JP2005517718A - 免疫応答および輸送の代替抗体による調整のための組成物および方法 - Google Patents

免疫応答および輸送の代替抗体による調整のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

免疫応答の調整のための方法および組成物を提供する。組成物は、目的のリガンドと相互作用する二機能性代替抗体分子を含み、前記二機能性代替抗体は免疫調整薬および／または輸送薬にさらに結合している。本発明の組成物は、目的のリガンドへの免疫調整薬の送達方法で適用される。また、目的のリガンドに対する被験体の免疫応答を調整する方法をさらに提供する。この方法は、治療有効量の本発明の二機能性代替抗体を投与するステップを含む。本発明の方法はまた、免疫応答の調整を必要とする被験体の臨床結果の改善で適用される。癌、免疫疾患、アレルギー、プリオン、ならびに細菌、寄生虫、酵母、またはウイルスを原因とする種々の疾患または病態を含む種々の病態および／または障害の治療または予防方法をさらに提供する。

Description

本発明は、免疫応答および輸送の調整に関する。
伝統的なワクチン開発アプローチには、生きた弱毒化病原体、完全に死滅させた病原体、または不活化毒素の使用が含まれていた。これらの方法は、一定の疾患の蔓延において限定的に成功していたが、その使用に関して欠点があった。例えば、生きた病原体を含むワクチンは、有毒株の弱毒化されている種類、または関連する毒性の低い種類のいずれでも、通常、完全な免疫応答の誘導に非常に有効である。しかし、これらのワクチン型は、有毒形態に逆戻りする可能性がある。完全に死滅させたワクチンでは、主な欠点は、抗原が単に外因性抗原として処理されて、しばしば細胞性免疫反応が不十分となるという点である。ワクチン開発におけるより最近のアプローチには、サブユニットワクチン、合成ペプチド、またはプラスミドＤＮＡの使用が含まれる。これらは感染リスクはないが、サブユニットワクチンおよび合成ペプチドは、免疫原性が低く、製造コストが高い。
抗原特異的免疫応答を有効且つ効率的に作製するための方法および組成物が必要である。
免疫系を調整するための方法および組成物を提供する。詳細には、本発明は、目的のリガンドと相互作用し、且つ免疫調整薬(immunomodulatory agent)とさらに結合した二機能性代替抗体分子を提供する。この様式では、二機能性代替抗体分子の目的のリガンドとの相互作用により、リガンド／二機能性代替抗体の相互作用部位で免疫応答がターゲティングされる。
本発明の組成物は、特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子(isolated bi-functional surrogate antibody molecule)を含む。特異性鎖は、第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第一の定常領域と相互作用する第一の安定化領域および第二の定常領域と相互作用する第二の安定化領域を含む。二機能性代替抗体は、免疫調整薬とさらに結合し、二機能性代替抗体分子は目的のリガンドと相互作用することができる。
他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は異なる分子(distinct molecules)を含む。他の実施形態では、安定化鎖は、さらに、第一の安定化ドメインと第二の安定化ドメインとの間に第一のスペーサードメインを含む。他の実施形態では、安定化鎖は、アミノ酸配列または核酸結合分子のポリマーを含む。他の実施形態では、安定化鎖は、第二の核酸配列を含む。
本発明は、さらに、免疫調整薬が、免疫グロブリン定常領域、免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、または免疫グロブリン定常領域の変異型、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域の活性変異型、またはＩｇＧ免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、サイトカイン、サイトカインの活性変異型、サイトカインの活性フラグメント、ケモカイン、ケモカインの活性変異型、またはケモカインの活性フラグメント、ＣｐＧモチーフ、免疫刺激性ＣｐＧモチーフ(immunostimulatory CpG motif)、接着分子(adhesion molecule)、接着分子の活性変異型、接着分子の活性フラグメント、リポ多糖、またはリポ多糖の活性誘導体を含む、単離二機能性代替抗体分子を提供する。
他の実施形態では、本発明の二機能性代替抗体分子は二重特異性抗体である。したがって、二機能性代替抗体分子に結合した免疫調整薬は、第二の特異性領域が免疫応答レギュレーターと相互作用することができる第二の特異性ドメインを含む。１つの実施形態では、第二の特異性領域は、ＦγＲ受容体と相互作用する。
さらなる実施形態では、単離二機能性代替抗体分子は目的のリガンドと相互作用する。種々のリガンド（例えば、ポリペプチド、細胞、プリオン、または微生物が含まれる）を使用することができる。
本発明の方法は、目的のリガンドへの免疫調整薬の送達方法を含む。この方法は、単離二機能性代替抗体分子であって、前記免疫調整薬は二機能性代替抗体分子に結合し、前記二機能性代替抗体分子が目的のリガンドと相互作用することができる単離二機能性代替抗体分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。
本発明のさらなる方法は、被験体において目的のリガンドに対する免疫応答を調整する方法であって、単離二機能性代替抗体分子であって、前記代替抗体は免疫調整薬に結合し、前記二機能性代替抗体分子が目的のリガンドと相互作用することができる単離二機能性代替抗体分子を被験体に投与するステップを含む。
種々の障害（例えば、癌、自己免疫疾患が含まれる）ならびに細菌、寄生虫、酵母、またはウイルスを原因とする種々の疾患および病態の治療および／または予防方法をさらに提供する。
本発明のさらなる組成物には、輸送薬(transport agent)に結合した二機能性代替抗体および目的のリガンドと相互作用することができる二機能性代替抗体分子が含まれる。１つの実施形態では、輸送薬は、ＩｇＡの定常領域またはその活性フラグメントもしくは変異型またはＩｇＭの定常領域またはその活性フラグメントもしくは変異型を含む。
本発明は、全てではないがいくつかの本発明の実施形態を示す添付の図面を参照して以下により完全に記載する。実際、これらの発明を多数の異なる形態で実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、この開示は適用可能な法的必要条件を満たすようにこれらの実施形態を記載している。図面を通して、同じ番号は同じ要素を示す。
本明細書中に記載の本発明の多数の修正形態および他の実施形態は、これらの発明の分野に属する当業者に理解され、上記説明および関連する図面に示す教示の利点を有する。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図されると理解すべきである。本明細書中で特定の用語が使用されているが、これらは一般的および説明としてのみ使用されており、制限を目的としていない。
［概要］
必須の抗原への抗体の結合は外来抗原のその内因性標的（例えば、受容体またはリガンド）への結合を防止することができるという中和作用があるが、結合のみでは外来抗原を除去することができない。外来抗原を有効に除去および／または破壊するために、その標的抗原に対する高い親和性および特異的結合ならびに有効な免疫エフェクター機能を抗体に付与しなければならない。本発明は、二機能性代替抗体分子および二機能性代替抗体分子の種々の集団を含む組成物および方法に関する。本明細書中で使用される、「二機能性」代替抗体は、目的のリガンドに選択的に結合することができ、且つ免疫調整薬および／または輸送薬にさらに結合している、異なる核酸構造またはモチーフを含む分子クラスをいう。この様式では、二機能性代替抗体分子の目的のリガンドとの相互作用により、リガンド／代替抗体の相互作用部位で免疫応答の調整がターゲティングされる。
本発明の二機能性代替抗体分子は、免疫応答を「調整する」。「調整する」または「調整」は、特定の特徴、質、活性、物質、または応答の増減を意図する。例えば、免疫応答の調整は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、半減期／クリアランス比、依存細胞細胞傷害性(dependant cell cytotoxicity)、オプソニン誘導性食作用、補体依存性溶菌、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の死滅、多形核（ＰＭＮ）細胞の死滅、即時型過敏症、および遅延型過敏症の増減を含み得る。したがって、本発明の二機能性代替抗体を、目的のリガンド部位への免疫系の動員のためにデザインする。免疫応答（すなわち、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、半減期／クリアランス比）の所望の調整に応じて、適切な免疫調整薬を、二機能性代替抗体分子に結合する。
例えば、免疫系の動員が所望される場合、二機能性代替抗体分子は、目的のリガンド部位で免疫エフェクター機能を改良することができる免疫応答薬を含み得る。この場合、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ部分を、二機能性代替抗体分子に結合させ、それによりＦｃγＲへの結合および／または補体活性化の改良によって免疫エフェクター機能を強化することができる。他の実施形態では、免疫エフェクター機能が有害であるが長期の半減期を所望する場合、免疫グロブリン定常領域または分子の半減期を増大させる操作免疫グロブリンを二機能性代替抗体に結合させることができる。目的の免疫調整薬に関するさらなる詳細を、本明細書中に記載する。したがって、本発明の二機能性代替抗体分子を、所望の治療活性（すなわち、目的のリガンドに対する所望の結合親和性および特異性ならびに意図する適用のための所望の免疫エフェクター機能）を有するようにデザインすることができる。
本発明の組成物は、目的のリガンドへの免疫調整薬の送達方法で適用される。本発明の組成物は、さらに、目的のリガンドに対する被験体の免疫応答の調整で適用される。この方法は、被験体に治療有効量の本発明の二機能性代替抗体を投与するステップを含む。
本発明の組成物および方法は、さらに、種々の病態の治療または予防に使用することができる治療用二機能性代替抗体として適用される。したがって、本発明の方法は、ターゲティングされた免疫応答を必要とする被験体の臨床結果の改善で適用される。「治療または予防」は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果の獲得を意図する。効果は、特定の感染もしくは疾患またはその徴候もしくは症状の完全または部分的防止という点では予防的であり、感染もしくは疾患および／または感染もしくは疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。したがって、本発明の方法は、二機能性代替抗体分子を投与した被験体において疾患または障害の副作用を「防止」（すなわち、遅延または阻害）および／または「軽減させる」（すなわち、減少させる、遅延させる、または緩和する）。被験体は、任意の動物、好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ムース、ラット、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリが含まれる）であり得る。
本発明のさらなる組成物では、二機能性代替抗体は、輸送薬を含む。以下で考察するように、輸送薬はトランスサイトーシスを媒介し、それにより代替抗体を粘膜内層に送達させる。
以下でさらに考察するように、所望の目的のリガンドと相互作用する本発明の二機能性代替抗体および二機能性代替抗体の種々の集団（すなわち、選択された集団、ポリクローナル集団、モノクローナル二機能性代替抗体集団）を作製することができる。したがって、二機能性代替抗体により、所望のリガンド部位での免疫応答のターゲティングされた調整を行うことができる。したがって、二機能性代替抗体を使用して、試験、薬学的、および研究での適用で従来の抗体と置き換えることができる。
本明細書中で使用される、「リガンド」は、二機能性代替抗体と相互作用する目的の任意の分子（イオン、分子、または分子群が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。本明細書中で使用される、「リガンド」は、抗原性を示す必要はない。したがって、リガンドは、細胞および／または任意の細胞構成要素または免疫ハプテンであり得る。リガンドは、任意の発生段階（種々の表現型を有する）および種々の病態（すなわち、正常および異常な状態）での任意の目的の細胞型であり得る。例えば、微生物（すなわち、原核細胞（例えば、細菌）、ウイルス、真菌、原生動物、および寄生虫）の表面上またはその内部または真核細胞（例えば、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、感覚細胞、癌細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球、白血球、および幹細胞など）の表面上またはその内部で見出される正常、異常、および／または固有の構成要素を含むリガンドに結合するように二機能性代替抗体を開発することができる。目的のリガンドはまた、上記の細胞型の１つまたは複数の構成要素を含み得る。
例えば、本発明の二機能性代替抗体を開発するのに使用される、目的のリガンドは、種々の腫瘍細胞（黒色腫細胞、結腸腫瘍細胞、乳癌細胞、乳房腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、膠芽細胞腫細胞、腎臓癌細胞、神経芽細胞腫細胞、肺癌細胞、膀胱癌細胞、形質細胞腫結腸癌細胞、乳癌細胞、リンパ腫細胞、および／または細胞型の種々の構成要素など）を含み得る。このようなリガンドを、切除腫瘍の培養またはＨＣＴ １１６、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ４０３、またはＳＷ６２０（結腸癌）、およびＢＴ−２０細胞株（乳癌）などの確立された細胞株（すなわち、ヒト細胞株）から得ることができる。例えば、American Type Culture Collection(ATCC;Rockville,Md.)から、このような細胞は、当業者に利用可能である。さらに、目的のリガンドは、初代神経膠腫細胞または確立されたヒト膠芽細胞腫もしくは星状細胞腫株由来の細胞であり得る。Wakimoto et al.(1999)Japan.J.Cancer Res.88:296-305(1997)（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のように、神経膠腫細胞の初代培養物を、外科的に切除した腫瘍組織から確立することができる。ヒト膠芽細胞腫株（Ｕ−８７ＭＧまたはＵ−１１８ＭＧなど）またはヒト星状細胞腫株（ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１またはＳＷ１０８８(Chi et al.(1997)Amer.J.Path.150:2142-2152)など）を、ＡＴＣＣから得ることができる。本発明でリガンドとして使用することができる望ましくないさらなる細胞型には、自己免疫疾患の治療のための自己抗体産生リンパ球またはアレルギー治療のためのＩｇＥ産生リンパ球が含まれる。
さらに、目的のリガンドが抗原性を示す必要はないが、いくつかの実施形態では、リガンドは、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原および自己免疫疾患関連抗原が含まれる）であり得る。このような疾患関連抗原は当分野で公知であり、例えば、成長因子受容体、細胞周期レギュレーター、血管形成因子、シグナル伝達因子が含まれる。
目的の他のリガンドには、有機化合物、無機化合物、有毒環境化合物、核酸、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、受容体、成長因子、ホルモン、酵素、天然および合成ポリマー、炭水化物、多糖、ムコ多糖、エフェクター、抗原、抗体、プリオン、基質、代謝産物、免疫ハプテン、小分子、薬物、毒素、遷移状態のアナログ、補因子、インヒビター、栄養素、固有の細胞表面決定基、または細胞内マーカーなどが含まれるが、これらに限定されない。リガンドには、さらに、有機または無機環境汚染物質（例えば、ＰＣＢ、ダイオキシン、石油炭化水素）、治療薬および乱用物質を含む免疫ハプテンが含まれ得る。
本発明の二機能性代替抗体は、所望のリガンドと相互作用し、免疫応答も調整するようにデザインされる。したがって、二機能性代替抗体を使用して、種々の病態／障害（腫瘍および癌、自己免疫疾患、細菌、寄生虫、またはウイルスに起因する感染症および障害が含まれるが、これらに限定されない）を治療または防止することができる。１つの実施形態では、本発明の方法を使用して、癌（黒色腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膠芽細胞腫、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、神経芽腫、肺癌、白血病、およびリンパ腫などの癌が含まれる）の予防または治療のために免疫応答を調整することができる。本発明の方法を使用して、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの感染症から防御または治療することもできる。
さらに、本発明の方法を使用して、既存の自己免疫疾患（関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、Ｉ型真性糖尿病、重症筋無力症、アジソン病、自己免疫性胃炎、グレーブス病、および白斑など）の発症を防御するか治療することができる。本発明の免疫応答調整方法を使用して、花粉症、喘息、全身性アナフィラキシー、または接触性皮膚炎などのアレルギー反応も治療することができる。
本発明の方法を使用して、細菌、寄生虫、酵母、またはウイルスに起因する種々の疾患または病態を防止および治療することもできる。このような疾患および病態には、胃潰瘍および消化性潰瘍；歯周病；カンジダ感染；寄生虫感染；結核；ヘモフィルス媒介疾患（細菌性髄膜炎など）；百日咳ウイルス媒介疾患（百日咳など）；コレラ；マラリア；インフルエンザ感染；呼吸器合胞体抗原；肝炎；灰白髄炎；陰部および非陰部単純ヘルペスウイルス感染；ロタウイルス媒介疾患（急性小児胃腸炎および下痢など）；およびフラビウイルス媒介疾患（黄熱病および脳炎など）が含まれる。さらに、本発明の方法および組成物は、生物兵器（例えば、クロストリジウム毒素、出血熱ウイルス、およびFrancisella tularensis、Yersinia pestis、およびBacillus antracsisなどの細菌が含まれるが、これらに限定されない）への曝露の治療で適用される。
本明細書中に開示されるように、本発明の方法を使用して、このような疾患もしくは病態の１つを有する個体またはこのような疾患もしくは病態の１つを有すると疑われる個体を治療することができる。本発明の方法を使用して、実際の疾患の発症からこのような疾患または病態の１つの発症リスクを有する個体を防御することもできる。特定の疾患（特定の癌型など）を発症しやすい個体を、遺伝子スクリーニング方法を使用して同定することができる。たとえば、Mao et al.(1994)Canc.Res.54(Suppl.):1939s-1940およびGarber et al.(1993)Curr.Opin.Pediatr.5:712-715（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。このような個体は、例えば、黒色腫、網膜芽腫、乳癌、または結腸癌を発症しやすいか、多発性硬化症または関節リウマチを発症しやすい。
［組成物］
Ｉ．二機能性代替抗体
本発明の二機能性代替抗体は、目的のリガンドに対する種々の範囲の結合特異性および結合親和性を有する抗体を開発可能な種々の構造を含む。この種々の構造に関する詳細およびどのようにして本発明の二機能性代替抗体を開発するかについて、以下に詳述する。
二機能性代替抗体は、本明細書中で「特異性鎖」といわれる第一の鎖および本明細書中で「安定化鎖」といわれる第二の鎖を含む。特異性鎖は、第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第一の定常領域と相互作用する第一の安定化領域および第二の定常領域と相互作用する第二の安定化領域を含む。このような代替抗体分子には、2002年2月19日提出の米国特許仮出願60/358,459号および同時出願された「代替抗体およびその調製および使用方法」というタイトルの通常の米国特許出願にさらに記載されている。本発明の二機能性代替抗体分子は、さらに、免疫応答を調整することができる免疫調整薬に結合している。
本発明は、単離または実質的に単離された二機能性代替抗体組成物を含む。「単離」二機能性代替抗体分子は、実質的に他の細胞物質、培養培地、化学的前駆体、または化学合成されている場合は他の化合物を含まない。実質的に細胞物質を含まない二機能性代替抗体には、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の夾雑タンパク質または核酸を有する代替抗体の調製物が含まれる。さらに、代替抗体分子が天然の配列に相同な核酸配列を含む場合、「単離」二機能性代替抗体分子は、代替抗体が相同性を有する生物のゲノムＤＮＡ中に核酸に天然に近接し得る配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に存在する配列）を含まない。
本明細書中で使用される、「核酸」は、ＴＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その一本鎖または二本鎖、およびその任意の化学的修飾物を意味する。二機能性代替抗体は、１つまたは複数の特異性ドメインを安定化させる相互作用定常ドメインが存在する二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖組み合わせ、ハイブリッドＴＮＡ−ＤＮＡ、ハイブリッドＴＮＡ−ＲＮＡ、ハイブリッドアミノ酸／ＲＮＡ、アミノ酸／ＤＮＡ、アミノ酸／ＴＮＡ、またはその組み合わせから構成され得る。ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が天然に存在する残基および／または合成された修飾残基を含み得ることがさらに認識される。
Ａ．特異性鎖
本明細書中で使用される、二機能性代替抗体の特異性鎖は、２つの定常領域に近接する特異性領域を有する核酸分子を含む。本明細書中で使用される、「に近接する」は、定常領域が特異的領域に直接近接するか、定常領域が特異性領域の５’および３’で見出されるがスペーサー配列で分離されていることを意図する。特異性領域はリガンド結合部位として機能し、定常ドメインは安定化鎖上で見出される安定化ドメインと相互作用し、それにより特異性ドメインは目的のリガンドと相互作用する領域を形成する。
特異性鎖は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）、修飾ＴＮＡ、またはその任意の組み合わせから構成される核酸配列を含む。例えば、Chaput et al.(2003)J.Am.Chem.Soc.125:856-857（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。修飾には、ヌクレオチド配列の任意の機能的部分(functional moiety)または分子の結合が含まれる。修飾は、鎖中のどこかの各ヌクレオチド残基に付加するか、ピリミジンまたはプリン残基の全てまたは一部に結合するか、ヌクレオチド残基の所与の型の全てまたは一部に結合させた配列の５’末端および／または３’末端に存在し得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ残基への種々の修飾が当分野で公知であり、本発明の二機能性代替抗体に対する目的の修飾のいくつかの例は、以下でさらに詳細に考察している。
特異性鎖およびその反応性ドメイン（すなわち、定常ドメインおよび特異性ドメイン、ならびにいくつかの実施形態ではスペーサー領域）は、鎖が本明細書中に記載の二機能性代替抗体を形成することができる限り任意の長さであり得る。例えば、特異性鎖は、１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。あるいは、特異性鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。定常ドメインおよび特異性ドメインは、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約８０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。
二機能性代替抗体分子は特異性領域中にスペーサー領域を必要としないが、この領域が存在する場合、任意の長さであり得る。例えば、スペーサー領域が特異性鎖中に存在する場合、この領域は、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。さらに他の実施形態では、スペーサー領域は核酸残基を含む必要はないが、所望の空間を空けて二機能性代替抗体分子を形成する鎖に組み込まれたリン酸部分などの任意の分子であり得る。
いくつかの実施形態では、特異性鎖またはその成分（定常領域または特異性領域）は、天然に存在する核酸配列と有意に類似する。他の実施形態では、核酸配列は、天然の配列とほとんどまたは全く同一ではない配列を共有することができる。さらに他の実施形態では、核酸残基を本明細書中に記載のように修飾することができる。
Ｂ．安定化鎖
二機能性代替抗体は、安定化鎖をさらに含む。安定化鎖は、特異性鎖の定常ドメインに相互作用して特異性ドメインのリガンド結合溝を安定化することができる任意の分子を含む。したがって、安定化鎖は、例えば、アミノ酸配列、核酸配列、または種々のポリマー（任意のカチオン性ポリマー、シクロデキストリンポリマー、または臭化リチウムもしくは臭化エチジウムなどの適切に荷電した挿入剤を有するポリマーが含まれる）を含み得る。
二機能性代替抗体中の安定化領域は同一であり得るか（すなわち、同一のヌクレオチド配列またはペプチド配列）、各安定化領域が特異性鎖中で見出されるその対応する定常領域と相互作用する限り、領域は非同一であり得ることが認識される。さらに、定常領域と安定化領域との間の相互作用は直接または間接的であり得る。相互作用は、さらに、生理学的条件下（すなわち、所望のリガンド結合条件）を含む種々の条件下などで相互作用が起こる。
いくつかの実施形態では、安定化鎖および特異性鎖ならびに／またはその各ドメインは、天然に存在しない。他の実施形態では、これらは、天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列と有意に類似し得るか、実際に天然に存在する配列であり得る。当業者は、安定化ドメインの長さは特異性鎖の定常ドメインに必要な相互作用の型に依存して変化することを認識する。このような相互作用を、本明細書中でさらに詳細に考察する。
アミノ酸配列を含む安定化鎖は、特異性鎖の定常ドメインの核酸配列と相互作用することができる任意のポリペプチドを含み得る。例えば、ＤＮＡ結合活性を有するアミノ酸配列（すなわち、ジンクフィンガー結合ドメイン(Balgth et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.98:7158-7163;Friesen et al.(1998)Nature Structural Biology,Tang et al.(2001)J.Biol.Chem.276:19631-9;Dreier et al.(2001)J.Biol.Chem.29466-79;Sera et al.(2002)Biochemistry 41:7074-81))、ヘリックス−ターンドメイン、ロイシンジッパーモチーフ(Mitra et al.(2001)Biochemistry 40:1693-9)、またはレクチン活性を有するポリペプチドを１つまたは複数の安定化ドメインに使用することができる。したがって、種々のポリペプチド（転写因子、制限酵素、テロメラーゼ、ＲＮＡもしくはＤＮＡポリメラーゼ、インデューサー／リプレッサー、または核酸結合活性を保持するそのフラグメントおよび変異型が含まれる）を使用することができる。例えば、Gadgil et al.(2001)J.Biochem.Biophys.Methods 49:607-24を参照のこと。さらに他の実施形態では、安定化鎖には、ポリアミドなどの小分子に結合する配列特異的ＤＮＡ(Dervan et al.(1999)Current Opinion Chem.Biol.6:688-93およびWinters et al.(2000)Curr Opin Mol Ther 6:670-81)；アミノグリコシド(Yoshhizawa et al.(2002)Biochemistry 41:6263-70)、キノキサリン抗生物質(Bailly et al.(1998)Biochem Inorg Chem 37:6874-6883)などの抗生物質；ＡＴ特異的結合分子(Wagnarocoski et al.(2002)Biochem Biophys Acta 1587:300-8)；ロジウム複合体(Terbrueggen et al.(1998)Inorg.Chem.330:81-7)が含まれ得る。
当業者は、例えば、安定化鎖中でジンクフィンガー結合ドメインを使用する場合、対応する核酸結合部位は特異性鎖の所望の定常領域に存在することを認識する。同様に、安定化鎖中でレシチン活性を有するポリペプチドを使用する場合、特異性鎖の対応する定常ドメインは所望の相互作用に必要な修飾を有する。安定化ドメインがアミノ酸配列を含む場合、任意のアミノ酸残基を機能的部分を含むように修飾することができる。このような修飾を、本明細書中でさらに詳細に考察する。
