusterungsverfahren untersucht werden, die nachstehend noch ausführlicher beschrieben werden.
Phosphatonin-Antikörper
Wie weiterhin vorstehend beschrieben ist, ermöglicht die Bereitstellung des Phosphatonin-Polypeptids der vorliegenden Erfindung die Herstellung von Phosphatonin-spezifischen Antikörpern. In diesem Zusammenhang können anhand der Hybridom-Technologie Zelllinien hergestellt werden, die Antikörper gegen im Wesentlichen jede gewünschte, eine Immunantwort hervorbringende Substanz ausscheiden. Danach kann die RNA, welche die leichten und schweren Ketten des Immunglobulins codiert, aus dem Cytoplasma des Hybridoms erhalten werden. Der 5'-terminale Teil der mRNA kann verwendet werden, um cDNA herzustellen, die in einen Expressionsvektor eingefügt werden soll. Anschließend kann die DNA, welche den Antikörper oder seine Immunglobulinketten codiert, in Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, exprimiert werden. Abhängig von der Wirtszelle kann es sein, dass Renaturierungsverfahren erforderlich sind, um die richtige Konformation des Antikörpers zu erhalten. Gegebenenfalls können in dem Bestreben, die Bindung zu optimieren, in der DNA Punktsubstitutionen unter Verwendung herkömmlicher Kassetten-Mutagenese oder anderer Verfahren der Proteinveränderung, wie hier offenbart, durchgeführt werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Antikörper, der spezifisch das Phosphatonin-Polypeptid der Erfindung erkennt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper, ein polyclonaler Antikörper, ein einzelkettiger Antikörper, ein menschlicher oder humanisierter Antikörper, ein primatisierter, ein chimärisierter oder ein Fragment davon, das spezifisch an das Peptid oder Polypeptid bindet, auch einschließlich bispezifischer Antikörper, synthetischer Antikörper, eines Antikörperfragments wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente usw., oder eines chemisch modifizierten Derivats von einem dieser Stoffe. Die allgemeine Methodik zum Herstellen von Antikörpern ist bekannt und wurde z.B. beschrieben in: Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 494, und ist als Übersicht dargestellt in: J. G. R. Hurrel, Hrsg., „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raton, FL (1982), und außerdem ist sie angegeben in L. T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604–619. Weiterhin können Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend erwähnten Peptide unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z.B. in: Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben sind.
Für die Herstellung von Antikörpern in Versuchstieren können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse und andere, durch Injektion mit Polypeptiden der vorliegenden Erfindung oder einem beliebigen Fragment oder Oligopeptid oder Derivat davon, das immunogene Eigenschaften besitzt, immunisiert werden. Verfahren zum Herstellen und Bearbeiten polyclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und u.a. in: Mayer und Walker, Hrsg., „Immunochemical Methods in Cell an Molecular Biology", Academic Press, London (1987), beschrieben. Polyclonale Antikörper können auch aus einem Tier, vorzugsweise einem Säuger, erhalten werden. Verfahren zum Reinigen von Antikörpern sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Immunaffinitäts-Chromatographie. Abhängig von der Art des Wirts können verschiedene Adjuvantien oder immunologische Träger eingesetzt werden, um die Immunantworten zu verstärken. Solche Adjuvantien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid und grenzflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen und Dinitrophenol. Ein Beispiel eines Trägers, an den z.B. ein Peptid der Erfindung gekoppelt werden kann, ist KLH (keyhole Limpet hemocyanin).
Die Herstellung chimärer Antikörper ist z.B. in WO 89/09622 beschrieben. Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper sind z.B. in EP-A1 0 239 400 und WO 90/07861 beschrieben. Eine weitere Quelle von Antikörpern, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind sogenannte xenogene Antikörper. Das allgemeine Prinzip für die Herstellung xenogener Antikörper wie menschlicher Antikörper in Mäusen ist z.B. in WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 und WO 96/33735 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Antikörper der Erfindung eine Affinität von mindestens etwa 10^–7 M, vorzugsweise von mindestens etwa 10^–8 M, stärker bevorzugt von mindestens etwa 10^–9 M und am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 10^–10 M. Andererseits kann der Phosphatonin-Antikörper eine Bindungsaffinität von etwa 10⁵ M^–1, vorzugsweise nicht höher als 10⁷ M^–1 aufweisen, wenn eine Stimulation der Phosphatonin-Aktivität gewünscht wird, und vorteilhafterweise von bis zu 10¹⁰ M^–1 oder mehr, wenn die Phosphatonin-Aktivität unterdrückt werden soll.
Verwendung der Phosphatonin-Polynucleotide
Die hier identifizierten Phosphatonin-Polynucleotide können auf ganz verschiedene Art und Weise als Reagenzien eingesetzt werden. Die folgende Beschreibung sollte als beispielhaft angesehen werden, wobei bekannte Verfahren verwendet werden.
Es besteht immer noch der Bedarf, neue Chromosomenmarker zu identifizieren, da zurzeit nur wenige Chromosomen-markierende Reagenzien verfügbar sind, die auf aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungs-Polymorphismen) beruhen. Mit Phosphatonin zusammenhängende Polynucleotide (genomische und/oder cDNA) können eingesetzt werden, um eine Restriktionsanalyse durchzuführen, wie ausführlich beschrieben ist (Rowe, Hum. Genet. 94: 5 (1994), 457–467; Benham, Genomics 12 (1992), 368–376; Gillett, Ann. Hum. Genet. 60 (3) (1996), 201–211; Rowe, Nucleic Acids Res. 22 (23) (1994), 5135–5136). Insbesondere die Verwendung von Mikrosatelliten (Rowe, Hum. Genet. 94: 5 (1994), 457–467; Rowe, Nucleic Acids Res. 22 (23) (1994), 5135–5136; Rowe, Hum. Genet. 93 (1994), 291–294; Rowe, Hum. Genet. 91 (1993), 571–575; Rowe, Hum. Genet. 97 (1996), 345–352; Rowe, Hum. Genet. 89 (1992), 539–542) und die Isolierung von informativen Markern unter Verwendung von Bestrahlungs-Fusions-Gentransfer-Hybriden und ALU-PCR (Benham, Genomics 12 (1992), 368–376) machen eine schnelle Isolierung von hoch-informativen Verfahren zur Durchmusterung von Phosphatonin und daraus hergeleiteten ererbten Krankheiten möglich. Die vorstehenden Verfahren waren besonders erfolgreich beim Kartieren und Lokalisieren des PHEX-Gens (MEPE wird als ein PHEX-Substrat vorgeschlagen), und eine umfangreiche Mutationsanalyse hat Strukturregionen und Motive aufgedeckt, die für die biologische Aktivität von PHEX unbedingt erforderlich sind (Rowe, Hum. Genet. 6 (1997), 539–549; Rowe, Exp. Nephrol. 5 (1997), 355–363; Rowe, Current Opinion in Nephrology & Hypertension 7 (4) (1998), 367–376; Rowe, Clinical and Experimental Nephrology 2 (3) (1998), 183–193), diese Vorgehensweisen können genauso für Phosphatonin eingesetzt werden. Kürzlich wurden leistungsfähige, das ganze Genom betreffende Verknüpfungs- und Durchmusterungsverfahren entwickelt, die auf einzelnen Nucleotid-Polymorphismen (SNPs) und der Verwendung einer Kombination von Gel-basierter Sequenzierung und DNA-Chips zum Nachweis einer Variation hoher Dichte („high-density variationdetection DNA chips") (Wang, Science 280 (1998), 1077–1082) beruhen. Kürzlich wurden SNP-Daten durch das Center for Genome Research an dem Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts, USA, (Whitehead-MIT) im Internet verfügbar gemacht unter http://wwwgenome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html. Diese leistungsfähige, neue Oligonucleotid-Array-basierte Methodik wird den zukünftigen Weg für molekulare Expressionsanalyse, Polymorphismus und Gentypsierung und Krankheitsmanagement darstellen (Wang, Science 280 (1998), 1077–1082; Chee, Science 274 (1996), 610–614; Gentalen, Nucleic Acids Res. 27 (1999), 1485–1491; Hacia, Nucleic Acids Res. 26 (1998), 3865–3866; Lipshutz, Nat. Genet. 21 (1999), 20–24; Fan, Eur. J. Hum. Genet. 6 (1998), 134). In Anbetracht der für MEPE in dieser Beschreibung angegebenen Sequenzinformationen können die vorstehenden neuen Vorgehensweisen und Verfahren eingesetzt werden, um die beschriebenen Bereiche anzusprechen. Die Sequenz kann unter Verwendung bekannter Verfahren auf ein bestimmtes Chromosom oder auf eine spezifische Region des Chromosoms kartiert werden. Diese umfassen die in situ-Hydridisierung auf Chromosomenausbreitungen, Durchfluss-sortierten Chromosomenpräparaten oder künstlichen Chromosomenkonstrukten wie künstlichen Hefechromosomen, künstlichen Bakterienchromosomen, Bakterien-P1-Konstruktionen oder einzelnen Chromosomen-cDNA-Banken, wie in den Übersichtsartikel von Price (Blood Rev. 7 (1993), 127–134) und Trask (Trends Genet. 7 (1991), 149–154) beschrieben. Das Verfahren der fluoreszierenden in situ-Hybridisierung von Chromosomenausbreitungen wurde u.a. in: Verma, (1988), Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York NY, beschrieben. Die fluoreszierende in situ-Hybridisierung von Chromosomenpräparaten und andere physikalische Chromosomen-Kartierungstechniken können mit weiteren genetischen Kartierungsdaten abgestimmt werden. Ausführliche Kartierungsdaten, die für die wissenschaftliche Öffentlichkeit zugänglich sind, finden sich im Internet auf Seiten, die vom Human-Genome-Mapping-Project United Kingdom (HGMP-RC) gefördert sind, http://www.hgmp.mrc.ac.uk/homepage.html, der National Collection of Biological Information (NCBI), gefördert vom National Institute of Health USA (NIH), hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov/, auch des Center for Genome Research at the Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts, USA (Whitehead-MIT) http://www-genome.wi.mit.edu/. Außerdem können ausführliche Mikrosatelliten-Karten und damit zusammenhängende Kartierungswerkzeuge, welche das gesamte menschliche Genom abdecken, über Genethon erhalten werden (von der französischen Regierung geförderte Datenbank) http://www.aenethon.fr/genethon en.html. Ferner wurden Samen/Keim-Karten in Science und Nature veröffentlicht (vgl. z.B. Dib, Nature 380 (1996), 152–154), jedoch sollten die Internetseiten für aktuellste Daten konsultiert werden. Der Zusammenhang zwischen der Lage des Gens, das ein Phosphatonin-Polypeptid der Erfindung codiert, auf einer physikalischen Chromosomenkarte und einem spezifischen Merkmal, z.B. einer hypo- oder hyperphosphatämischen Krankheit, kann dazu beitragen, die mit diesem Merkmal assoziierte DNA-Region einzugrenzen. Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Unterschiede in Gensequenzen zwischen normalen Individuen, Trägern oder erkrankten Individuen nachzuweisen. Außerdem können die hier beschriebenen Mittel und Verfahren für die Marker-unterstützte Züchtung von Tieren eingesetzt werden. Die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der Chromosomenposition aufgrund von Translokation, Inversion usw. bei normalen Individuen, Trägern oder erkrankten Individuen nachzuweisen.
Schließlich können die Phosphatonin-Polynucleotide auch noch als Molekulargewicht-Marker bei Southern-Gelen, als diagnostische Sonden zum Nachweisen des Vorliegens einer spezifischen mRNA in einem bestimmten Zelltyp, als eine Sonde für „Heraus-Subtrahieren" bekannter Sequenzen im Prozess zum Entdecken neuer Polynucleotide, zum Selektieren und Herstellen von Oligomeren zur Anheftung an ein „Gen-Chip" oder einen anderen Träger, zum Hervorbringen von anti-DNA-Antikörpern unter Verwendung von DNA-Immunisierungsverfahren und als ein Antigen zum Induzieren einer Immunantwort eingesetzt werden.
Verwendung von Phosphatonin-Polypeptiden und Antikörpern
Phosphatonin-Polypeptide und Antikörper dagegen können auf ganz unterschiedliche Art und Weise eingesetzt werden. Die folgende Beschreibung sollte als beispielhaft angesehen werden, wobei bekannte Techniken verwendet werden.
Phosphatonin-Polypeptide können eingesetzt werden, um Proteinspiegel in einer biologischen Probe unter Verwendung von Antikörper-basierten Techniken zu testen. Z.B. kann die Proteinexpression in Geweben mit klassischen immunhistologischen Methoden untersucht werden; vgl. z.B. Jalkanen, J. Cell. Biol. 101 (1985), 976–985; Jalkanen, J. Cell. Biol. 105 (1987), 3087–3096). Andere, auf Antikörpern beruhende Verfahren, die zum Nachweisen der Protein-Genexpression eingesetzt werden können, schließen Immuntests ein, wie den enzyme verbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) und den Radioimmuntest (RIA). Geeignete Antikörper-Test-Markierungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Enzym-Markierungen wie Glucoseoxidase und Radioisotope wie Iod (¹²⁵I, ¹²¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H), Inidium (¹¹²In) und Technetium (⁹⁹mTc) und fluoreszierende Marken wie Fluorescein und Rhodamin und Biotin.
Außerdem können Proteinspiegel in einer biologischen Probe auch bestimmt werden, indem die Proteine in vivo durch bildgebende Verfahren nachgewiesen werden. Antikörper-Markierungen oder Marken für eine bildgebende in vivo-Darstellung eines Proteins umfassen diejenigen, die durch Röntgenographie, NMR oder ESR nachgewiesen werden können. Für die Röntgenographie umfassen geeignete Markierungen Radioisotope wie Barium oder Cäsium, die eine nachweisbare Strahlung aussenden, jedoch beim Individuum keine offenkundigen Schäden verursachen. Geeignete Markierungen für NMR und ESR schließen diejenigen mit einem nachweisbaren charakteristischen Spin wie Deuterium ein, die in den Antikörper durch Markierung von Nährstoffen für das relevante Hybridom eingebaut werden können.
Ein Protein-spezifischer Antikörper oder ein Protein-spezifisches Antikörperfragment, der/das mit einer geeigneten nachweisbaren bildgebenden Einheit markiert wurde, wie einem Radioisotop (z.B. ¹³¹I, ¹²¹In, ⁹⁹mTc), einer radiopaquen Substanz oder einem Stoff, der durch kernmagnetische Resonanz nachweisbar ist, wird in den Säuger eingeführt (z.B. parenteral, subkutan oder intraperitoneal). Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die Menge der bildgebenden Einheit, die zum Produzieren von diagnostischen Bildern erforderlich ist, durch die Größe des Individuums und das verwendete bildgebende System bestimmt wird. Im Fall einer Radioisotopen-Einheit für ein menschliches Individuum liegt die Menge der injizierten Radioaktivität normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 20 Millicurie ⁹⁹mTc. Anschließend wird der markierte Antikörper oder das markierte Antikörperfragment bevorzugt an der Position von Zellen, die das spezifische Protein enthalten, akkumulieren. Die bildgebende in vivo-Darstellung von Tumoren ist z.B. in: Burchiel, „Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and their Fragments", Kapitel 13, in: Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel und Rhodes, Hrsg., Masson Publishing Inc., (1982), beschrieben.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Verfahren für eine Störung, umfassend (a) Testen der Expression von Phosphatonin-Polypeptid in Zellen oder Geweben oder des Spiegels von Phosphatonin oder seiner aktiven Fragmente oder Epitope in der Körperflüssigkeit eines Individuums; (b) Vergleichen der Genexpressionsrate mit einer Standard-Genexpressionsrate, wobei eine Zunahme oder Abnahme der getesteten Expressionsrate des Phosphatonin-Polypeptid-Gens im Vergleich zur Standard-Expressionsrate ein Zeichen für eine Störung ist.
Außerdem können Phosphatonin-Polypeptide zum Behandeln einer Krankheit eingesetzt werden. Z.B. können Phosphatonin-Polypeptide an Patienten verabreicht werden, um Serumphosphatspiegel zu erhöhen oder zu erniedrigen und/oder um die beeinträchtigte Knochenbildung zu verbessern (X-gebundene hypophosphatämische Rachitis, onkogene hypophosphatämische Osteomalazie, Nierenversagen, Osteoporose, renale Osteodytrophie usw.). Es kann seine Rezeptoren aktivieren oder hemmen, wodurch die Expression von Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransportern hoch- oder herunterreguliert wird. Außerdem kann das Phosphatonin-Gen-Promotor- und/oder -Enhancer-Element in Anwendungen der Gentherapie eingesetzt werden, um Phosphatstoffwechsel-spezifische Störungen zu behandeln, insbesondere X-gebundene hypophosphatämische Rachitis. Außerdem könnte möglicherweise bei Störungen mit Knochenmineralverlust, bei denen eine abnorme Genregulation und/oder posttranslationale Modifikation von MEPE aufgrund von undefinierten sekundären oder primären Veränderungen auftritt (z.B. bei Frauen in der Postmenopause, Osteoporose, mit dem Alter zusammenhängend), eine Ergänzungsbehandlung mit dem Hormon (und/oder mit Agonisten-Antagonisten zu dem Rezeptor oder Hormon) möglicherweise als ein Zusatz zu einer Hormonersatztherapie das Phosphat- und Knochenmineral-Gleichgewicht wiederherstellen. Ein entscheidendes Merkmal der MEPE-Bioaktivität und somit der Behandlung von Krankheiten ist die Voraussage, dass die N-terminale Sequenz die renale Phosphataufnahme reguliert und der C-Terminus (besonders Regionen, die mit dem früher beschriebenen MEPE-Motiv assoziiert sind) für eine normale Mineralisation und ein normales Wachstum des Knochens unbedingt erforderlich sind.
Nach einer Nierentransplantation sind chronische Hyperphosphatämie oder in einigen Fällen Hypophosphatämie entscheidende Merkmale, die zu ernsthaften klinischen Komplikationen führen. Z.B. wurde berichtet, dass die Nierentransplantation einer normalen Niere in einen männlichen HYP-Patienten zu pathophysiologischen Veränderungen in der normalen, transplantierten Niere führte, so dass sich ein renaler Phosphatverlust vom „Rachitis-Typ" entwickelte (Morgan, Arch. Intern. Med. 134 (1974), 549–552). Die klinische Anwendung von N-terminal gespaltenen, prozessierten Fragmenten von MEPE könnte zu einer wirksamen antihypophosphatämischen Therapie führen. Im Gegensatz dazu könnten Fälle von Nierentransplantation, die zu einer Hyperphosphatämie führen, mit vollständigem rekombinantem MEPE oder aktiven Peptidderivaten, die bestimmten N-terminalen Resten nachgebildet wurden, behandelt werden. Andere Krankheiten, die von einer Behandlung mit MEPE, MEPE-Peptidderivaten, Rezeptor-Antagonisten-Agonisten (Peptide könnten so modifiziert werden, dass die Stärke und Spezifität der Wirkung erhöht wird) profitieren könnten, schließen renale Osteodystrophie, Nierentoxizität, Paget-Krankheit des Knochen, autosomale Formen von Rachitis, bestimmte Formen des renalen Fanconi-Syndroms ein. Wenn die Rezeptoren in einem Spektrum von Geweben (Darm usw.) und außerdem in der Niere exprimiert werden, gibt es ferner die Möglichkeit, dass auch Patienten im Endstadium des Nierenversagens (d.h. dem vollständigen Verlust der Nierenfunktion) behandelt werden.
Genauso können Antikörper, die gegen Phosphatonin-Polypeptide gerichtet sind, auch zum Behandeln einer Krankheit verwendet werden. Z.B. kann die Verabreichung eines Antikörpers, der gegen ein Phosphatonin-Polypeptid gerichtet ist, daran binden oder die Überproduktion des Polypeptids reduzieren. Genauso kann die Verabreichung eines Antikörpers das Polypeptid aktivieren, etwa durch Bindung an ein Polypeptid und Spaltung dieses Polypeptids zu einer Form mit einer anderen Aktivität.
Schließlich können die Phosphatonin-Polypeptide als Molekulargewicht-Marker auf SDS-PAGE-Gelen oder auf Molekularsieb-Gelfiltrations-Säulen unter Verwendung von Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Phosphatonin-Polypeptide können auch zum Induzieren von Antikörpern eingesetzt werden, die ihrerseits verwendet werden, um die Proteinexpression aus einer rekombinanten Zelle zu bestimmen, wobei auf diese Weise die Transformation der Wirtszelle festgestellt werden kann.
Weiterhin können Phosphatonin-Polynucleotide und -Polypeptide in Tests verwendet werden, um auf eine oder mehrere biologische Aktivitäten zu testen. Wenn Phosphatonin-Polynucleotide und -Polypeptide in einem bestimmten Test eine Aktivität zeigen, besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass Phosphatonin an den Krankheiten beteiligt ist, die mit der biologischen Aktivität assoziiert sind. Deshalb könnte Phosphatonin zum Behandeln der damit zusammenhängenden Krankheit eingesetzt werden.
Regulatorische Sequenzen von Phosphatonin-Genen
Außerdem wird hier eine regulatorische Sequenz eines Promotors beschrieben, der die Expression eines Polynucleotids, welches das vorstehend beschriebene Phosphatonin-Polypeptid der Erfindung codiert, oder eines Polynucleotid-Homologs zu einem Polynucleotid der Erfindung natürlich reguliert. Die regulatorischen Sequenzen der Promotoren, welche die Expression der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen natürlich regulieren, können mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert werden. Z.B. kann eine genomische Bank, die aus menschlicher genomischer DNA besteht, die in Phagen- oder bakterielle Vektoren cloniert ist, von einem Fachmann unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle als Sonden durchgemustert werden. Eine solche Bank besteht z.B. aus genomischer DNA, hergestellt aus menschlichen Blutzellen, fraktioniert in Fragmente im Bereich von 5 kb bis 50 kb, cloniert in die Lambda GEM11-Phagen (Promega). Diejenigen Phagen, die mit den Sonden hybridisieren, können gereinigt werden. Aus den gereinigten Phagen kann die DNA extrahiert und sequenziert werden. Z.B. wird eine menschliche genomische P1-Bank (Genomic Systems, Inc.) anhand einer markierten cDNA-Sonde, wie in Beispiel 11 beschrieben, durchgemustert. Nachdem die genomischen Sequenzen isoliert wurden, welche den die vorstehend beschriebenen Phosphatonin-Proteine codierenden Genen entsprechen, ist es möglich, heterologe DNA-Sequenzen an diese Promotoren oder ihre regulatorischen Sequenzen anhand von transkriptionalen oder translationalen Fusionen zu fusionieren, die dem Fachmann bekannt sind. Um die regulatorischen Sequenzen und spezifische Elemente dieser Phosphatonin-Gene zu identifizieren, können 5'-stromaufwärts liegende genomische Fragmente vor den Markergenen wie luc, gfp oder die GUS-codierende Region cloniert werden, und sodann können die resultierenden chimären Gene für eine transiente oder stabile Expression in Zellen oder Tiere transfiziert werden. Das Expressionsmuster, das in den transgenen Tieren oder transfizierten Säugerzellen festgestellt wird, welche das Markergen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen der Erfindung enthalten, kann mit dem Muster des Phosphatonin-Gens, wie in Beispiel 10 beschrieben, verglichen werden, wodurch die Grenzen des Promotors und seiner regulatorischen Sequenzen aufgedeckt werden. Üblicherweise ist die regulatorische Sequenz Teil eines rekombinanten DNA-Moleküls, z.B. eines Vektors, vgl. vorstehend. Die vorliegende Anmeldung beschreibt weiterhin Wirtszellen, die mit einer regulatorischen Sequenz oder einem DNA-Molekül oder einem Vektor, das/der die regulatorische Sequenz der Erfindung enthält, transformiert sind. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein; vgl. vorstehend.
Diagnostizieren von Störungen des Phosphatstoffwechsels
Ein weiterer hier beschriebener Aspekt betrifft die pharmakogenomische Selektion von Arzneistoffen und Arzneistoff-Vorläufern für Patienten, die an Störungen im Phosphatstoffwechsel leiden (vgl. z.B. Beispiel 6), wobei diese mögliche Kandidaten für eine Arzneistofftherapie sind. Somit stellen die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung die Möglichkeiten der Entwicklung neuer Arzneistoffe für ein pharmakologisches Eingreifen mit dem Ziel, die Funktion von genetisch modifizierten Phosphatonin-Proteinen wiederherzustellen, bereit. Außerdem kann eine gentherapeutische Vorgehensweise mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst werden. Somit beschreibt die vorliegende Anmeldung ein diagnostisches Verfahren für eine Störung, welches einschließt:

