JP2798305B2

JP2798305B2 - アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用

Info

Publication number: JP2798305B2
Application number: JP7502627A
Authority: JP
Inventors: アルバートディ．フリーセン，
Original assignee: ジェネシスファーマインコーポレイテッド
Priority date: 1993-06-23
Filing date: 1994-06-23
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: CA2165821C; WO1995000638A2; CA2165821A1; JPH09501047A; EP0705335A1; KR960703170A; US5594122A; HU9503751D0; AU7237194A; HUT74597A; US5811537A; WO1995000638A3; US6420551B1; AU697234B2

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、オリゴヌクレオチド（ODN）をベースとす
る治療法、特にヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染の処
置に関する。

発明の背景本発明は、感染した細胞におけるHIVの複製を阻害す
ることによるHIV感染個体の処置において使用すること
に適したODNに関する。

本明細書中で引用されるすべての文献は、その文献全
体として本明細書中に参考として援用される。

HIVは、後天性免疫不全症候群（AIDS）として知られ
てきつつある疾患の原因である。初めて認識されたのは
1981年であるが、この避け難い致死的な疾患の治療法は
いまだ見いだされていない。HIVは、性的接触、感染し
た血液または血液産物、および周産期のような、種々の
手段で拡がった。HIV感染は複雑であり、そして有効な
治療法が不足しているため、感染を検出し、治療し、そ
して予防する方法を開発するための多大な努力が繰り広
げられている。感染した、人、血液、および他の生物学
的産物を同定するための診断的手順が開発されている。

HIVゲノムは、詳しく特徴づけられている。このゲノ
ムは、約10kbのコード配列であり、HIV複製の調節セグ
メント、ならびにgag、polおよびenv遺伝子（これらは
それぞれ、コアタンパク質、逆転写酵素−プロテアーゼ
−エンドヌクレアーゼ、ならびに内部および外部エンベ
ロープ糖タンパク質をコードする）を含む。HIVは高頻
度で変異するので、その結果、ウイルスの株の間での遺
伝的多様性が高く、そして実際、感染した単一の個人の
ウイルス粒子間での遺伝的多様性が高い。HIVゲノム中
には、変異しない傾向にある「保存」領域がいくつかあ
る。これらの領域のうちのいくつかは、ウイルスの機能
に必須のタンパク質の部分をコードすると推定され、従
って、これらの領域は非常に少ない変異的事象に抵抗し
得る。

HIVのenv遺伝子は糖タンパク質であるgp160をコード
し、これは通常、タンパク質分解性切断により、外部ウ
イルス糖タンパク質であるgp120およびウイルス膜透過
性糖タンパク質であるgp41を形成する。gp120は、gp41
と非共有的（noncovalent）相互作用のため、HIVビリオ
ンと会合したままである。これらの非共有的（noncoval
ent）相互作用は弱く、従って、gp120の大部分は、可溶
性形態で細胞およびビリオンから放出される。

大部分のウイルスと同様に、HIVはしばしば、中和抗
体の産生を誘発する。しかし、感染によって防護的な免
疫性に達する、他の多くのウイルスおよび他の感染因子
とは異なり、HIV特異的抗体は、この疾患の進行を防止
するには不十分である。従って、HIVの場合、天然の感
染の免疫性を誘発するワクチンは、有効ではないことが
証明され得る。実際、HIVタンパク質gp160から調製され
るワクチンは、中和抗体を誘発するものの、HIV感染に
対する免疫性はほとんど提供しないようである。このよ
うな有効な抗HIVワクチンの産生の失敗から、有効なワ
クチンは1990年代の終わりまでには得られないという予
想がなされている。現在AIDSの処置に使用されている治
療薬は、しばしば、重大な副作用を引き起こし、このこ
とがこれらの治療薬を多くの患者に使用することを妨げ
ている。従って、ワクチン接種および現在使用されてい
る薬剤を伴わない、この疾患の処置および予防のための
別法を得ることは有用である。

最近、ウイルス感染に関連するタンパク質の産生を、
このタンパク質の合成を指揮するmRNA分子を妨げること
によって低減する試みがなされている。このタンパク質
の産生を妨げることによって、治療効果を最大にし、か
つ副作用を最小にする治療効果を達成することが期待さ
れている。このような治療的アプローチの一般的に目的
は、所望されないタンパク質の形成に至る遺伝子発現を
妨害するか、あるいは他の方法によって遺伝子の発現を
低減させることである。

特定の遺伝子の発現を阻害するための方法として有望
であると考えられている方法のひとつは、「アンチセン
ス」アプローチであ。主としてRNAである一本鎖核酸
は、ODNのための標的分子であり、これはアンチセンス
機構によって遺伝子発現を阻害するために使用される。
アンチセンスの概念および治療的アプローチは、有効で
あることが示されている。

SteinおよびCohen（1988）Cancer Res.，48:2659−26
68;Walder（1988）Genes＆Development，２:502−504;M
arcu−Sekura（1988）Anal.Biochem.，172:289−295;Zo
n（1987）J.Pro.Chem.，６:131−145;Zon（1988）Phar
m.Res.，５:539−549;Van der Krolら（1988）Biotechn
iques，６:958−973;Loose−Mitchell（1988）TIPS，
９:45−47;Sterling（1992）GEN12:1;Drug and Develop
ment,Inc.（1993）4:179−195;Ratajczakら（1992）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA89:11823−11827;およびWagnerら
（1993）Science260:1510−1513。

アンチセンサODNは、相補的RNA配列にハイブリダイズ
することによって標的遺伝子発現に影響を与えることが
要求される。ハイブリッドRNA−ODN二重鎖は、プロセッ
シング、翻訳、および代謝回転を包含するRNA代謝の１
つまたはそれ以上の局面を妨げるようである。化学修飾
されたODNは、ヌクレアーゼの安定性、および細胞の透
過性を増強させるために使用される。

二重鎖DNAは、認識可能なヌクレオモノマー（nucleom
onomer）配列に基づくオリゴマーによって特異的に認識
され得る。「GT」認識と名付けられたモチーフは、Beal
ら（1992）Science、251:1360−1363;Cooneyら（1988）
Science、241:456−459;およびHoganら、EP公開第37540
8号によって記載されている。このＧ−Ｔモチーフにお
いて、ODNは、標的プリンチッチの配列にアンチパラレ
ルに配向し、そしてＡ−Ｔ対は、アデニンまたはチミン
残基によって認識され、そしてＧ−Ｃ対はグアニン残基
によって認識される。

一本鎖標的配列および二重鎖標的配列の両方の配列特
異的標的化は、診断、分析、および治療における用途を
有する。このような結合が行われるいくつかの状況下に
おいて、得られる二重鎖または三重鎖を長期間に渡って
安定化させることは有利である。

