ES2536103T3

ES2536103T3 - Oligorribonucleótidos inmunoestimuladores

Info

Publication number: ES2536103T3
Application number: ES06838257.1T
Authority: ES
Inventors: Alexandra Forsbach; Joerg Vollmer; Grayson B. Lipford
Original assignee: Zoetis Belgium SA
Current assignee: Zoetis Belgium SA
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2026-11-22
Also published as: EP1957647A2; CA2630738C; US20110206719A1; BRPI0622298A2; BRPI0618857A8; JP4538522B2; BRPI0622298A8; WO2007062107A3; KR20080072934A; US8354522B2; PL1957647T3; EP1957647B1; AU2011202189A1; AU2011202189B2; CA2630738A1; JP2009517048A; DK1957647T3; EP2883957A1; CN102517292A; TW200738877A

Abstract

Un procedimiento para estimular la producción de una citocina proinflamatoria seleccionada entre TNF-alfa e IL-12 que comprende: poner en contacto una célula que expresa TLR8 in vitro con un oligonucleótido de ARN (ORN) que comprende: N-U-R1-R2, en el que N es un ribonucleótido y N no incluye un U, U es uracilo o un derivado del mismo, y R es un ribonucleótido en el que al menos uno de R1 y R2 es adenosina (A) o citosina (C) o derivados de los mismos y en el que R no es U a no ser que N-U-R1-R2 incluya al menos dos A, en el que el ORN es seleccionado de: GCCACCGAGCCGAAUAUACC SEC ID Nº: 11; AUAUAUAUAUAUAUAUAUAU SEC ID Nº: 12; UUAUUAUUAUUAUUAUUAUU SEC ID Nº: 13; AAUAAUAAUAAUAAUAAUAA SEC ID Nº: 16; AAAUAAAUAAAUAAAUAAAU SEC ID Nº: 17; AAAAUAAAAUAAAAUAAAAU SEC ID Nº: 18; CUACUACUACUACUACUACU SEC ID Nº: 24; UUAUUAU SEC ID Nº: 30; UAUAUAU SEC ID Nº: 33; CCGAGCCGCAUAUCCC SEC ID Nº: 36; CCGAGCCGCUAUACCC SEC ID Nº: 37; CCGAGCCAUAUAUCCC SEC ID Nº: 38; CCGAGCCAUAUAUAUC SEC ID Nº: 39; CCGAGCCGAAUAACCC SEC ID Nº: 40; CCGAGCCGCAUAACCC SEC ID Nº: 41; CCGAGCCGAAUACCCC SEC ID Nº: 42; CCGAGCCGCCUAACCC SEC ID Nº: 43; CCGAGCCGAAUCCCCC SEC ID Nº: 44; CCGAGCCGCAUACCCC SEC ID Nº: 45; CCGAGCCGCAUCCCCC SEC ID Nº: 46; CCGAGCCGCCUACCCC SEC ID Nº: 47; CCGAGCCGCAUUACCC SEC ID Nº: 48; CCGAGCCGCUAUCCCC SEC ID Nº: 55; CCGAGCCGAAUGUACC SEC ID Nº: 63; CCGAGCCGAUAUUACC SEC ID Nº: 65; CCGAGCCGAAGGUACC SEC ID Nº: 82; CCGAGCCGAAGGUGCC SEC ID Nº: 83; CCGAGCCGAAGCUCCC SEC ID Nº: 84; CCGAGCCGAAGAUACC SEC ID Nº: 85; CCGAGCCGAAGCUACC SEC ID Nº: 87; y CCGAGCCGAAGCUGCC SEC ID Nº: 88; en el que el ORN incluye opcionalmente al menos una modificación en su estructura; en una cantidad eficaz para estimular la producción de citocinas proinflamatorias y en el que la producción de IFN-α en respuesta al ORN no está inducida significativamente en relación al fondo; y además en el que el ORN está formando complejo con N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoniometil-sulfato (DOTAP).

Description

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inmunoestimuladores de la invención no están limitados a ARN, como se describirá más adelante.

Un ORN inmunoestimulador de la invención puede, en una realización, incluir una o más nucleobases modificadas, es decir, derivadas de A, C, G, y U. Las realizaciones específicas de estas nucleobases modificadas incluyen, pero sin limitación, citosinas 5-sustituidas (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromocitosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina, y 5-alquinil-citosina sustituida o no sustituida), citosinas 6-sustituidas, citosinas N4-sustituidas (por ejemplo, N4-etil-citosina), 5-azacitosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina con sistemas de anillos condensados (por ejemplo, N,N'-propilen citosina o fenoxacina), y uracilo y sus derivados (por ejemplo, 5-fluorouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinil-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo), derivados de timina (por ejemplo, 2-tiotimina, 4-tiotimina, timinas 6-sustituidas), derivados de guanosina (7-desazaguanina, guanina 7desaza-7-sustituida (tales como 7-desaza-7-(C2-C6)alquinilguanina), guanina 7-desaza-8-sustituida, hipoxantina, guaninas N2-sustituidas (por ejemplo N2-,metil-guanina), guanina 8-sustituida (por ejemplo 8-hidroxiguanina y 8bromoguanina), y 6-tioguanina), o derivados de adenosina (5-amino-3-metil-3H,6H-tiazol[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, adeninas sustituidas con purina, indol, adenina (por ejemplo, N6-metil-adenina, 8oxo-adenina)). La base también puede sustituirse por una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol, 3nitropirrol, P-base, y K-base), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, bencimidazol o dicloro-bencimidazol, amida del ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) un sistema de anillo aromático (por ejemplo, fluorobenceno o difluorobenceno) o un átomo de hidrógeno (dEspaciador). Las modificaciones de base preferida son uracilo y 7desaza-guanina. Estas nucleobases de U modificadas y sus correspondientes ribonucleósidos están disponibles a través de proveedores comerciales.

