EA008777B1 - Способы и продукты, относящиеся к лечению и предупреждению инфекции вируса гепатита c - Google Patents

Abstract

Данное изобретение обеспечивает способы идентификации и лечения субъектов, имеющих инфекции гепатита С. В некоторых случаях эти субъекты являются не отвечающими на не-CpG-терапию. Предпочтительно, чтобы этих субъектов лечили иммуностимуляторными CpG-нуклеиновыми кислотами класса С, имеющими полумягкий скелет молекулы.

Description

Данное изобретение обеспечивает способы и продукты для лечения субъектов, хронически инфицированных вирусом гепатита С.

Уровень техники

Вирус гепатита С (Н8У) является РНК-вирусом с положительной цепью, относящимся к семейству ИауМгиз, который инфицирует гепатоциты людей и некоторых других приматов. Впервые охарактеризованный в 1989 г. (1) Н8У имеет геном 9,5 т.п.н., который кодирует три структурных белка: кор (сердцевину) и два гликопротеина оболочки (Е1 и Е2), а также несколько неструктурных (N8) белков, которые участвуют в репликации вируса и взаимодействии с клеткой-хозяином (2).

Н8У является серьезной проблемой общественного беспокойства, вызывая >90% парентерального не-А, не-В-гепатита (1). Инфицировано от 0,4 до 1,5% населения мира (3,4), в том числе приблизительно 300000 канадцев (Неа11й Саиаба). Эпидемиологические статистики трудно составлять, так как огромное большинство острых инфекций являются субклиническими; однако, приблизительно определено, что 5080% инфицированных Н8У индивидов не способно к выведению этого вируса, и большинство из них становятся пожизненными носителями. Примерно у 50% носителей развивается хронический гепатит, и у 20% из них разовьется цирроз печени, у многих из них впоследствии разовьется гепато-клеточный рак (5-9). В Соединенных Штатах гепатит С вызывает по приблизительной оценке 8000-10000 смертей ежегодно (СО8).

В Соединенных Штатах и Канаде имеются две различные схемы лечения, которые были одобрены в качестве терапии гепатита С: монотерапия альфа-интерфероном и комбинированная терапия альфаинтерфероном и рибавирином. Хотя комбинированная терапия дороже и связана с большими количеством побочными эффектов, она определенно в более высокой степени способствует поддерживаемому эффекту, чем монотерапия.

Доступны несколько форм альфа-интерферона (альфа-2а, альфа-2Ь и консенсусный интерферон (А1Гасоп)). Эти интерфероны обычно вводят подкожно три раза в неделю. ПЭГилированный интерферон, т.е. альфа-интерферон, модифицированный путем присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ) для увеличения продолжительности существования в кровообращении, является другим интерфероном, и его вводят только один раз в неделю. В отличие от этого, рибавирин является пероральным антивирусным агентом, который вводят дважды в день в капсулах по 200 мг.

Побочные эффекты альфа-интерферона включают в себя усталость, мышечные боли, головные боли, тошноту и рвоту, раздражение кожи в месте инъекции, небольшой жар, потерю массы, раздражимость, депрессию, суицид, небольшую супрессию костного мозга и потерю волос (обратимую). Побочные эффекты рибавирина включают в себя анемическую усталость и раздражимость, зуд, высыпания на коже, заложенность носа, синусит и кашель.

Лечение интерфероном - отдельно или в комбинации с рибавирином - приводит к быстрому улучшению сывороточных уровней АЬТ (аланинаминотрансферазы) у 50-75% пациентов и исчезновению детектируемой РНК Н8У из сыворотки у 30-50% пациентов. Долгосрочное улучшение в заболевании печени обычно происходит только в том случае, если РНК Н8У исчезает во время терапии и остается недетектируемой в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. Комбинированная терапия приводит как к большей потере РНК Н8У при лечении, так и к меньшему количеству рецидивов после завершения лечения. Однако результаты в большой степени зависят от генотипа вируса, причем лучшие результаты получают при генотипах 2 и 3 (приблизительно 90% в случае лечения в течение 1 года ПЭГилированным ΙΡΝ-α и рибавирином), но гораздо худшие результаты (приблизительно 40% поддерживаемого эффекта реакции) для Н8У генотипа 1. В настоящее время большинство хронических носителей Н8У в Северной Америке являются носителями генотипа 1.

Оптимальная продолжительность лечения варьируется в зависимости от применения монотерапии интерфероном или комбинированной терапии, а также от генотипа Н8У. Обычно эта продолжительность варьируется от 6 до 12 месяцев.

В настоящее время нет вакцины против Н8У или высокоэффективной терапии для хронической инфекции. Таким образом, существует безотлагательная потребность в эффективном лечении, которое могло бы быть использовано для лечения больных - хронических носителей инфекции НУ8.

Сущность изобретения

Предпосылкой данного изобретения отчасти являются неожиданные открытия, включая наблюдение, что иммуностимуляторные СрО-нуклеиновые кислоты могут быть использованы для лечения субъектов, которые хронически инфицированы вирусом гепатита С (Н8У) и которые не отвечали на ранее назначаемые курсы не-СрО-терапии. Кроме того, предпосылкой данного изобретения отчасти являлось наблюдение, что у таких субъектов может возникать синергическая реакция в результате комбинированного использования иммуностимуляторных СрО-нуклеиновых кислот и антивирусного агента, такого как ΙΡΝ-α.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, инфицированного вирусом Н8У, который не поддавался прежнему лечению под действием не-СрО-терапии, предусматри

- 1 008777 вающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.

В одном варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя интерферон альфа. В родственном варианте осуществления этим интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа. В другом варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя интерферон альфа и рибавирин или интерферон альфа и рибавирин и эмантидин. В некоторых важных вариантах осуществления не-СрС-терапия включает в себя ПЭГилированный интерферон альфа и антивирусный агент, такой как рибавирин.

В одном варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса А. В другом варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса А.

Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.

Этот способ может необязательно включать в себя введение антивирусного агента, такого как интерферон альфа, вместе с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон, но это не является ограничением. В одном варианте осуществления антивирусный агент вводят, по существу, одновременно с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой.

В одном варианте иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета молекулы. В родственном варианте осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В одном важном варианте осуществления иммуностимуляторная СрСнуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет. В других важных вариантах осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой класса С, имеющей полумягкий скелет.

Таким образом, в другом аспекте предложен способ лечения субъекта, имеющего инфекцию НБУ, которая не поддается успешному лечению под действием прежней не-СрС-терапии, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты класса С, имеющей полумягкий скелет, в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.

Еще в одном аспекте предложен способ лечения субъекта, имеющего инфекцию НБУ, которая не поддается успешному лечению под действием прежней не-СрС-терапии, предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта, нуждающегося в таком лечении, с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой, в количестве, эффективном для стимуляции иммунной реакции, и повторную инфузию этих клеток субъекту.

В одном варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В другом варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки. В одном варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С. В родственном варианте осуществления эта иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота имеет полумягкий скелет.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта с инфекцией НБУ, который предположительно может оказаться не реагирующим на не-СрС-терапию, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.

В другом варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает идентификацию субъекта, который предположительно может оказаться не реагирующим на не-СрС-терапию. В одном варианте осуществления этого субъекта идентифицируют как индивида, который, возможно, не будет реагировать на не-СрС-терапию на основе анализа интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку. В другом варианте осуществления этого субъекта идентифицируют как индивида, который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию на основе генотипа НБУ.

В одном варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя интерферон альфа. В родственном варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя интерферон альфа и рибавирин.

В одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает введение субъекту антивирусного агента. В важных вариантах осуществления таким антивирусным агентом является интерферон альфа. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа, но это не является ограничением. В одном варианте осуществления интерферон альфа вводят в субтерапевтическом количестве, и необязательно комбинация иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты и интерферона альфа является синергической.

В одном варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой, используемой для лечения этого субъекта, является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса А, иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса В или иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.

В одном варианте осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота используется

- 2 008777 для идентификации того, является ли субъект индивидом, который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию. и такой иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса А или иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.

В одном варианте осуществления антивирусный агент вводят субъекту, по существу, одновременно с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления интерферон альфа вводят в течение некоторого периода перед лечением иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой.

В некоторых вариантах иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственных вариантах осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет, а в некоторых еще более предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой класса С, имеющей полумягкий скелет.

В другом аспекте обеспечен способ лечения субъекта, инфицированного Н8У, который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию. предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты класса С, имеющей полумягкий скелет, в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.

Еще в одном аспекте данного изобретения предусмотрен способ скрининга иммуностимуляторных СрС-нуклеиновых кислот, применимых в лечении хронической вирусной инфекции гепатита С. Этот способ предусматривает контактирование мононуклеарных клеток периферической крови, полученной у субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, с иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислотой и измерение тест-реакции мононуклеарных клеток крови после воздействия. Субъектом, у которого были взяты эти мононуклеарные клетки периферической крови, являлся субъект, в отношении которого есть основания полагать, что использование прежней терапии окажется безуспешным.

В одном варианте осуществления тест-реакция была выбрана из группы, состоящей из стимуляции В-клеток, секреции 1Ь-6, секреции 1Ь-10, секреции 1Ь-12, секреции интерферона гамма, секреции интерферонов типа 1 (альфа + бета), секреции ΙΡ-10, активности клеток-киллеров (ΝΚ), экспрессии СБ80, экспрессии СБ86, экспрессии СБ83 и повышающей регуляции экспрессии МНС класса II.

В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В родственном варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки. Еще в одном варианте осуществления этими клетками являются дендритные клетки, и тест-реакция выбрана из группы, состоящей из секреции 1Ь-12, секреции интерферонов типа 1, экспрессии СБ80, экспрессии СБ86, экспрессии СБ83 и повышающей регуляции экспрессии МНС класса II.

В одном варианте осуществления контактирование имеет место ίη νίΐτο. В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови культивируют. Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторную СрС-нуклеиновую кислоту добавляют к культивируемым мононуклеарным клеткам периферической крови.

В одном варианте предыдущая терапия является не-Срб-терапией. В другом варианте не-Србтерапия включает в себя интерферон альфа. В другом варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя дополнительно рибавирин. В других вариантах осуществления интерферон альфа является ПЭГилированным интерфероном альфа. В одном варианте осуществления предыдущая терапия является терапией с СрС-нуклеиновой кислотой отличающейся последовательности или отличающегося класса.

В других вариантах осуществления этот способ дополнительно предусматривает скрининг иммуностимуляторных СрС-нуклеиновых кислот на способность стимулировать контрольную реакцию мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у нормального субъекта.

Этот способ может дополнительно предусматривать контактирование мононуклеарных клеток периферической крови с интерфероном альфа по существу одновременно с иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислотой.

В одном варианте осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственном варианте осуществления этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. В важных вариантах осуществления иммуностимуляторная СрСнуклеиновая кислота имеет полумягкий скелет. Эта иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота может быть иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой класса А, иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислотой класса В или иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой класса С. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С, а в других вариантах осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С с полумягким скелетом молекулы.

В другом аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, имеющего

- 3 008777 инфекцию Н8У, который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию. Этот способ предусматривает подвергание мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта, имеющего вирусную инфекции гепатита С, действию иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты, измерение интерферона альфа, продуцированного этими клетками, и определение количества интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, где количество интерферона альфа, которое ниже 1,0 пг/мл, служит показателем того, что субъект, по-видимому, не будет реагировать на не-СрСтерапию. В одном варианте осуществления количество, которое ниже 0,5 пг/мл, служит показателем того, что субъект, вероятно, не будет реагировать на не-СрС-терапию.

В одном варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя терапию интерфероном альфа. В другом варианте осуществления не-СрС-терапия включает в себя терапию рибавирином. В другом варианте осуществления интерферон альфа является ПЭГилированным интерфероном альфа.

В некоторых важных вариантах осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой класса А или иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислотой класса С.

В других вариантах осуществления мононуклеарные клетки периферической крови дополнительно подвергают действию антивирусного агента вместе с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой. Антивирусным агентом может быть, не ограничиваясь им, интерферон альфа. В одном варианте осуществления интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.

В другом варианте осуществления мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки. В родственном варианте осуществления эти дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки.

В другом варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является острой вирусной инфекцией гепатита С.

В другом варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает определение генотипа Н8У.

Еще в одном дополнительном аспекте предусмотрен способ идентификации субъекта, имеющего инфекцию Н8У, который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию, предусматривающий подвергание мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у субъекта, имеющего вирусную инфекции гепатита С, действию иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты класса А или класса С, измерение уровня интерферона альфа, продуцированного этими клетками, и определение количества интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, где количество интерферона альфа, которое ниже 1,0 пг/мл, служит признаком того, что субъект предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию.

В еще одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, имеющего вирусную инфекцию гепатита С, предусматривающий введение субъекту, идентифицированному согласно способу, описанному выше, молекулы иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.

В одном варианте осуществления этот способ дополнительно предусматривает введение этому субъекту интерферона альфа. В одном варианте этим интерфероном альфа является интерферон альфа2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон.

В одном варианте осуществления иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой, используемой для лечения этого субъекта, является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса А, иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса В или иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.

В другом варианте осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета. В родственном варианте этой модификацией скелета является фосфоротиоатная модификация скелета. Еще в одном варианте осуществления иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет.

В одном варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является хронической инфекцией вируса гепатита С. В другом варианте осуществления вирусная инфекция гепатита С является острой инфекцией вируса гепатита С.

Каждое из ограничений согласно изобретению может включать в себя различные варианты согласно изобретению. Таким образом, предполагается, что каждое из ограничений согласно изобретению, включающее в себя любой один элемент или комбинацию элементов, может быть включен в каждый аспект согласно изобретению.

Эти и другие аспекты согласно изобретению описаны более подробно ниже.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана индукция секреции ΙΕΝ-α из Н8У-инфицированных и нормальных РВМС после стимуляции 3 классами СрС. РВМС из нормальных и Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами СрС в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на пред

- 4 008777 мет секреции ΙΕΝ-α с использованием коммерческих наборов ЕЬ1§Л. Средние уровни секреции ΙΕΝ-α для 10 нормальных субъектов и 10 Н8У-инфицированных субъектов показаны черными чертами.

На фиг. 2 показаны результаты проточного цитометрического анализа свежевыделенных РВМС, полученных у хронических носителей Н8У и нормальных субъектов. РВМС выделяли из крови Н8Уинфицированных субъектов и из нормальных здоровых доноров и проводили иммуноокрашивание флуоресцентномечеными антителами против плазмацитоидных дендритных клеток (рЭС). Клетки анализировали на проточном цитометре и результаты сравнивали с данными по секреции ΙΕΝ-α на тех же самых субъектах при стимуляции СрС.

На фиг. 3 показана индукция ΙΕΝ-α при стимуляции РВМС С-олигонуклеотидами класса С и мягкими олигонуклеотидами класса С. РВМС из нормальных и Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами СрС в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΕΝ-α с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Средние значения уровня секреции ΙΕΝ-α у 10 нормальных субъектов и 10 Н8У-инфицированных субъектов показаны черными чертами.

На фиг. 4 показана индукция ΙΕΝ-α после стимуляции панелью полумягких СрС класса С. РВМС, выделенные из 5 Н8У-инфицированных субъектов, инкубировали с панелью полумягких олигонуклеотидов класса С в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΕΝ-α с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Среднее значение уровня секреции ΙΕΝ-α у 5 Н8У-инфицированных субъектов показано черными чертами.

На фиг. 5 показана секреция ΙΕΝ-α после стимуляции тремя классами СрС. РВМС из нормальных или Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами СрС в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΕΝ-γ с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Средние значения уровня секреции ΙΕΝ-γ у 10 нормальных субъектов и 10 Н8Уинфицированных субъектов показаны черными чертами.

На фиг. 6 показана индукция ΙΕΝ-γ после стимуляции панелью полумягких СрС класса С. РВМС, выделенные из 5 Н8У-инфицированных субъектов, инкубировали с панелью полумягких олигонуклеотидов класса С в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и в них анализировали секрецию ΙΕΝ-γ с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Средняя секреция ΙΕΝ-γ у 5 Н8У-субъектов показана черными чертами.

На фиг. 7 показана секреция ΙΡ-10 после стимуляции тремя классами СрС. РВМС из нормальных или Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами СрС в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и в них анализировали секрецию ΙΡ-10 с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Средние значения уровня секреции ΙΡ-10 у 10 нормальных субъектов и 10 Н8Уинфицированных субъектов показаны черными чертами.

На фиг. 8 показано действие СрС на пролиферацию В-клеток. РВМС из Н8У-инфицированных или нормальных доноров инкубировали с СрС класса А, В или С в течение 5 дней. Затем клетки подвергали импульсному воздействию ³Н-тимидина в течение 16-18 ч перед измерением радиоактивности. Величины представлены в виде индексов стимуляции в сравнении со средой в качестве контроля (8Ι = имп/мин клеток, инкубированных с СрС/имп/мин клеток, инкубированных только со средой).

На фиг. 9 показано действие полумягкого СрС класса С на пролиферацию В-клеток. РВМС из 5 Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с СрС класса А, В, С полумягкого СрС класса С в течение 5 дней. Затем клетки подвергали импульсному воздействию ³Н-тимидина в течение 16-18 ч перед измерением радиоактивности. Величины представлены в виде индексов стимуляции в сравнении со средой в качестве контроля (8Ι = имп/мин клеток, инкубированных с СрС/имп/мин клеток, инкубированных только со средой).

На фиг. 10 показана секреция ΙΡ-10 после стимуляции тремя классами СрС. РВМС из нормальных или Н8У-инфицированных субъектов инкубировали с различными классами СрС в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΡ-10 с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Средний уровень секреции ΙΡ-10 у 10 нормальных субъектов и 10 Н8Уинфицированных субъектов показан черными чертами.

На фиг. 11 показана секреция ΙΕΝ-α после стимуляции Н8У-инфицированных клеток рибавирином и СрС, отдельно или в комбинации с интроном А. РВМС у 10 Н8У-инфицированных субъектов и 10 нормальных здоровых доноров инкубировали с интроном А, рибавирином или СрС класса С отдельно, а также с интроном А и без интрона А (очищенного экзогенного источника ΙΕΝ-α) в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΕΝ-α с использованием коммерческих наборов ЕЫ8Л. Для количества ΙΕΝ-α, измеренного для интрона А отдельно для каждого субъекта, учитывали фон, и это количество вычитывали из вариантов интрон А, рибавирин + интрон А и класс С + интрон А для тех же самых субъектов перед включением этих данных в диаграмму. Средние величины для нормальных и НЗУ-субъектов показаны черными и белыми чертами соответственно.

На фиг. 12 - синергическое действие СрС в комбинации с интроном А на секрецию ΙΕΝ-α Н8У

- 5 008777 инфицированными клетками. РВМС из 15 НБУ-инфицированных субъектов инкубировали с СрС класса С, отдельно или вместе с интроном А (очищенным экзогенным источником ΙΡΝ-α) в течение 48 ч. Клеточные супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции ΙΡΝ-α с использованием коммерческих наборов ЕЫБА. Количество ΙΡΝ-α, измеренное для одного интрона А для каждого субъекта, вычитывали из СрС + интрон А для тех же самых субъектов перед включением этих данных в диаграмму.

Должно быть понятно, что эти фигуры не являются необходимыми для осуществления заявленного изобретения.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению было обнаружено, что СрС-олигонуклеотиды могут активировать РВМС, полученные у пациентов, хронически инфицированных НБУ, в том числе пациентов, в отношении которых прежде безуспешно применяли терапию с использованием интерферона альфа, таким же образом, как и РВМС из здоровых субъектов.

Было обнаружено, что эндогенная секреция ΙΡΝ-α сильно индуцировалась из плазмацитоидных дендритных клеток (РБС), которые, как предполагается, инфицированы Н8У. что приводит к их дисфункции и уменьшенной способности отвечать на другие стимулы. В некоторых случаях было обнаружено, что классы СрС А и С, которые индуцируют высокие уровни ΙΡΝ-α в РВМС здоровых добровольцев, индуцируют наивысшие уровни ΙΡΝ-α из рЭС. Далее было обнаружено, что полумягкие СрС-ΘΌΝ класса С также особенно применимы для этого действия. Эти ΘΌΝ могут быть предпочтительными в некоторых вариантах, так как они не будут накапливаться в почках при повторном введении доз.

Далее согласно изобретению было обнаружено, что ни экзогенный ΙΡΝ-α (интрон А), ни рибавирин не оказывают никаких детектируемых прямых иммунных стимуляторных действий на РВМС из нормальных субъектов или хронических носителей НБУ ни при использовании по отдельности, ни при совместном использовании. Однако при совместном использовании интрона А и СрС-ΟΌΝ (например, класса В или С) наблюдают сильный синергизм в отношении продуцирования эндогенного ΙΡΝ-α.

Эти результаты показывают, что СрС-ΟΌΝ являются эффективной терапией отдельно или вместе с ΙΡΝ-α для лечения хронической инфекции НБУ. Данное изобретение обеспечивает способы и продукты для предупреждения и лечения инфекции НБУ на основании этих открытий.

По-видимому, хроническая инфекция обусловлена, по меньшей мере частично, быстрой скоростью мутации НБУ, приводящей к образованию квази-видов, которые могут избежать иммунного надзора (10, 11). У хронически инфицированных индивидов могут быть детектированы как гуморальный, так и клеточно-опосредованный (ΟΜΙ) иммунитет. Хотя нейтрализующие антитела являются критическими для защиты от инфекции, клеточно-опосредованный иммунитет (ΟΜΙ) играет, по-видимому, главную роль в выведении (клиренсе) вируса после возникновения инфекции.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, инфицированного вирусом гепатита С (НБУ), который не был успешно вылечен прежней не-СрС-терапией. Этот способ предусматривает введение не отвечающему на прежнюю терапию субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для ингибирования этой инфекции.

не-СрС-терапия означает в данном контексте терапию, в которой используются активные или неактивные соединения, которые не являются иммуностимуляторными СрС-нуклеиновыми кислотами. В различных вариантах не-СрС-терапия включает в себя интерферон альфа. ПЭГилированный ΙΡΝ-α вводят обычно НБУ-субъектам (например, больным с НБУ) предпочтительно в комбинации с рибавирином и необязательно амантадином. Этим интерфероном альфа может быть интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон. Все предыдущие попытки лечения с использованием интерферона альфа включены в определение не-СрС-терапии.

Субъект, лечение которого в результате прежней не-СрС-терапии оказалось безуспешным, является субъектом, который, вопреки предыдущему лечению, все еще имеет детектируемую вирусную нагрузку в кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения терапии. Эти субъекты включают в себя субъектов, которые могут отвечать на предыдущую не-СрС-терапию, но не могут побеждать инфекцию, и она впоследствии рецидивирует, о чем свидетельствует детектируемая вирусная нагрузка. В данном контексте для простоты этих субъектов называют «нереспондерами», однако, этот термин должен пониматься, как определено здесь, а не так, как он понимается в клинике. Другими словами, хотя в клинике термин «нереспондер» определяется только как узкая субпопуляция субъектов, которая неспособна обнаруживать никакой реакции на лечение, данное изобретение относится к более широкой категории субъектов, которые, хотя, возможно, и отвечают до некоторой степени на предыдущее лечение, однако, успешному лечению не поддаются. Субъект, который считается успешно вылеченным, является субъектом, кровоток которого свободен от детектируемой вирусной нагрузки спустя 6 месяцев после прекращения лечения. Успешным лечением называют лечение, которое приводит к недетектируемому уровню вирусной нагрузки в кровотоке, который поддерживается по меньшей мере в течение 6 месяцев после прекращения лечения. Должно быть понятно, что нереспондер в данном контексте означает также хронически инфицированный НБУ.