オリゴマーを標的に共有架橋（covalent crosslinkin
g）させることは、安定化を延長するためのひとつのア
プローチを提供する。共有架橋を伴う一本鎖DNAの配列
特異的認識は、いくつかのグループによって報告されて
いる。例えば、Vlassovら（1986）Nuc.Acide Res.、14:
4065−4076は、一本鎖DNAフラグメントと標的配列に相
補的なヌクレオモノマーのアルキル化誘導体との共有結
合を記載した。同じグループによる同様の研究の報告
は、Knorreら（1985）Biochimie、67:785−789に記載さ
れている。一本鎖DNAの配列特異的切断は、切断を活性
化し得る改変されたヌクレオモノマーの取り込みによっ
て媒介され得る。IversonおよびDervan（1987）J.Am.Ch
em.Soc.、109:1241−1243。標的ヌクレオモノマーに対
する共有架橋はまた、一本鎖標的ヌクレオモノマー配列
に相補的なアルキル化試薬を用いて達成された。Meyer
ら（1989）J.Am.Chem.Soc.、111:8517−8519。ソラレン
（psoralen）によって媒介される一本鎖ODNへの光活性
化架橋が開示されている。Leeら（1988）Biochem.、27:
3197−3203。三重らせん形成性プローブにおける架橋の
使用もまた開示されている。Horneら（1990）J.Am.Che
m.Soc.、112:2435−2437。

一本鎖オリゴマーおよび二本鎖オリゴマーへの架橋の
ためのアルリウ化試薬としてN⁴,N⁴−エタノシトシンを
使用することもまた記載されている。WebbおよびMatteu
cci（1986）J.Am.Chem.Soc.、108:2764−2765;（1986）
Nuc.Acids Res.、14:7661−7674;およびShaw（1991）J.
Am.Chem.Soc.、113:7765−7766。これらの論文はまた誘
導体化シトシンを含むODNの合成を記載している。一本
鎖DNAへのODNの結合に関係する、N⁶,N⁶−エタノアデニ
ンを含有するオリゴマーの合成、およびこの残基の架橋
特性が記載されている。MatteucciおよびWebb（1987）T
etrahedron Letters、28:2469−2472。

最近の論文において、光活性化可能な架橋剤に連結し
たオクタチミジン（octathymidylate）の一本鎖DNAおよ
び二本鎖DNAの両方への配列特異的結合が記載されてい
る。Praseuthら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）、
85:1349−1353。さらに、ODNの５′−リン酸を介してア
ルキル化試薬による二重鎖DNAの標的化が記載されてい
る。Vlassovら（1988）Gene313−322;およびFedorovaら
（1988）FEBS Lett.、228:273−276。

三重鎖を得るための結合を行う場合、例えば、標的の
１つの鎖上にプリン残基が集中すると、他方の鎖上に逆
の極性のオリゴマーが提供され得る。「逆の極性」と
は、反対の極性を有するタンデム配列を含むオリゴマー
を意味する。すなわち、片方が５′→３′の極性を有
し、次いで他方が３′→５′の極性を有する。あるいは
その逆である。このことは、これらの配列が、事実上の
３′−３′ヌクレオチド間（internucleoside）結合
（しかしこの結合は達成される）または事実上の５′−
５′ヌクレオシド間結合と考えられ得る結合によって連
結していることを暗示している。このようなオリゴマー
は、環状ODNを得るための反応の副生成物として示唆さ
れている。Capobioncoら（1990）Nuc.Acids Res.、18:2
661−2669。３′−３′逆位（inversion）または５′−
５′逆位のいずれかを用いるAT結合によって固定される
ヘアピンを形成するように設計された「平行鎖DNA」の
組成物が合成されている。van de Sandeら（1988）Scie
nce、241:551−557。さらに、３′−３′結合を含むオ
リゴマーを用いる三重らせん形成が記載されている。Ho
rneおよびDervan（1990）J.Am.Chem.Soc.、112:2435−2
437;およびFroehlerら（1992）Biochem.、31:1603−160
9。

標的遺伝子発現の発現を阻害する手段としての三重ら
せん（triple helix or triplex）複合体の使用が、以
前に提示されている（国際出願番号PCT/US89/05769）。
三重らせん構造は、標的遺伝子発現を妨害することが示
されており、このアプローチの実現可能性を示す。国際
出願番号PCT/US91/09321;およびYoungら（1991）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA、88:10023−10026に示されている。

ODNにおいて使用するために適した種々の修飾が見い
だされている。５−プロピニル修飾ピリミジンを含むオ
リゴマーが記載されている。Froehlerら（1992）Tetrah
edron Letters、33:5307−5310。２′−デオキシ−７−
デアザアデノシンおよび２′−デオキシ−７−デアザグ
アノシンをODNに組み入れ、そして相補的DNA配列への結
合について評価された。熱変性分析（Tm）によれば、こ
れらのアナログで２′−デオキシアデノシンおよび２′
−デオキシイグアノシンを置き換えたとき、これらの置
換によって、二重鎖のTmはすこし減少することが示され
た。SeelaおよびKehwne（1987）Biochem.、26:2232−22
38;およびSeelaおよびDriller（1987）Nuc.Acids Re
s.、14:2319−2332。２′−デオキシ−７−デアザ−ア
デノシンと−チミジンが交互であるODNは、２′−デオ
キシ−アデノシンと−チミジンとを含むODNよりも二重
鎖のTmがわずかに上昇し得ることが示されている。Seel
aおよびKehne（1985）Biochem.、24:7556−7561。

アミダイトおよびホスホン酸水素化学によるDNA合成
が記載されている。米国特許第4,725,677号；同4,415,7
32号；同4,458,066号；および同4,959,463号。

HIVの処置にアンチセンスODNを使用することは、幾人
もの研究者が記載している。MatthewsおよびKricka（19
88）Anal.Biochem. 169:1−25;Degolら（1992）Antivira
l Res.279−287;およびCantinらの米国特許第5,110,802
号。HIVに対するアンチセンス標的化における先行する
試みは、感染を成功させるために必須のウイスルタンパ
ク質の合成を、培養中の感染しやすい細胞の新たな（de
novo）感染を用いることによって阻害することを焦点
にあてている。Agrawalら（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 85:7079−7083;Goodchildら（1988）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 85:5507−5511;およびZamecnikら（1986）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 83:4143−4146。その本来の性質
上、このようなアッセイは、試験化合物が、ウイルスの
ライフサイクル中の任意の重大のプロセスを潜在的に妨
害することを可能にする。従って、新たな感染のアッセ
イは抗ウイルス活性について化合物を初期スクリーニン
グするためには有効であるが、抗ウイルス活性が、アン
チセンスプロセスから実際に誘導される意図するアンチ
センスオリゴマーによって示されるのか、あるいは感染
プロセスの初期段階で作動する作用の結果であるのかを
含む、作用機構を確立するためには複雑な系である。

Ｔリンパ球がHIVに感染すると、細胞変性効果および
細胞死が起こり、これは免疫系のヘルパーＴリンパ球の
機能の選択的な損失に関連する。Aryaら（1985）Scienc
e29:69−73。感染細胞内でHIV−１抗原が蓄積すること
により細胞死に至る急性感染（Pettewayら（1991）TiPS
12:28−34）に加えて、慢性または持続性感染もまた起
こる。このようなウイルスリザーバー（reservor）の持
続は、HIV感染およびAIDSの進行に関する。Noeら（198
8）Biochim.Biophys.Acta946:253−260。HIV複製の後期
段階の事象を標的化する合理的な薬剤の発見は、この慢
性リザーバーからの感染性ビリオンの産生を阻害するこ
とによってウイルスが拡がることをブロックすることが
可能な抗ウイルス剤を与える可能性を有する。