(a) Testen der Expressionsrate des Phosphatonin-Gens in Zellen oder Körperflüssigkeiten eines Individuums; und
(b) Vergleichen der Expressionsrate des Phosphatonin-Gens mit einer Standard-Expressionsrate des Phosphatonin-Gens, wobei eine Zunahme oder Abnahme der getesteten Expressionsrate des Phosphatonin-Gens im Vergleich zur Standard-Expressionsrate ein Zeichen für eine Störung im Phosphatstoffwechsel z.B. der Niere oder des Knochensystems oder anderer Gewebe ist.

Insbesondere beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Diagnostizieren eines pathologischen Zustands oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand in einem Individuum, der mit einer Störung des Phosphatstoffwechsels in Zusammenhang steht, umfassend:

(a) Bestimmen des Vorliegens oder der Abwesenheit einer Mutation in dem Polynucleotid, welches Phosphatonin codiert; und
(b) Diagnostizieren eines pathologischen Zustands oder einem Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand, der auf dem Vorliegen oder der Abwesenheit der Mutation beruht.

Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Diagnostizieren eines pathologischen Zustands oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand bei einem Individuum, der mit einer Störung des Phosphatstoffwechsels im Zusammenhang steht, umfassend:

(a) Bestimmen des Vorliegens oder der Menge der Expression eines Phosphatonin-Polypeptids oder einer mutierten Form davon in einer biologischen Probe; und
(b) Diagnostizieren eines pathologischen Zustands oder einer Anfälligkeit für einen pathologischen Zustand aufgrund des Vorliegens oder der Menge der Expression des Polypeptids.

Es ist offensichtlich, dass die vorstehend beschriebenen Nucleinsäure-Sonden und Antikörper der Erfindung vorzugsweise für die erwähnten Verfahren eingesetzt werden.
Das vorstehend beschriebene Diagnoseverfahren kann auch eingesetzt werden, um den Status dieser Störungen zu bestimmen. Der Begriff „pathologischer Zustand" umfasst die Optionen, dass das Gen, die mRNA, das Protein oder ein Transkriptionskontrollelement, z.B. eine Promotor/Enhancer-Sequenz, möglicherweise eine Mutation, eine Deletion oder eine beliebige andere Modifikation enthält, welche die Gesamtaktivität des Gens im Vergleich zum normalen Wildtyp-Genprodukt beeinflussen würden. In diesem Begriff sind posttranslationale Modifikationen des Proteins enthalten.
In dem vorstehend beschriebenen Verfahren zeigt der Status in dem Individuum eine bestimmte Form der Störung im Phosphatstoffwechsel an. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, dass in dem Verfahren der Status in dem Individuum im Embryonal- oder Neugeborenen-Stadium, z.B. anhand einer Amniozentese, bestimmt wird.
Die spezifische Analyse des Status einer (möglichen) Störung des Phosphatstoffwechsels im Embryonal-, Neugeborenen- oder erwachsenen Stadium stellt weiterhin Einblicke in z.B. spezifische Krankheitszustände, die mit dem entsprechenden Stadium assoziiert sind, bereit. Z.B. kann man erwarten, dass die Ätiologie z.B. der X-gebundenen hypophosphatämischen Rachitis (XHL) oder der onkogenen hypophosphatämischen Osteomalazie (OHO) durch Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung aufgeklärt werden kann. Anhand dieses Wissens können dann neue pharmazeutische Wirkstoffe entwickelt und getestet werden. Die hier beschriebenen Verfahren können auch auf eine Vielzahl von Tieren, abhängig vom Zweck der Untersuchung, angewendet werden. So ist das Tier vorzugsweise ein Maus. Dieser Aspekt ist besonders für die Grundlagenforschung geeignet, um die funktionelle Wechselbeziehung verschiedener Proteine, welche den Phosphatstoffwechsel regulieren, aufzuklären.
Das vorstehend beschriebene Verfahren kann einen weiteren Schritt umfassen, umfassend das Behandeln des Neugeborenen mit einem Medikament, um eine Störung im Phosphatstoffwechsel aufzuheben oder abzuschwächen. Eine frühe Diagnose einer Störung im Phosphatstoffwechsel oder einer Anfälligkeit für diese Störung ist in der Medizin besonders von Vorteil und von großer Wichtigkeit. Weiterhin kann der Status mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren anhand einer Amniozentese diagnostiziert werden. Die frühe Diagnose von Störungen in der Phsophataufnahme und/oder Reabsorption gemäß allen Anwendungen des vorstehend beschriebenen Verfahrens macht es möglich, dass eine Behandlung bereits direkt nach der Geburt erfolgen kann, bevor klinische Symptome auftreten.
Patienten mit X-gebundener Rachitis und Patienten mit Tumor-Osteomalazie (vor der Tumorresektion oder falls eine Resektion nicht möglich ist) werden mit hohen Dosen von Calcitriol oder 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D₃ (kommerziell auch als Rocaltrol^® bekannt und von Roche verfügbar; genaue Informationen über die Verabreichung, vgl. die Webseite http://www.rochecanada.com/rocaltrol pml e.html) und oralen Phosphat-Zusätzen (dibasisches Natriumphosphat und/oder Phosphorsäure) behandelt. Gelegentlich werden auch Vitamin-D-Analoga eingesetzt (z.B. Dihydrotachysterol), und es wird berichtet, dass der Verlust von Phosphor und Calcium über den Urin durch die zusätzliche Verwendung von Thiazid-Diuretika wie Hydrochlorthiazid oder Amilorid noch weiter reduziert wird (Alon, Paediatrics 75 (1985), 754–763). Ein ausführlicher Übersichtsartikel der zurzeit üblichen Behandlungen findet sich in: Carpenter, Pediatrics Clinics of North America 44 (1997), 443–466). Bei Kindern müssen die Knochen durch Brechen von deformierten Gliedmaßen neu eingerichtet werden (Osteotomie), und die vorstehend beschriebenen Medikationen haben schweres Erbrechen und Diarrhö zur Folge. Die mit der familiären Rachitis assoziierten Wachstumsdefekte können unter Verwendung der zurzeit üblichen Behandlungen nicht zufriedenstellend behandelt werden.
Durch Ersetzen der vorstehenden Medikationen durch Phosphatonin und/oder Phosphatonin-Peptidderivate könnte man die klinischen Symptome korrigieren und die Wachstumsdefekte normalisieren, und zwar ohne die unangenehmen Nebenwirkungen und chirurgischen Osteotomien.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren können weiterhin umfassen:
Einführen des funktionellen und exprimierbaren Phosphatonin-Gens in Zellen eines Individuums mit einer Störung oder einer Anfälligkeit für eine Störung im Phosphatstoffwechsel. In diesem Zusammenhang und wie in dieser Beschreibung verwendet, bedeutet „funktionelles" Phosphatonin-Gen ein Gen, wobei das codierte Protein einen Teil oder die Gesamtheit der primären Strukturkonformation des Phosphatonin-Polypeptids mit der vorstehend beschriebenen biologischen Aktivität aufweist. Der Nachweis einer Expression einer mutierten Form von Phosphatonin würde den Schluss zulassen, dass die Expression mit der Erzeugung oder Aufrechterhaltung einer Störung im Phosphatstoffwechsel im Zusammenhang steht. Demgemäß würde ein alternativer oder zusätzlicher Schritt angewendet werden, um die Expressionsrate auf niedrige Spiegel des mutierten Phosphatonin zu reduzieren oder diese ganz zum Verschwinden zu binden. Dies kann z.B. durch eine mindestens partielle Elimination der Expression des mutierten Gens durch biologische Mittel, z.B. durch die Verwendung von Ribozymen, Antisense-Nucleinsäuremolekülen oder intrazellulären Antikörpern gegen die mutierten Formen dieser Proteine, erfolgen. Weiterhin können pharmazeutische Produkte entwickelt werden, welche die Expressionsraten der entsprechenden mutierten Gene reduzieren.
Bindungsaktivität
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Bindungspartners für ein Phosphatonin-Polypeptid, umfassend:

(a) Inkontaktbringen eines Phosphatonin-Polypeptids der Erfindung mit einer Verbindung, die durchgemustert werden soll; und
(b) Bestimmen, ob die Verbindung eine Aktivität des Polypeptids bewirkt. Phosphatonin-Polypeptide können eingesetzt werden, um nach Proteinen, die an Phosphatonin binden, oder nach Proteinen, an die Phosphatonin bindet, durchzumustern. Die Bindung von Phosphatonin und des Moleküls kann die Aktivität des Phosphatonins oder des gebundenen Moleküls aktivieren (Agonist), steigern, hemmen (Antagonist) oder abschwächen. Beispiele solcher Moleküle schließen Antikörper, Oligonucleotide, Proteine (z.B. Rezeptoren) oder kleine Moleküle ein.

Vorzugsweise ist das Molekül nah verwandt mit dem natürlichen Liganden von Phosphatonin, z.B. ein Fragment des Liganden oder ein natürliches Substrat, ein Ligand, ein strukturelles oder funktionelles Mimetikum; vgl. z.B. Coligan, Current Protocols in Immunology 1 (2) (1991); Kapitel 5. Ähnlich kann das Molekül nah verwandt sein mit dem natürlichen Rezeptor, an den Phosphatonin bindet, oder mindestens mit einem Fragment des Rezeptors, der in der Lage ist, von Phosphatonin gebunden zu werden (z.B. das aktive Zentrum). In beiden Fällen kann das Molekül unter Verwendung bekannter Verfahren rational entworfen werden; vgl. auch vorstehend.
Vorzugsweise schließt das Durchmustern nach diesen Molekülen das Herstellen geeigneter Zellen ein, die Phosphatonin entweder als ausgeschiedenes Protein oder auf der Zellmembran exprimieren. Bevorzugte Zellen schließen Zellen von Säugern, Hefe, Drosophila oder E. coli ein. Danach werden die Phosphatoninexprimierenden Zellen (oder die das exprimierte Polypeptid enthaltene Zellmembran) vorzugsweise mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht, welche möglicherweise das Molekül enthält, um eine Bindung, Stimulation oder Hemmung der Aktivität von entweder Phosphatonin oder des Moleküls festzustellen.
Der Test kann einfach die Bindung einer Kandidaten-Verbindung an Phosphatonin testen, wobei die Bindung durch eine Markierung oder in einem Test nachgewiesen wird, der die Kompetition mit einem markierten Kompetitor umfasst. Weiterhin kann der Test bestimmen, ob die Kandidaten-Verbindung zu einem Signal führt, das durch die Bindung an Phosphatonin erzeugt wird.
Alternativ kann der Test unter Verwendung von zellfreien Präparaten, eines Polypeptids/Moleküls, fixiert an einen festen Träger, von chemischen Banken oder natürlichen Produktgemischen durchgeführt werden. Der Test kann auch einfach die Schritte umfassen: Mischen einer Kandidaten-Verbindung mit einer Phosphatoninenthaltenden Lösung, Messen der Phosphatonin/Molekül-Aktivität oder -Bindung, und Vergleichen der Phosphatonin/Molekül-Aktivität oder -Bindung mit einem Standard.
Vorzugsweise kann ein ELISA-Test den Phosphatonin-Spiegel oder die Phosphatonin-Aktivität in einer Probe (z.B. einer biologischen Probe) unter Verwendung eines monoclonalen oder polyclonalen Antikörpers messen. Der Antikörper kann den Phosphatonin-Spiegel oder die Phosphatonin-Aktivität messen, entweder indem er direkt oder indirekt an Phosphatonin bindet oder indem er mit Phosphatonin um ein Substrat kompetiert.
Alle diese vorstehenden Tests können als diagnostische oder prognostische Marker verwendet werden. Die unter Verwendung dieser Tests entdeckten Moleküle können eingesetzt werden, um in einem Patienten eine Krankheit zu behandeln oder ein bestimmtes Ergebnis zu erreichen (z.B. Anstieg des Phosphatspiegels im Blut), indem das Phosphatonin/Molekül aktiviert oder gehemmt wird. Außerdem können durch die Tests Mittel entdeckt werden, welche die Produktion von Phosphatonin aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben hemmen oder steigern können.
Deshalb schließt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen ein, die an Phosphatonin binden, umfassend die Schritte:

(a) Inkubieren einer bindenden Kandidaten-Verbindung mit Phosphatonin; und
(b) Bestimmen, ob eine Bindung erfolgt ist.

Ferner schließt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Agonisten/Antagonisten ein, umfassend die Schritte:

(a) Inkubieren einer Kandidaten-Verbindung mit Phosphatonin;
(b) Testen einer biologischen Aktivität, wie vorstehend beschrieben; und
(c) Bestimmen, ob eine biologische Aktivität von Phosphatonin verändert wurde.