Las realizaciones específicas de nucleobases de G modificadas incluyen N2-dimetilguanina, 7-desazaguanina, 8azaguanina, guanina 7-desaza-7-sustituida, 7-desaza-7-(C2-C6)alquinilguanina, guanina 7-desaza-8-sustituida, 8hidroxiguanina, 6-tioguanina, y 8-oxoguanina. En una realización, la nucleobase de G modificada es 8hidroxiguanina. Estas nucleobases de G modificadas y sus correspondientes ribonucleósidos están disponibles a través de proveedores comerciales.

En determinadas realizaciones, al menos una unidad de β-ribosa puede sustituirse por β-D-desoxirribosa o una unidad de azúcar modificado, en la que la unidad de azúcar modificado se selecciona, por ejemplo, entre β-D-ribosa, α-D-ribosa, β-L-ribosa (como en 'Spiegelmers'), α-L-ribosa, T-amino-2'-desoxirribosa, 2'-fluoro-2'-desoxirribosa, 2'-Oalquil (C1-C6)-ribosa, preferentemente, 2'-O-alquil (C1-C6)-ribosa es 2'-O-metilribosa, 2'-O-alquenil (C2-C6)-ribosa, 2'-[O-alquil (C1-C6)-O-alquil (C1-C6)]-ribosa, LNA y α-LNA (Nielsen P y col., (2002) Chemistry-A European Journal 8:712-22), β-D-xilo-furanosa, α-arabinofuranosa, 2'-fluoro arabinofuranosa, y análogos de azúcar carbocíclicos y/o de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche y col., (1993) Tetrahedron 49:7223) y/o análogos de bicicloazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M y col., (1993) Helv Chim Acta 76:481).

Los ribonucleótidos y ribonucleósidos individuales de los ORN inmunoestimuladores de la invención pueden, como alternativa, unirse mediante enlazantes no nucleotídicos, en particular, enlazantes abásicos (dEspaciadores), unidades de trietilenglicol, o unidades de hexaetilenglicol. Los enlazantes adicionales son enlazantes de alquilamino, tales como aminoenlazantes C3, C6, y C12, y también enlazantes de alquitiol, tales como enlazantes de tiol C3 o C6. Los nucleótidos y nucleósidos individuales de los ORN inmunoestimuladores de la invención pueden, como alternativa, enlazarse a restos aromáticos que pueden estar sustituidos adicionalmente mediante grupos alquilo o grupos alquilo sustituidos.

El ARN es un polímero de ribonucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster 3'-5'. Los nucleótidos del ORN inmunoestimulador de la invención también pueden estar unidos mediante enlaces fosfodiéster 3'-5'. Sin embargo, la invención también abarca ORN inmunoestimuladores que tienen enlaces internucleótidos no frecuentes, incluyendo específicamente enlaces internucleótido 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3', y 2'-5'. En una realización, dichos enlaces no frecuentes están excluidos del motivo de ARN inmunoestimulador, aunque uno o más de dichos enlaces pueden aparecer en cualquier otra parte dentro del ORN inmunoestimulador. Para los ORN inmunoestimuladores que tienen extremos libres, la inclusión de un enlace internucleótido 3'-3' puede dar como resultado un ORN inmunoestimulador que tiene dos extremos 5' libres. Por el contrario, para los ORN inmunoestimuladores que tienen extremos libres, la inclusión de un enlace internucleótido 5'-5' puede dar como resultado un ORN inmunoestimulador que tiene dos extremos 3' libres.

Una composición inmunoestimuladora que comprende un ORN de esta invención puede contener dos o más motivos de ARN inmunoestimuladores que pueden estar unidos mediante una unidad de ramificación. Los enlaces internucleótido pueden ser enlaces 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3', o 2'-5'. Por lo tanto, la nomenclatura 2'-5' se selecciona de acuerdo al átomo de carbono de la ribosa. El enlace internucleótido no frecuente puede ser un enlace fosfodiéster, pero como alternativa puede modificarse, tal como fosforotioato o cualquier otro enlace modificado tal como se describe en el presente documento. La fórmula a continuación muestra una estructura general para los ORN inmunoestimuladores de la invención a través de una unidad de ramificación nucleotídica. Por lo tanto, Nu1, Nu2, y Nu3 pueden unirse mediante enlaces 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3', o 2'-5'. La ramificación de los ORN inmunoestimuladores también puede implicar el uso de enlazantes no nucleotídicos y de espaciadores abásicos. En una realización, Nu1, Nu2, y Nu3 representan motivos de ARN inmunoestimuladores idénticos o diferentes. En otra realización, Nu1, Nu2, y Nu3 comprenden al menos un motivo de ARN inmunoestimulador y al menos un motivo de

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ADN CpG.