保存HIVタンパク質、特にp24コア抗原タンパク質の合
成のシグナルであるウイルスRNAの保存部位を標的化す
ることによって、ウイルス遺伝子の発現および複製の阻
害がより効果的に達成され得ることが、ここで見いださ
れた。

発明の要旨本発明は、ヌクレオチド配列を含むODNに関し、該ヌ
クレオチド配列は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）遺伝
物質の保存領域に結合したときに、該ODNがHIV遺伝物質
の発現を効果的に減少させるに十分、該領域に相補的な
ヌクレオチド配列である。

図面の簡単な説明図１は、HIVタンパク質およびそれらの分解生成物の
インビボ合成を示すSDS−PAGEのオートラジオラフであ
る。

図２、HIV−１ゲノムの第１のスプライスドナー部位
に対するアンチセンスODNによってHIVタンパク質の発現
が有意に阻害されることを示すSDS−PAGEのオートラジ
オグラフである。

図３は、HIV遺伝子産物合成に対するHIVゲノムの第１
ドナー部位に対するアンチセンスODN濃度の違いの影響
を示すフェスタンブロット分析である。

図４は、B4−14と呼ばれるpGAGPOL−rre−ｒ（HIV遺
伝子配列）で安定にトランスフェクトされたCOS−様サ
ル腎細胞株中におけるHIV−１ウイルス遺伝子発現に対
する、アンチセンスODN、GPI2Aの濃度依存性阻害を示す
SDS−PAGEのオートラジオグラフである。

図５は、リポフェクチン（lipofectin）との処方によ
る、細胞に関連する放射標識機ODNの増強を表す。

図６は、HIV−1gagタンパク質前駆体p55の生合成に対
する、１μＭのGPI2Aの阻害活性を表す。

図７は、HIV−１ウイルスコア抗原p24の生合成に対す
る、１μＭのGPI2Aの配列特異的阻害活性を表す。

図８は、HIV gagタンパク質p24の生合成に対する、GP
I2A濃度依存生阻害活性を示すオートラジオグラフのデ
ンシトメトリー分析を表す。

図９は、HIV−1 mRNAに対する１μＭのGPI2Aの阻害活
性を表す。A:ODNを用いた４時間の予備処理後の総RNA抽
出物;B:24時間の予備処理後。

図10（ウイルス感染Ｐ−PHA刺激CBMC細胞におけるGPI
2AによるRT活性の濃度依存性阻害）は、GPI2Aによる急
性感染細胞におけるHIV−１複製の阻害を表す。

図11は、慢性感染したH9/IIIB細胞におけるHIV−１複
製の阻害を表す。

図12は、予備処理された、または未処理のB4.14細胞
のコロニー形成能を表す。

図13は、B4.14細胞の成長特性に対するODN予備処理の
影響を未処理コントロールと比較して表す。

発明の説明 HIV RNA内のいくつかの領域が、アンチセンスODNおよ
びそれらのアナログによってウイルス遺伝子産物の発現
を阻害するための有効な標的であることが、現在、見い
だされた。この阻害は、p24の産生によって測定され
る、ウイルス複数の間の特定の機能をブロックする能力
に基づく。p55の開裂産物であるp24の臨床的な重要性
は、HIVのp24抗原に対する抗体の血清レベルが、ウイル
スに対する免疫応答の有効性の証拠を提供すること、そ
してAIDSが進行した段階の患者の血清中の遊離ウイルス
のマーカーとして働くことによって証明される。Goeder
tら（1989）N.Engl.J.Med.、321:114。

本発明によれば、２つの20merのODN配列が設計され、
そして抗HIV化学療法剤としてのそれらの有効性につい
て試験された。いかなる特定の理論にも拘束されない
が、アンチセンス化学療法の作用機構は、翻訳または転
写をそれぞれ妨げるように、mRNAまたはDNAに結合する
ことに専ら起因し得る。この作用機構はまた、RNase H
の活性化、およびそれに続くRNAの分解に起因し得る。

この配列は、少なくとも２つの異なるHIV単離物中で
保存される（Battleら（1992）J.Viol. 66:6868）。従っ
て。このアンチセンスODNは、広範なHIV株に対する有効
な薬剤である得る。

この配列を、ODN合成のホスホルアミダイト化学に基
づいて、Applied Biosystemsモデル380D自動DNA合成機
および392DNA/RNA合成機上で合成した。これらを、ODN
精製カートリッジ、PAGEおよび／またはHPLCを用いて精
製した。

治療的用途において、このODNは、標的遺伝子領域の
発現を阻害することによって種々の症状を処置するため
に適切な方法によって使用される。このような治療にお
いて、ODNは単独または組み合わされて、全身投与、局
所投与、または局部投与を包含する種々の投与様式とし
て製剤化され得る。技法および製剤化は、一般的に、Re
mington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing
Co.,East on,PA,最新版に見いだされ得る。ODN活性成
分は、一般に、投与様式および投薬形態の形質に依存し
て、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活
性剤、または滑沢剤を包含し得る希釈剤または賦形剤の
ような薬学的に受容可能な担体と組み合わされる。典型
的な投薬形態は、錠剤、散剤、液体調剤（懸濁剤、乳濁
剤、および溶液を包含する）、顆粒剤、カプセル、およ
び座剤を包含し、そしてリポソーム調剤を包含する注射
のための液体調剤を包含する。

好ましくは、この組成物は、有効濃度の脂質処方物を
含む。有効濃度とは、細胞によるODNの取り込みを増強
する濃度である。取り込みを増強することにおいて特定
の脂質処方物またはその濃度が有効か否かを決定するこ
とは、当業者の技術範囲内であり、以下に例を示す。適
切な脂質処方物には、脂質混合物、リポソーム、および
カチオン性脂質調整物が包含されるがこれらに限定され
ない。適切なカチオン性脂質処方物は、リポフェクチン
である。

全身投与のためには、注射が好ましく、筋肉内、静脈
内、腹腔内、および皮下が包含される。注射のために
は、本発明のODNは、溶液中、好ましくはハンクス液、
またはリンゲル液のような生理学的に適合性の緩衝液中
に製剤化される。さらに、ODNは固体形態として製剤化
され得、そして使用直前に再溶解あるいは懸濁し得る。
凍結乾燥形態もまた包含される。全身投与に使用され得
る投薬量は、好ましくは、１日に１回または２回の投与
で約0.01mg/Kgから50mg/Kgの範囲である。しかし、
（ｉ）個々のODNがその標的DNAまたはRNAの活性を阻害
する能力、（ii）病理学的疾患状態の重篤度または程
度、または（iii）所与のODNの薬物動態学的挙動、に依
存して、異なる投薬スケジュールを使用し得る。

全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によって
行われ得、あるいはこの化合物は経口投与され得る。経
粘膜投与または経皮投与のためには、浸透されるべきバ
リアに適した浸透剤（penetrant）が製剤中で使用され
る。このような浸透剤は当該分野で一般的に知られてお
り、例えば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩およびフ
シジン酸誘導体である。さらに、透過を促進するために
増強剤（enhancer）を使用し得る。経粘膜投与は、例え
ば、点鼻スプレーまたは座剤を用いて行われ得る。経口
投与のためには、ODNは、カプセル、錠剤、およびトニ
ック剤のような従来の経口投与形態中に製剤化される。