- 6 008777

В данном контексте при ссылке на лечение с использованием СрС-нуклеиновых кислот подразумевают способы достижения успешного лечения субъектов. Успешное лечение субъектов с использованием СрС-лечения определяется как уменьшение вирусной нагрузки до недетектируемых уровней в кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения терапии. Интересно, что уменьшение вирусных нагрузок во время или сразу после лечения СрС может не наблюдаться, скорее может наблюдаться только уменьшение спустя некоторое время после лечения, причем конечным результатом будет то, что в кровотоке этих субъектов не будет детектируемого вируса спустя 6 месяцев после прекращения лечения. Таким образом, лечение инфекции означает уменьшение вирусной нагрузки до недетектируемого уровня в кровотоке субъекта и поддержание этого уровня в течение 6 месяцев после прекращения лечения. Таким образом, эффективные количества агентов вводят для достижения этого конечного результата.

В некоторых вариантах осуществления потенциальные нереспондеры могут быть идентифицированы как предполагаемые нереспондеры в будущем (т.е. перед фактическим лечением ίη νινο не-СрСтерапией), и данное изобретение обеспечивает способы не только идентификации таких субъектов, но также и их лечения. Потенциальные нереспондеры могут быть идентифицированы оценкой их способности отвечать на иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты, в частности, класса А и класса С. Способность отвечать на иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты будет оцениваться по количеству интерферона альфа, которое продуцируется на одну рЭС у Н8У-инфицированных субъектов. Согласно изобретению было обнаружено, что Н8У-инфицированные субъекты, которые вряд ли будут отвечать на не-СрС-терапию, такую как ΙΡΝ-α-терапия, могут быть идентифицированы перед получением такого лечения. Такая возможность идентифицировать таких субъектов перед терапией ίη νινο исключает ненужное лечение и создает возможность обеспечить этим субъектам терапевтически выгодное лечение иммуностимуляторными СрС-нуклеиновыми кислотами согласно изобретению либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами для анти-Н8У-терапии, в том числе, но не ограничиваясь им, ΙΡΝ-α. Эти субъекты меньше бы страдали от цитотоксичности, и период роста вируса также был бы сокращен в результате того, что больных не будут подвергать безуспешному лечению. Субъектов, имеющих уровень индукции ΙΡΝ-α на одну рЭС ниже определенного уровня, вероятно, не удастся успешно лечить ΙΡΝ-α и, следовательно, их нужно лечить предлагаемыми здесь способами. Измерение индукции ΙΡΝ-α и количеств рЭС описаны более подробно в примерах.

Должно быть понятно, что Н8У-инфицированный субъект, который успешно лечится любыми из терапевтических агентов и способов, обсуждаемых здесь, будет, возможно, все еще носителем вируса. Однако хотя этот субъект не способен полностью уничтожить этот вирус, он способен контролировать вирусную нагрузку (удерживая ее на недектируемых уровнях). Хотя и не желая связывать себя какойлибо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что поддержание недетектируемых вирусных нагрузок у таких субъектов связано с иммунной системой, которая способна контролировать репликацию и распространение вируса.

Рядовой специалист в данной области с использованием предложенных здесь способов сможет определить, будет ли субъект «нереспондером» в отношении ΙΡΝ-α-терапии. В качестве примера, если индукцию ΙΡΝ-α проводили с использованием нуклеиновой кислоты класса А, такой как нуклеиновая кислота, представленная 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1, в условиях культуры, описанных в примерах, то нормальной реакцией, которая служит признаком способности отвечать на ΙΡΝ-α-терапию, будет 1 пг/мл на одну рЭС. Количество, меньшее, чем это, будет служить признаком некоторой дисфункции рЭС. Количества, меньшие, чем 0,5 пг/мл на одну рЭС. коррелируют с более высокой вероятностью отсутствия реакции на ΙΡΝ-α-лечение. Рядовой специалист в данной области умеет определять такие пределы для конкретного типа используемой нуклеиновой кислоты в этом анализе и, следовательно, сможет идентифицировать субъектов, в отношении которых не следует надеяться на успешное лечение ΙΡΝ-α (по меньшей мере) перед фактическим лечением таких субъектов подобным образом.

В других вариантах способ идентификации субъекта, который предположительно будет нереспондером на не-СрС-терапию (например, ΙΡΝ-α-терапию), может дополнительно предусматривать идентификацию генотипа Н8У, которым он/она инфицированы. Например, более вероятно, что субъект, инфицированный Н8У генотипа 1, не будет успешно реагировать на ΙΡΝ-α-терапию. Таким образом, кроме оценки продуцирования ΙΡΝ-α на одну ЭС у таких субъектов, может быть также определен их генотип Н8У (с использованием способов, известных в данной области), и эта комбинация информации может быть использована для идентификации субъекта, который, скорее всего, не будет отвечать на ΙΡΝ-αтерапию.

Кроме того, должно быть понятно, что в некоторых аспектах данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, который вероятнее всего не будет успешно отвечать на не-СрС-терапию (фактически без попытки лечения этого субъекта не-СрС-терапией), и затем лечения этого субъекта с использованием иммуностимуляторных СрС-нуклеиновых кислот, либо отдельно, либо в комбинации с таким неограничительным антивирусным агентом как ΙΡΝ-α.

Описанные выше способы могут быть также использованы для скрининга субъектов на предмет их реагирования на конкретные иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты.

- 7 008777

В других вариантах осуществления эти способы могут предусматривать дополнительную стадию идентификации субъектов, получавших прежде не-СрС-терапию. но в результате не вылеченных. Рядовые специалисты в данной области. используя предлагаемые здесь способы. смогут идентифицировать таких субъектов. В качестве примера. такие субъекты будут иметь детектируемые вирусные нагрузки в их кровотоке спустя 6 месяцев после прекращения лечения. В некоторых вариантах эти субъекты могут также демонстрировать уменьшение вирусной нагрузки сразу же после лечения. но это уменьшение не будет устойчивым.

В данном изобретении подразумевается лечение субъектов. для которых предыдущая не-СрСтерапия прошла безуспешно. с использованием. помимо прочего. только иммуностимуляторных СрСнуклеиновых кислот или в комбинации с другими активными агентами. такими как описанные ранее для Н8У-инфекции. В широком смысле. иммуностимуляторными СрО-нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты. имеющие по меньшей мере один СрО-динуклеотидный мотив. в котором. по меньшей мере. С этого динуклеотида является неметилированным. Иммуностимуляторные СрСнуклеиновые кислоты включают в себя. не ограничиваясь ими. иммуностимуляторные СрО-нуклеиновые кислоты класса А. класса В и класса С. как описано более полно здесь и в патентах. и патентных заявках. цитируемых здесь и включенных в качестве ссылки. Эти классы иммуностимуляторных СрСнуклеиновых кислот имеют отличающиеся свойства и профили активации.

В важных вариантах осуществления иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С. Согласно данному изобретению неожиданно было обнаружено. что иммуностимуляторные СрО-нуклеиновые кислоты класса С являются предпочтительными в некоторых вариантах осуществления. несмотря даже на то. что эти нуклеиновые кислоты обладают свойствами. промежуточными относительно свойств класса А и класса В. Приведенные здесь примеры показывают. что. несмотря даже на то. что рЭС хронически инфицированных субъектов. не излечиваемых в результате прежней не-СрО-терапии. сами инфицированы Н8У и вследствие этого являются нефункциональными в некоторых аспектах. воздействие на такие клетки иммуностимуляторных СрОнуклеиновых кислот. в частности. иммуностимуляторных кислот класса С. восстанавливает их функцию. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно также. чтобы иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты класса С были либо мягкой. либо полумягкой разновидности. как описано здесь более подробно. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная СрО является полумягкой нуклеиновой кислотой класса С.

В других аспектах иммуностимуляторные СрО-нуклеиновые кислоты используют в комбинации с активными агентами. которые предпочтительно включают в себя активные агенты. описанные ранее для лечения Н8У. Особенно важно использование иммуностимуляторных СрО-нуклеиновых кислот с интерфероном альфа (например. интроном А). Интерфероны. которые могут быть использованы в комбинации с иммуностимуляторными СрО-нуклеиновыми кислотами согласно изобретению. включают в себя. не ограничиваясь ими. интерферон альфа-2Ь. интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа. Здесь описаны и другие антивирусные агенты. Любой из классов СрО может быть использован в этих комбинациях. В качестве примера. согласно изобретению неожиданно было обнаружено. что хотя под действием экзогенно вводимого интерферона альфа лечение этих субъектов безуспешно. при комбинировании с иммуностимуляторными СрО-нуклеиновыми кислотами это средство терапевтически эффективно. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота является иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой класса С. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления она является полумягкой нуклеиновой кислотой класса С.

Времена введения СрО-нуклеиновой кислоты и антивирусного агента (например. интерферона альфа) могут варьировать от субъекта к субъекту и в зависимости от тяжести инфекции. Антивирусный агент может вводиться. по существу. одновременно с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой. Это означает. что эти два агента могут быть объединены перед введением или могут быть объединены в процессе введения (например. с подачей обоих в систему внутривенной инфузии субъекту). или они могут вводиться раздельно. но в пределах периода времени. которого будет достаточно для выполнения двух введений (например. времени для введения субъекту двух инъекций). Независимо от того. вводят ли эти агенты. по существу. одновременно или ступенчато. последовательность введения может варьироваться. Таким образом. в некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная СрОнуклеиновая кислота может вводиться перед антивирусным агентом. таким как ΙΡΝ-α. тогда как в других вариантах осуществления она может вводиться после антивирусного агента.

При применении СрО-нуклеиновых кислот вместе с другими антивирусными агентами (например. ΙΡΝ-α) эти соединения могут вводиться в объединенном количестве. которое является терапевтически эффективным. Таким образом. количество любого соединения может быть субтерапевтическим или супертерапевтическим (т.е. ниже или выше количества. которое было бы терапевтически эффективно при раздельном введении).

Альтернативно. каждое из этих соединений может вводиться в терапевтическом количестве. но комбинация этих агентов создает терапевтическое преимущество. такое как уменьшение побочных дей

- 8 008777 ствий. В предпочтительных вариантах, если антивирусным агентом является ΙΡΝ-α, его вводят в терапевтическом количестве. Независимо от фактически вводимых количеств, комбинация агентов может быть синергической. Синергической является реакция, которая является более высокой, чем аддитивная реакция, ожидаемая от комбинации этих агентов.

В других аспектах и в соответствии с приведенным выше описанием, данное изобретение обеспечивает способы скрининга СрС-нуклеиновых кислот на предмет определения способности стимулировать иммунные клетки, выделенные из субъекта, хронически инфицированного Н8У и не излечиваемого в результате не-СрС-терапии или который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию. Эти способы скрининга обычно выполняют ίη νίΐτο путем приведения в контакт мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой в эффективном количестве, достаточном для стимуляции иммунной реакции. Иммунная реакция может быть оценена по любым показателям, в том числе по продуцированию ΙΡΝ-α, стимуляции В-клеток, секреции цитокинов, таких как 1Ь-6, РС-10, 1Ь-12, интерферон гамма, интерфероны типа 1 (альфа + бета), секреции хемокинов, таких как ΙΡ-10, активности природных клеток-киллеров (ΝΚ), экспрессии костимуляторных молекул (например, СБ80, СБ86) и молекул созревания (например, СБ83) и повышению экспрессии МНС класса ΙΙ.

В некоторых важных вариантах осуществления иммунными клетками являются дендритные клетки и предпочтительно плазмацитоидные дендритные клетки (рБС). и маркеры иммунной реакции являются специфическими для этого типа клеток. Они включают в себя, не ограничиваясь ими, экспрессию костимуляторных молекул (например, СБ80 и СО86), экспрессию молекул созревания (например, СО83), экспрессию и/или секрецию 1Ь-12 и интерферонов типа 1 (альфа + бета) и повышающую регуляцию экспрессии МНС типа II. Должно быть понятно, что эти ίη νίΐτο анализы не зависят от выделения дендритных клеток, таких как рОСЗ из остальных РВМС. Предпочтительнее эти анализы могут проводиться в гомогенных популяциях РВМС.

Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ идентификации субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, подлежащую лечению иммуностимуляторной СрОнуклеиновой кислотой. Этот способ предусматривает воздействие на мононуклеарные клетки периферической крови, полученные у субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, ί) иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой и ίί) иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой и антивирусным агентом (например, интерфероном альфа) и измерение реакции мононуклеарных клеток периферической крови после воздействия. Реакция на иммуностимуляторную СрО-нуклеиновую кислоту служит признаком того, что субъект подлежит лечению иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой, либо после, либо вместо не-СрО-1-терапии (как описано выше, но только после идентификации субъекта, который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию). Реакция на иммуностимуляторную СрО-нуклеиновую кислоту вместе с антивирусным агентом (например, интерфероном альфа), которая сильнее реакции в ответ только на иммуностимуляторную СрО-нуклеиновую кислоту, служит признаком того, что субъект подлежит лечению этой комбинацией. Как здесь описано, антивирусным агентом может быть интерферон альфа, в том числе, но не только, интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа. Предпочтительно мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки, такие как плазмацитоидные дендритные клетки. Данное изобретение дополнительно включает в себя лечение субъектов, идентифицированных, как только что было описано, с использованием либо только иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты, либо в комбинации с антивирусным агентом (например, ΙΡΝ-α), в зависимости от результата указанного скрининг-анализа. Клинические стратегии предусматривают локальное и системное введение ίη νίνο таких нуклеиновых кислот, а также стратегии ех νίνο, в которых рЭС выделенные из нечувствительных Н8Уинфицированных субъектов, активируют ίη νίΐτο иммуностимуляторными нуклеиновыми кислотами и затем повторно инфузируют пациенту локально или системно. Эти терапевтические стратегии могут включать в себя комбинацию с другими факторами роста (1Ь-3, ОМ-С8Р, Г113-лигандом и т.д.), а также с другими стимулами (суперантигенами, вирусными продуктами). Поскольку природный ΙΡΝ-α представляет собой семейство из более чем дюжины отдельных генных продуктов, некоторые из которых имеют уникальные профили активности, клиническое применение природного интерферона может быть предпочтительным в сравнении с рекомбинантным ΙΡΝ-α, полученным на основе единственного рекомбинантного гена ΙΡΝ-α.

В данном изобретении дополнительно предусмотрен способ активации рЭС из инфицированного вирусом гепатита С субъекта. Этот способ предусматривает выделение рБС из субъекта, нуждающегося в таком лечении, культивирование этих выделенных рЭС ίη νίΐτο, контактирование этих рБС ίη νίΐτο с эффективным количеством выделенной иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты и возврат этих проконтактировавших клеток субъекту. Эти клетки могут быть также в контакте ίη νίΐτο с фактором роста или цитокином. Эти иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты и условия, требующиеся для лечения с использованием ΙΡΝ-α в соответствии с данным аспектом изобретения, являются условиями, описанными выше.

- 9 008777

Сам ΙΡΝ-α представляет собой семейство из более чем дюжины родственных, гомологичных белков (изоформ, см. табл. 1 ниже), каждый из которых кодируется уникальным геном и каждый проявляет уникальный профиль активности. Активности различных разновидностей интерферона альфа в отношении вирусов могут отличаться в двадцать раз или более. Продукты ΙΡΝ-α в клиническом применении являются рекомбинантными белками или высокоочищенными природными белками единственной изоформы. В Соединенных Штатах ΙΡΝ-α доступен в виде рекомбинантного П'А-с/2а человека (ΚΟΡΕΚΟΝ-Α), рекомбинантного ΙΡΝ-α2Ρ (ΙΝΤΚΟΝ А) и в виде очищенного природного ΙΡΝ-αη3 (ΑΕΡΕΚΟΝ Ν). Вне Соединенных Штатов ΙΡΝ-α доступен также в виде очищенного ΙΡΝ-αη1 (ΑΕΕΕΡΕΚΟΝ).

Таблица 1

Семейство ΙΡΝ-α человека

ΙΕΝ-αΑ	(1ЕЫ-а2а)
ΙΕΝ-α2	(ΙΕΝ-α2Β)
ΙΕΝ-α4Β	(ΙΕΝ-α4)
ΙΕΝ-αΒ2	(ΙΕΝ-α8)
ΙΕΝ-аС	(ΙΕΝ-αΙΟ)
ΙΕΝ-αϋ	(ΙΕΝ-αΙ)
ΙΕΝ-αΕ	(ΙΕΝ-α21)
ΙΕΝ-аС	(ΙΓΝ-α5)
ΙΕΝ-αΗ2	(ΙΕΝ-α14)
ΙΕΝ-αΙ	(ΙΕΝ-α17)
ΙΕΝ-аЛ	(ΙΕΝ-α7)
ΙΕΝ-αΚ	(ΙΕΝ-α6)
ΙΕΝ-αΜΙ
ΙΕΝ-αΝ
ΙΕΝ-аИА	(ΙΕΝ~α16)

Некоторые из способов согласно изобретению требуют измерения иммунных реакций, детектирующих присутствие ΙΡΝ-α. Анализы на ΙΡΝ-α хорошо известны в данной области. Они включают в себя прямые тесты, например твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), специфичный в отношении по меньшей мере одного ΙΡΝ-α, и непрямые тесты, например функциональные тесты, включающие в себя активацию/цитотоксичность ΝΚ-клеток (ТгшеЫеп О Αάν ]ттипо1 47:187-376 (1989)) и фенотипирование с использованием анализа сортинга клеток с активацией флуоресценции (ΡΆΟ8) для МНС класса Ι. Дополнительные специфические способы анализов, хорошо известные в данной области, могут быть, в частности, использованы в условиях, когда интерес представляет локальная концентрация или локальное присутствие ΙΡΝ-α. Эти способы включают в себя, например, иммуногистохимию, гибридизацию нуклеиновых кислот (например, Нозерн-блоттинг), Вестерн-блоттинг с использованием обратной транскриптазы/полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) и ОТ/ПЦР ΐη зйи. Внутриклеточный ΙΡΝ-α может быть также детектирован с использованием проточной цитометрии.

Данное изобретение в некоторых аспектах включает в себя измерение активации р[)С. Активация р[)С может анализироваться различными путями. Они включают в себя продуцирование ΙΡΝ-α, экспрессию костимуляторных молекул (например, СО80 и СО86), экспрессию молекул созревания (например, СО83), экспрессию Ш-12 и повышение экспрессии МНС класса ΙΙ. В отличие от введения экзогенного ΙΡΝ-α, активация р[)С приводит к образованию различных, если не всех, форм ΙΡΝ-α, а также интерферонов другого типа Ι, таких как ΙΡΝ-β. Таким образом, в некоторых вариантах р!)С активируются, что определяется по их способности продуцировать интерфероны типа Ι, в том числе ΙΡΝ-α.

В данном изобретении предусмотрены различные способы с использованием иммуностимуляторных нуклеиновых кислот.

Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой является молекула нуклеиновой кислоты, которая при контактировании с клетками иммунной системы сама способна стимулировать контактирующие клетки иммунной системы к пролиферации и/или превращения их в активированные клетки. Это контактирование может быть прямым или опосредованным, например, такая иммуностимуляторная нуклеиновая кислота может напрямую стимулировать иммунные клетки первого типа для экспрессии продукта, который может, в свою очередь, стимулировать иммунные клетки второго типа, которые не были под- 10 008777 вергнуты действию иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты или не реагируют на эту иммуностимуляторную нуклеиновую кислоту. Это иммуностимуляторное действие иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты является отдельным от действия любого продукта, который может, вероятно, кодироваться последовательностью этой иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты. Подобным образом, иммуностимуляторное действие иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты отличается от любого антисмыслового механизма и не основано на каком-либо антисмысловом механизме.

Только определенные нуклеиновые кислоты являются иммуностимуляторными нуклеиновыми кислотами. Сначала считалось, что определенные палиндромные последовательности являются иммуностимуляторными. Токииада Т. с1 а1., М1стоЬю1 1ттипо1 36:55-66 (1992); УататоЮ Т. с1 а1., Аийкеике Кек Беу 4:119-22 (1994). Последующие исследования показали, что непалиндромные последовательности также являются иммуностимуляторными, при условии, что они содержат СрС-динуклеотиды в конкретных контекстах последовательности (СрС-мотивах) Кпед А.М. е1 а1., №1Шге 374:546-9 (1995).

Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Обычно двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот являются более стабильными ίη у1уо, тогда как одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот имеют повышенную иммунную активность. Таким образом, в некоторых аспектах согласно изобретению предпочтительно, чтобы иммуностимуляторная нуклеиновая кислота была одноцепочечной, а в других аспектах предпочтительно, чтобы иммуностимуляторная нуклеиновая кислота была двухцепочечной.

Способы и продукты, обеспеченные в соответствии с данным изобретением, относятся к применению СрО-олигонуклеотидов. СрО-ΟΌΝ запускает большинство (>95%) В-клеток в отношении пролиферации, секреции иммуноглобулина (1д), 1Ь-6 и 1Ь-12 и делает их защищенными от апоптоза. Кроме того, СрО-ΟΌΝ вызывают созревание БС, а также прямо активируют БС, моноциты и макрофаги в плане секреции ΙΡΝ-α/β, 1Ь-6, 1Ь-12, ОМ-С8Р, хемокинов и ΤΝΡ-α. Эти цитокины стимулируют природные клетки-киллеры (ΝΚ) в плане секреции ΙΡΝ-γ и имеют увеличенную литическую активность. В целом СрО индуцирует сильное Т111-подобное распределение продуцирования цитокинов, в котором доминируют 1Ь-12 и ΙΡΝ-γ, с малой секрецией ТЬ2-цитокинов.

Кроме индукции природных иммунных реакций, СрО-ДНК усиливает также антигенспецифические реакции вследствие (ί) сильного синергизма между путями передачи сигналов В-клеток, запускаемых через рецептор В-клеточного антигена, и посредством СрО, (ίί) Тй1-подобных цитокинов, которые заменяют или усиливают антигенспецифическую Т-помощь, усиливая как специфические для В-клеточных антигенов, так и специфические для Т-клеточных антигенов реакции, и (ш) повышающей регуляции костимуляторных молекул, которые требуются для клеточных реакций.

Было показано, что СрО-ΟΌΝ является сильным адъювантом для НВкАд у мышей Ва1Ь/с с явными Тй1-подобными реакциями (преимущественно антителами 1дО2а и сильными СТЬ) (49). Было обнаружено, что СрО-ΟΌΝ превосходит другие адъюванты ТЬ1, такие как монофосфориллипид А (МРЬ, Сопха) или даже полный адъювант Фрейнда (СРА), который слишком токсичен для использования на человеке. Сходные результаты сообщались с использованием СрО-ΟΌΝ со множеством других антигенов (47, 5053). Сообщалось также, что СрО-ΟΌΝ изменяют направление ТЬ2-реакции, ранее установленное иммунизацией ТЬ2-антигеном (т.е. поверхностным антигеном 8сЫ51о5от1а515) (54) или Тй2-адъювантом (т.е. квасцами).

Имеются по меньшей мере три основных класса СрО-ΟΌΝ, которые, как обнаружено, эффективны в стимуляции РВМС здорового человека (табл. I). Они вызывают разные эффекты, которые, вероятно, ассоциированы с различными способами действия, при помощи которых СрО-ΟΌΝ могут стимулировать иммунные клетки.