Wie vorstehend erwähnt, stellen die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine Grundlage für die Entwicklung mimetischer Verbindungen, die Inhibitoren oder Aktivatoren von Phosphatonin sein können, oder ihrer codierenden Gene bereit. Es ist so zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung auch zellbasierte Durchmusterungsverfahren bereitstellt, die eine Hochdurchsatz-Durchmusterung (HTS) von Verbindungen erlauben, die möglicherweise Kandidaten für solche Inhibitoren und Aktivatoren sind.
Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zum Identifizieren und Erhalten eines Arzneistoffkandidats für die Therapie von Störungen im Phosphatstoffwechsel, umfassend die Schritte:

(a) Inkontaktbringen des Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert, in Gegenwart von Verbindungen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf eine Phosphataufnahme bereitstellen können, mit dem Arzneistoffkandidaten, der durchgemustert werden soll, unter Bedingungen, bei denen ein Phosphatstoffwechsel zugelassen wird, und
(b) Nachweisen des Vorliegens oder der Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme des Signals, das aus dem Phosphatstoffwechsel erzeugt wird, wobei das Vorliegen oder die Zunahme des Signals einen mutmaßlichen Arzneistoff anzeigt.

Z.B. können die Nierenzelllinie CL8, menschliche primäre Nierenzellen oder primäre menschliche Osteoblastenzellen verwendet werden, um eine radioaktive N⁺-abhängige Phosphataufnahme und/oder Vitamin-D-Stoffwechsel unter Verwendung von Verfahren zu messen, die z.B. von Rowe 1996, vorstehend, beschrieben sind.
Weiterhin können Poly-A⁺-RNA oder Gesamt-RNA, extrahiert aus den in (a) beschriebenen Zellen, und Oligonucleotid-Primer, die zu der Sequenz für Phosphat-Transporter-Gene (NPTII usw.), renale 24-Hydroxylase, eine α-Hydroxylase, PTH oder Osteopontin komplementär sind, eingesetzt werden, um die Expression dieser Gene z.B. unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion zu messen.
Außerdem kann die Messung der Mineralisation menschlicher primärer Osteoblastenzellen unter Verwendung der von Kossa-Färbung durchgeführt werden.
Dieses Verfahren umfasst z.B.:

– Züchten menschlicher primärer Osteoblasten (zu beziehen von Clonetics-Biowhitaker) bis zur Konfluenz unter Verwendung von Medien, Zusätzen und Bedingungen, die von Clonetics empfohlen sind;
– für Mineralisierungexperimente: Versetzen der Zellen mit dem Phosphat-Donor β-Glycerinphosphat, und für Kontrollen: mit Hydroxycortison-11-hemisuccinat;
– Anreichern experimenteller Zellen mit β-Glycerinphosphat und MEPE, 25 ng/ml;
– nach drei Wochen in Kultur und seriellen Austauschen von Medien Färben der Osteoblasten auf Knochenmineralisation unter Verwendung der von Kossa-Färbung, wie von Clonetics beschrieben (AgNO₃; Silbersalz-Fällung).

Weiterhin können Tests angewendet werden, welche die folgenden Vorgehensweisen umfassen:

– Perfusionsexperimente an Ratten und Messen der Effekte von Phosphatonin auf die renale Phosphataufnahme;
– Bestimmen der Expression eines Spektrums von relevanten Genen in der menschlichen Nierenzelllinie CL8 und der Effekte einer MEPE-Anreicherung, wie – Na⁺-Phosphat-Transporter, – 24- und 1-α-Hydroxylase, – Osteopontin und Osteocalcin;
– Co-Transfektionssystem in COS-Zellen mit MEPE und PHEX;
– Biotest-Untersuchungen unter Verwendung von Peptidfragmenten, die mindestens eines der vorstehend beschriebenen Motive umfassen. So umfasst ein anderes Nachweisverfahren die Messung von Proteinkinase C, Caseinkinase II, Tyrosinkinase oder andere Signaltransduktions-Stoffwechselwege in Zellen, die mit Phosphatonin und Peptidderivaten in Kontakt gebracht werden, anhand herkömmlicher Techniken. Weiterhin können die in den beigefügten Beispielen beschriebenen Verfahren einfach an die vorstehend beschriebenen Durchmusterungsverfahren angepasst werden.

Der Arzneistoffkandidat kann eine einzelne Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen sein. Der Begriff „Vielzahl von Verbindungen" in einem Verfahren der Erfindung ist als eine Vielzahl von Substanzen zu verstehen, die identisch sein können, jedoch nicht identisch sein müssen. Die Verbindung oder die Vielzahl von Verbindungen kann chemisch synthetisiert oder mikrobiologisch hergestellt sein, und/oder sie kann z.B. in Proben, z.B. Zellextrakten aus z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen, enthalten sein. Weiterhin kann (können) die Verbindung(en) dem Fachmann bekannt sein, wobei jedoch bisher nicht bekannt war, dass sie in der Lage ist (sind), Phosphatonin-Polypeptide oder andere Komponenten im Phosphatstoffwechsel zu unterdrücken oder zu aktivieren. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zell- oder Gewebekultur umfassen. Geeignete Ansätze für das hier beschriebene Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. allgemein beschrieben in: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3. Aufl. (1994), und in den beigefügten Beispielen. Die Vielzahl von Verbindungen kann z.B. zu dem Reaktionsgemisch oder Kulturmedium zugefügt, in eine Zelle injiziert oder auf andere Weise an das transgene Tier appliziert werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine Wirtszelle, Säugerzelle oder ein nicht-menschliches transgenes Tier der Erfindung, wie in den vorstehenden Ausführungsformen beschrieben.
Wenn eine Probe, die eine Verbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen enthält, im Verfahren der Erfindung identifiziert wurde, ist es entweder möglich, die Verbindung aus der ursprünglichen Probe zu isolieren, für die bestimmt wurde, dass sie die Verbindung enthält, welche Phosphatonin unterdrücken oder aktivieren kann, oder man kann weiterhin die ursprüngliche Probe unterteilen, z.B. wenn sie eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungen enthält, um auf diese Weise die Zahl unterschiedlicher Substanzen pro Probe zu reduzieren, und sodann das Verfahren mit den unterteilten Fraktionen der ursprünglichen Probe wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Proben können die vorstehend beschriebenen Schritte mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise so lange, bis die gemäß dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur eine begrenzte Zahl von Substanzen oder nur eine Substanz enthält. Vorzugsweise umfasst die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am stärksten bevorzugt sind die Substanzen identisch.
Die Verbindungen, die gemäß einem Verfahren der Erfindung getestet und identifiziert werden können, können Expressionsbanken, z.B. cDNA-Expressionsbanken, Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Moleküle, Hormone, Peptidomimetika, PNAs oder dergleichen sein (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879–880; Hupp, Cell 83 (1995), 237–245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193–198; und vorstehend zitierte Referenzen). Außerdem können Gene, die einen mutmaßlichen Regulator von Phosphatonin-Protein codieren und/oder die ihre Effekte stromauf- oder stromabwärts des Phosphatonin-Proteins der Erfindung ausüben, identifiziert werden, indem z.B. eine Insertionsmutagenese unter Verwendung von z.B. Gen-Targeting-Vektoren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. z.B. pShooter-Plasmid-Serien, welche die Expression zielgerichtet zu Nucleus, Mitochondrien oder Cytoplasma hinsteuern, pEF/myc/nuc, pCMV/myc/nuc, pEF/myc/mito, pCMV/myc/mito, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto oder pDISPLAY-Expressionsvektor, der rekombinante Proteine zur Oberfläche von Säugerzellen hinsteuert. Alle diese Vektoren sind von Invitrogen zu beziehen (http://www.invitrogen.com/).
Die Bestimmung, ob eine Verbindung in der Lage ist, Phosphatonin-Proteine zu unterdrücken oder zu aktivieren, kann z.B. durchgeführt werden, indem die Na⁺-abhängige Phosphataufnahme oder Knochenmineralisation überwacht wird; vgl. vorstehend. Weiterhin kann sie durchgeführt werden, indem die phänotypischen Eigenschaften der mit den Verbindungen in Kontakt gebrachten Zelle der Erfindung überwacht und mit denjenigen von Wildtyp-Zellen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform können die Eigenschaften mit denjenigen einer Zelle verglichen werden, die mit einer Verbindung in Kontakt gebracht wurde, von der bekannt ist, das sie entweder in der Lage ist oder nicht in der Lage ist, Phosphatonin-Proteine zu unterdrücken oder zu aktivieren.
Sobald die beschriebene Verbindung identifiziert und erhalten wurde, wird sie vorzugsweise in einer therapeutisch verträglichen Form bereitgestellt. Somit wird hier ein Verfahren zum Herstellen eines therapeutischen Wirkstoffs offenbart, das die Schritte der Verfahren der Erfindung, wie vorstehend beschrieben, umfasst; und

(i) Synthetisieren der in Schritt (b) eines Verfahrens der Erfindung erhaltenen oder identifizierten Verbindung oder eines Analogons oder Derivats davon in einer ausreichenden Menge, um das Mittel in einer therapeutisch wirksamen Menge einem Patienten zur Verfügung zu stellen; und/oder
(ii) Kombinieren der in Schritt (b) eines Verfahrens der Erfindung erhaltenen oder identifizierten Verbindung oder eines Analogons oder Derivats davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

Verfahren für die Herstellung von chemischen Derivaten und Analoga sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. beschrieben in: Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, NY, 10010 USA, und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Außerdem können die Derivate und Analoga gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, synthetisiert und auf ihre Effekte getestet werden; vgl. auch vorstehend und nachstehend.
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Anmeldung die Bereitstellung von Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die den Phosphatstoffwechsel aufgrund ihrer direkten oder indirekten Aktivierung von Phosphatonin modulieren können. Demgemäß liegen auch Verbindungen im Umfang der vorliegenden Erfindung, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung als Inhibitoren bzw. als Aktivatoren der Phosphatoninaktivität identifiziert wurden.
Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen Zusammensetzungen, die mindestens eines/einen/eine der vorstehend erwähnten Polynucleotide, Nucleinsäuremoleküle, Vektoren, Proteine, regulatorischen Sequenzen, rekombinanten DNA-Moleküle, Antikörper oder Verbindungen umfassen. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung Bestandteile wie Puffer, Kälteschutzmittel usw., die mit den erwähnten Bestandteilen der Erfindung nicht natürlich assoziiert sind und die zur Folge haben, dass diese für eine praktische Verwendung geeignet sind.
Es ist von Vorteil, wenn die Zusammensetzung für die Verwendung als ein Medikament, ein diagnostisches Mittel oder ein Kit geeignet ist. Arzneimittel werden noch ausführlicher in den Beispielen 6 und 7 beschrieben. Insbesondere können bioaktive Fragmente, wie vorstehend beschrieben, als ein Medikament für die Behandlung einer Störung des Phosphatstoffwechsels wie X-gebundener Rachitis und Osteomalazie und anderer Krankheiten des Knochenmineralstoffwechsels geeignet sein. Weiterhin werden Phosphatonin und PHEX-Metallopeptidase als ein Kombinationspräparat für die gleichzeitige, getrennte oder aufeinander folgende Anwendung als ein Medikament bereitgestellt. Auf diese Weise kann die PHEX-Metallopeptidase eingesetzt werden, um Phosphatonin zu spalten, so dass aktive Phosphatonin-Fragmente hergestellt werden, die für die Behandlung von Störungen des Phosphatstoffwechsels, wie hier erörtert, eingesetzt werden können. Alle diese Krankheiten sind zwar bei Menschen besonders wichtig, jedoch können auch andere Säuger gemäß der Erfindung behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung hat erstmalig Phosphatonin in einer im Wesentlichen isolierten oder gereinigten Form, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen ist, bereitgestellt. Natives Phosphatonin und native Fragmente von Phosphatonin, die frei von Verunreinigungen wie SDS und/oder störenden Proteinen sind, sind in der Lage, den Phosphatstoffwechsel, wie hier beschrieben, zu regulieren und aktive Bestandteile in Arzneimitteln für die Behandlung von Krankheiten bereitzustellen, die mit Störungen des Phosphatstoffwechsels assoziiert sind.
Somit beschreibt die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Phosphatonin-Polypeptids der vorliegenden Erfindung oder einer DNA, welche das Polypeptid codiert und das Polypeptid exprimieren kann, des Antikörpers, des Aktivators/Agonisten, Inhibitors/Antagonisten oder Bindungspartners der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung des Phosphatstoffwechsels.
Insbesondere beschreibt die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Phosphatonin-Polypeptids mit Phosphatonin-Aktivität oder einer DNA, welche das Polypeptid codiert und das Polypeptid exprimieren kann, des Antikörpers, des Aktivators/Agonisten oder Bindungspartners der Erfindung, deren Vorliegen in der Zelle zu einer Phosphatonin-Aktivität führt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hyperphosphatämie, vorzugsweise zur Behandlung der renalen Osteodystrophie, Hyperphosphatämie bei Nierendialyse/Prädialyse, sekundärem Hyperparathyroidismus oder Osteitis fibrosa cystica.
Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Phosphatonin-Polypeptids mit anti-Phosphatonin-Aktivität oder einer DNA, welche das Polypeptid codiert und das Polypeptid exprimieren kann, des Antikörpers der Erfindung, des Nucleinsäuremoleküls oder des Inhibitors/Antagonisten der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hypophosphatämie, vorzugsweise für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von X-gebundener hypophosphatämischer Rachitis, hereditärer hypophosphatämischer Rachitis mit Hyperkalzurie (HHRH), hypomineralisierten Knochenläsionen, von verkümmertem Wachstum bei Jugendlichen, onkogener hypophosphatämischer Osteomalazie, renalem Phosphatverlust, renaler Osteodystrophie, Osteoporose, Vitamin-D-resistenter Rachitis, Endorgan-Resistenz, renalem Fanconi-Syndrom, autosomaler Rachitis, Paget-Krankheit, Nierenversagen, Nierentubulusazidose, zystischer Fibrose oder Sprue.
Weiterhin werden das Phosphatonin-Polypeptid mit anti-Phosphatonin-Aktivität oder eine DNA, welche das Polypeptid codiert und das Polypeptid exprimieren kann, der Antikörper der Erfindung, das Nucleinsäuremolekül der Erfindung oder der Inhibitor/Antagonist beschrieben, dass sie für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung mit Knochenmineralverlust geeignet sind.
Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung die Verwendung eines Phosphatonin-Polypeptids und einer PHEX-Metallopeptidase für die Herstellung eines Kombinationspräparats für eine gleichzeitige, getrennte oder nacheinander erfolgende Verwendung zur Behandlung einer Störung des Phosphatstoffwechsels.
Die vorstehend beschriebenen Anwendungen und Verfahren werden in Beispiel 6 noch ausführlicher beschrieben.
Außerdem wird hier die Verwendung einer transformierten Osteoblasten- oder Knochen-Zelllinie, die zur Phosphatonin-Überexpression in der Lage ist, für die Produktion und Isolierung von Phosphatonin beschrieben.
Die folgenden Beispiele sind angegeben, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen, wie verschiedene Aspekte der Erfindung durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen, und sollen den Umfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, in keiner Weise einschränken, außerdem sollen sie nicht so aufgefasst werden, dass sie bedeuten oder implizieren, dass die nachstehenden Experimente alle oder die einzigen Experimente darstellen, die durchgeführt wurden. Man hat sich bemüht sicherzustellen, dass die verwendeten Zahlenangaben (z.B. Mengen, Temperaturen usw.) korrekt sind, jedoch sollte mit einem gewissen experimentellen Fehler und mit einer gewissen Abweichung gerechnet werden. Sofern nichts anderes angegeben ist, stellen Teile auf Gewicht bezogene Teile dar, bedeutet das Molekulargewicht das auf Gewicht bezogene durchschnittliche Molekulargewicht, und die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1: Reinigung von Phosphatonin aus einem Tumor
Ein mesenchymaler Tumor mit phosphaturischer Expression wurde aus einem Patienten entfernt, und die folgenden Proben wurden genommen:

A: Eine Probe eines reinen Tumorgewebes in der Größe von zwei großen Erbsen wurde in ein 2-ml-Gläschen gegeben, das DMEM-Eagle/10 % FCS/Glutamin/Antibiotikum-Antimykotikum, Gibco-BRL, enthielt.
B: Eine Probe eines Subdura-Tumors in etwa der gleichen Größe, möglicherweise etwas kleiner. Diese wurde in die gleichen Medien wie in A gegeben.
C: Eine Probe einer abnormen Dura: zähes weißes Material. Diese wurde in die gleichen Medien wie in A gegeben.
D: Eine Probe einer Tumorflüssigkeit.

Bearbeiten der Proben:
Tag 1:
Die Proben wurden unter Verwendung eines sterilen Skalpells jeweils in kleine 0,5-cm-Würfel geschnitten. Die Hälfte jeder Probe wurde in ein Gefrierröhrchen gegeben und unmittelbar in N2 (1) eingefroren. Auch die das Gewebe umgebende Flüssigkeit (DMEM/10 % FCS usw.) wurde gewonnen und eingefroren. Die andere Hälfte jeder Probe wurde zu DMEM-Eagle/10 % FCS/Glutamin/Antimykotikum-Antibiotikum, ergänzt mit Kollagenase A1, 0,2 mg/ml (etwa 15 ml), zugegeben und das Ganze über Nacht bei 37°C gehalten.
Tag 2:

1. Nach einer Übernacht-Inkubation in mit Serumergänztem DMEM schienen die Zellen hauptsächlich RBCs zu sein, und sehr wenige sich anheftende Zellen wurden beobachtet. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur abzentrifugiert und die Überstände gesammelt und unmittelbar eingefroren (etwa 15 ml).
2. Danach wurden die Pellets in 10 ml DMEM-Eagle, ergänzt mit Antibiotikum/Antimykotikum (Medium-Flaschen), resuspendiert und danach weitere acht Stunden 10 Minuten inkubiert.
3. Die serumfreien Überstände wurden, wie in Punkt 1 beschrieben, gewonnen (etwa 10 ml), und die Zellen wurden in DMEM-EAG mit 10 % FCS usw. (etwa 15 ml) resuspendiert, und die Inkubation wurde fortgesetzt. Die Überstände wurden bei –80°C gelagert.

Tag 6:

1. Nach der Inkubation von Tag 2 wurden die Zellen, wie für Punkt 1 von Tag 2 beschrieben, abzentrifugiert. 10 % FCS-Proben wurden gewonnen und eingefroren.
2. Die Pellets wurden in serumfreiem DMEM (10 ml), wie für Tag 2 beschrieben, resuspendiert und dieses Mal vier Stunden belassen.
3. Das Gleiche wie für Punkt 3 von Tag 2 beschrieben.

