KR100689942B1 - 면역자극 핵산분자 - Google Patents

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Abstract

면역활성, 시토킨생성, NK용균활성 및 B세포증식의 Th1패턴을 자극하는 것을 포함하는 면역반응을 조정하는 비메틸화된 CpG디뉴클레오티드를 함유하는 핵산서열이 기재되었다. 서열은 또는 합성 보조체로서 유용하다.

Description

면역자극 핵산분자{IMMUNOSTIMULATORY NUCLEIC ACID MOLECULES}
본 발명에 있어서 연구결과는 국제보건기구 허가 No.R29-AR42556-01호에 의해 부분적으로 뒷받침되고 있다. 미국정부는 본 발명에 있어서 확실한 권리를 확보하고 있다. 본 발명은 일반적으로 올리고뉴클레오티드에 관한 것이고, 더 구체적으로는 면역자극성을 보유한 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
1970년대의 몇몇 연구자들은 고분자 DNA를 세포막에 결합시키는 것을 발표하였다(Learn, R.A., et al. 1971, "Membrane-associated DNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68:1212; Agrawal, S.K., R.W. Wagner, P.K. McAllister, and B. Rosenberg. 1975. "Cell-surface- associated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexs by eletron microscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:928). 1985년에, Bennett 등은 림프구에 대한 DNA 결합은, 결합이 안정하고, 길항적(competitive)이며, DNA 엔도사이토시스를 유발하고 올리고뉴클레오티드로 분해된다는 점에서 리간드 수용기 공동상승작용과 유사하다는 첫 번째 증거를 제시하였다(Bennet, R.M., G.T. Gabor, and M.M. Merrit. 1985. "DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degration of DNA". J.Clin. Invest. 76:2182). DNA와 같이, 올리고디옥시리보뉴클레오티드 (ODNs)는 서열독립성, 온도와 에너지 의존방식으로 포화가능하게 세포내로 진입할 수 있다(review in Jaroszewski, J.W., and J.S. Cohen. 1991. "Cellular uptake of antisense oligodeoxynucleotides". Advanced Drug Delivery Reviews 6:235; Akhtar, S.,Y.Shoji, and R.L. Juliano. 1992. "Pharmaceutical aspects of the biological stability and membrane transport characteristics of antisense oligonuclotides". In: Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA. R.P. Erickson, and J.G. Izant, eds. Raven Press, Ltd. New York, pp.133; and Zhao, Q.,T. Waldschmidt, E.fisher, C.J. Herrera, and A.M. Krieg.,1994. "STag specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors". Blood, 84:3660). DNA 또는 ODN 수용기는 아직 클론화되지 않고 있으며, 아직까지는 ODN결합과 세포흡수가 고분자 DNA의 결합과 동일 또는 다른 메카니즘을 통해 발생하는지 아닌지가 분명하지가 않다.
림프구 ODN 흡수는 세포 활성화에 의해 조정되는 것으로 나타났다. B세포 마이토젠성 LPS로 자극되는 비장세포는 B세포군에서 ODN 흡수를 상당히 향상시켰고, 한편 T세포 마이토젠성 Con A로 처리된 비장세포는 B세포가 아닌 T세포에 의해 ODN흡수를 향상시켰다(Krieg, A.M., F. Gmelig-Meyling, M.F. Gourley, W.J. Kisch, L.A. Chrisey, and A.D. steinberg. 1991. "Uptake of oligodeoxyribonucleotides by lymphoid cells is heterogeneous and inducible". Antisense Research and Development 1:161).
몇몇 폴리뉴클레오티드는 생물학적 반응 변형인자로서 광범위하게 평가된다. 가장 좋은 예로는, 마크로파아지 활성제 및 NK 활성유도체뿐만 아니라 IFN생성의 잠재유도체인 폴리(I,C)를 들 수 있다(Talmadge, J.E., J. Adams, H. Phillips, M. Collins, B. Lenz, M. Schneider, E.Schlick, R.Ruffmann, R.H. Wiltrout, and M.A. Chirigos. 1985. "Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose". Cancer Res. 45:1058; Wiltrout, R.H., R.R. Salup, T.A. Twilley, and J.E. Talmadge. 1985. "Immunomodulation of natural killer activity by polyribonucleotides" J.Biol.Resp.Mod. 4:512;Krown, S.E.1986. "Interferon and interferon inducers in cancer treatment". Sem. Oncol. 13:207; and Ewel, C.H., S.J. Urba, W.C. Kopp,J.W.Smith II,R.G.Steis, J.S. Rossio, D.L. Longo, M.J. Jones, W.G. Alvord, C.M. Pinsky, J.M. Beveridge, K.L. McNitt, and S.P. Creekmore. 1992. "Polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose in combination with interleukin-2 in patients with cancer: clinical and immunological effects". Canc.Res. 52:3005). 이러한 마우스 NK 활성화는 IFN-β분비의 유발에 기인할 수 있다(Ishikawa, R., C.A. Biron. 1993. " IFN induction and associated changes in splenic leukocyte distribution". J. Immunol. 150:3713). 디옥시리보스가 비효과적이기 때문에 이러한 활성화는 리보스당용으로 특효가 있다. 실험관 항종양 활성에서의 그 잠재성에 대한 폴리-L-라이신과 카르복시메틸셀룰로오스가 복합된 폴리(I,C)를 사용하여 몇가지 임상시험을 행하였다(RNAse에 의한 분해를 감소시키기 위하여)(Talmadge, J.E., et al., 1985. cited supra; Wiltrout, R.H., et al., 1985. cited supra); Krown, S.E., 1986. cited supra); and Ewel, C.H., et al.,1992. cited supra). 불행히도, 중독성 측면의 영향이 있어 여태까지 폴리(I,C)를 유용한 치료제로 만드는 것이 방해되어 왔다.
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C8위치에 브롬 또는 티올기가 치환되는 구아닌 리보뉴클레오티드는 B세포 마이토젠이고, "B세포 분화인자"로 대체할 수 있다(Feldbush, T.L. and Z.K. Ballas. 1985. "Lymphokine-like activity of 8-mercaptoguanosine: induction of T and B cell differentiation". J.Immunol.134:3204; and Goodman, M.G. 1986. "Mechanism of synergy between T cell signals and C8-substituted guanine nucleosides in humoral immunity: B lymphotropic cytokines induce responsiveness to 8-mercaptoguanosine". J.Immunol. 136:3335). 8-메르캅토구아노신과 8-브로모구아노신 또한 MHC 한정 CTL의 생성에 필요한 시토킨을 대체할 수 있으며(Feldbush, T.L.,1985. cited supra), 마우스 NK 활성도를 증가시키며(Koo, G.C., M.E. Jewell, C.L. Manyak, N.H. Sigal, and L.S. Wicker. 1988. "Activation of murine natural killer cells and macrophages by 8-bromoguanosine". J.Immunol. 140:3249), IL-2와 상승작용을 하여 마우스 LAK의 발생을 유발시킨다(Thompson, R.A., and Z.K. Ballas. 1990. "Lymphokine-activated killer(LAK) cell. V. 8-Mercaptoguanosine as an IL-2-sparing agent in LAK generation". J.Immunol. 145:3524). 이 C8이 치환된 구아노신의 활성을 증가시키는 NK와 LAK는 IFN의 유발에 기인되는 것으로 나타난다(Thomson, R.A., et al. 1990. cited supra). 최근, 마이코박테리움에 의해 생성된 5'트리포스포릴레이트화 티미딘이 인간 γδT세포 집합에 대한 마이토젠성이 있다는 것이 발견되었다(Constant, P.,F. Davodeau, M. -A. Peyrat, Y.Poquet, G.Puzo, M. Bonneville, and J.-J. Fournie. 1994. "Stimulation of human γδT세포 by nonpeptide mycobacterial ligands" Science 264:267). 이러한 보고는 면역체계가 미생물 핵산에 선택적으로 반응하기 위한 발전된 방법을 포함할 수 있다는 것을 나타낸다.
또한, 특정 DNA 구조는 림프구를 활성화하기 위한 잠재성을 보유하고 있다는 몇가지 관찰이 제안되었다. 예컨대, 벨(bell) 등은 비장세포 상청액에서 뉴클레오솜 단백질 DNA 복합체(naked DNA가 아님)는 B세포 증식과 면역글로불린 분비를 유발시킨다는 것을 보고했다(Bell,D.A.,B.Morrison, and P.VandenBygaart. 1990. "Immunogenic DNA-related factors". J.Clin.Invest.85:1487). 한편, 네이키드 DNA는 면역효과가 있다는 것이 보고되었다. 예컨대, Messina 등은 최근 260 내지 800bp의 폴리(dG)·(dC)와 폴리(dG·dC)의 프레그먼트가 B세포에 대하여 마이토젠성을 보유하고 있다는 것을 보고했다(Messina, J.P., G.S. Gilkeson, and D.S. Pisetsky. 1993. "The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens". Cel. Immunol. 147:148). Tokunaga 등은 dG·dC가 γ-IFN과 NK활성을 유발시킨다는 것을 보고했다(Tokunaga, S. Yamamoto, and K. Namba. 1988. "A synthetic single-stranded DNA, poly(dG,dC), induces interferon-α/b and -g, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth" Jpn.J.Cancer Res. 79:682). Pisetsky 등은 호모폴리머 서열 등과는 달리, 순종 포유동물의 DNA는 면역효과가 없지만, 특정 박테리아로부터의 DNA는 B세포 활성화와 면역글로불린 분비를 유발시킨다는 것을 보고했다(Messina, J.P., G.S. Gilkeson, and D.S. Pisetsky. 1991. "Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by baterial DNA". J. Immunol. 147:1759). 이러한 데이터가 몇가지 특이한 접촉원으로부터 발생된 것이 아니라면, 이러한 연구들은 박테리아 DNA의 특이구조 또는 다른 특성이 B세포 활성화를 유발시킬 수 있다는 것을 제시하였다. 마이코 박테리아 DNA 서열에 대한 조사에서는, 어떤 팰린드롬(palindrome) 서열을 보유하는 ODN이 NK세포를 활성화할 수 있다는 것을 설명해 주었다(Yamamoto, S.,T. Yamamoto, T. Kataoka, E. Kuramoto, O. Yano, and T.Tokunaga. 1992. "Unique, palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce INF and augment INF-mediated natural killer activity". J.Immunol. 148:4072; Kuramoto, E.,O.Yano,Y.Kimura,M.Baba, T.Makino, S. Yamamoto, T.Yamamoto, T.Kataoka, and T.Tokunaga. 1992. "Oligonucleotide sequences required for natural killer cell activation". Jpn. J.Cancer Res. 83:1128).
몇가지 포스포로티오에이트 변형 ODN은 실험관 또는 생체 내에서 B세포 자극을 유발시킨다고 보고되어 있다(Tanaka, T.,C.C. Chu, and W.E.Paul. 1992. "An antisense oligonucleotide complementary to a sequence in Ig2b increase g2b germline transcripts, stimulates B cell DNA synsis, and inhibits immunoglobulin secretion". J.Exp.Med. 175:597; Branda, R.F.,A.L.Moore, L.Mathews, J.J. McCormack, and G.Zon. 1993. "Immune stimulation by an antisense oligomer complementary to the rev gene of HIV-1". Biochem. Pharmacol. 45:2037; McIntyre, K.W.,K.Lombard-Gillooly, J.R. Perez, C. Kunsch, U.M. Sarmiento, J.D. Larigan, K.T. Landreth, and R.Narayanan. 1993. "A sense phosphorothioate oligonucleotide direct to the initiation codon of transscription factor NF-kB T65 cause sequence-specific immune stimulation". Antisense Res. Develop. 3:309; and Pisetsky, D.S., and C.F.Reich. 1993. "Stimulation of murine lymphocyte proliferation by a phosphorothioate oligonucleotide with antisense activity for herpes simplex virus". Life Sciences 54:101). 이러한 보고들은 그 효과를 설명할 수 있는 ODN에서의 일반 구조의 특성 또는 서열요소를 제시하지는 않는다.
cAMP 반응요소 결합단백질(CREB)과 활성전사인자(ATF) 또는 전사인자의 CREB/ATF족은 11개의 멤버가 떨어져서 클론화된 전사인자류를 도처에 발현하고 있다(reviewd in de Groot, R.P., and P.Sassone-Corsi: "Hormonal control of gene expression: Multiplicity and versatility of cyclic adenosine 3'5'- monophosphate-responsive nuclear regulation by CREB and its relatives". biochim. Biophys. Acta 1174:221, 1993.). 이들은 모두 염기성 영역/류신 지퍼(bZip)류 단백질에 속한다. 모든 세포는 하나 이상의 CREB/ATF 단백질을 발현하지만, 그 멤버는 발현되어 표준의 mRNA 스플라이싱에서는 조직특이성을 나타낸다. 활성 도메인의 분화 스플라이싱은 특이 CREB/ATF 단백질이 전사금지제인지 활성제인지를 결정할 수 있다. 많은 CREB/ATF 단백질이 바이러스 전사를 활성화하지만, 몇몇 스플라이싱 변이체는 활성도메인이 금지되는 것이 부족하다. CREB/ATF 단백질은 cAMP반응요소, CRE, 비메틸화된 서열 TGACGTC로 형성되는 공통부분을 통하여 호모다이머 또는 헤테로다이머로서 DNA와 결합할 수 있다(CpG가 메틸화되어 있다면 결합이 파기된다)(Iguchi-Ariga, S.M.M., and W.Schaffner: "CpG methylation of the cAMP responsive enhance/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcription activation". Gene & Develop. 3:612,1989.).
B세포 활성화 동안에는 CRE의 전사활동은 증가된다(Xie,H.T.C.Chiles, and T.L. Rothstein: "Induction of CREB activity via the surface Ig receptor of B cells". J.Immunol. 151:880, 1993.). CREB/ATF 단백질은 fos, jun B, Rb-1, IL-6, IL-1과 같이 면역학적으로 중요한 유전자를 포함하는 CRE를 통하여 동의 유전자의 발현을 조정하는 것으로 나타난다(Tsukada, J.,K. Saito, W.R. Waterman, A.C. Webb, and P.E. Auron: "Transcription factors NF-IL6 and CREB recognize a common essential site in the human prointerleukin 1 gene". Mol. Cell. Biol. 14:7285, 1994; Gray, G.D., O.M. Hernandez, D. Hebel, M. Root, J.M. Pow-Sang, and E.Wickstrom: "Antisense DNA inhibition of tumor growth induced by c-Ha-ras oncogene in nude mice". Cancer Res. 53:577,1993), IFN-(Du,W., and T.Maniatis: "An ATF/CREB binding site protein is required for virus induction of the human interferon B gene". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2150,1992), TGF-1(Asiedu, C.K.,L.Scott, R.K. Assoian, M. Ehrlich: "Binding of AP-1/CREB protein and of MDBP to contiguous sites downstream of the human TGF-B1 gene". Biochim. Biophys. Acta 1219:55, 1994.), TGF-2, class ⅡMHC(Cox, P.M., and C.R. Goding: "An ATF/CREB binding motif is required for aberrant constitutive expression of the MHC class ⅡDRa promoter and activation by SV40 T-antigen". Nucl. Acids Res. 20:4881, 1992.), E-selectin, GM-CSF, CD-8, the germline Ig constant region gene, the TCR V gene, and the proliferating cell nuclear antigen(Huang, D.,P.M. Shipman-Appasamy, D.J. Orten, S.H. Hinrichs, and M.B. Prystowsky: "Promoter activity of the proliferating-cell nuclear antigen gene is associated with inducible CRE-binding proteins in interleukin 2-stimulated T lymphocytes". Mol. Cell. Biol. 14:4233, 1994.). cAMP 경로를 통한 활성화와 함께, CREB는 또는 세포내 Ca-농도를 변화시키기 위하여 전사 반응을 중재할 수 있다(Sheng, M., McFadden, and M.E. Greenberg: "Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB". Neuron 4:571, 1990).