СрО-ΟΌΝ В класса синтезируются с нуклеаза-резистентными фосфоротиоатными скелетами и обычно характеризуются хорошей активацией В-клеток и БС, приводящей к продуцированию 1Ь-12 и антитела, но только ограниченной активацией ΝΚ-клеток. Этот класс ΟΌΝ хорошо функционирует в качестве вакцинного адъюванта, как уже было продемонстрировано при тестировании СрО (члена этого класса) в клиническом испытании фазы Ι/ΙΙ (8ЕО ΙΌ ΝΟ:2) в качестве адъюванта в отношении коммерческой вакцины гепатита В (60).

СрО-ΟΌΝ класса А синтезируются с химерным скелетом, в котором 5'- и З'-концы являются фосфоротиоатными, а район центрального СрО-мотива является фосфордиэфирным. Эти ΟΌΝ характеризуются хорошей активацией ΝΚ-клеток и БС, приводящей к большему продуцированию ΙΡΝ-α, но ограниченной активации В-клеток.

СрО-ΟΌΝ класса С синтезируются с фосфоротиоатным скелетом и имеют стимуляторные свойства, промежуточные относительно двух других классов СрО-ΟΌΝ (например, хорошую активацию В-клеток, а также активацию ΝΚ-клеток и БС).

- 11 008777

Таблица I Характер иммунной активации ίη νίΐίο, индуцируемой тремя различными классами СрС-ΟΩΝ

Класс	Скелет	вклетки	Природные клетки- киллеры	Дендритные клетки	ΙΡΝ- α
А	ЗОЗ2	+	++++	++++	++++
В	З1	++++	++	++++	+
С	з1	+++	+++	+++	+++

¹8-ΟΏΝ приготовлены с фосфоротиоатным скелетом ²8Ο8-ΟΏΝ приготовлены с химерным скелетом, в котором центральный СрС-содержащий район имеет фосфодиэфирные связи, а 3'- и 5'-концы ΟΩΝ приготовлены с фосфоротиоатными связями

Способы согласно изобретению могут включать в себя использование иммуностимуляторных СрСнуклеиновых кислот класса А, класса В и класса С. Что касается СрС-нуклеиновых кислот, недавно было описано, что имеются различные классы СрС-нуклеиновых кислот. Один класс является сильным в отношении активации В-клеток, но относительно слабым в индукции активации ΙΡΝ-α и ΝΚ-клеток; этот класс был назван классом В. СрС-нуклеиновые кислоты класса В обычно являются полностью стабилизированными и включают в себя неметилированный СрС-динуклеотид в определенных предпочтительных контекстах оснований. См., например, патенты США №№ 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Другой класс является сильным в индукции активации ΙΡΝ-α и ΝΚ-клеток, но относительно слабым в стимуляции В-клеток; этот класс был назван классом А. СрС-нуклеиновые кислоты класса А обычно имеют стабилизированные поли-С-последовательности на 5'- и 3'-концах и палиндромную фосфодиэфирную СрС-динуклеотидсодержащую последовательность по меньшей мере из 6 нуклеотидов. См., например, опубликованную патентную заявку РСТ/и8 00/26527 (^Ο 01/22990). Еще один класс СрС-нуклеиновых кислот активирует В-клетки и ΝΚ-клетки и индуцирует ΙΡΝ-α; этот класс был назван классом С. СрС-нуклеиновые кислоты класса С как первого охарактеризованного класса обычно являются полностью стабилизированными, включают в себя последовательность типа В-класса и ССбогатый палиндром или почти палиндром. Этот класс был описан в предварительной заявке США 60/313273, поданной 17 августа 2001 г., И8 10/224523, поданной 19 августа 2002 г., содержание которых в полном объеме включено здесь в качестве ссылки.

Иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты класса А были описаны в непредварительной патентной заявке США с регистрационным номером 09/672126 и опубликованной РСТ-заявке РСТ/и8 00/26527 (^Ο 01/22990), обе поданы 27 сентября 2000 г. Эти нуклеиновые кислоты характеризуются способностью индуцировать высокие уровни интерферона альфа, при этом минимально воздействуя на активацию В-клеток.

Иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты класса А необязательно содержат гексамерный палиндром САССТС, АССССТ или ААССТТ, описанные Уатато!о и сотр. (Уатато!о 8. е! а1. Р 1ттиηο1 148:4072-6 (1992)).

Примеры последовательностей иммуностимуляторных нуклеиновых кислот класса А описаны в непредварительной патентной заявке США с регистрационным номером 09/672126 и опубликованной РСТзаявке РСТ/И8 00/26527 (^Ο 01/22990), обе поданы 27 сентября 2000 г.

Иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты класса В сильно активируют В-клетки человека, но минимально воздействуют на индукцию интерферона-α. Иммуностимуляторные СрС-нуклеиновые кислоты класса А были описаны в патентах США 6194388 В1 и 6239116 В1, поданных 27 февраля 2001 г. и 29 мая 2001 г. соответственно.

СрС-олигонуклеотиды согласно изобретению являются олигонуклеотидами, которые включают в себя по меньшей мере один неметилированный СрС-динуклеотид. Олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере один неметилированный СрС-динуклеотид, является молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит неметилированную цитозин-гуанин-динуклеотидную последовательность (т.е. СрС-ДНК или ДНК, содержащую 5'-цитозин, за которым следует 3'-гуанин, связанные фосфатной связью) и активирует иммунную систему. Весь СрС-олигонуклеотид может быть неметилированным или части могут быть неметилированными, но, по меньшей мере, С мотива 5'-СС-3' должен быть неметилированным. Термины СрС-олигонуклеотид или СрС-нуклеиновая кислота в данном контексте относятся к иммуностимуляторному СрС-олигонуклеотиду или СрС-нуклеиновой кислоте, если нет другого указания.

В одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает СрС-олигонуклеотид класса В, представленный, по меньшей мере, формулой

5' Х₁Х₂ССХ₃Х₄ 3', где Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ являются нуклеотидами. В одном варианте осуществления Х₂ является аденином, гуанином или тимином. В другом варианте осуществления Х3 является цитозином, аденином или тимином.

- 12 008777

В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает СрО-олигонуклеотид класса В, представленный, по меньшей мере, формулой

5' ^Х₁Х₂СОХ₃Х^₂ 3', где Χι, Х₂, Х₃ и Х₄ являются нуклеотидами и N означает любой нуклеотид и Ν₁ и Ν₂ являются последовательностями нуклеиновой кислоты, состоящими приблизительно из 0-25 Ν, каждая. В одном варианте осуществления Х1Х2 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ОрТ, ОрО, ОрА, АрА, АрТ, АрО, СрТ, СрА, СрО, ТрА, ТрТ и ТрО; и Х3Х4 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, АрТ, ТрО, АрО, СрО, ТрС, АрС, СрС, ТрА, АрА и СрА. Предпочтительно Х1Х₂ является ОрА или ОрТ, а Х3Х4 является ТрТ. В других вариантах осуществления Х1 или Х2 оба являются пуринами, а Х3 или Х4 оба являются пиримидинами, или Х1Х2 является ОрА, а Х3 и Х4 оба являются пиримидинами. В другом предпочтительном варианте осуществления Х1Х2 является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрА, АрА, АрС, АрО и ОрО. Еще в одном варианте осуществления Х₃Х₄ является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, ТрА, ТрО, АрА, АрО, ОрА и СрА. В другом варианте осуществления Х1Х₂ является динуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из ТрТ, ТрО, АрТ, ОрС, СрС, СрТ, ТрС, ОрТ и СрО; Х3 является нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из А и Т, а Х₄ является нуклеотидом, но при этом, когда Х1Х₂ является ТрС, ОрТ или СрО, тогда Х3Х4 не является ТрС, АрТ или АрС.

В другом предпочтительном варианте осуществления СрО-олигонуклеотид имеет последовательность 5' ТСНТХ|Х₂СОХ₃Х₄ 3' (8ЕО ΙΌ ΝΟ:26). СрО-олигонуклеотиды согласно изобретению в некоторых вариантах осуществления включают в себя Х1Х2, выбранный из группы, состоящей из ОрТ, ОрО, ОрА и АрА, а Х3Х4 выбран из группы, состоящей из ТрТ, СрТ и ТрС.

Последовательности СрО-нуклеиновых кислот класса В согласно изобретению являются последовательностями, широко описанными выше, а также описанными в опубликованных патентных заявках РСТ: РСТ/И8 95/01570 и РСТ/И8 97/19791 и И8Р 6194388 и И8Р 6239116 В1, выданных 27 февраля 2001 г. и 29 мая 2001 г. соответственно. Примеры последовательностей включают в себя, не ограничиваясь ими, последовательности, описанные в этих последних заявках и патентах.

Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты класса С содержат по меньшей мере два отличающихся мотива и оказывают уникальные и желаемые стимуляторные действия на клетки иммунной системы. Некоторые из этих ΟΌΝ имеют как традиционную стимуляторную СрО-последовательность, так и ОС-богатый или нейтрализующий В-клетки мотив. Эти нуклеиновые кислоты с комбинированными мотивами оказывают иммуностимуляторные действия, которые можно расположить где-то между эффектами, связанными с традиционными СрО-ΟΌΝ класса В, которые являются сильными индукторами активации В-клеток и активации дендритных клеток (ОС), и эффектами, связанными с позже описанным классом иммуностимуляторных нуклеиновых кислот (СрО-ΟΌΝ класса А), которые являются сильными индукторами ΙΡΝ-α и активации природных клеток-киллеров (ΝΚ), но относительно слабыми индукторами активации В-клеток и ОС. Кпед А.М. е! а1. (1995) №1Ц|ге 374:546-9; Ва11а§ Ζ.Κ. е! а1. (1996) 1 1ттипо1 157:1840-5; УататоЮ 8. е! а1. (1992) 1 1ттипо1 148:4072-6. Хотя предпочтительные СрО-ΟΌΝ класса В часто имеют фосфортиоатные скелеты, а предпочтительные СрО-ΟΌΝ класса А имеют смешанные или химерные скелеты, иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты с комбинированными мотивами класса С могут иметь или стабилизированные, например, фосфортиоатные, химерные или фосфодиэфирные скелеты, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления они имеют полумягкие скелеты.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты, принадлежащие этому новому классу иммуностимуляторных нуклеиновых кислот с комбинированными мотивами. Домен, стимулирующий В-клетки, определяется формулой 5' Х₁ЭССНХ₂ 3'. Ό означает нуклеотид, отличный от С. С означает цитозин, О означает гуанин. Н означает нуклеотид, отличный от О.

Х1 и Х2 означают любую последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-10 нуклеотидов. Х1 может включать в себя СО, и в этом случае предпочтительно, чтобы Т находился непосредственно перед этим СО. В некоторых вариантах осуществления ОСО означает ТСО. Х₁ имеет длину предпочтительно 06 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления Х2 не содержит мотивов поли-О или поли-А. В других вариантах осуществления эта иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет поли-Тпоследовательность на 5'- или на 3'-конце. В данном контексте «поли-А» или «поли-Т» будет относиться к отрезку из четырех или более последовательных А или Т, соответственно, например, 5' АААА 3' или 5' ТТТТ 3'.

В данном контексте «поли-О-конец» будет означать отрезок из четырех или более последовательных О, например, 5' ОООО 3', встречающихся на 5'-конце или 3'-конце нуклеиновой кислоты. В данном контексте «поли-О-нуклеиновая кислота» будет означать нуклеиновую кислоту, имеющую формулу 5' Х₄Х₂ОООХ₃Х₄ 3', где Х₄, Х₂, Х₃ и Х₄ являются нуклеотидами и предпочтительно по меньшей мере один из Х3 и Х4 означает О.

Некоторые предпочтительные конструкции стимулирующего В-клетки домена под этой формулой включают в себя ТТТТТСО, ТСО,ТТСО, ТТТСО, ТТТТСО, ТСОТ, ТТСОТ, ТТТСОТ, ТСОТСОТ.

- 13 008777

Второй мотив этой нуклеиновой кислоты называют или Р, или Ν, и он расположен непосредственно со стороны 5' от Х₁ или непосредственно со стороны 3' от Х₂.

Ν является нейтрализующей В-клетки последовательностью, которая начинается с тринуклеотида ССС и имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов. Нейтрализующий В-клетки мотив включает в себя по меньшей мере одну СрС-последовательность, в которой СС предшествует С или за ней следует С (Кпед А.М. е1 а1. (1998) Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. И8А 95:12631-12636), или он является СС-содержащей ДНК-последовательностью, в которой С динуклеотида СС является метилированным. В данном контексте «СрС» означает 5' цитозин (С), за которым следует 3' гуанин (С), и они связаны фосфатной связью. По меньшей мере С динуклеотида 5' СС 3' должен быть неметилированным. Нейтрализующие мотивы являются мотивами, которые имеют некоторую степень иммуностимуляторной способности, когда они присутствуют в противном случае нестимуляторном мотиве, которые, при их присутствии в контексте других иммуностимуляторных мотивов, служат для уменьшения иммуностимуляторного потенциала этих других мотивов.

Р является СС-богатой палиндром-содержащей последовательностью с длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов. В данном контексте «палиндром» и эквивалентно «палиндромная последовательность» будет относиться к инвертированному повтору, т.е. последовательности, такой как АВСОЕЕ'О'С'В'А'. в которой А и А' , В и В' и т. д. являются основаниями, способными образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика.

В данном контексте «СС-богатый палиндром» относится к палиндрому, имеющему состав оснований, по меньшей мере на две трети состоящий из С и С. В некоторых вариантах осуществления ССбогатый домен находится предпочтительно со стороны 3' от В-клетки стимулирующего домена. В случае СС-богатого палиндрома из 10 оснований, этот палиндром, следовательно, содержит по меньшей мере 8 С и С. В случае СС-богатого палиндрома из 12 оснований, этот палиндром также содержит по меньшей мере 8 С и С. В случае 14-мерного СС-богатого палиндрома по меньшей мере 10 оснований этого палиндрома являются С и С. В некоторых вариантах этот СС-богатый палиндром готовят исключительно из С и С.

В некоторых вариантах осуществления СС-богатый палиндром имеет состав оснований, по меньшей мере на 81% состоящий из С и С. В случае такого СС-богатого палиндрома с длиной 10 оснований этот палиндром следовательно состоит исключительно из С и С. В случае такого СС-богатого палиндрома с длиной 12 оснований предпочтительно, чтобы по меньшей мере десять оснований (83%) этого палиндрома составляли С и С. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления СС-богатый палиндром из 12 оснований приготовлен исключительно из С и С. В случае 14-мерного СС-богатого палиндрома по меньшей мере двенадцать оснований (86%) этого палиндрома являются С и С. В некоторых предпочтительных вариантах этот СС-богатый палиндром из 14 оснований готовят исключительно из С и С. Основания С в СС-богатом палиндроме могут быть неметилированными или метилированными.

Обычно этот домен имеет по меньшей мере 3 С и С, более предпочтительно - по 4 каждого из них и наиболее предпочтительно - по 5 или более каждого из них. Количество С и С в этом домене не обязательно должно быть одинаковым. Предпочтительно, чтобы основания С и С в этом домене не были аранжированы таким образом, чтобы они образовывали самокомплементарный дуплекс, или палиндром, такой как СССССССС. Он может прерываться А или Т, но предпочтительно, чтобы самокомплементарность была, по меньшей мере, частично сохранена, как, например, в мотивах ССАССТТССТСС (8ЕО ΙΌ N0:27) или ССССССССТСССС (8ЕО ΙΌ N0:28). Когда комплементарность не сохранена, предпочтительно, чтобы некомплементарными парами оснований были ТС. В предпочтительном варианте имеется не более чем 3 последовательных основания, которые не являются частью этого палиндрома, предпочтительно не более чем 2 и наиболее предпочтительно не более чем 1. В некоторых вариантах СС-богатый палиндром включает в себя по меньшей мере один тример ССС, по меньшей мере один тример ССС или по меньшей мере один тетрамер СССС. В других вариантах осуществления СС-богатый палиндром не является СССССССССССС (8ЕО ΙΌ N0:29) или СССССССССССС (8ЕО ΙΌ N0:30), СССССССССС (8ЕО ΙΌ N0:31) или СССССССССС (8ЕО ΙΌ N0:32).

По меньшей мере один из С СС-богатого района может быть заменен инозином (Ι). В некоторых вариантах осуществления Р включает в себя более чем один Ι.

В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет одну из следующих формул 5' Х'Х-ПСОНХ; 3', 5' Х-ПССНХЛ 3', 5' РХ-ПСОНХ; 3', 5' Х-ПСОНХ.-Р 3', 5' Х1ОССНХ₂РХ₃ 3', 5' Х^ССНРХз 3', 5' БССНХ₂РХ₃ 3', 5' ТССНХ₂РХ₃ 3', 5' БССНРХ₃ 3' или 5' БССНР 3'.

В других аспектах данного изобретения предложены иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты, которые определяются формулой 5' ^РуС^Р 3'. N1 означает любую последовательность длиной 1-6 нуклеотидов. Ру означает пиримидин, С означает гуанин. N означает любую последовательность из 0-30 нуклеотидов. Р означает СС-богатый палиндром, содержащий последовательность длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов.

N и N могут содержать более чем 50% пиримидинов и предпочтительно более чем 50% Т. N может включать в себя СС, и в этом случае предпочтительно, чтобы Т непосредственно предшествовал СС. В некоторых вариантах осуществления ^РуС является ТСС (например, 0^N 5376, который имеет 5'

- 14 008777

ТССС). и наиболее предпочтительно ТССИ₂. где Ν₂ не является С.

Ν|ΡνΟΝ_;Ρ может включать в себя один или более инозиновых (I) нуклеотидов. Или С. или С в N может быть заменен инозином. но Ср1 является предпочтительным в сравнении с 1рС. Для замен инозином. таких как 1рС. оптимальная активность может быть достигнута с использованием «полумягкого» или химерного скелета. где связь между 1С или С1 является фосфодиэфирной. N может включать в себя по меньшей мере один мотив С1. ТС1. 1С или Т1С.

В некоторых вариантах осуществления ΝιΡγΟΝ₂ является последовательностью. выбранной из группы. состоящей из ТТТТТСС. ТСС. ТТСС. ТТТСС. ТТТТСС. ТССТ. ТТССТ. ТТТССТ и ТССТССТ.

Некоторые неограничивающие примеры нуклеиновых кислот класса С включают в себя

3Εζ} Ю ΝΟ:	Последовательность
17	т*с с*с е*т*с с*т*т*с с*с*с*с*с с*с*с*с*с*с
18	Т*С С*Т*С С*А*С 6*Т*Т*С с*с*с*с*с е*с*с*с*с*с
19	Т*С С*С*А*С б*т*т*с С*6*С*С*С е*с*с*с*с*с
20	Т*С 6*6*А*С С*Т*Т*С С*С*С*6*С*С*С*С*6
21	Т*С 6*С 6*Т*С С*Т*Т*С С*С*С*С*С*6*С*С*0
22	Т*С С*А*С С*Т*Т*С 6*6*С*С*С С*С*С*С*С*6
23	Т*С С*А*С 6*Т*Т*С С*6*С*С*С*6*С*С*6
24	Т*С 6*С 6*Т*С С*Т*Т*С С*6*С*6*С*С*6
25	Т*С С*С С*А*С е*Т*Т*С 6*6*С*6*С 6*С*6*С*С*6

Для облегчения поглощения в клетки иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты. в том числе СрС-содержащие олигонуклеотиды. имеют предпочтительно длину в диапазоне 8-100 оснований. Однако нуклеиновые кислоты любого размера. большего чем 8 нуклеотидов (даже длиной во много т.п.н.). способны индуцировать иммунную реакцию в соответствии с данным изобретением. если присутствует достаточное количество иммуностимуляторных мотивов. так как нуклеиновые кислоты большей длины деградируются до олигонуклеотидов внутри клеток. Предпочтительно длина иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты варьирует в диапазоне 8-100 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют в длину 12-40 нуклеотидов. В более предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют длину 8-30 нуклеотидов. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты имеют длину 8-24 нуклеотида.

Палиндромная последовательность будет означать инвертированный повтор. т.е. последовательность. такую как ΛΒΤΌΕΕΌΌΒ'Λ'. в которой А и А'. В и В'. С и С. Ό и Ό' и Е и Е' являются основаниями. способными образовывать обычные пары оснований Уотсона-Крика. Ιη νίνο такие палиндромные последовательности могут образовывать двухцепочечные структуры. В одном варианте осуществления СрС-олигонуклеотид содержит палиндромную последовательность. Палиндромная последовательность в этом контексте означает палиндром. в котором СрС является частью этого палиндрома и предпочтительно является центром этого палиндрома. В другом варианте осуществления СрС-олигонуклеотид не содержит палиндрома. СрС олигонуклеотид. который не содержит палиндрома. является СрСолигонуклеотидом. в котором СрС-динуклеотид не является частью палиндрома. Такой олигонуклеотид может включать в себя палиндром. в котором СрС не является центром этого палиндрома.

В некоторых вариантах осуществления согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды включают в себя иммуностимуляторные мотивы. которые являются СрС-динуклеотидами. СрСдинуклеотид может быть метилированным или неметилированным. Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой. содержащей по меньшей мере один неметилированный СрС-динуклеотид. является молекула нуклеиновой кислоты. которая содержит неметилированную динуклеотидную последовательность цитозин-гуанин (т.е. неметилированный 5'-цитидин. за которым следует З'-гуанозин. которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему; такой иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой является СрС-нуклеиновая кислота. СрС-нуклеиновые кислоты были описаны в ряде патентов. опубликованных патентных заявках и других публикациях. в том числе патентах США с номерами 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Иммуностимуляторной нуклеиновой кислотой. содержащей по меньшей мере один метилированный СрС-динуклеотид. является нуклеиновая кислота. которая содержит метилированную динуклеотидную последовательность цитозин-гуанин (т. е. метилированный 5'-цитидин. за которым следует 3'-гуанозин. которые связаны фосфатной связью) и которая активирует иммунную систему. В других вариантах осуществления иммуностимуляторные олигонуклеотиды не содержат СрС-динуклеотидов. Олигонуклеотиды. которые не содержат СрС-динуклеотидов. называют не-СрС-олигонуклеотидами. и они имеют не-СрС-иммуностимуляторные мотивы. Таким образом. данное изобретение включает в себя также нуклеиновые кислоты с другими типами иммуностимуляторных мотивов. которые могут быть метилированы или неметилированы. Иммуностимуляторные олигонуклеотиды согласно изобретению могут дополнительно включать в себя любую комбинацию метилиро

- 15 008777 ванных и неметилированных иммуностимуляторных СрС- и не-СрС-мотивов.

Молекулы иммуностимуляторных нуклеиновых кислот могут иметь химерный скелет. Для целей согласно изобретению химерный скелет означает частично стабилизированный скелет, в котором по меньшей мере одна межнуклеотидная связь является фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной и в котором по меньшей мере одна другая межнуклеотидная связь является стабилизированной межнуклеотидной связью, причем эта по меньшей мере одна фосфодиэфирная связь или фосфодиэфироподобная связь и эта по меньшей мере одна стабилизированная связь являются различными. Поскольку сообщалось, что боранофосфонатные связи являются стабилизированными относительно фосфодиэфирных связей, для целей химерного характера скелета, боранофосфонатные связи могут быть классифицированы как фосфодиэфироподобные или как стабилизированные, в зависимости от контекста. Например, химерный скелет в соответствии с данным изобретением мог бы в одном варианте осуществления включать в себя по меньшей мере одну фосфодиэфирную (фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную) связь и по меньшей мере одну боранофосфонатную (стабилизированную) связь. В другом варианте осуществления химерный скелет в соответствии с данным изобретением мог бы включать в себя боранофосфонатные (фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные) и фосфоротиоатные (стабилизированные) связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь будет означать межнуклеотидную связь, которая является относительно устойчивой к деградации ίη νίνο (например, экзо- или эндонуклеазой) в сравнении с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. Предпочтительные стабилизированные межнуклеотидные связи включают в себя, без ограничения, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные и метилфосфортиоатные связи. Другие стабилизированные межнуклеотидные связи включают в себя, без ограничения, пептидные, алкильные, дефосфо- и другие связи, описанные выше.