Tag 7:

1. In der Subdura- und insbesondere in der Tumorkultur hatten sich unzählige Foci entwickelt, die Klumpen von Zellen enthielten, die an den Kunststoff der Gewebekulturplatten angeheftet zu sein schienen. Unterhalb dieser Polypartigen Vorsprünge lag eine Einzelschicht von Fibroblasten-artigen Zellen, die sich von unterhalb der Tumor-artigen Strukturen aus strahlenförmig ausbreiteten. Diese Zellschicht schien als eine Matrix zu wirken, um die Polyp-artigen Tumoren zu verankern. Keine dieser Strukturen wurde in der Dura-Probe gefunden, hier schienen Zellen in diesem Stadium zu fehlen, sie enthielt Faser-artige verfilzte Strukturen.
2. Die Kulturen wurden abzentrifugiert und die Überstände gewonnen (10 % FCS). Danach wurden die Pellets zur Seite gelegt.
3. Danach wurden die Platten mit 10 ml Trypsin-EDTA-Lösung, Gibco/BRL, Verdünnung von 1/10 in PBS, etwa 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Platten kräftig abgeklopft und 5 ml FCS zugegeben.
4. Die resuspendierten Zellen wurden sodann zu den in Punkt 2 erhaltenen Pellets zugegeben, resuspendiert und abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
5. Anschließend wurden die Zellen in 18 ml 10 % FCS-DMEM-Eagle-Medium mit Ergänzung von Glutamin und Antibiotikum/Antimykotikum ausplattiert (große Flaschen wurden verwendet).
6. Schließlich wurden die Zellen bei 37°C in CO₂-Atmosphäre inkubiert.

Tag 9:

1. Die Tumorzellen und in einem gewissen Ausmaß die Subdura-Zellen traten als zahllose Klumpen von Zellen auf und schienen die gleiche Morphologie wie die Zellen vor der Trypsin-Behandlung zu haben. Einige der Klumpen waren ziemlich groß und mit dem bloßen Auge sichtbar.
2. Die mit Serumergänzten Medien wurden gewonnen und aufbewahrt. Große Flaschen wurden verwendet und 18 ml Medium pro Flasche zugegeben (DMEM, 10 % FCS, Antimykotikum/Antibiotikum, Glutamin).

Tag 13:

1. Die Zellen wurden eingefroren (etwa 15 ml) und in Falcons als 10 % FCS-DMEM-konditionierte Medien gelagert.
2. Die Zellen wurden in serumfreiem DMEM-Eag (etwa 11 ml) um 11:10 vormittags resuspendiert und sechs Stunden bei 37°C belassen (CO₂-Inkubator).
3. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und die Überstände gewonnen (serumfreie Kontrollmedien). Danach wurde 10 % FCS-DMEM-EAG zu den verbliebenen Zellen zugegeben.

Tag 16:
Das vorstehende Verfahren wurde wiederholt und Tumor-konditioniertes Medium (TCM) über mehrere Wochen gewonnen. Alternativ kann TCM von SaOS2-Zellen (ECACC 89050205) oder U2-OS-Zellen (ATCC HTB-96) gewonnen werden.
Reinigung von Phosphatonin:
Concanavalin A-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie:

1. 3 ml TCM wurden mit 1 M Natriumphosphat, pH 7,2, und 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 0,06 M Natriumphosphat, pH 7,2, und 0,5 M NaCl plus 0,01 % Natriumazid eingestellt.
2. Con A-Sepharose (Pharmacia-Code-Nr. 17-0440-01) kam in 20 % Ethanol an, und diese wurde zuerst mit mehreren Säulenvolumina Wasser gewaschen und danach in Laufpuffer äquilibriert. Eine kleine C10/10-Säule (Pharmacia, Code-Nr. C10/10 i.D. 10 mm) wurde mit ConA bis auf eine Höhe von 5,5 cm gepackt (Volumen von etwa 4,3 bis 5,0 ml). Die Äquilibration erfolgte bei einer maximalen Fließrate von 0,5 ml/Min..
3. Die Probe (eingestellt auf Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, 0,01 % Natriumazid) wurde sodann auf die Säule mittels Schwerkraftzuführung aufgetragen und noch dreimal erneut aufgetragen. Die Farbe der Probe machte es möglich, dass die Passage durch die Säule zu sehen war. Danach wurde ungebundenes Material gewonnen und als künftige Referenz gelagert.
4. Anschließend wurde das Waters-LC-System angeschlossen und die Probe mit mehreren Säulenvolumina Auftragepuffer gewaschen.
5. Nach Auftragen und Waschen erfolgte die Elution unter Verwendung von 60 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 0,5 M NaCl, 0,5 M α-Methyl-D- glucopyranosid, 0,01 % Azid-Puffer. Vgl. 1a. Ein einzelner Peak wurde nachgewiesen, und dieser wurde gewonnen.
6. Danach wurde die Säule laufen gelassen, bis eine Grundlinie entstand, max. etwa 40 ml, und anschließend über Nacht belassen.
7. Nach einer Übernacht-Inkubation in Methylglycosid-Puffer wurde ein zweiter Peak eluiert (vgl. 1b), der bei etwa 5 ml lag.
8. Der zweite Peak wurde gewonnen und gegen 0,05 M Essigsäure dialysiert und danach gefriergetrocknet. Sowohl die Cancanavalin-Peaks A1 (niedrige Affinität) als auch Concanavalin-A2 (hohe Affinität) hemmen wirksam den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport und den Vitamin-D-Stoffwechsel in einer menschlichen Nierenzelllinie (CL8). Die Hochaffinitäts-Fraktion, die menschliche Nierenzelllinie (CL8) und die für den Test verwendeten Bedingungen sind in Rowe et al., 1996, beschrieben. Eine weitere geeignete bekannte Nierenzelllinie für diesen Test ist die OK-Zelllinie, die als ECACC 91021202 hinterlegt wurde.

Kationenaustausch-Chromatographie unter Verwendung einer 1-ml-HiTrap-SP-Kationenaustauscher-Säule (Code-Nr. 17-1151-01; Pharmacia):

1. Danach wurde das gefriergetrocknete Protein in 0,05 M Ammoniumacetat, pH 5, wieder gelöst und sodann auf eine äquilibrierte 1-ml-HiTrap-Sp-Sepharose-Kationenaustauscher-Säule aufgetragen.
2. Die Säule wurde vor Zugabe der Probe durch Waschen mit Wasser und danach mit fünf Volumina Startpuffer (0,02 M Ammoniumacetat, pH 5) äquilibriert.
3. Die Probe wurde anhand des folgenden Protokolls eluiert:

Ein einzelner scharfer Peak wurde erhalten, und danach wurde die Probe gegen 0,05 M Essigsäure dialysiert und gefriergetrocknet; vgl. 2.
Nach Resuspendieren in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, wurden 20-μl-Aliquots in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert (auf eine Endkonzentration = 125 mM Tris-HCl, pH 6, 2,5 % Glycerin, 0,5 % (Gew./Vol.) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 0,01 % Bromphenolblau), gekocht (5 Min.), abgekühlt und danach auf einem SDS-PAGE-Gel, 12,5 %, laufengelassen (vgl. Chromatogramm), wodurch eine Doppelbande von 55 kD aufgelöst wurde (vgl. Rowe et al., 1996). Sowohl die Concanavalin-A- als auch die Kationen-Banden haben auch eine aggregierte Form. Alle Fraktionen, einschließlich der Tumor-konditionierten Medien, hemmten wirksam den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport in einer menschlichen Nierenzellline (Verdünnung von 1/1000) und veränderten außerdem den Vitamin-D-Stoffwechsel. Die vollständige Beschreibung der Verfahren, die zum Messen des Phosphat-Transports und des Vitamin-D-Stoffwechsels verwendet wurden, finden sich in: Rowe et al., 1996. Alle Reinigungsschritte wurden auf einem Waters-HPLC/FPLC-System durchgeführt, das durch Computer-Millennium-Software programmiert war. Die aktivste Fraktion war die Concanavalin-A1-Fraktion aus dem OHO-Tumor. Präoperative Antiseren wurden verwendet, um die immobilisierte gereinigte Fraktion durchzumustern. Die Fraktion hemmt auch wirksam NaPi und beeinflusst den Vitamin-D-Stoffwechsel in einer menschlichen Nierenzelllinie (CL8).
Beispiel 2: Durchmusterung von Tumor-konditioniertem Medium (TCM) und gereinigten Fraktionen mit prä- und postoperativen Antiseren: plus Glycogrotein-Durchmusterung
Präoperative und postoperative Antiseren aus einem Patienten wurden früher in Rowe et al., 1996, beschrieben. Nur präoperative Antiseren wiesen die gereinigten Fraktionen und Hormon in TCM nach, wobei der Western- und Glycoprotein-Nachweis von TCM und gereinigten Fraktionen unter Verwendung der erhöhten Chemilumineszenz erreicht wurde. Proteinmarker wurden biotinyliert und mit Streptavidin-Peroxidase-Konjugat markiert. Die Pfeile zeigen das Aggregat und aktives Glycoprotein. Postoperative Antiseren und Kaninchen-Präimmunseren wiesen keine der Fraktionen nach. Auch waren nur diejenigen Tumoren positiv, die einen phosphaturischen Faktor ausschieden. Medien- und Hautkontrollen waren negativ. Ein charakteristisches Merkmal der Con-A1-, Con-A2- und CA1-Proben war ihre starke Fähigkeit, in einer menschlichen Nierenzelllinie (CL8) NaPi zu hemmen und den Vitamin-D-Stoffwechsel zu verändern. Alle gereinigten Fraktionen haben eine Tendenz, auf SDS-PAGE zu einer Form mit geringerer Mobilität zu aggregieren. Außerdem sind die gereinigten Fraktionen und aktiven Fraktionen von TCM stark glycolsyliert. Das Ausmaß der Glycosylierung wurde durch Periodat-Oxidation von immobilisierten Proteinen auf PVDF-Membranen bestätigt, worauf eine Biotinylierung von Kohlenhydratresten folgte. Danach wurden diese mit Streptavidin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, und auf eine erhöhte Chemilumineszenz durchgemustert. Die aktive Form (hemmt NaPi usw.) ist mit der 58- bis 60-kDa-Fraktion assoziiert. Ein zusätzliches und leistungsstarkes Verfahren zum Reinigen des Proteins bis zur Homogenität besteht in der Verwendung eines SDS-PAGE-Systems bei neutralem pH-Wert, pH 7, unter Verwendung eines 4 bis 12 % Bis-Tris-Gels mit MOPS-Laufpuffer. Vorgegossene Gele können von Novex bezogen werden.
Beispiel 3: SDS-PAGE bei neutralem pH-Wert unter Verwendung von 4 bis 12 % Polyacrylamid-Gradienten- und Bis-Tris-Gel mit MOPS-Laufpuffer (Nu-PAGE-System von NOVEX): Reduzierte Mobilität von Hormon
Auf diesem System hat eine Fraktion des glycosylierten Hormons eine reduzierte Mobilität und läuft bei etwa 200 kDa. Außerdem ist die Form mit niedrigerem Molekulargewicht bei 58/60 kDa sichtbar. Das Auftreten des etwa 200-kDa-Proteins beruht möglicherweise auf dem isoelektrischen Punkt der Proteins (unterschiedliche Ladung bei neutralem pH-Wert) und auf der Wechselwirkung eines Kohlenhydratrestes mit der Gelmatrix. Außerdem kommt es oben auf dem Gradienten-Gel aufgrund des niedrigen prozentualen Acrylamidgehalts (4 bis 12 % Gradient) zu einer erhöhten Effizienz beim Elektroblotverfahren von Komponenten mit hohem Molekulargewicht. Wenn man Fraktionen durch dieses System laufen lässt, wird die Reinheit und Homogenität des Moleküls gesteigert. Durch einen Western-Blot unter Verwendung dieses Systems und einschließlich der folgenden Proben (präoperatives Antiserum wurde eingesetzt, um die Blots anhand des Nachweises der erhöhten Chemiluminescenz durchzumustern): 1. Proteinmarker; 2. intrakranielle Tumorzelllinie OHO; 3. Zellen aus der an den Tumor angrenzenden Subdura; 4. Zellen aus der an die Subdura angrenzenden Dura; 5. Zelllinie HTB6; 6. Zelllinie SaOS2; 7. definiertes Medium als Kontrolle; 8. Hautfibroblasten-Kontrolle; 9. Naevus-sebaceus-Polyp-Tumor machte deutlich, dass ein Naevus-Polyp-Tumor auf neutralen SDS-PAGE-Gelen eine spezifische phosphaturische Bande bei etwa 200 kDa zeigte.
Beispiel 4: Clonierung und Sequenzierung von Phosphatonin
1. Konstruktion einer Bank
Ein Tumor, der von einem in einer früheren Veröffentlichung beschriebenen Patienten stammte (BD, Rowe et al., 1996), wurde zerkleinert und die mRNA extrahiert, indem Standardverfahren verwendet wurden. Die mRNA wurde unter Verwendung einer reversen Transkriptase kopiert, so dass eine cDNA-Population hergestellt wurde, die anschließend in einen Bakteriophagen-Vektor, λ-ZAP II uni, cloniert wurde (der Vektor wurde bezogen von Stratagene Ltd., Unit 140, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, CB4 4GF, Großbritannien). Die Clonierung erfolgte in eine Richtung, und das 5'-Ende des Gens lag neben dem T3-Promotor und grenzte an eine EcoRI-Stelle. Das 3'-Ende der cDNAs grenzte an eine XhoI-Stelle stromaufwärts eines bakteriellen T7-Promotors. Kurz gesagt wurde der resezierte Tumor aus dem Patienten BD in 1-mm-Blöckchen geschnitten, und die Poly-A⁺-RNA direkt extrahiert, indem das Verfahren unter Verwendung von paramagnetischen Streptavidin-Magnesphere-Partikeln (PolyATract^®-System, Promega) genutzt wurde. Danach wurde die gereinigte mRNA dazu verwendet, eine cDNA-Matrize herzustellen, wobei der cDNA-Synthese-Kit von Stratagene eingesetzt wurde. Linker-Primer wurden zu der cDNA zugegeben, um ein 5'-EcoRI-kompatibles cDNA-Ende und ein XhoI-kompatibles 3'-cDNA-Ende zu erzeugen, wodurch ein forciertes gerichtetes Clonieren in den Bakteriophagen-Vektor λ ZAP II uni ermöglicht wird. Die rekombinanten Bakteriophagen wurden auf E. coli XL1-Blue mrf' ausplattiert und amplifiziert. Insgesamt lagen 800 000 der primären Clone vor, von denen 6 % den Wildtyp darstellten.
2. Durchmusterung mit präoperativen Antiseren:
Die cDNA-Bakteriophagen-Bank wurde auf NZY-Agarplatten ausplattiert und das β-Galactosidase-Operon unter Verwendung von IPTG induziert. Danach wurden die exprimierten Fusionsproteine auf Hybond-C-Membranen (Amersham) überführt und die Membranen anschließend mit präoperativen Seren aus dem Patienten durchgemustert. Die verwendeten Antiseren wurden beschrieben (Rowe et al., 1996). Vor der Verwendung wurden die Antiseren gründlich mit E. coli-Lysat und Vollblut vorabsorbiert, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Kaninchen-Antiseren, die gegen das präoperative Serum des Patienten BD erzeugt worden waren (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169), wurden gründlich mit normalem menschlichem Serum und E. coli-Lysat vorabsorbiert, um E. coli-Antikörper und die aus dem menschlichen Serum stammenden Hintergrund-Antikörper zu entfernen. Kurz gesagt wurden fünf Nitrocellulose-Filter mit einem Durchmesser von 80 mm zu Gesamt-E. coli-Lysat (Stratagene) zugegeben, und ein zweiter Satz von fünf Filtern wurde mit normalem menschlichem Serum (10 ml) getränkt. Die imprägnierten Filter wurden jeweils zehn Minuten bei Raumtemperatur nacheinander in 250 ml einer 1:1000-Verdünnung von anti-Kaninchen-präoperativen Antiseren in 1 % BSA; 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl (TBS); 0,02 % NaN₃ inkubiert. Die vorabsorbierten präoperativen Antiseren (Pre-Aanti-op) wurden sodann zum Durchmustern der cDNA-Bank verwendet. Die Bakteriophagen λZAP II uni-OHO-cDNA-Clone wurden auf E. coli XL1-Blue mrf' ausplattiert und drei Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die mit 10 mM IPTG vorinkubierten Hybond N⁺-Filter auf die sich entwickelnden Plaques aufgelegt und weitere drei Stunden bei 42°C inkubiert. Danach wurden die Filter entfernt und mit TBS, ergänzt mit Tween 20 (TBST), gewaschen und danach mit 1 % BSA in TBS mit 0,02 % NaN₃ über Nacht bei 4°C blockiert. Sodann wurde Pre-Aanti-op zu den blockierten Filtern zugegeben und diese wurden eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die anschließenden Waschgänge der Filter und die Inkubation mit einem Konjugat aus Ziegen-anti- Kaninchen und alkalischer Phosphatase, gefolgt von einer Sichtbarmachung unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium, wurden, wie beim Picoblue^TM-Immunscreening-Kit von Stratagene beschrieben, durchgeführt. Nach der Durchmusterung von etwa 600 000 Clonen wurden neun positive Clone selektiert und durch eine sekundäre und tertiäre Durchmusterung gereinigt. Die Bakteriophagen-Clone wurden unter Verwendung des ExAssist-Helferphagen als Phagemide gerettet und in E. coli SOLR-Zellen cloniert. ExAssist-Helferphage und SOLR-Zellen wurden von Stratagene Ltd., Suite 140, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge, CB4 4GF, Großbritannien, bezogen.
3. Sequenzierung von Clonen:
Phagemide wurden hergestellt und die DNA sequenziert. Alle neun Clone wurden sequenziert. Positive Bakteriophagen-Plaques wurden nach der tertiären Durchmusterung mit einer sterilen Hohlwelle („hollow quill") aus den Agaroseplatten entnommen. Die Agaroseklumpen, welche die lytischen Plaques enthielten, wurden sodann zu 0,5 ml SM-Puffer, ergänzt mit 0,02 % Chloroform, zugegeben und über Nacht bei 4°C belassen. Die Rettung und Transformation von Bakteriophagen-Clonen zu BSCPT SKII^–-Phagemiden erfolgten unter Verwendung des ExAssist-Phagen, wie von Stratagene beschrieben. Die Wirtszellen für das gereinigte Phagemid waren E. coli-SOLR-Zellen. Danach wurde Plasmid-DNA anhand von Standardverfahren hergestellt (Rowe, Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5134–5136) und unter Verwendung einer automatischen ABI-Fluoreszenz-Sequenzierung und herkömmlichen Vektor-spezifischen Primern sequenziert. Sechs der Clone überlappten und waren mit dem bakteriellen β-Galactosidase-Promotor im Raster, so dass aufeinander folgende/überlappende Epitope und exprimierte Proteine mit identischen überlappenden DNA-Sequenzen erhalten wurden. Der längste sequenzierte Clon umfasste die cDNA-Sequenzen der fünf anderen und ist in 8 dargestellt. Diese Sequenz (Aminosäure/cDNA) ist eine vollständige Sequenz für Phosphatonin. Cloniert sind hier 430 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) und 1655 bp einer DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1). Die Voraussage der Sekundärstruktur zeigt ein stark hydrophiles Protein mit Glycosylierung am COOH-Ende und das Vorliegen eines Zellanheftungs-Tripeptids am Aminoende (RGD), vgl. 8. Auch ist das Protein stark antigen, mit einer Reihe von helikalen Haupt-Domänen (10). Eine gründliche Durchmusterung aller verfügbarer Datenbanken unter Verwendung von BLAST hat keinerlei statistisch relevante Homologie zu bekannten Genen oder Proteinsequenzen gezeigt.
4. Reinigung eines rekombinanten menschlichen Phosphatonin:
Der isolierte cDNA-Clon wird als gerettete Phagemide in dem Vektor BSCPT SKII^– (Stratagene Vektor) dargestellt und ist in SOLR-E. coli-Wirtszellen enthalten.
Eine Expression des Fusionsproteins mit geringer Rate wurde über eine Induktion des β-Galactosidase-Promotors durch IPTG erreicht. Das Phosphatonin-Clon-Fusionsprodukt reagiert auf Western-Blots mit präoperativen Antiseren. Eine gesteigerte Expression und biologische Aktivität der Fusionsproteine kann durch Subclonierung in den Vektor pCAL-n-EK (Stratagene Vektor) erreicht werden (vgl. nachstehend). Das Konstrukt, welches menschliches Phosphatonin enthält, ist in E. coli (BL21 (DE3) pLysS)-Zellen (bezogen von Stratagene) enthalten. Die IPTG-Induktion des Fusionsproteins ist viel höher, und ein im Wesentlichen reines Protein kann durch Calmodulin-Affinitäts-Chromatographie von Zelllysaten erhalten werden. Rekombinantes Phosphatonin mit einem Fusionsmarker bindet in Gegenwart von Ca²⁺ an die Calmodulin-Säule. Danach wird das Phosphatonin-Fusionsprotein nach Waschen mit EGTA freigesetzt. Der kleine mikrobielle Fusionsmarker wird durch eine Behandlung mit Enterokinase entfernt, wodurch reines menschliches Phosphatonin zurückbleibt.
4a. Subclonierung von Phosphatonin in den Vektor pCAL-n-EK
Die gesamte hergeleitete codierende cDNA-Sequenz (hergeleitet vom größten cDNA-Clon pOHO11.1) von Phosphatonin (MEPE) wurde in das prokaryontische Expressionsvektor-Plasmid pCAL-n-EK (Stratagene Vektor) subcloniert und das Konstrukt in E. coli BL21 (DE3) pLysS bzw. E. coli XL1-Blue mrf' transformiert (Stämme wurden von Stratagene bezogen). Das Verfahren der Ligierungsunabhängigen Clonierung LIC wurde, wie durch Stratagene Affinity^TM-Clonierungs- und Proteinreinigungskit (Kat.-Nr. #214405 und #214407) beschrieben, eingesetzt. Zwei Primer wurden aus dem 5'- bzw. 3'-Ende der Phosphatonin-Sequenz mit zusätzlichem Überhang einer Linkersequenz wie folgt entworfen (die fett geschriebene Sequenz stellt den Linker dar):
Die PCR-Amplifikation von Phosphatonin umfasst eine DNA-Sequenz, welche den ersten Valinrest bis zum Stoppcodon von Phosphatonin codiert (vgl. 8), plus die Linker-Sequenz. Anschließend wird ein 5'-Überhang der Linker-Sequenz erzeugt, indem das PCR-Fragment mit Pfu-Polymerase und dATP behandelt wird. Die Induktion des Fusionsproteins erfolgt, indem die Zellen gezüchtet werden und IPTG zugefügt wird. Die Bedingungen der PCR waren wie folgt: Vordenaturierung: 95°C, 3 Min., gefolgt von 20 Zyklen mit Denaturierung: 95°C, 45 Sek., Anelierung: 59°C, 60 Sek., 72°C, 2 Min., und eine letzte Verlängerung: 72°C, 7 Min., gefolgt von Abkühlen auf 4°C. Ein Perkin Elmer 9600-Thermalcycler wurde programmiert, dass die PCR durchgeführt wurde, und der folgende PCR-Puffer (PB) wurde verwendet: 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1 μM der Primer, 200 μM dNTPs. Der PB-Puffer wurde mit 2 mM MgCl₂ ergänzt. Für eine Ligierungs-unabhängige Clonierung (LIC) wurde das amplifizierte Produkt sodann mit pfu-Polymerase und dATP, wie von Stratagene beschrieben, behandelt, und danach wurde es direkt an den linearisierten Plasmidvektor pCAL-n-EK mit komplementären Linker-Überhängen aneliert. Anschließend wurde das Konstrukt in kompetente E. coli XL1-blue mrf'-Zellen transformiert, und danach wurden kompetente E. coli BL21 (DE3)-Clone auf Ampicillin-Platten selektiert und Plasmide hergestellt und sequenziert. Eine Zusammenfassung des Vektors und Fusionskonstrukts ist in 14 dargestellt. Mit dem Wirt E. coli XL1-blue mrf' erhält man ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, und mit E. coli BL21 (DE3) erreicht man eine hohe Expressionsrate des rekombinanten Proteins.
4b. Reinidung von Phosphatonin durch Calmodulin-Affinitätsharz
Das von Stratagene beschriebene Verfahren (Kat.-Nr. 214405) kann verwendet werden. Eine Sequenz stromaufwärts der Phosphatonin-spezifischen Reste wird eine Calmodulin-bindende Sequenz enthalten. Das Calmodulin-Harz wird zu dem rohen Zelllysat in Gegenwart von Calcium zugegeben, und die Bindung des Proteins wird zugelassen. Danach wird die Aufschlämmung mit Calciumenthaltendem Puffer gewaschen, und das Phosphatonin-Fusionsprotein wird durch Zugabe von 2 mM EGTA in einem Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8) eluiert. Anschließend erfolgt die Entfernung des Calmodulin-bindenden Proteinmarkers durch Spaltung mit der stellenspezifischen Protease EK, wodurch reines rekombinantes menschliches Phosphatonin zurückbleibt. Vorzugsweise kann das Verfahren wie folgt durchgeführt werden (die Pufferzusammensetzungen finden sich in der nachstehenden Tabelle):