CREB/ATF 단백질에 의한 전사활성화에 있어서 단백질-단백질 간의 상호작용의 역할이 상당히 중요하다. NFKB 단백질과 CREB/ATF 단백질 사이의 직접 또는 간접적인 상호작용을 보고하는 몇가지 출시된 연구결과들이 있다(Whitley, et. al.,(1994) Mol. & Cell. Biol. 14:6464; Cogswell, et al.,(1994) J.Immun. 153:712; Hines, et al.,(1993) Oncogene 8:3189; and Du, et al.,(1993) Cell 74:887). 환상 AMP 경로를 통한 CREB의 활성화는 ser133상에 CREB341을 포스포릴레이트화시키는 단백질 키나아제A(PKA)를 필요로 하고, 최근에는 클론화된 단백질 CBP에 결합할 수 있다(Kwok, R.P.S., J.R. Lundblad, J.C. Chrivia, J.P. Richards, H.P. Bachinger, R.G. Brennan, S.G.E. Robert, M.R. Green and R.H. GoodMan: "Nuclear protein CBP is a coactivator for the transcription factor CREB". Nature 370:223, 1994; Arias, J., A.S.Alberts, P.Brindle, F.X. Claret, T. Smea, M.Karin, J. Feramisco, and M.Montminy: "Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on common nuclear factor". Nature 370:226, 1994.). 다음으로 CBP는 증가된 전사를 유발시키는 기초 전사인자(TFIIB)와 상호작용을 한다. CREB는 또한 dTAFII 110과 상호작용을 하고, 결합이 전사를 조정할 수 있는 단백질-결합인자와 결합하는 TATA와 상호작용을 한다는 것이 보고되었다(Ferreri, K.,G.Gill, and M. Montminy: "The cAMP-regulated transcription factor CREB interacts with a component of the TFIID complex". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1210, 1994.). 이러한 상호작용과 함께, CREB/ATF는 특히 다른 핵 인자와 다중결합할 수 있다(Hoeffler, J.P., J.W. Lustbader, and C.-Y. Chen: "Identification of multiple nuclear factors that interact with cyclic adenosine 3'5'-monophophate response element-binding protein and activating transcription factor-2 by protein-protein interations" Mol. Endocrinol. 5:256, 1991), 그러나, 이러한 대부분의 상호작용에 대한 생물학적 중요성은 알려져 있지 않다. CREB는 일반적으로 몇가지 다른 단백질과 호모다이머 또는 헤테로다이머로서 DNA와 결합하는 것으로 생각되어진다. 놀랍게도, CREB 단량체는 구성적으로 전사를 활성화시킨다(Krajewski, W., and K.A.W.Lee: "A monomeric derivative of the cellular transcription factor CREB functions as a constitutive activator". Mol. Cell. Biol. 14:7204, 1994.).
세포성 전사를 조정하는 비평적인 역할과는 달리 최근에 CREB/ATF 단백질은 바이러스 복제에 요구되는 몇몇 감염성 바이러스와 레트로바이러스에 의해 파괴된다. 예를 들면, 알려진 가장 강력한 포유동물 촉진제의 하나인 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 촉진제는 촉진 기능에 필수적인 11개의 CRE 복제물을 포함한다(Chang, Y.-N.,S. Crawford, J. Stall, D.R. Rawlins, K.-T. Jeang, and G.S. Hayward: "The palindromic series I repeat in the simian cytomegalovirus major immediate-early promoter behave as both strong basal enhancers and cyclic AMP response elements". J. Virol. 64:264,1990). 많은 촉진제를 유발시키는 아데노바이러스 E1A 단백질의 적어도 몇가지 전사활성효과는 E1A 유발 전사활성화를 조정하는 ATF-2, CREB/ATF 단백질의 DNA 결합도메인에 대한 그 결합에 기인한다(Liu, F., and M.R. Green: "Promoter targeting by adenovirus E1a through interation with different cellular DNA-binding domain". Nature 368:520, 1994). 또한 E1A가 CREB-결합 단백질, CBP에 결합한다는 것이 제안되었다(Arany, Z.,W.R. Sellers, D.M. Livingston, and R. Eckner: "E1A-associated p300 and CREB-associated CBP belong to a conserved family of coactivator". Cell 77:799, 1994). 인간 T세포 백혈병과 열대성 경련성 전신마비를 유발하는 인간 T 림프구 바이러스-I(HTLV-1), 레트로바이러스도 복제를 위하여 CREB/ATF 단백질을 필요로 한다. 이 경우, 레트로바이러스는, CREB/ATF 단백질과 결합하고 이들을 정상 세포결합 사이트로부터 HTLV 전사 증강구조 내에 존재하는 다른 DNA 서열(G-와 C-가 풍부한 서열이 측면에 접함)로 방향을 바꾸게 하는 단백질 Tax를 생성한다(Paca-Uccaralertkun, S., L.-J. Zhao, N. Adya, J.V. Cross, B.R. Cullen, I.M. Boros, and C.-Z. Giam: "In vitro selection of DNA element highly responsive to the human T-cell lymphotropic virus type I transcriptional activator, Tax". Mol. Cell. Biol. 14:456, 1994; Adya, N., L.-J. Zhao, W. Huang, I.Boros, and C.-Z. Giam: "Expansion of CREB's DNA recognition specificity by Tax result from interaction with Ala-Ala-Arg at position 282-284 near the conserved DNA-binding domain of CREB". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5642, 1994).
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본 발명은 비메틸화된 시토신-구아닌(CpG)디뉴클레오티드를 함유하는 몇몇 핵산이 객체에서 림프구를 활성화시키고, Th2 로부터 Th1 로 객체의 면역반응의 방향을 전환하게 한다(예를 들면, 단핵세포 및 그 밖의 세포를 유발하여, IL-12, IFN-γ 및 GM-CSF을 포함하는 Th1 시토킨을 생성함으로써)는 발견에 기초한 것이다. 이러한 발견에 기초한 본 발명은, 하나의 관점에서 새로운 면역자극 핵산 조성물을 특징으로 한다.
일실시예에서, 본 발명은 다음 일반식으로 나타낸 CpG 모티프(motif)를 포함하는 단리된 면역자극 핵산서열을 제공한다.
5'N1X1CGX2N23'
여기서, 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리하고; X1은 아데닌, 구아닌 또는 티민이고; X2는 시토신 또는 티민이고; N은 뉴클레오티드이고, N1+N2는 N1과 N2가 CCGG쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG트라이머를 함유하지 않을 경우, 대략 0-26염기이고; 핵산서열은 대략 8-30염기 길이이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다음 일반식으로 나타낸 CpG 모티프를 포함하는 단리된 면역자극 핵산서열을 제공한다:
5'N1X1X2CGX3X4N23'
여기서, 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리하고; X1X2는 CpT, GpG, GpA, ApT 및 ApA로 이루어진 군으로부터 선택되고; X3X4는 TpT 또는 CpT로 이루어진 군으로부터 선택되고; N은 뉴클레오티드이고, N1+N2는 N1과 N2가 CCGG쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG트라이머를 함유하지 않을 경우, 대략 0-26염기이고; 핵산서열은 대략 8-30염기 길이이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 객체, 바람직하게 인간에게 본 발명의 핵산서열을 투여함으로서 면역활성을 촉진시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 면역활성은 면역활성의 Th1패턴에 현저한 효과가 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산서열은 시토킨 생성을 촉진시킨다. 특히, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF 등의 시토킨을 상술한 핵산서열을 이용한 면역 시스템의 자극을 통해서 생성한다. 또 다른 관점에서, 본 발명의 핵산서열은 자연킬러세포(NK)의 용균활성 및 B세포의 증식을 촉진시킨다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 핵산서열은 쥐 또는 인간 등의 포유류에서의 항체생성 중에 사용하기 위한 인공의 보조제(adjuvant)로서 유용하다.
또 다른 실시예에서, 자가면역장애가 CpG로 매개된 백혈구 활성에 대한 객체의 반응을 저해함으로써 치료된다. 본 발명은 자가면역장애를 개선하기 위해 바필로마이신(bafilomycin), 클로로퀸(chloroquine) 및 모넨신(monensin) 등의 엔도솜의 산성화 저해제의 투여를 제공한다. 특히, 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus)가 이 방법으로 치료된다.
본 발명의 핵산서열은 또 다른 장해(예를 들면, 종양 또는 암 또는 바이러스, 곰팡이, 박테리아 또는 기생충 감염)를 치료하고, 막거나 개선하기 위해 또한 사용될 수 있다. 또한, 핵산서열은 백신에 대한 객체의 반응을 촉진시키기 위해 투여된다. 더욱이, Th2 로부터 Th1으로 객체의 면역반응의 방향을 바꿈으로써, 본 발명의 핵산서열을 사용하여, 천식장애를 치료하거나 막을 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산분자는 천식장애와 관련된 알레르기 반응의 발생을 치료 또는 막기 위한 탈감작(desensitization) 요법의 형태로서 특별한 알레르겐과 결합하여 객체에 투여될 수 있다.
더욱이, 세포 사이클로 들어가도록 백혈병 세포를 유발하는 상술한 본 발명의 핵산서열의 활성은, 종래의 절단수술의 화학요법에 뒤따르는 만성적인 백혈병 세포의 민감성을 증가시킴으로써, 또는 핵산서열과 또다른 면역요법을 결합함으로써, 백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특성 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 더욱 확실하게 될 것이다.
도1a는 T-세포가 제거된 비장세포 배지(culture)에서 여러 DNA서열에 대한 투약량에 따른 IL-6생성물을 점을 찍어 나타낸 그래프로서, E.coli DNA(1) 및 송아지 흉선 DNA(n)서열 및 LSP(E. coli와 송아지 흉선 DNA농도의 10배)(u)를 나타내는 그래프;
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도 1b는 T-세포가 제거된 비장세포 배지(culture)에서 여러 DNA서열에 대한 투약량에 따른 IL-6생성물을 점을 찍어 나타낸 그래프로서, 대조군(control) 포스포디에스테르 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 5'ATGGAAGGTCCAGTGTTCTC3' (서열번호: 1) (n) 및 두 개의 포스포디에스테르 CpG ODN 5'ATCGACCTACGTGCGTTCTC3'(서열번호: 2)(u) 및 5'TCCATAACGTTCCTGATGCT3' (서열번호: 3)(l)를 나타내는 그래프;
도 1c는 T-세포가 제거된 비장세포 배지에서 여러 DNA 서열에 대한 투여량에 따른 IL-6 생성물을 점을 찍어 나타낸 그래프로서, 대조군(control) 포스포로티오에이트 ODN 5'GCATGACGTTGAGCT3' (서열번호: 4) (n) 및 두개의 포스포로티오에이트 CpG ODN 5'GAGAACGTCGSCCTTCGAT3' (서열번호: 5)(u) 및 5'GCATGACGTTGAGCT3' (서열번호: 6)(l)를 나타내는 그래프(데이터는 3회의 평균±표준편차를 나타냄);
도 2는 주사(injection) 후 1시간 내지 8시간에 생체 내에서의 CpG DNA에 의해 유발된 IL-6생성물을 점으로 찍은 그래프(데이터는 두마리 쥐 혈청의 2회 분석으로부터의 평균을 나타냄. BALB/c 쥐(두마리 쥐/그룹)는 PBS(o)의 100㎕ 또는 CpG 포스포로티오에이트 ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (서열번호: 7)(n) 또는 비-CpG 포스포로티오에이트 ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3'(서열번호: 8)의 200㎍이 iv로 투여된다);
도 3은 PBS(o)의 100㎕ 또는 CpG 포스포로티오에이트 ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (서열번호: 7) 또는 비-CpG 포스포로티오에이트 ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (서열번호: 8)의 200㎍이 iv로 투여된 BALB/c 쥐(두 마리 쥐/그룹)의 생체내 자극 후의 여러 기간에 간, 비장 및 흉선에서의 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 결정된 IL-6 mRNA발현을 나타내는 방사선사진;