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Los ORN inmunoestimuladores pueden contener una unidad duplicadora o triplicadora (Glen Research, Sterling, VA), en particular, aquellos ORN inmunoestimuladores con un enlace 3'-3'. Una unidad duplicadora, en una realización, puede estar basada en 1,3-bis-[5-(4,4'-dimetoxitritiloxi)pentilamido]propil-2-[(2-cianoetil)-(N,Ndiisopropil)]-fosforamidita. Una unidad triplicadora, en una realización, puede estar basada en la incorporación de Tris-2,2,2-[3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propiloximetil]etil-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita. La ramificación del ORN inmunoestimulador mediante múltiples duplicadores, triplicadores, u otras unidades multiplicadoras da lugar a dendrímeros que son una realización adicional de esta invención. Los ORN inmunoestimuladores ramificados pueden dar lugar a la reticulación de receptores para ARN inmunoestimulador, tales como TLR3, TLR7, y TLR8, con distintos efectos inmunitarios en comparación con formas no ramificadas del ORN inmunoestimulador. Además, la síntesis de ORN inmunoestimuladores ramificados o de otro modo multiméricos puede estabilizar al ARN frente a la degradación y puede permitir que secuencias débiles o parcialmente eficaces de ARN ejerzan un nivel terapéuticamente útil de actividad inmune. Los ORN inmunoestimuladores también pueden contener unidades enlazantes resultantes de reactivos modificadores de péptidos o de reactivos modificadores de oligonucleótidos (Glen Research). Además, los ORN inmunoestimuladores pueden contener uno o más restos de aminoácidos naturales o no naturales que están conectados al polímero mediante enlaces peptídicos (amida).

Los enlaces internucleótido 3'-5', 5'-5', 3'-3', 2'-2', 2'-3' y 2'-5' pueden ser directos o indirectos. Enlaces directos, en este contexto, se refieren a un enlace fosfato o fosfato modificado tal como se desvela en el presente documento, sin un resto enlazante interviniente. Un resto enlazante interviniente es un resto orgánico distinto de un enlace fosfato o fosfato modificado tal como se desvela en el presente documento, que puede incluir, por ejemplo, polietilenglicol, trietilenglicol, hexaetilenglicol, dEspaciador (es decir, un desoxinucleótido abásico), una unidad duplicadora, o una unidad triplicadora.

En determinadas realizaciones, el ORN está conjugado a otra entidad para proporcionar un conjugado. Como se usa en el presente documento, un conjugado se refiere a una combinación de cualesquiera dos o más entidades unidas entre sí mediante cualquier medio fisicoquímico, incluyendo la interacción hidrófoba y el acoplamiento covalente.

En otra realización, el ORN inmunoestimulador puede conjugarse a un ligando de bajo peso molecular que se reconoce por un receptor inmunomodulador. Este receptor es preferentemente un miembro de la familia TLR, tal como TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, o TLR9. Los ligandos de de bajo peso molecular son miméticos de los ligandos naturales para estos receptores. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, a R-848 (Resiquimod), R-837 (Imiquimod; ALDARA™, 3M Pharmaceuticals), 7-desaza-guanosina, 7-tia-8-oxo-guanosina, y 7-alil-8-oxo-guanosina (Loxoribina) que estimulan a TLR7 o a TLR8. Los derivados de D-glucopiranosa, tales como 3D-MPL (ligando de TLR4), también pueden conjugarse al ORN inmunoestimulador. Pam3-Cys es un ejemplo de un ligando de TLR2 que puede conjugarse a ORN inmunoestimuladores. Los oligodesoxinucleótidos que contienen motivos CpG son ligandos de TLR9, y estos también pueden conjugarse a los ORN inmunoestimuladores de la invención. En una realización, se conjuga al menos un oligodesoxinucleótido que comprende un motivo CpG, eficaz para estimular la señalización de TLR9, a un ORN inmunoestimulador de la invención. La conjugación de ligandos para distintos TLR en una molécula puede dar lugar a la multimerización de receptores que da como resultado una estimulación inmune potenciada o un perfil inmunoestimulador diferente del resultante de cualquiera de dichos ligandos individualmente.

En un aspecto, la invención proporciona un conjugado de un ORN inmunoestimulador de la invención y un resto

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lipófilo. En determinadas realizaciones, el ORN inmunoestimulador está unido covalentemente a un resto lipófilo. El resto lipófilo aparecerá generalmente en uno o más extremos de un ORN inmunoestimulador que tenga extremos libres, aunque en determinadas realizaciones, el resto lipófilo puede aparecer en cualquier otra parte a lo largo del ORN inmunoestimulador, y por lo tanto no necesita que el ORN inmunoestimulador tenga un extremo libre. En una realización, el ORN inmunoestimulador tiene un extremo 3' y el resto lipófilo está unido covalentemente al extremo 3'. El grupo lipófilo, en general, puede ser un colesterilo, un colesterilo modificado, un derivado de colesterol, un colesterol reducido, un colesterol sustituido, colestano, cadena de alquilo C16, un ácido biliar, ácido cólico, ácido taurocólico, desoxicolato, ácido oleil litocólico, ácido oleoil colénico, un glucolípido, un fosfolípido, un esfingolípido, un isoprenoide, tales como esteroides, vitaminas, tales como vitamina E, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, ésteres de ácidos grasos, tales como triglicéridos, pirenos, porfirinas, texafirina, adamantano, acridinas, biotina, cumarina, fluoresceína, rodamina, rojo Texas, digoxigenina, dimetoxitritilo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo, tintes de cianina (por ejemplo, Cy3 o Cy5), tinte Hoechst 33258, psoraleno, o ibuprofeno. En determinadas realizaciones, el resto lipófilo se selecciona de entre colesterilo, palmitilo, y acilo graso. En una realización, el resto lipófilo es colesterilo. Se cree que la inclusión de uno o más de dichos restos lipófilos en el ORN inmunoestimulador de la invención le confiere más estabilidad adicional frente a la degradación por nucleasas. En los casos donde hay dos o más restos lipófilos en un solo ORN inmunoestimulador de la invención, cada resto lipófilo puede seleccionarse independientemente entre sí.