1. Die Zellen werden, wie durch das Protokoll von Stratagene für pCAL-n-EK-Vektoren (Kat.-Nr.: #214405) beschrieben, unter Verwendung von E. coli-Wirtszellen BL23 (DE3), umfassend das Plasmid p1BL21, gezüchtet und induziert; vgl. 14.
2. Auch das Proteinlysat wird, wie im Protokoll von Stratagene beschrieben, hergestellt, wobei jedoch CCBB-II als Resuspensionspuffer verwendet wird (das Zellpellet aus 500 ml wird in 10 ml CCBB-II resuspendiert). Es ist erforderlich, eine Beschallung mit 30-Sek.-Pulsen durchzuführen, worauf 4 Min. Kühlen mit Eis folgt. Die Röhrchen, welche die Zellen enthalten, werden während der Beschallung auf Eis gehalten.
3. Nach der Beschallung werden die Zellen bei 10 000 g abzentrifugiert und der Überstand wird dekantiert. Der Großteil des rekombinanten MEPE bleibt im Überstand (Proteinlysat).
4. Danach wird das Proteinlysat unter Verwendung der Konzentrationsapparatur VIVASCIENCE VIVASPIN (Kat.-Nr.: VS1521, bezeichnet mit: 30,000 MWCO PES) mit einem Molekulargewichts-Ausschluss von 30.000 eingeengt. Etwa 8 ml Überstand aus 500 ml Zellen ergeben ein Konzentrat von 3,2 ml (2,5-fach konzentriert). Eine weitere Einengung ist nicht ratsam.
5. Für ein Proteinlysat, das aus 190 bis 200 ml Zellen hergestellt wurde (etwa 1,3 ml äquivalentes Proteinlysat), wird sodann 1 ml äquilibriertes Calmodulin-Harz zugegeben (das Harz wird, wie von Stratagene beschrieben, unter Verwendung von CCBB-II-Puffer äquilibriert).
6. Die Suspension wird über Nacht bei 4°C mit Rotationsbewegungen bewegt.
7. Die Suspension wird abzentrifugiert (etwa 3000 UpM auf einer Eppendorf-Zentrifuge, 2 Min.), der Überstand wird entfernt und das Harz in 1 ml CCBB-II-Puffer resuspendiert.
8. Das Harz wird erneut abzentrifugiert und die erste Waschlösung entfernt. Dies wird noch zweimal wiederholt (insgesamt drei Waschgänge in CCBB-II).
9. Danach wird das Harz einmal mit WB-III gewaschen; es ist anzumerken, dass keiner der Puffer, einschließlich des letzten Waschpuffers, Detergenzien enthält. Die für den Bioassay verwendeten Zellen sind extrem empfindlich gegenüber Detergenzien, sogar wenn diese nur in Spurenmengen vorliegen. WB-III ist das Gleiche wie CCBB-II, jedoch ohne Protease-Inhibitoren.
10. Unspezifische Proteine werden durch zweimaliges Waschen mit dem Puffer EB-I (1 ml) eluiert.
11. MEPE wird zwei- bis dreimal mit EB-II (1 ml) eluiert.
12. Das Protein wird unter Verwendung einer Konzentrationsapparatur Flowgen 10K Mikrosep bei 4°C eingeengt. Im Allgemeinen können 3 ml des MEPE-Eluats in zwei Stunden auf etwa 170 μl eingeengtwerden.
13. Nachdem die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen
wurden, um die Reinheit und die Menge zu bestimmen, werden zahlreichen Aliquots hergestellt und bei –80°C eingefroren. Ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird vermieden.

Puffer:
Wenn Protease-Inhibitor-Tabletten verwendet wurden, wurden sie mit einer Tablette pro 10 ml zugegeben (Boehringer Mannheim), Protease-Inhibitor ohne EDTA (Kat.-Nr.: 1836 170). Eine letzte Elution mit einem 1 M NaCl, EGTA (4 mM) enthaltenden Puffer führt zu einer Reinheit von Phosphatonin von > 95 %.
Beispiel 5: Struktur von Phosphatonin
1. Primärstruktur und Motive:
Die Primärstruktur der Protein- und der Nucleinsäuresequenz sind in 8 dargestellt. Der größte für MEPE isolierte cDNA-Clon bestand aus 1655 bp und enthielt das gesamte 3'-Ende des Gens mit einem Poly-A⁺-Schwanz und einer einzelnen Polyadenylierungssequenz (AA[T/U]AAA) (8). Ein offenes Leseraster von 430 Resten wurde gefunden, das die anderen isolierten, kleineren MEPE-cDNA-Clone überlappte und verlängerte, mit einem vorausgesagten Mr von 47,3 kDa und einem pl-Wert von 7,4. Das am besten passende Consensus-Startcodon (Kozak, Nucleic Acids Res. 15 (1987), 8125–8148) liegt bei 255 bp, obwohl davor noch zwei andere Methioninreste stehen. Es ist möglich, dass eine zusätzliche 5'-Sequenz fehlt, wobei ein früheres Startcodon und/oder eine erweiterte 5'-untranslatierte Sequenz noch charakterisiert werden müssen/muss. Die GCG-Voraussage der Sekundärstruktur zeigt, dass das Protein sehr hydrophil ist und dass drei lokalisierte Bereiche mit niedriger Hydrophobie vorliegen (9). Das Protein hat Glycosylierungsmotive an den Resten 382 und 385 (NNST) und den Resten 383 bis 386 (NSTR). Außerdem gibt es eine Glycosaminoglycan-Anlagerungsstelle an den Resten 161 bis 164 (SGDG). Das ungefähre Molekulargewicht ohne Glycosylierung beträgt 54 kDa und stimmt gut mit der gereinigten glycosylierten Form von 58 bis 60 kDa überein. Es gibt eine Reihe von Motiven für Phosphorylierungstellen (vgl. Tabelle 1), wobei man voraussagen kann, dass diese in der biologischen Aktivität des Hormons oder von Fragmenten davon eine Rolle spielen. Tabelle 1
Ein entscheidendes Merkmal des Proteins ist eine Zellanlagerungssequenz an den Resten 152 bis 154 (RGD). Die Arg-Gly-Asp-Sequenz spielt in Rezeptor-Wechselwirkungen im Allgemeinen eine Rolle und ist in Fibronectin für die Zelloberflächenrezeptor-Bindung an ein spezifisches Integrin essentiell. Noch beachtenswerter ist das Vorliegen dieses Motivs in einigen Formen von Kollagenen (Knochenmatrixprotein), Fibrinogen, Vitronectin, Von-Willebrand-Faktor (VWF), Schlangen-Disintegrinen und Schleimpilz-Discoidinen. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist dieser Teil des Phosphatonins an Rezeptor- und/oder Knochenmineral-Matrix-Wechselwirkungen beteiligt. Außerdem vermitteln diese Wechselwirkungen das Folgende:

1. Osteoid-Mineralisation (Osteoblasten).
2. Regulation der Expression des Gens des Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransporters.
3. Regulation der Expression des Gens der 24-Hydroxylase und/oder der 1-α-Hydroxylase (Niere).
4. Knochen- und Zahnmineral-Matrix-Wechselwirkungen und Regulation der Mineralablagerung über Keimbildung.

Das Vorliegen einer Glycosaminoglycan-Anlagerungssequenz an den Resten 161 bis 164 (SGDG) hat wichtige Folgen, welche die Knochenmineral-Anlagerung und Wechselwirkungen betreffen. Die Rolle von Proteoglycanen im Knochen ist besonders in der Zell-Signalgebung gut dokumentiert. Es ist sehr wahrscheinlich, dass dieser Teil des Moleküls auch für die vorstehenden biologischen Aktivitäten (Punkt 1 bis 4) und insbesondere für eine Osteoblasten-vermittelte Mineralisation von Osteoid essentiell ist.
Das RGD-Motiv liegt in einer Region einer vorausgesagten Schleife (Voraussage nach Garnier, Antheprot) und wird von zwei Regionen eines β-Faltblatts flankiert (Reste 134 bis 141 und 172 bis 178). Die vorausgesagte Faltblattstruktur wiederum wird von zwei Regionen einer verlängerten α-Helix flankiert (121 bis 132 und 196 bis 201). Der allgemeine strukturelle Zusammenhang, die vorausgesagte Schleife und das Vorliegen der RGD-Zellanlagerungssequenz sind ähnlich wie die Strukturen, die in Osteopontin gefunden werden. Außerdem hat das Protein eine Reihe von vorausgesagten Phosphorylierungsmotiven für Proteinkinase C, Caseinkinase II, Tyrosinkinase und eine cAMP/cGMP-abhängige Proteinkinase. Ferner wurde gefunden, dass MEPE eine große Zahl von N-Myristoylierungsstellen aufweist, wobei diese Stellen ein Merkmal von RGD-enthaltenden Phosphoglycoproteinen zu sein scheinen (Osteopontin, Vitronectin, Kollagen, h-Integrin-bindendes Protein, Dentin-Sialophosphoprotein, Dentinmatrix-Protein-1, Knochen-Sialoprotein-II und Fibronectin). Es liegt ein ungewöhnlich hoher Gehalt an Aspartat-, Serin- und Glutamatresten vor (26 %), wie dies auch im Osteopontin der Fall ist (37 %). Von besonderem Interesse ist die vollständige Abwesenheit von Cysteinresten in der MEPE-Sequenz, dies zeigt, dass Cystein-Cystein-Disulfidbrücken in der Sekundärstruktur dieses Moleküls keine Rolle spielen. Eine Sequenzhomologie mit Dentin-Phosphoryn (DPP) wurde gefunden, nachdem die TrEMBL-Datenbank mit MEPE durchgemustert wurde. Eine Region am C-Terminus von MEPE hat eine Sequenz von Aspartat- und Serinresten (Reste 414 bis 427), die fast identisch sind (Homologie von 80 %) mit einem in DPP gefundenen wiederkehrenden Motiv (26A und 26B). Der physikalisch-chemische Vergleich des MEPE-Motivs (DDSSESSDSGSSSESD) mit dem DSP-Motiv (SDSSDSSDSSSSSDSS) erhöht die Homologie auf 93 %. Das MEPE-Motiv tritt einmal am C-Terminus in MEPE auf (Reste 414 bis 427), wohingegen das DSP-Homolog an den DSP-Restepositionen 686 bis 699, 636–646 und 663 bis 677 wiederholt wird. Außerdem wurden die zwei verwandten Sequenzen DSSDSSDSNSSSDS und DSSDSSDSSNSSDS, auch mit einer Homologie von 80 % zum MEPE-Motiv, in DSP an den Positionen 576 bis 589 bzw. 800 bis 813 gefunden. Ein ähnliches Motiv mit einer Homologie von 60 % (DDSHQSDESHHSDESD) wurde auch im Osteopontin gefunden (Reste 101 bis 116), und eine Caseinkinase-II-Phosphorylierungsstelle ist innerhalb der homologen Region enthalten (12). Die Aktivität der Skelett-Caseinkinase-II ist bei der X-gebundenen Rachitis defekt (Rifas, vorstehend). Obwohl das Osteopontin-MEPE-Motiv zentral und nicht C-terminal vorliegt, wurde eine Spaltung von Osteopontin in vivo beschrieben, hierdurch würde ein Peptid erzeugt werden, bei dem das MEPE-Motiv C-terminal platziert ist (Smith, J. Biol. Chem. 271 (1996), 28485–28491). Eine weitere Sequenzhomologie zu dem C-terminalen MEPE-Motiv liegt auch in DMA-1 an den Resten 408 bis 429 vor (SSRRRDDSSESSDSGSSSESDG). Eine grafische Darstellung der regionalen Sequenzhomologie des MEPE-Motivs in DSSP, DMA-1 und OPN findet sich in 12 als eine statistische „Llanview"-Darstellung, und in Tabelle 2 sind die Sequenzähnlichkeiten beim Alignment dargestellt. Tabelle 2 MEPE im Vergleich mit DSSP