도 4a는 안티-IL-6에 의한 CpG-유발 IgM 생성의 투약량에 따른 저해도를 점을 찍어 나타낸 그래프(DBA/2 쥐의 비장 B-세포를 중화시킨 안티-IL-6(u) 또는 아이소타입 조절 Ab(l)의 표시된 농도 및 ELISA에 의해 결정된 배약 상청액에서의 IgM 레벨 하에서, CpG ODN 5'TCCAAGACGTTCCTGATCCT3'(서열번호: 9)으로 자극하였다. CpG ODN존재 하에서, 안티-IL-6 Ab는 IgM분비(n)에 효과가 없었다);
도 4b는 안티-IL-6 및 CpG S-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (서열번호: 7)(u) 또는 안티-IL-6항체만(n)으로 배양된 CpG-유도된 비장 B-세포의 자극 지표를 점을 찍어 나타낸 그래프(데이터는 3회의 평균±표준편차를 나타냄);
도 5는 프로모터-레스(promoter-less) CAT 구조(pCAT), 양성 대조군(contorl) 플라스미드(RSV) 또는 IL-6프로모터-CAT구조 단독으로 트렌스펙트되거나, 표시된 농도에서의 CpG 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (서열번호: 7) 또는 비-CpG 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (서열번호: 8) 포스포로티오에이트 ODN으로 배양된 WEHI-231에서 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 활성을 나타낸 막대 그래프(데이터는 3회의 평균을 나타냄);
도 6은 B세포 및 단핵세포(대식세포 및 수지상(dendritic) 세포를 포함) 둘 다를 직접적으로 활성화시키는, 면역자극 비메틸화된 CpG 함유 핵산의 면역효과의 개략도(면역자극 올리고뉴클레오티드는 순수 NK세포를 직접적으로 활성화시키지 않지만, 그들의 IFN-γ생성의 현저한 증가로 IL-12와 반응하기에 충분하게 만든다. IL-12 생성을 유발하고 이어서 NK세포에 의한 증가된 IFN-γ분비를 유발하는 것에 의해서, 면역자극 핵산은 Th1 타입 면역반응을 촉진시킨다. 고도로 정제된(highly purified) T-세포에 의한 시토킨 분비 증식의 직접적인 활성은 없다는 것을 발견하였다. 그러나, 면역자극 올리고뉴클레오티드에 의한 Th1 시토킨 분비의 유발은 세포독성의 림프구 반응 발생을 촉진시킨다);
도 7은, 접촉시킨 후 15분과 30분 등 다양한 측정시간에서 E.coli(EC)DNA(비메틸화 CpG 모티프를 함유함), 대조군(CT) DNA(비메틸화 CpG 모티프를 함유하지 않음) 및 리포다당체(LPS)로 처리된 단핵백혈구에서의 NFkB mRNA 유발을 나타내는 방사능 사진;
도 8a는, 반응성 산소종의 레벨을 결정하기 위해서 디하이드로로다민(dihydrorhodamine) 123 염료와 함께 쥐의 B세포를 사용한 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 연구결과를 나타내는 도면(도면에서 패널 A의 염료만의 샘플은 28.6%로 염료에 양성인 세포의 배경레벨을 28.6%로 나타낸다. 이러한 반응성 산소종의 레벨은 PMA, 이오노마이신, 양성 대조군(패널 B)으로 20분간 처리된 세포에서 거의 80%까지 증가되었다. CpG 올리고(TCCATGACGTTCCTGACGTT 서열번호 10(SEQ ID No. 10))로 처리된 세포는 또한 세포의 50%이상이 양성이 되어 반응성 산소종의 레벨에 있어서 증가를 나타냈다(패널 D). 그러나, CpG가 바뀌는 것을 제외하고 동등한 서열(TCCATGAGCTTCCTGAGTGCT 서열번호 11(SEQ ID NO.11))을 보유한 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포는 반응성 산소종의 레벨에 있어서 이러한 유의적 증가는 나타내지 않았다(패널 E));
도 8b는, 반응성 산소종의 레벨을 결정하기 위해서 디하이드로로다민 123 염료와 함께 클로로퀸의 존재하에서 쥐의 B세포를 사용한 플로우 사이토메트리 연구결과를 나타내는 도면(클로로퀸은 패널 A에서 미처리된 세포가 양성으로 되는 것이 단지 4.3%가 되도록 세포내 반응성 산소종의 배경레벨을 약간 저하시킨다. 클로로퀸은 CpG DNA(패널 B)로 처리된 세포 내에서 반응성 산소종의 유발을 완전히 없애지만, PMA와 이오노마이신(패널 E)으로 처리된 세포 내에서 반응성 산소종의 레벨을 감소시키지는 않는다);
도 9는, 폐세척(lung lavage) 세포수를 시간에 따라서 표시한 그래프(이 그래프는 Th2 면역반응을 유발시키는 만손 주혈흡충증 에그 "egg"를 처음에 주사하고, 이어서 만손 주혈흡충증 에그 항원 "SEA"을 흡입시켰을 때(오픈 사이클), 많은 염증 세포가 폐내에 존재하는 것을 나타낸다. 그러나, 쥐에 에그와 함께 CpG 올리고(SEQ ID NO.10)를 주입했을 때(오픈 트라이앵글), 폐 내의 염증 세포는 이어지는 SEA의 흡입으로 인하여 증가되지 않는다);
도 10은, 폐세척 호산구수를 시간에 따라서 표시한 그래프(이 그래프는 쥐에 에그를 주사하고 이어서 SEA를 흡입시켰을 때(오픈 사이클), 많은 호산구가 폐 내에 존재하는 것을 나타낸다. 그러나, 에그와 함께 CpG 올리고(SEQ ID NO.10)를 처음에 주입시켰을 때, 폐 내의 염증 세포는 이어지는 SEA의 흡입(오픈 트라이앵글)으로 인하여 증가되지 않는다);
도 11은, 식염수에만; 에그 그리고 SEA에; 에그와 서열번호 11(SEQ ID No.11) , 그리고 SEA에; 에그와 대조군 올리고(SEQ ID No.11), 그리고 SEA에 노출시켰을 때 유발되는 마크로파아지, 림프구, 호중구와 호산구 세포에 대한 효과를 나타내는 막대 그래프(쥐를 에그에 대한 초기 노출시에 대조군 올리고로 처리했을 때, SEA 흡입 후에 수반하는 폐로의 호산구 유입에 대한 효과는 거의 없다. 따라서, 에그를 쥐가 14일 또는 21일에 흡입할 때, 이것은 폐에서 급성 염증 반응을 발생시킨다. 그러나, 0일과 7일에 초기 항원 노출시에 에그와 함께 CpG 올리고를 주입하는 것은, 쥐가 14일에 에그 항원을 흡입하는 경우에, 호산구의 증가를 거의 완전히 없앤다);
도 12는 보호 올리고 SEQ ID No. 10.을 다양한 양으로 주사하는 것에 대한 호산구수를 나타내는 막대 그래프;
도 13은, 에그를 주사하고 다음에 SEA를 주사하거나(오픈 다이아몬드); 에그와 SEQ ID No.10과, 다음에 SEA을 주사하거나(오픈 사이클); 또는 식염수와 다음에 식염수를 주사하는 것(오픈 스퀘어)에 대하여 쥐 내에서 시간의 경과에 따른 인터류킨 4(IL-4)의 생성을 나타내는 그래프(이 그래프는 폐에서 Th2 시토킨 IL-4의 레벨과 염증반응이 서로 관련된다는 것을 나타낸다);
도 14는, 식염수를 주사하거나; 에그 다음에 SEA를 주사하거나; 또는 SEQ ID No. 10과 에그 다음에 SEA를 주사하는 것에 대하여 쥐 내에서 시간의 경과에 따른 인터류킨 12(IL-12)를 나타내는 그래프(이 그래프는 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 투여가, 폐의 시토킨 반응의 방향을 실제로 Th1형 면역반응을 나타내는 IL-12의 생성으로 전환시킬 수 있음을 보여준다); 및
도 15는, 식염수를 주사하거나; 에그 다음에 식염수를 주사하거나; 또는 SEQ ID No.10과 에그 다음에 SEA를 주사하는 것에 대하여 시간의 경과에 따른 쥐 내에서 인터페론 감마(IFN-γ) 생성(pg/ml)을 나타내는 그래프(이 그래프는 또한 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 투여가, 폐의 시토킨 반응의 방향을 실제로 Th1형 면역반응을 나타내는 IFN-λ의 생성으로 전환시킬 수 있음을 보여준다).
여기에서 사용되는, 다음의 항목과 어구들은 아래에서 설정되는 의미를 나타낸다.
"알레르겐"이란 민감한 객체에서 알레르기 반응 또는 천식반응을 유발할 수 있는 물질을 말한다. 알레르겐 리스트는 광대하여, 꽃가루, 곤충의 독, 동물의 털(dander) 먼지, 균질의 포자와 페니실린과 같은 약품 등을 들 수 있다. 선천성, 동물성 그리고 식물성 알레르겐의 예로는 다음과 같은 종류에 한정되는 단백질을 포함한다. 예컨대, 캐니스 페밀리어리스 등의 캐닌; 더마토파고이데스 파리나에 등의 더마토파고이데스; 펠리스 도메스티커스 등의 펠리스; 암브로시아(암브로시아 아테미이스폴리아; 롤리움 페레네 또는 롤리움 멀티플로룸 등의 롤리움 등); 크립프토메리아 자포니카 등의 크립프토메리아; 앨터나리아 앨터나타 등의 앨터나리아; 앨더; 앨너스 굴티노사 등의 앨너스; 베툴라 베루코사 등의 베툴라; 큐어코스 앨바 등의 큐어코스; 올레아 유로파 등의 올레아; 아테미시아 불가리스 등의 아테미시아, 플랜타고 랜세오라타 등의 플랜타고; 파리에타리아 오피시널리스 또는 파리에타리아 쥬다이카 등의 파리에타리아; 블라텔라 저머니카 등의 블라텔라; 아피스 멀티플로룸 등의 아피스; 큐프레서스(큐프레서스 셈퍼바이렌스, 큐프레서스 아리조니카와 큐프레서스 마크로카파 등); 쥬니퍼러스 사비노이데스, 쥬니퍼러스 버지니아나, 쥬니퍼러스 커뮤니스와 쥬니퍼러스 어세이 등의 쥬니퍼러스; 튜야 오리엔탈리스 등의 튜야; 채마에사이패러스 오브튜사 등의 채마에사이패러스; 페리플라네타 아메리카나 등의 페리플라네타; 애그로피론 레펜스 등의 애그로피론; 스캐일 세리얼레 등의 스캐일; 트리티컴 아에스티범 등의 트리티컴; 닥틸리스 글로메라타 등의 닥틸리스; 페스튜카 엘라티오 등의 페스튜카; 포아 프래텐시스 또는 포아 컴프레사 등의 포아; 아베나 사티바 등의 아베나; 홀커스 래너터스 등의 홀커스; 안톡산썸 오도라튬 등의 안톡산썸; 아렌아테륨 엘라티어스 등의 아렌아테륨; 애그로스티스 앨바 등의 애그로스티스; 플레움 프래텐스 등의 플레움; 팔라리스 아룬디나세아 등의 팔라리스; 파스팔룸 노타튬 등의 파스팔룸; 소그험 할레펜시스 등의 소그험; 브로머스 이너미스 등의 브로머스 등을 들 수 있다.
"알레르기"란 물질(알레르겐)에 대해 얻어진 과민성을 말한다. 알레르기성 상태는 습진, 알레르기성 비염 또는 코감기, 건초열, 기관지 천식, 두드러기, 음식 알레르기와, 그 밖의 아토피성 상태를 포함한다.
"천식"이란 염증의 성격을 나타내고 기관(氣管)이 좁아져서 흡입제에 대한 기관의 반응성을 증가시키는 호흡기 계통의 장애이다. 천식은 아토피성 또는 알레르기성 증세와 관련된 것 이외일지라도 종종 발생된다.
"면역체계 결핍" 이란 환자의 면역체계가 정상적 기능을 발휘하지 못하거나, 또는 종양 또는 암(예컨대, 뇌, 폐(소세포와 비소세포 등), 난소, 유방, 전립선, 결장에서의 종양, 이외에 다른 암종과 육종 등) 또는 환자로의 감염 등을 제거하기 위한 환자의 면역반응을 향상시키는 데 있어서 유용하지 못한 질병 또는 장애를 의미한다.
감염성 바이러스의 예로는, RNA종양바이러스(HIV-1과 같은 인간 면역결핍성 바이러스(HTLV-Ⅲ, LAV 또는 HTLV-Ⅲ/LAV, 또는 HIV-Ⅲ로서도 언급됨; HIV-LP와 같은 다른 분리균; 피코나비리다에(예컨대, 폴리오 바이러스, 간염 A 바이러스, 엔테로바이러스, 인간 콕사키바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스 등); 칼시비리다에(가스트로엔테리티스를 유발하는 스트레인(strain) 등); 토가비리다에(엔세팔리티스 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비리다에(뎅기열 바이러스, 엔세팔리티스 바이러스, 황열 바이러스); 코로나비리다에(코로나바이러스 등); 라브도비리다에(베시큘러 스토마티티스 바이러스, 래비스 바이러스); 필로비리다에(에볼라 바이러스 등); 파라미소비리다에(파라인플루엔자 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 홍역바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 등); 올토미소비리다에(인플루엔자 바이러스 등); 번가비리다에(한탄 바이러스, 번가바이러스, 펠레보바이러스와 나이로 바이러스); 아레나 비리다에(유행성 출혈열 바이러스 등); 레오비리다에(레오바이러스, 오비바이러스와 로타바이러스 등); 버나비리다에; 헤페드나비리다에(헤파터티스 B 바이러스, 즉, B형 간염 바이러스); 파보비리다에(파보바이러스); 파포바비리다에(파필로마 바이러스, 폴리오마바이러스); 아데노비리다에(모스트 아데노바이러스); 허페스비리다에(허페스 심플렉스 바이러스(HSV) 1과 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 허페스 바이러스); 폭스비리다에(바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스 등); 이리도비리다에(아프리카 돼지 콜레라 바이러스 등); 미분류 바이러스(스폰지폼 엔세팔로패티스의 병원체, 델타 헤파터티스 작용제(헤파터티스 B 바이러스의 결손 사텔라이트로 생각됨), non-A, non-B 헤파터티스 작용제(클라스 1 = 내부적으로 전파된 것, 클라스 2 = 경구적으로 전파된 것(헤파터티스 C, 즉, C형 간염 바이러스); 노르워크와 관련된 바이러스)를 포함한다.
감염성 박테리아의 예로는, 헬리코박터 필로리스, 보렐리아 버그도페리, 레지오넬라페뉴모필리아, 마이코박테리아 sps (M.튜버큘로시스, M.아븀, M.인트라셀룰레어, M.칸사이, M.골도나에), 스타필로콕커스 아울레어스, 네이세리아 고놀호에아에, 네이세리아 메닌저티디스, 리스테리아 모노사이토젠, 스트렙토콕커스 피요젠(군 A 스트렙토콕커스), 스트렙토콕커스 아갈락티에(군 B 스트렙토콕커스), 스트렙토콕커스(비리단 군), 스트렙토콕커스 파에칼리스, 스트렙토콕커스 보비스, 스트렙토콕커스(아나에로빅 sps.), 스트렙토콕커스 페뉴모니아에, 파토제닉 캄필로박테리아 sp., 엔테로콕커스 sp., 하에모필러스 인플루엔자에, 바실러스 안트라시스, 코리네박테리움 디프테리에, 코리네박테리움 sp., 에리시펠로트릭스 루시오파티에, 클로스트리디움 퍼프린거, 클로스트리디움 테타니, 엔테로박터 아에로젠, 클레브시엘라 페뉴모니아에, 패스트우렐라 멀토시다, 박테로이드 sp., 푸소박테리움 뉴클레아튬, 스테렙토바실러스 모닐리포미스, 트레포네마 팰리듐, 트레포네마 퍼테뉴, 렙토스피라, 액티노마이스 이스라엘리 등을 포함한다.
감염성 균의 예로는, 크립토콕커스 네오포맨스, 히스토플라즈마 캡슐라튬, 콕시디오이드 이미티스, 블라스토마이스 더마터티디스, 클라미디아 트라코마티스, 캔디다 알비칸스 등을 포함한다. 이외의 감염성 유기체(프로티스트 등)는 플라스모디움 팰시파룸과 톡소플라즈마 곤디이를 포함한다.
"면역자극성 핵산분자"는, 비메틸화된 사이토신, 구아닌 디뉴클레오티드 서열(즉, 포스페이트 결합에 의해 연결되고 사이토신 다음에 이어지는 구아닌을 함유하는 DNA 또는 "CpG DNA")을 보유하고 척추동물의 림프구를 자극하는(즉, 마이토젠성 효과를 보유하거나 또는 시토킨 발현을 유발시키거나 증가시키는) 핵산분자를 말한다. 면역자극성 핵산분자는 2본쇄(double-stranded) 또는 1본쇄로 할 수 있다. 일반적으로, 2본쇄 분자는 생체 내에서 더 안정될 수 있으며, 반면 1본쇄 분자는 면역활성을 증가시켰다.
일 실시예에서 본 발명은 아래의 식으로 나타내는 CpG 모티프를 포함하는 단리된 면역자극성 핵산 서열을 제공한다.