En una realización, el grupo lipófilo está unido a una posición 2' de un nucleótido del ORN inmunoestimulador. Un grupo lipófilo puede, como alternativa o además, unirse a la nucleobase heterocíclica de un nucleótido del ORN inmunoestimulador. El resto lipófilo puede unirse covalentemente al ORN inmunoestimulador a través de cualquier enlace directo o indirecto adecuado. En una realización, el enlace es directo y es un éster o una amida. En una realización, el enlace es indirecto e incluye un resto espaciador, por ejemplo, uno o más restos nucleotídicos abásicos, oligoetilenglicol, tal como trietilenglicol (espaciador 9) o hexaetilenglicol (espaciador 18), o un alcano-diol, tal como butanodiol.

En una realización, el ORN inmunoestimuador de la invención está combinado ventajosamente con un lípido catiónico o un péptido catiónico. Se cree que los lípidos catiónicos y péptidos catiónicos asisten en el tráfico del ORN inmunoestimulador al compartimento endosómico, donde se encuentra TLR8. En una realización, el lípido catiónico es DOTAP (metil-sulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio). Se cree que DOTAP transporta al oligómero de ARN al interior de las células y específicamente, lo trafica al compartimento endosómico, donde puede liberar al oligómero de ARN de manera dependiente de pH. Una vez dentro del compartimento endosómico, el ARN puede interactuar con determinados TLR intracelulares, activando las vías de transducción de señales mediadas por TLR implicadas en la generación de una respuesta inmune. Otros agentes con propiedades similares, incluyendo el tráfico al compartimento endosómico, pueden usarse en lugar de o además de DOTAP. Otras formulaciones lipídicas incluyen, por ejemplo, EFFECTENE™ (un lípido no liposómico con un potenciador de la condensación de ADN especial) y SUPERFECT™ (una tecnología dendrimérica de nueva actuación). Los liposomas están comercialmente disponibles a través de Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que están formados de lípidos catiónicos, tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetil dioctadecilamonio (DDAB). Los procedimientos para producir liposomas se conocen bien en la técnica y se han descrito en muchas publicaciones. También se han revisado los liposomas por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

En una realización, los ORN inmunoestimuladores de la invención están en forma de moléculas covalentemente cerradas, en forma de mancuerna con estructura tanto primaria como secundaria. Como se describe más adelante. En una realización, dichos oligorribonucleótidos cíclicos incluyen dos bucles monocatenarios conectados mediante un segmento bicatenario interviniente. En una realización, al menos un bucle monocatenario incluye un motivo de ARN inmunoestimulador de la invención. Otras moléculas covalentemente cerradas en forma de mancuerna de la invención incluyen moléculas de ADN:ARN quiméricas en las que, por ejemplo, el segmento bicatenario es al menos parcialmente ADN (por ejemplo, bien ADNbc homodimérico o ADN:ARN heterodimérico) y al menos un bucle monocatenario incluye un motivo de ARN inmunoestimulador de la invención. Como alternativa, el segmento bicatenario del segmento de la molécula quimérica es ARN.

En determinadas realizaciones, el ORN inmunoestimulador está aislado. Una molécula aislada es una molécula que es sustancialmente pura y está libre de otras sustancias con las que normalmente se encuentra en la naturaleza o en sistemas in vivo hasta un punto práctico y adecuado para su uso previsto. En particular, los ORN inmunoestimuladores son lo suficientemente puros y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos como para ser útiles en, por ejemplo, la producción de preparaciones farmacéuticas. Debido a que un ORN inmunoestimulador de la invención puede estar mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el ORN inmunoestimulador puede comprender únicamente un pequeño porcentaje en peso de la preparación. El ORN inmunoestimulador, sin embargo, es sustancialmente puro en tanto que se ha separado sustancialmente de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos.

Para su uso en la presente invención, el ORN inmunoestimulador de la invención puede sintetizarse desde el inicio o adaptase a partir de cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de β-cianoetil fosforamidita (Beaucage SL y col., (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el procedimiento de H-fosfonato (Garegg P y col., (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler BC y col., (1986) Nucl Acid Res

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Los oligorribonucleótidos cíclicos descritos en el presente documento incluyen formas circulares cerradas de ARN y pueden incluir ARN monocatenario con o sin ARN bicatenario. Por ejemplo, en una alternativa, el oligorribonucleótido cíclico incluye ARN bicatenario y adopta una conformación de mancuerna con dos bucles monocatenarios conectados mediante un segmento bicatenario interviniente. Los oligodesoxinucleótidos de CpG covalentemente cerrados en forma de mancuerna se han descrito en la Patente de los Estados Unidos Nº 6.849.725. En otra alternativa, el oligorribonucleótido cíclico incluye ARN bicatenario y adopta una conformación con tres o más bucles monocatenarios conectados mediante segmentos bicatenarios intervinientes. En una realización, un motivo de ARN inmunoestimulador está localizado en uno o más segmentos monocatenarios.