局所投与のためには、本発明のODNは、当該分野で一
般に知られているような、軟膏（ointment、salve）、
ゲル、またはクリーム中に製剤化される。眼科適応のた
めには、本発明のオリゴマーの製剤は、当該分野で公知
の標準組成物に基づく。

治療において使用することに加えて、本発明のODN
は、ODNが特異的に結合する標的核酸の存在または不存
在を検出するための診断薬として使用され得る。本発明
のODNの増強された結合親和性は、プライマーおよびプ
ローブとしてのそれらの使用に有効である。診断的試験
は、二重らせんまたは三重らせん形成のいずれかによる
ハイブリダイゼーションを行い、次にこれを通常の手段
によって検出することによって行われ得る。例えば、OD
Nを、放射活性、蛍光、または色素原標識によって標識
し得、そして固体支持体に結合した標識の存在を検出す
る。あるいは、二重らせんまたは三重らせんの存在は、
これらの形態を特異的に認識する抗体によって検出され
得る。

本発明の置換結合を含むODNを三重らせん形成による
診断薬として使用することは有利である。なぜなら、三
重らせんは緩和な条件下で形成され、このアッセイは、
試験検体を過酷な条件下に供さなくても行うことができ
るからである。RNAの検出に基づく診断アッセイは、し
ばしば、試料または実験室で成育された生物からRNAを
単離することを必要とする。RNAは遍在するヌクレアー
ゼに対して非常に感受性が高いので、RNAの単離は労力
を要し、かつ時間がかかる。

ODNプローブはまた、ODNを特にヌクレアーゼ安定性に
する糖の修飾および／または結合の置換のようなさらな
る修飾を導入し得、このようにして、通常ヌクレアーゼ
活性を含んでいる細胞または組織抽出物の存在下におい
て行われるアッセイのために有用であり得る。末端修飾
を含むODNは、しばしば、特異性を失うことなく、相補
的配列に結合するそれらの能力を保持する。Uhlmannら
（1990）Chem.Rev.、90:543−584。上記のように、本発
明のプローブはまた、別の（alternate）DNA鎖に特異的
に結合し得るリンカーを、このような結合をさせるリン
カーを導入することによって含み得る。Froehlerら（19
92）Biochem.、31:1603−1609;およびHorneら（1990）
J.Am.Chem.Soc.、112:2435−2437。

塩基アナログを、共有架橋剤も含んでいるプローブに
導入することは、診断アッセイまたは検出アッセイにお
ける感度を増加させ、そしてバックグラウンドを低下さ
せる可能性を有する。さらに、架橋剤の使用により、新
規なアッセイの改変が可能となる。例えば、（１）プロ
ーブの識別能を高めるために、架橋を使用する、（２）
バックグラウンドを低下させるために変性洗浄工程を導
入する、および（３）標的中の二次構造を減少させ、そ
してプローブの特異性を増大させるために、ハイブリッ
ドの融点または融点付近でハイブリダイゼーションおよ
び架橋を行う、ことのような改変である。ハイブリダイ
ゼーション条件の改変は、以前に記載されている。Gamp
erら（1986）Nuc.acids Res.、14:9943。

本発明のODNは、米国特許第4,775,619号に記載のよう
な、検出されるべきオリゴマーまたは核酸のいずれかが
固体支持体に共有結合するような方法を用いる診断アッ
セイに使用されることに適している。このODNはまた、
例えば欧州特許公開第0 393 744号に記載されているよ
うな方法に従って、標的配列を増幅するためのポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）に基づく診断アッセイに使用され
ることに適している。プライマーとして働き得る３′末
端を含む本発明のODNは、TaqまたはVent^TM（New Englan
d Biolabs）ポリメラーゼのような、PCR法に使用される
ポリメラーゼに適合性である。従って、本発明のODN
は、PCRプロトコルにおけるプライマーとして使用され
得る。

このODNは、分離した（discrete）配列であるプライ
マーとして有用であり、またはランダム配列を有するプ
ライマーとして有用である。ランダム配列プライマー
は、通常、約６、７、または８ヌクレオモノマー長さで
あり得る。このようなプライマーは、種々の核酸増幅プ
ロトコル（PCR、リガーゼ連鎖反応など）またはクロー
ニングプロトコルにおいて使用され得る。本発明の置換
結合は、一般に、プライマーとしてのODNの能力を妨害
しない。３′−末端残基以外の部位に２′−修飾を有す
る本発明のODN、およびODNをRNaseを無能力にするか、
あるいは他の方法でヌクレアーゼ安定性にするような別
の改変は、細胞抽出物またはヌクレアーゼを含む他の溶
液中で、RNAまたはDNA配列のためのプローブまたはプラ
イマーとして有利に使用され得る。従って、このODN
は、標的核酸を含む試料とこのODNを混合し、次いで、O
DNを標的核酸にハイブリダイズし、そしてPCR、LCRまた
は他の適切な方法により、この標的核酸を増幅すること
によって試料中の核酸を増幅するためのプロトコルにお
いて使用され得る。

EDTF、DTPA、または1,2−ジアミノシクロヘキサン酢
酸のアナログのようなキレート剤へ誘導体化されたODN
は、例えば米国特許第4,772,548号、同4,707,440号、お
よび同4,707,352号に記載のような、種々のインビトロ
診断アッセイに使用され得る。あるいは、本発明のODN
は、５−（３−ヨードアセタミドプロプ−１−イル）−
２′−デオキシウリジンまたは５−（３−（４−ブロモ
ブチルアミド）プロプ−１−イル）−２′−デオキシウ
リジンのような架橋剤によって誘導体化され得、そして
例えば国際公開Wo90/14353に記載のような種々のアッセ
イ法またはキットにおいて用いられ得る。

上記のような使用に加えて、このオリゴマーが遺伝子
発現を阻害する能力は、被験体細胞または組換え系にお
ける発現レベルを、任意の適切な方法によって測定する
ことによってインビトロ系において実証し得る。Graess
mannら（1991）Nuc.Acids.Res.、19:53−59。本発明の
場合、p24のレベルが、ウイルス複製の指標として測定
された。

本発明の第１の実施態様は、gag遺伝子の５′長末端
反復（LTR）と第１の開始コドン（AUG）との間の領域に
相補的なODNである。この領域は、効果的なウイルスRNA
パッケージングに必要な高度に保存された配列を含む。
The Human Retroviruses、GalloおよびJay編、Acad.Pre
ss.中のKlotmanおよびWong−Staal（1991）。このアン
チセンスODNを「アンチ−gag」と呼ぶ。このODNはHIV−
１遺伝子発現を阻害するに十分な長さおよび相補性であ
る。この相補的部位は塩基＋262から塩基＋281までであ
り、この番号付はRatnerら（1985）Nature、313:277−2
83に従う。好ましい実施態様においては、アンチ−gagO
DNは特定の配列：５′CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG 3′ を有する。

本発明の、第２の実施態様は、第２のスプライス受容
部位内の領域に相補的なODNである（Battlesら、199
2）。このアンチセンスODNは、「GPI2A」と呼ばれる。
このODNはHIV−１遺伝子発現を阻害するに十分な長さお
よび相補性である。この相補的部位は塩基＋1189から塩
基＋1208までであり、この番号付はRatnerら（1985）に
従う。好ましい実施態様においては、GPI2A ODNは特定
の配列：５′GGTTCTTTTGGTCCTTGTCT 3′ を有する。