安定化鎖が核酸分子を含む場合、二機能性代替抗体は、特異性鎖を含むヌクレオチド配列を含み、上記のように、安定化鎖上の２つの安定化領域に相補的な２つの安定化領域を含む。この実施形態では、安定化鎖および特異性鎖が互いにハイブリッド形成して安定化ドメインと定常ドメインとの間に適切な相互作用が得られた場合、二機能性代替抗体が形成される。１つの実施形態では、安定化鎖は特異性鎖よりも長い。
安定化鎖は、任意のヌクレオチド塩基（例えば、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、またはその任意の組み合わせが含まれる）を含み得る。
Ｃ．二機能性代替抗体の形成
二機能性代替抗体の形成方法は、特異性鎖および安定化鎖を得るステップと、第一の安定化ドメインが第一の定常領域と相互作用し、且つ第二の安定化ドメインが第二の定常領域と相互作用する条件下で特異性鎖を安定化鎖に接触させるステップとを含む。安定化ドメインと定常ドメインとが安定に相互作用する任意の条件下で、特異性鎖を安定化鎖に接触させることができる。この代替抗体の形成方法を使用して、代替抗体集団を作製することができる。
好ましい実施形態では、二機能性代替抗体分子を、生理学的条件下で形成する。当業者は、意図する適用のための適切な条件を経験的に決定することができる。例えば、生理学的条件は、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．０、約ｐＨ７．０〜約７．６、または約ｐＨ７．２、７．３、７．４、または７．５を含み得る。生理学的条件は、約２３０〜約３５０ミリオスモル、約２５０〜約３００ミリオスモル、約２８０〜約３００ミリオスモルの生理学的塩条件を含む。あるいは、生理学的塩条件は、約２７０ミリオスモル、２８０ミリオスモル、２９０ミリオスモル、３００ミリオスモル、３１０ミリオスモル、３３０ミリオスモル、３４０ミリオスモル、３５０ミリオスモル、３６０ミリオスモル、３７０ミリオスモル、または３８０ミリオスモルを含み得る。生理学的条件は、さらに、約３４℃〜約３９℃、および約３５℃〜約３８℃、約３６℃〜約３７℃の温度を含む。当業者は、意図する適用に適切な塩濃度およびｐＨを決定することができる。１つの実施形態では、生理学的条件は、約３７℃でｐＨ７．４および塩濃度２８０〜約３００ミリオスモルを含む。
安定化鎖が核酸配列を含む場合、定常領域および安定化領域のヌクレオチド配列は所望の条件下で（すなわち、リガンド結合条件下で）相互作用する（すなわち、ハイブリッド形成する）。さらに、好ましくは第一の定常ドメインが第一の安定化ドメインと相互作用し、好ましくは第二の安定化ドメインが第二の定常ドメインと相互作用するように会合するように、各安定化ドメインおよび各定常ドメインをデザインすることができる。この方法では、特異性鎖と安定化鎖との相互作用時に、二機能性代替抗体の配列直接的自己会合が起こり得る。
１つの実施形態では、各安定化／定常ドメイン相互作用のＴｍが意図する適用温度（すなわち、所望のリガンド結合条件）より約１５℃〜約２５℃高くなるように代替抗体分子をデザインする。したがって、意図する適用が治療への適用または生理学的に条件下で行われる任意の適用である場合、Ｔｍは、約３７℃＋約１５℃〜約３７℃＋２５℃（すなわち、４９℃、５０℃、５２℃、５４℃、５５℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、またはそれ以上）であり得る。意図する適用が室温で行われる診断アッセイである場合、Ｔｍは、２５℃＋約１５℃〜約２５℃＋２５℃（すなわち、３８℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５３℃またはそれ以上）であり得る。Ｔｍの測定式は、当分野で公知である。Ｔｍの好ましい計算プログラムは、IDTBioTools(著作権)2000のOligoAnalyzer3.0を含む。本発明の方法に任意の温度を使用することができると認識される。したがって、リガンド結合条件の温度は、約５℃、１０℃、１５℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３８℃、４０℃、４２℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、またはそれ以上であり得る。
あるいは、約４０％〜約９９％、約４０％〜約５０％、または約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれ以上の代替抗体集団が意図するリガンド結合条件下でアニーリングを保持するように、安定化ドメインおよび各定常ドメインをデザインする。ゲル電気泳動を含む種々の方法を使用して、代替抗体の形成率を決定することができる。実施例を参照のこと。さらに、この決定型の計算は、例えば、Markey et al.(1987)Biopolymers 26:1601-1620およびPetersteim et al.(1983)Biochemistry 22:256-263（その両方が本明細書中で参考として組み込まれる）に見出すことができる。
比が二機能性代替抗体の形成に好ましい限り、特異性鎖および安定化鎖の相対濃度を変化させることができる。このような条件には、過剰な安定化鎖の獲得が含まれる。
安定化鎖および特異性鎖が核酸分子である場合、定常領域および安定化領域は、任意の所望のＧ／Ｃ含量（例えば、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＧ／Ｃが含まれる）を有し得る。
安定化鎖およびこれに含まれるドメイン（安定化ドメイン、いくつかの実施形態では、スペーサードメイン）は、鎖が本明細書中に記載の代替抗体を形成することができる限り、任意の長さであり得る。例えば、安定化鎖は、約８、１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。あるいは、安定化鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００、またはそれ以上であり得る。
安定化ドメインは、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。スペーサー領域が安定化鎖中に存在する場合、この領域は、約１ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約５ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。あるいは、本明細書中で考察されるように、スペーサーは、１つまたは複数の分子（例えば、リン酸部分が含まれる）を含み得る。定常ドメインと安定化ドメインとの間の相互作用が代替抗体構造の安定化および安定な特異性領域の産生に十分である限り、各ドメインの長さおよびＧ／Ｃ含量を変化させることができる。さらに、安定化鎖は、線状、環状、または球状であり、複数（２、３、４、５、６、またはそれ以上）の特異性鎖が相互作用する安定化ドメインをさらに含むことができる。
当業者は、安定化鎖安定化ドメインおよび特異性鎖定常ドメインを所望の条件下で相互作用の安定性を最大にするようにデザインし、それにより代替抗体の構造を維持することができると認識する。例えば、Guo et al.(2002)Nature Structural Biology 9:855-861およびNair et al.(2000)Nucleic Acid Research 28:1935-1940を参照のこと。代替抗体分子の安定性または構造を測定する方法は公知である。例えば、表面プラズモン共鳴(BIACORE)を使用して、代替抗体分子形成の速度値を決定することができる(BIACORE AB)。他の使用技術には、ＮＭＲ分光法および電気泳動移動度シフトアッセイが含まれる。Nair et al.(2000)Nucleic Acid Research 9:1935-1940を参照のこと。安定化鎖および特異性鎖が核酸である場合、相補性ハイブリッド形成安定化領域および定常領域は互いに１００％相同である必要はないと認識される。これらは配向性様式で互いに結合し、リガンド結合条件に曝露された場合に安定な構造を形成することが必要である。一般に、これは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、およびそれ以上の配列が相同な安定化ドメインおよび定常ドメインが必要である。さらに、相互作用には、安定化ドメインおよび対応する定常ドメイン中に少なくとも５個の連続する相補性ヌクレオチド残基が必要であり得る。
「配列同一性または相同性」は、定常ドメインのヌクレオチド配列の特定された連続セグメントが整列され、安定化ドメインのヌクレオチド配列と比較した場合、定常領域および安定化ドメイン内に相補塩基を有するヌクレオチドが見出されることを意図する。配列アラインメントおよび配列間の同一性の決定方法は、当分野で周知である。例えば、Ausubel et al.eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter19(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York);およびALIGNプログラム(Dayhoff(1978)in Atlas of Polypeputide Sequence and Structure 5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.))を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の至適アラインメントに関して、定常／安定化ドメインの連続セグメントは、対応する定常／安定化ヌクレオチド配列に関してさらなるヌクレオチドまたは欠失ヌクレオチドを有し得る。基準ヌクレオチド配列との比較で使用した連続セグメントは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５個の連続ヌクレオチドを含み、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列中のギャップの封入に関する配列同一性の増大を、ギャップペナルティの割り当てによって補正することができる。
２配列間の同一率を、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。ギャップオープンペナルティ２５およびギャップ伸長ペナルティ５を使用したSmith-Waterman相同検索アルゴリズムを使用して、ヌクレオチド配列の同一率を決定する。例えば、TimeLogicのDeCypher Hardware Acceleratorを使用して、このような配列同一性を決定することができる。
代替抗体の特異性鎖および安定化鎖が核酸配列を含む場合、第一および第二の鎖を溶液に入れること、溶液を加熱すること、および冷却時に第一および第二の鎖がアニーリングして抗体を形成するような条件下で溶液を冷却することによって代替抗体を形成することができる。他の実施形態では、加熱せずに代替抗体を形成することができる。
Ｄ．二機能性代替抗体の多様な構造
多数の種々の二機能性代替抗体構造を形成することができる。１つの実施形態では、本明細書中に記載の二機能性代替抗体は、１つまたは複数の特異性ドメインを有する１つまたは複数の異なる特異性鎖を含むことができ、各特異性ドメインは定常ドメインに近接する。したがって、本発明の二機能性代替抗体は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の特異性ドメインを有し得る。したがって、二機能性代替抗体分子を、複数のオリゴヌクレオチドを使用して形成することができる。例えば、図２および３を参照のこと。したがって、二機能性代替抗体は、「多価」であり得るので、１つの特異性鎖または複数の異なる鎖上に含まれる複数の特異性ドメインを含む。したがって、多価の代替抗体の特異性ドメインは、同一のヌクレオチド配列および同一のサイズであってよく、且つ同一のリガンド結合部位を認識することができる。他の実施形態では、特異性ドメインが異なり得るので、「多特異的」代替抗体を形成することができる。多特異的抗体は、異なるリガンドまたは同一リガンドの異なる領域に結合する。したがって、各特異性ドメインを、同一のリガンドまたは異なるリガンドに結合するようにデザインすることができる。この方法では、二機能性抗体は、１つの細胞上の２つの共通の決定基に同時に結合するか、異なる決定基に結合するか、２つの異なる方向で化合物に結合することができる。例えば、抗体は、好ましい結合部位およびアロステリックな位置でも特定の受容体に結合することができる。あるいは、代替抗体は、所与の細胞表面上の受容体の特定の対に結合して共同結合相互作用によって親和性を増大するか、分子または細胞間に架橋を形成することができる。
二機能性代替抗体は、個別のループ構造の間にヒンジ領域（またはスペーサー領域）をさらに含むことができる。代替抗体は、従来の抗体中でヒンジ単位として類似の様式で機能する「ヒンジ単位」またはスペーサーを含み得る。結合を立体的に至適化するために、スペーサー配列は、特異性鎖上の構造の間および／または安定化鎖の安定化ドメインの間に存在し得る。この方法では、スペーサー領域を使用して、分子中の結合ストレスを排除するか、結合溝のサイズおよび／または形状に多様性を持たせるか、特異性ループの配向を変化させるか、凝集もしくは綿状沈殿(flocculation)を至適化するか、エネルギー（フルーア）移動反応を至適化することができる。したがって、二機能性代替抗体分子は、同数のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列または異なる数のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列を有する複数のスペーサー領域を含み得る。
安定化鎖および特異性鎖がヌクレオチド配列を含む場合、同一または個別の（すなわち、異なる）核酸分子上に鎖を含むことができることがさらに認識される。したがって、別の実施形態では、１つのヌクレオチド鎖から、第一の定常領域、特異性ドメイン、第二の定常領域、第二の定常領域とハイブリッド形成することができる第二の安定化領域、および第一の定常領域とハイブリッド形成することができる第一の安定化領域を含む代替抗体を形成する。１つの実施形態では、各領域は、約１個から約２０個のヌクレオチドを含み、この分子は代替抗体構造を形成するためのスペーサー領域をさらに含み得る。さらに、安定化領域および定常領域が相互作用する限り、ヌクレオチドの鎖は線状または環状であり得る。
あるいは、特異性鎖および安定化鎖は、共有性相互作用によって結合する必要はない。その代わり、特異性鎖および安定化鎖は、非共有相互作用を介して（直接または間接的に）相互作用する異なる分子(distinct molecule)を含み得る。この様式では、特異性鎖および安定化鎖が核酸配列を含む場合、各「異なる」鎖は３’末端および５’末端を有する核酸配列を含む。したがって、本発明は、２つまたはそれ以上の一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖、２つまたはそれ以上の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖、２つまたはそれ以上のＴＮＡオリゴヌクレオチド鎖、または２つまたはそれ以上の一本鎖ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、もしくはＴＮＡ鎖の組み合わせの会合を含むリガンド結合代替抗体分子に関する。
代替抗体分子種々の型の代表を、図１、２、および３に示す。図２は、複数の特異性領域を含む代替抗体分子の２つの実施形態を示す。１つの実施形態では、代替抗体分子は、複数の特異性領域、安定化領域、および集合的に多次元リガンド結合を提供するスペーサー領域を含む。これらの分子型を、例えば、図３ａ〜３ｄに示す。
Ｅ．免疫調製薬
本発明の二機能性代替抗体は、所望の目的のリガンドと相互作用し、且つ免疫調整薬にさらに結合している。「免疫調整薬」は、免疫応答を調整する（刺激または抑制する）ことができる任意の分子が意図される。以下で考察するように、免疫応答の調整は、直接的または間接的な効果であり得る。
「結合」または「結合される」は、二機能性代替抗体との薬剤の任意の結合（共有結合、イオン結合、疎水性結合、または任意の他の手段）を意図する。結合は、所望の適用条件下での二機能性代替抗体と免疫調整薬との相互作用を維持するほどである。種々の非共有結合方法には、例えば、アビジン−ビオチン、予備複合体形成抗体(pre-complexed antibody)−抱合タンパク質(conjugated protein)、レクチン−糖、化合物に結合したキレート剤（シクロデキストリンなど）などが含まれる。免疫調整薬を、代替抗体の任意の領域（すなわち、安定化鎖、少なくとも１つの安定化ドメイン、特異性鎖、特異性ドメイン、少なくとも１つの定常ドメイン、スペーサードメイン（存在する場合）、またはその任意の組み合わせ）に結合することができる。
免疫調整薬は、代替抗体上の任意の位置（すなわち、残基）で結合することができる。したがって、核酸配列への「結合」は、例えば、糖残基への共有結合を含むか、免疫調整薬が核酸配列（すなわち、ＣｐＧモチーフ）でもある場合、薬剤を、鎖中に内在的または５’もしくは３’末端でのリン酸結合を介して結合することができる。同様に、安定化鎖がアミノ酸配列を含む場合、任意の残基で免疫調整薬が結合することができる。いくつかの実施形態では、安定化鎖のＮ末端またはＣ末端で結合する。
代替抗体構造への免疫調整薬の種々の結合方法は、当分野で公知である。例えば、代替抗体にポリペプチドまたは目的の種々の他の化合物が抱合される生体抱合反応(bioconjugation reaction)を、例えば、Aslam et al.(1999)Protein Coupling Techniques for Biomed Sciences,Macmillan Press;Solulink Bioconjugation system(www.solulink.com;Sebestyen et al.(1998)Nature Biotechnology 16:80-85;Soukchareum et al.(1995)Bioconjugate chem.6:43-54;Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-52、およびWong et al.(2000)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）で見出すことができる。
１つまたは複数の同一または異なる免疫調整薬を、二機能性代替抗体を形成する１つまたは複数の鎖に結合することができる。代替抗体分子の鎖を、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なるまたは同一の免疫調整薬に結合することができる。薬剤は、安定化鎖または特異性鎖のいずれかの末端のいずれかまたは両方に存在し、いずれかの鎖中のどこにでも各残基を付加するか、残基の全てまたは一部に結合するか、または所与の残基型の全部または一部に結合することができる。１つの実施形態では、免疫調整薬を、１つまたは複数の定常ドメインおよび／または安定化ドメインに結合する。他の実施形態では、薬剤を特異性ドメインに結合する。当業者は、薬剤の結合部位は所望のリガンドに依存し、代替抗体の標的リガンドとの相互作用を破壊するほどではないことを認識する。
種々の免疫調整薬が本発明で適用される。二機能性代替抗体構造に組み込まれる免疫調整薬は、目的のリガンドおよび／または二機能性抗体を投与する被験体におけるリガンド部位での所望の免疫応答型に依存して選択される。
免疫調整薬には、ポリペプチド（免疫グロブリン重鎖、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、補体系のポリペプチド、および熱ショックタンパク質（すなわち、マイコバクテリア熱ショックタンパク質ＨＳＰ６５(Silva et al.(1996)Infect.Immun.64:2400-2407)）など）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる免疫調整薬には、非タンパク質ポリマー（米国特許第6,468,532号を参照のこと）、ＣｐＧモチーフおよびその活性変異型、サポニンおよびその誘導体（トリテルペノイドグリコシド（ＱＳ−２１）Kim et al.(2000)Vaccine 19:530-7など）、細菌毒素ならびにその変異型および誘導体、リポ多糖誘導体、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびその誘導体(Ellouz et al.(1974)Biochem.Bioophys.Res.Commun.59:1317-25、Azuma et al.(1992)Int.J.Immunopharmacol.14:487-96、およびO’Reilly et al.(1992)Clin.Infect.Dis.14:1100-9)、ホルモン（すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはデヒソロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）(Daynes et al.(1996)Infect.Immun.64:1100-9、Enioutina et al.(1999)Vaccine 17:3050-64、Van der Stede et al.(2001)Vaccine 19:1807-8、およびKriesel et al.(1999)Vaccine 17:1883-8)）、ビタミン(Tengerdy et al.(1989)Ann.N.Y.Acad.Sci.570:335-44およびBanic et al.(1982)Int.J.Vitam.Nurt.Res.Suppl 23:49-52)、およびイミダゾキノリン（Ｒ−８３７、Ｒ−８４８など）(Wagner et al.(1999)Cell Immunol 191:10-9およびBernstein et al.(1993)J.Infect.Dis.167:731-5)が含まれる。免疫調整薬には、さらに、接着分子ならびにその活性変異型およびそのフラグメント（セレクチン、カドヘリン、インテグリン、ムチン様血管アドレシン(addressin)、インテグリン、および免疫グロブリンスーパーファミリー（ＣＤ２、ＣＤ５４、ＣＤ１０２、リンパ球抗原提示細胞（ＬＦＡ３およびＣＤ１０６など））が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。例えば、米国特許第6,406,870号、同第6,123,915号、同第6,482,840号、および同第5,714,147号（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。さらなる薬剤の例を、以下でさらに詳述する。
他の実施形態では、免疫調整薬は、投与時に標的リガンド部位で方向性抗代替抗体応答(directed anti-surrogate antibody response)を可能にする宿主に対して外来の任意の化合物（例えば、ＢＳＡ、マウスＩｇなどの生体異物タンパク質）を含み得る。例えば、補体活性化、オプソニン化誘導性食作用などを含む収束(focused)炎症応答を確保することができる。
免疫調整薬がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、生物活性変異体および配列フラグメントを含み得る。適切な生物活性変異型は、免疫調整薬のフラグメント、アナログ、および誘導体（すなわち、免疫グロブリンの定常ドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）；サイトカイン；ケモカイン；サイトカインアンタゴニスト；ＨＳＰなど）であり得る。「フラグメント」は、生物活性を保持する（すなわち、免疫応答を調整する）ポリペプチド配列の一部のみからなるタンパク質を意図する。フラグメントは、ポリペプチドのＣ末端欠失物またはＮ末端欠失物であり得る。免疫応答を調整することができるポリペプチドの「変異型」（すなわち、免疫グロブリンの定常ドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）；サイトカイン；ケモカイン；サイトカインアンタゴニスト；ＨＳＰなど）は、免疫応答を調整することができる全長ポリペプチドのアナログまたは１つまたは複数のアミノ酸が置換、挿入、または欠失した天然の配列および構造を含むそのフラグメントを意図する。免疫応答を調整することができるポリペプチドの「誘導体」（すなわち、免疫グロブリンの定常ドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）；サイトカイン；ケモカイン；サイトカインアンタゴニスト；ＨＳＰなど）は、活性が保持される限り、天然のポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその各変異型の任意の適切な修飾（グリコシル化、リン酸化、または外来部分の他の付加など）を意図する。
好ましくは、免疫応答を調整することができるポリペプチドの天然または非天然の変異型（すなわち、免疫グロブリンの定常ドメイン、サイトカイン、ケモカイン、サイトカインアンタゴニスト、熱ショックタンパク質など）は、基準分子（例えば、免疫グロブリンのＦｃドメイン（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４））とアミノ酸配列が、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％同一なアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、BLOSUM行列６２を使用したアフィンギャップ検索を使用したSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムを使用して配列同一率を決定する。Smith-Waterman相同検索アルゴリズムは、Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489で教示されている。変異型は、例えば、１〜１０個ほどのアミノ酸残基（６〜１０など）、５個ほど、４、３、２、または１ほどのアミノ酸残基が異なり得る。
２つのアミノ酸配列の至適アラインメントに関して、変異アミノ酸配列の連続セグメントは、基準アミノ酸配列に関してさらなるアミノ酸残基を含むか、アミノ酸残基が欠失され得る。基準アミノ酸配列との比較のために使用した連続セグメントは、少なくとも２０個の連続アミノ酸を含み、３０個、４０個、５０個、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存残基置換またはギャップに関する配列同一性を修正することができる（Smith-Waterman相同検索アルゴリズムを参照のこと）。
上で概説するように、当業者は、このような変異型の調製および使用に関する実質的なガイダンスを提供している。免疫応答を調整することができるペプチドのフラグメントは、一般に、全長分子の少なくとも約１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは全長ドメインの約１５〜２５個の連続アミノ酸残基、または全長定常ドメインの少なくとも約２０〜５０個またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含む。
免疫応答を調整することができる薬剤が非タンパク質分子である場合、薬剤は、活性誘導体を含み得る。免疫応答を調整することができる薬剤の「誘導体」（すなわち、ホルモン（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３またはデヒソロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）；ビタミン；イミダゾキノリン（Ｒ−８３７、Ｒ−８４８など））は、所望の活性が保持される限り（免疫応答の調整）、天然の薬剤の任意の適切な修飾（グリコシル化、リン酸化、外来部分の他の付加、または天然構造の変化など）を意図する。
意図する適用のための会合の維持に必要な最小の配列長を有する核酸配列のみから排他的に構成される代替抗体を単離することによって、ならびに配列をヒト化することおよび／または安定化ドメインの形成に必要なペプチドのサイズを減少させることによって、免疫原性の低い代替抗体を作製することができることがさらに認識される。さらに、二機能性代替抗体に結合した免疫調整薬もまた、非ヒトポリペプチドの「ヒト化」形態であり得る。これらの実施形態では、ドナーポリペプチド由来のアミノ酸を、対応するヒト残基に置換する。さらに、ヒト化ポリペプチドは、ヒト配列またはドナー抗体中で見出されない残基を含み得る。ポリペプチドの性能をさらに改良するためにこれらの修飾を行う。さらなる詳細については、Jones et al.(1986)Nature 321:522-525;Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-329;およびPresta et al.(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596を参照のこと。
ｉ．免疫グロブリン定常鎖
１つの実施形態では、免疫応答を調整することができる免疫調整薬は、免疫グロブリンまたはその活性変異型もしくは活性フラグメント由来の定常領域を含むアミノ酸配列を含む。