5'N1X1CGX2N23'
여기에서, 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1은 아데닌, 구아닌, 또는 티민이고; X2는 시토신 또는 티민이며; N은 뉴클레오티드 중 하나이고, N1+N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 포함하지 않는 경우 N1+N2는 약 0-26염기를 보유하고, 그 핵산 서열은 길이에 있어서 약 8-30염기를 보유한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 아래의 식에서 나타내는 CpG 모티프를 포함하는 단리된 면역자극성 핵산서열을 제공한다.
5'N1X1X2CGX3X4N23'
여기에서, 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpGs를 분리시키고; X1X2는 GpT, GpG, GpA, ApT 및 ApA로 이루어진 군 중에서 선택되고; X3X4는 TpT 또는 CpT로 이루어진 군 중에서 선택되며; N은 뉴클레오티드 중 하나이고, N1+N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG트라이머를 포함하지 않을 경우 N1+N2는 약 0-26염기를 보유하고, 그 핵산 서열은 길이에 있어서 약 8-30염기를 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 면역자극 핵산서열은 GpT, GpG, GpA 및 ApA로 이루어진 군 중에서 선택된 X1X2를 포함하고; X3X4는 TpT, CpT와 GpT(실시예 참조, 표 5)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 세포로 흡수(uptake)를 용이하게 하기 위하여, CpG를 포함하는 면역자극성 핵산분자는 8 내지 30 염기 범위의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 어떤 크기의 핵산은, 세포 내에서 큰 핵산이 올리고뉴클레오티드로 분해되기 때문에, 충분한 면역자극성 모티프가 존재할 경우 면역자극성이 있다. 바람직한 합성 올리고뉴클레오티드는 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 5' 및/또는 3' 말단에 또는 그 근처에 함유하지 않으며, 및/또는 연속적인 마이토젠성 CpG 모티프는 팰린드롬(palindrome) 구조가 아니다. 연장되는 면역자극성은, 안정화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어질 수 있으며, 안정화된 올리고뉴클레오티드는 인산 골격으로 변형된 것이다. 예를 들면, 그 변형은 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형이다. 더 구체적으로는, 인산 골격 변형은 5'말단, 예를 들면 핵산의 5'말단의 첫 번째 두 개의 뉴클레오티드에서 발생한다. 더욱이, 인산 골격 변형은 핵산의 3'말단, 예를 들면 핵산의 3'말단의 마지막 5개의 뉴클레오티드에서 발생한다.
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면역자극성 CpG DNA는, 이것이 올리고뉴클레오티드일 경우, 8 내지 30염기 크기의 범위에 있는 것이 바람직하다. 또는 CpG 디뉴클레오티드는 플라스미드에서 큰 크기로 제조될 수 있는데, 이는 객체에 투여된 후 올리고뉴클레오티드로 분해된다. 바람직한 면역자극성 핵산분자(예를 들면, 객체에 있어서 항체(예를 들면 인간)반응을 촉진함으로서 백신의 효과를 증가시키고 면역체계 결핍을 치료하기 위하여 사용되는) 면역자극성 핵산분자는 B세포, 단핵세포 및/또는 자연 킬러 세포 반응(예를 들면, 시토킨, 증식(proliferative), 용해(lytic), 또는 다른 반응 등)에 대하여 상대적으로 높은 자극 지수를 보유한다.
본 발명의 핵산 서열은 예를 들면 객체에서 시토킨의 생성을 촉진한다. 시토킨은 IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, 그리고 GM-CSF를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전형적인 서열로는, TCCATGTCGCTCCTGATGCT(SEQ ID NO: 42), TCCATGTCGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO: 43), 그리고 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 56)를 포함한다.
본 발명의 핵산서열은 또한 인간과 같은 객체에서 자연 킬러세포(NK) 용해(lytic)활성을 촉진시키는데 유용하다. 아래의 서열과 같은 예를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO: 57), TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 59), GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:), TGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO: 60)와 TCGTCGTCGTCGTT(SEQ ID NO: 61) 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산서열은 또는 인간과 같은 객체에서 B세포 증식을 촉진시키는데 유용하다. 구체적으로 아래의 서열과 같은 예를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT(SEQ ID NO:62), TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO :63), TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT(SEQ ID NO:64), TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT(SEQ ID NO: 65), TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:67)과 TGTCGTTGTCGTTGTCGTT(SEQ ID NO:68) 등을 들 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명의 핵산서열은 포유동물에 있어서 항체생성 동안에 사용되는 보조제로서 유용하다. 구체적으로 아래와 같은 서열을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다: TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO.10), GTCG(T/C)T, TGTCG(T/C)T 등을 들 수 있다. 더욱이, 제시된 핵산서열은 Th2으로부터 Th1으로 객체 면역반응을 전환시킴으로써 천식장애의 증세를 치료하거나 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 전형적인 서열로는 TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO.10)를 포함한다.
특정의 면역자극성 CpG DNA의 자극 인덱스는 다양한 면역세포 시험법에 의해 시험할 수 있다. B세포 증식에 대한 면역자극성 CpG DNA의 자극 인덱스는, 20uM의 ODN을 20시간 동안 37℃로 접촉시키고 1uCi의 3H우리딘을 펄스하고 4시간 후 채취하여 실시예 1에 기재된 방법으로 측정한 쥐과 동물의 B세포 배양에서, 3H 우리딘의 결합으로 환산하여 적어도 5, 바람직하게는 10, 더 바람직하게는 15, 가장 바람직하게는 20으로 하는 것이 좋다. 생체용으로, 예를 들면 객체에서 세포-매개 면역반응을 자극함으로써 면역체계 결핍을 치료하기 위해서는, 면역자극성 CpG DNA가 단핵세포 및/또는 자연 킬러(NK)세포 용해활성에 의해 효과적으로 시토킨 분비를 유발시킬 수 있는 것이 중요하다.
면역자극성 CpG 핵산은, 실시예 12에서 기재되어 있는 시험법에 의해 결정된 바와 같이 치료의 증상에 따라서 적어도 500pg/ml의 TNF-α, 15pg/ml IFN-γ, 70pg/ml의 GM-CSF, 275pg/ml IL-6, 200pg/ml IL-12에서 효과적인 것이 바람직하다. 다른 면역자극성 CpG DNAs는 적어도 10%정도, 더 바람직하게는 15%정도, 가장 바람직하게는 20% 정도의 YAC-1 세포 특이성 용해, 또는 실시예 4에 기재되어 있는 시험법에 의해 결정된 적어도 30%정도, 더 바람직하게는 35%정도, 가장 바람직하게는 40% 정도의 2C11세포 특이성 용해에 효과적인 것이 바람직하다.
"핵산" 또는 "DNA"는 다중 뉴클레오티드(즉, 인산기 및 교환가능한 유기염기와 연결된 당(리보오스 또는 디옥시리보오스)를 포함하는 분자. 상기 유기염기는 치환된 피리미딘(시토신(C), 티민(T), 우라실(U)) 또는 치환된 퓨린(아데닌(A) 또는 구아닌(G))이다. 여기에서 사용되는 용어는 올리고디옥시리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 리보뉴클레오티드를 말한다. 이 용어는 또한 폴리뉴클레오사이드(즉, 폴리뉴클레오티드 마이너스 포스페이트)와 다른 유기염기 함유 폴리머를 포함한다. 핵산은 이미 존재하는 핵산원(게놈 또는 cDNA 등)으로부터 얻어질 수 있지만, 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 생산하는 것과 같은 합성에 의한 것이 바람직하다.
"핵산 운반 복합체"라는 것은 표적수단(예를 들면, 표적세포(B-세포, 자연 킬러(NK)세포 등)에 보다 높은 친화결합을 초래하는 분자)과 결합되는(예를 들면, 이온결합 또는 공유결합되는; 또는 캡슐형태로 둘러싸이는) 핵산분자를 의미한다. 핵산 운반 복합체의 예로는, 스테롤(콜레스테롤 등), 지질(양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜 등), 또는 표적세포 특이적 결합제(표적세포 특이적 수용체에 의해 인식되는 리간드 등)와 결합되는 핵산을 포함한다. 복합체는 표적세포에 의한 내부이행 이전에 유의적인 짝풀림(uncoupling)을 방지하기 위하여 생체 내에서 충분히 안정한 상태로 되어 있어야 하는 것이 바람직하다. 그러나, 복합체는, 핵산이 기능적 형태로 방출되게 하기 위해 세포내의 적절한 조건하에서 분해가능한 것이어야 한다.
"팰린드롬 구조의 서열(palindromic sequence)"이라는 것은 전후 반복(예를 들면, ABCDEE'D'C'B'A'와 같은 서열에 있어서, A와 A'는 일반적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 염기)를 의미한다. 생체 내에서, 이러한 서열은 2본쇄형 구조로 형성할 수 있다.
"안정화된 핵산분자"라는 것은 생체분해(예를 들면, 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제)에 대해 상대적으로 저항성이 있는 것을 의미한다. 안정화는 길이 또는 2차구조의 작용일 수 있다. 수십 내지 수백의 kbs 길이의 비메틸화된 CpG 함유 핵산은 생체분해에 대해 상대적으로 저항성이 있다. 보다 짧은 면역자극성 핵산분자는, 2차구조가 안정화를 시킬 수 있으며 그 효과를 증가시킨다. 예를 들면, 핵산분자의 3'말단이 상류부에 자기-상보성을 보유하는 경우, 되접혀서(fold back) 일종의 스템 루프(stem loop) 구조를 형성할 수 있어, 핵산분자가 안정화되고, 활성을 더 나타낸다.
본 발명의 안정화된 핵산분자는 변형 골격을 보유하는 것이 바람직하다. 면역자극에 이용하기 위해, 안정화된 핵산분자로는 포스포로티오에이트(예를 들면, 핵산분자의 포스페이트 산소 중 1 이상이 황으로 치환) 또는 포스포로디티오에이트 변형 핵산분자가 특히 바람직하다. 더 구체적으로는, 인산염 골격 변형은 핵산의 5'말단, 예를 들면 핵산의 5'말단의 첫 번째 2개의 뉴클레오티드에서 발생한다. 또한, 인산염 골격 변형은 핵산의 3'말단, 예를 들면 핵산의 3'말단의 마직막 5개의 뉴클레오티드에서 발생할 수도 있다. 여기에서 보고된 바와 같은 안정화된 핵산분자와 함께, 포스포로티오에이트-변형 핵산분자(포스포로디티오에이트 -변형을 포함)는 여기에서 나타내는 바와 같은 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 핵산분자의 면역 자극의 정도를 증가시킬 수 있다. "포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 아날로그에 의한 면역 자극"이라는 제목의 국제특허 출원 공개번호: WO 95/26204에서는 포스포로티오에이트 변형의 올리고뉴클레오티드의 비서열 특이적 면역자극성 효과에 대한 것이 보고되어 있다. 이 보고에 의하면, 포스포토티오에이트 골격을 보유한 비메틸화 CpG 함유의 핵산분자가 선택적으로 B-세포 활성을 활성화시킨다는 것이 발견되었고, 한편 포스포디에스테르 골격을 보유한 비메틸화 CpG 함유 핵산분자는 선택적으로 단핵세포류(대식세포, 수지상 세포와 단핵세포 등)와 NK세포를 활성화시킨다는 것이 발견되었다. 바람직한 인간 모티프를 갖는 포스포로티오에이트 CpG 올리고뉴클레오티드는 또한 단핵세포류와 NK세포의 강한 활성제이다.
다른 안정화된 핵산분자로는, 알킬-, 아릴-포스포네이트(여기에서 전하를 띤 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴기로 치환된다)와 같은 비이온성 DNA 아날로그, 전하를 띤 산소 일부분이 알킬화된 포스포디에스테르와 알킬포스포트리에스테르 등을 포함한다. 어느 하나 또는 양쪽 말단에 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜과 같은 디올을 포함하는 핵산분자는 또한 실질적으로 뉴클레아제 분해에 대한 저항성이 있는 것으로 나타났다.
"객체"라는 것은 인간 또는 개, 고양이, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 닭, 원숭이, 쥐, 생쥐 등의 척추동물을 의미한다.
여기에서 사용되는 것으로서, "벡터"라는 것은 핵산분자에 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산분자를 말한다. 벡터는 자율복제와 서로 연결되어 있는 핵산(에피솜 등)의 발현을 할 수 있는 것이 바람직하다. 작동상으로 서로 연결되어 있는 유전자 발현을 지시할 수 있는 벡터를 여기에서는 "발현 벡터"라고 부른다. 유전자 재조합 기술에 있어서 유용한 발현벡터는 일반적으로 그 벡터형태에 있어서 염색체에 결합되지 않는 환상의 2본쇄 DNA 루프로 불리우는 "플라스미드" 형태로 되어 있다. 본 명세서에 있어서, 플라스미드로서 내부변화가 가능하도록 사용되는 "플라스미드"와 "벡터"는 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 제공하며 본 기술분야에서 공지되어 있는 다른 형태의 발현벡터 등을 포함한다.
(어떤 비메틸화 CpG 함유 핵산은 실험관내 및 생체 내에서 나타내는 바와 같은 B세포 자극활성을 보유한다)
실시예 1과 2에 기재된 프로토콜을 사용하여 내재성의 RNA종양바이러스 서열에 특이적인 두 개의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 림프구 자극효과를 조사하는 과정에 있어서, 24개의 "콘트롤"("안티센스" ODN 패널에 대하여 다양한 스크램블, 센스, 매스매치 콘트롤을 포함) 중 2개만 B세포 활성과 IgM 분비를 매개하였고, 나머지 "콘트롤"은 효과가 없다는 것이 발견되었다.
두 개의 관찰은 "콘트롤" ODN에 의한 B세포 활성의 메카니즘이 안티센스 효과((1)Genbank에 기재된 척추동물의 DNA 서열의 비교는 비자극성 ODN에서 보여진 것 보다 더 크게 상동성을 나타내지 않는다는 것과 (2)두개의 콘트롤이 10㎍의 비장 폴리 A+RNA로 Northern 블럿 혼성을 나타내지 않는다는 것)를 포함하지 않을 수 있다는 것을 제시하였다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 또는 고압액체크로마토그래피에 의한 광범위한 정제 또는 다른 합성제에 의한 이 ODN의 재합성은 동일한 자극을 제공하고, 불순물의 가능성을 제거한다. C3H/HeJ 쥐 유래의 B세포를 사용하여 유사한 자극을 나타냈고, 리포다당체(LPS) 오염물이 그 결과물에 존재할 가능성을 제거했다.
두 개의 "안티센스" ODN의 것과 유사하게 B세포 활성을 유발시키는 두 개의 "콘트롤" ODN가, 4개의 모든 ODN이 서열 모티브를 포함하는 몇가지 비(non)-안티센스 메카니즘을 통해 B세포를 자극시킬 가능성을 향상시킨다는 사실이, 다른 모든 비자극성 콘트롤 ODN에는 없다. 이러한 서열을 비교함에 있어서, CpG 디뉴클레오티드가 포함된 4개의 모든 자극성 ODN이 비자극성 콘트롤과는 다른 서열내용으로 되어 있다는 것이 발견되었다.