Los ORN inmunoestimuladores de la invención son útiles, solos o en combinación con otros agentes, tales como adyuvantes. Un adyuvante, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sustrato distinto de un antígeno que potencia la activación de las células inmunitarias en respuesta a un antígeno, por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Los adyuvantes promueven la acumulación y/o activación de las células complementarias para potenciar las respuestas inmunes específicas de antígeno. Los adyuvantes se usan para potenciar la eficacia de las vacunas, es decir, composiciones que contienen antígenos usadas para inducir inmunidad protectora contra el antígeno.

Los adyuvantes en general incluyen adyuvantes que crean un efecto de depósito, adyuvantes inmunoestimuladores, y adyuvantes que crean un efecto de depósito y estimulan al sistema inmune. Un adyuvante que crea un efecto de depósito, tal como se usa en el presente documento, es un adyuvante que hace que el antígeno se libere lentamente en el organismo, de este modo prolongando la exposición de las células inmunitarias al antígeno. Esta clase de adyuvantes incluye, pero sin limitación, alúmina (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio); formulaciones basadas en emulsiones que incluyen aceite mineral, aceite no mineral, emulsiones de agua en aceite

o de aceite en agua, emulsiones de aceite en agua tales como la serie Seppic ISA de adyuvantes de Montanide (por ejemplo, Montanide ISA 720; AirLiquide, París, Francia); MF-59 (una emulsión de escualeno en agua estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, Calif.); y PROVAX (una emulsión de aceite en agua que contiene un detergente estabilizante y un agente formador de micelas; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Calif.).

Un adyuvante estimulador inmunitario es un adyuvante que provoca la activación de una célula del sistema inmune. Puede, por ejemplo, hacer que una célula inmunitaria produzca y secrete citocinas. Esta clase de adyuvantes incluye, pero sin limitación, saponinas purificadas de la corteza del árbol Q. saponaria, tales como QS21 (un glucolípido que eluye en el 21er pico con fraccionamiento HPLC; Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno (polímero PCPP; Virus Research Institute, EE.UU.); derivados de lipopolisacáridos, tales como lípido A de monofosforilo (MLP; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.), dipéptido de muramilo (MDP; Ribi) y dipéptido de treonil-muramilo (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacárido de glucosamina relacionado con lípido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza); y factor de elongación de Leishmania (una proteína de Leishmania purificada; Corixa Corporation, Seattle, Wash.). Esta clase de adyuvantes también incluye ADN CpG.

Los adyuvantes que crean un efecto de depósito y estimulan al sistema inmune son aquellos compuestos que poseen ambas de las funciones anteriormente identificadas. Esta clase de adyuvantes incluye, pero sin limitación, ISCOMS (complejos inmunoestimuladores que contienen saponinas mezcladas, lípidos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden soportar antígenos; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (sistema adyuvante Nº 2 de SmithKline Beecham que es una emulsión de aceite en agua que contiene MPL y QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Bélgica); SB-AS4 (sistema adyuvante Nº 4 de SmithKline Beecham que contiene alúmina y MPL; SBB, Bélgica); copolímeros de bloque no iónicos que forman micelas, tales como CRL 1005 (estos contienen una cadena lineal de polioxipropileno hidrófobo flanqueado por cadenas de polioxietileno; Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.); y Formulación Adyuvante Syntex (SAF, una emulsión de aceite en agua que contiene Tween 80 y un copolímero de bloque no iónico; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.).

La invención, en un aspecto, proporciona un adyuvante que incluye un ORN inmunoestimulador de la invención, solo. En otra realización, la invención proporciona un adyuvante que incluye un ORN inmunoestimulador de la invención y al menos un adyuvante más (un adyuvante de combinación). El otro adyuvante puede incluir un adyuvante que crea un efecto de depósito, un adyuvante estimulador inmunitario, un adyuvante que crea un efecto de depósito y estimula al sistema inmune, y cualquier combinación de los mismos. En una realización, el ORN inmunoestimulador de la invención y al menos un adyuvante más están unidos covalentemente entre sí. Un adyuvante de combinación según la invención puede mostrar un efecto inmunoestimulador sinérgico en comparación con la suma de los efectos del ORN inmunoestimulador solo y el al menos un adyuvante más solo. Además o como alternativa, un adyuvante de combinación de acuerdo con la invención puede mostrar un perfil inmunoestimulador alterado en comparación con el de el ORN inmunoestimulador solo o el del al menos un adyuvante más solo. Por ejemplo, el adyuvante de combinación puede proporcionar una forma más equilibrada de inmunoestimulación de Th1/Th2 en una realización, o puede proporcionar una forma más sesgada de inmunoestimulación de Th1/Th2 en otra realización. Los expertos en la materia reconocerán cómo seleccionar componentes individuales para promover un tipo deseado de inmunoestimulación, por ejemplo, más equilibrada o más sesgada respecto al carácter de Th1 y Th2. Th1 y Th2 se describen adicionalmente más adelante.