免疫グロブリンの「定常領域」は、免疫グロブリンのイソ型特異的特性またはエフェクター機能を付与する免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸領域を意図する。定常領域は、軽鎖の定常領域および重鎖の定常ドメインを含み得る。定常ドメインは、抗体のリガンドへの結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在し、これらのいくつかをさらにサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分類することができる。異なる免疫グロブリンクラスに相当する重鎖定常領域を、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。任意の免疫グロブリンの定常領域またはその活性変異型もしくはフラグメントを、本発明で免疫調整薬として使用することができる。免疫グロブリン定常重鎖のアミノ酸配列および免疫グロブリン定常軽鎖は、Kabet et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institute of Health,Methesda,Md（その全内容が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
これらの免疫グロブリン定常鎖の活性変異型およびフラグメントはまた当分野で公知であり、免疫調整薬として適用される。免疫グロブリン重鎖の活性変異型またはフラグメントは、免疫応答を調整する能力、特に、免疫エフェクター機能を調整する能力を保持する。抗体定常領域によって媒介されるエフェクター機能には、抗体の抗原への結合後に作用する機能（すなわち、食作用または補体依存性細胞傷害性を得ることができる補体カスケードまたはＦｃ受容体（ＦｃＲ）保有細胞への影響によるもの）が含まれる。定常領域はまた、抗原結合に独立して作用する機能に影響を与え得る（すなわち、循環中の持続性の付与およびトランスサイトーシスによって細胞障壁を移動する能力）。Ward et al.(1995)Therapeutic Immunology 2:77-94を参照のこと。
したがって、免疫グロブリンの定常領域の活性フラグメントは、例えば、重鎖ＣＨ１領域、重鎖ＣＨ２領域、重鎖ヒンジ領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域、κ軽鎖、またはその任意の組み合わせを含み得るか、免疫グロブリン定常領域の活性フラグメントはＦｃ領域を含み得る。「Ｆｃ領域」は、パパイン消化時の天然の抗体の消化時に産生されるＣ末端免疫グロブリンを意図する(Deisenhofer et al.(1981)Biochemistry 20:2361-2370)。
したがって、免疫グロブリンの定常ドメインまたはその活性フラグメントおよび変異型は、本発明の代替抗体と結合した場合、オプソニン化、補体固定、抗原クリアランス、ＡＤＣＣ、または細胞傷害性の調整を含む種々の方法で免疫応答を調整することができる。
１つの実施形態では、免疫調整薬は、ＩｇＧである。他の実施形態では、免疫調整薬は、ＩｇＧの定常領域（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）を含み、他の実施形態では、免疫調整薬は、ＩｇＧ定常領域の活性フラグメントまたは変異型（すなわち、重鎖ＣＨ１領域、重鎖ＣＨ２領域、重鎖ヒンジ領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域、κ軽鎖、またはその任意の組み合わせまたはＦｃ領域）を含む。これらのＩｇＧドメインのアミノ酸配列は、Kabet et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,Md,volume1:661-723に記載されている。これらの各ページは、本明細書中で参考として組み込まれる。ＩｇＧ分子の略図を、図８に示す。
免疫グロブリン定常領域またはその活性フラグメントもしくは変異型が有する免疫エフェクター機能に対する特定の影響は公知であるので、免疫応答を望ましく調整する免疫グロブリン定常鎖またはその変異型もしくはフラグメントをデザインすることができる。例えば、異なる細胞機構を介して、ＡＤＣＣおよび食作用はどちらも、細胞結合ｍＡｂがそのＦｃ領域を介してＦｃγＲ（すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ）へ最初に結合する。この相互作用の後に免疫系細胞によって標的が破壊される。種々のＩｇＧ定常鎖ならびにその活性変異型およびフラグメントの種々のＦｃγＲ受容体型との相互作用が公知である。したがって、所望のＦｃγＲ受容体と結合することができるＩｇＧ定常ドメインまたはその活性フラグメントもしくは変異型を含む二機能性代替抗体は、免疫応答を調整する（すなわち、炎症メディエーターの放出の調整、免疫複合体のエンドサイトーシス、ＡＤＤＣの調整、ＦｃγＲ保有細胞に対する架橋剤としての作用、および免疫系細胞活性化の増大）。
１つの実施形態では、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域を使用する。他の実施形態では、ＩｇＧ定常領域の活性変異型およびフラグメントを使用する。４つのＩｇＧサブクラスのＦｃドメインは、種々のＦｃγＲメンバーに対して異なる結合親和性を有する。このような相互作用は、当分野で公知である。例えば、Gessner et al.(1998)Ann.Hematol 76:231-248,Warmerdam et al.(1991)J.Immunol.147:1338-1343、de Haas et al.(1996)J.Immunol.156:2948-2955、Koene et al.(1997)Blood 90:1109-1114、Wu et al.(1997)J.Clin.Invest.100:1059-1070、Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institute of Health,Lund et al.(1995)FASEB J.9:115-119、Morgan et al.(1995)Immunology 86:319-324、Michaelsen et al.(1992)Mol.Immunol.29:319-326、Shields et al.(2001)J.Biol.Chem.267:6591-6604(それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。これらの引例は、ＩｇＧサブクラスの定常領域がＦｃγＲ相互作用を媒介することを考察している。この所望の活性を有する免疫グロブリンの変異型を考察している米国特許第6,194,551号も参照のこと。したがって、所望の免疫調整のための所望のＦｃドメインをデザインすることができる。
ＦｃγＲと相互作用するＩｇＧ定常領域のアナログもまた公知である。例えば、配列は、炭水化物至適化を含み得る。例えば、ＦｃドメインのＡｓｎ２９７に結合した炭水化物は、ＩｇＧのＦｃγＲとの相互作用に影響を与え、ＡＤＣＣ活性を減少させる。したがって、エフェクター機能の増大を所望する場合、アグリコシルポリペプチドを使用することができるか、Ａｓｎ２９７のアミノ酸の位置を、別のアミノ酸に変化させることができる。例えば、Hobbs et al.(1992)Mol.Immunol.29:949-956を参照のこと。さらに、アナログは、ガラクトース、ガラクトース−シアリン酸、マンノース、フコース、およびＮ−アセチルグルコサミンを含む種々のオリゴ糖の結合を含み得る。さらなる活性変異型の概説については、Presta et al.(2002)Current Pharmaceutical Biotechnology 3:237-256を参照のこと。
別のＩｇＧ依存性エフェクター系は、補体活性化を使用する。免疫系細胞（ＡＤＣＣおよび食作用の場合）の代わりに、補体系は、古典経路（細胞に結合したＩｇＧへのｃ１ｑ結合）または他の分子への最初の結合を使用する代替経路のいずれかによって細胞を死滅させる複合体を形成するカスケードである一連の可溶性血中タンパク質である。Ｃ１ｑは、カスケードを開始するために細胞表面に結合した複数のＩｇＧに結合しなければならない補体タンパク質である。
種々のＩｇＧ定常領域のＣ１ｑ補体タンパク質との相互作用が特徴付けられた。したがって、補体を活性化することができる免疫グロブリン定常領域またはその活性フラグメントもしくは変異型を有する二機能性代替抗体をデザインすることができる。Ｃ１ｑと相互作用することができる免疫グロブリン定常領域またはその変異型もしくはフラグメントを含む二機能性代替抗体の相互作用は、補体カスケードの調整によって免疫応答を調整する能力を有する。
Ｃ１ｑ相互作用のためのＩｇＧエピトープを研究した。研究により、Ａｓｐ２７０、Ｌｙｓ３２２、Ｐｒｏ３２９、およびＰｒｏ３３１がＣ１ｑ結合エピトープを含むことが示唆される。例えば、Tao et al.(1993)J.Exp.Med.178:661-667、Idusogie et al.(2000)J.Immunol.164:4178-4184、Thommesen et al.(2000)Mol.Immunol.37:995-1004（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
Ｃ１ｑとの相互作用を介して免疫応答を調整するＩｇＧ定常鎖の変異型およびアナログも公知である。末端シアリン酸および末端ガラクトースの効果についての研究も補体活性化を調整する。例えば、Wright et al.(1998)J.Immunol.160:3393-3402、Jassal et al.(2001)Biodhem.Biophys.Res.Commun.286:243-249、Gottleib et al.(2002)J.Am.Acad.Dermatol.43:595-604（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。さらに、修飾された場合に補体活性化が増大するＩｇＧ１中のアミノ酸残基が同定されている。例えば、Idusogie et al.(2001)J.Immunol.166:2571-2575を参照のこと。所望の活性を有する免疫グロブリンの変異型を考察している米国特許第6,194,551号も参照のこと。
ＩｇＧの別のエフェクター機能は、その半減期またはクリアランス比を含む。ヒトＩｇＧの半減期は比較的長い。したがって、免疫グロブリンの定常ドメインまたはその活性変異型もしくは活性フラグメントを有する二機能性代替抗体は、二機能性代替抗体の半減期の増大によって免疫応答を調整する。この改変により、二機能性代替抗体の有効性に影響を与えることなく投薬量または投与頻度を減少させることができる。
免疫グロブリンの半減期は、ＦｃＲｎとの相互作用による影響である。ＩｇＧのＦｃＲｎとの相互作用のためのエピトープがマッピングされており(Kim et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:542-548、Kim et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:2429-2434、Kim et al.(1999)J.Immunol.29:2819-2825、Medesan et al.(1997)J.Immunol.158:2211-2217、およびWeiner et al.(1995)Cancer Res.55:4586-4593)、マウスＦｃＲｎへの結合を改良するマウスＩｇＧ中の特定のアミノ酸の変化によりマウス中での半減期も増大することが示されている(Ghetie et al.(1997)Nature Biotechnol.15:637-640)。したがって、本発明の二機能性代替抗体に結合した場合に意図する適用に望ましい半減期を産生する多数のＩｇＧの変異型を作製することができる。
ＩｇＡの定常領域もまた免疫エフェクター機能を誘発することができる。例えば、ＦｃαＲ１と相互作用するＩｇＡ定常鎖の領域は、ＡＤＣＣ、好中球呼吸バースト、および食作用を含む免疫応答を調整することができる。例えば、Morton et al.(1996)Crit.Rev.Immunol.16:423-440、Van Egmond et al.(2000)Nat.Med.6:680-685、Van Egmond et al.(1999)Blood 93:4387-4394、Van Egmond et al.(1999)Immunol.Lett.68:83-87、米国特許第6,063（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。ＩｇＡの活性変異型およびフラグメントは公知である。例えば、Mattu et al.(1998)J.Biol.Chem.273:2260-2272、Rifai et al.(2000)J.Exp.Med.191:2171-2181を参照のこと。
本発明の免疫グロブリンの変異型は、ヒト化ポリペプチドをさらに含み得る。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。これらの実施形態では、ドナー免疫グロブリン由来のアミノ酸を、対応するヒト残基に置換する。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト抗体またはドナー抗体で見出されない残基を含み得る。免疫グロブリンドメインの抗体性能をさらに改良するためにこれらの修飾を行う。Jones et al.(1986)Nature 321:522-525;Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-329;およびPresta et al.(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596を参照のこと。
さらに別の実施形態では、二機能性代替抗体に結合した免疫グロブリン定常鎖またはその活性変異型もしくはフラグメントは、輸送薬として作用する。「輸送薬」は、トランスサイトーシスを介した経上皮輸送を行うことができる任意の分子を意図する。ＩｇＡおよびＩｇＭが共に粘膜表面で分泌され、それにより輸送薬として作用することができる。上記で考察されるように、ヒトでは２つのＩｇＡイソ型（ＩＧＡ１およびＩｇＡ２）が生じる。二量体ＩｇＡは、Ｊ鎖と呼ばれるシトシンリッチポリペプチドに結合したジスルフィドによって結合した２つのＩｇＡ分子を含む。二量体ＩｇＡの粘膜への輸送は、高分子免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）によって媒介される。この受容体は、粘膜上皮細胞の基底外側表面で二量体ＩｇＡと結合し、ＩｇＡ／ｐＩｇＲ複合体が先端細胞表面にトランスサイトーシスされる。二量体ＩｇＡ／Ｊ鎖／ｐＩｇＲ複合体が放出され、それにより、粘膜表面で病原微生物に対する分泌防御系を産生する。輸送活性を有するＩｇＡの変異型およびフラグメントは公知である。米国特許第6,063,905号（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。例えば、Kerr et al.(1990)Biochem J.271:285-296、Morton et al.(1996)Crit.Rev.Immunol.16:423-440、Chintalacharuvu et al.(1999)Immunotechnology 4:165-174、米国特許第5,928,895号、米国特許第6,045,774号も参照のこと。１つの実施形態では、輸送薬は、ＩｇＡまたはＩｇＭの分泌ドメインを含む。例えば、米国特許第6,063,905号（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
結合した輸送薬を有する二機能性代替抗体の輸送アッセイは当分野で公知である。このようなアッセイには、ｐＩｇＲに対する結合活性および特異性についてのアッセイが含まれる(Bakos et al.(1991)J.Immunol.147:3419-3426)。さらに、免疫グロブリンの活性フラグメントおよび変異型を産生する種々のインビトロ発現系を使用してＦｃ構造／機能の分野が開発されている。これらの系は、補体の誘発および／またはＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＥ上のＦｃ受容体結合部位の誘発を容易にした(Burton et al.(1992)Adv.Immunol.51:1-84)。類似のアッセイ系を使用して、ｐＩｇＲ結合活性を保持し、それにより粘膜輸送されるＩｇＡおよびＩｇＭならびにその活性変異型およびフラグメントが研究されている。さらに、インビトロトランスサイトーシスアッセイが公知である。簡単に述べれば、ｐＩｇＲでトランスフェクトしたＭＤＣＫ（Madin-Dabyイヌ腎臓）細胞株を使用して、トランスサイトーシスをアッセイした。これは、半透性支持体上で成長させた場合に輸送活性を有するＩｇＡ、ＩｇＭ、またはその活性変異型および活性フラグメントを組織培養ウェルの下（基底外側）から上（先端）のチャンバーに輸送する強固に連結した単層を形成することができる極性細胞株である。
したがって、別の実施形態では、二機能性代替抗体は、１つまたは複数の結合した同一または異なる輸送薬を含み得る。輸送薬を有する分子は、さらに、１つまたは複数の免疫調整薬または本明細書中で考察される他の機能的部分を含み得る。
ｉｉ．二重特異性抗体
別の実施形態では、本発明の二機能性代替抗体分子を、二重特異性抗体となるようにデザインする。二重特異性抗体は、２つの特異性を含む抗体である（すなわち、これらは、２つの異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合する）。この実施形態では、免疫調整薬は、免疫応答レギュレーターと相互作用することができる特異性ドメインを含む。本明細書中で使用される、「免疫応答レギュレーター」は、リガンド／代替抗体相互作用部位に輸送された場合に免疫応答を調整することができる任意の分子である。
例えば、１つの実施形態では、代替抗体は、標的リガンドと相互作用する第一の特異性ドメインおよび免疫応答レギュレーター（ＦｃγＲなど）と相互作用する第二の特異性ドメインを含む。したがって、ＦｃγＲとの相互作用は、標的抗原を破壊するために免疫エフェクター細胞を漸増させる。例えば、Da Costa et al.(2000)Cancer Chemother Pharmacol.46:S33-S36、McCall et al.(1999)Mol.Immunol.36:433446、Akewanlop et al.(2001)Cancer Res.61:4061-4065、Sundarapandiyan et al.(2001)J.Immunol.Meth 248:113-123、およびStockmeyer et al.(2001)J.Immunol.Meth.248:103-111（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。他の免疫応答レギュレーターには、α１抗トリプシンおよび主要組織適合性複合体（すなわち、腫瘍特異的抗原またはウイルス関連抗原に結合する組織適合抗原）が含まれるが、これらに限定されない。
ｉｉｉ．サイトカイン
サイトカインは、広範な免疫細胞型に影響を与える免疫調整分子である。本明細書中で使用される、用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞によって産生され、免疫応答を調節または調整するタンパク質クラスのメンバーをいう。このような調節は、体液性または細胞性免疫応答内で生じることができ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、または他の免疫系細胞のエフェクター機能の調整が含まれる。本発明の代替抗体へのサイトカインの結合により、サイトカインの標的リガンド（すなわち、癌細胞、細菌、ウイルス）への送達がターゲティングされ、それにより所望の部位でのサイトカイン送達のターゲティングにより全身投与で頻繁に認められたサイトカインの毒性が減少する。
本明細書中で使用される、用語「サイトカイン」は、リンパ球および他の細胞型（指定のリンホカイン）によって分泌されたサイトカインならびに単球およびマクロファージによって分泌されたサイトカインおよび他の細胞型（指定のモノカイン）を含む。用語「サイトカイン」には、造血系細胞および免疫系細胞の成長および分化に主に影響を与える白血球によって分泌される分子であるＩＬ−２(Harvill et al.(1995)Immunotechnology 1:95-105およびShu et al.(1995)Immunoltechnologgy 1:231-241)、IL-3、IL-4、およびIL-12(Lode et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:2475-2450、Peng et al.(1999)J.Immunol.163:250-258、Kenney et al.(1999)J.Immunol.163:4481-8、およびBuchanan et al.(1998)J.Immunol.161:5525-33)などのインターロイキンが含まれる。
用語「サイトカイン」には、コロニー刺激因子１(Nobiron et al.(2001)Vaccine 19:4226-35およびDela et al.(2000)J.Immunol.165:5112-5121)などのコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（米国特許第6,482,407号）などの造血成長因子も含まれる。さらに、用語「サイトカイン」は、種々の白血球の走化性を媒介し、白血球インテグリン発現または接着を調節することができる低分子量の分子であるケモカインを含む。ケモカインの例には、インターロイキン８(Holzer et al.(1999)Cytokine 8:214-221)、樹状細胞ケモカイン１（ＤＣ−ＣＫ１）およびＴ細胞の動員および粘膜免疫に重要なケモカインであるリンホタクチンならびにＣ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃケモカインサブファミリーの他のメンバーが含まれる。別のアミノ酸によって分離された２つのシステイン残基ならびに好中球の移動を促進する機能を有するＣＸＣファミリーメンバーを特徴付け、これらの例には、ＩＬ８、ＩＰ１０、ＳＤＦ１が含まれる。ＣＣファミリーメンバーは単球または他の細胞型の移動を促進し、例として、マクロファージ化学誘引タンパク質、またはＭＣＰ１、ＭＩＰαおよびβ、ＲＡＮＴＥＳ，エオタキシン、リンホタクチン（胸腺中でＴ細胞前駆体を誘引する）が含まれる。ＣＸＸＸＸＣファミリーのメンバーには、単球およびＴ細胞を誘引するフラクタルカインが含まれる。例えば、Miller et al.(1992)Crit.Rev.Immunol.12:17-46(1992);Hedrick et al.(1997)J.Immunol.158:1533-1540;およびBoismenu et al.(1996)J.Immunol.157:985-992（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
本明細書中で使用される、用語「サイトカイン」はまた、Ｔヘルパー１（ＴH1）およびＴヘルパー２（ＴH2）サブセットによって産生されたサイトカインを含む。ＴH1サブセットのサイトカインは、ＴH1細胞によって産生され、ＩＬ−２、ＩＬ−１２，ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−βが含まれる。ＴH1サブセットのサイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球、マクロファージ、および遅延型過敏症の活性化などの古典的細胞性機能を担う。ＴH1サブセットのサイトカインは、腫瘍細胞、感染細胞、および細胞内病原体に対する免疫応答の刺激に特に有用である。
ＴH2サブセットのサイトカインは、ＴH2細胞によって産生され、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０(Kim et al.(1999)J.Med.Primatol.28:214-23およびSuh et al.(1999)J.Interferon Cytokine Research 19:77-84)が含まれる。ＴH2サブセットのサイトカインは、Ｂ細胞活性化のヘルパーとして有効に機能し、自由生活性細菌および寄生虫に対する免疫応答を刺激するのに特に有用である。ＴH2サブセットのサイトカインもまた、アレルギー反応を媒介することができる。したがって、任意のサイトカインを、代替抗体に結合することができる。米国特許第6,399,068号もまた参照のこと。さらなる目的のサイトカインには、リンホトキシンおよびＴＧＦ−βが含まれる。
サイトカインの活性フラグメントおよび変異型もまた、本発明で有用である。活性サイトカインフラグメントおよび変異型は当分野で公知であり、例えば、全長ＩＬ−１βサイトカインの免疫刺激活性を保持するＩＬ−１β由来の９アミノ酸ペプチドが含まれる。Hakim et al.(1996)J.Immunol.157:5503-5511（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。さらに、米国特許第6,482,407号に記載されている、骨髄増殖アッセイなどの種々の周知のサイトカイン活性のインビトロおよびインビボアッセイはサイトカインフラグメントの活性試験に有用である。Thomson(1994)The Cytokine Handbook(second Edition)London:Harcourt Brace & Companyも参照のこと。これらの引例は共に本明細書中で参考として組み込まれる。
サイトカインアンタゴニストはまた、本発明で有用な免疫調整分子であり得る。このようなサイトカインアンタゴニストは、天然に存在しても非天然であってもよく、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、リンホタクチン、およびＤＣ−ＣＫ１のアンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストには、サイトカイン欠失および点変異、サイトカイン由来ペプチド、サイトカイン受容体の可溶性のドミナントネガティブ部分が含まれる。例えば、ＩＬ−１の天然に存在するアンタゴニストを、ＩＬ−１の病態生理的活性を阻害するために本発明の免疫調整薬として使用することができる。このようなＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βとほぼ等しい親和性を有するが受容体を活性化しないＩＬ−１受容体Ｉに結合するポリペプチドであるＩＬ−１Ｒａが含まれる（Fischer et al.(1991)Am.J.Physiol.261:R442-R449;Dinarello et al.(1991)Immunol.Today 12:404-410（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる））。ＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１β由来のペプチドおよびＩＬ−１ムテインも含まれる（本明細書中で参考として組み込まれる、Palaszynski et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.147:204-209）。本発明で有用なサイトカインアンタゴニストには、例えば、ＴＮＦ−αのアンタゴニストも含まれる（Ashkenazi et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539;およびMire-Sluis et al.(1993)Trends in Biotech.11:74-77（それぞれ本明細書中で参考として組み込まれる））。
ｉｖ．免疫調整核酸モチーフ
本発明の別の実施形態では、二機能性抗体を、免疫調整核酸モチーフに結合した。本明細書中で使用される、「ＣｐＧモチーフ」は、免疫応答を調整することができる非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、リン酸結合で連結されたシトシンおよびその後にグアニンを含むＣｐＧモチーフ）を含む。
１つの実施形態では、免疫調整核酸モチーフは、免疫調整核酸モチーフを含む。本明細書中で使用される、「免疫刺激核酸モチーフ」は、免疫応答を刺激することができ、非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、シトシンおよびその後にリン酸結合で連結されたグアニンを含むＣｐＧモチーフ）を含む。このような刺激は、脊椎動物リンパ球に対するマイトジェン効果、または脊椎動物リンパ球によるサイトカイン発現の増大を含み得る。刺激ＣｐＧモチーフはまた、例えば、天然のキラー細胞溶解活性を増大させ、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を調整し、そして／またはＢ細胞樹状細胞およびＴ細胞を活性化する。したがって、免疫調整核酸モチーフを有する二機能性特異的抗体は、本発明で適用される。
種々の免疫刺激ＣｐＧモチーフが公知である。例えば、米国特許第6,339,068号、同第6,476,000号、Klinman et al.(2002)Microbes and Infection 4:897-901、McKenzie et al.(2001)Immunological Research 24:225-244、およびCarpentier et al.(2003)Frontiers in Bioscience 8:115-127（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。典型的な免疫刺激ＣｐＧモチーフは、５’Ｎ1ＣＧＮ2３’（配列番号５）（少なくとも１つのヌクレオチドが連続するＣｐＧモチーフを分離し、Ｎ1はアデニン、グアニン、またはチミン／ウリジンであり、Ｎ2はシトシン、チミン／ウリジン、またはアデニンである）を含む。免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフの例には、ＧＡＣＧＴＴ（配列番号６）、ＡＧＣＧＴＴ（配列番号７）、ＡＡＣＧＣＴ（配列番号８）、ＧＴＣＧＴＴ（配列番号９）、およびＡＡＣＧＡＴ（配列番号１０）が含まれる。別の免疫刺激核酸モチーフには、ＴＣＡＡＣＧＴＴ（配列番号１１）が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる例には、ＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）Ｔ（配列番号１２）、ＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１３）、ＴＧＴＣＧ（Ｔ／Ｃ）Ｔ（配列番号１４）、ＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１５）、ＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１６）、およびＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号１７）が含まれる。