Модифицированные скелеты, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с помощью автоматизированных способов, с использованием или фосфорамидатной, или Н-фосфонатной химии. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США № 4469863; а алкилфосфотриэфиры (в которых заряженную кислородную часть алкилируют, как описано в патенте США № 5023243 и европейском патенте № 092574) могут быть получены путем автоматизированного твердофазного синтеза с использованием коммерчески доступных реагентов. Способы получения других модификаций и замен скелетов ДНК были описаны. ИЫтапп Е. с1 а1. (1990) СЕет Вет 90:544; Соойс1и1й 1 (1990) В1осоп)ида1е СЕет 1:165. Способы получения химерных олигонуклеотидов также известны. Например, такие способы описаны в патентах, выданных на имя ИЫтапп е1 а1.

Смешанные ΟΌΝ с модифицированными скелетами могут быть синтезированы с использованием коммерчески доступного ДНК-синтезатора и стандартной фосфорамидитной химии. (Ρ.Ε. Ескйеш, Ο1ίдопиЫеоййек апй Апа1одие§ - А РгасйсЫ АрргоасЕ ШИ Ргекк, Οχίοτά, ИК, 1991 и Μ.Ό. МаПеисс! апй М. Н. СагЫйегк, Те1гаЕейгоп Ьей. 21, 719 (1980)). После связывания Р8-связи вводят путем сульфурирования с использованием реагента Веаисаде (В.Р. Вег ^. Едап, кВ. Ведап апй 8.Ь. Веаисаде, 1. Ат. СЕет. 8ос. 112, 1253 (1990)) (0,075 М в ацетонитриле) или фенилацетилдисульфида (РАИ8) с последующим блокированием уксусным ангидридом, 2,6-лутидином в тетрагидрофуране (1:1:8; об./об./об.) и Νметилимидазолом (16% в тетрагидрофуране). Эту стадию блокирования выполняют после реакции сульфурирования для минимизации образования нежелательных фосфодиэфирных (РО) связей в положениях, в которых должна быть расположена фосфоротиоатная связь. В случае введения фосфодиэфирной связи, например, при СрС-динуклеотиде, промежуточный фосфор-ΙΙΙ окисляют путем обработки раствором иода в смеси вода/пиридин. После отщепления от твердого носителя и конечного удаления защитных групп обработкой концентрированным аммиаком (15 ч при 50°С) ΟΌΝ анализируют при помощи ВЭЖХ на колонке Сеп-Рак Ρаx (М|Шроге-Аа1ег5) с использованием градиента №1С1 (например, буфер А: 10 мМ NаН₂РΟ₄ в смеси ацетонитрил/вода = 1:4/об./об. рН 6,8; буфер В: 10 мМ NаН₂РΟ₄, 1,5 М №1С1 в смеси ацетонитрил/вода = 1:4/об./об. 5-60% В в течение 30 мин при 1 мл/мин) или капиллярного гельэлектрофореза. ΟΌΝ может быть очищен при помощи ВЭЖХ или при помощи ГРБС (жидкостной экспресс-хроматографии белков) на колонке 8оигсе Н1дЕ РегГогтапсе (АтегкЕат РЕагтаЫа). ВЭЖХгомогенные фракции объединяют и обессоливают с использованием колонки С18 или ультрафильтрации. ΟΌΝ анализировали ΜА^^I-ТΟΡ-масс-спектрометрией для подтверждения рассчитанной массы.

Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут также включать в себя другие модификации. Они включают в себя неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная часть молекулы алкилирована. Было показано, что нуклеиновые кислоты, которые содержат диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, или на одном, или на обоих концах, являются, по существу, резистентными к деградации нуклеазами.

В некоторых вариантах осуществления эти олигонуклеотиды могут быть мягкими или полумягкими олигонуклеотидами. Мягким олигонуклеотидом является иммуностимуляторный олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированный скелет, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи встречаются только в по меньшей мере одном внутреннем динуклеотиде пиримидин-пурин (ΥΖ) или непосредственно рядом с ним. Предпочтительно ΥΖ представляет собой ΥΠ динуклеотид пиримидин-гуанозин (ΥΠ). Этот по меньшей мере один внутренний ΥΖ-динуклеотид сам

- 16 008777 имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. Фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь, находящаяся непосредственно рядом по меньшей мере с одним внутренним ΥΖ-динуклеотидом, может быть со стороны 5'-, со стороны 3'- или как 5'-, так и 3'относительно по меньшей мере одного внутреннего ΥΖ-динуклеотида.

В частности, фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи включают в себя «внутренние динуклеотиды». Внутренний динуклеотид обычно будет означать любую пару смежных нуклеотидов, соединенных межнуклеотидной связью, в которой ни один из нуклеотидов не является концевым нуклеотидом, т.е. ни один из нуклеотидов в этой паре не является определяющим 5'- или 3'конец этого олигонуклеотида.

Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет длину η нуклеотидов, имеет всего η-1 динуклеотидов и только η-3 внутренних динуклеотидов. Каждая межнуклеотидная связь во внутреннем динуклеотиде является внутренней межнуклеотидной связью. Таким образом, линейный олигонуклеотид, который имеет в длину η нуклеотидов, имеет всего η-1 динуклеотидов и только η-3 внутренних динуклеотидов. Таким образом, стратегически расположенными фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными межнуклеотидными связями являются фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи, расположенные между любой парой нуклеотидов в последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эти фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи не расположены между любой парой нуклеотидов, ближайшей к 5'- или 3'концу.

Предпочтительно фосфодиэфирная или фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь, встречающаяся непосредственно рядом по меньшей мере с одним внутренним ΥΖ-динуклеотидом, сама является внутренней межнуклеотидной связью. Таким образом, для последовательности Ν₁ΥΖΝ₂, где каждый из Ν₁ и Ν₂ независимо друг от друга являются любым единственным нуклеотидом, этот ΥΖ-динуклеотид имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и, кроме того, (а) Ν₁ и Υ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда Ν₁ является внутренним нуклеотидом, (Ь) Ζ и Ν₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда Ν₂ является внутренним нуклеотидом, или (с) Ν₁ и Υ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда Ν1 является внутренним нуклеотидом, и Ζ и Ν2 связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, когда Ν₂ является внутренним нуклеотидом.

Считается, что мягкие олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением являются относительно чувствительными к нуклеазному расщеплению в сравнении с полностью стабилизированными олигонуклеотидами. Не желая связывать себя конкретной теорией или конкретным механизмом, авторы изобретения считают, что мягкие олигонуклеотиды согласно изобретению могут расщепляться до фрагментов с уменьшенной иммуностимуляторной активностью или с отсутствием иммуностимуляторной активности относительно полноразмерных мягких олигонуклеотидов. Считается, что включение по меньшей мере одной чувствительной к нуклеазам межнуклеотидной связи, в частности, вблизи середины этого олигонуклеотида, обеспечивает «выключение», которое изменяет фармакокинетику этого олигонуклеотида таким образом, что уменьшается продолжительность максимальной иммуностимуляторной активности этого олигонуклеотида. Это может быть особенно ценным в тканях и в клинических приложениях, в которых желательно избегать повреждения, связанного с хроническим локальным воспалением или хронической локальной иммуностимуляцией, например, в почке.

Полумягким олигонуклеотидом является иммуностимуляторный олигонуклеотид, имеющий частично стабилизированный скелет, в котором фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи встречаются только внутри по меньшей мере одного внутреннего пиримидин-пурин (ΥΖ)динуклеотида. Полумягкие олигонуклеотиды обычно обладают увеличенной иммуностимуляторной силой относительно соответствующих полностью стабилизированных иммуностимуляторных олигонуклеотидов. Вследствие более высокой силы полумягких олигонуклеотидов, полумягкие олигонуклеотиды могут использоваться, в некоторых случаях, при более низких эффективных концентрациях и имеют более низкие эффективные дозы, чем обычные полностью стабилизированные олигонуклеотиды, для достижения желаемого биологического действия.

Считается, что вышеуказанные свойства полумягких олигонуклеотидов обычно увеличиваются с увеличением «дозы» внутренних ΥΖ-динуклеотидов, включающих в себя фосфодиэфирные или фосфодиэфироподобные межнуклеотидные связи. Таким образом, считается, например, что обычно для конкретной олигонуклеотидной последовательности с пятью внутренними ΥΖ-динуклеотидами олигонуклеотид с пятью внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными ΥΖ-межнуклеотидными связями является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с четырьмя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными ΥС-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь, является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с тремя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными ΥΖ-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь, является более иммуностимуляторным, чем олигонуклеотид с двумя внутренними фосфодиэфирными или фосфодиэфироподобными ΥΖ-межнуклеотидными связями, который, в свою очередь, является более иммуностиму

- 17 008777 ляторным, чем олигонуклеотид с одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной ΥΖмежнуклеотидной связью. Важно, что включение даже одной внутренней фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной ΥΖ-межнуклеотидной связи считается более предпочтительным в сравнении с отсутствием фосфоэфирной или фосфодиэфироподобной ΥΖ-межнуклеотидной связи. Кроме количества фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных связей, на силу может влиять также положение вдоль длины нуклеиновой кислоты.

Мягкие и полумягкие олигонуклеотиды будут обычно включать в себя, кроме фосфодиэфирных или фосфодиэфироподобных связей, в предпочтительных внутренних положениях 5'- и З'-концы, которые являются устойчивыми к деградации. Такие устойчивые к деградации концы могут включать в себя любую подходящую модификацию, которая приводит к увеличенной устойчивости против экзонуклеазной деградации в сравнении с соответствующими немодифицированными концами. Например, 5'- и З'концы могут быть стабилизированными включением в них по меньшей мере одной фосфатной модификации скелета. В предпочтительном варианте осуществления этой по меньшей мере одной фосфатной модификацией скелета на каждом конце является независимо фосфоротиоатная, фосфородитиоатная, метилфосфонатная или метилфосфоротиоатная межнуклеотидная связь. В другом варианте осуществления устойчивый к деградации конец включает в себя одну или несколько нуклеотидных единиц, присоединенных пептидными или амидными связями на З'-конце.

Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь является типом связи, характерным для нуклеиновых кислот, обнаруживаемых в природе. Как показано на фиг. 20, эта фосфодиэфирная межнуклеотидная связь включает в себя атом фосфора, фланкированный двумя образующими мостиковую связь атомами кислорода и связанный также двумя дополнительными атомами кислорода, одним заряженным и другим незаряженным. Фосфодиэфирная межнуклеотидная связь является особенно предпочтительной, когда важно уменьшение полупериода существования в ткани этого олигонуклеотида.

Фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь является фосфорсодержащей образующая мостик группой, которая является химически и/или диастереомерно сходной с фосфодиэфиром. Критерии сходства с фосфодиэфиром включают в себя чувствительность к нуклеазному расщеплению и способность активировать РНКазу Н. Так, например, фосфодиэфирные, но не фосфоротиоатные олигонуклеотиды являются чувствительными к нуклеазному расщеплению, хотя как фосфодиэфирные, так и фосфоротиоатные олигонуклеотиды активируют РНКазу Н. В предпочтительном варианте осуществления фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является боранофосфатная (или эквивалентно боранофосфонатная) связь. Патент США № 5177198; патент США № 5859231; патент США № 6160109; патент США № 6207819; 8егдиееу е! а1., (1998) 1 Ат Сйет Бое 120:9417-27. В другом предпочтительном варианте осуществления фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является диастереомерно чистый Крфосфоротиоат. Считается, что диастереомерно чистый Кр-фосфоротиоат является более чувствительным к нуклеазному расщеплению и лучше активирует РНКазу Н, чем смешанный или диастереомерно чистый 8р-фосфоротиоат. Стереомеры СрС-олигонуклеотидов являются предметом ожидающей одновременного рассмотрения заявки на патент США 09/361575, поданной 27 июля 1999 г. и опубликованной РСТ заявки РСТ/ϋδ 99/17100 (\УО 00/06588). Следует отметить, что для целей согласно изобретению термин «фосфодиэфироподобная межнуклеотидная связь» специфически исключает фосфородитиоатную и метилфосфонатную межнуклеотидные связи.

Как описано выше, мягкие и полумягкие олигонуклеотиды согласно изобретению могут иметь фосфодиэфироподобные связи между С и С. Одним примером фосфодиэфироподобной связи является фосфоротиоатная связь в Кр-конформации. р-Хиральность олигонуклеотида может иметь явно противоположные действия на иммунную активность СрС-олигонуклеотида в зависимости от временной точки, в которой измеряют активность. В ранней временной точке 40 мин Кр-, но не 8р-стереоизомер фосфоротиоатного СрС-олигонуклеотида индуцирует фосфорилирование 1ΝΚ в клетках селезенки мыши. В противоположность этому, при тестировании в поздней временной точке 44 ч 8р-, но не Кр-стереоизомер является активным в стимуляции пролиферации клеток селезенки. Это различие в кинетике и биоактивности Кр- и 8р-стереоизомеров происходит не из различия в поглощении клеток, а скорее наиболее вероятно обусловлено двумя противоположными биологическими ролями этой р-хиральности. Во-первых, повышенная активность Кр-стереоизомера в сравнении с 8р-стереоизомером в отношении стимуляции иммунных клеток в ранних временных точках указывает на то, что Кр может быть более эффективным во взаимодействии с СрС-рецептором, ТЬК9, или в индуцировании ниже по ходу путей передачи сигнала. С другой стороны, более быстрая деградация Р8-олигонуклеотидов Кр в сравнении с 8р приводит к гораздо более короткой продолжительности передачи сигнала, так что Р8-олигонуклеотиды 8р являются, по-видимому, более биологически активными при тестировании в более поздних временных точках.

Неожиданно сильное действие достигается р-хиральностью в самом СрС-динуклеотиде. В сравнении со стереорандомизированным СрС-олигонуклеотидом стереоизомер, в котором единственный СрСдинуклеотид был связан в Кр, был слегка более активным, хотя стереоизомер, содержащий 8р-связь, был почти неактивным в отношении индуцирования пролиферации клеток селезенки.

Размер (т. е. количество нуклеотидных остатков вдоль длины нуклеиновой кислоты) иммуностимуляторного олигонуклеотида может также способствовать иммуностимуляторной активности этого оли

- 18 008777 гонуклеотида. Для облегчения поглощения в клетки иммуностимуляторный олигонуклеотид предпочтительно имеет минимальную длину 6 нуклеотидных остатков. Нуклеиновые кислоты любого размера. превышающего 6 нуклеотидов (даже с длиной многих т.п.н.). способны индуцировать иммунную реакцию в соответствии с данным изобретением. если присутствуют достаточные иммуностимуляторные мотивы. так как более длинные нуклеиновые кислоты деградируются внутри клеток. Авторы согласно изобретению считают. что полумягкие олигонуклеотиды. имеющие длину всего лишь 4 нуклеотида. могут также быть иммуностимуляторными. если они могут быть доставлены во внутреннее пространство клетки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 4-100 нуклеотидов. В типичных вариантах осуществления иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 6-40 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах согласно изобретению иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину 6-19 нуклеотидов.

Обычно иммуностимуляторные олигонуклеотиды имеют длину в диапазоне 4-100 и в некоторых вариантах осуществления 10-40 нуклеотидов. Длина может находиться в диапазоне 16-24 нуклеотида.

Термин нуклеиновая кислота и олигонуклеотид включает в себя также нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с заменами или модификациями. например. в основаниях и/или сахарах. Например. они включают в себя нуклеиновые кислоты. имеющие скелетные сахара. которые ковалентно присоединены к низкомолекулярным органическим группам. другим. чем гидроксильная группа в положении 2'. и другим. чем фосфатная группа или гидроксигруппа в положении 5'. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут включать в себя 2'-О-алкилированную рибозную группу. Кроме того. модифицированные нуклеиновые кислоты могут включать в себя сахара. такие как арабиноза или 2'-фторарабиноза. вместо рибозы. Таким образом. эти нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными в составе скелета. содержащими посредством этого любую возможную комбинацию полимерных звеньев. связанных вместе. такими как пептид-нуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный скелет с основаниями нуклеиновых кислот).

Нуклеиновые кислоты включают в себя также замещенные пурины и пиримидины. такие как модифицированные основания С-5-пропинпиримидин и 7-деаза-7-замещенный пурин. ХУадпсг Β.ν. е1 а1. (1996) Ναι Вю1ес11по1 14:840-4. Пурины и пиримидины включают в себя. но не ограничиваются ими. аденин. цитозин. гуанин. тимин. 5-метилцитозин. 5-гидроксицитозин. 5-фторцитозин. 2-аминопурин. 2амино-6-хлорпурин. 2.6-диаминопурин. гипоксантин и другие природно встречающиеся или не встречающиеся природно нуклеооснования. замещенные и незамещенные ароматические части молекулы. Другие подобные модификации хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области.

Иммуностимуляторные олигонуклеотиды согласно изобретению могут включать в себя различные химические модификации и замены. в сравнении с природными РНК и ДНК. в том числе фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика. β-Ό-рибозной единицы и/или природного нуклеотидного основания (аденина. гуанина. цитозина. тимина. урацила). Примеры химических модификаций известны специалисту с квалификацией в данной области и описаны. например. в ИЫтапп Е. е1 а1. (1990) СНет Реу 90:543; Рго1осо18 £ог ОНдопискоИбек апб Апа1од§ 8уп1Ьея8 апб РгорегИек & 8уп1Ьея8 апб Апа1уИса1 Тес11пк|ие5.

8. Адга^а1. Еб. Нитапа Рге§8. То1о\уа. И8А 1993; Сгооке 8.Т. е1 а1. (1996) Аппи Реу РНагтасо1 Тохюо1 36:107-129; и Нип/Псег 1. е1 а1. (1995) Моб 8уп1к МеШобз 7:331-417. Олигонуклеотид согласно изобретению может иметь одну или несколько модификаций. причем каждая модификация расположена в конкретном фосфодиэфирном межнуклеотидном мостике и/или в конкретной β-Ό-рибозной единице и/или в конкретном положении природного нуклеотидного основания в сравнении с олигонуклеотидом той же самой последовательности. которая состоит из природных ДНК или РНК.

Например. данное изобретение относится к олигонуклеотиду. который может содержать одну или несколько модификаций. причем каждая модификация независимо выбрана из

a) замены фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика. локализованного при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида. модифицированным межнуклеотидным мостиком.

b) замены фосфодиэфирного межнуклеотидного мостика. локализованного при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида. дефосфо-мостиком.

c) замены сахар-фосфатной единицы из сахар-фосфатного скелета другой единицей.

б) замены β-Ό-рибозной единицы модифицированной сахарной единицей и

е) замены природного нуклеотидного основания модифицированным нуклеотидным основанием. Более подробные примеры химической модификации олигонуклеотида являются следующими. Фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик. расположенный при 3'- и/или 5'-конце нуклеотида. может быть заменен модифицированным межнуклеотидным мостиком. причем этот модифицированный межнуклеотидный мостик выбран. например. из фосфоротиоатного. фосфородитиоатного. ΝΡ'Ρ²фосфорамидатного. боранофосфатного. α-гидроксибензилфосфонатного. фосфат-(С1-С₂1)-О-алкилэфирного. фосфат-[(С₆-С1₂)арил-(С1-С₂1)-О-алкил]эфирного. (С1-С₈)алкилфосфонатного и/или (С₆-С1₂)арилфосфонатного мостиков. (С₇-С1₂)-а-гидроксиметиларила (например. описанного в νθ 95/01363). где (С₆С1₂)арил. (С₆-С₂₀)арил и (С₆-С1₄)арил необязательно замещены галогеном. алкилом. алкокси. нитро. циа

- 19 008777 но, и где К¹ и К² означают независимо друг от друга водород, (С1-С1₈)алкил, (С₆-С₂₀)арил, (С₆-С1₄)арил(С1-С₈)алкил, предпочтительно водород, (С1-С₈)алкил, предпочтительно (С1-С₄)алкил и/или метоксиэтил, или К¹ и К² образуют вместе с атомом азота, несущим их, 5-6-членное гетероциклическое кольцо, которое может дополнительно содержать дополнительный гетероатом из группы О, 8 и Ν.

Может быть произведена замена фосфодиэфирного мостика, расположенного при 3'- и/или при 5'конце нуклеотида, дефосфо-мостиком (дефосфо-мостики описаны, например, в ИЫтапп Е. апй Реутап Α. ίη МейБойк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 20, Рго!осо1к £ог О11допис1ео!1йек апй Апа1одк, 8. Адга^а1, Ей, Нитапа Ргекк, Тойо\уа 1993, СБарйег 16, рр. 355 ££), где дефосфо-мостик выбран, например, из дефосфомостиков формацеталя, 3'-тиоформацеталя, метилгидроксиламина, оксима, метилендиметилгидразо, диметиленсульфона и/или силильных групп.

Сахар-фосфатная единица (т.е. β-Ό-рибоза и фосфодиэфирный межнуклеотидный мостик, образующие вместе сахар-фосфатную единицу) из сахар-фосфатного скелета (т.е. сахар-фосфатного скелета, состоящего из сахар-фосфатных единиц) может быть заменена другой единицей, причем эта другая единица является, например, подходящей для образования «морфолинопроизводного» олигомера (описанного, например, в ЗйтсБак Е.Р. е! а1. (1989) №1с1ею Асййк Кек 17:6129-41), т.е., например, заменой единицей морфолинопроизводного; или образования полиамидной нуклеиновой кислоты («ПНК»; как описано, например, в №е1кеп Р.Е. е! а1. (1994) Вюсопщд СБет 5:3-7), т.е., например, заменой ПИК-скелетной единицей, например, 2-аминоэтилглицином.

β-Рибозная единица или β-Ό-дезоксирибозная единица может быть заменена модифицированной сахарной единицей, причем эта модифицированная сахарная единица выбрана, например, из β-Ό-рибозы, а-Э-2'-дезоксирибозы, Ь-2'-дезоксирибозы, 2'-Е-2'-дезоксирибозы, 2'-Е-арабинозы, 2'-О-(С1-С₆)алкилрибозы, предпочтительно 2'-О-(С1-С₆)алкилрибозой является 2'-О-метилрибоза, 2'-О-(С₂-С₆)алкенилрибозы, 2'-[О-(С1-С₆)алкил-О-(С1-С₆)алкил]рибозы, 2'-NН₂-2'-дезоксирибозы, β-Ό-ксилофуранозы, αарабинофуранозы, 2,4-дидезокси-в-О-эритрогексопиранозы и карбоциклических (описанных, например, в ЕтоеЫет 1 (1992) Ат СБет 8ос 114:8320) и/или имеющих открытую цепь аналогов сахаров (описанных, например, в УапйепйпекксБе е! а1. (1993) ТейгаБейгоп 49:7223) и/или аналогов бициклосахаров (описанных, например, в Та^кον М. е! а1. (1993) Нек СБ1т Ас!а 76:481).

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления этот сахар является 2'-О-метилрибозой, в частности, для одного или обоих нуклеотидов, связанных фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью.

Нуклеиновые кислоты включают в себя также замещенные пурины и пиримидины, такие как модифицированные основания С-5-пропинпиримидин и 7-деаза-7-замещенный пурин. Аадпег К.А. е! а1. (1996) №й В1о!есБпо1 14:840-4. Пурины и пиримидины включают в себя, но не ограничиваются ими, аденин, цитозин, гуанин и тимин и другие природно встречающиеся или не встречающиеся природно нуклеооснования, замещенные и незамещенные ароматические части молекулы.