さらに好ましい実施態様において、ODNは、ホスホジ
エステル骨格の少なくとも１つの天然に存在する非架橋
酸素原子をイオウで置換して、このオリゴマーの対応す
るホスホロチオエート誘導体を形成することによって化
学的に修飾される。イオウ原子の好ましい位置は以下に
示す通りである。

アンチ−gag：５′C^SCG^SCC^SCC^STC^SGC^SCTC^STTG^SCC^SG 3′および GPI2A: ３′G^SGTTC^STTTTG^SGTCC^STTG^STC^ST 3′。

本発明によれば、p24タンパク質の発現を調節する方
法が提供される。標的RNAまたはこれを含む細胞を、HIV
のp24コア構造タンパク質をコードするRNAの特定の領域
に結合するODNアナログで処理する。RNA標的部位は、HI
Vのp24コア構造タンパク質を発現する機構に関連する領
域を含む。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図する
が、限定することを意図しない。１μＭのGPI2A存在下
におけるウイルスコア抗原の産生を配列特異的に阻害す
ることを示す実施例もまた、観察された。p24形成に対
するGPI2Aの濃度依存的阻害効果を示すオートラジオグ
ラフのデンシトメトリー分析（１μＭで84％を超える）
は、0.5μＭのIC₅₀を与えた。GPI2Aで予備処理された細
胞から得られたmRNAレベルの劇的な減少が、ノーザン分
析によって示された。両方の効果は予備処理の４時間後
でさえ観察されたので、阻害パターンは、このタンパク
質レベルにおいて得られたデータに合致する。ODNの細
胞障害性効果を、細胞のコロニー形成能および増殖特性
によって評価した。

ウイルスタンパク質生合成の濃度依存的減少は、GPI2
Aの薬理学的価値を示している。より低い転写レベルか
ら得られる阻害効果は、RNase H活性化による、可能な
作用機構を示しており、それによって、提唱されたアン
チセンスODNのホスホロチオエート誘導体の作用機構を
支持している。このアブローチは、おそらく、HIV感
染、および機能的に関連した治療的に重要な疾患関連タ
ンパク質の発現を調節することによって戦い得る、大部
分の主要な疾患の有効な治療のための薬剤の候補として
のアンチセンスオリゴマーの開発のための、一般的スク
リーニングに多大に寄与する。

実施例１細胞培養ウイルスの遺伝子発現に対するアンチセンスオリゴマ
ーの効果を決定するために、B4.14細胞（David Rekosh
博士（バージニア大学微生物学科）より提供された）
を、１ウェルあたり5,000〜12,000細胞の細胞密度で12
ウェル/35mmのプラスチック製組織培養プレートに接種
し、そして５％CO₂の加湿インキュベーター内で10％の
仔ウシ血清、50μg/mlのゲンタマイシンおよび200μg/m
lのハイグロマイシンＢを含むIscove改変Dulbecco培地
に37℃で２〜３時間維持した。次いで、インキュベート
された細胞を洗浄し、そして示された濃度のオリゴマー
および血清ヌクレアーゼ活性を減少させるために加熱不
活化した10％血清を含む培地と共に同一条件下でインキ
ュベートした。同じオリゴマー配列（ただし、極性を切
り換えられた）をコントロールとして使用した。

実施例２ウイルス抗原アッセイ実施例１に記載したように培養した細胞を、29.2mg/1
00mlのグルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン、200μg
/mlのハイグロマイシンＢ、加熱不活化した10％仔ウシ
胎児血清および所望の濃度のオリゴマーを含む無メチオ
ニン培地の存在下で、75〜150μCi/mlの［³⁵S］−メチ
オニン］（70％Ｌ−メチオニン/15％Ｌ−システイン）
で標識した。［³⁵S］−メチオニン濃度は185MBqであ
り、そして比活性は1057Ci/mmolであった。次いで、標
識された試料をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄
し、そして50mM Tris,pH7.2;150mM NaCl;5mM EDTA;1％T
riton−100;0.2％デオキシコール酸を含む200μｌの溶
解緩衝液に再懸濁した。

標識されたウイルスを含む培養培地を、１％の最終濃
度まで10％Triton X−100を用いて処理し、ウイルス粒
子を粉砕した。この試料をプロテインＡ−Sepharoseビ
ーズを用いて４℃で30分間予備吸着させた。次いで、［
³⁵S］−メチオニンで標識したウイルスタンパク質を、
プロテインＡ−Sepharoseビーズおよび2.5μl/試料のHI
V−1 p25/24に特異的なポリクローナルウサギ抗血清を
用いて２時間免疫沈降させた。抗体は、Nationalr Inst
itute of Allergy＆Infectious Disease（AIDS Reseach
＆Reference Reagent Program）およびMicroGeneSys,In
c.から得た。

得られたペレットを、溶解緩衝液で４回洗浄し、500m
M Naclを含む溶解緩衝液で１回洗浄し、そして最後に10
mM Tris,pH7.2;25mM NaCl;1mM EDTAを含むTNE緩衝液で
１回洗浄した。次いで、試料を、Laemmli（1970）Natur
e，227:680−685により記載された方法に従って、20〜3
0μｌの２×SDS試料緩衝液に再懸濁し、５〜10分間煮沸
し、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、次いで電気泳動により分析した。得られた結果を図
１および２に示す。阻害パーセントをオートラジオグラ
フィーのデンシトメトリー分析により測定した。ODN
は、ホスホロチオエート誘導体（塩基を交互にイオウ
化）であった。

B4.14細胞における抗gagによるウイルスタンパク質合
成（CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG;相補的部位262−281;機能、
スプライスドナー）の阻害は30％であった（図２）。

図１は、HIV−１ウイルスタンパクおよびそれらの分
解産物のインビボ合成を示すSDS−PAGEのオートラジオ
グラフである。「³⁵S］−メチオニンで代謝的に標識し
た後のCMT3［野生型（左）］細胞分解液およびB4.14
［トランスフェクトされた株（右）］細胞溶解液の各20
0μｌを、上述のようにp24ウイルス抗原に対するウサギ
血清を用いて免疫沈降させ、SDS−PAGE上で電気泳動
し、そしてＸ線フィルムに曝した。ウイルスタンパク
（p160;p55およびp24）の位置は、B4.14細胞溶解液では
はっきりと肉眼で見えるが、コントロール細胞株である
CMT3の細胞溶解液では見えない。

図２は、抗gag ODNによるHIVタンパク質の発現の有意
な阻害を示すSDS−PAGEのオートラジオグラフィーであ
る。200μｌのB4.14［トランスフェクトされた細胞株］
細胞溶解液を、アンチセンス［AS］；センス、すなわち
アンチセンスODNの逆相補体（inverse complement）
［Ｓ］；およびコントロール（B4.14、細胞溶解液単
独）で６日間処理し；そして引き続いて³⁵S−メチオニ
ン標識した後、上述のようにp24ウイルス抗原に特異的
なウサギ血清を用いて免疫沈降させた。等量のタンパク
質を各レーンに加えた。