자극성 ODN에 존재하는 CpG 모티프가, 관찰되는 자극의 원인이 되는지 여부를 결정하기 위해서, 다양한 서열내용에 메틸화, 비메틸화 또는 CpG가 없는 디뉴클레오티드를 포함하는 5 내지 42염기를 보유한 길이 범위의 300 ODN이 합성되었다. 두 개의 최초 "콘트롤"(ODN1과 ODN2)과 "안티센스"로서 합성된 최초 두 개의 것(ODN 3D와 3M; Krieg, A.M. J. Immunol. 143:2448(1989))를 포함하는 이 ODN을, 비장세포에 대한 실험관 효과를 시험하였다(대표적인 서열을 표 1에 기재하였다). 몇가지 ODN은 B세포 활성과 IgM분비를 유발시키는 CpG를 포함하고 있으며, 이러한 자극의 크기는 전형적으로 CpG디뉴클레오티드를 더 첨가함으로서 증가시킬 수 있다(표 1: ODN 2 내지 2a, 또는 3D 내지 3Da 및 3Db를 비교). 자극은 안티센스 메카니즘 또는 불순물로부터 기인하는 것으로 나타나지 않았다. ODN은 관찰할 수 있는 γδ 또는 다른 T세포군의 증식을 유발시키지 않았다.
CpG 디뉴클레오티드가 변이되거나(표 1: ODN 1 내지 1a; 3D 내지 3Dc; 3M 내지 3Ma; 4 내지 4a를 비교) 또는 CpG 디뉴클레오티드의 시토신이 5-메틸시토신으로 치환될 경우(표 1: ODN 1b, 2b, 3Dd, 3Mb), 마이토젠성 ODN 서열은 균일하게 비자극성으로 되었다. CpG 모티프의 부분적 메틸화는 자극효과의 부분적 손실을 유발하였다(표 1: 2a 내지 2c 비교). 대조적으로, 다른 시토신의 메틸화는 ODN 활성을 감소시키지 않았다(ODN 1c, 2d, 3De, 3Mc). 이러한 데이터는 CpG 모티프가 B세포를 활성화시키는 ODN에 존재하는 필수요소라는 것을 확인해 주었다.
이 연구과정에서, CpG 디뉴클레오티드 측면에 접하는 염기는 ODN에 의해 유발된 마우스 B세포 활성화를 결정하는데 중요한 역할을 한다는 것이 분명해졌다. 최상의 자극모티프는, 두 개의 5'퓨린(바람직하게는 GpA 디뉴클레오티드)과 2개의 3'피리미딘(바람직하게는 TpT 또는 TpC 디뉴클레오티드)이 측면에 위치하는 CpG인 것으로 결정되었다. CpG 모티프를 이러한 이상에 근접시키기 위한 ODN 변이는 자극을 증진시키는 반면(표 1: ODN 2 내지 2e; 3M 내지 3Md를 비교), 모티프를 방해하는 변이는 자극을 감소시켰다(예를 들면, 표 1: ODN 3D 내지 3Df; 4 내지 4b, 4c 및 4d를 비교). 한편, CpG 모티프 바깥쪽에 변이는 자극을 감소시키지 않았다(예를 들면, 표 1: ODN 1 내지 1d; 3D 내지 3Dg; 3M 내지 3Me를 비교). 인간 세포 활성화를 위해, 가장 측면에 접하는 염기는 약간 차이가 있다(표 5에 기재).
이렇게 시험한 것 중에, 8염기 보다 짧은 ODNs는 비자극성이었다(예를 들면, 표 1, ODN 4e). 48 중에 시험된 8염기 ODN 중에, 높은 자극 서열은 자기 상보적인 "팰린드롬(palindrome)" AACGTT를 보유하는 TCAACGTT(ODN 4)로서 확인되었다. 이 모티프를 더욱 최적화하는데 있어서, 특히 ODN의 말단 내부뉴클레오티드 결합(internucleotide linkage)의 포스포로티오에이트 변형에 의해 뉴클레아제 저항성이 된다면, 양 말단에 Gs를 보유한 ODN이 증가된 자극을 나타내는 것이 발견되었다. 첫 번째 2개와 마지막 5개의 내부뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트 변형된 ODN 1585 (5'GGGGTCAACGTTCAGGGGGG3' (SEQ ID NO: 12))는, 양 말단에 10Gs가 10As로 치환되는 것 이외에 ODN 1585와 동일한 서열을 갖는 ODN 1638은 쥐 비장세포 증식을 평균 3.2배 증가시킨 것에 비해, 쥐 비장세포 증식을 평균 25.4배 증가시켰다. ODN 1638에 CpG 모티프 없이 여러개의 G 말단을 추가하는 경우 증식의 증가는 없었다. 8염기쌍 보다 긴 핵산분자에 있어서, 비메틸화 CpG를 보유한 비(non)-팰린드롬 모티프는 더 많은 면역자극이 있는 것이 발견되었다.
5' 말단에 TpC 디뉴클레오티드를 보유하는 6염기 팰린드롬을 포함하는 다른 옥타머 ODN 또한 활성이 있었다(예를 들어, 표 1: ODN 4b, 4c). 5' 말단에 다른 디뉴클레오티드는 감소된 자극을 나타냈다(예를 들어, ODN 4f; 시험되어진 모든 16개의 가능한 디뉴클레오티드). 3'디뉴클레오티드의 존재는 5'디뉴클레오티드의 부족을 보충하기에는 불충분하였다(예를 들어, 표 1: ODN 4g). 팰린드롬의 중단은 옥타머 ODN에 자극을 제거했다(예를 들어, 표 1: ODN 4h). 그러나 팰린드롬은 더 긴 ODN에서는 필요로 되지 않았다.
Figure 111999004153182-pct00001
(쥐 B세포의 올리고뉴클레오티드 자극)
자극지수들은 적어도 3회의 각각의 실험에서 얻어진 평균 및 표준편차(std. dev.)이다. 그리고 ODN을 추가하지 않은 상태로 배양된 배양물과 비교했다.
ND = 실행하지 않음
CpG 디뉴클레오티드는 밑줄이 그어져 있음.
점들은 동일성(identity)을 나타낸다; 대시(dash,"_"를 말함)들은 삭제부분(deletion)을 나타낸다.
Z는 5-메틸시토신을 나타낸다.
Figure 111999004153182-pct00002
(쥐의 IL-6 생성과 B세포 활성을 위한 최적 CpG 모티프의 확인)
점들은 동일성을 나타낸다; CpG 디뉴클레오티드는 밑줄 그어져 있음;
ND=실행하지 않음
이 실험은 적어도 3번을 유사한 결과를 가지고 실행되었다.
CH12.LX와 비장 B세포의 비자극성 대조 배양물의 IL-6 레벨은 ≤10pg/㎖이다. 비자극성 배양물의 IgM 레벨은 547±82 ng/㎖이다. CpG 디뉴클레오티드는 밑줄 그어져 있다. 그리고 점들은 동일성을 나타낸다.
b[3H] 우리딘 포획(uptake)은 비자극성 대조(2322.67±213.68cpm)에 대한 배(fold) 증가(SI:자극계수)로 나타냈다.
세포는 여러 가지 CpG O-ODN 20μM으로 자극되어졌다. 데이터는 3회의 평균 ±표준편차(SD)로 나타낸다.
ELISA에 의해 측정함.
림프구 활성의 동력학은 쥐 비장세포를 사용하여 조사되었다. 세포를 ODN 추가와 동시에 펄스(pulse)하고 4시간 후 채취했을 때, 이미 3H 우리딘 결합(incorporation)이 2배 증가하였다. 자극은 12∼48시간에 절정이었다. 그 다음에는 감소했다. 24시간 후에, 원래 그대로의 ODN은 발견되지 않았는데, 이는 아마도 (submitogenic 용량에서) 안티-IgM을 가지거나 가지지 않는 정제된 B세포를 CpG ODN과 함께 배양했을 때 일어나는 자극의 감소를 설명하며, 증식은 48시간 후 결합하고 있는 두 개의 마이토젠에 의해서 약 10배 상승적으로 증가하는 것이 발견되었다. 자극의 크기는 농도에 의존하며 최적 조건하에서 둘다 LPS의 자극 크기를 초과하였다. 뉴클레아제 저항성 포스포로티오에이트 골격을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 거의 200배 이상 효력이 있었다.
세포주기 분석은 CpG-ODN에 의해 활성화된 B세포의 비율을 결정하기 위해 사용되었다. CpG-ODN은 B세포의 95% 이상에서 순환(cycling)을 유발했다. 플로우 사이트메트리에 의해 CD23-(주변지역(marginal zone)) 및 CD23+(난포(follicular)) 소집단으로 분류되는 비장 B 림프구는, ODN-유발 자극에 대하여, 퍼콜 구배(Percoll gradients) 분류에 의해 분리되는 B세포의 활성화된 군(activated population) 및 휴면 군(resting population)과 동등하게 반응했다. 이 연구들은 CpG-ODN은 필수적으로 세포주기로 들어가는 모든 B세포를 유발시킨다는 것을 나타냈다.
(쥐 B세포 아포토시스를 차단하는 면역자극성 핵산분자)
WEHI-231과 같은 어떤 B 세포 라인은, 안티-IgM에 의한 그 항원 수용기의 교차결합에 응하여 성장억제 및/또는 아포토시스를 행함으로써 유발된다(Jakway, J.P. et al., "Growth regulation of the B lymphoma cell line WEH-231 by anti-immunoglobulin, lipopolysaccharide and other bacterial products" J.Immunol.137:2225(1986); Tsubata, T.,J. Wu and T.Honjo: B-cell apotosis induced by antigen receptor crosslinking is blocked by a T-cell signal through CD40." Nature 364:645(1993)). WHEI-231 세포는 LPS와 같은 확실한 자극과 CD40 리간드에 의해 성장정지가 구제된다. CpG모티프를 포함한 ODN 또한 WEHI-231을 안티-IgM 유발 성장정지로부터 보호하는 것이 발견되었다. 이는, 보조 세포집단은 그 효과에 대해 요구되어지지 않는 것을 나타낸다. 그 다음의 연구는 CpG ODN이 아포토시스로부터의 보호의 원인일 수 있는 Bcl-x 및 myc 발현을 유발하는 것을 나타낸다. 또한, CpG 핵산은 인간세포에서 아포토시스를 차단하는 것이 발견되어 왔다. 이러한 아포토시스의 억제는 CpG DNA에 의해 면역 활성을 연장하고 증진해야 하기 때문에 중요하다.
((IL6) 쥐와 IgM분비와 B세포 증식의 유발에 대한 최적의 CpG 모티프의 확인)
최적의 B세포 자극성 CpG 모티프가 IL-6 분비를 위한 최적의 CpG 모티프와 동일한지를 평가하기 위해서, CpG 디뉴클레오티드 측면에 위치한 염기가 점진적으로 치환된 ODN 패널이 연구되었다. 이 ODN 패널은 비장 B세포와 CH12.LX 세포를 사용함으로써, B세포 증식과, Ig생산과 IL-6 분비에 대한 효과를 분석하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 최선의 자극성 모티프는 2개의 5'퓨린과 2개의 3'피리미딘이 측면에 접한 비메틸화 CpG를 포함한다. 일반적으로, 5' 퓨린의 피리미딘으로의 변이 또는 3' 피리미딘의 퓨린으로의 변이는 그 효과를 상당히 감소시켰다. 5'퓨린의 C로의 변화는 특히 해롭다. 그러나, 5' 퓨린의 T로의 변화 또는 3'피리미딘의 퓨린으로의 변화는 덜 해로운 효과를 나타냈다.
이 분석들과, 다른 ODN의 기록에 기초하여 IL-6분비의 유발을 위한 최적의 CpG 모티프는, 최적의 마이토젠(분열유발) 및 IgM 유발 CpG모티프와 동일한 TGACGTT이다(표 2). 이 모티프는 조사된 서열(1639,1707 및 1708)을 포함하는 어떠한 팰린드롬 보다 더 자극적이다.
(세균성의 DNA 또는 올리고뉴클레오티드 내에 마우스의 시토킨 분비의 유발)
실시예 9에서 설명한 바와 같이, CpG DNA 자극 후에 비장 세포에 의해 분비된 IL-6의 양은 ELISA에 의해 측정되었다. 전체 비장세포보다 T세포가 제거된 비장세포 배양물이 CpG DNA로 자극된 비장세포에 의해 생성된 IL-6에 대해 없거나 또는 약간 기여한다는 것을 보여주는 다음 예비조사를 실험관 내에서 조사하기 위해 사용하였다. 표 3에서 나타낸 바와 같이, IL-6 생성물은 송아지 흉선 DNA와 함께 배양된 세포에서가 아니라 E.coli DNA와 함께 배양된 세포에서 증가했다. 증가된 IL-6 생산물은 다른 세균성 생산물에 의하여 오염되었기 때문이 아니라는 것을 확인하기 위해서, DNA는 분석에 앞서 DNAse로 다이제스트되었다. DNAse 전처리는 E.coli DNA에 의해 유발된 IL-6 생산을 없앴다(표 3). 또한 LPS-무반응 C3H/HeJ 쥐 유래의 비장세포는 세균성 DNA에 반응하여 비슷한 수준의 IL-6을 생산했다.
E.coli DNA에 의해 유발된 IL-6분비가 세균성 DNA 내에 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드에 의해 매개된 것인지를 분석하기 위하여, 메틸화된 E. coli DNA 및 합성 ODN의 패널이 시험되었다. 표 3에서 나타내는 바와 같이, CpG ODN은 유의적으로 IL-6 분비를 유발하였고(ODN 5a, 5b, 5c), 반면 CpG 메틸화된 E.coli DNA 또는 메틸화된 CpG를 함유하거나(ODN 5f) CpG가 없는(ODN 5d) ODN은 IL-6 분비를 유발하지 않았다. CpG 디뉴클레오티드 이외의 부위 변화(ODN 5b) 또는 다른 시토신의 메틸화(ODN 5g)는 CpG ODN의 효과를 감소시키지 않았다. 3개의 CpGs를 보유한 ODN에서 단일 CPG의 메틸화는 자극의 부분적 감소로 나타났다(예를 들면, ODN 5c 내지 5e; 표 3).
Figure 111999004153182-pct00003
(세균성 DNA의 CpG 모티프 또는 올리고뉴클레오티드에 의한 쥐의 IL-6 분비의 유발)
DB A/2 쥐 유래의 T세포가 제거된 비장세포를 포스포디에스테르 변형된 올리고뉴클레오티드(O-ODN) (20uM), 효소처리가 있거나 없는 송아지 흉선 DNA(50㎍/㎖) 또는 E.coli DNA(50㎍/㎖) 또는 LPS(10㎍/㎖)로 24시간 자극하였다. 데이터는 3회 평균(pg/㎖)±SD로 나타낸다. CpG 디뉴클레오티드는 밑줄 그어져 있다. 그리고 점은 동일성을 나타낸다. Z는 5-메틸시토신을 나타낸다.
(CpG모티프는 인공적 면역보조제로 사용될 수 있다.)