他の実施形態では、免疫抑制核酸モチーフを、代替抗体分子に組み込むことができる。このようなモチーフには、ＣｐＧジヌクレオチド、ＣＣＧトリヌクレオチド、ＣＧＧトリヌクレオチド、ＣＣＧＧテトラヌクレオチド、ＣＧＣＧテトラヌクレオチド、またはこれらのモチーフの任意の組み合わせの直接反復を含むＣｐＧモチーフが含まれる。Carpentier et al.(2003)Frontiers in Bioscience 8:115-127も参照のこと。
付加される正確な免疫調整ＣｐＧモチーフは、二機能性代替抗体の最終目的に依存する。例えば、二機能性代替抗体を感染の治療に使用する場合、細胞性免疫応答および／または特定のサイトカインプロフィールを優先的に誘導するモチーフを二機能性代替抗体に組み込む。ＣｐＧ配列の免疫刺激効果のアッセイ方法は公知である。例えば、特異的ＣｐＧモチーフの一定のインビトロ免疫刺激効果とインビボ効果との間に強い相関関係が認められる。例えば、体液性応答の強度は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、およびＢ細胞増殖のインビトロ誘導と非常に強く相関する。細胞傷害性Ｔ細胞応答の強度は、ＩＦＮ−γのインビトロ誘導と十分に相関する。例えば、米国特許第6,339,068号、Krieg et al.(2002)Annu.Rev.Immunol 20:709-760、Krieg et al.(1995)Nature 374:546-549、Yi et al.(1996)J.Immunol 157:5394-5402、Stacey et al.(1996)J.Immunol 157:2116-2122、Cho et al.(2000)Nat.Biotechnol 18:509-514、Iho et al.(1999)J.Immunol.163:3642-3652（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
これらの種々のＣｐＧモチーフの活性変異型、フラグメント、およびアナログを、本発明で免疫調整薬として使用することもできる。ＣｐＧモチーフの活性変異型およびフラグメントは、免疫応答を調整する能力を保持する。上記で考察されるように、ＣｐＧ配列が所望の免疫調整活性を保持するかどうかを決定するための種々のアッセイが公知である。ＣｐＧ配列の活性変異型またはアナログは免疫調整活性を保持し、基準ＣｐＧ配列と同一である少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列を含む。ヌクレオチド配列の同一率の決定方法は、本明細書中で考察されている。
ｖ．リポ多糖およびその誘導体
ＬＰＳは、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αなど）の強力な免疫モジュレーター且つインデューサーである。ＬＰＳの活性誘導体が公知である。例えば、脂質Ａの免疫刺激活性を保持し、さらに毒性が減少した脂質Ａの誘導体が産生されている。このような活性誘導体には、体液性および細胞性免疫応答の両方を増大させることが示されているモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）が含まれる。例えば、Kiener et al.(1988)J.Immunol 141:870-4およびChilders et al.(2000)Infect.Immun.68:5509-16を参照のこと。
Ｆ．さらなる機能的部分
上記で考察するように、二機能性代替抗体（すなわち、特異性鎖および安定化鎖）の調製で使用される残基（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）は、天然に存在するか修飾され得る。このような修飾には、「機能的部分」が二機能性代替抗体と結合する特異性鎖または安定化鎖の成分の変化が含まれる。上記で考察されるように、結合は意図する適用の条件下で代替抗体と安定な相互作用を形成する任意の結び付き（共有結合、イオン結合、疎水性結合が含まれる）である。
本明細書中に記載の任意の種々の方法および組成物では、種々の機能的部分（１、２、３、４、５またはそれ以上）を１つまたは複数の鎖と関連させて鎖上の１つまたは複数の位置で二機能性抗体を形成することができる。機能的部分は、安定化鎖または特異性鎖のいずれかの末端のいずれかまたは両方に存在し得るか、いずれかの鎖のどこかの各残基に付加するか、残基（すなわち、ピリミジンまたはプリン）の全部または一部に結合するか、所与の残基型（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ／Ｕ）の全部または一部に結合するか、残基の任意の領域（すわなち、糖、リン酸、窒素含有塩基）に結合することができる。１つの実施形態では、機能的部分を、１つまたは複数の定常ドメインおよび／または安定化ドメインに結合する。他の実施形態では、機能的部分を、特異性ドメインに関連させる。当業者は、機能的部分の結合部位は所望の機能的部分に依存することを認識する。さらに、二機能性代替抗体構造に組み込むために選択された機能的部分を、二機能性代替抗体がそのリガンドまたは潜在的リガンドと接触する条件に依存して選択することができる。
二機能性代替抗体分子中のこれらの修飾の例には、アミン、ジオール、チオール、ホスホロチオエート、グリコール、フッ素、ヒドロキシル、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、アビジン、ビオチン、芳香族化合物、アルカン、およびハロゲンで修飾されたヌクレオチドが含まれる。このような修飾には、さらに、シトシン環外アミン、５−ブロモ−ウラシルの置換(Golden et al.(2000)J.of Biotechnology 81:167-178)、骨格修飾、メチル化、異常の塩基対合組み合わせなどでの修飾が含まれ得るが、これらに限定されない。概説として、Jayasena et al.(1999)Clinical Chemistry 45:1628-1650を参照のこと。
当業者は、エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対してより高い安定性を付与する、ヌクレオチドおよび隣接ヌクレオチド間のリン酸結合の修飾を多数認識している(Uhlmann et al.(1996)Chem Rev.90:543-98およびAgraul et al.(1996)Trends Biotechnology 14:147-9およびUsman et al.(2000)The Journal of Clinical Investigations 106:1997-1202)。このような機能的部分には、例えば、糖の２’位での修飾が含まれる(Hobbs et al.(1973)Biochemistry 12:5138-45およびPieken et al.(1991)Science 253:314-7)。例えば、修飾ヌクレオチドを、２’位でアミノおよびフルオロ官能基で置換することができる。さらに、目的のさらなる機能的部分には、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドおよびホスホロチオエート修飾ヌクレオチド(Green et al.(1995)Chem.Biol.2:683-695;Vester et al.(2002)J.Am.Chem.Soc.124:13682-13683;Rhodes et al.(2000)J.Biol.Chem.37:28555-28561;およびSeyler et al.(1996)Biol.Chem.377:67-70)が含まれる。したがって、別の実施形態では、二機能性代替抗体分子は、血清ヌクレアーゼの存在下で分子を安定化させる修飾ヌクレオチドを含む機能的部分を含む。
目的の他の機能的部分には、修飾ヌクレオチドが特異性ドメインに疎水性結合能力を導入する、特異性鎖の特異性ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する化学修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、この化学修飾は、ヌクレオチドの糖またはリン酸分子の２’位で起こる。このような修飾は当分野で公知であり、例えば、６−メチルプリンおよび２，４−ジフルオロトルエンなどの非極性の非水素結合形状の模倣物が含まれる（Schweizer et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.117:1863-72およびGuckian et al.(1998)Nat.Struct.Biol.5:950-9（その両方が本明細書中で参考として組み込まれる））。さらなる修飾には、イミダゾール、フェニル、プロリン、およびイソロイシルが含まれる。
他の実施形態では、二機能性代替抗体分子の特異性鎖が優先的に増幅されることが望ましい。「優先的に増幅される」は、二機能性代替抗体分子の特異性鎖が、対応する安定化鎖の増幅レベルと比較して高い頻度で増幅工程中に増幅されることを意図する。したがって、目的のさらなる機能的部分は、二機能性代替抗体分子の特異性鎖を優先的に増幅する修飾を含む。二機能性代替抗体の増幅方法は、本明細書中でさらに詳細に考察するが、この増幅型を可能にする修飾型は当分野で公知であり、例えば、ＰＣＲ反応においてポリメラーゼ活性耐性を増大させる安定化鎖に対する少なくとも１つのヌクレオチドの修飾が含まれる。このような修飾には、例えば、ビオチンを含む増幅を妨害する任意の機能的部分が含まれる。
目的のさらなる機能的部分には、例えば、レポーター分子が含まれる。本明細書中で使用される、「レポーター分子」は、結合した二機能性代替抗体を検出する分子をいう。したがって、別の実施形態では、機能的部分としての「レポーター」分子の組み込みまたは結合により、代替抗体および複合体形成された標的リガンドが検出される。このようなレポーター分子には、例えば、ポリペプチド；ラジオヌクレオチド（例えば、32Ｐ）；蛍光分子(Jhaveri et al.(2000)J.Am.Soc.122:2469-2473)、発光分子、発色団（ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ＴＲＩＴＣ、メチルウンベリフェロン、ルミノール、ルシフェリン、およびTexas Redなど(Sumedha et al.(1999)Clinical Chemistry 45:1628-1649,Wilson et al.(1998)Clin.Chemistry 44:86-91、および(2000)Nature Biotechnology 18:345-349)）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼなど）、ランタニド系列（例えば、ユーロピウム、テルビウム、イットリウム）、およびミクロスフェア（例えば、サブミクロンポリスチレン（染色または非染色））が含まれる。このようなレポーター分子は、直接的な定性または定量検出またはエネルギー転移反応が可能である。
さらに他の実施形態では、遺伝コードを拡大するために機能的部分を特異性鎖に組み込む。このような部分には、例えば、ＩｓｏＧ／ＩｓｏＣ対および２，６−ジアミノピリミド／キサンチン塩基対(Piccirilli et al.(1990)Nature 343:537-9およびTor et al.(1993)J.Am.Chem.Soc.115:4461-7)；methylisoCおよび（６−アミノヘキシル）イソＧ塩基対(Latham et al.(1994)Nucleic Acid Research 22:2817-22)、ベンジル基(Dewey et al.(1995)J.Am.Chem.Soc.117:8474-5およびEaton et al.(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1:10-6)、およびアミノ酸側鎖が含まれる。
目的の他の機能的部分には、架橋分子（すなわち、光架橋または化学的架橋のいずれかのためのヨウ素または臭素；化学的架橋のための−ＳＨ）；治療薬（すなわち、癌、関節炎、敗血症、心筋の不整脈および梗塞、ウイルスおよび細菌感染、自己免疫疾患、およびプリオン疾患の治療で使用される化合物）；生体分布、薬物動態学、および組織浸透、またはその任意の組み合わせを変化させる化学修飾物が含まれる。このような修飾は、ピリミジン残基のＣ−５位に存在し得る。
二機能性代替抗体に組み込まれた機能的部分（安定化鎖もしくは特異性鎖またはその両方のいずれか）は、多機能であり得る（すなわち、この部分により標識および親和性送達、ヌクレアーゼ安定化が可能であり、そして／または所望の複数の治療効果もしくは毒性が得られる）。これらの種々の「機能的部分」修飾は、例えば、蛍光標示式細胞分取(Charlton et al.(1997)Biochemistry 36:3018-3026およびDavis et al.(1996)Nucleic Acid Research 24:702-703)、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(Drolet et al.(1996)Nat.Biotech 14:1021-1025)などに適用するための検出の補助で適用される。さらに、テクネチウム−９９ｍキレート化ケージ(chelatin cage)との抱合によりインビボで画像化することができる。例えば、Hnatowich et al.(1998)Nucl.Med.39:56-64を参照のこと。
目的のさらなる機能的部分には、インビボで血漿クリアランスを減少させるためのポリエチレングリセロールの添加(Tucker et al.(1999)J.Chromatography 732:203-212)またはジアシルグリセロール脂質基の添加(Willis et al.(1998)Bioconjugate Chem.9:573-582)が含まれる。さらに、抗菌活性（すなわち、抗細菌、抗ウイルス、または抗真菌）特性を有する機能的部分を、天然または改変された病原性生物およびウイルスを抑制するための抗バイオテロ薬として代替抗体と共に使用することができる。
１つの実施形態では、機能的部分はジゴキシゲニンである。いくつかの異なる蛍光色素または酵素に直接結合した抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションまたは直接免疫蛍光によってこの機能的部分を検出する。Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.およびCeleda et al.(1992)Biotechniques 12:98-102（両方が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。レポーターとして作用することができるさらなる分子には、ビオチンおよびポリＡテールが含まれる。
別の実施形態では、機能的部分は、固体支持体または溶液中の他の分子に二機能性代替抗体を結合させるために使用することができる親和性タグである。したがって、リガンド結合二機能性代替抗体複合体の単離を、代替抗体に結合した親和性タグの使用によって容易にすることができる。本明細書中で使用される、「親和性タグ」は、代替抗体分子に結合することができ、且つ化合物を分離するために使用することができ、そして／または代替抗体に化合物を結合させるために使用することができる任意の化合物である。好ましくは、親和性タグは、結合分子または抗体などの別の化合物と結合するか相互作用する化合物である。親和性タグと捕捉成分とのこのような相互作用は特異的相互作用であることも好ましい。例えば、代替抗体分子がカラム、マイクロタイターウェル、または固定化ストレプトアビジンを含むチューブに結合した場合、ビオチン化プライマーを使用して調製した代替抗体分子により固相に結合したストレプトアビジンに結合する。この様式で使用される他の親和性タグには、ポリＡ配列、プロテインＡ、受容体、抗体分子、キレート剤、アンチセンス配列によって認識されるヌクレオチド配列、シクロデキストリン、およびレシチンが含まれ得る。核酸プローブの文脈で記載されているさらなる親和性タグは、Syvanen et al.(1986)Nucleic Acids Res.14:5037に記載されている。好ましい親和性タグには、核酸配列に組み込むことができ(Langer et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6633)、且つストレプトアビジンまたはビオチン特異的抗体を使用して捕捉することができるビオチンが含まれる。親和性タグ用の好ましいハプテンは、ジゴキシゲニンである(Kerkhof(1992)Anal.Biochem.205:359-364)。特異性抗体が公知であるか特異性抗体を作製することができる多数の化合物を、親和性タグとして使用することができる。親和性タグとして有用な抗体は市販されているか、十分に確立された方法を使用して産生することができる。例えば、Johnston et al.(1987)Immunochemistry In Practice(Blackwell Scientific Publications,Oxford,England)30-85を参照のこと。
他の親和性タグは、抗抗体抗体である。このような抗抗体抗体およびその使用は周知である。例えば、一般に、一定のクラスまたはイソ型もしくはサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）または一定の種の抗体（例えば、抗ウサギ抗体）に特異的な抗抗体抗体を使用して、他の抗体群を検出または結合させる。したがって、これらは、親和性タグに対する抗体を有することができ、この抗体：親和性タグ：代替抗体複合体を複合体の抗体部分への抗体の結合によって精製することができる。
別の親和性タグは、他の最適な分子と選択的に切断可能な共有結合を形成することができるものである。例えば、この型の親和性タグは、硫黄原子を含むものである。この親和性タグと結合する核酸分子を、チオプロピルセファロースカラムへの保持によって精製することができる。カラムの強力な洗浄により望ましくない分子を除去し、例えば、β−メルカプトエタノールでの還元により、精製後に比較的穏やかな条件下で所望の分子を回収可能である。
さらに、例えば、セルロース(Yang et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.95:5462-5467)またはSephadex(Srisawat et al.(2001)Nucleic Acid Research 29)に結合することが公知のアプタマーが同定されている。これらのアプタマーを、代替抗体に結合し、代替抗体分子の単離または検出手段として使用することができる。
代替抗体構造への機能的部分の種々の結合方法は、当分野で公知である。例えば、代替抗体にポリペプチドまたは目的の種々の他の化合物が抱合される生体抱合反応を、例えば、Aslam et al.(1999)Protein Coupling Techniques for Biomed Sciences,Macmillan Press and Solulink Bioconjugation system(www.solulink.com);Sebestyen et al.(1998)Nature Biotechnology 16:80-85;Soukchareum et al.(1995)Bioconjugate chem.6:43-54;Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-52、およびWong et al.(2000)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）で見出すことができる。
さらなる機能的部分には、標的リガンドの位置に指示されることが望まれる種々の薬剤が含まれる。送達用薬剤は、任意の目的の分子（治療薬または薬物送達媒介物が含まれる）であり得る。このような薬剤およびその送達方法は、本明細書中に開示されている。
ＩＩ．薬学的組成物
本発明の代替抗体分子は、無機もしくは有機で固体もしくは液体の薬学的に許容可能なキャリアをさらに含み得る。キャリアはまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、安定化剤、緩衝液、溶媒、および塩を含み得る。組成物を滅菌し、固体、粒子、粉末、溶液、懸濁液、または乳濁液として存在することができる。
薬学的に許容可能なキャリア媒介物との混合などによって薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従って二機能性代替抗体を処方することができる。適切な媒介物およびその処方は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol,A.(ed.),Mack,EastonPA(1980))に記載されている。有効な投与に適切な薬学的に許容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、単独で、または適切な量のキャリア媒介物と共に有効量の二機能性代替抗体分子を含む。
薬学的に許容可能なキャリアは、投与方法および意図する使用方法に依存して変化する。使用される薬学的キャリアは、例えば、固体、液体、または徐放物であり得る。代表的な固体キャリアは、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶性セルロース、およびポリマーヒドロゲルなどである。典型的な液体キャリアには、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、シクロデキストリン、および乳濁液などが含まれる。当業者は、それぞれの一般的に使用される投与方法に適切なキャリアを周知である。さらに、二機能性代替抗体の総投与量は投与される薬学的組成物（すなわち、使用されるキャリア）、投与様式、結合活性、および所望の効果（すなわち、免疫応答の調整）に依存すると認識する。二機能性代替抗体の投与量は、免疫応答の所望の調整に十分である。
一旦薬学的組成物が処方されると、これを溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保存することができる。このような処方物を、すぐに使用できる形態または投与直前に再構成が必要な形態で保存することができる。
二機能性代替抗体を、カテーテルまたはシリンジの使用によって適切な細胞、組織、または器官系に局所的に送達させることもできる。このような二機能性代替抗体の細胞への他の局所的送達手段には、移植片周辺領域への治療用二機能性代替抗体の徐放に影響を与え得る輸液ポンプ（例えば、Alza Corporation,Palo Alto,CA）の使用または高分子移植片への代替抗体の組み込み（例えば、Johnson eds.(1987)Drug Delivery Systems(Chichester,England:Ellis Horwood Ltd.)を参照のこと）が含まれる。
種々の方法が、被験体（すなわち、被験体）、組織、器官、または細胞）への代替抗体の送達に利用可能である。全身送達のための二機能性代替抗体の投与様式は、皮下、筋肉内、静脈内、ＩＤ、または鼻腔内であり得る。さらに、吸入ミスト、経口活性処方物、経皮イオン導入、または坐剤も想定される。１つのキャリアは生理学的食塩水であるが、他の薬学的に許容可能なキャリアも使用することができることが意図される。１つの実施形態では、キャリアおよび代替抗体分子は生理学的に適合可能な徐放処方物を構成することが想定される。このようなキャリア中の主な溶媒は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。さらに、キャリアは、処方物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌、安定性、溶解速度、または臭気の修正または維持のための他の薬理学的に許容可能な賦形剤を含み得る。同様に、キャリアは、代替抗体の安定性、溶解速度、放出、または吸収の修正または維持のためのさらに他の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位用量または複数回用量形態のいずれかでの非経口投与のための投薬量を処方するために通常および習慣的に使用される物質である。
例えば、一般に、開示の二機能性代替抗体を、微粒子またはリポソーム内またはその表面上に組み込むことができる。開示の代替抗体を含む微粒子またはリポソームを、例えば、開示の二機能性代替抗体の目的のリガンドへの送達に有効な量の静脈内または腹腔内投与によって全身に投与することができる。適切な微粒子と組み合わせて使用した場合、他の可能な経路には、経皮または経口投与が含まれる。一般に、個体に投与されるリポソーム結合代替抗体の総量は、同一の望ましいか意図する効果のために投与されなければならない非結合代替抗体の量未満である。
したがって、本発明はまた、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアおよび任意選択的に任意の他の治療成分と共に二機能性代替抗体を含む脊椎動物およびヒトの医療用の薬学的処方物または組成物を提供する。キャリアは、処方物の他の成分と適合することができるがそのレシピエントに過度の悪影響を与えないという意味で薬学的に許容可能でなければならない。
組成物には、経口、直腸、局所、鼻腔内、眼内、または非経口（腹腔内、静脈内、皮下、または筋肉内注射が含まれる）投与に適切なものが含まれる。組成物は、単位投与形態で都合よく存在することができ、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。全ての方法は、有効成分を１つまたは複数の副成分を構成するキャリアと組み合わせるステップを含む。一般に、有効成分を液体キャリア、微粉化固体キャリア、またはその両方と均一且つ十分に組み合わせ、その後必要に応じて生成物を所望の処方物に成形することによって組成物を調製する。
経口投与に適切な本発明の組成物は、カプセル、カシェ、錠剤、およびロゼンジなどの個別の単位として存在することができ、それぞれ粉末もしくは顆粒、シロップ、エリキシル、乳濁液、および吸気などの水性または非水性の液体中の懸濁液として所定量の有効成分を含む。
任意の副成分も添加することができる糖（例えば、スクロース）の濃縮水溶液への活性化合物の添加によってシロップを作製することができる。このような副成分には、香料、適切な防腐剤、糖の結晶化を遅延させる薬剤、多価アルコール（例えば、グリセロールまたはソルビトール）などの任意の他の成分の可溶性を増大させる薬剤が含まれ得る。
非経口投与に適切な処方物は、レシピエントの血液と等張であり得る活性化合物の滅菌水性調製物を都合よく含む。
鼻腔スプレー処方物は、防腐剤および等張化剤と共に有効成分の精製水溶液を含む。このような処方物を、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調節することが好ましい。
直腸投与用の処方物は、ココアバター、硬化脂肪、または硬化脂肪カルボン酸などの適切なキャリアを含む坐剤として存在することができる。
ｐＨおよび等張因子を好ましくは眼のそれに適合するように調整すること以外は鼻腔内スプレーに類似の方法によって眼内処方物を調製する。
局所処方物は、鉱物油、石油、多価アルコール、または局所処方物に使用される他の基剤などの１つまたは複数の媒体中に溶解または懸濁された活性化合物を含む。上記の他の副成分の添加が望ましい。
さらに、本発明は、代替抗体のリポソーム処方物を提供する。リポソーム懸濁液の形成テクノロジーは当分野で周知である。二機能性代替抗体が水溶性塩である場合、従来のリポソームテクノロジーを使用して、これを脂質小胞に組み込むことができる。このような例では、化合物の水溶性のために、化合物を実質的に親水性中心またはリポソームのコアに混入させる。使用した脂質層は、任意の従来の組成物に由来し、コレステロールを含み得るか、無コレステロールであり得る。目的の化合物または塩が水に不溶性である場合、従来のリポソーム形成テクノロジーを使用して、塩を親水性脂質二重層内に実質的に混入してリポソーム構造を形成することができる。いずれかの例では、標準的な音波処理および均一化技術を使用して生成されたリポソームのサイズを減少させることができる。プロゲステロン代謝産物またはその塩を含むリポソーム処方物を凍結乾燥させて、水などの薬学的に許容可能なキャリアで再構成させてリポソーム懸濁液を再度作製することができる凍結乾燥物を生成することができる。
エアゾールとして吸入投与に適切な薬学的処方物も提供する。これらの処方物は、所望の代替抗体の溶液もしくは懸濁液または化合物もしくは塩の複数の固体粒子を含む。所望の処方物を小チャンバーに入れて噴霧することができる。化合物または塩を含む複数の液滴または固体粒子を形成する圧縮空気または超音波エネルギーによって噴霧することができる。
上記の成分に加えて、本発明の組成物は、希釈剤、緩衝液、香料、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、および防腐剤（抗酸化剤が含まれる）などからなる群から選択される１つまたは複数の副成分をさらに含み得る。
ＩＩＩ．キット