MEPE im Vergleich mit Osteopontin:
Osteopontin im Vergleich mit DSSP:
Von Interesse ist das wiederholte Auftreten des Motivs an der C-terminalen Region von DSSP oder am Dentin-Phosphoryn-Teil. In 13 ist ein Punktmatrix-Sequenzvergleich von MEPE mit DSSP bei hoher und niedriger Stringenz dargestellt, und hierbei wird das wiederholte Auftreten des Aspartat-Serin-reichen MEPE-Motivs in DSSP gezeigt.
DPP wird durch die posttranslationale Spaltung eines viel größeren Proteins, des Dentin-Sialo-Phosphoproteins (DSSP), in die zwei verschiedenen Proteine DPP und Dentin-Sialoprotein (DSP) gebildet. Es liegt eine beträchtliche Sequenzhomologie von MEPE und Osteopontin mit dem Dentin-Phosphoryn (DPP), einem Teil des Dentin-Sialo-Phosphoproteins (DSSP), vor, während keine Homologie mit dem Dentin-Sialo-Proteinteil des Moleküls DSP zu sehen ist (13). Zu beachten ist das nahe Alignment des RGD-Motivs, von Caseinkinase-II-Phosphorylierungsmotiven und N-Glycosylierungsstellen in sowohl DPP als auch MEPE (13). Auch sind alle Proteinkinase-C-Stellen, die mit DSSP assoziiert sind, in der Region der Überlappung mit MEPE (Dentin-Phosphoryn-Teil) gruppiert, und keine sind im DSP-Teil des Moleküls zu finden.
2. Sekundärstruktur
GCG-Peptidstruktur-Voraussageprofile von Hydrophobie/Hydrophilie, Antigenität, Flexibilität und Zelloberflächen-Wahrscheinlichkeit sind in den 3 bis 6 dargestellt. Diese Figuren zeigen die GCG-Peptidstruktur-Voraussageanalyse der primären Aminosäuresequenz. Die Hydrophobie- und Hydrophilieindizes sind als Dreiecke bzw. Ovale dargestellt. Glycosylierungsmotive sind an den Resten 382 bis 386 als Kreise auf Stielen angegeben. Glycosylierungsymbole sind in 6 noch deutlicher zu erkennen. Die Protein-Schleife ist durch die Form der Linie angegeben, welche die primäre Aminosäuresequenz darstellt. Regionen einer α-Helix-, Spiralen- und Faltblattstruktur sind durch lokalisierte Wellenlinien bezeichnet (vgl. Einzelheiten in 7). Die Computer-Voraussagen wurden unter Verwendung der GCG-Software gemacht, die vom HGMP Resource Center Cambridge (Rice, 1995) Programme Manual for the EGCG-Package stammte (Cambridge, CB10 1RQ, England: Hinxton Hall). Ein auffälliges Merkmal ist das Fehlen von Sistinresten und das hohe Ausmaß an Hydrophilie, mit vier kleineren Stellen mit niedrigen Hydrophobieindizes (Reste 48 bis 53, 59 bis 70, 82 bis 89 und 234 bis 241). Das Protein hat kein Transmembran-Profil, wie aus einer Sekundärstruktur-Voraussage unter Verwendung der Antheroplot-Software hergeleitet wurde. Außerdem ist das Protein stark antigen und flexibel (4 und 5). Das gesamte Sekundärstruktur-Profil zeigt, dass es sich um ein extrazellulär ausgeschiedenes Protein handelt, und dies stimmt mit der vorgeschlagenen Funktion des Proteins überein. 7 zeigt die Helix-, Faltblattstruktur, die Schleifen- und Spiralen-Regionen des Phosphatonins.
Dies beruht auf der Voraussage unter Verwendung der Garnier-Analyse des
Antheprot V2.5e-Pakets. Die vier Linien in jedem Abschnitt (von oben bis unten) stellen Helix-, Spiralen-, Faltblatt- und Schleifen-Wahrscheinlichkeitsindizes der primären Aminosäuresequenz dar. Die grafische Darstellung unten zeigt die gleichen Ergebnisse in Blockform. Auffällig ist der hohe Gehalt an Helix, insbesondere am NH₂-Terminus und auch in Richtung zum C-Terminus, dies hat möglicherweise einen funktionellen Zusammenhang.
Beispiel 6: Medizinische Anwendungen von Phosphatonin und Phosphatonin-Fragmenten
Verschiedene Störungen sind für eine Behandlung unter Verwendung der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung zugänglich.
X-gebundene Rachitits (Hyophosphatämie) (HYP):
Die X-gebundene hypophosphatämische Rachitis ist eine der häufigsten vererbten Krankheiten des Knochenmineralstoffwechsels (Rowe, 1997). Bioaktive Fragmente von Phosphatonin wie solche, die durch PHEX gespalten werden, und das ungespaltene Hormon werden in der Behandlung der Krankheit eine Hauptrolle spielen. Es wird vorausgesagt, dass das clonierte und hier beschriebene Protein mit seinem entsprechenden Rezeptor in der Niere interagiert und eine Hemmung der Expression eines renalen Na-abhängigen Phosphat-Cotransporters (NaPi) sowie eine entweder direkte oder indirekte Hochregulation einer renalen 24-Hydroxylase bewirkt. Außerdem wird vorausgesagt, dass es die Expression einer renalen 1-α-Hydoxylase (direkt/indirekt) herunterreguliert. Nach der Spaltung mit PHEX oder anderen posttranslationalen Modifikatoren wird vorausgesagt, dass die von dem Hormon stammenden Peptidfragmente die gegenteilige biologische Funktion aufweisen (Hochregulation von NaPi, Herunterregulation von 24-Hydroxylase, Hochregulation von 1-α-Hydroxylase). Für das Fragment, welches die RGD-Zellanlagerungsreste (152 bis 154) aufweist, wird vorausgesagt, dass es in den Rezeptor-Wechselwirkungen eine Rolle spielt, wobei jedoch auch andere Peptidderivate Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen für andere biologische Aktivitäten vermitteln können. Außerdem werden Phosphatonin-Derivate in der Normalisierung der hypomineralisierten Knochenläsionen eine wichtige Funktion ausüben. Dabei wird vorausgesagt, dass dies durch Vermitteln von Änderungen in der Osteoblasten-vermittelten Mineralisation des Osteoids und durch Korrigieren der abnormen Expression/Phosphorylierung der Knochenmineral-Matrixproteine (Osteopontin/Osteocalcin) erfolgt. Die RGD-Zellanlagerungssequenz und auch das Glycosaminoglycan-Anlagerungsmotiv könnten für die funktionelle Keimbildung und Kristallisation von Hydroxylapatit und Knochenmineral erforderlich sein.
Die Beeinträchtigung des Wachstums ist ein Hauptmerkmal von HYP, und die zurzeit verwendeten Behandlungen sind ungeeignet. Eine Behandlung durch Verabreichung von Phosphatonin-hergeleiteten Fragmenten kann dies im Gegensatz zu einer Ergänzungsbehandlung mit anorganischem Phosphat und Vitamin D möglicherweise korrigieren.
Demgemäß zählen zu den nützlichen Effekten von Peptidfragmenten von Phosphatonin:

1. Korrektur von Hypophosphatämie (NaPi, vorzugsweise renaler);
2. Normalisierung der Aktivtät von 24-Hydroxylase, 1-α-Hydroxylase (renale);
3. Mineralisation von Knochen und Knochenreparatur (Korrektur/Prophylaxe von Rachitis);
4. Vollständiges Verschwinden von Knochenschmerz-Symptomen;
5. Korrektur von verkümmertem Wuchs.