実施例３異なる濃度のアンチセンスODNの効果 HIV遺伝子発現に対するアンチセンスODNの用量関係が
存在するかどうかを決定するために、以下の実験を行っ
た。

実施例１に記載したように細胞を培養し、そして５μ
g/mlのリポフェクチンおよび１％加熱不活化FCSの存在
下で異なる濃度の抗gag ODNと共に一晩インキュベート
した。次いで、培地を、10％加熱不活化血清を含む新鮮
な培地に取り替えた。次いで、ODNを加え、そして７日
間インキュベートした。ウェスタンブロット分析を、HI
V p24/55タンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗
体を用いて行った。

SDSポリアクリルアミド電気泳動の後、細胞タンパク
質を、以下のようにImmobilonメンブラン（Schleicher
and Schuell）に電気泳動的に移行させた。Immobilonメ
ンブランをきれいな皿内のメタノール中に置き、脱イオ
ン蒸留水で数回洗浄し、そしてウェスタン移行緩衝液
（western transfer buffer）（60.6gのTris−HCl;288g
のグリシン;4リットルのメタノール、そして蒸留水で20
リットルにした）に浸した。使用した装置は、Bio−Rad
Trans−Blot cellであり、これを製造者の指示書に従
って使用した。ウェスタンブロット分析を、Vectastain
ABCキット（Alkaline Phosphatase Rapid IgG）（Vect
or Laboratories）を用いて製造者の指示書に従って行
った。

結果を図３に示す。図３では、0.5および１μＭのア
ンチセンスODNは、HIV−１ウイルスタンパク質合成を妨
げるという点で等しく効果的であった。

実施例４異なる濃度のODN GPI2Aの効果 HIV感染細胞におけるp24の発現をODN GPI2Aが阻害す
る能力を測定するために、以下の実験を行った。

細胞を、１％加熱不活化仔ウシ胎児血清の存在下で、
0.1、0.5および1.0μＭのODNと共に一晩インキュベート
した。続いて、血清濃度を10％まで増加させ、そして３
日間インキュベートした。約３×10⁷cpm/プローブを、
上述のようにp24/25ウイルスタンパク質に特異的なウサ
ギポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。コント
ロールとして示されたレーンは、センス鎖、すなわちア
ンチセンスオリゴマーの逆相補体を有していた。図４の
オートラジオグラフは、とりわけ、HIVウイルスコア抗
原の用量依存性阻害が存在したことを示す。

実施例５発現プラスミドの構築 pCMVrevは、サルサイトメガロウイルス（CMV）IE94遺
伝子由来のプロモーター−エンハンサー領域の制御下の
HIV−1 cDNAフラグメント由来のコード配列（−650〜＋
30）を含む（Jeangら（1987）J.Virol.61:1559−157
0）。このプラスミドを、pCV1由来のBsu961フラグメン
トをベクターpCMV中に挿入することにより構築した。pC
MVにおいて、pBABY内に含まれるSV40配列を、CMVプロモ
ーター領域と交換した（Lewisら（1990）J.Virol.64:16
90−1697）。

pGAGPOLは、pBABYのXho I部位に挿入されたHIV−１プ
ロウイルスBH10クローン由来のcDNAフラグメント（HXB2
ヌクレオチド679−5785位に対応）を含む。このフラグ
メントは、gag、polおよびvifのためのオープンリーデ
ィングフレームを含む。それを、ベクターpSP64（Prome
ga Biotec、Madison、WI）において完全BH10プロウイル
スクローンをSal Iフラグメントとして含むプラスミド
から単離した。HIV−１配列を、pSP64ポリリンカー内の
Sal I部位とHIV−1 DNA内の5785位のSal I部位との間の
Sal Iフラグメントとして切り出した。pBABY内へ挿入し
た後、小欠失（Ava I−Xba I）を、残りのpSP64ポリリ
ンカーにおいて、制限酵素消化、T4 DNAポリメラーゼ修
復およびBam H I部位（ポリリンカー）の欠失を生じる
再連結により行った。SV40 DNA配列とpBR322 DNA配列と
の境界での第２のBamH I部位もまた、制限酵素消化およ
び修復により取り除いた。これらの操作を、pGAGBPL−R
RE−ｒの構築を容易にするために行った。HIV−1 BH10
クローン由来のBal II−BamH Iフラグメント（HXB2ヌク
レオチド7620〜8474に対応）をpGAGPOL内に存在する特
有のBamH I部位中に、gag、polおよびvifに関してウイ
ルスゲノムの場合と同一の方向に挿入することにより、
pGAGPOL−RRE−ｒを作成した。

実施例６トランスフェクトされた細胞およびそれらの培養 COS様サル腎細胞株CMT3（GerardおよびGlutzman（198
5）Mol.Cell Biol.5:3231］−3240）を、pCMVgagpol−r
re−ｒ、gagの効果的発現に必要なpCMVrev（Smithら（1
990）J.Virol.64:2743−2750）、および標準のCaPO₄法
（Grahamおよびvan der Eb（1973）Virology52:456）に
よりハイグロマイシン耐性遺伝子を発現する選択マーカ
ープラスミドを用いてトランスフェクトして、細胞株B
4.14（David Rekosh博士、バージニア大学微生物学科）
を得た。この細胞を、10％仔ウシ血清、50μg/mlゲンタ
マイシンおよび200μg/mlハイグロマイシンＢを有するI
scove改変Dulbecco培地中で維持した。

臍帯血単核細胞（BCMC）を、Ficoll−Hypaque（Pharm
acia、Uppsala、Sweden）勾配遠心分離により単離し
た。細胞を回収し、洗浄し、そして赤血球凝集素（Ｐ−
PHA）刺激した。細胞を培養フラスコ中に接種し、そし
て10％加熱不活化ウシ胎児血清（Flow Laboratories、T
oronto、Ontario、Canada）、2mM L−グルタミン、およ
び200U/mlペニシリンを補充した完全RPMI−1640培養培
地（Gibco Laboratories、Toronto、Ontario、Canada）
中で３日間維持した（Bourら（1991）J.Virol.65:6387
−6396）。

実施例７オリゴデオキシヌクレオチド配列の合成自由エネルギー（ΔＧ）、ハイブリダイゼーション温
度ならびに最も近接したΔＧ値の精度の高い測定に基づ
くDNAおよびRNAの二次構造を計算するコンピュータモデ
ルプログラム［OLIGO:Primer Analysis Softoware、Ver
sion3.4］を使用して、目的の標的配列に高度に選択的
であるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを作成
した。このようにして作成されたオリゴデオキシヌクレ
オチドは、最小の遺伝子的変異性を有すると予想され
（Battlesら（1992）J.Virol.66:6868−6877）、安定な
二重鎖（duplex）および非自己相補性を形成した。GPI2
Aは、Ratnerら（1985）Nature313:277−284の命名法に
従って以下の塩基組成より作成されるアンチセンス構築
物である:⁵′GGTTCTTTTGGTCCTTGTCT³′、２箇所の点変
異（下線）:⁵′GGTTCTTTTGTGCCTTGTCT³′、およびセン
ス鎖：ヌクレオチド＋1189〜＋1208位（多くのレトロウ
イルスにおいて遺伝的に保存される領域）にわたる^５′
TCTGTTCCTGGTTTTCTTGG³′。（Battlesら（1992）;Garve
yら（1990）Virology175:391−409;およびGondaら（198
7）Nature330:388−391）。この伸長領域（stretch）内
において、BIVは、EIAVとは10残基のうち８残基を、SIV
_macとは10残基のうち６残基を、ビスナウイルスとは10
残基のうち３残基を、SIV_agm、HIV−２およびHIV−１と
は10残基のうち７残基を共有した（Garveyら（199
0））。GPI2Aを、７つの異なる塩基位置で、ホスホジエ
ステル骨格の天然由来の非架橋酸素原子をイオウ原子に
置換することにより化学的に修飾して、比較的ヌクレア
ーゼ耐性であるの対応するホスホロチオエート誘導体を
形成した（Cohen（1989）Trends Pharmacological Sci.
10:435−437;およびZon（1988）Pharmaceut.Res.5:539
−548）。