開示の本発明の二機能性代替抗体分子を、キット中の試薬として使用することもできる。キットは、免疫応答を調整することができる薬剤に結合した二機能性代替抗体集団および適切な緩衝液またはキャリアを含む。１つの例では、二機能性代替抗体および緩衝液は、溶液、懸濁液、または固体（粉末または凍結乾燥物など）の形態で存在し得る。試薬は、共に存在するか、互いに分離されている。開示のキットを、治療薬として使用することもできる。
［方法］
本発明は、所望の目的のリガンドと相互作用し、且つ免疫応答を調整することができる免疫調整薬をさらに含む二機能性代替抗体分子を提供する。この様式では、二機能性代替抗体分子の標的との相互作用により、リガンド／代替抗体の相互作用部位で免疫応答がターゲティングされる。
免疫調整薬の目的のリガンドへの送達方法を提供する。この方法は、リガンドを二機能性代替抗体に接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子であって、前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含む単離二機能性代替抗体分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む。単離二機能性抗体は、さらに免疫調整薬と結合し、二機能性代替抗体分子は目的のリガンドと相互作用することができる。他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は異なる分子を含む。
二機能性代替抗体の目的のリガンドとの相互作用のアッセイ方法は公知である。例えば、種々の濾過方法およびリガンド／代替抗体相互作用をモニターするために使用することができる結合を測定するための他の日常的技術が公知である。さらに、インビボ相互作用を決定する種々の技術が公知である。例えば、二機能性代替抗体のテクネチウム−９９ｍキレート化ケージ(chelatin cage)との抱合により、インビボで画像化することができる。例えば、Hnatowich et al.(1998)Nucl.Med.39:56-64を参照のこと。さらに、レポーター分子を含む任意の機能的部分（すなわち、放射性標識または蛍光分子）を使用して、相互作用をモニターすることができる。
本発明は、さらに、被験体におけるリガンドに対する免疫応答の調整方法を提供する。この方法は、特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子であって、前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含む単離二機能性代替抗体分子を被験体に投与するステップを含む。二機能性代替抗体は、免疫調整薬とさらに結合しており、二機能性代替抗体分子は目的のリガンドと相互作用することができる。したがって、二機能性代替抗体は、種々の疾患、障害、および病原体に対するワクチンとして適用される。
免疫応答のこのような調整を、インビボ攻撃誘発アッセイ、インビボ免疫原性アッセイ、インビトロ細胞受容体結合アッセイ、およびインビトロ抗原競合アッセイを含む標準的なバイオアッセイを使用して測定することができる。当業者は、意図する適用に適切なアッセイを認識する。例えば、補体応答調整のための代表的アッセイには、二機能性代替抗体のＣ１ｑへの結合アッセイまたは二機能性代替抗体が補体媒介細胞溶解を付与する能力を有するかどうかを決定するアッセイが含まれる。例えば、Duncan(1988)Nature 332:738-40；米国特許第5,648,260号；同第5,624,821号；Tao et al.(1993)J.Exp.Med.178:661-667;Brekke et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:2542-47;Xu et al.(1993)J.Immunol.150:152A；およびWO94/29351（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
免疫応答の調整を測定するためのさらなるアッセイには、ワクチン誘導細胞性免疫応答を測定するElispotアッセイが含まれる。このアッセイは、特異的抗原によって活性化されたＴ細胞数を測定する。簡単に述べれば、被験体を目的のリガンドで攻撃誘発し、その後二機能性代替抗体を投与する。分泌（細胞外）サイトカインについての染色によって応答細胞を検出する。他のアッセイには、細胞内サイトカインアッセイ（ＩＣＣ）が含まれる。このアッセイは、特定の抗原に応答するサイトカインの産生を測定する。この場合、蛍光標識サイトカイン結合抗体を使用して、サイトカインを細胞の内側で検出する。次いで、蛍光発光細胞を、フローサイトメトリーを使用して計数する。
さらなるアッセイには、ＦｃγＲをモニターするためのアッセイが含まれる。Bredius et al.(1994)Immunology 83:624-630;Tax et al.(1984)J.Immunol.133(3):1185-1189;Nagarajan et al.(1995)J.Biol.Chem.270(43):25762-25770;およびWarmerdam et al.(1991)J.Immunol.147(4)1338-1343（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。
二機能性代替抗体の半減期またはクリアランス比をモニターするためのアッセイには、ＦｃＲｎとの直接的相互作用のアッセイまたは血清半減期の増減、循環中の平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加、および／または免疫調整薬を欠く代替抗体の血清クリアランス速度の減少のモニタリングが含まれる。例えば、米国特許第6,468,532号（本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。Gazzano-Santoro et al.(1997)J.Immunol.Methods 202:163に記載のように、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のアッセイを準備することができる。米国特許第6,194,551号も参照のこと。これらの両引例は、本明細書中で参考として組み込まれる。
種々の障害の治療方法または予防方法をさらに提供する。この方法は、治療有効量の単離二機能性代替抗体分子を含む組成物を必要とする被験体に投与するステップを含む。単離二機能性代替抗体は、特異性鎖および安定化鎖を含み、前記特異性鎖は第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖は前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含む。二機能性代替抗体は、免疫調整薬とさらに結合しており、二機能性代替抗体分子は目的のリガンドと相互作用することができる。
「有効量」は、免疫応答の調整（すなわち、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および半減期／クリアランス比の増減）の誘発に十分な二機能性代替抗体の濃度を意味する。したがって、二機能性抗体の有効量は、治療または予防される疾患、障害、または病態の臨床系の軽減または減少に十分である。
本発明の方法を単独で使用して、例えば、腫瘍から防御または治療するか、手術、放射線治療、および化学療法などの従来の治療による腫瘍の減量後のアジュバント療法として使用することができる。
他の実施形態では、二機能性代替抗体を被験体の粘膜表面に送達させる。この方法では、二機能性代替抗体は輸送薬に結合している。
さらに他の実施形態では、本発明は、体内への侵入前に感染を阻害または予防する方法を提供する。この方法により、被験体への特定の病原体の侵入前の最初の防御ラインが得られる。１つの実施形態では、結合した輸送薬を有する二機能性代替抗体を使用して、受動的効果機構（例えば、宿主細胞のウイルス受容体の遮断または細菌の移動の阻害）を得ることができる。
他の実施形態では、二機能性代替抗体を輸送薬ならびに少なくとも１つの免疫調整薬および／または抗菌薬および／または他の治療薬に結合する。したがって、粘膜表面での免疫応答を増強し、それにより感染因子の体内への侵入を防止することができる。このような方法は、ヒトならびに家畜および非家畜動物における性感染疾患、出生時の疾患の母体感染、尿生殖管、口腔鼻腔経路(mouth nasal passage)、肺、眼などの粘膜表面を介して進入する他の感染の防止で適用される。
本発明の投与単位中の代替抗体の濃度は、所望の効果を得るのに有効である。有効量は、多数の要因（例えば、使用した特定の二機能性代替抗体、所望の効果、被験体の反応性、被験体の体重、他の被験体内の変動性、投与方法、使用した処方物）に依存する。有効性、投薬量、Ｋａ、および投与経路を決定する方法は、当業者に公知である。
本発明の実施形態は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ，４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇの用量の二機能性代替抗体の投与を提供する。あるいは、代替抗体を、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．２ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
本発明の別の実施形態では、治療有効用量の二機能性代替抗体を含む薬学的組成物を断続的に投与する。「断続的投与」は、治療有効用量の二機能性代替抗体を投与し、その後一定期間中断し、その後治療有効量をさらに投与することなどを意図する。例えば、治療有効用量を、徐放性処方物を使用して連続的様式で投与することができるか、所望の毎日の投薬計画（例えば、１日に１回、２回、３回、またはそれ以上の投与回数）に従って投与することができる。「中断期間」は、調節薬の連続的な徐放または毎日の投与の中断を意図する。中断期間は、連続的な徐放期間または毎日の投与期間よりも長くても短くてもよい。中断中、関連する組織中の二機能性代替抗体レベルは、治療中に得られる最大レベルよりも実質的に低い。好ましい中断期間は、使用した二機能性代替抗体の有効用量または形態の濃度に依存する。中断期間は、少なくとも２日間、少なくとも４日間、少なくとも１週間、またはそれ以上であり得る。徐放性処方物を使用する場合、損傷部位での調節薬をより長期間留まらせるために中断期間を延長しなければならない。あるいは、有効用量の徐放性処方物の投与頻度を増加させることができる。所望の治療効果が得られ、最終的に疾患または障害が治療されるまで二機能性代替抗体の断続的投与スケジュールを継続することができる。
さらに別の実施形態では、治療有効用量の調節薬の断続的投与は周期的である。「周期的」は、約１ヶ月から約２、３、４、５、または６ヶ月までの範囲の周期で投与時に中断を伴う断続的投与を意図する。例えば、投与スケジュールは、短期間の単回用量を１週間に１回を４週間、その後３ヶ月間の断続投与の中断、その後１週間に１回の短期間の単回用量の断続投与を４週間、その後３ヶ月間の断続的投与の中断による、有効用量の二機能性代替抗体の断続的投与であり得る。別の例では、短期単回用量を１週間に１回を２週間投与することができ、その後１ヶ月間断続投与を中断し、その後短期単回用量を１週間に１回を２週間投与し、その後１ヶ月間断続投与を中断することができる。所望の治療結果が得られ、最終的に障害または疾患が治療されるまで、調節薬の被験体への周期的断続投与スケジュールを継続することができる。
本発明は、さらに、目的のリガンドの活性を調整し、被験体中のリガンド部位での免疫応答を調整する方法を提供する。リガンドの調整は、二機能性代替抗体のエピトープ結合ドメインとの直接相互作用に起因し得る。あるいは、二機能性抗体を、標的リガンドまたは標的リガンド周辺の成分の活性を調整することができる機能的部分に結合することができる。
リガンド活性調整のアッセイ方法は、リガンドに依存して変化する。当業者は、アッセイによりリガンド活性を直接測定することができるか、あるいは細胞、組織、または器官の表現型を変化させることができるか、二機能性代替抗体を投与した被験体の臨床結果を改良することができることをさらに認識する。
リガンドの活性を調整することができる機能的薬剤は、種々の治療薬を含み得る。目的の治療薬には、例えば、癌、関節炎、敗血症、心筋の不整脈および梗塞、ウイルスおよび細菌感染、自己免疫疾患、およびプリオン疾患の治療のために開発された薬学的化合物が含まれる。この様式では、治療薬の送達および目的の領域に指向された (directed)免疫応答を調整するための手段として二機能性代替抗体を使用することができる。
目的のリガンドの活性を調整することができる治療薬が特定の障害を治療するために送達される場合、特定の障害のために治療薬を選択することができる。例えば、二機能性代替抗体を特定の腫瘍部位の腫瘍細胞表面上で見出される固有のリガンドにターゲティングする場合、その部位への特異的送達および正常な組織に対する付随的病態を最小にするか排除するために二機能性代替抗体を抗腫瘍薬に抱合することができる。
治療薬は、代替抗体に結合することができる事実上任意の型の抗腫瘍または抗脈管形成化合物（すなわち、腫瘍への血管の供給を破壊する薬剤）（例として、細胞毒素、インターロイキン、化学走性因子、放射性ヌクレオチド、メトトレキセート、シスプラチン、アナストロゾール／Arimidex(登録商標)、およびタモキシフェンなどの合成または天然の化合物が含まれ得る）であり得る。
さらなる目的の薬剤には、リシンもしくはジフテリア毒素、真菌由来のカリケアミシン、メイタンシノイド、モモルジン、アメリカヤマゴボウ(pokeweek)抗ウイルスタンパク質、StapoloccoccalエンテロトキシンＡ、シュードモナス外毒素、リボソーム相互作用タンパク質、および種々の細胞傷害薬（ネオカルチノスタイン、メトトレキセート、またはカリケアミシオン(callicheamicin)が含まれる）などの生物毒素が含まれる。例えば、Buschsbaum et al.(1999)Clin.Cancer Res 5:Grassband et al.(1992)Blood 79:576-83;Batra et al.(1991)Mol Cell Biol.11:2200-5;Penichet et al.(2001)J Immunol Meth 248:91-101;Hinman et al.(1993)Cancer Res 53:3336-3342;Tur et al.(2001)Intt J Mol Med 8:579-584;Tazzari et al.(2001)J Immunol 167:4222-4229;Panousis et al.(1999)Drugs Aging 15:1-13,Trail et al.(1993)Science 212-5;Yamaguchi et al.(1993)Jpn J Cancer Res 84:1190-4を参照のこと。
あるいは、治療薬はプロドラッグを含み得る。特異的標的へのその局在化後、薬物をプロドラッグにした非毒性分子を注射する。例えば、Senter et al.(1996)Advanced Drug Delivery 22:341-9を参照のこと。
１つの実施形態では、機能的部分は、抗菌活性を有する化合物である。「抗菌活性」は、任意の微生物の成長を阻害または減少させる能力および／または微生物集団中の微生物数を減少させる能力を意図する。「微生物」は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫を意図し、したがって、抗菌活性を有する機能的部分は、抗細菌活性、抗真菌活性、および／または抗ウイルス活性を有する。
「抗細菌活性」は、任意の細菌の成長を阻害または減少させる能力および／または細菌集団中の生存細菌細胞数を減少させる能力を意図する。薬剤は、グラム陽性抗細菌薬、グラム陰性抗細菌薬、または雄性特異的抗細菌薬であり得る。「抗ウイルス活性」は、任意のウイルスまたはウイルス感染細胞の成長を阻害または減少させる能力および／または集団中の生存ウイルス粒子またはウイルス感染細胞集団を減少させる能力を意図する。用語「抗真菌活性」は、真菌の成長を阻害または減少させる能力を意図する。抗菌薬は当分野で公知であり、種々のケモカイン、サイトカイン、抗菌ポリペプチド（すなわち、抗細菌、抗ウイルス、および抗真菌ポリペプチド）、抗生物質、ＬＰＳ、補体アクチベーター、ＣｐＧ配列、および抗菌活性を有する種々の他の薬剤が含まれる。抗菌薬の例を、以下でさらに詳細に考察する。
したがって、１つの実施形態では、本発明は、抗菌薬に共有結合した二機能性代替抗体を提供する。本明細書中に記載の種々の方法を使用して、特定の標的リガンド（すなわち、標的微生物のエピトープ）に結合するように二機能性代替抗体をデザインすることができる。次いで、二機能性代替抗体／抗菌複合体を、抗菌薬を微生物に送達するための手段として使用する一方で、ターゲティングした免疫応答に免疫調整薬を提供することができる。したがって、組成物は、必要な被験体に投与した場合に被験体中に含まれる微生物の成長を阻害または減少させ、そして／または被験体中の微生物集団を減少させる治療薬として適用される。
抗菌薬ならびにその活性変異型および誘導体の例は当分野で公知であり、同時出願され、本明細書中で参考として組み込まれる、「Surrogate Antibodies and Methods of Preparation and Uses Thereof」というタイトルの米国出願に開示されている。
別の実施形態では、二機能性代替抗体は、インビトロでの免疫応答を増強する。例えば、１つの実施形態では、免疫応答の調整により、サンプル中の微生物レベルが減少する。この実施形態では、代替抗体によって認識されるリガンドは微生物（または微生物の表面上の構成要素）である。代替抗体を、細胞集団に接触させ、二機能性代替抗体は標的微生物と相互作用する。適切な補体因子、好中球、および／またはリンパ球を、サンプルに添加する。適切な補体因子、好中球、またはリンパ球により、インビトロで免疫応答がターゲティングされ、代替抗体に結合した微生物が死滅する。微生物活性の減少のアッセイ方法は公知である。
［代替抗体の作製］
本発明の二機能性代替抗体を、免疫調整薬に結合されている。所望の特異性および親和性を有するリガンドと相互作用する二機能性代替抗体の産生方法を以下で考察する。免疫調整薬および／または輸送薬を以下で考察した任意の選択工程で代替抗体に結合することができると認識される。したがって、以下の方法は「代替抗体」について考察しているが、各代替抗体集団もまた（所望する場合）「二機能性代替抗体」であり、それにより免疫調整薬と結合することができると認識される。用語「（二機能性）代替抗体」を、いずれかの構造（代替抗体または二機能性代替抗体）を使用することができることを示すために下記の方法で使用する。
Ｉ．（二機能性）代替抗体ライブラリー
目的のリガンドに対する所望の結合親和性および特異性を有する（二機能性）代替抗体または（二機能性）代替抗体集団を同定するために代替抗体ライブラリーまたは二機能性代替抗体ライブラリーをスクリーニングすることができる。「集団」は、２つまたはそれ以上（すなわち、１０、１００、１，０００、１０，０００、１×１０6、１×１０7、１×１０8、またはそれ以上）の（二機能性）代替抗体を含む群または集団を意図する。（二機能性）代替抗体の種々の「集団」が存在し、例えば、以下に詳細に考察するように、無作為化された特異性領域を有する（二機能性）代替抗体集団を含む（二機能性）代替抗体のライブラリーが含まれる。（二機能性）代替抗体の種々の集団を、混合物または基質／アレイ中で見出すことができる。
（二機能性）代替抗体分子の結合多様性は、ゲノム内の遺伝子セグメントの多様性に制限されない。したがって、（二機能性）代替抗体分子のライブラリーは、種々の構造の分子を含み得る。例えば、集団中の特異性ドメインのサイズを変化させ、それにより認識することができる種々の規模のエピトープに拡大することができる。さらに、ライブラリーの多様性は、異なるヌクレオチド塩基および機能的部分（すなわち、ヌクレオチド修飾物）の数の関数として増大される。４０個の天然のヌクレオチドから構成される特異性領域を有するライブラリーは、潜在的に１．２×１０24種の特異性を有する。複数の特異性領域を有する（二機能性）代替抗体分子の産生により、この数が増大する。天然の塩基と組み合わせた修飾塩基の選択的使用により、再び抗体レパートリーの多様性が増大する。
（二機能性）代替抗体のライブラリーは、所望の（二機能性）代替抗体が同定／捕捉される選択技術のインビトロでの反復によって進行する。各選択ラウンドにより、ライブラリーと比較して所望のリガンドに対する結合親和性および／または特異性が増大した（二機能性）代替抗体分子集団が選択される。例えば、同時出願され、本明細書中で参考として組み込まれる、「Surrogate Antibodies and Methods of Preparation and Uses Thereof」というタイトルの米国出願を参照のこと。
（二機能性）代替抗体分子のライブラリーは、所望のリガンドに結合することができる（二機能性）代替抗体分子が捕捉される安定且つ予め形成された異なる配列の（二機能性）代替抗体分子の混合物である。本明細書中で使用される、「（二機能性）代替抗体分子のライブラリー」は、特異性鎖および安定化鎖を含む分子の集団を含む。特異性鎖は、第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、安定化鎖は、第一の定常領域に相互作用する第一の安定化ドメインおよび第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含む。さらに、集団中の特異性鎖の第一の定常領域はそれぞれ同一であり；集団中の特異性鎖の第二の定常領域はそれぞれ同一であり；集団中の特異性鎖の特異性領域はそれぞれ無作為化されており；集団中の安定化鎖はそれぞれ同一である。本明細書中に記載の任意の種々の構造を有する（二機能性）代替抗体分子のライブラリーを会合することができると認識される。
本明細書中で使用される、「ライブラリー」は、典型的には、約２および約１×１０14との間の（二機能性）代替抗体を有する集団が含まれる。あるいは、選択で使用される（二機能性）代替抗体ライブラリーには、各結合溝（すなわち、特異性ドメイン）中に少なくとも１０ヌクレオチド長の連続無作為化配列を有する約２と約１０18との間、約１０9と約１０14との間、約２と１０27との間、またはそれ以上の（二機能性）代替抗体の混合物が含まれ得る。さらに他の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも３、１０、１００、１０００、１００００、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０10、１×１０14、１×１０18、１×１０22、１×１０25、１×１０27、またはそれ以上の無作為化または半ランダム特異性ドメインを有する（二機能性）代替抗体分子を含む。ライブラリー中に含まれる分子を、混合物中またはアレイ中で見出すことができる。
本明細書中の用途についての一定の他の例では、用語「集団」を、１つまたは複数の選択された特徴を有する本発明のポリクローナルまたはモノクローナル代替抗体調製物を言うために使用することができる。
「ポリクローナル抗体集団」は、目的のリガンドへの結合が増大したポリクローナルライブラリーを産生するために会合した（二機能性）代替抗体の各クローン集団を含む。一旦（二機能性）代替抗体または複数の個別の（二機能性）代替抗体クローンが標的能力の基準を満たすことが見出されると、これらをポリクローナル試薬に会合して、標的リガンドの検出／相互作用において複数のエピトープ認識およびより高い感受性を得ることができる。ポリクローナル代替抗体集団は所望のリガンドに対する捕捉および増幅工程後に得られる分子のプールに相当し得ると認識される。あるいは、ポリクローナル代替抗体集団を、所望のリガンド結合特性を有する少なくとも２つの各モノクローナル（二機能性）代替抗体クローンの混合によって形成することができる。
Ａ．特異性領域の無作為化集団の形成
無作為化特異性ドメインを有する特異性鎖集団の産生または形成方法は、当分野で公知である。例えば、多数の方法（例えば、無作為化核酸配列の合成および無作為に切断された細胞核酸からの選択が含まれる）で特異性領域を調製することができる。あるいは、核酸（またはその一部）の直接化学合成または適切な酵素の使用によって核酸（またはその一部）を調製することができるテンプレートの合成によって完全または部分的な配列の無作為化を容易に行うことができる。例えば、Breaker et al.(1997)Science 261:1411-1418;Jaeger et al.(1997)Methods Enzy 183:281-306;Gold et al.(1995)Annu Rev Biochem 64:763-797;Perspetive Biosystems(1998)、およびBeaucage et al.(2000)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons,N.Y.3.3.1-3.20（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。あるいは、オリゴヌクレオチドを天然の供給源（ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ調製物）から切断し、定常領域の間にライゲーションすることができる。
「無作為化(randomized)」は、原則的に所与の長さを超える天然または修飾塩基を含む任意の可能なヌクレオチド配列を有する核酸のセグメントを説明するために使用される用語である。上で考察されるように、特異性領域は種々の長さであり得る。したがって、（二機能性）代替抗体ライブラリー中の無作為化配列はまた、約１０から約９０までまたはそれ以上のヌクレオチドの範囲の所望する種々の長さであり得る。ランダム配列セグメントが作製される化学反応または酵素反応では、存在し得る未知の偏りまたはヌクレオチドの優先度により、数学的にランダムな配列を得ることはできない。本明細書中で使用される、用語「無作為化」または「ランダム」は、非理想性からのこのような逸脱の可能性を反映する。現在公知の技術（例えば、連続的化学合成）では、大きな逸脱が起こることは知られていない。２０個またはそれ以下のヌクレオチドの短いセグメントについては、存在し得る任意の小さな偏りは、無視できる結果である。１回の合成手順が長いほど任意の偏りの影響が大きくなる。
配列変動性（すなわち、ライブラリーの多様性）を、巨大な天然核酸（ゲノムＤＮＡ調製物または細胞ＲＮＡ調製物など）の部分的に消化された（または切断された）調製物のサイズ選択フラグメントを使用して達成することができる。ライブラリーが全ての可能な変異型配列を含む必要はない。ライブラリーは、選択に実用的であるので、最大数の潜在的な結合配列を確実に同定するために非常に多数の可能な配列変異型として含み得る。例えば、特異性領域中の無作為化配列が３０個のヌクレオチドを含む場合、４つの天然に存在する塩基を使用して、約１０18（すなわち、４30）種の配列並べ替えを含む。
例えば、合成反応の前駆体ヌクレオシド（またはデオキシヌクレオシド）三リン酸のモル比の変化によって、無作為化配列に偏りを意図的に導入することができる。意図的な偏りは、例えば、所与の生物における各塩基の比率に近づけるか二次構造に影響を与えるのに望ましい。Hermes et al.(1998)Gene 84:143-151およびBartel et al.(1991)Cell 67:529-536（両方が本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。規定のステムループ構造を含む偏りを有する無作為化集団を作製したDavis et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99:11616-11621も参照のこと。したがって、本明細書中で使用されるように、ドメインの一次配列および／または二次構造中に所望の偏りが含まれるように特異性ドメインの無作為化集団を作製することができる。
他の実施形態では、ライブラリー中の各メンバーの特異性領域の長さは、実質的に同一であっても異なっていてもよい。特異性ドメインのサイズが各ライブラリーで変化するかループサイズが混合したライブラリーを形成するために組み合わせる場合、特定の標的リガンドについての至適ループサイズを同定する目的のために、反復ライブラリーを使用することができる。
上記で考察されるように、特異性鎖は、種々の機能的部分を含み得る。特異性鎖の無作為化集団の形成方法は、鎖に含まれる機能的部分に依存して変化する。例えば、１つの実施形態では、機能的部分は、修飾アデノシン残基を含む。これに関して、特異性ドメイン中のみにアデノシン残基を含むように特異性鎖をデザインすることができる。増幅時に使用したヌクレオチド混合物は、所望の機能的部分（すなわち、疎水性結合特性を増大させる部分）を有するアデノシンを含む。他の例では、合成反応後に機能的部分を代替抗体に結合することができる。
免疫応答を調整することができる薬剤を、選択プロセス中のいつでも抗体に結合することができるか、薬剤を、所望のリガンド結合特性を有する代替抗体の同定後に結合することができる。
Ｂ．（二機能性）代替抗体ライブラリーの作製
一旦無作為化した特異性領域を有する特異性鎖集団が形成されると、（本明細書中で考察されるように）所望の条件下での特異性鎖の適切な安定化鎖との接触によって（二機能性）代替抗体が形成される。
（二機能性）代替抗体分子のライブラリーの作製方法は、ａ）特異性鎖集団を得るステップであって、ｉ）特異性鎖集団が核酸分子集団として特徴付けられ、ｉｉ）前記集団中の各特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接した特異性領域を有する核酸配列を含み、ｉｉｉ）前記集団中の特異性鎖の各第一の定常領域が同一であり、ｉｖ）前記集団中の特異性鎖の各第二の定常領域が同一であり、ｖ）前記集団中の特異性鎖の各特異性領域が無作為化されているステップを含む。特異性鎖集団を安定化鎖に接触し、安定化鎖は前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含み、第一の安定化ドメインが第一の定常領域と相互作用し、且つ第二の安定化ドメインが第二の定常領域と相互作用する条件下で接触させる。他の実施形態では、ライブラリーを構成する代替抗体は、異なる鎖上に含まれる特異性鎖および安定化鎖を有する。