Onkogene hypophosphatämische Osteomalazie (OHO):
Das klinische Profil von OHO ist ähnlich wie bei HYP. Hier liegen vor: ein Entweichen von Phosphat aus der Niere, niedrige zirkulierende Spiegel von 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D₃ (Calcitriol), eine erhöhte alkalische Phosphatase, Knochen-Hypomineralisation, die sich in Erwachsenen als eine allgemeine Knochenerweichung (Osteomalazie) präsentiert, und niedriges Serumphosphat. Die Pathophysiologien von HYP und OHO überlappen sich deutlich. Bei Rachitis ist der Defekt ein nicht-funktionelles PHEX-Gen. Bei OHO jedoch ist der Defekt zirkulierendes nicht-prozessiertes Phosphatonin. Die Tumoren sind oft schwer zu finden, und ihre Resektion kann extrem schwierig und gefährlich sein. Wenn eine Entfernung des Tumors kontraindiziert ist, ist eine Kontrolle des Phosphatstoffwechsels und der Knochenmineralisation entscheidend. Man kann davon ausgehen, dass die Verabreichung von PHEX zur Spaltung des Hormons an Patienten gefährlich ist, da möglicherweise andere zirkulierende Hormone und Proteine durch eine wahllose Spaltung beeinflusst werden können. Stattdessen könnten Phosphatonin-Fragmente so entworfen werden, dass sie eine hohe Rezeptoraffinität und biologische Aktivität aufweisen, so dass sie wirksam mit einem von einem Tumor stammenden, nicht-prozessierten zirkulierenden Hormon kompetieren würden.
Andere Rachtitis- oder hypophosphatämische Zustände:
Außer HYP und OHO gibt es zahlreiche Ursachen für Rachitis, die meisten umfassen Anomalien von Vitamin D, es gibt jedoch auch andere Ursachen wie Hypophosphatämie, Nierentubulusazidose, die Verwendung bestimmter Medikamente, Sprue, zystische Fibrose usw.. Die Verwendung von Fragmenten von Phosphatonin und von Phosphatonin selbst kann beim Behandeln dieser Krankheiten von Nutzen sein. Einige der Krankheiten werden nachstehend kurz besprochen (Krankheiten, die zu Hyperphosphatämie führen, können möglicherweise durch Verwendung des vollständigen Hormons behandelt werden).
– Nierentransplantate und renale Osteodystrophie:
Ein chronisches Merkmal der Nierentransplantation ist die Entwicklung des Entweichens von Phosphat aus der Niere (Hypophosphatämie) und einer abnormen Knochenmineralisation. Phosphatonin-Fragmente wären in der Behandlung dieser Zustände wirksam, ohne die mit den herkömmlichen Medikationen einhergehenden Nebenwirkungen zu verursachen.
Die Osteodystrophie (eine Kombination von Knochenstörungen) wird üblicherweise durch chronisches Nierenversagen (Nierenkrankheit) verursacht. Ein Nierenversagen führt zum Tod, wenn nicht eine Dialyse erfolgt (Endstadium des Nierenversagens). Deshalb erhalten Patienten mit Osteodystrophie normalerweise eine Dialysetherapie. Diese Knochenkrankheit, die auch als „renale Osteodystrophie" bezeichnet wird, ist bei Patienten mit chronischer Hämodialyse häufig. Ein sekundärer Hyperparathyroidismus entwickelt sich in den meisten Patienten mit chronischem Nierenversagen und geht mit dem histologischen Befund der Osteitis fibrosa cystica einher. Die Krankheit ist durch Wachstumsstörungen und schwere Knochendeformitäten bei Kindern, insbesondere bei den sehr kleinen Kindern, gekennzeichnet. Die Pathogenese der renalen Osteodystrophie hängt mit einer Phosphat-Retention (Hyperphosphatämie) und deren Wirkung auf den Calcium- und Calcitriol-Stoffwechsel zusammen, und außerdem mit der jeweiligen Rolle, welche die metabolische Azidose, Cytokine und der Abbau von Nebenschilddrüsenhormon spielen. Die Behandlung schließt eine Einschränkung der Phosphataufnahme mit der Nahrung, Phosphatbinder und die Verwendung aktiver Metaboliten von Vitamin D ein. In diesem Zusammenhang wäre die Zugabe von nicht-prozessiertem Hormon ein wirkungsvolles Mittel, um die Phosphatspiegel zu kontrollieren, und dies würde zur Heilung der Knochen führen. Falls Rezeptoren für Phosphatonin sowohl in einem Spektrum von Geweben als auch in der Niere exprimiert werden, dann besteht die Möglichkeit, dass auch Patienten im Endstadium der Nierenerkrankung (d.h. bei einem vollständigen Verlust der Nierenfunktion) behandelt werden können.
– Osteoporose/Knochenmineralverlust:
Bei Frauen in der Postmenopause besteht die Neigung, dass Knochenmineral verloren geht, wodurch es anschließend zu einer Schädigung der Aufbaus des Skeletts kommt. Die Ursache ist unbekannt, es ist jedoch wahrscheinlich, dass eine komplexe Wechselwirkung von genetischen und Umweltfaktoren beteiligt ist. Die gegenwärtige Forschung konzentriert sich auf die Vervollkomnung statistischer Modelle, um multifaktorielle Krankheiten wie Osteoporose zu analysieren.
Die Verwendung von Phosphatonin-hergeleiteten Fragment(en) würde dazu beitragen, diese Krankheit zu behandeln, indem der Verlust von Knochenmineral möglicherweise umgekehrt wird. Außerdem könnten die bioaktiven Peptide so modifiziert werden, das die Stärke und Spezifität der Wirkung erhöht werden.
– Paget-Krankheit des Knochens:
Die Paget-Krankheit tritt aufgrund einer asynchronen Knochen-Remodellierung auf. Die Knochenmineralisation (vermittelt durch Osteoblasten) und die Knochenresorption (vermittelt durch Osteoklasten) sind aus dem Gleichgewicht geraten. Es tritt eine exzessive resorptive Aktivität der Osteoklasten auf (hauptsächlich in der frühen resorptiven Phase), und Knochenmark wird durch fibröses Gewebe und desorganisierte Trabeculae ersetzt. Obwohl die Ursache unbekannt ist, kann die Verabreichung von Peptidderivaten von Phosphatonin möglicherweise in der Behandlung der Krankheit hilfreich sein.
– Krankheiten, die mit Störungen im NaPi in anderen Geweben als der Niere zusammenhängen:
Der Natrium-abhängige Phosphat-Cotransporter (NaPi) wird nicht nur in der Niere exprimiert, sondern auch in zahlreichen anderen Geweben. Drei Typen von NaPi, nämlich Typ 1, II und III, wurden bisher beschrieben, und alle sollen in der Niere exprimiert werden. In anderen Geweben als der Niere soll der Typ III ubiquitär exprimiert werden (Murer, Eur. J. Physiol. 433 (1997), 379–389; Kavanaugh, Kidney Int. 49 (1996), 956–963), und für Typ 1 wurde bestätigt, dass er zusätzlich zur Niere in der Leber und im Gehirn exprimiert wird (Hilfiker, PNAS 95 (1998), 14564–14569). Andererseits wurde angenommen, dass der Typ II nur im proximalen Tubulus der Niere exprimiert wird.
Obwohl bekannt ist, dass der proximale Tubulus der Niere alle drei vorstehenden Typen exprimiert, ist es allgemein anerkannt, dass der Typ II hinsichtlich der Phosphat-Reabsorption an dieser Stelle die wichtigste Rolle spielt. Dies wurde durch eine Knockout-Maus gezeigt, in der das Gen (mit Npt2 bezeichnet), welches den Typ II-NaPi codiert, inaktiviert war. Die homozygoten Mutanten (Npt2-/-) zeigten eine erhöhte Phosphatausscheidung im Urin, Hypophosphatämie, Erhöhung der Serumkonzentration von 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D und andere typische Symptome der hereditären hypophosphatämischen Rachitis mit Hyperkalzurie (HHRH) (Beck, PNAS 95 (1998), 5372–5377). Da die Regulation der Phosphat-Homöostase in Säugern größtenteils durch die Niere bestimmt wird, geht man davon aus, dass dieses Ergebnis deutlich macht, dass der Typ II-NaPi von den drei Typen die wichtigste Rolle in der systemischen Phosphat-Homöostase spielt. Außerdem zeigen diese Tatsachen zusammen mit dem Ergebnis aus dem Experiment mit der CL8-Zelllinien in den Beispielen, dass es sich bei dem NaPi, der durch Phosphatonin in der Niere reguliert wird, hauptsächlich um den Typ II handelt.
Eines der größten klinischen Probleme bei Patienten mit Nierenversagen ist die Hyperphosphatämie. Wenn ein solches exzessives Serumphosphat kontrolliert werden könnte, wäre dies für die Klinik von signifikanter Bedeutung. Deshalb haben Phosphatonin, seine Fragmente oder Derivate, die NaPi herunterregulieren und den Serumphosphatspiegel reduzieren können, einen großen potentiellen Wert. In Patienten mit progressivem Nierenversagen (vor dem sogenannten Endstadium der Nierenerkrankung = ESRD) wird eine Herunterregulation der NaPi-Expression in der Niere durch Phosphatonin von Nutzen sein.
Sobald jedoch bei diesen Patienten das ESRD eingetreten ist und die Nieren praktisch nicht mehr funktionieren, wird Phosphatonin schließlich seine Wirkstelle in der Niere verlieren, da kein Phosphat mehr aus den Glomeruli ausgeschieden wird. In einem solchen Krankheitsstadium besteht ein möglicher Wert darin, die Phosphatabsorption aus der Nahrung im Verdauungstrakt zu steuern. Der Verdauungstrakt, insbesondere der Darm, ist der einzige Ort, wo Phosphat aus der Nahrung in den Kreislauf aufgenommen wird. Deshalb wird es das nächste wichtige Ziel sein, die Phosphataufnahme in den Kreislauf zu steuern, nachdem die Nieren nicht mehr funktionieren.
Es wurde berichtet, dass ein Subtyp des Typ 11-NaPi, genannt Typ IIb, aus dem Darm der Maus cloniert wurde (Hilfiker, PNAS 95 (1998), 14564–14569). Obwohl noch geklärt werden muss, ob Phosphatonin auf den Typ IIb-NaPi des Darms wirken kann, ist es angemessen davon auszugehen, dass dieser Typ IIb-NaPi im Darm bei der Absorption von Phosphat aus der Nahrung eine entscheidende Rolle spielt und dass Phosphatonin möglicherweise der bedeutsamste Faktor für seine Hoch- und Herunterregulation ist.
Beispiel 7: Arzneimittel
Arzneimittel können formuliert werden, die ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei gegebenenfalls ein pharmazeutisch verträglicher/s Excipient, Verdünnungsmittel oder Träger beigemischt wird. Die genaue Natur und die genauen Mengen der Bestandteile solcher Zusammensetzungen können empirisch bestimmt werden und hängen zum Teil von der Verabreichungsroute der Zusammensetzung ab. Routen für eine Verabreichung an einen Patienten schließen eine orale, bukkale, sublinguale, topische (einschließlich einer Verabreichung ins Auge), rektale, vaginale, nasale und parenterale (einschließlich einer intravenösen, intraarteriellen, intramuskulären, subkutanen und intraartikulären) Verabreichung ein. Um eine unerwünschte Proteolyse zu vermeiden, ist eine parenterale Route bevorzugt.
Geeignete Dosierungen eines Moleküls der vorliegenden Erfindung werden variieren, abhängig von Faktoren wie der Krankheit oder Störung, die behandelt werden soll, der Verabreichungsroute und dem Alter und Gewicht des Individuums, das behandelt werden soll. Z.B. kann für eine parenterale Verabreichung eine tägliche Dosis von 0,1 μg bis 1,5 mg/kg eines Moleküls der Erfindung geeignet sein, um einen typischen Erwachsenen zu behandeln. Besser geeignet wäre eine Dosis, die bei 1 μg bis 150 μg liegt. Demgemäß geht man davon aus, dass der Polypeptid-Wirkstoff in einem Dosisbereich von 0,01 bis 100 mg, typischerweise von 0,1 bis 10 mg pro Tag an einen erwachsenen Menschen verabreicht werden kann.
Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung werden üblicherweise z.B. eine Lösung des Moleküls, gelöst in einem verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, wie Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin usw.. Es ist von Vorteil, wenn solche Lösungen steril und im Allgemeinen frei von Aggregat und anderen partikulären Stoffen sind. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Puffer enthalten, um den pH-Wert einzustellen oder die Toxizität zu verändern, z.B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat usw.. Die Konzentration des Moleküls in diesen Formulierungen kann stark variieren, z.B. von weniger als etwa 0,5 Gew.-% bis zu so viel wie 15 oder 20 Gew.-%, und könnte vom Fachmann geeignet ausgewählt werden.
Typische Arzneimittel sind ausführlich beschrieben in: Remington's Pharmaceutical Science, 15. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980). Z.B. könnten Arzneimittel für die Injektion so hergestellt werden, dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg des Moleküls enthalten. Eine typische Zusammensetzung für die Infusion könnte so hergestellt werden, dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg des Moleküls enthält. Effektive Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen sind dem Fachmann bekannt oder für ihn offensichtlich. Vorgehensweisen für Formulierung und Verabreichung von Polypeptid-Arzneimittteln sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. erörtert von P. Goddard, in: Advanced Drug Delivery Reviews 6 (1991), 103–131.
Beispiel 8: Weitere Charakterisierung von Phosphatonin (MEPE) und seines codierenden Gens
Klinisches Profil von Patienten (BD, ND, EM und DS) mit onkogener Osteomalazie:
Der Patient BD wurde in einer früheren Veröffentlichung beschrieben (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169), und außerdem wurde ein Fallbericht für den Patienten ND veröffentlicht (David, J., Neurosug. 84 (1996), 288–292). Beide Patienten zeigten eine klassische Tumor-Osteomalazie und präsentierten sich mit niedrigem Serumphosphat und einer radiologischen Osteomalazie sowie einem niedrigen Serum-1,25-Vitamin-D₃. Der Patient BD (eine 44 Jahre alte Frau) und der Patient ND (eine 66 Jahre alte Frau) zeigten nach der Entfernung von Tumoren aus der linken Nasenhöhle (Hämangioperizytom) bzw. dem intrakraniellen Raum (mesenchymaler Hämangioperizytom-ähnlicher Tumor) eine vollständige Remission der Symptome. Die Patientin ND hatte innerhalb von 20 Jahren drei solche Operationen, und nach jeder Resektion trat eine Remission ein.
Tumor-konditionierte Medien:
Tumorproben aus sowohl BD, ND als auch EM wurden unmittelbar nach der Resektion gewonnen. Danach wurden die Proben in etwa 1-mm-Stückchen geschnitten und einige in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die restlichen Stückchen des Tumorgewebes wurden, wie früher beschrieben, für eine Gewebekultur bearbeitet (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Kurz gesagt wurden Proben über Nacht mit Kollagenase gespalten und danach alternierenden Kulturzyklen in Gegenwart und in Abwesenheit von Serum unterworfen (DMEM-Medien). Beim Patienten ND wurden auch noch zusätzliche Proben aus der umgebenden Subdura und der Dura gewonnen und, wie vorstehend beschrieben, behandelt. Außerdem wurden Haut-Fibroblasten-Kulturen als Kontrolle aus Patient BD am gleichen Tag wie die Tumorresektion entnommen und in gleicher Weise wie die Tumorproben behandelt. Die Proben aus Patient BD wurden wie folgt bezeichnet: 1: Tumorkonditionierte Medien (TCM-BD); 2: Haut-konditionierte Medien (SCM-BD). Die Proben aus Patient ND wurden wie folgt bezeichnet: Tumor-konditionierte Medien (TCM-ND); 2: Subdura-konditionierte Medien (SDCM-ND); 3: Dura-konditionierte Medien (DCM-ND); 4: Flüssigkeit, die den intrakraniellen Tumor umgab (FST-ND). Alle Proben wurden aus Kulturzyklen gewonnen, in denen die Zellen in serumfreien DMEM-Medien gezüchtet wurden, sofern im Text nicht zusätzlich zu den vorstehenden Abkürzungen noch „Serum-ergänzt" angegeben ist.
Concanavalin-A-Aftinitäts-Chromatographie von TCM:
Die Concanavalin A-Affinitäts-Chromatographie eines Tumor-konditionierten Mediums (TCM) aus Patient ND, durchgeführt gemäß Beispiel 1, führte zur Isolierung von Fraktionen mit hoher und mit niedriger Affinität (HCA bzw. LCA). Sowohl HCA- als auch LCA-Fraktionen wurden mit α-Methyl-D-glucopyranosid- (0,5 M) Elutionspuffer eluiert. Kurz gesagt wurde eine teilweise Reinigung von TCM-Proteinen durch Concanavalin A-Affinitäts-Chromatographie durchgeführt, indem das von Wagner (Gen. Comp. Endocrinol. 63 (1986), 481–491) beschriebene Verfahren mit Modifikationen verwendet wurde. Zuerst wurde die Concanavalin A-Sepharose (Pharmacia, Code-Nr.: 17-0440-01, 14 ml) in 20 ml Ethanol mit mehreren Säulenvolumina Wasser gewaschen und danach in Laufpuffer äquilibriert (CRB: 0,06 M Natriumphosphat, pH 7,2, und 0,5 M NaCl). Die äquilibrierte Aufschlämmung wurde sodann auf eine Pharmacia Säule mit Schraubverschluss von 12 mm × 115 mm aufgetragen und drei Säulenvolumina CRB-Laufpuffer mit einer Fließrate von 0,4 ml/Min. wurden zugegeben (FPLC/HPLC Millenium Waters-Chromatographiesystem). Anschließend wurden die in CRB-Puffer (10 ml) äquilibrierten konditionierten Medien auf die Säule aufgetragen und ihre Bindung zugelassen. Danach wurde die Säule mit mehreren Säulenvolumina von CRB-Auftragepuffer gewaschen, und anschließend erfolgte die Elution gebundener Proteine durch Zusatz von Natriumphosphat-Elutionspufter (ERB: 60 mM, pH 7,2, 0,5 M NaCl, 0,5 M α-Methyl-D-glucopyranosid, 0,01 % Azid) bei einer Fließrate von 0,2 ml/Min. (40 ml). Hochaffinitätsproteine wurden eluiert, nachdem eine Inkubation der Säule über Nacht in ERB-Puffer und anschließend eine zweite Passage von ERB-Puffer mit 0,2 ml/Min. erfolgt waren. Die Elutionsprofile für Concanavalin-A-TCM-Proteine mit hoher und mit niedriger Affinität waren beide identisch und erzeugten einen einzelnen symmetrischen Peak bei etwa 1,6 Säulenvolumina. Der Peak LCA stellte 1/3 der Gesamtmasse von Peak HCA dar, und 1 μg HCA-Material wurde aus 10 ml Tumor-konditionierten Medien (TCM) aus Patient ND gewonnen.
SDS-PAGE von TCM und Concanavalin A-Fraktionen:
Tumor-konditioniertes Medium, konditionierte Medien und Concanavalin A-Peaks (HCA und LCA) wurden durch SDS-PAGE getrennt und nach SYBR-Orange-Färbung sichtbar gemacht. Die SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Novex NuPAGE^TM-Elektrophorese-Systems, bestehend aus 4 bis 12 % Bis-Tris-Acrylamid-Gradientengelen (pH 6,4), und MOPS-SDS-Laufpuffer (50 mM 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure, 50 mM Tris-Base, 3,5 mM SDS, 1,0 mM EDTA, pH 7,7) durchgeführt. Die Läufe wurden bei konstanter Spannung von 200 für 50 Min. durchgeführt. Die Proben wurden zehn Minuten bei 70°C in NuPage-LDS-Probenpuffer (10 % Glycerin, 1,7 % Tris-Base, 1,7 % Tris-HCl, 2 % Lithiumdodecylsulfat, 50 mM Dithiothreit, 0,015 % EDTA, 0,075 % Serva Blue G250, 0,025 % Phenolrot, pH 7,5, Endkonzentration) denaturiert. NuPage-Antioxidans wurde zur oberen Elektrophoresekammer, wie von den Herstellern empfohlen, zugegeben. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine durch Inkubieren der Gele in 7,5 % Essigsäure, versetzt mit SYPRO-Orange, angefärbt. Die Proteine wurden sodann durch UV-Bestrahlung unter Verwendung eines BioRad-Fluorlmager-Gel bildgebungssystems sichtbar gemacht. HCA- und LCA-Fraktionen wurden für zwei Proteine bei 56 kDa bzw. 200 kDa positiv angefärbt und ergaben identische Profile. Konditionierte Medien (Patient ND) aus Material des intrakraniellen Tumors, der Subdura (unmittelbar angrenzend an den Tumor im Patienten) und der Dura enthielten mehrere Hauptbanden, die den Bereich von etwa 50 bis 80 kDa überspannten. Eine auffallende Bande lag in allen Präparaten bei etwa 66 kDa vor, und eine schwächere Komponente mit sehr hohem Molekulargewicht bei etwa 200 kDa war in Tumor- und Subdura-Material vorhanden. Die relative Intensität der etwa 200-kDa-Bande war im Tumormaterial am höchsten und fehlte im Dura-Material. Ein diffuser Satz von Banden bei etwa 55 bis 60 kDa lag im Tumor und in der Subdura vor, fehlte jedoch in den Dura-konditionierten Medien (Patient ND). Konditionierte Medien von der Haut und Kontrollmedien zeigten keinerlei Färbung für Protein. Konditionierte Medien von den Patienten BD und EM ergaben ähnliche Profile, mit der Ausnahme, dass das Protein mit dem hohen Molekulargewicht bei 200 kDa fehlte.
Nicht-phosphaturische Tumorgewebe aus den Patienten LA und SL und außerdem Hautkontrollen enthielten alle die 66-kDa-Bande und außerdem eine diffuse Färbung bei 50 bis 60 kDa. In den Concanavalin A-Affinitäts-Peaks HCA und LCA war die hochmolekulare 200-kDa-Bande angereichert und sie enthielten auch Proteine aus dem Bereich von 50 bis 66 kDa. Konditionierte Medien von den Knochenzelllinien HTB96 und SaOS2 ergaben fast identische Proteinprofile wie Tumor-konditionierte Medien aus dem OHO-Patienten ND. Die Intensität der 200-kDa-Bande in SaOS2 war im Vergleich zu TCM von dem Gehirntumor (Patient ND), der Subdura (Patient ND) und dem CM von HTB96 reduziert.
Immunblot-Verfahren mit und Glycoprotein-Färbung von TCM und gereinigten Fraktionen:
Für das Western-Blot-Verfahren wurden die Proteine unter Verwendung einer submarinen Elektrophorese auf PVDF-Membranen (Amersham) überführt. Nach der SDS-PAGE-Elektrophorese wurden die Gele in Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 0,38 M Glycin, 0,2 % SDS (TB)) eine Stunde bei Raumtemperatur äquilibriert. Die PVDF-Membranen wurden auf die richtige Größe zugeschnitten, kurz in Methanol gespült, in destilliertem Wasser gewaschen und danach in TB äquilibriert. Das äquilibrierte Gel und die PVDF-Membran wurden sodann in Sandwich-Anordnung zwischen Filter gelegt und in eine Kassette eingebracht. Danach wurde die Kassette in eine submarine Hoeffer-System-Elektroblot-Apparatur mit TB-Puffer eingebracht und die Kühlung mit einem Thermokühler bei 4°C gehalten. Die Übertragung der Proteine erfolgte dann, indem das PVDF-Ende der Sandwich-Anordnung zur Anode hin ausgerichtet wurde und die Elektrophorese bei konstanten 0,4 A (45 V) 45 Minuten durchgeführt wurde. Die Blots wurden mit einer 1/1000-Verdünnung von Prä-anti-op-Antiseren, Post-anti-op-Antiseren oder Calmodulin, konjugiert an alkalische Phosphatase, durchgemustert, wobei die Verfahren verwendet wurden, die im Enhanced-Chemiluminescence-Kit (Amersham; ECL+) bzw. im Calmodulin Affinity Detection-Kit (Stratagene) beschrieben sind. Die Chemilumineszenz wurde unter Verwendung des Bio-Rad Fluorlmaging-Systems nachgewiesen und gefilmt, und die Calmodulin-Affinitäts-Bindung wurde sichtbar gemacht, indem das kolorimetrische System verwendet wurde, das schon früher für den Clon-Nachweis beschrieben wurde (Stratagene). Biotinylierte Molekulargewichts-Marker (Amersham) wurden als innere Kontrollen eingesetzt, um die Übertragung und das Molekulargewicht zu beurteilen. Streptavidin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP), wurde zu dem sekundären Antikörper (Ziegen-anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an HRP) zugegeben, um die Sichtbarmachung der biotinylierten Marken mittels Chemilumineszenz zu erleichtern.