Модифицированным основанием является любое основание, которое является химически отличающимся от природно встречающихся оснований, обычно обнаруживаемых в ДНК и РНК, таких как Т, С, С, А и и, но имеет общие основные химические структуры с этими природно встречающимися основаниями. Модифицированное нуклеотидное основание может быть, например, выбрано из гипоксантина, урацила, дигидроурацила, псевдоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-аминоурацила, 5-(С1-С6)алкилурацила, 5-(С2-С6)алкенилурацила, 5-(С2-С6)алкинилурацила, 5-(гидроксиметил)урацила, 5хлорурацила, 5-фторурацила, 5-бромурацила, 5-гидроксицитозина, 5-(С1-С₆)алкилцитозина, 5-(С₂-С₆) алкенилцитозина, 5-(С2-С6)алкинилцитозина, 5-хлорцитозина, 5-фторцитозина, 5-бромцитозина, Ν²диметилгуанина, 2,4-диаминопурина, 8-азапурина, замещенного 7-деазапурина, предпочтительно 7деаза-7-замещенного и/или 7-деаза-8-замещенного пурина, 5-гидроксиметилцитозина, Ш-алкилцитозина, например, №-этилцитозина, 5-гидроксидезоксицитидина, 5-гидроксиметилдезоксицитидина, №-алкилдезоксицитидина, например, №-этилдезоксицитидина, 6-тиодезоксигуанозина, и дезоксирибонуклеотидов нитропиррола, С5-пропинилпиримидина и диаминопурина, например, 2,6-диаминопурина, инозина, 5-метилцитозина, 2-аминопурина, 2-амино-6-хлорпурина, гипоксантина или других модификаций природных нуклеотидных оснований. Имеется в виду, что этот список является примерным и не должен интерпретироваться как ограничивающий.

В конкретных описанных здесь формулах определен набор модифицированных оснований. Например, буква Υ используется для нуклеотида, содержащего цитозин или модифицированный цитозин. Модифицированный цитозин в данном контексте означает природно встречающийся или не встречающийся природно аналог пиримидинового основания цитозина, который может заменять это основание без нарушения иммуностимуляторной активности олигонуклеотида. Модифицированные цитозины включают в себя, но не ограничиваются ими, 5-замещенные цитозины (например, 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5-бромцитозин, 5-иодцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 5дифторметилцитозин и незамещенный или замещенный 5-алкинилцитозин), 6-замещенные цитозины, Ш-замещенные цитозины (например, №-этилцитозин), 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, изоцитозин, псевдоизоцитозин, аналоги цитозина с конденсированными кольцевыми системами (например, Ν,Ν'- 20 008777 пропиленцитозин или феноксазин) и урацил и его производные (например, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-бромвинилурацил, 4-тиоурацил, 5-гидроксиурацил, 5-пропинилурацил). Некоторые предпочтительные цитозины включают в себя 5-метилцитозин, 5-фторцитозин, 5-гидроксицитозин, 5-гидроксиметилцитозин и Ш-этилцитозин. В другом варианте осуществления согласно изобретению цитозиновое основание заменено универсальным основанием (например, 3-нитропирролом, Р-основанием), ароматической кольцевой системой (например, фторбензолом или дифторбензолом) или атомом водорода (6спейсер).

Буква Ζ используется для означения гуанина или модифицированного гуанинового основания. Модифицированный гуанин в данном контексте означает природно встречающийся или не встречающийся природно аналог пуринового основания гуанина, который может заменять это основание без нарушения иммуностимуляторной активности олигонуклеотида.

Модифицированные гуанины включают в себя, но не ограничиваются ими, 7-деазагуанин, 7-деаза7-замещенный гуанин (такой как 7-деаза-7-(С₂-С₆)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенный гуанин, гипоксантин, Ю-замещенные гуанины (например, Ю-метилгуанин), 5-амино-3-метил-3Н,6Н-тиазоло[4,5б]пиримидин-2,7-дион, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, пурин, индол, аденин, замещенные аденины (например, N6-метиладенин, 8-оксоаденин), 8-замещенный гуанин (например, 8-гидроксигуанин и 8бромгуанин) и 6-тиогуанин. В другом варианте осуществления согласно изобретению гуаниновое основание замещено универсальным основанием (например, 4-метилиндолом, 5-нитроиндолом и Коснованием), ароматической кольцевой системой (например, бензимидазолом или дихлорбензимидазолом, амидом 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты) или атомом водорода (б-спейсер).

Эти олигонуклеотиды могут иметь один или более доступных 5'-концов. Могут быть созданы модифицированные олигонуклеотиды, имеющие два таких 5'-конца. Это может быть достигнуто, например, соединением двух олигонуклеотидов через связь 3'-3' для образования олигонуклеотида, имеющего один или два доступных 5'-конца. Связь 3'-3' может быть фосфодиэфирным, фосфоротиоатным или любым другим межнуклеотидным мостиком. Способы образования таких связей известны в данной области. Например, такие связи описаны в 8е11дег, Н. е! а1., Обдопис1еоббе апа1одк \ν61ι !егтта1 3'-3'- апб 5'-5'1п!егпис1еобб1с бпкадек ак апбкепке шЫЬйогк оГ упа1 депе ехргеккюп, Шскоибек & ^скоббек (1991), 10(1-3), 469-77 и Лапд е! а1., Ркеибо-сусЛс оЛдопискоббек: ш уйго апб ш убуо ргорегбек, Вюогдашс & Мебкша1 Сйетбкбу (1999), 7(12), 2727-2735.

Кроме того, 3'3'-связанные нуклеиновые кислоты, в которых связь между 3'-концевыми нуклеотидами не является фосфодиэфирным, фосфоротиоатным или другим модифицированным мостиком, могут быть получены с использованием дополнительного спейсера, такого как три- или тетраэтиленгликольфосфатная часть молекулы (Эигапб, М. е! а1., Тг1р1е-Ье11х Гогтабоп Ьу ап обдопискоббе соп!а1шпд опе (бА) 12 апб 1\\ό (бТ) 12 кециепсек Ьпбдеб Ьу 1\\ό Нехае1Ну1епе д1усо1 сйабпк, Вюсйетбкбу (1992), 31(38), 9197-204, патент США № 565738 и патент США № 5668265). Альтернативно, этот ненуклеотидный линкер может быть произведен из этандиола, пропандиола или из неосновной дезоксирибозной (б-спейсер) единицы (Роп!апе1, Мапе Ьаигепсе е! а1., 81епса1 гесодшбоп Ьу Т4 ро1упис1еоббе ктаке оГ поп-пискокббк токиек 5'-а11асНеб Ю обдопискоббек; Шскк Асббк Векеагсй (1994), 22(11), 2022-7) с использованием стандартной фосфорамидитной химии. Эти ненуклеотидные линкеры могут быть включены один раз или множество раз или комбинированы друг с другом, что делает возможным получение любого желаемого расстояния между 3'-концами этих двух ΟΌΝ.

Для использования в данном изобретении олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы бе поуо с использованием любого ряда процедур, хорошо известных в данной области. Например, может быть использован Ь-цианоэтилфосфорамидитный способ (Веаисаде, 8.Л., апб Саги!йегк, М.Н., Те!. Ье!. 22:1859, 1981); нуклеотид-Н-фосфонатный способ (Сагедд е! а1., Те!. Ье!. 27:4051-4054, 1986; ЬгоеЫег е! а1., Кис1. Асбб. Век. 14:5399-5407, 1986; Сагедд е! а1., Те!. Ье!. 27:4055-4058, 1986, СаГГпеу е! а1., Те!. Ье!. 29:2619-2622, 1988). Эти химические способы могут выполняться с использованием различных автоматизированных синтезаторов нуклеиновых кислот, доступных на рынке. Эти олигонуклеотиды называют синтетическими олигонуклеотидами. Выделенным олигонуклеотидом обычно называют олигонуклеотид, который был отделен от компонентов, с которыми он обычно связан в природе. В качестве примера, выделенным олигонуклеотидом может быть олигонуклеотид, который выделен из клетки, из ядра, из митохондрий или из хроматина.

Эти олигонуклеотиды являются частично устойчивыми к деградации (например, являются стабилизированными).

Стабилизированная молекула олигонуклеотида должна означать олигонуклеотид, который является относительно устойчивым к деградации ш У1!го (например, экзо- или эндонуклеазой). Стабилизация нуклеиновых кислот может быть выполнена посредством модификации скелета. Олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, обеспечивают максимальную активность и защищают этот олигонуклеотид от деградации внутриклеточными экзо- и эндонуклеазами. Другие модифицированные олигонуклеотиды включают в себя фосфодиэфир-модифицированные нуклеиновые кислоты, комбинации фосфодиэфирной и фосфоротиоатной нуклеиновой кислоты, метилфосфонатные, метилфосфоротиоатные, фосфородитиоатные, п-этоксинуклеиновые кислоты и их комбинации.

- 21 008777

Модифицированные скелеты, такие как фосфоротиоаты, могут быть синтезированы с использованием автоматизированных способов, использующих либо фосфорамидатную, либо Н-фосфонатную химию. Арил- и алкилфосфонаты могут быть получены, например, как описано в патенте США № 4469863, и алкилфосфотриэфиры (в которых заряженную кислородную часть молекулы алкилируют, как описано в патенте США № 5023243 и европейском патенте № 092574) могут быть получены автоматизированным твердофазным синтезом с использованием коммерчески доступных реагентов. Способы получения других модификаций и замен скелета ДНК были описаны (например, ПЫтаил, Е. апб Реутащ А., СНеш. Вее. 90:544, 1990; ΟοοάοΗίΙά, I., В^οсοη^идаΐе СНеш. 1:165, 1990).

Другие стабилизированные олигонуклеотиды включают в себя неионные аналоги ДНК, такие как алкил- и арилфосфаты (в которых заряженный фосфонатный кислород заменен алкильной или арильной группой), фосфодиэфиры и алкилфосфотриэфиры, в которых заряженная кислородная часть молекулы алкилирована. Было показано также, что нуклеиновые кислоты, которые содержат диол, такой как тетраэтиленгликоль или гексаэтиленгликоль, или на одном, или на обоих концах, являются, по существу, резистентными к деградации нуклеазами.

Иммуностимуляторные олигонуклеотиды могут также содержать одну или более необычных связей между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов в молекуле. Обычной межнуклеотидной связью является связь 3'5'. Все другие связи рассматриваются как необычные межнуклеотидные связи, такие как 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, 2'3'-связи. Вследствие этого, номенклатура 2'-5' выбрана в соответствии с атомом углерода рибозы. Однако, если используются необычные сахарные части молекулы, такие как расширенные кольцом сахарные аналоги (например, гексаноза, циклогексен или пираноза) или би- или трициклические сахарные аналоги, то эта номенклатура изменяется в соответствии с номенклатурой мономера. В случае аналогов 3'-дезокси-в-Б-рибопиранозы (также называемой п-ДНК) эти мононуклеотиды связаны, например, через 4'2'-связь.

Если нуклеотид содержит одну 3'3'-связь, то этот аналог олигонуклеотида будет иметь два несвязанных 5'-конца. Подобным образом, если нуклеотид содержит одну 5'5'-связь, то этот олигонуклеотид будет иметь два несвязанных 3'-конца. Доступность несвязанных концов нуклеотидов может быть более доступной для их рецепторов. Оба типа необычных связей (3'3'- и 5'5'-связи) описаны ВашаПю ϋΠί^αο еΐ а1. (АгиЕеще ВекеагсН αηά ^еνе1οртеηΐ (1992) 2, 129-46), где сообщалось, что олигонуклеотиды, имеющие 3'3'-связь, обнаруживали повышенную стабильность к расщеплению нуклеазами.

Различные типы связей могут быть также объединены в одной молекуле, что может приводить к разветвлению этого олигомера. Если одна часть этого олигонуклеотида присоединена при 3'-конце через 3'3'-связь ко второй части олигонуклеотида и на 2'-конце через 2'3'-связь к третьей части олигонуклеотида этой молекулы, это приводит к разветвленному олигонуклеотиду с тремя 5'-концами (3'3'-, 2'3'разветвленному).

В принципе, связи между различными частями олигонуклеотида или между различными олигонуклеотидами соответственно, могут иметь место через все части этой молекулы, пока это не влияет отрицательно на узнавание ее рецептором. Согласно природе нуклеиновой кислоты, эта связь может включать в себя сахарную часть (8и), гетероциклическое нуклеооснование (Ва) или фосфатный скелет (РН). Таким образом, возможными являются связи типа 8и-8и, 8и-РН, 8и-Ва, Ва-Ва, Ва-8и, Ва-РН, РН-РН, РН-8и и РНВа. Если эти олигонуклеотиды дополнительно модифицированы определенными ненуклеотидными заместителями, эта связь может также происходить через модифицированные части этих олигонуклеотидов. Эти модификации включают в себя также модифицированные нуклеиновые кислоты, например, ПНК, ЛНК или морфолино-олигонуклеотидные аналоги.

Эти связи предпочтительно состоят из С, Н, Ν, О, 8, В, Р и галогена и содержат 3-300 атомов. Примером с 3 атомами является ацетальная связь (Ο^N1-3'-Ο-СН₂-Ο-3'-Ο^N2; РгоеЫег аЫ МаПеисс!), соединяющая, например, 3'-гидроксигруппу одного нуклеотида с 3'-гидроксигруппой второго олигонуклеотида. Примером с приблизительно 300 атомами является ПЭГ-40 (тетраконтаполиэтиленгликоль). Предпочтительными связями являются фосфодиэфирная, фосфоротиоатная, метилфосфонатная, фосфорамидатная, боранофосфонатная, амидная, простая эфирная, тиоэфирная, ацетальная, тиоацетальная, карбамидная, тиокарбамидная, сульфонамидная, состоящая из основания Шиффа, и дисульфидная связи. Другой возможностью является использование системы биоконъюгации 8ο1ιι1ίη1< (\ν\ν\ν.Ιπ1ίη1<Νο^1ι^οιη).

Если этот олигонуклеотид состоит из двух или более частей последовательности, эти части могут быть одинаковыми или различными. Так, в олигонуклеотиде с 3'3'-связью эти последовательности могут быть идентичными 5'-ΘΟΝ1-3'3'-ΘΟΝ1-5' или различными 5'-ΘΟΝ1-3'3'-ΘΟΝ2-5'. Кроме того, химическая модификация различных частей олигонуклеотида, а также соединяющий их линкер могут быть различными. Поскольку поглощение коротких олигонуклеотидов является, по-видимому, менее эффективным, чем поглощение длинных олигонуклеотидов, связывание двух или нескольких коротких последовательностей приводит к улучшенной иммунной стимуляции. Длина коротких олигонуклеотидов равна приблизительно 2-20 нуклеотидам, более предпочтительно 3-16 нуклеотидам, но наиболее предпочтительно 5-10 нуклеотидам. Предпочтительными являются связанные олигонуклеотиды, которые имеют два или более несвязанных 5'-концов.

Олигонуклеотидные частичные последовательности могут быть также связаны ненуклеотидными

- 22 008777 линкерами, в частности, неосновными линкерами (ά-спейсеры), единицами триэтиленгликоля или единицами гексаэтиленгликоля. Дополнительными предпочтительными линкерами являются алкиламинолинкеры, такие как С3-, С6-, С12-аминолинкеры, а также аликлтиоловые линкеры, такие как С3- или С6тиоловые линкеры. Эти олигонуклеотиды могут быть также связаны ароматическими остатками, которые могут быть дополнительно замещены алкильными или замещенными алкильными группами. Эти олигонуклеотиды могут также содержать удвоенную или утроенную единицу (\\л\лг.д1спгс5.еот.). в частности, эти олигонуклеотиды с 3'3'-связью. Разветвление этих олигонуклеотидов множественными удвоенными, утроенными или другими умноженными единицами приводит к дендримерам, которые являются следующим вариантом осуществления согласно изобретению. Эти олигонуклеотиды могут также содержать линкерные единицы, происходящие из пептидмодифицирующих реагентов или олигонуклеотидмодифицирующих реагентов (\\л\лу.д1епге5.сот.). Кроме того, они могут содержать один или несколько природных или неприродных аминокислотных остатков, которые соединены пептидными (амидными) связями.

Другой возможностью связывания олигонуклеотидов является связывание; посредством сшивания гетероциклических оснований (Уегта апй ЕскЧет; Аппи. Рее. Вюсйет. (1998) 67:99-134; раде 124). Еще одной возможностью является связь между сахарной частью одной части последовательности и гетероциклическим основанием другой части последовательности (1уег е1 а1., Сигг. Θρίη. Мо1. ТЪегареиДск (1999) 1: 344-358; раде 352).

Различные олигонуклеотиды синтезируют установленными способами, и они могут быть связаны вместе одновременно во время твердофазного синтеза. Альтернативно, они могут быть связаны вместе после синтеза отдельных частичных последовательностей.

«Субъект» будет означать человека или позвоночное животное, в том числе, но не только, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, курицу, примата, не являющегося человеком (например, обезьяну), рыбу (виды аквикультуры, например, лосося), кролика, крысу и мышь.

«Субъект, имеющий вирусную инфекцию» является субъектом, который был подвергнут действию вируса и имеет острое или хроническое проявление или детектируемые уровни вируса в его теле. В предпочтительных вариантах осуществления согласно изобретению этим субъектом является субъект, имеющий хроническую вирусную инфекцию, более предпочтительно хроническую инфекцию гепатита С. В важных аспектах согласно изобретению этим субъектом является субъект, который является не отвечающим на предыдущую терапию инфекции гепатита С. Например, не отвечающий субъект (нереспондер) включает в себя субъекта, который ранее лечился по поводу инфекции гепатита С, например, ΙΕΝ-α (например, интроном А), но такое лечение не было успешным, как описано здесь. Данное изобретение предполагает лечение субъектов, которые являются не отвечающими (не-респондерами) на прежнюю терапию, и в некоторых случаях идентификацию субъектов, которые могли бы быть не отвечающими, для сортировки эффективного лечения.

Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть эффективными у любого позвоночного животного. Различные иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут вызывать оптимальную иммунную стимуляцию в зависимости от вида млекопитающего. Так, иммуностимуляторная нуклеиновая кислота, вызывающая оптимальную стимуляцию или ингибирование у людей, может не вызывать оптимальную стимуляцию или ингибирование у мыши, и \тсе уегаа. Специалист с квалификацией в данной области сможет идентифицировать большинство подходящих иммуностимуляторных нуклеиновых кислот, применимых для конкретного представляющего интерес вида млекопитающего с использованием рутинных анализов, описанных здесь и/или известных в данной области, с использованием представленного здесь руководства.

Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота может непосредственно вводиться субъекту или может вводиться вместе с комплексом доставки нуклеиновых кислот. «Комплекс доставки нуклеиновых кислот» означает молекулу нуклеиновой кислоты, связанную (например, ионно связанную или ковалентно связанную или инкапсулированную внутри) с нацеливающим средством (например, молекулой, которая приводит к высокоаффинному связыванию с клеткой-мишенью (например, рБС или В-клетками), и/или увеличивает клеточное поглощение клетками-мишенями. Примеры комплексов доставки нуклеиновых кислот включают в себя нуклеиновые кислоты, связанные со стерином (например, холестерином), липидом (например, катионным липидом, виросомой или липосомой), или агентом специфического связывания клетки-мишени (например, лигандом, узнаваемым специфическим рецептором клетки-мишени). Предпочтительные комплексы могут быть достаточно стабильными ίη νινο для предотвращения значимого отсоединения до интернализации клеткой-мишенью. Однако этот комплекс может быть расщеплен при подходящих условиях в клетке, так что нуклеиновая кислота высвобождается в функциональной форме.

Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота или другие терапевтические вещества могут вводиться отдельно (например, в солевом растворе или буфере) или с использованием любых носителей доставки, известных в данной области. Например, были описаны следующие носители доставки: кохлеаты; эмульсомы; 18СОМ; липосомы; живые бактериальные векторы (например, 8а1топе11а, ЕксйепсЫа сой, ВасШик Са1тейе-6иег1п, 8Ыде11а, Ьас1оЬасШи8); живые вирусные векторы (например, Уасаша, аденовирус,

- 23 008777 не грек 81тр1ех); микросферы; вакцины нуклеиновых кислот; полимеры (например, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан); полимерные кольца; протеосомы; фторид натрия; трансгенные растения; виросомы; вирус-подобные частицы. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что могут быть также использованы также другие носители доставки, которые известны в данной области.

В соединении с обеспеченными здесь объяснениями, посредством выбора среди различных активных соединений и взвешивания факторов, таких как сила, относительная биодоступность, масса тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения, может быть спланирована эффективная схема терапевтического лечения, которая не вызовет существенной токсичности, но все еще будет полностью эффективной для лечения конкретного субъекта, как описано выше. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьироваться в зависимости от таких факторов, как подлежащее лечению заболевание или состояние, конкретная вводимая иммуностимуляторная нуклеиновая кислота (например, иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С, количество неметилированных СрС-мотивов или их местоположение в этой нуклеиновой кислоте, степень хиральности относительно олигонуклеотида и т.д.), от того, вводится ли также антиген, и от природы такого антигена, размера субъекта или тяжести заболевания или состояния. Специалист с обычной квалификацией в данной области сможет эмпирически определить эффективное количество конкретных иммуностимуляторных нуклеиновых кислот и/или другого терапевтического агента без необходимости чрезмерного экспериментирования.

Для взрослых субъектов дозы соединений иммуностимуляторных нуклеиновых кислот, описанных выше, обычно находятся в диапазоне 50 мкг на дозу - 20 мг на дозу, более часто приблизительно 80 мкг на дозу - 8 мг на дозу и наиболее обычно приблизительно 800 мкг на дозу - 4 мг на дозу. Установленные в зависимости от массы тела субъекта типичные дозы находятся в диапазоне приблизительно 0,5-500 мкг/кг на дозу, более обычно приблизительно 1-100 мкг/кг на дозу и наиболее обычно приблизительно 10-50 мкг/кг на дозу. Дозы будут зависеть от факторов, включающих в себя способ введения, например, пероральное введение может требовать существенно большей дозы, чем подкожное введение.

Формы согласно изобретению вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые могут рутинным образом содержать фармацевтически приемлемые концентрации соли, буферящих агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов.

Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут предоставляться вместе с другими агентами, известными в данной области как применимые в лечении вирусных инфекций. Особенно важной является комбинация иммуностимуляторных нуклеиновых кислот с антивирусными агентами, такими как ΙΡΝα, как показано в разделе Примеры, для обеспечения синергической реакции. Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут быть использованы в качестве замены рибавирина, который в настоящее время вводят вместе с ΙΡΝ-α. Примеры таких других агентов, используемых в настоящее время или находящихся в испытании для применения в комбинации с ΙΡΝ-α, включают в себя амантадин и цитокины, в том числе 1Ь-2, 1Ь-10, 1Ь-12 и ΙΡΝ-γ.

Антивирусные агенты являются соединениями, которые предотвращают инфекцию клеток вирусами или репликацию вируса в клетке. Имеется гораздо меньше антивирусных лекарственных средств, чем антибактериальных лекарственных средств, так как процесс вирусной репликации настолько тесно связан с репликацией ДНК в клетке-хозяине, что неспецифические антивирусные агенты часто являются токсичными для хозяина. Имеются несколько стадий в процессе вирусной инфекции, которые могут быть блокированы или ингибированы антивирусными агентами.