면역반응의 비특이적 자극제는 보조제로서 알려져 있다. 면역보조제의 사용은 가용성 항원에 강한 항체 응답을 유발하는데 필수적이다(Harlow and Lane. Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring harbor, N.Y. Current Edition; hereby incorporated by reference). 면역보조제의 전체적인 효과는 극적이며, 그것들의 중요성은 지나치게 강조될 수 없다. 면역보조제의 작용은 사용되는 항원의 투여량을 적게하고, 더욱 지속적인 항체반응을 발생시키는 것이다. 면역반응의 비특이적 활성화는 면역반응을 얻는데 있어서 성공과 실패 사이의 차이를 가져올 수 있다. 면역보조제는 이를 피해야할 아주 특별한 이유가 없다면, 첫 번째 주입을 위해 사용되어야 한다. 대부분의 면역보조제는 두 개의 성분을 결합한다. 한 성분은 빠른 물질분해대사(예를 들면, 리포솜 또는 합성 계면활성제(Hunter et al. 1981))로부터 항원을 보호하기 위해 설계된다. 리포솜은 면역원이 바깥 지질층 안으로 결합될 때만 단지 효과적이다. 파멸된 분자들은 면역체계에 의해 보여지지 않는다. 다른 성분은 비특이적으로 면역반응을 자극하는 물질이다. 이 물질들은 림포카인의 레벨을 올리는 것에 의해 작용한다. 림포카인은 직접적으로 항원 진행세포의 활성을 자극한다. 그리고 주입부분에 국소적 염증 반응을 일으킨다. 초기의 연구는 열-사균 박테리아(Diene 1936) 또는 리포다당체(LPS)(Johnson et al. 1956)에 완전히 의존하였다. LPS는 상당한 독성이다. 그리고 그 구조적 성분의 분석을 통해, 면역보조제로서의 특성의 대부분은 지질 A로서 알려진 부분 안에 있는 것으로 나타났다. 지질 A는 LPS 보다 훨씬 더 적은 독성이 있는 수많은 합성형태와 자연형태로 이용가능하면서도, 모계인 LPS분자의 보다 우수한 보조제 특성을 대부분 유지한다. 지질 A 화합물은 종종 리포솜을 이용하여 송달된다.
최근 더욱 수용가능한 부작용의 보조제를 발견하기 위한 강력한 시도에 의해, 새로운 합성 보조제가 생산되었다. 본 발명은, CpG함유 핵산을 포함하는 보조제인 서열 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:10)를 제공한다. 이 서열은 강한 면역 활성화 서열이며, 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant)를 능가할 만한 효능을 보유하고, 확실히 독성이 없는 우수한 보조제이다.
(CpG 모티프에 의한 쥐의 IL-6 분비 유발의 적정)
세균성 DNA와 CpG ODN은 용량 의존방식으로 T세포 제거된 쥐 비장세포의 IL-6 생산을 유발한다. 그러나 척추동물 DNA와 non-CpG ODN은 그렇지 않다.(도 1) IL-6 생산은 대략 세균성 DNA 50μg/ml 또는 CpG O-ODN 40μM에서 안정수준에 이른다. 세균성 DNA와 CpG ODN에 의해 유발된 IL-6의 최고 수준은 각각 1-1.5mg/ml와 2-4ng/ml이다. 이 레벨은 LPS(0.35ng/ml)에 의한 자극 후에 보여진 것 보다 상당히 크다(도 1A). 뉴클리아제 저항성 DNA 골격을 갖는 CpG ODN이 또한 IL-6 생산을 유발하는 지를 평가하기 위해서, S-ODN을 T세포를 제거한 쥐 비장 세포에 첨가하였다. CpG S-ODN은 또한 non-CpG S-ODN이 IL-6를 유발하는데 실패하는 것에 비하여 CpG O-ODN처럼 거의 똑같은 레벨의 용량 의존성 방식으로 IL-6 생산을 유발했다(도 1C). 0.05μM의 농도에서 CpG-S-ODN은 이들 세포 내에서 최대의 IL-6 생산을 유발할 수 있었다. 이 결과는 뉴클레아제 저항성 DNA 골격 변형은 IL-6 분비를 유발하는 CpG S-ODN의 서열 특이적 능력을 유지하며, CpG S-ODN은 CpG-O-ODN 보다 80배 더 강력하다는 것을 나타낸다.
(생체 내에서 CpG DNA에 의한 쥐 IL-6 분비의 유발)
생체 내에서 IL-6 분비를 유발하는 세균성 DNA와 CpG S-ODN의 능력을 평가하기 위해, BALB/c 쥐에, E. coli DNA, 소흉선 DNA 또는 CpG 또는 무자극 S-ODN 10㎍을 iv로 주입하였다. 그리고 자극 후 2시간 후 혈액을 채취하였다. E. coli DNA를 주입한 군의 혈청 내 IL-6의 수준은, 소흉선 DNA 또는 PBS를 주입한 군의 혈청 내에서 IL-6이 발견되지 않은 반면, 대략 13μg/ml이다.(표 4) CpG S-ODN은 또한 생체 내에 IL-6 분비를 유발했다. CpG-ODN을 주입한 군의 혈청 내 IL-6 레벨은 대략 20ng/ml이었다. 반대로, IL-6은 무자극 S-ODN 주입 군의 혈청 내에서는 발견되지 않았다(표 4).
Figure 111999004153182-pct00004
(생체 내에서 CpG DNA 자극에 의해 유발된 쥐 IL-6의 분비)
(생체 내 CpG 모티프에 의한 자극 후 쥐 IL-6 분비의 동력학)
생체 내에 CpG DNA에 의한 IL-6 분비의 유발에 대한 동력학을 평가하기 위해서, BALB/c 쥐에 CpG 또는 대조군 non-CpG S-ODN을 정맥주사(iv)로 주입하였다. 혈청 IL-6 수준은 1시간 안에 상당히 증가되었다. 그리고 CpG S-ODN 주입 군에서 대략 9μg/ml의 수준으로 2시간에 절정을 이루었다.(도 2) 혈청 내에 IL-6 단백질은 4시간 후 급격히 감소했다. 그리고, 자극 후 12시간에는 기본 레벨로 돌아왔다. CpG DNA 군과 대조적으로, 무자극 S-ODN 또는 PBS 주입 군에서는 혈청 내에서 어떠한 유의적 IL-6의 증가도 관찰되지 않았다.(도 2)
(생체 내에 CpG 모티프에 의해 유발된 IL-6 mRNA 발현의 동역학과 조직 분배)
도 2에서 도시한 바와 같이, 혈청 IL-6의 수준은 CpG DNA 자극 후 빨리 증가했다. 이 혈청 IL-6의 가능한 조직기원과 CpF DNA 자극 후에 생체 내에 IL-6 유전자 발현의 동력학을 연구하기 위하여, BALB/C 쥐에 CpG 또는 non-CpG S-ODN을 iv로 주입하였다. 그리고 RNA는 자극 후 여러 시점에, 골수와 흉선, 비장, 간장으로부터 추출되었다. 도 3A에서 나타내는 바와 같이, 간장, 비장, 흉선 안에 IL-6 mRNA 의 레벨은 CpG-S-ODN 주입 후 30분 안에 증가되었다. 간장 IL-6 mRNA는 주입 후 2시간에 절정을 이루었다. 그리고 빠르게 줄어들었다. 그리고 자극 후 8시간에는 기본 레벨에 도달했다(도 3A).
비장 IL-6 mRNA는 자극후 2시간에 절정을 이루었다. 그리고 나서 점차적으로 감소했다(도 3A). 흉선 IL-6 mRNA는 1시간 후 주입에 절정을 이루었다. 그리고 나서 점차적으로 감소했다(도 3A). IL-6 mRNA는 CpG S-ODN 주입 후 1시간 안에 골수에서 상당히 증가되었다. 그리고 나서 기본 레벨로 돌아왔다. CpG S-ODN에 대한 응답에 있어서 간장과 비장 및 흉선은 골수보다 IL-6 mRNA 발현에 있어서 실질적인 증가를 보였다.
(CpG DNA에 의해 유발된 쥐의 시토신 발현의 패턴)
생체 내 또는 전체 비장세포 내에서는, 다음의 인터류킨 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 또는 IL-10의 단백질 레벨의 증가가 6시간 내에는 나타나지 않았다(Klinman, D.M. et al.,(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2879-2883). 그러나 TNT-α의 레벨은 30분 내에 증가되었다. 그리고 IL-6의 레벨은 CpG ODN과 함께 주입한 쥐 혈청 안에서 2시간 내에 현저하게 증가하였다. 비장세포에 의한 γ인터페론(IFN-γ) mRNA와 IL-12의 증가된 발현은 처음 2시간 내에 관찰되었다.
Figure 111999004153182-pct00005
(CpG 올리고스(oligos)에 의한 인간 PBMC 시토킨 분비의 유발)
점들은 동일성을 나타낸다; CpG 디뉴클레오티드는 밑줄 그어졌고, R&D 시스템(pg/ml)로부터 퀀티카인 키트(Quantikine kits)를 사용하는 ELISA에 의해 측정되며, 세포는 상청액 회수와 분석 이전에 다른 시토킨에 대해 24시간 또는 THF-α의 경우에는 4시간 동안 지시된 올리고디옥시뉴클레오티드(12㎍/ml)로 10%의 자기혈청(autologous serum)에서 배양하였다. 데이터는, 올리고디옥시뉴클레오티드가 첨가되지 않는 상기한 배양액에서 시토킨의 레벨로서 나타낸다.
(CpG DNA는 인간 PBMC, 특히 단핵세포에 의해 시토킨 분비를 유도한다)
쥐의 시토킨 발현을 연구하기 위해 사용된 ODN의 동일한 패널이, 인간 세포 또한 CpG모티프에 의해 유발되어 시토킨을 발현(또는 증식)시키는지 결정하고, CpG모티프가 관여하는지 확인하기 위해 사용된다. 올리고뉴클레오티드 1619(GTCGTT)는 TNF-α 및 IFN-γ분비의 가장 우수한 유도인자이고, 거의 동일한 올리고뉴클레오티드 1634(GTCGCT)에 의해 밀접하게 뒤따른다(표 5). 올리고데옥시뉴클레오티드 1637 및 1614(GCCGGT 및 GACGGT)에서의 모티프는 강또 다른 시토킨의 비교적 소량의 유도로 강한 IL-6를 분비하게 한다. 따라서, 인간의 림프구가 쥐의 림프구처럼, 주위의 염기에 따른 CpG디뉴클레오티드에 다르게 반응하여 시토킨을 분비한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 쥐 세포를 가장 자극하는 모티프는 인간 세포에서 가장 효과적인 것과는 다르다. 어떤 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 인간세포를 활성화시키기에는 부족하다(팰린드롬 형성 서열 GACGTC 및 CACGTG을 각각 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드 1707, 1708).
시토킨 분비는, 선택적으로 단핵세포에 독성(그러나 T림프구 및 NK세포에는 독성)이 있고, B세포 Ig분비에 영향을 미치지 않는 L-루실-L-루신 메틸에스테르(L-LME)를 세포에 처리함으로써 없어지기 때문에, DNA에 반응하는 세포는 단핵세포로 나타난다(표 6). L-LME 처리에 생존한 세포는 트리판블루 배제에 의해 95% 이상 생존율을 나타내며, 이는 이들 세포 중의 시토킨 반응 부족이 단순히 모든세포 타입의 비특이적 사멸을 반영하는 것이 아님을 나타낸다. E. coli(EC) DNA에 반응하는 시토킨 분비는 EC DNA(표6의 맨 아랫줄 다음)의 메틸화에 의해 없어지기 때문에, 비메틸화된 CpG모티프가 요구된다. 오염도가 천연 및 메틸화된 DNA와 동일하고, 오염 LPS의 가장 많은 양의 두배의 첨가가 효과가 없기(도면에 나타나지 않음) 때문에, DNA의 LPS 오염은 결과를 설명할 수 없다.
Figure 111999004153182-pct00006
(CpG DNA는 인간의 PBMC에 의한 시토킨 분비를 유도)
1모든 시토킨의 레벨은 상기 표에서 기재한 바와 같은 R&D시스템으로부터 퀀티킨 고양이를 사용한 ELISA에 의해 결정된다. 결과는 다른 공여체로부터의 PBMC를 사용하여 나타낸다.
2세포를 15분 동안 L-루실-루신 메틸에스테르(M-LME)로 미리 처리하여, 이 상태하에서의 시토킨 생성물이 단핵세포(또는 다른 L-LME-민감성 세포)로부터 된 것인지를 결정한다.
3EC DNA는 제조자의 지시에 따라서 CpG메틸라아제의 2U/㎍ DNA를 사용하여 메틸화되고, 메틸화는 Hpa-Ⅱ 및 Msp-I로 소화(digestion)함으로써 확인되었다. 음성 대조군으로서, 이들 실험적 조건 하에서 탐지 가능한 시토킨 생산을 유도하지 못하는 EC DNA의 가장 높은 농도에 포함된 LPS 최대량의 두배를 포함하도록 샘플을 함유시켰다.
ND=행해지지 않음(not done).
L-LME로 처리된 PBMC에서 시토킨 생성의 손실은, 단핵세포가 CpG DNA에 반응하는 시토킨 생성의 원인이 될 수 있음을 제시하였다. 이 가설을 더욱 구체적으로 실험하기 위해. 고순도의 인간 단핵세포 및 대식세포에서의 CpG DNA의 효과가 실험되었다. 가설대로, CpG DNA는 인간의 대식세포에 의한 시토킨 IL-6, GM-CSF 및 TNF-α의 생성을 직접적으로 활성화하는 데 비하여, 비-CpG DNA는 활성는 그렇지 않았다(표 7).
IL-6(pg/㎖) GM-CSF(pg/㎖) TNF-α(pg/㎖)
세포단독 0 0 0
CT DNA (50㎍/㎖) 0 0 0
EC DNA (50㎍/㎖) 2000 15.6 1000
(CpG DNA가 정제된 인간 대식세포에서 시토킨 발현을 유도)
(CpG모티프에 반응하여 쥐의 IgM 생성을 유도하는 IL-6의 생물학적인 역할)
상술한 동력학적인 연구는 IL-6 분비 유도가 CpG자극 1시간 후 이내에 일어나고, IgM분비를 진행시킨다는 것을 밝혔다. IL-6의 분비를 유도하는 ODN에 대한 최적 CpG모티프는 IgM(표 2)에 대한 것과 동일하기 때문에, CpG모티프가 독립적으로 IgM 및 IL-6생성을 유도하는지 또는 IgM생성이 전(prior) IL-6분비에 의존적인지를 연구하였다. 중화하는 안티-IL-6항체의 첨가는 농도의존적으로 CpG ODN에 의해 매개되는 시험관 내 IgM 생성을 저해하였으나, 대조군 항체는 그렇지 않았다(도 4A). 반대로, 안티-IL-6 첨가는 염기성 단계나 CpG-유도 B세포 증식 중 하나에 영향을 미치지 않았다(도 4B).