Western-Blots von mit phosphaturischem Tumor konditionierten Medien (TCM) aus OHO-Patienten ergaben positive chemilumineszierende Banden, wenn sie mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren durchgemustert wurden. Nicht-phosphaturische Tumoren, Gewebekontrollen aus der Haut und Medium-Kontrollen waren alle negativ, wenn sie mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren durchgemustert wurden. Auch waren alle TCM und Proben von konditionierten Medien negativ, wenn sie mit postoperativen Antiseren durchgemustert wurden.
Die Durchmusterung von TCM-Proteinen aus Patient ND und den Osteosarkom-Zelllinien HTB96 und SaOS2 mit vorabsorbiertem präoperativem Antiserum ergab zwei verschiedene immunpositive Banden bei etwa 54 bis 57 kDa und etwa 200 kDa. Die Tumorprobe von Patient ND und das angrenzende Subdura-Gewebe ergaben im Vergleich zu den mit Dura-Gehirn-Probe konditionierten Medien viel stärkere 54- bis 57-kDa-Signale, und für die 200-kDa-Bande wurde in den Dura-konditionierten Medien keine Färbung gefunden. Sowohl die HCA- als auch die LCA-Concanavalin-A-Fraktionen enthielten ein sehr starkes Signal für die 200-kDa-Bande und ein reduziertes, jedoch sichtbares Signal bei 54 bis 57 kDa. Die Zelllinien SaOS2 und HTB96 waren auch für die gleichen Banden positiv, wobei jedoch SaOS2-konditionierte Medien im Vergleich zu TCM und HTB96 ein reduziertes Signal für die 200-kDa-Bande aufwiesen.
Haut-konditionierte Medien (Patienten ND und BD) und Medium-Kontrollen waren negativ, wie dies auch bei Durchmusterungen mit postoperativen Antiseren der Fall war (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Rekombinantes MEPE (rec-MEPE) wurde mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren positiv angefärbt, und dies konnte mit zugegebenem rec-MEPE weg-kompetiert werden. Eine positive Bande von 54 bis 57 kDa wurde bei rec-MEPE erhalten, das mit SYBR-Orange auf Protein gefärbt und mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren durchgemustert wurde. Diese hatte die gleiche Größe wie die 55- bis 57-kDa-Bande (vorabsorbiertpräoperativ-mit Western-Verfahren durchgemustert), die mit den durch den Tumor von Patient ND konditionierten Medien und den Osteosarkom-Zelllinien HTB96 und SaOS2 gefunden wurde. Rekombinantes MEPE enthält einen weiteren 4,5 kDa-CBP-Marker am N-Terminus, welches auf SDS-PAGE-Gelen die Mobilität vermindert und zu einer offensichtlichen Zunahme im Molekulargewicht führt. Somit beruht die äquivalente Größe von aus Tumor stammendem Protein und von rec-MEPE möglicherweise auf einer posttranslationalen Modifikation des vom Tumor stammenden MEPE (möglicherweise Glycosylierung).
TCM-Western-Blots von OHO-Tumoren der Patienten BD und EM enthielten, für vorabsorbierte präoperative Antiseren positive Hauptbanden bei einem etwas niedrigeren Molekulargewicht (48 bis 52 kDa) und außerdem eine Bande, die bei 55 bis 57 kDa gemeinsam mit rec-MEPE lief. Außerdem waren noch andere Banden mit einem höheren Molekulargewicht bei 61, 75, 80 und 93 kDa zu sehen (schwächere Signale).
In allen Proben war die mit SYBR-Orange gefärbte Haupt-Proteinbande bei 66 kDa negativ, wenn sie mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren durchgemustert wurden. Die Glycoprotein-Durchmusterung von Duplikat-Blots ergab die gleichen Ergebnisse wie die Durchmusterung mit präoperativen Antiseren, und sowohl die 54- bis 57-kDa- als auch die 200-kDa-Banden wurden positiv angefärbt, dies bestätigt, dass diese Proteine glycosyliert sind. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen geblottet, wie in den vorstehenden Verfahren beschrieben. Ein spezifischer Glycoprotein-Nachweis erfolgte unter Verwendung eines Immuno-Blot-Kits für den Glycoprotein-Nachweis (Bio-Rad), und biotinylierte Marken von Amersham wurden als innere Kontrollen zugegeben. Kurz gesagt wurden die Membranen nach der Übertragung mit 10 mM Natriumperiodat in Natriumacetat/EDTA-Puffer behandelt, um Kohlenhydratreste zu oxidieren. Danach wurden die Blots in PBS gewaschen und mit Hydrazid in Natriumacetat/EDTA-Puffer 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Filter dreimal (10 Minuten) mit TBS gewaschen. Die anschließende Blockierung und der anschließende Nachweis erfolgten, wie früher beschrieben, unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence-Kits (Amersham) und Streptavidin-Meerrettich- Peroxidase. Nicht verwendet wurden primärer Antikörper und sekundäre Ziegen-anti-Kaninchen-HRP.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass vorabsorbierte präoperative Antiseren spezifisch Proteine nachweisen, die von onkogenen hypophosphatämischen Osteomalazie-TCM stammen. Die nachgewiesenen Hauptproteine fallen in zwei drei getrennte Molekülgrößen-Bereiche von 48 bis 52 kDa, 54 bis 57 kDa und 200 kDa. Alle OHO-TCM-Proben waren für das 54- bis 57-kDa-Protein positiv, und alle durch vorabsorbierte präoperative Antiseren nachgewiesenen Proteine wurden positiv angefärbt, wenn sie auf den Glycoprotein-Status durchgemustert wurden. Die Nicht-OHO-Tumoren-Kontrollgewebe und -Medien waren negativ, wenn sie mit vorabsorbierten präoperativen Antiseren durchgemustert wurden.
Beispiel 9: Expression von MEPE-Fusionsprotein von dem Vektor pCAL-n-EK
Die gesamte codierende cDNA-Sequenz wurde in pCAL-n-EK subcloniert, wie in Beispiel 4a beschrieben. Die Bestätigung des Fusionskonstrukts, das durch IPTG-Induktion des E. coli-Wirts BL21 (DE3) erzeugt wurde, erfolgte durch Durchmusterung von Western-Blots mit präoperativen Antiseren und auch mit Calmodulin, konjugiert an alkalische Phosphatase, wie vorstehend beschrieben. Das Fusionsprotein mit dem mikrobiellen CBP-Marker (Calmodulin-bindendes Peptid von 4,5 kDa), enthaltend Calmodulin-Peptid, Enterokinasestelle und Thrombinstelle, hatte eine Größe von 56 kDa, wie durch SDS-PAGE hergeleitet wurde. Dies stimmt annähernd mit der erwarteten Molekülgröße (etwa 48 kDa) überein. Die Reinigung des Proteins wurde anhand einer Calmodulin-Affinitäts-Chromatographie, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Vorinkubation von präoperativen Antiseren mit dem gereinigten Fusionskonstrukt führte zu einer Verminderung des beim Durchmustern von TCM-Western-Blots festgestellten 55- bis 57-kDa-Signals, jedoch nicht der 200-kDa-Bande. Die Tatsache, dass das 55- bis 57-kDa-Signal nicht vollständig reduziert werden konnte, beruhte vermutlich auf einer spezifischen Erkennung der stark antigenen Glycosylierungseinheit, die im naszierenden MEPE-Protein (TCM) vorlag, jedoch im mikrobiellen Fusionskonstrukt von rec-MEPE fehlte. Das Fusionsprotein war in wässrigen Tris-Puffern löslich, so dass in keinem Stadium des Reinigungsprozesses Detergenzien erforderlich waren.
Beispiel 10: Gewebeexpression (RT/PCR und Northern-Analyse)
Northern-Blots, die Poly-A⁺-RNA enthielten, wurden mit MEPE-cDNA durchgemustert, wobei keine Hybridisierung mit Magen, Schilddrüse, Rückenmark, Lymphknoten, Luftröhre, Nebenniere, Knochenmark, Herz, Gehirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas nachgewiesen wurde (Clontech MTN-Blots I und III). Für die Northern-Analyse wurden zwei Blots von Clontech (MTN^TM und MTN^TMIII), enthaltend die folgenden Poly-A⁺-RNAs: 1: Herz, 2: Gehirn, 3: Plazenta, 4: Lunge, 5: Leber, 6: Skelettmuskel, 7: Niere, 8: Pankreas, 9: Magen, 10: Schilddrüse, 11: Rückenmark, 12: Lymphknoten, 13: Luftröhre, 14: Nebenniere, 15: Knochenmark, mit MEPE-cDNA, amplifiziert mit spezifischen inneren Primern (Pho433-111F und PHO877-111R), durchgemustert. Die Primersequenzen für Pho433-111F und PHO877-111R sind in 8 hervorgehoben (Nucleotidpositionen 433 bis 456 (SEQ ID NO: 24) bzw. 877 bis 900 (SEQ ID NO: 25)), und die folgenden PCR-Bedingungen wurden verwendet: Vordenaturierung: 95°C, 3 Min., gefolgt von 30 Zyklen mit Denaturierung: 95°C, 45 Sek., Anelierung: 65°C, 30 Sek., Polymerisation: 72°C, 45 Sek., und einer letzten Verlängerung von 72°C, 7 Min., worauf Kühlen auf 4°C folgt. PCR-Puffer (PB) wurde bei einer Endkonzentration von 2 mM MgCl₂ eingesetzt. Das 444 bp große amplifizierte MEPE-cDNA-Produkt wurde sodann durch submarine Agarose-Elektrophorese aufgetrennt, durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht und unter Verwendung von Glasperlen gereinigt (Gene-clean II Kit; Bio 101 INC.). Danach wurde die gereinigte DNA unter Verwendung von α-³²P-dCTP (3000 Ci/mMol) in Verbindung mit dem MegaPrime-Markierungskit von Amersham radiomarkiert. Routinemäßig wurden spezifische Aktivitäten von 5 × 10⁹ ZpM („cpm", Zählimpulse pro Minute")/μg erhalten. Die Hybridisierung (60°C) und die Vorhybridisierung (60°C) von Blots erfolgten unter Verwendung veröffentlichter Verfahren (Rowe, Hum. Genet. 97 (1996), 345–352), und Stringenz-Waschungen wurden wie folgt durchgeführt: 1: zwei Waschgänge bei Raumtemperatur, 30 Min., mit 2x SSC, 0,1 % SDS, zwei Waschgänge bei 60°C, 30 Min., in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS. Danach wurden die Filter sieben Tage bei –80°C gegenüber einem Film exponiert und die Filme sodann entwickelt. Die menschliche Gesamt-RNA aus Nebenniere, Gehirn, Duodenum, Herz, Niere, Leber, Lunge, Haut, Milz, Thymus, Schilddrüse und Tonsillen wurde unter Verwendung von RT/PCR und MEPE-spezifischer Primer nicht amplifiziert, wobei jedoch für Gehirn, Niere, Leber und Pankreas unter Verwendung einer cDNA-Matrize Hinweise auf eine Expression mit niedriger Rate gefunden wurden. Für dieses Experiment wurde die Gesamt-RNA aus den folgenden menschlichen Geweben extrahiert: 1: Thymus, 2: Gehirn, 3: Hoden, 4: Duodenum, 5: Herz, 6: Haut, 7: Leber, 8: Tonsillen, 9: Milz, 10: Schilddrüse, 11: Nebenniere, 12: Lunge, 13: Niere, 14: OHO-Tumorgewebe, 15: menschlichen primären Osteoblasten. Außerdem wurde die Gesamt-RNA aus primären Osteoblasten der Ratte erhalten. Innere MEPE-Primer, wie vorstehend beschrieben (Pho433-111 F und PHO877-111 R), wurden eingesetzt, um die Gesamt-RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase-PCR und des Perkin Elmer-Roche-RNA-PCR-Kits zu kopieren. Kurz gesagt wurde 1 μg Gesamt-RNA in 20 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM dNTPs, 1 Einheit/μl Ribonuclease-Inhibitor, 2,5 Einheiten/μl MULV-reverse Transkriptase, 0,75 μM Stromabwärts-Primer (PHO877-111 R) gelöst. Danach wurde das Gemisch zehn Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wurden der Stromaufwärts-Primer (Pho433-111 F), dNTPs, MgCl₂ und AmpliTaq-DNA-Polymerase zugegeben, so dass Endkonzentrationen von 0,15 μM, 200 μM, 2 mM bzw. 2,5 Einheiten/100 μl in einem Gesamtvolumen von 100 μl erhalten wurden. Anschließend wurde die PCR unter Venwendung eines Thermalcyclers von Perkin Elmer (System 9700) durchgeführt, bei dem das folgende Programm eingestellt wurde: Vordenaturierung: 95°C, 3 Min., gefolgt von 35 Zyklen mit Denaturierung: 95°C, 45 Sek., Anelierung: 65°C, 30 Sek., Polymerisation: 72°C, 45 Sek., und eine letzte Verlängerung von 72°C, 7 Min., worauf eine Kühlung auf 4°C folgte. Die amplifizierten Produkte wurden unter Verwendung einer Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und im Southern-Blot-Verfahren und durch Sequenzierung bestätigt. Außerdem waren in einem Panel von normalisierten cDNAs, die von einem Spektrum von Nicht-OHO-Tumoren stammten (Brustkrebs, Lungenkrebs I, Kolon-Adenokarnzinom I, Lungenkrebs II, Prostata-Adenomkarzinom, Kolon-Adenokarnzinom II, Eierstockkrebs, Pankreaskrebs; menschliches Tumorpanel #K1422-1 von Clontech), alle bei der MEPE-PCR negativ, mit Ausnahme einer Expression mit sehr niedriger Rate in einem Fall von Kolon-Adenokarzinom, Eierstockkrebs bzw. Prostatakrebs (nachgewiesen nach Southern-Durchmusterung von RT/PCR-amplifizierten Produkten mit radiomarkierter MEPE-cDNA). Im deutlichen Gegensatz dazu amplifizierte die RT/PCR unter Verwendung von MEPE-Primern die Poly-A⁺-RNA aus den OHO-Tumoren aus vier getrennten Patienten, BD, DM, EM und DS, dies zeigt hohe Expressionsraten an (normalisiert auf Glyerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Transferrin). Poly-A⁺-RNA aus nicht-phosphaturischen Tumoren und Kontrollgeweben von OHO-Patienten (Haut und neben den Tumoren gelegenes Material), der menschlichen Nierenzellline CL8, menschlichen primären Osteoblastenzellen (bezogen von Clonetics H-OST, vgl. Material) und Poly-A+-RNA, extrahiert aus einem mutmaßlichen Tumor-Polypen aus einem Patienten mit linearem Naevus sebaceus-Syndrom (das TCM des Polypen hemmte nicht die Phosphataufnahme in der renalen Nierenzelllinie CL8), zeigten keine Amplifikation unter Verwendung von MEPE-spezifischen Primern. Unter Verwendung der von Clontech bezogenen cDNAs, die von Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas stammten (menschliches Panel 1 #K1420-1), als Matrizen für die MEPE-Primer-PCR wurde eine Expression mit niedriger Rate in Gehirn, Leber, Lunge und Pankreas nachgewiesen. Die Sequenzierung der durch MEPE-Primer amplifizierten Banden zeigte eine vollständige Homologie mit MEPE-cDNA, und eine Southern-Durchmusterung der amplifizierten Banden mit MEPE- cDNA bestätigte die Ergebnisse der Sequenzierung. OHO-Matrizen-Poly-A⁺-RNA aus allen OHO-Patienten amplifizierten durchweg eine erwartete Bande von 480 bp und eine weiter unten liegende Bande von 190 bp. Die obere Bande wurde durch Sequenzierung und Southern-Autoradiographie als vollständig homolog zu der MEPE-Sequenz bestätigt, und die untere Bande wurde durch Southern-Analyse als ein MEPE-Derivat bestätigt. Die untere Bande trat in den mit niedriger Rate exprimierenden, normalen Geweben oder Nicht-OHO-Tumoren nicht auf. Dies zeigt, dass ein alternatives Spleißen in dem von einem Tumor stammenden MEPE möglicherweise eine Rolle spielt. Alle RT/PCR- und PCR-Experimente wurden auf G3PHD und Transferrin normalisiert.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine Expression mit hoher Rate von MEPE (gemessen durch die mRNA-Spiegel) nur in OHO-Tumorproben gefunden wurde und dass Hinweise auf eine Expression mit sehr niedriger Rate (möglicherweise ektopisch) in Gehirn, Leber, Niere und drei von elf Nicht-OHO-Tumoren gefunden wurde. Acht von elf Tumoren waren für die MEPE-mRNA-Expression negativ (RT/PCR), und alle Ergebnisse wurden auf GA3PDH- und Transferrin-RT/PCR-Primer standardisiert.
Beispiel 11: Southern-Analyse (Genomische Blots)
Genomische Blots, die immobilisierte DNA enthielten, welche von einer Familie mit autosomaler Rachitis stammte (Rowe, Hum. Genet. 91 (1993), 571–575) und mit PstI, EcoRI, PvuII bzw. MspI gespalten worden war, wurden mit radiomarkierter MEPE-cDNA, wie vorstehend beschrieben, durchgemustert. Die Southern-Analyse wurde unter Verwendung genomischer Spaltprodukte von DNA, die aus Blut extrahiert worden war, wie früher beschrieben, durchgeführt (Rowe, Hum. Genet. 93 (1994), 291–294). Der PstI-Blot zeigte das Vorliegen einer 11-kb-Bande und auch einen 4-kb-Polymorphismus in einem der 16 durchgemusterten Familienmitgliedern. Die EcoRI-, PvuII- und MspI-Blots waren alle positiv für einzelne Banden von 6 kb, 6,5 kb bzw. 4 kb und bestätigten die menschliche Herkunft des Gens. Da genetische Informationen fehlten, war es nicht möglich zu bestimmen, ob das Gen in dieser autosomalen Rachitisfamilie zusammen mit der Krankheit segregiert wurde.
Beispiel 12: Phosphataufnahme in einer menschlichen Nierenzelllinie, CL8: TCM und MEPE-Ergänzung
Phosphat- und Gucoseaufnahme-Experimente wurden an einer menschlichen Nierenzelllinie (CL8), wie früher beschrieben, durchgeführt (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Kurz gesagt wurden die Zellen in definiertem Medium (DM) bis zur Konfluenz oder als Übernacht-Inkubation in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen mit flachem Boden (Falcon 3047) gezüchtet. Danach wurde das DM durch frisches DM ersetzt, das mit gereinigtem Fusionsprotein oder Concanavalin-Affinitätsgereinigtem TCM angereichert war, und über Nacht bei 37°C belassen. Anschließend wurde die Aufnahme von ³²P- und ¹⁴C-Methylglucose gemessen (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169).
Die Zugabe von TCM (1/20 Verdünnung) zu menschlichen Nierenzelllinien führte zu einer signifikanten Reduktion in der Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme, wie früher berichtet wurde (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Diese Hemmung wurde durch eine Vorinkubation von TCM mit präoperativen und nicht mit postoperativen Antiseren verhindert, wie auch schon früher berichtet wurde (Rowe, Bone 18 (1996), 159–169). Auch die Zugabe von Concanavalin A-gereinigten Fraktionen mit hoher und niedriger Affinität (HCA bzw. LCA) bei Konzentrationen von 40 ng/ml führte zu einer Hemmung der Na⁺-abhängigen Phosphataufnahme (NaPi). Sowohl in TCM- als auch in Concanavalin A-Fraktionen war die Hemmung für die Phosphataufnahme spezifisch und beeinflusste nicht die Na⁺-abhängige Aufnahme von α-Methyl-D-Glucose. In allen Fällen waren die Wirkungen dosisabhängig.
Ähnliche Experimente wurden mit einem durch Calmodulin-Affinitäts-Chromatographie gereinigten MEPE-Fusionsprotein durchgeführt. Erstaunlicherweise hemmte rekombinantes MEPE nicht den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport, erhöhte jedoch die Phosphataufnahme in einer dosisabhängigen Art und Weise (vgl. 24). Eine Verdopplung der Phosphataufnahme wurde bei 1000 ng/ml festgestellt (p < 0,001). Diese Experimente bestätigen, dass das MEPE-Fusionsprotein spezifisch den Na⁺-abhängigen Phosphat-Cotransport in einer menschlichen Nierenzelllinie, CL8, steigert. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert, und das von einem Polynucleotid codiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die zumindest die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codieren, das die in SEQ ID NO: 2 (8) gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; (b) Polynucleotiden, die die in SEQ ID NO: 1 (8) gezeigte codierende Sequenz umfassen, die zumindest die Aminosäuren 1 bis 236 des Polypeptids codiert; (c) Polynucleotiden, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) hybridisieren, und die ein Polypeptid codieren, das Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert; (d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, dessen Sequenz eine Identität von 60% oder mehr zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das von einem Polynucleotid gemäß Teil (a) oder (b) codiert wird, wobei das Polypeptid Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert; (e) Polynucleotiden, die ein Fragment eines Polypeptids codieren, das von dem Polynucleotid gemäß einem der Teile (a) bis (d) codiert wird, wobei das Fragment Natrium-abhängigen Phosphat-Cotransport hochreguliert; (f) Polynucleotiden, die einen Epitop-tragenden Teil eines Polypeptids codieren, umfassend die Aminosäurereste von 1 bis 40, 141 bis 180 und/oder 401 bis 429 von SEQ ID NO: 2 (8); und (g) Polynucleotiden, deren Nucleotidsequenz auf Grund des genetischen Codes zu einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids gemäß einem der Teile (a), (b), (e) oder (f) degeneriert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1 mit einem ungefähren Molekulargewicht von 60 kDa, bestimmt mit einer SDS-PAGE, oder das ein ungefähres Molekulargewicht von 200 kDa hat, bestimmt mit einer Bis-Tris-SDS-PAGE bei pH 7.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das glycosyliert und/oder phosphoryliert ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich nach Aufreinigung aus Saos-2-Zellen (Hinterlegungsnummer ECACC 89050205).
Polynucleotid, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 5, das RNA oder DNA umfasst.
Vektor, enthaltend das Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6.
Wirtszelle, die genetisch mit dem Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 oder dem Vektor nach Anspruch 7 verändert wurde oder durch Einbringen einer Expressionskontrollsequenz in die Wirtszelle hergestellt wird, welche die Expression eines Gens vermittelt, das das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und Gewinnen des Polypeptids aus der Kultur.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bindet.
Nucleinsäuremolekül, das eine Länge von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Basen der codierenden Sequenz des in SEQ ID NO: 1 (8) gezeigten Polynucleotids oder eines komplementären Stranges davon umfasst.
Verfahren zum Auffinden eines Bindungspartners an ein Phosphatonin-Polypeptid umfassend: (a) Inkontaktbringen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer durchzumusternden Verbindung; und (b) Bestimmen, ob die Verbindung eine Aktivität des Polypeptids beeinflusst.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6, einen Vektor nach Anspruch 7, einen Antikörper nach Anspruch 10 oder das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 11.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, die ein Arzneimittel ist und ferner einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, die ein diagnostisches Mittel ist und ferner Mittel zum Nachweis umfasst.