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puede seleccionarse entre un lípido catiónico, un liposoma, un cocleato, un virosoma, un complejo inmunoestimulador (ISCOM), una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una vesícula unilamelar (LUV), una vesícula multilamelar, una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite, un emulsoma, un péptido policatiónico, y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se describen más adelante. La composición farmacéutica de la descripción puede incluir además opcionalmente un antígeno. La composición, junto con el antígeno cuando está presente, se pone en asociación física con el vehículo de administración usando cualquier procedimiento adecuado. La composición inmunoestimuladora puede estar contenida en el vehículo de administración, o puede estar presente sobre o en asociación con una superficie expuesta a disolvente del vehículo de administración. En una realización, el ORN inmunoestimulador está presente sobre o en asociación con una superficie expuesta a disolvente del vehículo de administración, y el antígeno, si está presente, está contenido en el vehículo de administración. En otra realización, tanto el ORN inmunoestimulador como el antígeno están presentes sobre o en asociación con una superficie expuesta a disolvente del vehículo de administración. En otra realización más, el antígeno está presente sobre o en asociación con una superficie expuesta a disolvente del vehículo de administración, y el ORN inmunoestimulador está contenido en el vehículo de administración. En otra realización más, tanto el ORN inmunoestimulador como el antígeno, si se incluye el antígeno, están contenidos en el vehículo de administración.

La invención también proporciona el uso de las composiciones inmunoestimuladoras de la invención. En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para activar una célula inmunitaria. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la descripción incluye la etapa de poner en contacto una célula inmunitaria, in vitro o in vivo, con una cantidad eficaz de una composición de un ORN de la invención, para activar la célula inmunitaria. La composición de un ORN de la invención puede incluir opcionalmente un antígeno. Una "célula inmunitaria" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula derivada de la médula ósea que puede participar en una respuesta inmune innata o adaptativa. Las células del sistema inmune incluyen, sin limitación, células dendríticas (CD), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, macrófagos, granulocitos, linfocitos B, células plasmáticas, linfocitos T, y células precursoras de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de una sustancia que es necesaria o suficiente para provocar un efecto biológico deseado. Una cantidad eficaz puede estar limitada pero no necesariamente a una cantidad administrada en una sola administración.

Como se usa en el presente documento, la expresión "activar a una célula inmunitaria" se refiere a inducir a una célula inmunitaria a entrar en un estado activado que se asocia con una respuesta inmune. La expresión "activar a una célula inmunitaria" se refiere tanto a inducir como a aumentar una respuesta inmune. Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta inmune" se refiere a cualquier aspecto de una respuesta inmune nativa

o adaptativa que refleje la activación de una célula inmunitaria para que prolifere, para que lleve a cabo una función efectora inmune, o para producir un producto génico implicado en una respuesta inmune. Los productos génicos implicados en una respuesta inmune pueden incluir productos secretados (por ejemplo, anticuerpos, citocinas, y quimiocinas) así como moléculas intracelulares y de la superficie celular características de la función inmune (por ejemplo, un determinado grupo de antígenos de diferenciación (CD), factores de transcripción, y transcritos génicos). La expresión "respuesta inmune" puede aplicarse a una sola célula o a una población de células.

La producción de citocinas puede evaluarse mediante cualquiera de los varios procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo ensayos de respuesta biológica, ensayo inmunoabsorbente acoplado a enzimas (ELISA), análisis mediante clasificación de células activadas por fluorescencia intracelular (FACS), y la reacción en cadena de la transcriptasa inversa/polimerasa (RT-PCR).

En una realización, la respuesta inmune implica la producción de una respuesta inmune de citocinas proinflamatorias. Una respuesta inmune de citocinas proinflamatorias puede incluir la expresión de cualquiera de determinadas citocinas y quimiocinas, incluyendo IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10, IL-6, y cualquier combinación de los mismos. Se excluye específicamente al IFN-α para los fines de la invención.

En una realización, la respuesta inmune implica la regulación positiva de marcadores de la superficie celular de activación de células inmunitarias, tal como CD25, CD80, CD86, y CD154. Los procedimientos para medir la expresión de dichos marcadores de la superficie celular se conocen bien en la técnica e incluyen análisis FACS.

Para la medición de la respuesta inmune en una célula o población de células, en una realización, la célula o población de células expresa TLR8. La célula puede expresar el TLR de manera natural, o puede manipularse para expresar el TLR mediante la introducción en la célula de un vector de expresión adecuado para el TLR. En una realización, la célula o población de células se obtienen como células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En una realización, la célula o población de células se obtiene como una línea celular que expresa el TLR. En una realización, la célula o población de células se obtiene como un transfectante transitorio que expresa el TLR. En una realización, la célula o población de células se obtiene como un transfectante estable que expresa el TLR.

También para su uso en la medición de una respuesta inmune en una célula o población de células, puede ser conveniente introducir en la célula o población de células una construcción indicadora que responda a la señalización celular mediante un TLR. En una realización, dicho indicador es un gen puesto bajo el control de un

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promotor de NF-κB. En una realización, el gen que se pone bajo el control del promotor es luciferasa. En condiciones de activación adecuadas, la construcción indicadora de luciferasa se expresa y emite una señal de luz detectable que puede medirse cuantitativamente usando un luminómetro. Dichas construcciones indicadoras y otras construcciones indicadoras adecuadas están disponibles comercialmente.