Эти стадии включают в себя присоединение вируса к клетке-хозяину (иммуноглобулином или связывающими пептидами), удаление оболочки вируса (например, амантадином), синтез или трансляцию вирусной мРНК, включающие в себя инициацию трансляции (например, интерфероном, антисмысловой нуклеиновой кислотой и рибозимом), вирусные ферменты (например, неструктурными сериновыми протеазами, РНК-полимеразами, обратными транскриптазами и геликазами), репликацию вирусной РНК или ДНК (например, аналогами нуклеозидов), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторами протеаз, такими как ингибитор сериновой протеазы ΒΙΓΝ2061Ζ\ν из Воейппдег ШдеШет, антиоксидантами, такими как Κϊνίΐΐ (И8Р 6136316) и отделение и высвобождение вируса. Другие антивирусные агенты описаны в И8Р 6130326 и 6440985 и опубликованной патентной заявке США 2002/0095033. Аналоги рибавирина являются также антивирусными агентами, включенными в данное изобретение.

Аналоги нуклеотидов являются синтетическими соединениями, которые являются сходными с нуклеотидами, но которые имеют неполную или отклоняющуюся от нормы дезоксирибозную или рибозную группу. Когда аналоги нуклеотидов находятся в клетке, они фосфорилируются с образованием трифосфата, который конкурирует с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. Как только эта трифосфатная форма аналога нуклеотида включается в растущую цепь нуклеиновой кислоты, она вызывает необратимую ассоциацию с вирусной полимеразой и, следовательно, терминацию цепи.

Иммуноглобулиновую терапию обычно используют для предупреждения вирусной инфекции, но она может быть также использована для уменьшения уровней циркулирующего вируса и предотвраще

- 24 008777 ния инфицирования новообразованных клеток.

Иммуноглобулиновая терапия для вирусных инфекций отличается от иммуноглобулиновой терапии в случае бактериальных инфекций, так как иммуноглобулиновая терапия действует посредством связывания с внеклеточными вирионами и предотвращения присоединения этих вирионов к клеткам и вхождения их в клетки, которые являются чувствительными к вирусной инфекции, а не посредством антигенспецифического действия. Эта терапия применима для уменьшения виремии (наличия вируса в крови) в течение периода времени, когда антитела присутствуют в хозяине. Обычно имеются два типа иммуноглобулиновых терапий, нормальная иммуноглобулиновая терапия и гипериммуноглобулиновая терапия. Нормальная иммуноглобулиновая терапия использует продукт антител, который получают из сыворотки нормальных доноров крови и объединяют. Этот объединенный продукт содержит низкие титры антитела к широкому диапазону вирусов человека, таких как вирус гепатита А, парвовирус, энтеровирус (в частности, у новорожденных). Для использования нормальной иммуноглобулиновой терапии для НСУ эта сыворотка должна быть получена от людей, которые были ранее инфицированы НСУ и которые успешно вывели эту инфекцию, либо спонтанно, либо с использованием какой-либо формы терапии. Гипериммуноглобулиновая терапия использует антитела, которые получают из сыворотки индивидуумов, которые имеют высокие титры антитела к конкретному вирусу. Затем эти антитела используют против специфического вируса. Для НСУ гипериммуноглобулины могут быть получены вакцинацией добровольцев рекомбинантными белками НСУ для получения иммуноглобулина гепатита С.

Другие антивирусные агенты, подходящие для использования в способах согласно изобретению, изготавливают ТпапДе РйагтасеиИсаП, 1пс., СПеаТ 1СИ, Ргос1ег апб ОатЫе и УпоРйагта 1псогрога1еб.

Для применения в терапии эффективное количество иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты может вводиться субъекту любым способом, который доставляет эти иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты в желаемый участок, например, через слизистую оболочку, системно. «Введение» фармацевтической композиции согласно изобретению может быть выполнено любым способом, известным специалисту с квалификацией в данной области. Предпочтительные способы введения включают в себя, но не ограничиваются ими, пероральный, парентеральный способы, способ введения в повреждение, местный, трансдермальный, внутримышечный, интраназальный, интратрахеальный, ингаляционный, глазной, вагинальный и ректальный способы.

Для перорального введения эти соединения (т.е. иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты или другие терапевтические агенты) могут быть легко приготовлены объединением с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители позволяют приготовить соединения согласно изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для приема через рот подлежащим лечению субъектом. Фармацевтические композиции для перорального применения могут быть получены в виде твердого эксципиента с необязательным измельчением полученной смеси и обработкой этой смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, с получением таблеток или сердцевин драже. Подходящими эксципиентами являются, например, наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, и/или поливинилпирролидон (ПВП). Если желательно, могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия. Необязательно, эти пероральные формы могут быть также приготовлены в солевом растворе или буферах для нейтрализации внутренних кислых условий или могут быть приготовлены без каких-либо носителей.

Сердцевины драже обеспечивают подходящим покрытием. Для этой цели могут быть использованы концентрированные растворы сахаров, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К покрытиям для таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для облегчения идентификации или для характеристики различных комбинаций доз активного соединения.

Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают в себя пушфит-капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, герметизированные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Пуш-фит-капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающими агентами, такими как крахмалы, и смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут добавляться стабилизаторы. Могут быть использованы микросферы, приготовленные для перорального введения. Такие микросферы были хорошо описаны в данной области. Все формы для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения.

Для буккального введения эти композиции могут иметь форму таблеток или пастилок, приготовленных общепринятым образом.

- 25 008777

Для введения путем ингаляции соединения для использования в соответствии с данным изобретением могут быть удобным образом представлены в виде аэрозольного спрея из находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единичная доза может быть обеспечена с помощью клапана для доставки дозированного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть приготовлены таким образом, чтобы они содержали порошкообразную смесь рассматриваемого соединения и подходящей поршкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Эти соединения, при необходимости системной доставки, могут быть приготовлены для парентерального введения путем инъекции, например болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Формы для инъекции могут быть приготовлены в унифицированной дозированной форме, например в ампулах или многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Эти композиции могут быть представлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных и водных носителях и могут содержать агенты для приготовления лекарственных средств, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические формы для парентерального введения включают в себя водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно эта суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость этих соединений, что позволяет приготовлять высококонцентрированные растворы.

Альтернативно, активные соединения могут быть в порошкообразной форме для восстановления с подходящим носителем, например, апирогенной водой, перед использованием.

Эти соединения могут быть также приготовлены в виде ректальных или вагинальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие общепринятые основы для суппозиториев, такие как какао-масло или другие глицериды.

Кроме описанных ранее форм, эти соединения могут быть также приготовлены в виде депопрепарата. Такие длительно действующие формы могут быть приготовлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или слаборастворимыми производными, например, в виде слаборастворимой соли.

Фармацевтические композиции могут также содержать подходящие твердофазные или гелеобразные носители или эксципиенты. Примеры таких носителей или эксципиентов включают в себя, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтических препаратов являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, инкохлеатированные, нанесенные на микроскопические частицы золота частицы, содержащиеся в липосомах, распыленные частицы, аэрозоли, шарики для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете для соскребания в кожу. Эти фармацевтические композиции включают в себя также гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытием, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с пролонгированным высвобождением активных соединений, в приготовлении которых эксципиенты и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как дезинтеграторы, связывающие агенты, агенты покрытий, агенты, вызывающие набухание, смазывающие вещества, ароматизаторы, подслащивающие вещества или солюбилизаторы используют общепринятым образом, как описано выше. Эти фармацевтические композиции являются подходящими для использования в разнообразных системах доставки лекарственных средств. В отношении краткого обзора способов доставки лекарственных средств см. статью Ьапдег 8с1епсе 249:1527 (1990), включенную здесь в качестве ссылки.

Иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты могут вводиться рег §е (сами по себе) или в форме фармацевтически приемлемой соли. При использовании в медицине эти соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но также и неприемлемые фармацевтически соли могут быть удобным образом использованы для получения фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают в себя, но не ограничиваются ими, соли, полученные из следующих кислот: хлористо-водородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфоновой, винной, лимонной, метансульфоновой, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфоновой и бензолсульфоновой. Такие соли могут быть также приготовлены в виде солей щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция карбоновых кислот.

Подходящие буферящие агенты включают в себя уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об.); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об.); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об.) и фосфорную кислоту и

- 26 008777 соль (0,8-2% мас./об.). Подходящие консерванты включают в себя хлорид бензалкония (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимерозал (0,004-0,02% мас./об.).

Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или одно или несколько инкапсулирующих веществ, которые являются пригодными для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин «носитель» означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Эти компоненты фармацевтических композиций способны также смешиваться с соединениями согласно изобретению и друг с другом таким образом, что не происходит взаимодействие, которое могло бы существенно нарушить желаемую фармацевтическую эффективность.

Различные способы введения являются доступными. Конкретный выбранный способ будет, конечно, зависеть от конкретных адъювантов или выбранного антигена, конкретного подлежащего лечению состояния и дозы, требуемой для терапевтической эффективности. Вообще говоря, способы согласно изобретению могут быть применены на практике с использованием любого способа введения, который является приемлемым в медицине, если иметь в виду любой способ, который дает эффективные уровни иммунной реакции без вызывания клинически неприемлемых побочных эффектов. Предпочтительные способы введения обсуждены выше.

Эти композиции могут быть удобным образом представлены в виде унифицированной дозированной формы и могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации. Все способы включают в себя стадию приведения этих соединений в контакт с носителем, который состоит из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов. Обычно эти композиции готовят однородным и основательным приведением этих соединений в контакт с жидким носителем, мелкоизмельченным твердым носителем или обоими и затем, если необходимо, приданием формы этому продукту. Жидкими дозированными единицами являются флаконы или ампулы. Твердыми дозированными единицами являются таблетки, капсулы и суппозитории. Для лечения пациента, в зависимости от активности конкретного соединения, способа введения, цели иммунизации (например, профилактической или терапевтической), характера и тяжести нарушения, возраста и массы тела пациента, могут быть необходимы различные дозы. Введение конкретной дозы может проводиться единственным введением в форме отдельной дозированной единицы или еще нескольких меньших дозированных единиц.

Другие системы доставки могут включать в себя системы доставки с контролируемым временем высвобождения, системы доставки задержанного или длительно поддерживаемого высвобождения. Такие системы могут позволить избежать повторяемых введений этих соединений, что увеличивает удобство для субъекта и для врача. Многочисленные типы систем доставки с регулируемым высвобождением являются доступными и известными специалистам с обычной квалификацией в данной области. Они включают в себя системы на основе полимеров, таких как поли(лактиды-гликолиды), сополиоксилаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, сложные полиортоэфиры, полигидроксимасляную кислоту и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные средства, описаны, например, в патенте США №5075109. Системы доставки включают в себя также неполимерные системы, такие как липиды, в том числе стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; системы высвобождения на основе гидрогеля; кремнийорганические системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; прессованные таблетки, использующие общепринятые связывающие агенты и эксципиенты; частично конденсированные имплантаты и т. п. Конкретные примеры включают в себя, но не ограничиваются ими: (а) эрозионные системы, в которых агент согласно изобретению содержится в форме, находящейся внутри матрикса, такие как описанные в патентах США №№ 4452775, 4675189 и 5736152, и (Ь) диффузионные системы, в которых активный компонент выходит при контролируемой скорости из полимера, такие как описанные в патентах США №№ 3854480, 5133974 и 5407686. Кроме того, могут быть использованы системы доставки с использованием приборов на основе насоса, некоторые их которых приспособлены для имплантации.

В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота является модифицированной. В некоторых вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет модифицированный скелет по меньшей мере с одной устойчивой к нуклеазам связью. Устойчивая к нуклеазам межнуклеотидная связь может быть выбрана из группы, включающей в себя фосфоротиоатную связь, фосфородитиоатную связь, метилфосфонатную связь и пептидную связь. В некоторых вариантах осуществления модифицированная иммуностимуляторная нуклеиновая кислота включает в себя по меньшей мере один аналог нуклеотида или по меньшей мере один аналог нуклеотида. Иммуностимуляторная нуклеиновая кислота в некоторых вариантах осуществления является палиндромом, тогда как в других вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота не является палиндромом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эта иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет длину 8-100 нуклеотидов, тогда как в других предпочтительных вариантах осуществления иммуностимуляторная нуклеиновая кислота имеет длину 12-40 нуклеотидов. Предпочтительные разме

- 27 008777 ры, последовательности и модификации описаны более подробно ниже.

Следующие примеры включены для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема согласно изобретению.

Примеры

Целью этого исследования была оценка способности различных классов СрС-ΟΏΝ (СрСолигодинуклеотидов) стимулировать РВМС у хронических носителей НСУ. РВМС выделяли из цельной крови, собранной у нормальных, здоровых добровольцев и хронических носителей НСУ и оценивали способность различных классов СрС-ΟΏΝ, а также мягких и полумягких молекул стимулировать пролиферацию В-клеток, секрецию цитокинов (ΙΡΝ-γ, ΤΝΡ-α, ΙΕ-10 и ΙΡΝ-α) и секрецию хемокинов (ΙΡ-10) т νίΐΐΌ.

Оценивали также иммуностимуляторные эффекты экзогенных IΡN-α-2Ь (интрона А) и рибавирина, каждого по отдельности, в комбинации друг с другом и в комбинации с СрС-ΟΏΝ (классов В и С).

Материалы и способы

Олигонуклеотиды

Все исходные материалы олигонуклеотидов ресуспендировали в ТЭ-буфере при рН 8,0 ((ΝηηιΡοΓ®; ЕМ 8с1епсе, С1ЬЬз1о\п, ΝΙ). Разведения различных ΟΏΝ выполняли с использованием полной среды ΚΡΜΙ 1640 (С1Ьсо ВКЕ, Сгапб !з1апб, ΝΥ), содержащей 10% инактивированную нагреванием АВсыворотку нормального человека (^1зеп1 !пс, 81. Вгипо, РС) и 1% пенициллин/стрептомицин (С1Ьсо ВКЕ, Сгапб !з1апб, ΝΥ) непосредственно перед их использованием в клеточных анализах. Для экспериментов с экзогенным ΙΡΝ-α интрон А (интерферон альфа-2Ь, ΏΙΝ 02223406, 8сЕегтд Сапаба Тпс., Рот1еС1а1ге, (ЭнеЬес, Сапаба) добавляли к растворам ΟΏΝ с получением конечных концентраций 125 или 1000 МЕ/мл. Рибавирин (Саз 36791-04-5, Са1ЬюсЕеш, СN Вюзиепсез Шс., Еа Ло11а, СА, ϋ8Ά) восстанавливали стерильной дистиллированной водой с получением 500 мкМ исходного раствора и разбавляли в среде, как описано выше, с получением конечной концентрации 5 мкМ в лунках. Клетки инкубировали при 37°С с 5% СО₂. Спустя 48 ч клеточные супернатанты собирали из каждой лунки и замораживали при -80°С.

Используемые в экспериментах ΟΏΝ показаны в следующей таблице.

Таблица 2

Последовательности олиго, используемых в экспериментах

3Εζ) ΙΕ) ΝΟ:	Класс	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1	А	О-О-ООАСОАСОТСОТОО-О-О-О-О-О
2	В	ТСС ТСО ТТТ ТОТ СОТ ТТТ СТС ОТТ
3	Контроль для В Класс	ТОС ТОС ТТТ ТТО СТО ОСТ ТТТ т
4	С	тсотсоттттсоосооссоссо
5	В	тсотсотттсотсоттттотсстт
6	В	ТСО тсс ТТТ ттс сто сот ТТТ т
7	Мягкий С	тсотсоттт-т-с-о-о-сооссоссо
8	Полумягкий В	тс-стс-отттт-стс-оттттстс-отт
9	Полумягкий С	тсотс-оттттсоос-ооссоссо
10	Полумягкий С	тсотсотптс-оосоосс-оссо
11	Полумягкий С	тсотсо-тптс-оососос-оссо
12	Полумягкий С	тсотс-отптс-оос-осос-сссо
13	Полумягкий С	ТСОТСОГПТАС-ООС-ОСС-ОТОССО
14	Полумягкий С	ТСОТСО-ТТТТАС-ООСОСС-ОТОССС
15	Полумягкий С	ТСОТС-ОТПТАС-ООСОСС-ОТОССС
16	Полумягкий С	тсотс-отптс-оосоосс-оссо

* Заменяющая фосфодиэфирную связь фосфоротиоатная связь в скелете олигонуклеотида указана (-)

Выделение РВМС

Цельную кровь (200 мл) собирали венозной пункцией в гепаринизированные вакутейнеры с зелеными крышками у десяти (10) нормальных, здоровых взрослых субъектов и пятнадцати (15) взрослых субъектов, хронически инфицированных НСУ, которые имели предшествующий 6-месячный курс терапии на основе ΙΡΝ-α и либо не имели успешного результата лечения, либо отвечали на лечение, но имели рецидив. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) очищали центрифугированием через Ρ^сο11-Нура^ие (АшегзЕаш РЕагшас1а Вю1есЕ, иррза1а, 8\ебеп) при 400*д в течение 35 мин. Клетки ресуспендировали при концентрации 10*10⁶ на мл в полной среде ΚΡΜΙ, содержащей 10% АВ-сыворотку человека (инактивированную нагреванием) и 1% пенициллин/стрептомицин.

Пролиферация В-клеток

Клетки выделяли, как описано выше, и ресуспендировали при 1*10⁶ на мл в полной среде ΚΡΜΙ и 100 мкл клеток добавляли в каждую лунку круглодонных 96-луночных планшетов. В лунки добавляли растворы ΟΏΝ (100 мкл) с получением выбранного диапазона конечных концентраций (1, 3, 6 мкг на

- 28 008777 лунку). Клетки культивировали в течение 5 дней и затем подвергали импульсному действию ³Нтимидина (1 мкКи на лунку) в течение 18 ч перед сбором на фильтровальную бумагу для измерения радиоактивности.

Результаты сообщаются в виде индекса стимуляции (8Ι) относительно необработанного контроля среды.

Анализы цитокинов

Свежевыделенные РВМС ресуспендировали при 10»10⁶ на мл (конечная концентрация 2») и 100 мкл клеток добавляли в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета, содержащую равный объем раствора 0^N (2» конечной концентрации). Диапазон концентраций (1, 3, 6 мкг/мл) испытывали на каждый 0БК Клетки инкубировали при 37°С с 5% С0₂. Спустя 48 ч клеточные супернатанты собирали из каждой лунки и замораживали при -80°С до анализа.

Уровни ШШа, ГР-10, ГБ-10 и ГЕ№у в супернатантах измеряли с использованием коммерческих наборов ЕЫ8А (В&Б §у8Геш8, М1ииеаро118, МН И8А; №-10, СаГ# Б№ 100, ΙΕ-10, СаГ# Б1000, №N-7, СаГ# ΌΙΡ50 или РВЬ ВюшеФсаГ ΙΕ№α СаГ# 41108). Когда измерения ЕЫ8А были ниже порога детектирования этого набора, указанного изготовителем, величину, равную самому низкому порогу детектирования, вводили в таблицы данных.

Результаты

РВМС, выделенные из крови, собранной у 15 хронически инфицированных НСУ субъектов и 10 нормальных здоровых добровольцев, инкубировали при 37°С с различными классами СрС (например, классом А, В, С, мягким С, полумягким В и полумягким С) и клеточные супернатанты оценивали на присутствие цитокинов, являющееся признаком секреции цитокинов во время периода инкубации. Результаты этих экспериментов приведены ниже.

Индукция секреции ΙΡΝ-α РВМС

При испытании трех классов СрС-0^N на РВМС у нормальных добровольцев очень высокие уровни -α продуцировались классом А (СрС 8ЕО ΙΌ N0:1), умеренно высокие уровни классом С (СрС 8Е0 ΙΌ N0:4) и только низкие уровни индуцировались классом В (СрС 8Е0 ГО N0:2) (фиг. 1). Основным клеточным источником ШШа является рБС.

В случае РВМС, полученных из хронических носителей НСУ, все три класса СрС могли индуцировать секрецию ШШа. Уровни с использованием классов В и С были такими же, что и уровни, полученные с нормальными РВМС. В противоположность этому, класс А индуцировал только приблизительно 50% нормального уровня (фиг. 1), что предполагает, что дисфункция НСУ-инфицированных рБС имеет некоторое влияние на эффективность СрС класса А в индукции ΙΕ^α, но не класса С. Таким образом, либо класс А, либо класс С мог бы быть использован для лечения хронических носителей НСУ, но в некоторых случаях класс С может быть предпочтительным.

Количество рБС определяли с использованием анализа ЕАС8. Линейную регрессию выполняли против этого в сравнении с количеством ΙΕ^α, секретируемым с СрС-0^N либо класса А, либо класса С, и обнаруживали приемлемую корреляцию для нормальных субъектов (например, К=0,43 и 0,58 соответственно). Кроме того, было обнаружено, что эта корреляция была несколько лучшей для 0^N класса С. В отличие от этого, не наблюдали корреляции между количеством рБС и количеством ΙΕ^α, секретируемым для НСУ-инфицированных субъектов (К=0,02 и 0,08 соответственно) (фиг. 3). Тем не менее НСУ-инфицированные БС способны секретировать ΙΕ№α в ответ на СрС-0БК

Анализировали также действие мягких и полумягких изменений в этих 0БК Синтезировали мягкие молекулы, которые имели ряд фосфодиэфирных связей в центральном районе этой молекулы. Синтезировали полумягкие молекулы, которые имели одну или более отдельных фосфодиэфирных связей, которые находились между нуклеотидами цитозином и гуанином СрС-мотивов. Как мягкие (фиг. 3), так и полумягкие (фиг. 4) СрС-0^N класса С были способны стимулировать секрецию ΙΕ^α из нормальных РВМС или НСУ-РВМС сходным образом в сравнении с исходными СрС-0^N класса С. Несколько из полумягких СрС-0^N класса С были даже более сильными, чем нормальный СрС-0^N класса С 8Е0 ЕБ N0:4 (фиг. 4). Это может быть обусловлено тем, что эта молекула является все еще достаточно стабильной для того, чтобы иметь максимальную иммунную стимуляцию, и эта фосфодиэфирная связь в середине СрС-мотива может увеличивать ее активность.

Индукция секреции ΙΡΝ-γ РВМС

Фиг. 5 сравнивает способность различных классов СрС индуцировать секрецию ТМ-цитокина, ШШ γ. Класс А индуцировал низкие уровни №N-7, тогда как в сравнении с ним класс В продуцировал умеренные количества, а класс С СрС стимулировал высокие концентрации №N-7. Как НСУинфицированные, так и нормальные РВМС обнаруживали сходную Тй1-реакцию для всех трех классов СрС. Сходные результаты были получены с полумягкими СрС-0^N класса С (фиг. 6).

Индукция секреции ΙΡ-10 РВМС

РР-10, хемокин, ассоциированный с продуцированием интерферонов типа 1 и 2, также индуцируется СрС-0Б№ Самые высокие уровни индуцируются СрС-0^N класса А, следующие высокие уровни индуцируются СрС-0^N класса С и самые низкие индуцируются СрС-0^N класса В. Независимо от класса

- 29 008777

СрС-ΟΌΝ, сходные уровни ГР-10 индуцируются клетками РВМС из организма нормальных субъектов и хронических носителей НСУ (фиг. 7).

Стимуляция В-клеток СрС-ΟϋΝ

Исследовали также действие СрС-ΟΌΝ на стимуляцию В-клеток. Как показано на фиг. 8 и 9, СрСΟΌΝ класса А был слабым стимулятором В-клеток как для НСУ-инфицированной, так и для нормальной популяций. В противоположность этому, СрС-ΟΌΝ классов В, С и полумягкого С сильно активировали В-клетки. Не было различий между РВМС из организма нормальных и НСУ-инфицированных субъектов.