ODNを、標準ホスホルアミデート（phosphoramidate）
化学法を用いて、Applied Biosystemsのモデル380B自動
DNA合成機およびモデル392DNA/RNA合成機で合成した。
オリゴマーおよびそれらのホスホロチオエートアナログ
を、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Applied Bi
osystem）、20％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、すなわちPAGE（Efcavitch（1990）,D.Rickwoodおよ
びB.D.Hames（編），Gel Electrophoresis of Nucleic
Acids−A Practical Approach Oxford University Pres
s.Oxford）を用いて、または高速液体クロマトグラフィ
ー、すなわちHPLC（ZonおよびThompson（1986）BioChro
matog.1:22−32）により精製した。

実施例８ ODN/脂質処方物を用いた細胞の前処理従来の研究により、GPI2Aの適度のアンチセンス活性
は、細胞膜透過性が乏しいことに起因することが示され
た。この効果を最適化するために、カチオン性脂質送達
システムを、高費用のODN合成を相殺するために用い
た。

リポフェクチン試薬は、Ｎ−［１−（2,3−ジオレイ
ルオキシ）プロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウム
クロライド（DOTMA）と、ジオレオイルホスファチジル
エタノールアミン（DOPE）との膜濾過水中の1:1［W/W］
リポソーム製剤（GIBCO BRL、Research Products Life
Sci.Inc.）である。リポフェクチン試薬は、DNAと自発
的に反応して、そのDNAを完全に捕らえる脂質−DNA複合
体を形成する。この複合体の細胞膜との融合は、カプセ
ル化したDNAのこの細胞の細胞内環境への効率的な取り
込みを生じる（JulianoおよびAkhtar（1992）Antisense
Res.＆Develop.2:165−176）。

適切な量のDNAおよびリポフェクチン試薬を、滅菌蒸
留水で別々に希釈し、次いでポリスチレンチューブ中で
１つにし、そしてボルテックス撹拌しないで穏やかに混
合した。次いで、この混合液を少なくとも15分間室温で
静置した。（Felgnerら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.US
A84:7413−7417）。約50〜70％集密度のプレートを無血
清培地で洗浄した。次いで、1mlの培地を細胞に加え、
そして複合体をできるだけ一定に滴下して穏やかに加え
た。実験条件に依存して、細胞を、加湿した５〜10％二
酸化炭素環境中で37℃で0.5分間〜24時間インキュベー
トした。細胞を免疫沈降または後に置換される培値およ
びODNのいずれかのために標識し、そして以前に公表さ
れた手順（Chanら（1993）Biochem.47:12835−12840）
の改変法による放射能標識および免疫沈降の前に、ODN
の存在下で所望の長さの時間インキュベートした。

細胞に関連する放射能を測定するために、細胞を³²P
−標識した５′−DNA末端標識化システム（GIBCO、BR
L）と共にインキュベートした。リポフェクチン試薬の
存在下または非存在下のODNおよび細胞に関連する放射
能を、液体シンチレーション培地（Universol,ICN Biom
edicals Inc.、Irvine、CA）中に標識した細胞を直接懸
濁することによって測定した。細胞を1.5×10⁴の密度で
接種し、続いて加湿した５〜10％二酸化炭素環境中、10
μg/mlのリポフェクチン試薬を含むかまたは含まない放
射能標識した１μＭのGPI2Aの存在下で37℃で１時間お
よび４時間インキューベートした。細胞をPBSで洗浄
し、そして細胞に関連する放射能（cpm、ｙ軸）を、液
体シンチレーション培地中での溶解および懸濁によりカ
ウントした。得られた結果を図５に示す。図５におい
て、各点は４つの実験の平均値を表す。統計的解析を、
Studentのｔ検定により行った：−Lipo（１時間）対＋U
ipo（１時間）についてはｐ＜0.01;−Lipo（４時間）対
＋Lipo（４時間）についてはｐ＜0.005;−Lipo（１時
間）対−Lipo（４時間）についてはｐ＜0.01;＋Lipo
（１時間）対＋Lipo（４時間）についてはｐ＜0.003。

実施例９アンチセンスオリゴマーおよびウイルス遺伝子発現ウイルス遺伝子発現に対するアンチセンスオリゴマー
の効果を測定するために、B4.14細胞を、所望の細胞密
度で６ウェルのプラスチック製組織培養プレートに接種
し、そして５％CO₂の加湿インキュベーターにおいて10
％の仔ウシ血清、50μg/mlのゲンタマイシンおよび200
μg/mlのハイグロマイシンＢを含むIscove改変Dulbecco
培地中で37℃で維持した。続いて、細胞を洗浄し、そし
て１μＭのGPI2Aおよび加熱不活化した血清を含む培地
と共に４時間インキュベートした。コントロールオリゴ
マー配列は、２箇所の点変異を含んでいたか、またはア
ンチセンス構築物の逆相補体であった。

次いで、前処理した細胞およびコントロールをPBSで
洗浄し、そして無メチオニン培地の存在下で、120〜250
μCi/mlの³⁵S−メチオニン（70％Ｌ−メチオニン15％Ｌ
−システイン、［³⁵S］−メチオニン濃度:185MPq.、比
活性:1057Ci/mmol）で30分間放射能標識した。続いて、
標識した試料をPBS緩衝液で洗浄し、そして200μｌの溶
解緩衝液（50mMのTris pH7.2、150mMのNaCl、5mMのEDT
A、１％のTriton X−100、0.2％のデオキシコール酸）
中に再懸濁した。

試料を、プロテインＡ−Spharoseビーズを用いて、少
なくとも30分間４℃で予めきれいにした。［³⁵S］−メ
チオニン標識したウンイルスタンパク質を、プロテイン
Ａ−SpharoseビーズおよびHIV−1 p25/24に特異的なポ
リクローナルウサギ抗血清（National Institute of Al
lergy＆Infctious Diseases［AIDS Research＆Referenc
e Reagent Program］およびMicoGeneySys,Inc.）の2.5
μl/試料を用いて４℃で２時間または一晩免疫沈降させ
た。得られたペレットを溶解緩衝液を用いて４回洗浄
し、500mMのNaClを含む溶液緩衝液を用いて１回洗浄
し、そして最後にTNE緩衝液（10mMのTris pH7.2;25mMの
NaCl;1mMのEDTA）を用いて１回洗浄した。次いで、試料
を20〜30μｌの２×SDS試料緩衝液中に再懸濁し、５〜1
0分間煮沸し、そして12.5％ SDS−PAGE上で分析し、乾
燥し、KODAK X−OMATフィルム（Eastman Kodak、Roches
ter、NY）上で曝露した。得られた結果を図６〜８に示
す。