La descripción también contempla el uso de procedimientos sin células para detectar la activación de TLR.

La invención, en determinados aspectos, se refiere a composiciones de un ORN de la invención para su uso en terapia. Las composiciones inmunoestimuladoras de un ORN de la invención pueden usarse solas o combinadas con otros agentes terapéuticos. La composición inmunoestimuladora y el otro agente terapéutico pueden administrarse simultánea o secuencialmente. Cuando la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención y el otro agente terapéutico se administran simultáneamente, pueden administrarse en la misma formulación o en formulaciones separadas, pero se administran a la vez. Además, cuando la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención y el otro agente terapéutico se administran simultáneamente, pueden administrarse a través de la misma vía de administración o por vías separadas, pero se administran a la vez. La composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención y otro agente terapéutico se administran secuencialmente cuando la administración de la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención está separada temporalmente de la administración del otro agente terapéutico. La separación en el tiempo entre la administración de estos compuestos puede ser cuestión de minutos o puede ser mayor. En una realización, la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención se administra antes de la administración del otro agente terapéutico. En una realización, la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención se administra después de la administración del otro agente terapéutico. Además, cuando la composición inmunoestimuladora de un ORN de la invención y el otro agente terapéutico se administran secuencialmente, pueden administrarse a través de la misma vía de administración o por vías separadas. Otros agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, adyuvantes, antígenos, vacunas, y medicamentos útiles para el tratamiento de infecciones, cáncer, alergia, y asma.

En un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para vacunar a un sujeto. El procedimiento de acuerdo con este aspecto de la descripción incluye la etapa de administrar al sujeto un antígeno y una composición de la invención. En una realización, la administración del antígeno incluye la administración de un ácido nucleico que codifica al antígeno.

Un "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal vertebrado. En varias realizaciones, el sujeto es un ser humano, un primate no humano, u otro mamífero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un gato, un perro, un cerdo, una oveja, una cabra, una vaca o un caballo.

Para su uso en el procedimiento de vacunación de un sujeto, la composición de un ORN de la invención en una alternativa incluye un antígeno. El antígeno puede estar separado de o unido covalentemente a un ORN de la invención. En una realización, la composición de un ORN de la invención no incluye en sí al antígeno. En esta realización, el antígeno puede administrarse al sujeto bien separadamente de la composición de la invención, o junto con la composición de un ORN de la invención. La administración que es por separado incluye separada en el tiempo, separada en cuanto a la localización o vía de administración, o separada tanto en el tiempo como en la localización o vía de administración. Cuando la composición de un ORN de la invención y el antígeno se administran separadas en el tiempo, el antígeno puede administrarse antes o después de la composición de la invención. En una realización, el antígeno se administra de 48 horas a 4 semanas después de la administración de la composición de la invención. El procedimiento también contempla la administración de una o más dosis de refuerzo del antígeno solo, de la composición sola, o de antígeno y composición, después de una administración inicial de antígeno y composición.

También se contempla en la invención que un sujeto pueda prepararse para un encuentro futuro con un antígeno desconocido administrando al sujeto una composición de un ORN de la invención, en el que la composición no incluye un antígeno. De acuerdo con esta realización, el sistema inmune del sujeto está preparado para montar una respuesta más vigorosa a un antígeno con el que se encuentra posteriormente el sujeto, por ejemplo, mediante exposición ambiental u ocupacional. Dicho procedimiento puede usarse, por ejemplo, para viajeros, trabajadores médicos, y soldados con probabilidad de estar expuestos a agentes microbianos.

En un aspecto, la invención proporciona una composición de un ORN de la invención en la fabricación de un medicamento o un ORN de la invención, o para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una deficiencia del sistema inmune. Los usos de acuerdo con este aspecto de la invención incluyen la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición de un ORN de la invención para tratar al sujeto. Una "deficiencia del sistema inmune", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una capacidad anormalmente deprimida de un sistema inmune para montar una respuesta inmune a un antígeno. En una realización, una deficiencia del sistema inmune es una enfermedad o trastorno en el que el sistema inmune del sujeto no está funcionando con capacidad normal o en el que puede ser útil potenciar la respuesta inmune del sujeto, por ejemplo, para eliminar un tumor o un cáncer o una infección en el sujeto. Un "sujeto que tiene una deficiencia inmune", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto en el que hay una capacidad deprimida del sistema inmune del sujeto para montar una respuesta inmune contra un antígeno. Los sujetos que tienen una deficiencia inmune incluyen sujetos que tienen una deficiencia inmune adquirida así como sujetos que tienen una deficiencia del sistema inmune congénita. Los

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Tabla 1:

IFN-alfa: TNF-alfa

SEC ID Nº: 1: imagen33 - +

SEC ID Nº: 2: imagen34 - +

SEC ID Nº: 3: imagen35 - +

SEC ID Nº: 4: - +

SEC ID Nº: 7: +

SEC ID Nº: 9: +

SEC ID Nº: 11: - +

SEC ID Nº: 12: - +

SEC ID Nº: 13: - +

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SEC ID Nº: 15: + +

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SEC ID Nº: 19: + +

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(continuación)

IFN-alfa: TNF-alfa

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SEC ID Nº: 25: + +

SEC ID Nº: 26: + +

SEC ID Nº: 27: + +

SEC ID Nº: 28: + +

SEC ID Nº: 29: + +

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SEC ID Nº: 32: + +

SEC ID Nº: 33: - +

SEC ID Nº: 34: + +

+: producción de citocinas.