Секреция 1Ь-10 из РВМС после стимуляции посредством СрС-ΟϋΝ

Оценивали также продуцирование цитокина ΙΠ-10 после стимуляции СрС-ΟΌΝ, и эти результаты показаны на фиг. 10. Как у НСУ-инфицированных, так и у нормальных субъектов все классы СрС-ΟΌΝ индуцировали значительную секрецию ΙΠ-10, и не было различий между РВМС из организма нормальных добровольцев и хронических носителей НСУ. Несколько типов клеток могут продуцировать ΙΠ-10 после инкубирования с СрС; однако, поскольку В-клетки являются главными продуцентами этого цитокина, продуцирование ΙΠ-10 может быть использовано в качестве индикатора уровня активации Вклеток.

Действия интрона А и рибавирина

Действие ш тйго рибавирина и экзогенного ΙΡΝ-α, интрона А, отдельно или в комбинации с СрС, испытывали на НСУ-инфицированных клетках. Ни рибавирин, ни интрон А, ни отдельно, ни вместе, не приводили к индукции секреции ΙΡΝ-α НСУ-инфицированными РВМС (фиг. 11).

Как обсуждалось выше, СрС-ΟΌΝ классов А и С приводят к сильной индукции секреции ΙΡΝ-α из рИС из нормальных и НСУ-инфицированных субъектов. Кроме того, при совместном использовании СрС-ΟΌΝ и интрона А наблюдали синергическую реакцию для большинства (60%) субъектов (фиг. 12).

Обсуждение

СрС-ΟΌΝ способны индуцировать ИС из пациентов, хронически инфицированных НСУ, для секреции ΙΡΝ-α, с более высокими уровнями при использовании СрС-ΟΌΝ классов А и С и более низкими уровнями при использовании СрС-ΟΌΝ класса В. Эти уровни секретируемого ΙΡΝ-α сравнимы с уровнями, наблюдаемыми в случае клеток из нормальных здоровых добровольцев. СР-10 также индуцируется из стимулированных НСУ-РВМС, что дополнительно указывает на иммунную активацию ТЕ1-типа.

НСУ-антигенспецифические иммунные реакции уже присутствуют в лицах, хронически инфицированных НСУ. Они являются ТЕ2-смещенными и, следовательно, не могут вызывать клиренс НСУинфицированных клеток. Реакции ТЕ1-типа являются необходимыми для выведения (клиренса) вируса. Увеличение системных уровней ТЕ1-цитокинов, без дополнительного антигена, позволяет лицам, хронически инфицированным НСУ, развивать НСУ-специфические иммунные реакции ТЕ1-типа, которые являются инструментом вирусного клиренса. Все классы СрС-ΟΌΝ (А, В и С) способны устанавливать реакции ТЕ1-типа. Эти реакции ТЕ1-типа являются существенными для долгосрочного клиренса хронической инфекции НСУ, но их трудно индуцировать терапией экзогенным ΙΡΝ-α, который имеет прямые антивирусные действия, но не прямые действия на иммунную систему. Таким образом, СрС-ΟΌΝ может быть использован в комбинации с экзогенным ΙΡΝ-α для лечения хронических носителей НСУ.

Альтернативно, СрС-ΟΌΝ мог бы также использоваться отдельно. Благодаря индукции цитокинов, таких как ΙΡΝ-α и ΙΡΝ-γ, СрС-ΟΌΝ сам имеет прямые антивирусные действия, в дополнение к индукции НСУ-специфических иммунных реакций ТЕ1-типа. В некоторых случаях, молекулы класса А и С являются предпочтительными, так как они индуцируют более высокие уровни ΙΡΝ-. В зависимости от их конкретной последовательности, СрС-ΟΌΝ могут предпочтительно стимулировать функции рИС, созревание и продуцирование ΙΡΝ-типа Ι (Кгид, А. еГ а1., Еиг I Iттиηο1, 2001; 31:2154-2163). Хотя согласно изобретению показано, что два класса СрС-ΟΌΝ являются предпочтительными в стимуляции продуцирования ΙΡΝ-α, любой СрС-ΟΌΝ, независимо от скелета или последовательности СрС-ΟΌΝ, мог бы быть использован в лечении хронического НСУ. Контролируемое высвобождение различных изоформ ΙΡΝ-типа Ι специфическими СрС-ΟΌΝ ш νί\Ό является предпочтительным относительно системного введения рекомбинантного ΙΡΝ-типа Ι, который является единственным подтипом (например, интрон А является только ΙΡΝ-α-2^. Мягкие и полумягкие версии СрС-ΟΌΝ способны стимулировать сходные уровни ΙΡΝ-α в сравнении с их исходной молекулой. Мягкие или полумягкие версии СрС-ΟΌΝ, в частности, класса С, могли бы предпочтительно использоваться для продолжительного лечения НСУ, так как они являются более легко деградируемыми, и, следовательно, можно не ожидать их накопления в органах, в частности, в печени, селезенке и почках.

По меньшей мере 50% субъектов с НСУ не способны отвечать на терапию экзогенным ΙΡΝ-α, однако, СрС-ΟΌΝ (особенно классов А и С) были способны индуцировать секрецию ΙΡΝ-α ш тйго при уровнях, сравнимых с уровнями нормальных здоровых добровольцев во всех субъектах. Таким образом, СрСΟΌΝ можно было бы использовать для лечения пациентов, которые не отвечали на терапию экзогенным ΙΡΝ-α, независимо от того, является ли этот ΙΡΝ-ПЭГилированным или неПЭГилированным, и независимо от того, включает ли это лечение рибавирин или не включает. Классы СрС-ΟΌΝ, которые индуци

- 30 008777 руют высокие уровни ΙΡΝ-α, являются предпочтительными, и еще более предпочтительными для продолжительного лечения были бы полумягкие версии.

Ни коммерческий интрон-А (ΙΡΝ-α-26), ни рибавирин, отдельно или в комбинации, не были способны индуцировать секрецию ΙΡΝ-α из РВМС из организмов нормальных или НСУ-инфицированных субъектов ίη тДго. Однако при использовании СрС-ΟΌΝ в комбинации с интроном-А наблюдали синергическое действие для секреции ΙΡΝ-α из РВМС из организмов НСУ-инфицированных субъектов. Было показано, что ΟΌΝ класса С обнаруживает синергизм с экзогенным ΙΡΝ-α; однако, лечение любым классом СрС-ΟΌΝ с коммерческими альфа-интерферонами было бы терапевтически эффективным. Как упоминалось ранее, вследствие их относительной легкости деградации до неиммуностимуляторных метаболитов, полумягкие версии СрС-ΟΌΝ могли бы использоваться для продолжительного лечения без риска накопления в конечных органах, таких как почки.

Подразумевается, что рибавирин действует на ТЫ, но в этих исследованиях он не проявлял иммуностимуляторную активность на РВМС человека. Даже в комбинации с интроном А рибавирин не усиливал продуцирование эндогенного ΙΡΝ-α. Таким образом, замена рибавирина в комбинированной терапии для НСУ на СрС-ΟΌΝ будет увеличивать долю длительных вирусных реакций. При комбинировании с СрС-ΟΌΝ рибавирин снижал эффективность СрС-ΟΌΝ. Таким образом, СрС-ΟΌΝ должен предоставляться в комбинации с альфа-интерферонами в отсутствие рибавирина.

СрС-ΟΌΝ вводили субъектам-людям ΙΜ, БС и Ιν, и было определено, что он является хорошо переносимым и безопасным (клиническое испытание, продолжающееся). Приемлемым был бы любой эффективный способ ввдения, такой как 8С, ΙΜ, ГУ, ингаляция и т.д., однако, предпочтительным является подкожное введение. СрС-ΟΌΝ разбавляли в ТЭ-буфере и добавляли к РВМС, однако, СрС-ΟΌΝ могли быть также приготовлены в виде систем доставки, таких как биоадгезивные полимеры (БДа е! а1., 1999), кохлеаты (Сои1й-Родеп!е е! а1., 1994, 1996), дендримеры (Кикошзка-БайаДо е! а1., 1996, Οίη е! а1., 1998), покрытые энтеросолюбильным покрытием капсулы (Схегкиъку е! а1., 1987, Бетте е! а1., 1987), эмульсомы (Уапсо!! е! а1., 1998, Бо\ее11 е! а1., 1997), Ι8ί.ΌΜ (Моша! е! а1., 1993, Мотет е! а1., 1999, Ни е! а1., 1998, Саткзоп е! а1., 1991), липосомы (СБПйеге е! а1., 1999, М1сДа1ек е! а1., 1989, 1992), микросферы (Сир!а е! а1., 1998, Ма1оу е! а1., 1994, Е1йпйде е! а1., 1989), наносферы (Коу е! а1., 1999), полимерные кольца (\Ууа!! е! а1., 1998), протеосомы (Боше11 е! а1., 1988, 1996) и виросомы (С1иск е! а1., 1992, Мепд1агй1 е! а1., 1995, Сгух е! а1., 1998).

Для лечения хронических носителей НСУ СрС-ΟΌΝ мог бы вводиться на повторяемой основе от одного раза в день до одного раза в месяц, но предпочтительно каждые 3-10 дней и наиболее предпочтительно один раз в неделю в течение продолжительного периода. Этот период мог бы быть периодом от одного месяца до двух лет, но предпочтительно 3-12 месяцев и наиболее предпочтительно в течение 6 месяцев. Таким образом, наиболее оптимальная терапия предусматривает введение два раза в неделю или один раз в неделю в течение 6 месяцев. Введение могло бы производиться также более часто во время индуктивной фазы (один раз в день каждый второй день или два раза в неделю или один раз в неделю в течение 1-3 месяцев), затем менее часто для поддержания (один раз в неделю или в каждую вторую неделю или один раз в месяц в течение еще нескольких месяцев).

Для комбинированной терапии СрС-ΟΌΝ и альфа-интерфероны (ПЭГилированные или неПЭГилированные) могли бы потенциально (ί) смешиваться вместе и предоставляться одновременно и одним и тем же способом введения (подкожно), (и) предоставляться одновременно и одним и тем же способом, но в несмешанном виде, (ш) предоставляться одновременно, но различными способами (например, альфа-интерферон мог бы вводиться 8С, а СрС-ΟΌΝ мог бы вводиться РУ, ГО, перорально или местно), (ίν) предоставляться в разных временных точках и при разных схемах введения одним и тем же способом или различными способами или (ν) предоставляться последовательно. В последнем случае предпочтительно сначала должен предоставляться ΙΡΝ-α для уменьшения вирусной нагрузки, затем СрС-ΟΌΝ должен предоставляться после этого для индукции и поддержания адоптивного иммунитета для продолжительного контроля.

Ссылки

1. СДоо, р.Ь., С. Кио, АД. Уетет, Ь.К. Ονе^Ьу, БАУ. Вгай1еу, М. НоидД!оп. 1989. коЬДоп ой а сБНА с1опе йептей йгот а Ыоой-Ьогпе поп-А, поп-В т1га1 ДераДДз депоте. 8с1епсе. 244:359-62.

2. СДоо, р.Ь., К1сДтап, К.Н., Нап, РН., Вегдег, К., Бее, С., Бопд, С., Са11едоз, С., СоД, Б., МейтаБе1Ьу, К., Вагг, Р.Й., е! а1. 1991. СепеДс огдашхаЕоп апй йгуегзДу ой !1е ДераДДз С νίπίδ. Ргос М1!1 Асай δα И8А. 88: 2451-5.

3. тап йег Рое1, С.Б., Сиурегз, Н.Т., Кеезшк, НАУ. 1994. НераДДз С νίπΐδ κιχ уеагз оп. Бапсе!. 344:1475-9.

4. тап йег Рое1, С.Б. 1994. НераДДз С νίπίδ. Ер1йетю1оду, Дипзтйззтп апй ргетепДоп. Сигг 8!ий Нета!о1 В1оой Тгапзйиз: 137-63.

5. К1уозаша, К., Бойеуата, Т., Тапака, Е., С1Ьо, Υ., ΥοзД^ζаша, К., Nакаηο, Υ. Ригийа, δ., АкаДапе, Υ., МзЫока, К., Ригсе11, К.Н., е! а1. 1990. Iη!е^^е1а!^οηзД^р ой Ь1оой Дипзйизюп, поп-А, поп-В ДераДДз апй Дера!осе11и1аг сатсшота: апа1уз1з Ьу йе!ес!юп ой апДЬойу !о ДераДДз С тДиз. Нера!о1оду. 12: 671-5.

- 31 008777

6. А1(ег, МЛ., Магдойк, Н.8., Кга\\'с/упккк К., 1ибкоп, Ρ.Ν., Магек, А., А1ехапбег, XV.!. Ни, Р.У., М111ег, 1.К., ОегЬег, М.А., 8атр1шег, К.Е., е( а1. 1992. ТНе па(ига1 Ыйогу оГ соттипйу-асс.|шгеб Нераййк С ш (Не Ипйеб 81а1ек. ТНе 8епйпе1 Соипйек СНгошс поп-А, поп-В Нераййк 81ибу Теат. Ν Епд1 1 Меб. 327: 1899-905.

7. А1(ег, М.1. 1994. Тгапкпиккюп оГ Нераййк С упик-гоЫе, боке, апб Шег. Ν Епд1 1 Меб. 330: 784-6.

8. А1(ег, М.1. 1994. Кеу1е\\' оГ кего1одк (екйпд Гог Нераййк С У1гик шГесйоп апб пкк оГ рокйгапкГикюп Нераййк С АгсН Ра(Но1 ЬаЬ Меб. 118: 342-5.

9. А11ег, М.1., Мак!, Е.Е. 1994. ТНе ер1бетт1оду оГ упа1 Нераййк ш (Не Иш!еб 8!а!ек. Оак!гоеп!его1 С1ш ΝΘΓίΕ Ат. 23:437-55.

10. ’№етег, А.1., Оеукеп, Н.М., СНпкЮрНегкоп, С., На11, ЕЕ., Макоп, Т.Е, 8агассо, О., Вошпо, Ρ., Сга\\Гогб, К., Мапоп, С.Э., СгатеГогб, К.А., е! а1. 1992. Еу1бепсе Гог 1ттипе ке1есйоп оГ Нераййк С У1гик (НСУ) ри!а!1уе епуе1оре д1усорго!ет уапаЫк: ро!еп!1а1 го1е ш сНгошс НСУ 1пГесйопк. Ргос №111 Асаб 8а И8А. 89:3468-72.

11. Ка!о, Ν., Οо!киуата, Υ., 8ек1уа, Н., ΟΗ^Η! 8., Nакаζа\νа. Т., Н1_)1ка!а, М., 8Ыто!оНпо, К. 1994. Оепейс бпй т НурегуапаЫе гедтп 1 оГ (Не упа1 депоте т регык!еп! Нераййк С упик тГесНоп. 1 У1го1. 68:4776-84.

12. П1еро1бег, Н.М., ΖасΗоνа1. К., НоГГтапп, К.М., А1егепда, Е.А., 8ап!ап!ошо, Т., 1ипд, М.С., Е1сНеп1аиЬ, Ό., Раре, О.К. 1995. Рокк1Ь1е тесНашкт шуоМпд Т-1утрНосу(е гекропке !о поп-к!гис!ига1 ргоГеш 3 т У1га1 с1еагапсе т аси!е Нераййк С упик шГесйоп. Ьапсе!. 346:1006-7.

13. М1кка1е, О., Вейош, К., Ьатопаса, У., УаЫ, А., Маккап, М., Моп, С., Кит1, М.О., НоидЫоп, М., Р1ассабог1, Ρ., Реггап, С. 1996. Э1ГГегеп1 с11шса1 ЬеНауюгк оГ аси!е Нераййк С У1гик тГесНоп аге аккоаа!еб \\НН ббЕегеп! У1дог оГ (Не апй-у1га1 се11-теб1а!еб 1ттипе гекропке. 1 С1т 1пуек!. 98:706-14.

14. Тка1, 8.Ь., Ь1ате, Υ.Ρ., СНеп, М.Н., Ниапд, ΟΥ., Кио, О.С 1997. Ое1есйоп оГ !уре 2-11ке Т-Не1рег се11к ш Нераййк С упик шГесйоп: ппрНсаНопк Гог Нера!1!1к С У1гик сНгошсйу. Нера!о1оду. 25: 449-58.

15. КеНегтапп, В., СНапд, К.М., МсНЫсЫкоп, ЕО., Кокка, К., НоидЫоп, М., Опкагк Ρ.Υ. 1996. Оиап(Найуе апа1ук1к оГ (Не репрНега1 Ь1ооб су!о!ох1с Т 1утрНосу1е гекропке ш райеп(к \νί11ι сНгошс Нера!1!1к С У1гик шГесйоп. 1оита1 оГ С11шса1 1пуекйдайоп. 98:1432-1440.

16. Епсккоп, А.Ь., НоидЫоп, М., СНоо, р.Ь., Аетег, А.Е, Ка1к(оп, К., МисНтоге, Е., Аа1кег, С.М. 1993. Нераййк С у1гик-кресШс СТЬ гекропкек т (Не Нуег оГ сЫтрап/еек \\НН аси(е апб сНгошс Нераййк С. 1 1ттипо1. 151:4189-99.

17. СНеп, М., 8а11Ьегд, М., 8оппегЬогд, А., АеНапб, Ο., Майккоп, Ь., Лп, Ь., В1гкей, А., Ре(егкоп, Ό., М1ЛсН, О.К.1999. ЫтНеб Нитога1 1ттипйу ш Нераййк С У1гик шГесйоп. Сак1гоеп1его1оду. 116: 135-43.

18. №1д1ег, А., Ьашег, Ь.Ь., РЫШрк, ЕН. 1988. ТНе еГГссГк оГ 1Ь-4 оп Нитап па(ига1 кШег се11к. А ро1еп1 геди1а(ог оГ 1Ь-2 асйуайоп апб ргоЛГегайоп. 1 1ттипо1. 141: 2349-51.

19. Магйпех, Ο.ΙΗ., О1ЬЬопк, К.8., Оагоуоу, М.К., Агопкоп, Ρ.Ε. 1990. 1Ь-4 шЫЬйк 1Ь-2 гесер(ог ехргеккюп апб 1Ь-2-берепбей ргоНГегайоп оГ Нитап Т-се11к. 1 1ттипо1. 144:2211-5.

20. Мооге, К.А., бе Vааί МЫеГуС ΟΌ.Ά.Β.., У1епа, Р., Моктапп, Т.К. 1993. ЫГепеикт-Ю. Аппи Кеу 1ттипо1. 11:165-90.

21. бе Vааί МЫеГуС К., 1. Наапеп, Н. 8рйк, М. О. Копсаго1о, А. (е Уе1бе, С. Ρ^дбо^, К. 1оНикоп, К Как(е1ет, Н. Υδ^ί, 1. Е. бе Упек. 1991. 1п(ег1еик1п 10 (1Л-10) апб У1га1 1Л-10 кйопд1у гебисе апйдеп-кресШс Нитап Т-се11 ргоНГегайоп Ьу б1т1ЫкЫпд (Не апйдеп-ргекепйпд сарасНу оГ топосу(ек У1а ботепгеди1айоп оГ с1акк II та)ог ЫкЮсотраНЬПНу сотр1ех ехргеккюп. 1 Ехр Меб. 174:915-24.

22. Ρωι^ΐ™, Ό.Ρ., А. Ζ1о!п^к, Р. У1епа, Т.К. Моктапп, М. Нотеагб, К.\\^;. Мооге, ΟΌΑ. 1991. 1Л-10 ас(к оп (Не апйдеп-ргекепйпд се11 (о 1пН1ЬН су(окте ргобисйоп Ьу ТН1 се11к. 1 1ттипо1. 146:3444-51.

23. 8сН1аак, ΕΡ., Т. РНх, НЕ. ЬоНг, К.Н. Меуег хит ВиксНепГе1бе, О. Оегкеп. 1998. 1Ыег1еикт 12 епНапсек беПаеп! НСУ-апйдеп-тбисеб ТН1-(уре 1ттипе гекропке оГ репрНега1 Ь1ооб топопис1еаг се11к. 1 Меб У1го1. 56: 112-7.

24. СасаагеШ, Т.У., О.М. Магйпех, К.О. О1кН, ЕС. УШапиеуа, 8.М. Кгатк. 1996. 1ттипогеди1а(огу суЮктек ш сНгошс Нераййк С У1гик шГесйоп: рге- апб рок11геа1теп1 \\ЙН НиегГегоп а1Га. Нера(о1оду. 24:6-9.

25. КихикНйа, Ν., Ν. НауакЫ, К. Ка(ауата, Т. Катаба. 1995. |Н№о1од1са1 ГеаЫгек апб Н^А-^NА (урек 1п НСУ сатегк тейН регк1к(еп(1у погта1 АЬТ 1еуе1к]. №рроп КткНо. 53: 576-81.

26. Кап(о, Т., Ν. НауакЫ, Т. ТакеНага, Т. Тайитк Ν. КихикНйа, А. Но, Υ. 8акак1, А. КакаНага, М. Ноп. 1999. 1траиеб а11ок11ти1а1ог^· сарасйу оГ рег1рНега1 Ь1ооб бепбпЕс се11к гесоуегеб Ггот Нераййк С уииктГейеб тб1У1биа1к. 1 1ттипо1. 162: 5584-91.

27. Ват, С, А. Ρι^, Ρ. Ζои1^т, ЕР. Ζа^кк^, С, Тгеро, О. 1псНаикре. 2001. 1трапеб а11окйти1а(огу ГипсНоп оГ бепбгЫс се11к т сНгошс Нераййк С 1пГесйоп. Сак1гоеп1его1оду. 120: 512-24.

28. 8аикопио, Ό., С. Ео1екопеге, У. СотассЫи1о, М. Ρаие11^, Р. Оа(й, О. 1об1се, У. КасапеШ, Ρ. Эаттассо. 1998. Нераййк С упик шГесйоп туоЫек СЭ34(+) Нета1оро1еНс ргодепйог се11к т Нераййк С У1гик сНгошс сатегк. В1ооб. 92: 3328-37.

29. АнГГегтапп-СгеРтдег, 8., Е.В. КееГГе, 8. Ьеуу. 2001. 1тра1геб бепбпйс се11 таШгайоп т райеЫк \\НН сНгошс, Ьи( по( гекоЫеб, Нераййк С упик шГесйоп. В1ооб. 97: 3171-6.

30. Кгике, М, Ο. Кокопик, Ρ. КгаРег, О. 81е1/, С. КиНЫ, О. 8сНи1ег, 1. НаиЬег, А. 8(е1пкаккегег. 2000.

- 32 008777

Ма1иге бепбг1Нс се11к Н1Гес(еб \νίΐ1ι Негрек к1тр1ех νίΓ^ικ 1уре 1 ехЫЬН шЫЬНеб Т-се11 к(тш1а(огу сарасНу. 1 У1го1. 74:7127-36.

31. Рид1ег-УМег, Ι., С. 8егее!-Ое1рга!, Р. КкаШег, М.С. К1ккоап, Υ.Ι. Ыи, С. КаЬоигбт-СотЬе. 1997. Меак1ек νίπικ кирргеккек се11-теб1а1еб 1ттиш1у Ьу ИНегГеппд \νίΐ1ι (Не кпггНО апб ГипсНопк оГ бепбпНс апб Т-се11к. 1 Ехр Меб. 186: 813-23.

32. 8агоЬе е!.а1. 2002, 1оигпа1 оГ У1го1о§у 76:10, 5062-5070 СЫкап, Р.У., С. Реггап. 1995. НераННк В упик 1ттипора1Нодепек1к. Аппи Кет Iттиηο1. 13:29-60.

33. Ойкал, Р.У. 1997. Су(о(ох1с Т-се11к апб νΐΓη1 НераННк. 1оита1 оГ СНшса1 IηνеκΗдаΗοη. 99: 14721477.