(CpG DNA에 반응하여 IL-6프로모터의 증가된 전사활성)
IL-6 mRNA의 증가된 레벨 및 CpG DNA자극 후의 단백질은 전사 또는 전사후 조절에 기인한다. CpG DNA에 반응하여 IL-6를 생성하는 CpG ODN, 쥐의 B세포주, WEHI-231로 배양된 B세포에서 IL-6프로모터의 전사활성이 상향조정되는지를 결정하기 위해서, IL-6프로모터-CAT 구조로 주입(transfect)된다(pIL-6/CAT(Pottratz, S.T. 등, 17B-에스트라디올)는 수용체 의존 메카니즘에 의해 인간의 인터루킨-6-프로모터-수용체 구조의 발현을 저해한다. J.Clin.Invest.93:944). CAT분석은 다양한 농도의 CpG 또는 비CpG ODN으로 자극 후 실시된다. 도5에서 나타는 바와 같이, CpG ODN은, 비-CpG ODN이 CAT활성을 유발하지 못하는 것에 비하여, 용량의존적으로 증가된 CAT활성을 유발했다. 이것은 CpG가 IL-6프로모터의 전사활성을 유발한다는 것을 확인시켜 준다.
(5' 및 3' 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합의 수에서 CpG ODN에 의한 B세포 활성의 의존성)
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ODN 골격의 부분적인 황 변형이 B세포 활성을 증진시키기에 충분한지 결정하기 위해, 5' 및 3' 말단에서의 S 인터뉴클레오티드 결합의 수가 다른 일련의 ODN의 효과를 실험하였다. ODN 핵산분해효소 분해의 종래의 연구에 기초하여, ODN의 5'말단에서의 적어도 두개의 포스포로티오에이트 결합은 세포내 엑소- 및 엔도- 핵산분해효소에 의한 분해로부터 ODN의 적당한 보호를 제공하도록 요구되어진다. 두개의 5'포스포로티오에이트 변형 결합 및 여러 개의 3'변형 결합을 함유하는 키메라 ODN만이 조사된다.
이들 ODN의 림프구 자극 효과는 처리된 비장세포 배지에서 세가지의 농도(3.3, 10 및 30μM)로 RNA합성(3H우리딘 결합에 의해) 또는 DNA합성(3H티미딘 결합에 의해)의 전단계를 측정함으로서 실험하였다(실시예 10). CpG 모티프 함유 O-ODN은 최소 10μM 농도 이상 첨가되지 않으면 비장세포 자극을 유발하지 않았다(실시예 10). 그러나, 이 서열이 5'말단에서 두개의 S결합과 3'말단에서 적어도 세개의 S결합으로 변형될 경우, 심한 자극이 3.3μM의 농도로 나타났다. 이러한 저 농도에서, 3'변형된 염기의 수가 증가함에 따라 자극은 점차적으로 증가를 나타내고, 자극지수가 감소되기 시작하는 자극 지표점에 도달되거나 6을 초과할 때까지 증가되었다. 일반적으로, 비장세포 자극을 위한 3' S결합의 적정수는 5이다. 이들 실험에서 실시된 모든 세개의 농도에서, S-ODN은 최적의 키메라 화합물(chimeric compound)보다 덜 자극적이다.
(골격변형의 타입에서 CpG-매개된 림프구 활성 의존성)
포스포로티오에이트 변형된 ODN(S-ODN)은 포스포디에스테르 변형된 ODN(O-ODN)보다 더 핵산분해효소(nuclease) 저항성이 있다. 따라서, O-ODN과 비교하여 S-ODN 및 S-O-ODN(즉, 중심결합이 포스포디에스테르지만, 두개의 5' 및 3'결합이 변형된 포스포로티오에이트인 키메라 포스포로티오에이트 ODN)에 의해 증가된 면역자극은 S-ODN 및 S-O-ODN의 핵산분해효소 저항성으로부터 생긴다. CpG ODN에 의한 면역자극의 ODN핵산분해효소 저항성 역할을 결정하기 위해서, 5'와 3' 말단이 메틸포스포네이트(MP-), 메틸포스포로티오에이트(MPS-), 포스포로티오에이트(S-) 또는 포스포로디티오에이트(S2-) 인터뉴클레오티드 결합 중 어느 하나를 가지는 핵산분해효소 저항성을 가지기 쉬운 키메라 ODN의 자극 효과가 실험되었다(실시예 10). 이들 연구는 그들의 핵산분해효소 저항에도 MP-O-ODN이 실질적으로 O-ODN보다 덜 면역자극이 있다는 것을 나타내었다. 그러나, 다리결합되지 않은(nonbridging) O분자를 둘다 5' 및 3' MPS인터뉴클레오티드 결합으로 치환시킴으로써 MP와 S변형을 결합하는 것은 O-ODN에 의해 유발된 것보다 조금 더 높은 단계로 면역자극을 복귀시켰다.
S-O-ODN은 적어도 3.3μM농도에서 O-ODN보다 더 자극적이고, S-ODN보다도 더 자극적이다. 3μM 이하의 농도에서, 3M 서열을 가지는 S-ODN은 대응하는 S-O-ODN보다 더 효능이 있고, 3D 서열을 갖는 S-ODN은 대응하는 S-O-ODN보다 효능이 더 적다(실시예 10). 이들 두개 서열의 자극 CpG모티프를 비교하면, CpG가 두개의 5'퓨린과 두개의 3'피리미딘의 측면에 위치한 점에서, 3D 서열은 자극 모티프를 위한 완벽한 매치임을 알 수 있다. 그러나, ODN 3D에서 CpG의 바로 측면에 접하는 염기는 최적이 아니다; 이는 5'피리미딘과 3'퓨린을 갖는다. 더욱 더 실험을 행한 것에 기초하여, 면역자극을 위한 서열 요구는 S-O- 또는 O-ODN에 대해서보다 S-ODN에 대해서 더 엄격하다는 것을 발견하였다. 최적 CpG모티프에 대해 부족한 매치를 갖는 S-ODN은 림프구 활성이 거의 없거나 전혀 없다(예를 들면, 서열 3D). 그러나, CpG의 측면에 바로 접하는 위치에서 모티프에 대해 양호한 결합을 가지는 S-ODN은, 더 높은 농도에서는 S-O-ODN으로부터의 피크효과가 더 크긴 하지만, 대응하는 S-O-ODN보다 더 효능이 있다(실시예 10).
S2-O-ODN은 현저하게 자극적이고, 모든 실험된 농도에서 대응하는 S-ODN 또는 S-O-ODN보다도 실질적으로 더 큰 림프구 활성을 일으켰다.
S 또는 S2를 함유하는 CpG ODN에서 나타나는 증가된 B세포 자극은 하기 효과의 전체 또는 일부로부터 나온 결과이다: 핵산분해효소 저항성, 증가된 세포의 흡수, 증가된 단백질 결합, 및 변화된 세포 내 위치. 그러나, MP-O-ODN이 CpG모티프를 가지는 O-ODN보다 실질적으로 덜 자극적이기 때문에, 핵산분해효소 저항성을 단순 설명할 수 없다. 종래의 연구는 림프구에 의한 ODN흡수가 골격 화학(자오 등 (1993)), 안티센스 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 혼합된 포스포로티오에이트 및 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드류의 세포결합 및 흡수의 비교)에 의해 매우 영향을 받는다는 것을 보여주었다(안티센스 조사 및 개발 3,55-66; 자오 등(1994) 위치 특이적인 골수 B세포 전구체에서의 올리고뉴클레오티드 흡수. Blood 84, 3660-3666). 가장 높은 세포막 결합 및 흡수는 S-ODN이고, 뒤이어 S-O-ODN, O-ODN 및 MP-ODN으로 나타났다. 이러한 흡수의 차이는 면역자극의 정도와 관련이 있다.
(올리고(Oligos)를 함유하는 비메틸화된 CpG는 NK세포 자극 활성을 가진다)
실험을 행하여, 올리고뉴클레오티드를 함유하는 CpG가 B세포에 첨가로 자연킬러세포(NK)의 활성을 자극하는 지를 결정한다. 표8에서 나타낸 바와 같이, CpG ODN 1 및 3Dd로 배양된 비장세포 사이의 NK세포 활성이 두드러지게 유발되는 것이 관찰되었다. 반대로, 비-CpG 대조군 ODN으로 처리된 경우 효과의 유도는 비교적 없었다.
% YAC-1 특이적 용해* 효과기: 표적 % 2C11 특이적 용해 효과기:표적
ODN 50:1 100:1 50:1 100:1
없음 -1.1 -1.4 15.3 16.6
1 16.1 24.5 38.7 47.2
3Dd 17.1 27.0 37.0 40.0
비-CpG ODN -1.6 -1.7 14.8 15.4
(CpG올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)에 의한 NK활성 유도)
(비-CpG DNA에 의해서가 아닌, CpG모티프를 함유하는 DNA에 의한 NK세포 활성의 유도)
박테리아 DNA는 18시간 동안 37℃에서 배양하고, B세포가 소모된 쥐의 비장세포와 인간의 PBMC 둘다의 NK분해활성을 유도한 K562(인간) 또는 Yac-1(쥐)의 표적세포를 죽이기 위해 배열되지만, 척추동물 DNA는 그렇지 않다(표 9). 박테리아 DNA의 자극 활성이 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 증가된 레벨의 결과인지를 결정하기 위해, 비메틸화, 메틸화 또는 CpG가 없는 디뉴클레오티드를 함유하는 50개 이상의 합성 ODN의 활성특성이 실험되었다. 표9에서 요약된 결과는 합성 ODN이 적어도 하나의 비메틸화된 CpG디뉴클레오티드를 함유하는 한, 유의적으로 NK활성을 자극할 수 있음을 나타낸다. 두개의 5'퓨린 또는 5'GpT 디뉴클레오티드와 두개의 3'피리미딘이 CpG의 측면에 위치한 ODN으로 최적 자극이 일반적으로 나타났다는 예고기재(caveat)와 함께, 팰린드롬(팰린드롬 AACGTT를 포함하는 ODN 1585와 같은) 내에 CpG가 있는 ODN의 자극효과에 있어서 팰린드롬이 없는 ODN(1613 또는 1619와 같은)과 차이가 없음이 관찰되었다. 속도론적 실험은 ODN의 첨가 후 NK활성이 약 18시간에 최고점에 달한다는 것을 증명하였다. 데이터는 쥐의 NK반응이 IL-12, TNF-α 및 IFN-α/b를 생성하도록 하는 CpG DNA에 의한 단핵세포의 전(prior) 활성에 의존한다는 것을 나타낸다(실시예 11).
Figure 111999004153182-pct00007
ODN서열에서의 CpG 디뉴클레오티드는 밑줄로 나타내고; Z는 메틸시토신을 가리킨다. 소문자는 핵산분해효소 저항성 포스포로티오에이트 변형된 인터뉴클레오티드 변형된 결합을 나타내며, 이는 적정실험에서 인접한 염기에 따라 비 변형된 ODN에 비해 20배 이상 효능이 있었다. 폴리 G 말단(g)은 ODN흡수 레벨을 매우 증가시키기 때문에, 일부 ODN에 사용되었다.
이러한 모든 연구로부터, CpG DNA 면역효과에 대한 더욱 완전한 이해가 달성되며, 이를 도6에 요약하였다.
CpG모티프에 의한 면역활성은 CpG와 인접하는 염기에 따르고, CpG의 수와 공간은 ODN 내에 존재한다. 이상적인 염기 환경에서의 단일 CpG가 매우 강하고 유용한 면역 활성인자가 될 수 있더라도, 적당한 공간과 인접하는 염기를 갖는 몇개의 CpG를 함유하는 ODN으로 보다 높은 효과를 나타낼 수 있다. 쥐 B세포의 활성을 위한 최적 CpG모티프는 TGACGTT이다.
후술하는 연구는 CpG디뉴클레오티드의 수, 공간, 인접하는 염기를 변화시키는 효과를 실험함으로써 인간의 자극을 위한 최적 ODN서열을 확인하도록 수행된다.
(인간 NK세포 활성을 위한 최적 CpG모티프를 가지는 포스포로티오에이트 ODN의 확인)
임상적 유용성을 가지기 위해, ODN은 핵산분해효소 분해에 대해서 ODN을 보호하는 형태로 객체에 투여된다. 포스포디에스테르 ODN으로 이를 달성하는 `방법은 학술적으로 잘 알려져 있고, 지질의 캡슐화 또는 나노입자 등의 운반시스템을 포함한다. 이 보호는 인터뉴클레오티드 결합이 핵산분해효소 저항성이 있는 것을 포함하는 변형된 DNA골격과 같은 DNA에 화학적 치환을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일부 변형은 증가된 세포 흡수 등의 부가적인 바람직한 특성을 부여한다. 예를 들면, 포스포디에스테르 결합은 포스포로티오에이트 DNA를 구성하는 황으로 비다리(nonbridge)결합된 산소원자 중 하나를 치환함으로써 변형될 수 있다. 포스포로티오에이트 ODN은 CpG 모티프를 가질 경우 개선된 세포흡수를 가지고(Krieg et al., Antisense Res. Dev. 6:133, 1996.), B세포 자극을 늘린다. NK활성이 생체 내에서의 보조효과와 매우 연관성을 가지기 때문에, 인간의 NK세포를 활성화시킬 포스포로티오에이트의 확인이 매우 중요하다.
인간의 NK활성(표 10)에서 다양한 염기성 환경의 CpG디뉴클레오티드를 함유하는 서로다른 포스포로티오에이트 ODN의 효과를 관찰하였다. TGTCGTT모티프의 2사본을 함유하는 ODN 1840이 두드러진 NK활성을 가진다(표 10). NK활성에 대해서 최적인 첨가 ODN을 더 확인하기 위해, 다른 수와 공간의 CpG모티프를 포함하는 대략 100 ODN이 대조군으로서 제공된 ODN 1982와 함께 실험되었다. 결과를 표11에 나타내었다.
효과적인 ODN은 5'말단에서 TC 또는 TG로 시작되었는데, 이는 강제적인 것은 아니었다. 내부 CpG모티프를 가지는 ODN(예를 들면, ODN 1840)은 일반적으로 GTCGCT모티프가 즉시 5'TC(예를 들면, ODN 1967 및 1968)를 따르는 것보다 덜 효과적인 자극물질이다. 그의 3'반에서 두번째의 GTCGTT 모티프를 갖는 ODN 1968은 이러한 두번째 모티프가 없는 ODN 1967보다 일관되게 더 자극적이다. 그러나. ODN 1967은 실험1과 3의 ODN 1968보다 조금 더 효력이 있지만, 실험 2에서는 그렇지 않다. 세번째의 GTCCGTT모티프를 가지는 ODN 2005는 1968보다 평균에서 조금 더 높은 NK활성을 유발하였다. 그러나, GTCGTT모티프 사이의 공간이 각 모티프 사이의 두개의 T 첨가에 의해 증가되는 ODN 2006은 모티프 중 단지 하나가 두개의 T 공간의 첨가를 가지는 ODN 2005와 ODN 2007보다 더 우수하다. CpG 모티프 사이의 최소 수용 공간은 ODN이 3'말단(예를 들면, ODN 2015)에서 두개의 피리미딘(바람직하게 T)을 가지는 한개의 뉴클레오티드이다. 놀랍게도, 5'T와 두개의 GTCGTT 모티프 말단에서 말단을 이어 결합시키는 것은 강한 NK활성 유발을 이끌었다(예를 들면, ODN 2016). 아데닌(A)이 그의 CpG(예를 들면, CGACGTT)를 분리시킨다는 사실에도 불구하고 ODN 2002가 적당한 NK활성을 유발하기 때문에, 연속적인 CpG디뉴클레오티드를 분리시키는 티민(T)의 선택이 절대적인 것은 아니다. 이는 CpG가 없는 ODN(예를 들면, ODN 1982), 연속된 CpG 또는 나쁜 서열환경(예를 들면, ODN 2010)의 CpG를 포함하는 ODN이 NK활성에 촉진효과가 없다는 것을 나타내는 것이다.