上記で考察されるように、長さの異なる無作為化特異性ドメインを有する（二機能性）代替抗体集団を産生することが有利であり得る。この様式では、ラブラリーを、任意の所与のリガンドに使用するための至適代替抗体の溝サイズを決定する（二機能性）代替抗体開発の「多適合」プロセスで使用することができる。このプロセスにより、パラトープ（結合部位）がサイズに無関係に全てのリガンドに有限な天然の抗体分子の結合特異性について代替抗体結合を改良することが可能である。「多適合」プロセスは、代替抗体−リガンド複合体の適合、特異性、および親和性を増大させる空間的特徴を有する溝サイズを同定する。「多適合」プロセスは、理想的な結合ループ／溝（進化および遺伝学の教えによってサイズまたは次元が制限されないもの）として同定することができる。したがって、代替抗体分子は、天然の抗体分子の性質について科学および研究に依存して形成されたエピトープまたは決定基のサイズに関する従来のパラダイムに挑む。種々のサイズおよび高次構造の特定ドメインを含む異種代替抗体集団を使用して、予備的「多適合」リガンド捕捉ラウンドを実施する。代替ライブラリー調製物についての至適溝サイズを、制限された数の捕捉および増幅サイクル後に最も高いリガンド結合度を示す溝サイズを有する下位集団によって示す。
Ｃ．（二機能性）代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法
所望のリガンド結合特性を有する（二機能性）代替抗体または（二機能性）代替抗体集団を同定または「捕捉する」ために、（二機能性）代替抗体ライブラリーまたは（二機能性）代替抗体の選択された集団をスクリーニングすることができる。この様式では、その後のクローニングのために、ランダム特異性領域および溶液中の分子の構造を安定化する安定化領域を含む予め合成した複数鎖の分子のライブラリーから（二機能性）代替抗体分子を選択する。
一般に、特定のリガンドに結合する（二機能性）代替抗体を、１つまたは複数のリガンドのライブラリーへの接触、リガンドへの１つまたは複数の（二機能性）代替抗体の結合、非結合（二機能性）代替抗体からの（二機能性）代替抗体結合リガンドの分離、および結合リガンドおよび／または結合（二機能性）代替抗体の同定によって出発代替抗体ライブラリーから捕捉する。
例えば、（二機能性）代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法は、
ａ）少なくとも１つの目的のリガンドを（二機能性）代替抗体分子のライブラリーに接触させるステップであって、前記ライブラリーが特異性鎖および安定化鎖を含む（二機能性）代替抗体分子集団を含み、
ｉ）前記特異性鎖が、第一の定常領域および第二の定常領域に近接した特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含み、
ｉｉ）前記集団中の特異性鎖の各第一の定常領域が同一であり、集団中の特異性鎖の各第二の定常領域が同一であり、前記集団中の特異性鎖の各特異性ドメインが無作為化されており、前記集団中の各安定化鎖が同一であるステップと、
ｂ）リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団から標的リガンドおよび（二機能性）代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップとを含む。
さらに他の実施形態では、（二機能性）代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法は、前記第一の安定化ドメインが前記第一の定常領域と相互作用し、且つ前記第二の安定化ドメインが前記第二の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。
他の実施形態では、（二機能性）代替抗体分子の安定化鎖および特異性鎖は異なる。
前に考察するように、この方法により、目的の所望のリガンドと相互作用する（二機能性）代替抗体分子が選択または捕捉される。それにより、この方法は、（二機能性）代替抗体分子のライブラリーからの選択およびその後の選択および増幅の段階的反復を用い、目的のリガンドについての所望の結合親和性および／または選択性を有する（二機能性）代替抗体分子を同定する。本明細書中で使用される、「（二機能性）代替抗体分子の選択された集団」は、少なくとも１ラウンドのリガンド結合を受けた分子集団を意図する。
したがって、別の実施形態では、（二機能性）代替抗体の捕捉方法は、（二機能性）代替抗体の選択された集団を目的のリガンドに接触させるステップを含む。この実施形態では、無作為化特異性ドメインを含む分子のライブラリーを使用する必要はないが、むしろ例えば、第２、第３、第４、第５、第６、第７、またはそれ以上のラウンドの選択／増幅後に作製された（二機能性）代替抗体分子の選択された集団を、所望のリガンドに接触させることができる。この実施形態では、（二機能性）代替抗体の捕捉方法は、
ａ）リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団を形成する条件下でリガンドを（二機能性）代替抗体分子集団に接触させるステップであって、前記（二機能性）代替抗体集団の（二機能性）代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含むステップと、
ｂ）前記リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記（二機能性）代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップとを含む。
他の実施形態では、代替抗体分子の捕捉方法は、前記第一の安定化ドメインが前記第一の定常領域と相互作用し、且つ前記第二の安定化ドメインが前記第二の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。さらに他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖が異なる。
上記の種々の方法では、１つを超える標的リガンドを使用して、複数の（二機能性）代替抗体を出発ライブラリーまたは集団から同時に捕捉するか、抗体集団の結合特異性を増大させることができると認識される。
ｉ．接触方法
「接触」は、目的の所望のリガンドを（二機能性）代替抗体分子またはその集団と相互作用させる任意の方法を意図する。当業者は、種々の条件をこの相互作用に使用することができることを認識する。例えば、種々の標的リガンドに結合する（二機能性）代替抗体を選択するために使用した実験条件を、標的がインビボで見出されるかインビトロでの適用が予想される環境を模倣するために選択することができる。この結合環境をより正確に反映するように変化させることができる調整可能な条件には、総イオン強度（浸透圧）、ｐＨ、酵素組成物（例えば、ヌクレアーゼ）、金属タンパク質（例えば、ヘモグロビン、セルロプラスミン）、温度、および無関係の化合物の存在が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Dang et al.(1996)J.Mol.Bio.264:268-278;O'Connell et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5883-7;Bridonneu et al.(1999)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 9:1-11;Hicke et al.(1996)J.Clin.Investig.98:2688-92;およびLin et al.(1997)J.Mol.Biol.271:446-8（その全てが本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。適切な生理学的条件を、本明細書中にさらに詳述している。
目的のリガンドと代替抗体との適切な接触条件を、反応化学に基づいて経験的に決定することができる。一般に、適切な条件は、１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％の抗体分子集団をリガンドと相互作用させるのに十分である。当業者は、所望の結果（すなわち、リガンドとの相互作用、特異性の増大、親和性の増大など）に基づいた適切な条件を認識する。
ｉｉ．分配方法
「分配」は、リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体と呼ばれる標的リガンドに結合した（二機能性）代替抗体を標的リガンドに結合していない（二機能性）代替抗体から分離する任意のプロセスを意図する。当分野で公知の種々の方法によって分配することができる。例えば、非結合代替抗体とは異なり、目的のリガンドに結合した代替抗体を固定してもよく、またはフィルターまたは分子篩を通過させなくてもよい。リガンド結合（二機能性）代替抗体を特異的に保持するカラムを分配に使用することができる。濾過ゲルリターデイションおよび密度勾配遠心分離と同様に液体−液体分配を使用することもできる。分配方法の選択は、リガンドの性質およびリガンド結合（二機能性）代替抗体に依存し、当業者に公知の原理および性質にしたがって作製することができる。
１つの実施形態では、分配は、目的のリガンド、（二機能性）代替抗体分子集団、およびリガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団を含む混合物を、濾過システムによって濾過するステップであって、リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体を保持物(retentate)中に保持し、且つ非結合（二機能性）代替抗体を通過させて濾過物とすることを特徴とするステップを含む。このような濾過システムは、当分野で公知である。例えば、種々の濾過膜を使用することができる。用語「濾過膜」には、サイズ（例えば、Amicon Microcon(登録商標)、Pall Nanosep(登録商標)）、電荷、疎水性、キレート化、および包接に基づいて分離するデバイスが含まれる。
濾過プロセスで使用される孔サイズを、標的リガンドのサイズおよび（二機能性）代替抗体の初期の集団で使用した（二機能性）代替抗体分子のサイズに対合させることができる。例えば、直径７〜１０ミクロンの細胞リガンドは、７ミクロンを排除するメンブレンによって保持される。複合体形成しない場合に１２０ヌクレオチドの二オリゴヌクレオチド構造を有する（二機能性）代替抗体分子が、メンブレンを通過するので容易に排除される。保持物中のリガンドに結合した（二機能性）代替抗体が捕捉され、その後の集団の会合に使用される。（二機能性）代替抗体とＢＳＡ−ハプテン抱合物との調製物には、代替抗体−抱合体複合体を排除する孔サイズを使用しなければならない。５０，０００または１００，０００ダルトンを排除するメンブレンにより、抱合体に結合したこの（二機能性）代替抗体が遊離の（二機能性）代替抗体から有効に分画される。小タンパク質（酵素西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に対して調製された（二機能性）代替抗体は、約５０，０００ダルトンまたはそれ以上の分子を排除し、非複合体形成（二機能性）代替抗体がフィルターを通過するメンブレンが必要である。サイズおよび膜排除特性を増大させるために、目的のリガンドは巨大なキャリア分子と化学的に抱合するか複合体形成することができる。
非結合（二機能性）代替抗体から標的リガンドに結合した（二機能性）代替抗体を分離するために使用される別のプロトコールは、本技術に利用可能である。例えば、溶液中に存在するリガンド結合（二機能性）代替抗体分子および遊離（二機能性）代替抗体分子を、サイズ排除カラムクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除／分子篩濾過、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、溶解性の調整（例えば、硫酸アンモニウム沈殿またはメタノール沈殿）、免疫沈降、タンパク質変性、ＦＡＣＳ密度勾配遠心分離を使用して分離することができる。リガンド結合および非結合（二機能性）代替抗体分子を、ＨＰＬＣおよび蛍光標示式細胞分取器などの分析方法を使用して分離することができる。
固相への選択的固定を使用したアフィニティクロマトグラフィ手順を使用して、非結合（二機能性）代替抗体分子から標的リガンドに結合した（二機能性）代替抗体を分離することができる。このような方法には、アガロース、ポリエチレン、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ガラス、ナイロン、セルロースアセテート、ポリプロピレン、またはシリコンチップから構成される吸着剤(absorbent)への標的リガンドの固定を含み得る。
（二機能性）代替抗体の特異性鎖の増幅方法が以下に記載されているが、標的リガンドに結合した代替抗体をＰＣＲ増幅で使用して、親和性マトリクスから分離されているか分離されていない組み合わせ特異性領域を有するオリゴヌクレオチド鎖を産生することができると認識される。
一旦結合されると、抗体の結合親和性および触媒活性に基づいて（二機能性）代替触媒抗体を選択することができる。触媒抗体の１つの選択方法は、酵素触媒反応の遷移状態のアナログに結合する代替抗体を調査することである。
溶液と固相分離との組み合わせには、（二機能性）代替抗体結合によって得られた生理化学的効果に基づいて単離することができるリガンド抱合ミクロスフェアへの（二機能性）代替抗体の結合が含まれ得る。個別のミクロスフェア集団を、異なる標的リガンドまたは異なる方向の同一のリガンドと抱合した発色団、フルオロフォア、マグネタイトで個別に標識することができる。各ミクロスフェア集団に結合した（二機能性）代替抗体分子を、ミクロスフェアレポーター分子の特徴に基づいて分離し、異なるリガンドに対する複数の代替集団を同時に産生することができる。
複数の化学的に異なるリガンドに結合する（二機能性）代替抗体分子を同時に産生するための方法を使用することができる。例えば、この方法を使用して、メンブレンを通過することができない標的リガンド抱合体の混合集団について（二機能性）代替抗体を選択することができる。非抱合濾過可能リガンドとの代替抗体集団の連続的インキュベーションにより、濾過物中の非特異的（二機能性）代替抗体集団を分離することが可能である。濾過可能な標的リガンドの予備インキュベーションにより、その後の増幅のための保持物中の（二機能性）代替抗体集団を迅速に分画することが可能である。
ｉｉｉ．増幅方法
（二機能性）代替抗体分子の特異性鎖の増幅方法、（二機能性）代替抗体集団の特異性鎖の増幅方法、および／またはリガンド結合（二機能性）代替抗体複合体の特異性鎖の増幅方法を提供する。増幅は、分子または分子クラスのコピーの量または数を増大させる任意のプロセスまたはプロセスの組み合わせを意味する。以下の一連の３つの反応：選択したＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作製、各ｃＤＮＡのコピー数を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応の使用、および選択ＲＮＡと同一の配列を有するＲＮＡ分子を得るためのｃＤＮＡコピーの転写によってＲＮＡ分子を増幅することができる。当業者に認識されるように、当分野で公知の任意の反応または反応の組み合わせ（直接ＤＮＡ複製および直接ＲＮＡ増幅などが含まれる）を必要に応じて使用することができる。増幅方法により、増幅混合物の比率は最初の混合物中の異なる成分配列の比率を本質的に代表するはずである。（二機能性）代替抗体分子中の特異性領域のいずれかの端の定常領域により特異性領域の構造が安定化する一方で、これらの領域を使用して（二機能性）代替抗体の増幅を容易にすることもできる。
この様式では、特異性鎖集団が作製される。したがって、増幅された特異性鎖を適切な安定化鎖に接触させた場合、所望のリガンド結合親和性および／または特異性を有する（二機能性）代替抗体集団を形成することができる。リガンド相互作用の特異性を選択的に増大する方法および集団の結合親和性の増大方法を以下に提供する。
一旦所望の（二機能性）代替抗体または代替抗体組が同定されると、１つまたは複数のモノクローナル（二機能性）代替抗体クローンを同定し、大量のモノクローナルまたは会合したポリクローナル（二機能性）代替抗体試薬のいずれかを作製することがしばしば望ましい。モノクローナル（二機能性）代替抗体の捕捉は、増幅された特異性鎖集団から少なくとも１つの特異性鎖をクローン化するステップをさらに含む。クローン化した特異性鎖を、日常的な方法を使用して増幅し、その後第一の安定化ドメインが第一の定常領域と相互作用し、且つ第二の安定化ドメインが第二の定常領域と相互作用する条件下で適切な安定化鎖と接触させることにより、モノクローナル（二機能性）代替抗体集団を産生することができる。
核酸配列（特異性鎖の核酸配列など）の増幅方法は公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例示的な核酸増幅方法である。ＰＣＲ法は、例えば、Saiki et al.(1985)Science 230:1350-1354;Saiki et al.(1986)Nature 324:163-166;Scharf et al.(1986)Sciencek233:1076-1078;Innis et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:9436-9440；ならびに米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号（それぞれの内容全体が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。
ＰＣＲ増幅は、ｓｓＤＮＡの３’末端および５’末端に相補的な特異的オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼを使用したプライマー伸長、およびＤＮＡ変性を使用した所望の一本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の反復複製サイクルを含む。伸長によって１つのプライマーから作製された産物は、他のプライマー由来の伸長のテンプレートとして作用する。ＰＣＴ公開出願WO89/01050号に記載の関連する増幅方法には、二本鎖中間体を得るために増幅されるべき配列の上流にプロモーター配列の存在または移入が必要である。次いで、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、中間体を含む二本鎖プロモーターの多ＲＮＡコピーを産生する。得られたＲＮＡコピーを、逆転写酵素で処理して中間体を含むさらなる二本鎖プロモーターを産生し、これらをＲＮＡポリメラーゼを使用した別の増幅ラウンドに供することができる。別の増幅方法は、特に、適切なベクターで選択されたＤＮＡまたは選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーをクローン化するステップと、宿主生物にベクターを移入し、ベクターおよびクローン化ＤＮＡが複製および増幅されるステップとを含む(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:1874)。一般に、選択された核酸配列を忠実且つ有効に増幅する任意の手段を使用することができる。増幅後の配列の比率が増幅前の混合物中の配列の相対的比率を少なくともおおよそ反映することのみが必要である。Crameri et al.(1993)Nucleic Acid Research 21:4110（本明細書中で参考として組み込まれる）も参照のこと。
この方法は、任意選択的に、適切な核酸精製工程を含み得る。
一般に、特異性領域のヌクレオチドを含む（二機能性）代替抗体鎖を増幅することができる。一般に、この鎖中で使用される任意の保存領域もまた増幅を妨害する分子を含まない。しかし、例えば、選択化学を介してＰＣＲなどの方法によってこの鎖の増幅を妨害し得る安定化鎖に機能的部分を導入することができる。このような代替抗体を、本発明の方法にしたがって、任意の必要な生物学的および／または化学的工程によって産生することができる。
他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は、安定化鎖の増幅を防止するために適切なプライマーと組み合わせて使用することができる非相同領域を含む。この実施形態の非限定的な例を図７および実施例の実施例４に示す。簡単に述べれば、この非限定的な例では、安定化鎖および特異性鎖は、特異性ドメインに対して５’に位置する約２、３、４、５、６、８、またはそれ以上のヌクレオチドが相同性を欠く。図７の斜線のボックスを参照のこと。特異性鎖の正の鎖の増幅に使用したプライマーは、特異性鎖の配列に相補的である。しかし、ミスマッチデザインによって、このプライマーは、安定化鎖の配列に対して３’末端で相同性を欠く。この相同性の欠如により、負の全長安定化鎖の増幅が防止される。したがって、この方法により、特異性鎖が優先的に増幅される。
ｉｖ．ステージング
選択された目的のリガンドに高親和性で特異的に結合する（二機能性）代替抗体エレメントの反復選択プロセスを、本明細書中で「ステージング」と命名する。ステージングは、高分子であるか免疫学的ハプテンサイズであり得る標的リガンドに結合する（二機能性）代替抗体分子の「捕捉および増幅」を意味する用語である。所望の（二機能性）代替抗体のこの同定が可能な種々の方法でステージングプロセスを修正することができる。例えば、「特異性の増大」により捕捉された集団から無関係または望ましくない（二機能性）代替抗体分子の数を排除または減少させる工程を使用することができる。さらに、「親和性を増大」させ、それにより標的リガンドに対して高親和性の（二機能性）代替抗体分子を選択することが可能である。ステージングプロセスは、目的の標的リガンドに対して高い親和性および特異性を有する（二機能性）代替抗体の迅速な単離および増幅に特に有用である。例えば、Crameri et al.(1993)Nucleic Acid Research 21:4410を参照のこと。
特異的結合は、場合に応じて決定される用語である。所与の（二機能性）代替抗体分子と所与のリガンドとの間の所与の相互作用の文脈で、（二機能性）代替抗体の標的との優先的結合相互作用が（二機能性）代替抗体と無関係および／または望ましくない標的との間に認められる相互作用よりも高い場合に結合特異性が増大する。（二機能性）代替抗体分子を、特異的分子を捕捉、単離、および増幅するための「ステージング」プロセスを使用して必要に応じて特異的に選択することができる。
したがって、（二機能性）代替抗体の結合特異性を増大する方法は、ａ）非特異的部分結合（二機能性）代替抗体複合体集団を形成する条件下で目的のリガンドに結合することができる（二機能性）代替抗体分子集団を非特異的部分に接触させるステップであって、
前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含むステップと、
ｂ）前記非結合（二機能性）代替抗体分子集団から前記非特異的部分および前記非特異的部分結合（二機能性）代替抗体複合体集団を分配するステップと、
ｃ）前記非結合（二機能性）代替抗体分子の特異性鎖を増幅するステップとを含む。
結合親和性の増大方法は、前記第一の安定化ドメインが前記第一の定常領域と相互作用し、且つ前記第二の安定化ドメインが前記第二の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖と接触させるステップをさらに含み得る。
さらなる実施形態では、（二機能性）代替抗体集団は、（二機能性）代替抗体のライブラリーおよび／または選択された（二機能性）代替抗体集団を含む。
非特異的部分結合（二機能性）代替抗体複合体集団を形成する条件下での（二機能性）代替抗体集団の非特異性部分との接触によって（二機能性）代替抗体集団の結合特異性を増大する。この様式では、標的リガンドおよび種々の非特異的部分の両方と相互作用する（二機能性）代替抗体を、所望のリガンドに対してより高い特異性レベルを有する（二機能性）代替抗体集団から分配することができる。
「非特異的部分」は、所望の標的リガンドではない任意の分子、化合物、細胞、生物、ウイルス、ヌクレオチド、またはポリペプチドを意図する。産生される所望の代替抗体集団に依存して、当業者は、使用すべき最も適切な非特異的部分を認識する。例えば、所望の標的がプロテインＹと９５％の配列が同一のプロテインＸである場合、プロテインＸに対する（二機能性）代替抗体集団の結合特異性を、非特異的部分としてプロテインＹを使用して増大させることができる。この方法では、プロテインＸに対する相互作用が増大した（二機能性）代替抗体集団を産生することができる。例えば、Giver et al.(1993)Nucleic Acid Research 23:5509-5516およびJellinek et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11227-11231を参照のこと。
結合親和性は、（二機能性）代替抗体とリガンドとの間の結合相互作用の強度を説明する用語である。結合親和性の増大により、標的リガンドと（二機能性）代替抗体との間の結合相互作用が増大する。（二機能性）代替抗体と標的リガンドとの間の相互作用の結合親和性は、（二機能性）代替抗体が達成することができる検出感度に直接相関する。実際の適用において結合親和性を評価するために、結合反応条件は意図する用途の条件に匹敵しなければならない。最も正確な比較のために、溶液中およびその意図する適用の条件下での（二機能性）代替抗体と標的リガンドとの間の相互作用を反映する測定を行う。
したがって、本発明は、ａ）リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団を形成するストリンジェントな条件下でリガンドを（二機能性）代替抗体分子集団に接触させるステップであって、
前記（二機能性）代替抗体集団の（二機能性）代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含むステップと、
ｂ）前記リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記（二機能性）代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップとを含む、（二機能性）代替抗体の結合親和性を増大する方法を提供する。
さらなる実施形態では、結合親和性を増大する方法は、前記第一の安定化ドメインが前記第一の定常領域と相互作用し、且つ前記第二の安定化ドメインが前記第二の定常領域と相互作用する条件下で上記のステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。
さらなる実施形態では、（二機能性）代替抗体集団は、（二機能性）代替抗体のライブラリーおよび／または選択された（二機能性）代替抗体集団を含む。
この実施形態では、リガンド結合（二機能性）代替抗体複合体集団を形成するストリンジェントな条件下での所望のリガンドと（二機能性）代替抗体分子集団との接触により、所望のリガンドに対する結合親和性が増大した（二機能性）代替抗体を選択可能である。「ストリンジェントな条件」は、所望のリガンドと（二機能性）代替抗体集団との相互作用にストレスを与える任意の条件を意図する。このような条件は、目的のリガンドおよび（二機能性）代替抗体とリガンドが相互作用する好ましい条件に依存して変化する。選択されたストリンジェントな条件は代替抗体構造の形成に寄与すると認識される。このようなストリンジェントな条件の例には、浸透圧、ｐＨ、溶媒（有機または無機）、温度、またはその任意の組み合わせの変化が含まれる。ストリンジェントな条件を得ることができるさらなる成分には、疎水性結合、水素結合、静電気、およびファンデルワールス相互作用を和らげる(compromise)成分が含まれる。例えば、１０％メタノールまたはエタノールは疎水性結合を和らげ、水溶性である。
条件のストリンジェンシーを、（二機能性）代替抗体：リガンド比によって操作することもできる。例えば、等しい（二機能性）代替抗体：リガンド比を使用した数ラウンドの選択後、比を１：１０または１：１００に増大させることができる。（二機能性）代替抗体の増加または標的リガンドの減少によってこれを増大させることができる。例えば、Irvine et al.(1991)J.Mol.Bio.222:739-761を参照のこと。結合条件のストリンジェンシーを増大させるためのさらなる変化には、塩濃度、結合平衡時間、結合緩衝液の希釈、ならびに洗浄の量および組成の変化が含まれる。条件のストリンジェンシーは、総集団の１％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９５％〜９９％の抗体の減少に十分である。
さらに他の実施形態では、所望のリガンド結合特異性を有するモノクローナル（二機能性）代替抗体の同定および単離後、当業者は、特異性領域の変異誘発およびより強固な結合変異体のスクリーニングによって所望する目的のために分子の親和性をさらに増大させることができる。例えば、Colas et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Science 97:13720-13725を参照のこと。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してより深く理解される。
［実施例１：増幅不可能な安定化鎖を使用したリガンド結合代替抗体試薬の作製プロセス］
近接する定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔのランダム特異性ドメイン配列を有する二量体分子を形成させるために自己会合オリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および会合／再アニーリングのサイクルを使用して、ＳＡｂ集団にＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１抱合体および非抱合ＢＺ１０１（２，２’，４，５，５’−ペンタクロロビフェニル）ハプテンに結合する分子を富化させた。