34. Мапаппеаи, Р., А.М. 81еГГап, С. Коуег, М.Т. Бгоие!, Ό. 1аеск, А. К1т, У. БепЬеГ 1999. ШГесНоп оГ рлтагу сиНигек оГ Нитап КирГГег се11к Ьу Бепдие уНик: по νίΓπ1 ргодепу куп1Нек1к, Ьи( су(окте ргобисНоп 1к е^бет 1 У1го1. 73:5201-6.

35. Кпед, А.М., А.К. Υί, 8. Ма1коп, Т.1. ^а1бксНт1б1, С.А. В1кНор, К. Теакба1е, С.А. Когеаку, Б.М. КНптап. 1995. СрС тоНГк ш Ьас(ег1а1 ΩΝΛ (Г1ддег б1гес! В-се11 асШаНоп. Ыа!иге. 374: 546-9.

36. Υί, А.К., Р. НотЬеск, Б.Е. ЬаГге^, А.М. Кпед. 1996. СрС БЧА гексие оГ типпе В 1утрНота се11к Ггот апНЧдМ-тбисеб дгот1Н аггек( апб ргодгаттеб се11 беа(Н 1к аккоаа1еб \\'НН тсгеакеб ехргеккюп оГ стус апб Ьс1-хЬ. 1 Iттиηο1. 157: 4918-4925.

37. Υί, А.К., 1.Н. СНасе, 1.8. Сотбегу, А.М. Кпед. 1996. ΙΡΝ-датта ргото1ек Ш-6 апб ЦМ кесгеНоп ш гекропке (о СрС тоНГк т Ьас(ег1а1 БЧА апб о11добеохупис1еоНбек. 1оита1 оГ Iттиηο1οду. 156: 558-64.

38. КНптап, Б.М., А.К. Υί, 8.Ь. Веаисаде, 1. Сοηονе^, А.М. Кпед. 1996. СрС тоНГк ргекеп! ш Ьас(ела БЧА гар1б1у шбисе 1утрНосу(ек !о кесге(е т!ег1еикш 6, т!ег1еикт 12, апб ш1егЕегоп датта. Ргос ЫаП Асаб 8а И8А. 93: 2879-2883.

39. КНптап, Б.М., Б. Уег1Не1у1, Ρ. ТакекННа, К.1. От. 1999. Iттиηе гесодшНоп оГ Гоге1дп БЧА: а сиге Гог Ью1еггопкт? Ιπιπιπιάν. 11:123-9.

40. На1рет, М.Б., К.1. Киг1апбег, Б.8. Р1ке1кку. 1996. Вас(ела1 БЧА тбисек типпе т1егГегоп-датта ргобисНоп Ьу к(тш1а(юп оГ т!ег1еикт-12 апб (итог песгок1к Гас(ог-а1рНа. Се11 Iттиηο1. 167:72-8.

41. Сотбегу, 1.8., кН. СНасе, А.К. Υί, А.М. Кпед. 1996. Вас!епа1 БЧА тбисек ΝΧ се11к 1о ргобисе ΙΡΝ-датта т νί\Ό апб тсгеакек (Не (охюНу оГ Нроро1укассНалбек. 1 Iттиηο1. 156:4570-4575.

42. 8сНтаг17, Б.А., Т.1. Оишп, Р.8. ТНоте, 8. 8ауееб, А.К. Υί, А.М. Кпед. 1997. СрС тоНГк т Ьас!епа1 БЫА сайке 1пГ1аттаНоп т (Не 1отег гекрпа(огу (гас(. 1оита1 оГ С11п1са1 ^е^аНою 100:68-73.

43. Υататοΐο, 8., Т. Υататοΐο, Т. Ка(аока, Е. Кигато1о, Ο. Υаηο, Т. Токипада. 1992. итс.|ие раНпбготк кециепсек т куп(НеНс оНдопис1еоНбек аге гес.|тгеб 1о тбисе ΙΡΝ [соггесНоп оГ ΙΝΡ] апб аидтеп1 ΙΡΝтеб1а(еб па1ига1 кШег ас(^ν^(у. 1 ^типок 148: 4072-6.

44. Ва11ак, Ζ.Γ., νΕ. Кактиккеп, А. М. Кпед. 1996. ШбисНоп оГ ΝΙ< ас(^ν^(у ш типпе апб Нитап се11к Ьу СрС тоНГк ш о11добеохупис1еоНбек апб Ьас(ела1 БЫА. 1 Iттиηο1. 157: 1840-1845.

45. СНасе, кН., Ы.А. Ноокег, К.Ь. МНбепкГещ А.М. Кпед, 1.8. Сотбегу. 1997. Вас(ела1 ПЫА-1пбисеб ЯК се11 ΙΡΝ-датта ргобисНоп 1к берепбеп1 оп тасгорНаде кесгеНоп оГ Ш-12. СНшса1 Iттиηο1οду & Ιιηтппора(Но1оду. 84:185-93.

46. Котап, М., Е. МагНп-Сго/со, 1.8. Сообтап, М.Б. Nдиуеη, Υ. 8а(о, А. КопадНу, К.8. КотЬ1и1Н, Б.Б. К1сНтап, Б.А. Сагкоп, Е. Нах. 1997. Iттиηοκΐ^ти1аΐο^у БХА кециепсек ГипсНоп ак Т Не1рег-1рготоНпд абщ\'ап(к [кее соттеп1к]. №1( Меб. 3: 849-54.

47. Кпед, А.М., 8. Ма!коп, К. СНепд, Е. Ρί^Γ, С.А. КогеРку, 1.С. Ко1апб. 1997. Iбеπ(^Г^са(^οπ оГ ап о11добеохупис1еоНбе кециепсе тоНГ На! кресШса11у тЫЬНк рНокрНогу1аНоп Ьу рго(ет 1угокте ктакек. АпНкепке апб ШсОс Ас1б Бгид Бе\'е1ортеп( 7:115-23.

48. Бау^, Н.Ь., К. ^еегап1а, Т.1. ^а1бксНт1б1, Ь. ТудгеН, 1. 8сНогг, А.М. Кпед. 1998. СрС БХА 1к а ро(еп( епНапсег оГ кресШс ттшпНу т писе ттштхеб νί(Ε гесотЬтаШ НераННк В кигГасе апНдеп. 1оита1 оГ Iттиηο1οду. 160: 870-6.

49. Мο1бονеаπи, Ζ., Ь. ^ονе-Нοтаπ, \ν.ρ. Ниапд, А.М. Кпед. 1998. СрС БКА, а ηονе1 1ттипе епНапсег Гог кук1етк апб тисока1 ттштхаНоп νί(Ε тПпепха Сгпк. Уассте. 16:1216-24.

50. СНи, К.8., Ο.8. Тагдош, А.М. Кпед, Р.У. ЬеНтапп, С.У. Нагбтд. 1997. СрС о11добеохупис1еоНбек ас1 ак аб^иνаπ(κ 1На1 к\\а(сН оп Т Не1рег 1 (ТН1) ттшпНу. 1оита1 оГ Ехрептеп1а1 Мебтте. 186: 1623-31.

51. Ь1рГогб, С.В., М. Ваиег, С. В1апк, К. КеНег, Н. Уадпег, К. Неед. 1997. СрС-соп1а1шпд купИеНс о11допис1еоНбек ргото1е В апб су1о1ох1с Т-се11 гекропкек 1о рго(ет апНдеп: а пет с1акк оГ \'ассте аб^иνаπ(κ. Еиг 1 ^типок 27: 2340-4.

52. ^етег, С.1., Н.М. Ьш, 1.Е. ^оо1бг1бде, С.Е. БаН1е, А.М. Кпед. 1997. Iтт^тοκΐ^ти1аΐο^у оНдобеохупис1еоНбек соп1аштд 1Не СрС тоНГ аге еГГес(Н'е ак 1ттипе аб)т'ап(к т 1итог апНдеп 1ттшиха(юп. Ргосеебтдк оГ Не №1Нопа1 Асабету оГ 8аепсек оГ 1Не ИпПеб 81а1ек оГ Атепса. 94: 10833-7.

53. К11пе, Ι.Ν., Т.1. ^аИксНпибН Т.К. Виктда, 1.Е. Ьет1кН, 1.У. ^етк(оск Р.8. ТНогпе, А.М. Кпед.

1998. Моби1аНоп оГ а1гтау шЙаттаНоп Ьу СрС о11добеохупис1еоНбек ш а типпе тобе1 оГ ак(Нта. 1 Iттипо1. 160: 2555-9.

54. Кпед, А.М. 2001. Ι кпот ту СрСк. Тгепбк М1сгоЬю1. 9:249-52.

55. Кпед, А.М., Ь. ^ονе-Нοтаη, А.К. Υί, 1.Т. НаПу. 1998. СрС ^NА тбисек кик1атеб Ш-12 ехргек

- 33 008777

81ои ίη у1уо апй гекккапсе ко Ьккейа топосукодепек с1а11епде. й Iттиηо1. 161: 2428-34.

56. Аа1кег. Р.8., Т. 8сйагкоп-Кег8кеп, А.М. Кйед, Ь. Ьоуе-Нотап, Е.Б. Ко\\1оп. М.С. ийеу, Й.С. Уоде1.

1999. ЛппипоЛтЫакогу о11дойеохупис1еоййе8 рготоке ргокескйуе пптиЫку апй ргоу1йе куккетйс Легару Гог 1екйташа8к У1а Ш-12- апй ΙΡΝ-датта-йерепйепк тесйапктк. Ргос №111 Асай 8а И8А. 96:6970-5.

57. Сгатхпъкк К.А., Б.Ь. Боо1ап, М. 8ейедай, Н.Ь. Бау18, А.М. Кйед, 8.Ь. НоГГтап. 2001. Лкег1еикт-12- апй датта ткегкегоп-йерепйепк ргокесйоп адашкк та1айа сопГеггей Ьу СрО о11дойеохупис1еок1йе ш тке. ЛГеск Iттии. 69: 1643-9.

58. Ко£й, Ь., О.С. Мек, О. АпкопеШ, О. Ве11ай, Р. РаЫххпкк А. Р1рето, М. Роххк Б. Кау1хха, О. Апде11, Р. Б1апхап1, ек а1. 1995. Вгеаккйгоидй йийпд гесотЫпапк шкегГегоп а1Га Легару т райепк \\йЛ сйгошс Ьерак1к18 С У1ги8 шГесйоп: ргеуа1епсе, ейо1оду, апй тападетепк. Нерако1оду. 21:645-9.

59. Инак Υ., 8. Катака, 8. Татига, Ι. УаЬиисЫ, 8. №йа, М. Лайа, Υ. Маейа, Υ. 8Ыга1, Т. Рикпхакк Ι. Ка_р, Н. кЫката, Υ. Макийа, М. М18Й1ка^а, К. 8ек1, Υ. Макихата. 1998. Ке1айоп оГ шкегГегоп Легару апй йеракосе11и1аг сагсшота т райепк \\йк11 сйгошс НераШк С. ΟδηΚη Неракосе11и1аг Сагстота Ргеуепйоп 8кийу Огоир. Апп Лкет Мей. 129: 94-9.

60. Баук Н.Ь., С.С., Мопк М.Ь., Ейег 8.М., Сатегоп Б.\У., НеаЛсоке й. 2000. СрО ΟΌΝ к каГе апй ЫдЫу еГГесйуе т йитапк ак афиуапк ко НВУ уассте: Ргейтшагу ге8и1к оГ Рйаке Ι йгйай \\йЛ СрО ΟΌΝ 8Е0 ΙΌ ΝΟ. 2. Ргекепкей ак Т1е ТЫгй Аппиа1 СопГегепсе оп Уассте Кекеагсй. 825: 47.

Эквиваленты

Должно быть понятно, что в отношении описанных здесь вариантов могут быть произведены различные модификации. Таким образом, приведенное выше описание должно рассматриваться не как ограничивающее, а только как примеры предпочтительных вариантов. Специалисты с квалификацией в данной области смогут представить себе другие модификации в объеме прилагаемой формулы изобретения.

Все ссылки, патенты и патентные заявки, описанные здесь, включены тем самым в качестве ссылок в полном объеме.

Claims (72)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения субъекта с хронической инфекцией НСУ, прежнее лечение которого с помощью предыдущей не-СрО-терапии оказалось безуспешным, предусматривающий введение субъекту, в случае необходимости такого лечения, иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты без дополнительного антигена в количестве, эффективном для лечения указанной инфекции.
2. 2. Способ по п.1, где не-СрО-терапия включает в себя введение интерферона альфа.
3. 3. Способ по п.2, где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.
4. 4. Способ по п.2, где не-СрО-терапия включает в себя введение интерферона альфа и рибавирина.
5. 5. Способ по п.2, где не-СрО-терапия включает в себя введение ПЭГилированного интерферона альфа и рибавирина.
6. 6. Способ по п.1, где иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота класса А, класса В или класса С.
7. 7. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадию введения субъекту интерферона альфа.
8. 8. Способ по п.7, где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.
9. 9. Способ по п.7, где интерферон альфа вводят, по существу, одновременно с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой.
10. 10. Способ по п.1, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета, при этом предпочтительно, чтобы модификация скелета являлась фосфоротиоатной модификацией скелета.
11. 11. Способ по п.1, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет.
12. 12. Способ лечения субъекта с хронической инфекцией НСУ, который идентифицирован как таковой, который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты без дополнительного антигена в количестве, эффективном для лечения этой инфекции.
13. 13. Способ по п.12, где субъект идентифицируется как таковой, который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию, на основе анализа интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, или на основе генотипа НСУ.
14. 14. Способ по п.12, где не-СрО-терапия включает в себя введение интерферона альфа или интерферона альфа и рибавирина.
15. 15. Способ по п.12 или 14, дополнительно предусматривающий введение субъекту антивирусного агента, причем предпочтительно, чтобы антивирусным агентом являлся интерферон альфа.

    - 34 008777
16. 16. Способ по п.15. где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь. интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.
17. 17. Способ по п.15. где интерферон альфа вводят в субтерапевтическом количестве.
18. 18. Способ по п.12. где иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.
19. 19. Способ по п.12 или 18. где иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет.
20. 20. Способ скрининга иммуностимуляторных СрС-нуклеиновых кислот. применимых в лечении хронической вирусной инфекции гепатита С. предусматривающий контактирование ίη νίίτο мононуклеарных клеток периферической крови. полученных из организма субъекта. имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С. с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой без дополнительного антигена. и измерение иммунной реакции мононуклеарных клеток крови после этого воздействия. причем субъект является таковым. для которого прежняя терапия оказалась безуспешной.
21. 21. Способ по п.20. где иммунная реакция выбрана из группы. состоящей из стимуляции В-клеток. секреции 1Ь-6. секреции 1Ь-10. секреции 1Ь-12. секреции интерферона гамма. секреции интерферонов типа 1 (альфа+бета). секреции ΙΡ-10. активности природных клеток-киллеров (ΝΚ). экспрессии СЭ80. экспрессии ί.Ό86. экспрессии СЭ83 и повышения экспрессии МНС класса II.
22. 22. Способ по п.20. где мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки.
23. 23. Способ по п.22. где дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки.
24. 24. Способ по п.22. где иммунная реакция выбрана из группы. состоящей из секреции 1Ь-12. секреции интерферонов типа 1. экспрессии ί.Ό80. экспрессии СЭ86. экспрессии СЭ83 и повышения экспрессии МНС класса II.
25. 25. Способ по п.20. где мононуклеарные клетки периферической крови культивируют и предпочтительно. когда иммуностимуляторную СрС-нуклеиновую кислоту добавляют к культивируемым мононуклеарным клеткам периферической крови.
26. 26. Способ по п.20. где предыдущей терапией является не-СрС-терапия или терапия с использованием СрС-нуклеиновой кислоты с другой последовательностью или из другого класса.
27. 27. Способ по п.20. дополнительно предусматривающий скрининг иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислоты на способность стимулировать контрольную реакцию со стороны мононуклеарных клеток периферической крови из организма нормального субъекта.
28. 28. Способ по п.20. дополнительно предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови с интерфероном альфа. по существу. одновременно с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой.
29. 29. Способ по п.20. где иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрС-нуклеиновая кислота класса С.
30. 30. Способ лечения субъекта. с инфекцией НСУ. прежнее лечение которого с помощью не-СрСтерапии оказалось безуспешным. предусматривающий введение субъекту. нуждающемуся в таком лечении. иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты класса С. имеющей полумягкий скелет. в количестве. эффективном для лечения указанной инфекции.
31. 31. Способ лечения субъекта с инфекцией НСУ. который предположительно не будет реагировать на не-СрС-терапию. предусматривающий введение субъекту. нуждающемуся в таком лечении. иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислоты класса С. имеющей полумягкий скелет. в количестве. эффективном для лечения указанной инфекции.
32. 32. Способ лечения субъекта с инфекцией НСУ. прежнее лечение которого с помощью не-СрСтерапии оказалось безуспешным. предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови. полученных из организма субъекта. нуждающегося в таком лечении. с иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой в количестве. эффективном для стимуляции иммунной реакции. и повторную инфузию этих клеток в организм субъекта.
33. 33. Способ по п.32. где мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки.
34. 34. Способ по п.33. где дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки.
35. 35. Способ по п.32. где иммуностимуляторной СрС-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С.
36. 36. Способ по п.35. где иммуностимуляторная нуклеиновая кислота класса С имеет полумягкий скелет.
37. 37. Способ лечения субъекта с хронической инфекцией НСУ. прежнее лечение которого с помощью предыдущей не-СрС-терапии. включая терапию интерфероном альфа. оказалось безуспешным. предусматривающий введение субъекту. в случае необходимости такого лечения. иммуностимуляторной СрСнуклеиновой кислоты в количестве. эффективном для лечения указанной инфекции.
38. 38. Способ по п.37. где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь. интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.

    - 35 008777
39. 39. Способ по п.37, где не-СрО-терапия включает в себя введение интерферона альфа и рибавирина.
40. 40. Способ по п.37, где не-СрО-терапия включает в себя введение ПЭГилированного интерферона альфа и рибавирина.
41. 41. Способ по п.37, где иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота класса А, класса В или класса С.
42. 42. Способ по п.37, дополнительно предусматривающий стадию введения субъекту интерферона альфа.
43. 43. Способ по п.42, где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.
44. 44. Способ по п.42, где интерферон альфа вводят, по существу, одновременно с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой.
45. 45. Способ по п.37, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета, при этом предпочтительно, чтобы модификация скелета являлась фосфоротиоатной модификацией скелета.
46. 46. Способ по п.37, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет.
47. 47. Способ по п.1 или 37, дополнительно предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови, полученных из организма субъекта, нуждающегося в таком лечении, с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой в количестве, эффективном для стимуляции иммунной реакции.
48. 48. Способ по п.47, где мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки, причем предпочтительно, если дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки.
49. 49. Способ лечения субъекта с хронической инфекцией НСУ и который идентифицирован как таковой, который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию, включая терапию интерфероном альфа, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты в количестве, эффективном для лечения указанной инфекции.
50. 50. Способ по п.49, где субъект идентифицирован как таковой, который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию, на основе анализа интерферона альфа, продуцируемого на одну дендритную клетку, или на основе генотипа НСУ.
51. 51. Способ по п.49, где не-СрО-терапия включает в себя введение интерферона альфа или интерферона альфа и рибавирина.
52. 52. Способ по п.49 или 51, дополнительно предусматривающий введение субъекту антивирусного агента, причем предпочтительно, чтобы антивирусным агентом являлся интерферон альфа.
53. 53. Способ по п.52, где интерфероном альфа является интерферон альфа-2Ь, интерферон альфа-2а или консенсусный интерферон альфа.
54. 54. Способ по п.52, где интерферон альфа вводят в субтерапевтическом количестве.
55. 55. Способ по п.49, где иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота класса С.
56. 56. Способ по п.49 или 55, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит полумягкий скелет.
57. 57. Способ по п.12 или 37, где иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота класса А, класса В или класса С.
58. 58. Способ по п.12 или 37, где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота содержит модификацию скелета, при этом предпочтительно, чтобы модификация скелета являлась фосфоротиоатной модификацией скелета.
59. 59. Способ по п.12 или 37, где инфекция вируса гепатита С представляет собой хроническую инфекцию вируса гепатита С или острую инфекцию вируса гепатита С.
60. 60. Способ скрининга иммуностимуляторных СрО-нуклеиновых кислот, применимых в лечении хронической вирусной инфекции гепатита С, предусматривающий контактирование ίη νίίτο мононуклеарных клеток периферической крови, полученных из организма субъекта, имеющего хроническую вирусную инфекцию гепатита С, с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой и измерение иммунной реакции мононуклеарных клеток крови после указанного воздействия, причем субъект является таковым, для которого прежняя терапия оказалась безуспешной, включая терапию интерфероном альфа.
61. 61. Способ по п.60, где иммунная реакция выбрана из группы, состоящей из стимуляции В-клеток, секреции ГЬ-6, секреции ГЬ-10, секреции ГЬ-12, секреции интерферона гамма, секреции интерферонов типа 1 (альфа+бета), секреции ΙΡ-10, активности природных клеток-киллеров (ΝΚ), экспрессии СБ80. экспрессии СБ86, экспрессии СБ83 и повышения экспрессии МНС класса ΙΙ.
62. 62. Способ по п.60, где мононуклеарные клетки периферической крови содержат дендритные клетки.
63. 63. Способ по п.62, где дендритные клетки содержат плазмацитоидные дендритные клетки.
64. 64. Способ по п.60, где иммунная реакция выбрана из группы, состоящей из секреции ΙΕ-12, секреции интерферонов типа 1, экспрессии СБ80, экспрессии СБ86, экспрессии СБ83 и повышения экспрес

    - 36 008777 сии МНС класса II.
65. 65. Способ по п.62. где мононуклеарные клетки периферической крови культивируют и предпочтительно. когда иммуностимуляторную СрО-нуклеиновую кислоту добавляют к культивируемым мононуклеарным клеткам периферической крови.
66. 66. Способ по п.60. где предыдущей терапией является не-СрО-терапия или терапия с использованием СрО-нуклеиновой кислоты с другой последовательностью или из другого класса.
67. 67. Способ по п.60. дополнительно предусматривающий скрининг иммуностимуляторной СрОнуклеиновой кислоты на способность стимулировать контрольную реакцию со стороны мононуклеарных клеток периферической крови из организма нормального субъекта.
68. 68. Способ по п.60. дополнительно предусматривающий контактирование мононуклеарных клеток периферической крови с интерфероном альфа. по существу. одновременно с иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой.
69. 69. Способ по п.60. где иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислотой является иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота класса С.
70. 70. Способ по любому из пп.1-69. где иммуностимуляторная СрО-нуклеиновая кислота имеет последовательность ТСОТСОТТТТСООСООССОССО (8Е0 ΙΌ Νσ.:4).
71. 71. Способ лечения субъекта с инфекцией НСУ. прежнее лечение которого с помощью предыдущей не-СрО-терапии оказалось безуспешным. предусматривающий введение субъекту. нуждающемуся в таком лечении. иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты. имеющей последовательность ТСОТСОТТТТСООСООССОССО (8Е0 10 \о.:4). в количестве. эффективном для лечения указанной инфекции.
72. 72. Способ лечения субъекта с инфекцией НСУ. который предположительно не будет реагировать на не-СрО-терапию. предусматривающий введение субъекту. нуждающемуся в таком лечении. иммуностимуляторной СрО-нуклеиновой кислоты. имеющей последовательность

    ТСОТСОТТТТСООСООССОССО (8Е0 10 \о.:4). в количестве. эффективном для лечения указанной инфекции.