実施例10 ノーザン解析単離したRNA試料についてのノーザン解析を、以前に
公表された手順（Amaraら（1993）Nuc.Acids Res.21:48
03−4809）の改変法により行った。簡潔に言えば、細胞
を、実施例８の記載のように10μg/mlのリポフェクチン
試薬の存在下で１μＭのODNを用いて前処理した。メッ
センジャーRNAを、Gough（1988）（Analytical Biochem
istry173:93−95）により記載された方法に従って、迅
速RNA調整法により細胞から抽出した。電気泳動を１％
ホルムアルデヒドアガロースゲル上で行った後、ナイロ
ンメンブラン（Schleicher＆Schuell、Nytran⁺、0.45μ
ｍ）上に一晩ブロッティングして、乾燥し、続いて80℃
で２時間ベーキングした。フィルターを、ハイブリダイ
ゼーションオーブン（Turbo Speed hybridization oven
Bio/Can Scientific）中42℃で一晩予備ハイブリダイ
ズした。次いで、フィルターを、BH10クローンの塩基33
4〜2037に対応する³²P−標識したプローブ（Oligolabel
ing kit、Pharmacia）を用いて42℃で一晩プローブした
（Ratnerら（1985））。メンブランをハイブリダイゼー
ションした後に洗浄し、続いて露光した（Kodak X−OMA
T AR）。得られた結果を図９に示す。図9Aは、負荷コン
トロールとしてGAPDHを用いた前RNAの単離前の構築物を
用いた４時間の前処理の後でのHIV−１転写物の阻害を
示す。図9Bは、負荷コントロールとして28Sを用いた前R
NAの単離前の前処理24時間後に得られた結果を示す。コ
ントロールは、（ｉ）アンチセンスの逆相補体；および
（ii）２箇所の点変異を有するアンチセンス構築物であ
った。

実施例11 抗ウイルス活性アッセイ急性感染した細胞においてアンチセンスオリゴデオキ
シヌクレオチドホスホロチオエートの抗ウイルス活性を
試験するために、慢性感染したH9細胞から単離したHIV
−１のHIV−IIIB研究室株（laboratory strain）を使用
して、Ｐ−PHAで刺激したCBMCをTCID₅₀＝2000のウイル
ス力価（ウイルスストック＝５×10³TCID₅₀/ml）で感染
させた。37℃で感染の２時間後、細胞を洗浄して、付着
しなかったウイルスを洗い落とし、そして10U/mlのIL−
２を含む新鮮な培地中に再懸濁した。細胞を４×10⁵細
胞／ウェルで接種し、そして適切な濃度のインシュリン
（Sigma Co.）またはIGF−１（Gibco Laboratories）お
よび各濃度のGP12Aを加えた。細胞培養上清におけるHIV
−１活性の阻害は、培養の４日後に実施例11において記
載される逆転写酵素アッセイにより測定された。得られ
た結果を図10に示す。

実施例12 逆転写酵素アッセイ HIV逆転写酵素（RT）に体するGP12Aの効果を測定する
ために、以下の実験を行った。

慢性感染させたH9/IIIBを細胞を、加熱不活化血清お
よび１μＭ濃度のODN/脂質処方物を用いて４×10⁵細胞
／ウェルで接種した。細胞を、ODN/脂質処方物との24時
間の予備インキュベーションの後にPBSで洗浄し、そし
て10％加熱不活化血清およびODNを含む新鮮な培地を加
えた。細胞を５日間培養し続けた。細胞培養上清におけ
るHIV−１活性の阻害を、培養上清上でのRTアッセイに
より測定した。Studentのｔ検定による透明解析は、ｐ
＜0.02［対応のない（unpared）］であった。

RTアッセイを以前に公表された手順（Boulericeら（1
990）J.Virol.64:1745−1744;およびLeeら、J.Clin.Mic
robiol.25:1717−1722）の改変法により行った。簡潔に
言えば、50μｌの清浄な培養上清を、ポリプロピレンチ
ューブ中、50mMのTris HCl pH7.9、5mMの塩化マグネシ
ウム、150mMの塩化カリウム、0.5mMのエチレングリコー
ル−ビス（β−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,N−
四酢酸、0.5％のTriton X−100、２％のエチレングリコ
ール、5mMのジチオトレイトール、0.3mMの還元グルタチ
オン、20μCiの滴定されたリミジン三リン酸および50μ
g/mlの鋳型プライマー［ポリ［rA）．オリゴ（ｄ）Ｔ］
を含む50μｌの反応カクテルに加えた。このチューブを
厳しく撹拌し、次いで30℃で22時間インキュベートし
た。この反応を、1mlの冷トリクロロ酢酸（TCA）の添加
により停止した。新規に合成したDNAを、氷上で少なく
とも２時間沈降させ、次いでWhatman CF/Cガラスフィル
ター上で集め、10％冷TCAおよび無水エタノールで２回
洗浄した。フィルターを20分間乾燥し、そして取り込ま
れた放射能をカウントした。得られた結果を図11に示
す。

実施例13 GPI2Aの毒性正常細胞（B4.14）のコロニー形成能力およひ生育特
性に対するGPI2Aの効果を測定するために、以下の実験
を行った。B4・14細胞を１μＭのオリゴマーで３日間前
処理した。続いて、細胞をPBSで洗浄し、回収し、次い
で低密度で再接種した。次いで、細胞を、コロニーが形
成されるまで（約６〜11日）培養し続けた後に、細胞を
染色した。得られた結果を図12示す。

正常細胞の生育に対するGPI2Aの効果を測定するため
に、以下の実験を行った。B4.14細胞を接種し、続いて
１μＭのODNの存在下で３日間生育させた。細胞を、100
mm組織培養プレート中に再接種し、そしてODNの存在下
で図13のＸ軸上に示した時間生育させた。次いで、細胞
を回収し、示された時間でカンントした。得られた結果
を図13に示す。図12および13から、GPI2Aは細胞培養に
おいて毒性を示さなかったことが認識され得る。

フロントページの続き (56)参考文献特開平２−276577（ＪＰ，Ａ) 特表平４−501052（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／18004（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／2531（ＷＯ，Ａ１) ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．41 （1992）Ｐ．1023−1033 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/48 A61K 31/70 A61K 47/14 A61K 48/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇｅｎｅｔｙｘ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列＋1189〜
＋1208に相補的なヌクレオチド配列を有する、オリゴヌ
クレオチド。
【請求項２】ヌクレオチド配列５′GGTTCTTTTGGTCCTTGTCT ３′ を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】ヌクレオチド配列５′G^SGTTC^STTTTG^SGTCC^STTG^STC^ST ３′ を有し、ここでＳがイオウ原子を示す、オリゴヌクレオ
チド。
【請求項４】請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴ
ヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項５】請求項２に記載の少なくとも１つのオリゴ
ヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項６】請求項３に記載の少なくとも１つのオリゴ
ヌクレオチドの治療的に有効な量、およびその薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項７】リポソーム調製物の治療的に有効な量をさ
らに含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】リポソーム調製物がリポフェクチンを含有
する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】リポソーム調製物の治療的に有効な量をさ
らに含有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】リポソーム調製物がリポフェクチンを含
有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】リポソーム調製物をさらに含有する、請
求項６に記載の組成物。
【請求項１２】前記リポソーム調製物がリポフェクチン
を含有する、請求項11に記載の組成物。