〔方法〕
Ａ．代替抗体ライブラリーの形成：
ランダム４０ｎｔ配列、ＦＩＴＣ（Ｆ）、およびビオチン化（Ｂ）プライマーを含む８７ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーを、ＩＤＴから購入した。可変領域に近接する定常配列領域中のヌクレオチド数を反映させるために、８７ｎｔ ｓｓＤＮＡを＃２２−４０−２５（８７ｇ２）と命名した。これらは、代替抗体分子の特異性鎖であり、８７量体の配列を以下に示し（上の鎖；配列番号１８）、４８ｎｔオリゴヌクレオチド（安定化鎖）を以下に示す（下の鎖；配列番号１９）。
Figure 2005517718
 可変配列のいずれかの端の２つの定常領域ヌクレオチドは、並列した４８ｎｔの安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的である。安定化鎖は、ＦＩＴＣ標識５’であり、オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）（太字の塩基は８７ｎｔ特異性鎖上の塩基と非相補性である）として参照される。
ＤＩ水中でオリゴを０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）に再構成し、ストック溶液として２ｍｌネジ蓋バイアルにて−２０℃で保存した。（再構成安定性についての製造者の主張は６ヶ月超である）。各２０μｌの作業アリコートをＰＣＲ反応チューブに分注し、−２０℃で保存した。
Ｂ．選択；サイクル１
４μｌの０．１ｍＭ ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ２２−４０−２５（すなわち、「＋８７」）ライブラリー（２．４×１０14分子）を、５’末端がＦＩＴＣ標識された４μｌの０．１ｍＭ Ｆ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）および２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＮＫ緩衝液）緩衝液と混合した。ＴＮＫ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）である。５×ストックは２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ、６９０ｍＭ ＮａＣｌ、１３．５ｍＭ ＫＣｌを含み、ワーキング緩衝液（１×）は５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ ＫＣｌを含む。ＴＮＫ５Ｍｇは５ｍＭ ＭｇＳＯ4（１Ｍ ＭｇＳＯ4ストックの２００倍希釈物）を含む上記のＴＮＫであり、５×ＴＮＫ５Ｍｇは２５ｍＭ ＭｇＳＯ4（１Ｍ ＭｇＳＯ4の４０倍希釈物）を含む５×ＴＮＫである。
HYBAID PCR EXPRESSサーマルサイクラーを使用して、ＳＡｂ分子をアニーリングした。オリゴ混合物を、９６℃で５分間加熱し、温度を２℃／秒の速度で６５℃に低下させ、この温度で２０分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で６３℃に低下させ、この温度で３分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で６０℃に低下させ、この温度で３分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で３℃ずつ低下させ、温度が２０℃に達するまで各温度で３分間保持した。６０℃から２０℃までの時間は４０分である。総アニーリング時間は、１．５時間である。
代替抗体の形成についてアッセイするために、電気泳動を使用した。各分離ゲル上で、ＦＡＭ−８７およびＦ−４８をロードして、対応するバンドおよびＳＡｂの位置を決定した。並行ゲル（または分離ゲルの他の半分）上に、各アニーリングＳＡｂのアリコート（０．５μｌ）の隣に１０ｂｐラダー、４８ｓｓ、８７ｓｓ、および保持ＰＣＲ産物。上記由来の１０μｌの反応混合物を、７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースと混合した。混合物を、２０％アクリルアミドゲル上にロードした。４８ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）およびｄｓＳＡｂは、緑色蛍光バンドとして出現した。４８バンドは、約５０塩基対に泳動し、ｄｓＳＡｂは約３０４に泳動された。Ｓａｂの抽出後、ゲルをＥｔＢｒ（１０ｍｇ／ｍｌを１０ｍｌ緩衝液に溶解したうちの１μｌ）で染色する。標準的な分子量関数を使用して、約１５７ｂｐに８７バンドが出現する。
ＳＡＢ８７／４８バンドを含むゲルフラグメントを切り出し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。滅菌ピペットチップを使用してゲル画分を浸漬させ、０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０を含む４００μｌＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加し、サンプルを２時間／ＲＴの低速での回転プラットフォームで震盪する。ゲルスラリーを吸引し、Pall Filter300Kに添加し、Eppendort5417R中にて１〜５０００×ｇ（７０００ｒｐｍ）で３分間スピンする。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む４０μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液を体積４４０μｌまで添加し、３分間遠心分離した。
濾過物の体積を測定する。１０μｌアリコートの濾過物および９０μｌ緩衝液、ならびにWallac VICTOR2、mdl1420（プログラム名「フルオレセイン（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ，１）」）を使用して、形成されたＳａｂのＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。緩衝液のみのブランクも測定した。バックグラウンドを差し引き、適切な希釈計数および体積を掛けることにより総蛍光を計算した。
２０μｌのＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１抱合体（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖを含むＴＮＫＭｇ５ Ｔｗ０．０５中の１μｇ／μｌの抱合体濃縮物）と共に１／１０の体積（４０μｌ）のＭｅＯＨを濾過物に添加した。実施例５に概説するように、ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１抱合体を合成し、特徴付けた。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。
反応混合物を吸引し、新規のNanosep 100K遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。（Nanosep 100Kおよび３００Ｋ遠心分離デバイスをPALL-Gelman（カタログ番号OD100C33）から購入し、ポリエチレン基質上にＯｍｅｇａ低タンパク質およびＤＮＡ結合修飾ポリエーテルスルホンを備えた遠心分離フィルターである。）フィルターを使用して、非結合ＳａｂからＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを分画した。保持物中の抱合体に結合したＳＡｂを回収し、非結合ＳＡｂは濾過物に保持された。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。１００μｌの混合物を除去し、Wallac VictorIIを使用してマイクロウェルプレート中でＲＦＵを定量した。サイクル１について保持物を４００μｌアリコートのＴＮＫＭｇ５緩衝液（ＴｗｅｅｎおよびＭｅＯＨを含まない）を使用した１０００ｇ／３〜８’で１回だけ洗浄した（サイクル２については２回、サイクル３〜６については３回）。スピン時間は、フィルターごとに異なる（一般に、３〜８分間）。保持物はＳＡｂを確保し、濾過物およびプールを保持し、保持物ＲＦＵと一致させるために蛍光×体積を測定した。濾過物を破棄した。
１００μｌアリコートのＤＩ Ｈ2Ｏの添加、撹拌、および吸引によって保持物中のＳＡｂ（ＳＡｂが抱合体と結合する場合、ＭＷ＞１００ＫＤ）を回収した。回収した物質について総ＲＦＵを計算した。抱合物とインキュベートした開始量のＳＡｂ中の総量に対する総回収量の計算によって回収率を計算した。
Ｃ．ＰＣＲ増幅
４０サイクルのＰＣＲ増幅プログラムおよび２μＭのプライマーＦ２２−５および２μＭのプライマーＢｉｏ２１−４を使用して保持物から回収したＤＮＡを増幅した。Ｂｉｏ２１−４は、−８７オリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを添加する。
ＰＣＲプライマー。８７鎖（特異性鎖）のみを増幅し、且つ−４８鎖（安定化鎖）を増幅しないように、プライマーをデザインした。８７鎖に相補するが４８鎖に相補しない３’末端上に４〜５塩基を有することによってこれを行った。図７を参照のこと。非相補性の
４〜５塩基は、伸長の阻害に十分であった。
ＰＣＲ増幅のために使用したプライマー配列を以下に示した。プライマーＦ２２−５は−８７鎖から増幅させて新規の＋８７鎖を作製し、配列：５’ＦＡＭ−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＴＣＴ Ｃ３’（配列番号２０）を含む。プライマーＢｉｏ−２１−４は＋８７から増幅させてビオチン標識−８７を作製し、いくつかの実施形態では、これを使用して−４８にアニーリングしない−８７鎖を抽出することができる。Ｂｉｏ−２１−４の配列は、ｂｉｏ−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＴＣ Ｔ３’（配列番号２１）である。
プライマーを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ＥＢ）中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）に再構成し、ストック溶液として−２０℃で２ｍｌのネジ蓋付きバイアルに保存した（再構成物の安定性は６ヶ月超である）。２０μｌのワーキングアリコートを、ＰＣＲ反応チューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。
ＰＣＲ反応：１０μｌの保持物を、０．２ｍｌ ＰＣＲチューブに添加した。１０ｍＭの４つの各ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、１２μＬの５Ｍベタイン（Sigma B-0300）および１０μｌの１０ｐｍｏｌｅ／μｌの各プライマーの混合物を含む５μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ １０×緩衝液、１μｌＮＴＰストック溶液（ＰＣＲ ｄＮＴＰ、ヌクレオチド三リン酸１０ｍＭ（Invitrogen 18427.013）を添加した。ＱＳを、ＤＩ Ｈ2Ｏで４９．５μｌにした。以下のパラメーターでプログラムを実行した。３分、９４℃−６５℃−７２℃で３０秒をそれぞれ３５回、１０℃で保持。ＰＣＲ装置が９６℃で５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（（NEBiolabsカタログ番号MO267S）５Ｕ／μＬ）を添加し、反応物を混合し、ＰＣＲ装置にセットした。
ＰＣＲ反応後、５μＬのＰＣＲ産物を、増幅およびバンドサイズを検証するための１０ｂｐラダーコントロールおよびｓｓオリゴと共に３％アガロース１０００ゲルまたは４％Ｅ−ゲルで泳動した。残存する増幅ＤＮＡを、１００％エタノールを使用した塩沈殿によって精製する。特に、１／３体積（１００μｌ）の８Ｍ酢酸アンモニウムを、２００μｌの増幅ＤＮＡに添加する。２．６倍の組み合わせ（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）体積（約７８０〜８００μｌ）の冷無水エタノール（−２０℃）をチューブに添加する。チューブを撹拌し、氷上で１時間保存する。サンプルを、冷却遠心分離機で１５’／１４，０００ｇ／４℃で遠心分離する。ペレットに触れたり破壊することなく上清液を除去する。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加する。サンプルを穏やかに混合し、５’／１４，０００ｇで遠心分離する。ペレットを乱すことなく上清を除去し、室温での空気への曝露によって蒸発乾燥させる。
保持物から選択したＤＮＡを増幅する場合、以下のコントロールも泳動する：ＤＮＡなし、８７のみ、および４８のみ。これにより、保持物由来のバンドが正しいサイズであり、プライマー二量体に起因しないことが確認される。ＳＡｂチューブ中で４８鎖が増幅されないこともまた示す。単独で、−４８は増幅し、−４８コントロールチューブで検出することができる。これにより、増幅した場合に、ＳＡｂチューブ中でｄｓ４８の位置が同定される。
再アニーリング：４μｌの滅菌ＤＩ Ｈ2Ｏ＋４μｌの０．１ｍＭ−４８ｎｔオリゴヌクレオチド（Ｆ２１−１０−１７）を含む８μｌの溶液の添加によって、ペレットを再構成した。サンプルを、０．２ｍｌＰＣＲチューブに移し、２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加した。（注意：過剰なＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーの添加により、所望の＋８７／−４８ＳＡｂ分子の形成が駆動される）。
Ｄ．サイクル２〜６：ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために前に特定した温度プログラムを使用した０．２ｍｌＰＣＲチューブでの再構成物質の加熱によってｄｓＳＡｂをアニーリングした。第１のサイクル後、複数のバンドが出現する。したがって、切断されたバンドが実際に新規のＳＡｂであることを確認するために、並行ＳＡｂアリコートをその対応するＰＣＲ開始鎖と共に泳動した。ＳＡｂバンドがｄｓ８７／４８であることを確認するために、アリコートを除去し、変性ゲル（１６％、２×尿素サンプル緩衝液中でボイル）で泳動し、分離ゲル由来のバンドが８７鎖および４８鎖の両方を含むことを確認した。
１２０ｖで４０分間電気泳動を行った。７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースを、１０μｌのＤＮＡと混合し、サンプルをロードした。５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ ８７／４８、ｄｓ４８およびｓｓ４８）が、長波長下で緑色蛍光バンドとしてゲル上に出現する。サイズマーカーとして利用可能なレーン中に５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）を泳動した。ＳＡｂは、２０％アクリルアミド未変性ゲルにおいて２５０〜３００ｎｔのｄｓＤＮＡと同時に移動することが認められた。ＳＡｂ−ゲル部分を切り出し、２５０μｌのＴＮＫＭｇ５Ｔｗ０．０５緩衝液中に浸漬させた。サンプルを、低速の回転プラットフォームで撹拌しながら２時間／ＲＴでインキュベートした。
ゲル上清をPall 300K遠心分離デバイスに移し、１〜５０００ｇ／３’で遠心分離してポリアクリルアミドを除去した。保持物を、５０μｌアリコートの緩衝液の添加によって洗浄し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。その後の選択サイクルで使用するために、濾過物からＳＡｂを回収する。
１００μｌアリコートの濾過物を使用してＳＡｂおよび緩衝液ブランクのＲＦＵをWallac Victor2によって上記のように測定した。
Ｅ．選択サイクル２〜７
サイクル１で１／１０体積のＭｅＯＨおよび２０μｌのＢＺ１０１−ａａ−ＢＳＡ（１μｇ／μｌ）を添加する。サンプルを１時間インキュベートし、Pall 100Kフィルターを使用して選択する。サイクル２については２回およびサイクル３〜６については３回洗浄後、保持物のＲＦＵを測定した。バックグラウンドＲＦＵを差し引くことにより、回収率を決定する。
負の選択。この実施例では、サイクル番号１〜６でＢＳＡを使用した負の選択を行わなかった。
負の選択を所望する場合、２５０μｌのＳＡｂ ８７／４８濾過物（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）を、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）ＢＳＡ溶液と混合した。サンプルを、３０’／ＲＴでインキュベートした。Wallac VICTOR IIプログラムを使用して１００μｌアリコート中のＲＦＵを測定した。
２５０μｌの上記反応混合物（１６％非変性ＰＡＧＥおよび８Ｍ尿素を使用した８％変性ＰＡＧＥのために２０μｌを確保する）を、Nanosep100K遠心分離濃縮器に添加した。フィルターを、１０００ｇ／１５’／ＲＴで遠心分離した。濾過物中の総体積は、約２４０μｌであった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌアリコートのＲＦＵをチェックした。
２００μｌ ＴＮＫＭｇ５緩衝液の添加によってフィルターを洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０’／ＲＴ）、遠心分離後にさらに２００μｌの同一の緩衝液を添加し、再度遠心分離し、１００μｌの同一の緩衝液を添加し、再度遠心分離した。１００μｌのＤＩ Ｈ2Ｏを添加し、濾過し、撹拌し、保持物を吸引下。保持物の吸引によってＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵをWallac VICTOR IIによって決定し、回収率を決定した。
２００μｌの負の選択を行った濾過物を、ＴＮＫＭｇ５緩衝液中に懸濁した２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０抱合体を混合した。総体積約２２０μｌの混合物を１時間／ＲＴでインキュベートした。反応溶液を新規のNanosep100K遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。ＴＮＫＭｇ５緩衝液を使用して３回洗浄した。非結合（遊離）ＳＡｂの比率を決定するために、１００μｌアリコートの濾過物のＲＦＵを測定した。
１００μｌのＤＩ Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引した。全サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに入れた。サンプルのＲＦＵおよびバックグラウンドを測定し、回収率を計算した。
さらなる工程。１００μｌアリコート中に回収した１〜２０％の結合ＳＡｂを、プライマーを使用したＰＣＲ増幅に使用した。前に記載のように、これにより、それぞれ５０μｌ含まれる４つのチューブ中にｄｓＤＮＡを再度作製する。ＳＡｂ集団において回収率がさらに増大しなくなるまで負および正の選択サイクルを繰り返した。
抱合体添加前のポリクローナルＳＡｂライブラリーとの遊離ハプテンの予備インキュベーションおよびその後の増幅のための濾過物の回収によってさらなるサイクルを実施することができる。高ＭｅＯＨ、界面活性剤、低ｐＨ、および／または塩の増加におけるＳＡｂおよび抱合体のインキュベーションによって親和性富化のサイクルを実施することができる。抱合体に結合した高親和性の残存ＳＡｂを増幅する。１．結合、２．特異性富化、３．親和性の増大およびその後のモノクローナルＳＡｂクローンの産生によってポリクローナルＳＡｂ産生プロセスを進行させる。
計算。抱合体とインキュベートした場合に存在するＲＦＵの総量に対する回収された抱合体結合アリコート中の総ＲＦＵ量を決定した。負の選択のために、ＢＳＡとインキュベートした場合に総ＲＦＵ量に対する回収したＢＳＡ結合アリコート中のＲＦＵ量を決定した。濾過物から定量したＲＦＵから非結合ＳＡｂおよび濾過デバイスでのロスを示すデータおよび補助的情報が得られる。
注釈：サイクル番号２〜５におけるＤＮＡ／抱合体比およびＤＮＡ／ＢＳＡ比は、１０〜１００ｎＭ ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質（すなわち、２０〜２００分子の抱合体またはＢＳＡに対して１分子のＳＡｂ）であった。この計算により、抱合体が１モルのタンパク質あたり報告された２０モルのＢＺ１０１を有すると推測される。（ＳＡｂ ８７／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量＝（Ａ２２−４０−２５＝２１７．４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。総量＝約１１６．８Ｋｄ；２ＳＡｂ１：１抱合体＝約１５９．６Ｋｄ。
［実施例２：モノクローナルＳＡｂの調製］
特異的プライマーを使用してＰＣＲによってポリクローナルＳＡｂ集団を増幅して、二本鎖７８ｎｔおよび二本鎖４０ｎｔ分子を先生する。信頼性の高いポリメラーゼおよび少数のＰＣＲサイクル（２５サイクル）の使用によって増幅物およびＰＣＲエラーを最小にする。ＰＣＲ産物を、３1/2高分解能アガロースゲルで電気泳動し、７８ヌクレオチドフラグメントを回収し、Qiagen Gel抽出キットによって精製する。精製７８ｎｔ二本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲクローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙなど）にクローン化して、各二本鎖７８ｎｔフラグメントコピーを含むプラスミドを産生する。大腸菌細菌（例えば、ＪＭ１０９株、Promega）を、エレクトロポレーションによってプラスミドで形質転換する。
形質転換細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートで培養する。７８ｎｔフラグメントを含む細菌は白色のコロニーを形成し、７８ｎｔフラグメントを含まない細菌は１３ｇａｌを発現し、青色のコロニーを形成する。各白色コロニーを、液体増殖培地を含むマイクロウェル（例えば、ＳＯＣ培地、Promega）に移し、３７℃で一晩インキュベートする。
各ウェルからＰＣＲマイクロプレートにアリコートを移した後、ウェルの内容物を増幅する。適切なプライマーおよびＰＣＲ条件の使用によって、ＰＣＲ産物を精製する必要性を回避する。前に記載のプロセスである４０ｎｔフラグメントの添加および定義の加熱および冷却サイクルを使用したサーマルサイクラーでのハイブリッド形成を使用して、マイクロプレート中でＳＡｂ分子を会合する。
［実施例３：分析およびデータベースの構築］
モノクローナルＳＡｂクローンの反応性パネルプロファイリングを使用して、市販のアプリケーションのために選択試薬で使用した結合特性を比較する。分析した特徴は、以下を含み得る：
１）標的リガンドの認識；
２）相対力価および親和性；
３）感受性；
４）特異性；
５）マトリクス効果；
６）温度効果；
７）安定性；および
８）商業的意義(commercial significance)の他の変化（例えば、溶解、エフェクター機能）。
標準的な試験プロトコールを使用し、各クローンから収集したデータを、リレーショナルデータ−ベースに入力する。
特徴づけアッセイは、会合したモノクローナルＳＡｂ試薬のアリコートを分析用の特定の特徴づけプレートに移す。親和性および滴定アッセイは、各試薬の相対親和性（Ｋａ）および濃度を比較する。感受性アッセイは、低濃度の標的リガンドを検出して最小検出用量を評価する能力を比較する。特異性アッセイは、無関係／望ましくないリガンドのＳＡｂ認識を比較する。マトリクス干渉研究は、ＳＡｂ結合に対する予想されるマトリクス成分の効果を評価する。温度効果は、結合との関係を評価する。安定性は、最も安定なクローンおよびさらなる評価に必要な問題を同定する。予想される適用に関連する他の特徴を、公知の手段を使用して評価することもできる。
［実施例４：ＰＣＢ同族体ＢＺ１０１に対する代替抗体８７／４８の調製］
近接する定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔのランダム配列結合ループを有する二量体代替抗体分子を形成させるために自己会合オリゴヌクレオチド鎖（７８ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および会合／再アニーリングのサイクルを使用して、ＳＡｂ集団にＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１抱合体および非抱合ＢＺ１０１（２，２’，４，５，５’−ペンタクロロビフェニル）ハプテンに結合する分子を富化させた。
Ａ．選択；サイクル１
代替抗体の形成。以下の実験で使用する代替抗体のライブラリーを、以下の様に形成した。ランダム４０ｎｔ配列ならびにＦＩＴＣ（Ｆ）およびビオチン化（Ｂ）プライマーを含む７８ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを、Gbco-Invitrogen life technologiesから購入した。７８ｎｔ ｓｓＤＮＡを、可変領域に近接する定常配列領域中のヌクレオチド数を反映させて＃１７−４０−２１と命名した。４８ｎｔオリゴヌクレオチド（すなわち、安定化鎖；配列番号２３）と共に７８量体配列（すなわち、特異的鎖；配列番号２２）を以下に示す。
（７８ｎｔオリゴヌクレオチド（上の鎖として示す））
Figure 2005517718
 （４８ｎｔオリゴヌクレオチド（下の鎖として示す））
可変配列のいずれかの端の２つの定常領域のヌクレオチド配列は、並列４８ｎｔ安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的である。ＦＩＴＣ標識５’−オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）の太字の塩基は、７８ｎｔ鎖上の塩基に非相補的である。ＤＩ水中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）のオリゴを再構成し、ストック溶液として２ｍｌのネジ蓋付きバイアルにて−２０℃で保存した。
４μｌの０．１ｍＭ ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ１７−４０−２１（すなわち、「＋７８」）ライブラリー（２．４×１０14個の分子）（すなわち、特異性鎖）を、５’末端でＦＩＴＣ標識した４μｌの０．１ｍＭ Ｆ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）（安定化鎖）および２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ ＭｇＳＯ4を含むＴＮＫ緩衝液）緩衝液と混合した。ＴＮＫ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）である（１×ストックは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、および２．７ｍＭＫＣｌを含む）。ＴＮＫＭｇ５緩衝液は、ＴＮＫ緩衝液＋５ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。
HYBAID PCR EXPRESSサーマルサイクラー（プログラム名：「Primer」）を使用してＳＡｂ分子をアニーリングした。オリゴ混合物を９６℃で５分間加熱し、この温度を２℃／秒の速度で６５℃に低下させ、この温度を２０分間維持する。次いで、温度を２℃／秒で６３℃に低下させ、この温度を３分間維持する。ついで、温度を２℃／秒で６０℃に低下させ、この温度を３分間維持する。ついで、温度を２℃／秒で３℃ずつ低下させ、温度が２０℃に達するまで各温度で３分間保持した。６０℃から２０℃までの総時間は４０分である。
１０μｌの上記由来の反応混合物を、７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースと混合し、１ｍｍの１６％アクリルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド：メチレンジサリチルアミド）にロードした。長波ＵＶ−３６６ｎｍブラックレイランプモデルＵＶＬ−５６を使用してゲルを試験した。緑色蛍光バンドとして４０ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）およびｄｓＳＡｂが出現する。
「ＳＡｂ ７８／４８」バンドをゲルから切り出し、ゲル画分を、０．０５ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０を含む４００μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液中に浸漬した。ゲルスライスを、低速のボルテックスにて２時間／室温で震盪した。
ゲルスラリーを吸引し、ゲル懸濁液をAmicon(Microcon)遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／１０’でスピンした。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む４０μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加し、サンプルを１０００ｇ／１０’で遠心分離した。総体積は、４４０μｌ以下である。