-: sin producción de citocinas. Tabla 2

ORN: Actividad máx. de IFN-alfa [pg/ml] Actividad máx. de TNFalfa [pg/ml] CE50 de IFNalfa [μΜ] CE50 de TNF-alfa [μΜ]

SEC ID Nº: 49: 3367 710,4 18039 5982 0.375 0 0,35 0

SEC ID Nº: 53: 3091 1028 14623 2088 0.244 0 0.952 0

SEC ID Nº: 51: 2615 893,9 23325 3378 0.582 0 0.125 0

SEC ID Nº: 50: 2614 599,2 11141 5133 0.562 0 0.564 0

SEC ID Nº: 77: 2519 336,9 21820 8316 0.151 0,15 0.257 0.095

SEC ID Nº: 52: 2263 744,8 11920 5654 0.508 0 0.895 0

SEC ID Nº: 67: 2094 0 40729 0 0.081 0 0.079 0

SEC ID Nº: 62: 1945 503,8 37334 4597 0.276 0.029 0.343 0.004

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(continuación)

SEC ID Nº: 72: 1896 476,1 38811 11366 0.075 0.019 0.146 0.037

SEC ID Nº: 68: 1821 0 29647 0 0.018 0 0.217 0

SEC ID Nº: 58: 1760 423,3 36627 9350 0.063 0.047 0.203 0,08

SEC ID Nº: 59: 1714 473,8 26762 691,6 0.074 0.036 0.224 0.106

SEC ID Nº: 70: 1702 554,3 44904 10972 0.132 0.035 0,15 0.029

SEC ID Nº: 71: 1626 629,7 45164 13344 0.051 0.023 0,16 0.011

SEC ID Nº: 66: 1616 188,4 43098 3722 0.558 0.326 0.051 0.033

SEC ID Nº: 78: 1609 805,1 20126 4342 0.006 0.002 0.241 0.139

SEC ID Nº: 57: 1499 54,8 33624 1507 0.077 0.034 0.213 0.072

SEC ID Nº: 60: 1463 192,9 36562 2374 0.109 0.036 0.187 0,06

SEC ID Nº: 64: 1421 0 30712 0 0.577 0 0.289 0

SEC ID Nº: 73: 1395 367,9 31619 10958 0.055 0.013 0.163 0.024

SEC ID Nº: 54: 1233 772,4 12595 5272 0,78 0 0.339 0

SEC ID Nº: 80: 1225 486,6 28108 3911 0.033 0,02 0.217 0.022

SEC ID Nº: 79: 1152 402,7 17728 415,8 0.035 0,02 0.334 0.138

SEC ID Nº: 69: 1031 584,8 26915 3185 0.619 0.582 0.313 0.174

SEC ID Nº: 75: 929,9 408,7 27576 4712 1.297 0.433 0.129 0.071

SEC ID Nº: 86: 856,5 212,6 4178 2818 0.767 0 0,85 0

SEC ID Nº: 81: 842,9 0 14519 3965 0.667 0.083 0.802 0.093

SEC ID Nº: 74: 609,1 141,6 30958 13275 0.419 0.408 0.329 0.067

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(continuación)

SEC ID Nº: 61: 587,7 223,7 42180 2040 0.736 0.009 0.141 0.077

SEC ID Nº: 48: 543,4 457,8 9988 3681 0,75 0 0.801 0

SEC ID Nº: 76: 448,6 323,9 26371 7157 1.543 0.457 0.109 0.017

SEC ID Nº: 42: 392,4 277,9 17418 3300 1,5 0 0.395 0

SEC ID Nº: 39: 356,7 262,3 19253 4261 1,5 0 0.324 0

SEC ID Nº: 65: 335,2 63,87 39377 3971 1.131 0,03 0.077 0.002

SEC ID Nº: 44: 305,6 163,3 19473 7758 1,5 0 0.321 0

SEC ID Nº: 47: 271,9 204 14265 4080 1,5 0 0.566 0

SEC ID Nº: 38: 245 148,3 14064 3564 1,5 0 0,89 0

SEC ID Nº: 37: 240,5 161,2 22800 6376 1,5 0 0,75 0

SEC ID Nº: 40: 235,3 124,3 18083 4101 1,5 0 0.352 0

SEC ID Nº: 55: 224,4 772,4 15154 5272 2 0 0.337 0

SEC ID Nº: 82: 204 28,62 12595 4373 2 0 0.219 0

SEC ID Nº: 85: 193,7 37,15 17146 7964 2 0 0.215 0

SEC ID Nº: 63: 177,3 6.443 34219 5563 1.836 0.094 0.309 0.151

SEC ID Nº: 43: 144,3 74,51 10261 2883 2 0 0.954 0

SEC ID Nº: 36: 110,4 32,54 18063 6409 1,5 0 0,85 0

SEC ID Nº: 87: 100,5 73,84 12979 6676 2 0 0.346 0

SEC ID Nº: 45: 98,44 42,34 10491 4195 1,7 0 0.754 0

SEC ID Nº: 41: 97,97 42,23 10756 3679 2 0 0.897 0

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Claims

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