４０μｌのＭｅＯＨを濾過物に添加した。抗体量を定量するために、１００μｌアリコートの濾過物およびWallac VICTOR2、ｍｄｌ １４２０（プログラム名「Fluorocein(485nm/535nm,1)」）を使用してＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。
全ＳＡｂ濾過物を、Nanosep 100K遠心分離デバイス（Pall-Gelman）に添加し、１０００ｇ／５’で遠心分離した。１００μｌアリコートの上記濾過物を使用して、ＲＦＵを定量した。
Ｂ．代替抗体の選択
上記由来の濾過物を、２０μｌのＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１抱合体（１μｇ／μｌの抱合体濃度）を含むＴＮＫＭｇ５ Ｔｗ０．０５（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖを含む）を含む０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加した。ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１抱合体を、下記のように合成した。最終濃度１０％ｖ／ｖのメタノールを添加した。最終濃度０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を添加した。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。
反応混合物を吸引し、新規のNanosep 100K遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／１０’で遠心分離した。使用したNanosep 100K遠心分離デバイス（カタログ番号OD100C33 PALL-Gelman、ポリエチレン基質上にポリエチレンスルホンを修飾したＯｍｅｇａ低タンパク質およびＤＮＡ結合の遠心分離フィルター）は、非結合ＳＡｂからのＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを分画することができた。抱合体に結合したＳＡｂが保持物中に回収され、非結合ＳＡｂは通過して濾過物となった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。１００μｌを取り出し、Wallac VictorIIを使用してマイクロウェルプレート中でＲＦＵを定量した。２００μｌアリコートのＴＮＫＭｇ５緩衝液（ｔｗｅｅｎおよびＭｅＯＨなし）を使用して保持物を１０００ｇ／１０’で３回洗浄した。濾過物を破棄した。
保持物中のＳＡｂ（ＳＡｂが抱合物に結合した場合、ＭＷは１００ＫＤ超）を、１００μｌアリコートのＤＩＨ2Ｏの添加、撹拌、および吸引によって回収した。回収物質についての総ＲＦＵを計算した。抱合物とインキュベートしたＳＡｂの総開始量に対する総回収量の計算によって回収率を決定した。
Ｃ．ＰＣＲ増幅
４０サイクルのＰＣＲ増幅プログラムならびに２μＭのプライマーＦＭ１３−２０および２μＭのプライマーＢｉｏＭ１３Ｒ４８を使用して、保持物から回収したＤＮＡを増幅させた。ＢｉｏＭ１３Ｒ４８は、＋７８オリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを付加する。ＰＣＲ反応により、＋７８ｎｔ、−４８ｎｔ、−７８ｎｔ、および＋４８ｎｔ鎖が増幅され、それによってＳＡｂの理論的収量が減少する。
ＰＣＲ増幅に使用したプライマー配列を以下に示す。プライマー＃ＦＭ１３−２０（配列番号２４）は配列５’ＦＩＴＣ−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴ３’を有し（ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートである）、プライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（配列番号２５）は配列５’Ｂｉｏ−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ３’（Ｂｉｏはビオチンである）を有する。ＤＩ中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）のプライマーを再構成し、ストック溶液として２ｍｌのネジ蓋付きバイアル中にて−２０℃で保存した。
１００μｌの保持物を、０．２ｍｌＰＣＲチューブに添加した。２０μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ １０×緩衝液、４μｌ ＮＴＰストック溶液、および４μｌの１００ｐｍｏｌｅ／μｌの各プライマーを添加した。ＤＩ Ｈ2Ｏで最終体積を２００μｌにした。サンプルを混合し、ＰＣＲ装置に入れた。温度が９６℃に到達したとき、プログラムを中止し、１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液と共に２μｌのDeep Vent（エクソヌクレアーゼ陰性）ＤＮＡポリメラーゼストック溶液（２単位／μｌ）（New England BioLabsカタログ番号M0259S）を添加した。１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液は、１０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８、２℃）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む。装置中で９６℃に予め加熱した空の５０μｌＰＣＲチューブに反応混合物を等分した。総増幅時間は、約２．５〜３時間であった。
等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１ｖ／ｖ）での抽出によって増幅ＤＮＡを精製した。２００μｌの増幅ＤＮＡを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。２００μｌの抽出溶液をチューブに添加した。チューブを撹拌し、５’／１２，０００ｇで遠心分離した。上清（緩衝液層）を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。
吸引したＤＮＡ溶液を、１００％エタノールを使用した塩沈殿に供する。１００μｌの８Ｍ酢酸アンモニウムを、約２００μｌの吸引ＤＮＡに添加した。２．６倍の組み合わせ（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）体積（約７８０〜８００μｌ）の冷無水エタノール（−２０℃）をチューブに添加した。チューブを混合し、氷水中で３０分間保存した。サンプルを、１５’／１２，０００ｇで遠心分離した。上清を、吸引し、破棄した。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加し、サンプルを５’／１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを崩壊させないように上清を除去し、室温での空気への曝露によって蒸発乾燥させた。４μｌの滅菌ＤＩ Ｈ2Ｏ＋４μｌの０．１ｍＭプライマー（Ｆ２１−１０−１７）を含む８μｌの溶液の添加によって、ペレットを再構成した。サンプルを、０．２ｍｌ ＰＣＲチューブに移し、２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加する。所望の＋７８／−４８ＳＡｂ分子の形成を優先する過剰なＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーの添加によって代替抗体を再形成させた。
Ｄ．ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために前に特定した温度プログラムを使用した０．２ｍｌ ＰＣＲチューブ中での再構成物質の加熱によって、ｄｓＳＡをアニーリングした。１０μｌのＤＮＡを含む７μｌの６０％ｗ／ｖのスクロースおよびロードサンプルを、１６％アクリルアミドゲルにロードした。長波長（ＵＶ−３６６ｎｍＢＬＡＫ−ＲＡＹ ＬＡＭＰモデルＵＶＬ−５６）下で緑色蛍光バンドとして５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ７８／４８、ｄｓ４８、およびｓｓ４８）がゲル上に出現する。サイズマーカーとして５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）もゲルに泳動した。ＳＡｂ ７８／４８の５００〜６００ｎｔのｄｓＤＮＡとの同時移動が認められる。ＳＡｂ−ゲル片を切り出し、２５０μｌのＴＮＫＭｇ５ Ｔｗ０．０５緩衝液をサンプルに添加した。次いで、サンプルを、低速のボルテックスで撹拌しながら２時間／ＲＴでインキュベートした。
ゲル懸濁液をAmiconPCR遠心分離デバイスに移し、１０００ｇ／１０’で遠心分離してポリアクリルアミドを除去した。５０μｌアリコートの緩衝液の添加によって保持物を洗浄し、１０００ｇ／１０’で遠心分離した。濾過物から回収したＳＡｂを、次の選択サイクルで使用する。１００μｌアリコートの濾過物を使用したＦＵによってWallac Victor2にてＳａｂを定量した。
Ｅ．選択サイクル２〜７
サイクル番号１でＢＳＡを使用した負の選択を行わなかった。負の選択混合物は、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）のＢＳＡ溶液と共に２５０μｌのＳＡｂ ７８／４８濾過物（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）を含む。サンプルを３０’／ＲＴでインキュベートし、Wallac VICTOR IIを使用して１００μｌアリコートのＲＦＵを測定した。
２５０μｌの上記反応混合物（１６％未変性ＰＡＧＥおよび８Ｍ尿素を含む８％変性ＰＡＧＥのために２０μｌを確保する）をNanosep100K遠心分離機に添加する。濾過物を、１０００ｇ／１５’／ＲＴで遠心分離した。濾過物中の総体積は、約２４０μｌであった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌアリコートのＲＦＵを決定した。
２００μｌＴＮＫＭｇ５緩衝液の添加によって濾過物を洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０’／ＲＴ）、遠心分離後にさらに２００μｌの同一緩衝液を添加した。サンプルを再構成し、１００μｌの同一緩衝液を添加した。サンプルを再度遠心分離した。１００μｌ のＤＩ Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引する。保持物の吸引および回収率の決定によって、Wallac VICTOR IIにてＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵを決定した。
２００μｌの負に選択された濾過物を、２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＴＮＫＭｇ５緩衝液中に懸濁されたＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０抱合体と混合した。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。反応物の総体積は２２０μｌである。
新規のNanosep 100K遠心分離デバイスに反応溶液を添加し、１０００ｇ／１５’で遠心分離した。ＴＮＫＭｇ５緩衝液を使用してフィルターを３回洗浄した。非結合（遊離）ＳＡｂの比率と共に１００μｌアリコートの濾過物のＲＦＵを決定した。
１００μｌのＤＩ Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引した。全サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、ＲＦＵおよび回収率を測定した。
ＰＣＲ増幅のために、プライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（１００ｐＭｏｌ）およびＦＭ１３−２０（１００ｐＭｏｌ）と共に１００μｌアリコート中で回収した１〜２０％の結合ＳＡｂを使用した。これにより、それぞれ５０μｌの上記を含む４つのチューブ中でｄｓＤＮＡが再度作製される。ＳＡｂ集団中で回収率がさらに増大しなくなるまで負および正の選択サイクルを繰り返す。
遊離ハプテンのポリクローナルＳＡｂライブラリーとの予備インキュベーション、その後の抱合体の添加、およびその後の増幅のための濾過物の回収によってさらなるサイクルを行うことができる。高ＭｅＯＨ、界面活性剤、低ｐＨ、および／または高濃度の塩の存在下でのＳＡｂおよび抱合体のインキュベーションによって親和性増加サイクルを行うことができる。抱合体に結合した残存高親和性ＳＡｂを増幅した。ポリクローナルＳＡｂの産生プロセスは、１）結合、２）特異性の増大、および３）モノクローナルＳＡｂクローン産生前の親和性の増大によって進行する。
Ｆ．計算
抱合体とインキュベートした場合に存在する総ＲＦＵ量に対する回収された抱合体結合アリコート中の総ＲＦＵ量は、代替抗体の結合率を示す。
負の選択のために、ＢＳＡとインキュベートした場合に存在する総ＲＦＵ量に対する回収されたＢＳＡ結合アリコート中のＲＦＵ量を決定する。
さらなる計算は、非結合ＳＡｂおよび濾過デバイスでのロスを示すデータおよび情報が得られる濾過物から定量したＲＦＵを含む。
サイクル番号２〜５におけるＤＮＡ／抱合体比およびＤＮＡ／ＢＳＡ比は、１０〜１００ｎＭ ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質（すなわち、２０〜２００分子の抱合体またはＢＳＡに対して１分子のＳＡｂ ７８／４８）であることにさらに留意のこと。この計算により、抱合体が１モルのタンパク質あたり報告された２０モルのＢＺ１０１を有すると推測される。さらに、（ＳＡｂ ８７／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量は、約１１３．４Ｋｄである（（Ａ１７−４０−２１＝２４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。２ＳＡｂ：１抱合体の分子量は、約１５２．８Ｋｄであり、１ＳＡｂ：２抱合体の分子量は、約１８９．４Ｋｄである。
［結果］
図１に示す代替抗体の産生を開始させて、ステム−ループ構造を有するアプタマーよりも万能なコア分子が得られた。デザインには、結合特異性ドメインをまとめた定常領域ドメインが組み込まれている。多オリゴヌクレオチド構造により、複数の標識（例えば、ＦＩＴＣ、ビオチン）（同一であっても同一でなくてもよい）を簡単に結合させることが可能である。複数の自己指示且つ自己形成結合溝を容易に組み込むことができる。結合鎖から離れた安定化鎖により、必要に応じて化学修飾のための都合のよい部位が付与される。
標的とのインキュベーション前の「安定化鎖」への「特異性鎖」のアニーリングによって代替抗体が形成される。結合する分子を、「特異性鎖」を優先的に富化する非対称ＰＣＲを使用して増幅する。定常配列（「安定化鎖」）を付加し、別の選択サイクルのために代替分子をアニーリングする。
結合ループ中のヌクレオチド数を変化させる「結合鎖」を使用して、代替抗体を会合することができる。これらの各分子は、異なる結合溝サイズおよび固有の結合配置を有する。図８は、「特異性」および「安定化」プライマーの異なる組み合わせを使用して会合した代替抗体の電気泳動の移動度を示す。フルオレセイン標識した「安定化鎖」（略語「Ｆ」）および非標識「特異性鎖」（略語「Ａ」）を、これらの分子の産生で使用した。この組み合わせは、フルオレセイン標識した「安定化」鎖およびアニーリング分子の電気泳動移動度の有意な変化を示す（図９）。図９中のレーンは、以下を示す：レーン１、プライマーＡ７８；レーン２、プライマーＦ４０；レーン３、Synthetide(商標)「Ａ５８／Ｆ４０」；レーン４、Synthetide(商標)「Ａ５８／Ｆ４８」；レーン５、Synthetide(商標)「Ａ８８／Ｆ４０」；レーン６、Synthetide(商標)「Ａ８８／Ｆ４８」；レーン７、プライマーＦ４８；レーン８、Ａ８８、レーン９、Synthetide(商標)「Ａ７８／Ｆ４０」；レーン１０、Synthetide(商標)「Ａ７８／Ｆ４８」；レーン１１、Synthetide(商標)「Ａ７８／Ｆ４０」；レーン１２、ｄｓＤＮＡマーカー（各鎖中のヌクレオチド数を右に示した）；レーン１３、プライマーＦ４０。
分子の二本鎖の性質および約１：１の比「特異性」鎖および「安定化」鎖を検証するために、未変性アクリルアミドゲル電気泳動を使用して特徴付けた代替抗体を、変性ゲル（８％アクリルアミド、８Ｍ尿素）を使用して再度特徴付けた（図１０）。図１０中のレーンは、以下を示す：レーン１、Ａ７８／Ｆ４０；レーン２、Ａ７８／Ｆ４８；レーン３、Ａ７８／Ｆ４０；レーン４、プライマーＦ４８；レーン５、Ａ８８；レーン６、Ｆ４８；レーン７、Ａ８８／Ｆ４８；レーン８、Ａ８８／Ｆ４０、レーン９、Ａ５８／Ｆ４８；レーン１０、Ａ５８／Ｆ４０；レーン１１、Ｆ４０；レーン１２、Ａ７８。
図１１は、ＢＳＡ−ＰＣＢ（ＢＺ１０１同族体）に対する代替抗体の選択および富化を示す。シグナル／ネガティブコントロールは、標的が存在しない（ネガティブコントロール）場合に回収された代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量の比率として示す。
［実施例５：ＩｇＧを認識するリガンド結合代替抗体試薬の作製方法］
実施例１に概説するように、近接する定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔのランダム特異性ドメイン配列を有する二量体分子を形成するための自己会合オリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して、代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および会合／再アニーリングのサイクルを使用して、ＳＡｂ集団にＩｇＧポリペプチドに結合する分子を富化させた。選択方法は、実施例１で詳細に考察している。
図１２は、ＩｇＧに対する代替抗体の選択および富化を示す。シグナル／ネガティブコントロールは、標的が存在しない（ネガティブコントロール）場合に回収された代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量の比率として示す。
明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願があたかも具体的且つ個別に参考として組み込まれるように示されるような範囲で本明細書中で参考として組み込まれる。
２つの並列したオリゴヌクレオチド鎖から構成され、１つまたは複数の安定化領域（ＳＴ）を含む非限定的な代替抗体分子を示す図である。下の鎖（安定化鎖）は、上の鎖（特異性鎖）の各定常領域（ＡおよびＤ）と相互作用する２つの安定化領域（Ａ’およびＤ’）に近接するスペーサー領域（Ｓ）を含む。ＳＰは特異性領域(specificity region)を示し、Ｓはスペーサードメイン(spacer region)を示し、ＳＴは安定化ドメイン(stabilization region)を示す。本発明では、代替抗体は、免疫調整薬とさらに結合している。 複数の特異性領域（ＳＰ）、安定化領域（ＳＴ）、およびスペーサー領域（Ｓ）を含む代替抗体分子の２つの非限定的な実施形態を示す図である。 複数の特異性領域（ＳＰ）、安定化領域（ＳＴ）、およびスペーサー領域（Ｓ）を含み、且つ集合的に多次元リガンド結合が得られる代替抗体分子の４つの非限定的な実施形態を示す図である。 サイズの異なるＳＰ領域ループを含む代替抗体分子への標的リガンドの結合を示す略図である。 天然の抗体と比較して結合親和性および特異性を増大させるための代替抗体の能力を示す略図である。 代替抗体の１つの調製方法の略図である。 代替抗体の非限定的な増幅方法を提供する。この実施形態では、「Ｆ４８」は安定化鎖（配列番号１）を含み、「Ｆ２２−４０−２５（８７）」は特異性鎖（配列番号２）を含む。安定化鎖は、特異性鎖に対して５つのヌクレオチドミスマッチ（斜線ボックス）を含む。適切なプライマー（Ｂ２１−４０、配列番号３およびＦ１７−５０、配列番号４）と組み合わせたこのミスマッチにより、ＰＣＲ増幅時の安定化鎖の増幅が抑制される。この増幅方法についてのさらなる詳細は、本明細書中に示す。 ヒトＩｇＧ１kの４鎖構造の略図を示す。右側の数字は、タンパク質ＥＵ中の実際の残基数に対応する(Edelman et al.(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63:78-85)。左半分の数字は、ＣＤＲ（軽鎖および重鎖の相補性決定セグメント／領域:complementary-determining segments/regions）を示す。可変領域および相補性決定セグメントまたは領域（ＣＤＲ）を、より太い線で示す。ＶLおよびＶHは、軽鎖および重鎖の可変領域をいう。ＣＨ1、ＣＨ2、およびＣＨ3は、重鎖の定常領域のドメインをいう。ＣLは、軽鎖の定常領域をいう。２つの重鎖がジスルフィド結合で連結したヒンジ領域を近づけて示す。残基２７９での炭水化物の結合を示す。残基１０７および１１０の矢印は、可変領域から定常領域への移行を示す。パパインおよびペプシンの作用部位ならびに多数の遺伝因子の位置を示す。 代替抗体分子の二本鎖の性質を評価する未変性アクリルアミドゲルを示す図である。 代替抗体分子の二本鎖の性質を評価する変性アクリルアミドゲルを示す図である。 ＢＳＡ−ＰＣＢ（ＢＺ１０１同族体）抱合体に対する代替抗体の選択および濃縮を示す図である。シグナル／ネガティブコントロールは、標的が存在しない場合（ネガティブコントロール）に回収される代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量を百分率として示す。 ＩｇＧに対する代替抗体の選択および濃縮を示す図である。シグナル／ネガティブコントロールは、標的が存在しない場合（ネガティブコントロール）に回収される代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量を百分率として示す。
【配列表】
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Claims (38)

  1. 特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子であって、
    前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
    前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含み、
    前記二機能性代替抗体がさらに免疫調整薬に結合しており、
    前記二機能性代替抗体分子が目的のリガンドと相互作用することができる、単離二機能性代替抗体分子。
  2. 前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項１の単離二機能性代替抗体分子。
  3. 前記安定化鎖が、前記第一の安定化ドメインと前記第二の安定化ドメインとの間に第一のスペーサードメインをさらに含む、請求項１の単離二機能性代替抗体分子。
  4. 前記安定化鎖がアミノ酸配列を含む、請求項１の単離二機能性代替抗体分子。
  5. 前記安定化鎖が第二の核酸配列を含む、請求項１の単離二機能性代替抗体分子。
  6. 前記免疫調整薬が、安定化鎖、第一の定常領域、または第二の定常領域の少なくとも１つに結合する、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  7. 前記免疫調整薬が、免疫グロブリン定常領域、免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、または免疫グロブリン定常領域の活性変異型を含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  8. 前記免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、またはＩｇＧ前記免疫グロブリン定常領域の活性変異型を含む、請求項７の単離二機能性代替抗体分子。
  9. 前記免疫調整薬が、サイトカイン、サイトカインの活性変異型、サイトカインの活性フラグメント、ケモカイン、ケモカインの活性変異型、またはケモカインの活性フラグメントを含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  10. 前記免疫調整薬がＣｐＧモチーフを含む核酸配列を含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  11. 前記ＣｐＧモチーフが免疫刺激性を示す、請求項１０の単離二機能性代替抗体分子。
  12. 前記免疫調整薬が、リポ多糖またはリポ多糖の活性誘導体を含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  13. 前記免疫調整薬が、第二の特異性領域を含み、前記第二の特異性領域が、免疫応答レギュレーターと相互作用することができる、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  14. 前記免疫応答レギュレーターがＦγＲ受容体を含む、請求項１３の単離二機能性代替抗体分子。
  15. 前記目的のリガンドが、ポリペプチド、細胞、微生物、有機分子、または無機分子からなる群から選択される、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  16. 前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項１５の単離二機能性代替抗体分子。
  17. 前記細胞が癌細胞である、請求項１５の単離二機能性代替抗体分子。
  18. ヌクレオチドの糖の２’位が修飾された修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  19. ヌクレアーゼ分解耐性を増大させる機能的部分をさらに含む、請求項５の単離二機能性代替抗体分子。
  20. ＰＣＲ反応におけるポリメラーゼ活性に対する耐性を増大させる非増幅可能部分を含む機能的部分をさらに含む、請求項５の単離分子。
  21. 請求項１の二機能性代替抗体を含む組成物。
  22. 目的のリガンドへの免疫調整薬の送達方法であって、
    ａ）特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子であって、
    前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
    前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含み、
    前記免疫調整薬が前記二機能性代替抗体分子に結合しており、
    前記二機能性代替抗体分子が目的のリガンドと相互作用することができる単離二機能性代替抗体分子を含む組成物を被験体に投与するステップを含む方法。
  23. 前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項２２の方法。
  24. 前記安定化鎖が第二の核酸配列を含む、請求項２２の方法。
  25. 前記免疫調整薬が、安定化鎖、第一の定常領域、または第二の定常領域に結合する、請求項２２の方法。
  26. 前記免疫調整薬が、免疫グロブリン定常領域、免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、または免疫グロブリン定常領域の活性変異型を含む、請求項２４の方法。
  27. 前記免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域、ＩｇＧ免疫グロブリン定常領域の活性フラグメント、またはＩｇＧ免疫グロブリン定常領域の活性変異型を含む、請求項２６の方法。
  28. 前記免疫調整薬が、サイトカイン、サイトカインの活性変異型、サイトカインの活性フラグメント、ケモカイン、ケモカインの活性変異型、またはケモカインの活性フラグメントを含む、請求項２４の方法。
  29. 前記免疫調整薬がＣｐＧモチーフを含む核酸配列を含む、請求項２４の方法。
  30. 前記ＣｐＧモチーフが免疫刺激性を示す、請求項２９の方法。
  31. 前記免疫調整薬が、リポ多糖またはリポ多糖の活性誘導体を含む、請求項２４の方法。
  32. 前記免疫調整薬が、免疫応答レギュレーターと相互作用することができる第二の特異性領域を含む、請求項２４の方法。
  33. 前記免疫応答レギュレーターがＦγＲ受容体を含む、請求項３２の方法。
  34. 前記目的のリガンドが、ポリペプチド、細胞、および微生物からなる群から選択される、請求項２４の方法。
  35. 前記微生物がウイルスまたは細菌である、請求項３４の方法。
  36. 前記細胞が癌細胞である、請求項３４の方法。
  37. 哺乳動物被験体において目的のリガンドに対する免疫応答を調整する方法であって、
    特異性鎖および安定化鎖を含む単離二機能性代替抗体分子であって、
    前記特異性鎖が第一の定常領域および第二の定常領域に近接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
    前記安定化鎖が前記第一の定常領域と相互作用する第一の安定化ドメインおよび前記第二の定常領域と相互作用する第二の安定化ドメインを含み、
    前記二機能性代替抗体分子が前記免疫調整薬に結合しており、
    前記二機能性代替抗体分子が目的のリガンドと相互作用することができる単離二機能性代替抗体分子を哺乳動物被験体に投与するステップを含む方法。
  38. 前記免疫応答が刺激される、請求項３７の方法。
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