Figure 111999004153182-pct00008
1용균단위는(LU) 종래 공지된 방법에 따라 측정되었다. 간단하게, PBMC를 보통의 제공자(donor)로부터 모아서, Ficoll 위에서 회전시키고, 표지된 ODN을 첨가하고 또는 ODN을 첨가하지 않고 24시간 동안 배양하였다(6㎍/㎖의 배지에 첨가). 그런 다음, 51Cr-표지된 K562세포를 용균시키는 그들의 활성을 측정하였다. 나타난 결과는 몇몇의 서로다른 보통의 인간 제공자(donor)에서 얻어진 것을 대표한다. 이 2올리고 혼합물은 각각의 위치에서 모든 4개의 염기의 임의의 선택을 포함하였다.
Figure 111999004153182-pct00009
1PBMC는 필수적으로 여기에 기재한 바와 같음(PBMC essentially as described herein). 결과는 6개의 각각의 실험을 대표한다; 각각의 실험은 다른 제공자(donor)를 나타낸다. 2이것은 ODN 1840의 메틸화된 형이고; Z=5-메틸시토신 LU는 용균단위이고; ND는 행해지지 않은 것이고(not done); CpG디뉴클레오티드는 명확하게 하기 위해 밑줄을 쳤다.
(인간 B세포 증식의 활성을 위한 최적 CpG모티프를 가지는 포스포로티오에이트 ODN의 확인)
B세포 증식을 유발하기 위한 CpG ODN의 활성은 그 보조제(adjuvant) 퍼텐셜의 유효한 지표이다. 또한, 강한 보조제 효과를 갖는 ODN은 일반적으로 B세포 증식을 유발한다. B세포 증식을 유발하기 위한 최적 CpG ODN이 NK세포 활성을 유발하기 위한 것과 동일한 지를 결정하기 위해, ODN과 동일한 패널(표12)을 실험하였다. 가장 일관된 자극이 ODN 2006(표 12)으로 나타났다.
Figure 111999004153182-pct00010
(포스포로티오에이트 CpG ODN에 의한 인간 B세포 증식의 유발)
1세포=외과적 추출 후 -70℃에서 저장된 인간의 비장세포 또는 일반 제공자(donor)로부터 수집된 PBMC를 Ficoll 위에서 회전시켰다. 세포를 표지된 ODN(6㎕에서 배양하기 위해 첨가)를 갖거나 갖지 않는 96웰(well) U-보텀 마이크로티터 플레이트에서 배양하였다. N=12실험. 세포를 4 내지 7일 동안 배양하고, 회수 및 신틸레이션 카운팅 전에 18 시간 동안 3H 티미딘 1μCi 으로 펄스를 발생시켰다. 자극지표= 표지된 ODN으로 전 배양기간 동안 자극된 웰(배양이 실시된 후 ODN의 첨가는 더이상 없음)에 대한 ODN이 없는 웰에서의 cpm의 비율. ND=행해지지 않음.
(인간의 IL-12분비를 유도하는 포스포로티오에이트 ODN의 확인)
IL-12분비를 유발하는 CpG ODN의 활성은, 특히 IL-12에 매우 의존적인 Th1면역반응을 유발하는 그 활성의 관점에서, 그 보조제 포텐셜의 좋은 지표이다. 따라서, 인간의 PBMC로부터 IL-12분비를 유발하는 포스포로티오에이트 ODN 패널의 활성(표13)을 시험관 내에서 측정하였다. 이들 실험은 몇몇 인간의 PBMC에서, 대부분의 CpG ODN이 IL-12분비(예를 들면 실험 1)를 유발할 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나, 또 다른 제공자는 몇몇 CpG ODN에만 반응하였다(예를 들면, 실험 2).
ODN 2006은 대부분의 객체로부터의 IL-12분비의 일관된 유도제였다(표 13).
Figure 111999004153182-pct00011
1PBMC를 일반 공여자로부터 모아서 Ficoll 위에서 회전시켰고, 6㎕/㎖에서 배양물에 첨가된 표지된 ODN을 갖거나 갖지 않는 96웰 U-보텀 마이크로티터 플레이트에서 106세포/웰에서 배양하였다. 상청액을 24시간에 수집하고, ELISA 방법에 의해 IL-12레벨을 실험하였다. 다른 공여자를 나타내는 각각의 실험에서 표준 커브를 나타내었다.
(B세포 및 단핵세포/NK세포-특이적 올리고뉴클레오티드의 확인)
도 6에서 나타낸 바와 같이, CpG DNA는 직접적으로 매우 정제된 B세포 및 단핵세포를 활성화시킬 수 있다. CpG DNA는 이들 세포 타입을 활성화시키는 메카니즘에 있어서 많은 유사한 점을 가진다. 예를 들면, 둘 다는 하기에 설명하는 바와 같은 NFkB 활성이 요구된다.
CpG DNA의 다른 면역 효과의 연구에서, 한가지 타입 이상의 CpG모티프가 있음을 발견하였다. 구체적으로, 가장 우수한 쥐의 B세포 모티프를 가지는 올리고 1668은 B세포와 자연킬러(NK)세포 활성 둘다의 강한 유도제이고, 올리고 1758은 약한 B세포 활성제이나, 여전히 우수한 NK반응을 유도한다(표 14).
Figure 111999004153182-pct00012
(포스포로티오에이트 CpG ODN에 의한 인간 IL-12분비 유도)
CpG디뉴클레오티드는 밑줄을 그었고; 올리고뉴클레오티드는 골격을 변형시킨 포스포로티오에이트로 합성하여 그 핵산분해효소 저항성을 향상시켰다. 배양 48시간 후 실시예 1에서 기재된 바와 같이 200nM 농도에서 올리고데옥시뉴클레오티드로 H 티미딘 결합(H thymidine incorporation)에 의해 측정됨. 용균단위(lytic units)로 측정됨.
(면역자극 핵산의 목적론적인 기초)
척추동물 DNA는 대개 메틸화되고 CpG디뉴클레오티드는 적게 나타난다. 자극 CpG모티프는 미생물의 게놈 DNA에서 일반적이지만, 척추동물 DNA에서는 매우 드물다. 첨가로, 박테리아의 DNA는 B세포 증식과 면역글로불린(Ig)생산을 유도하고, 포유류 DNA는 그렇지 않다고 보고되었다.(Messina, J.P. et al., J. Immunol. 147: 1759(1991)). CpG 메틸라아제를 가지는 박테리아 DNA의 메틸화가 유사분열성(mitogenicity)을 없애는 것으로 나타난 실시예 3에 기재된 실험은, CpG 상태의 차이가 박테리아 DNA에 의한 B세포 자극의 원인임을 나타낸다. 이 데이터는 다음 결론을 뒷받침한다: 박테리아 DNA 내에 존재하는 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드가 박테리아 DNA의 자극 효과의 원인이 되는 것이다.
목적론적으로, CpG 모티프에 의한 림프구 활성이 숙주 DNA로부터 박테리아를 구별할 수 있는 면역 방어 메카니즘을 나타낸다. 세포자살(세포사)로 인해 많은 해부학적 영역 및 염증부위에 존재하는 숙주 DNA는 일반적으로 CpG 억제(suppression) 및 메틸화에 기인한 림프구 활성이 거의 없거나 전혀 없도록 유도한다. 그러나, 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 박테리아 DNA의 존재는 감염된 해부학적 영역에서 정확하게 림프구 활성을 일으킬 수 있다. 이러한 새로운 활성경로는 T세포 의존적인 항원 특이적 B세포 활성에 빠른 대안을 제공한다. CpG 경로는 항원 수용체를 통한 B세포 활성과 함께 상승작용을 하기 때문에, 박테리아 항원에 특이적인 항원 수용체를 함유하는 B세포는 세포막 Ig를 통한 하나의 활성신호 및 박테리아 DNA로부터의 두번째 신호를 받아서, 우선적으로 활성화된다. B세포 활성의 또 다른 경로와 이 경로와의 상호관계는 항원특이적 반응을 유도하는 다클론성 항원을 적용하는 생리적인 메카니즘을 제공한다.
그러나, B세포 활성은 전체적으로 비특이적이지 않게 될 수 있다. 박테리아 생성물에 대해 특이적인 항원 수용체를 함유하는 B세포는 세포막 Ig를 통해 하나의 활성신호 및 박테리아 DNA로부터의 두번째를 받을 수 있으므로, 더욱 활발하게 항원특이적 면역반응을 일으키게 된다. 또 다른 면역 방어 메카니즘으로서. 박테리아 DNA에 대한 반응은 몇몇 세팅에서 바람직하지 못한 결과를 가질 수 있다. 예를 들면, 자기항원이 박테리아 DNA에 의해 유발된 자기반응성 B세포에도 두번째의 활성신호를 제공할 수 있기 때문에, 자기항원에 대한 자가면역반응 또한 박테리아 감염에 의해 우선적으로 일어나기 쉽다. 더욱이, 박테리아 감염에 의한 자가면역의 유도는 일반적인 임상적 현상이다. 예를 들면, 자가면역병 전신 홍반성 루프스는[(ⅰ) 안티-DNA 항체의 생성을 특징으로 하고, (ⅱ) DNA 메틸트랜스페라제를 저해하는 약에 의해 유도되고(Cornacchia, E.J. et al., Clin. Invest. 92:38(1993)), (ⅲ) 감소된 DNA 메틸화와 관련된(Richardson B., L. et al.,Arth. Rheum 35:647(1992))], 항원 수용체에 대한 박테리아 DNA의 결합에 의해서 뿐만 아니라, CpG모티프에 의해서 제공된 자극 신호를 통한 DNA 특이적 B세포의 활성화에 의해서 유발되기 쉽다.
더욱이, 면역 시스템의 집중적이고 비특이적인 활성으로 인한 높은 사망률과 치명성을 특징으로 하는 패혈증은, 박테리아 DNA 및 많은 림프구를 직접 활성화시키기에 충분한 농도에 이르는 박테리아를 죽이는 것으로부터 방출된 그 밖의 생성물에 의해 시작될 수 있다. 패혈증 증후군에서 CpG DNA의 역할의 증거는 Cowdery, J. et al., (1996) The Journal of Immunology 156:4570-4575에도 기재되어 있다.
그들의 표면 Ig수용체를 통해 B세포를 유발시키는 항원과 상이하게, CpG-ODN은 탐지 가능한 Ca2+플럭스, 단백질 티로신 인산화의 변화 또는 IP 3 생성을 유발하지 않았다. CpG 모티프와 함께 또는 CpG 모티프 없이 FITC-연결된 ODN으로 플로우 사이토메트리를 자오 큐 등(Antisense Research and Development 3:53-66(1993))에 기재된 방법으로 수행하여, 당량(equivalent) 막결합, 세포 흡수(uptake), 유출(efflux) 및 세포내 위치(localization)를 나타내었다. 이것은 세포막 단백질이 CpG ODN에 대해 특이적이지 않을 수 있음을 제시한다. 데이터는 세포막을 통해 작용하는 것보다 오히려 비메틸화된 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 활성을 위해 세포흡수(uptake)를 필요로 한다는 것을 제시한다: 아비딘 비드(beads) 또는 아비딘 도포된 페트리접시 중 하나에 고정된 ODN을 비오틴화시키기 때문에, 고체 테프론 지지체에 공유결합된 ODN은 비자극적이다. FITC나 비오틴 중 하나에 결합된(conjugated) CpG ODN은 입체적 장해가 없이 완전한 마이토젠(분열유발) 특성을 보유한다.
최근 데이터는 CpG효과의 직접 또는 간접 매개체로서 전사인자 NFkB의 관련성을 나타낸다. 예를 들면, CpG DNA를 가지는 B세포 또는 단핵세포 처리 15분 이내에 NFkB 결합 활성의 레벨이 증가된다(도 7). 그러나, CpG모티프를 포함하지 않는 DNA에 의해서는 증가되지 않는다. 게다가, NFkB 활성의 두가지 서로 다른 저해제, PDTC 및 글리오톡신은 B세포 증식 또는 단핵세포 시토킨 분비에 의해 측정된 CpG DNA에 의한 림프구 자극을 완전하게 차단한다는 것을 발견하였고, NFkB 작용은 둘 다의 세포 타입을 필요로 한다는 것을 알 수 있었다.
NFkB가 활성화될 수 있는 몇가지의 가능한 메카니즘이 있다. 이들은 다양한 단백질 키나아제의 활성화를 통한 메카니즘 또는 반응성 산소종의 생성을 통한 메카니즘을 포함한다. B세포 또는 단핵세포의 CpG DNA 처리 후 즉시 유도된 단백질 키나아제 활성화에 대한 증거는 발견되지 않았고, 단백질 키나아제A, 단백질 키나아제C 및 단백질 티로신 키나아제의 저해제는 CpG 유도 활성화에 효과가 없었다. 그러나, CpG DNA는, Royall, J.A. 및 Ischiropoulos, H.(Archives of Biochemistry and Biophysics 302:348-355(1993))에 기재된 방법으로 민감한 형광염색제 디히드로로다민 123에 의해 탐지된 바와 같이, B세포 및 단핵세포 둘 다에서 반응성 산소종의 생성을 빠르게 유도한다. 더욱이, 이들 반응성 산소종의 생성 저해는 NFkB 유발 및 세포 증식 및 CpG DNA에 의한 시토킨 분비 유발을 완전하게 차단한다.
CpG DNA가 어떻게 반응성 산소종을 빠르게 생성하게 하는지에 대한 의문이 뒤따른다. 본 발명자들에 의한 이전의 연구는 올리고뉴클레오티드 및 플라스미드 또는 박테리아의 DNA가 세포에 의해 엔도솜으로 이행된다는 것을 증명했다. 이들 엔도솜은 빠르게 세포 내부에서 산성화된다. 이 산성화단계가 CpG DNA가 반응성 산소종을 활성화시키는 메카니즘에서 중요한지 결정하기 위해서, 다른 메카니즘에서 작용하는 클로로퀸, 모넨신 및 바필로마이신을 포함하는 엔도솜 산성화의 특이적 저해제로 산성화 단계를 차단했다. 도 8A는 반응성 산소종의 레벨을 결정하기 위해 디히드로로다민 123 염색제와 쥐의 B세포를 사용한 플로우 사이토메트리로부터의 결과를 나타낸다. 도면에서 패널 A의 염료만의 샘플은 28.6%로 염료에 양성인 세포의 배경레벨을 28.6%로 나타낸다. 이러한 반응성 산소종의 레벨은 PMA, 이오노마이신, 양성 대조군(패널 B)으로 20분간 처리된 세포에서 거의 80%까지 증가되었다. CpG 올리고로 처리된 세포는 또한 세포의 50%이상이 양성이 되어 반응성 산소종의 레벨에 있어서 증가를 나타냈다(패널 D). 그러나, CpG가 바뀌는 것을 제외하고 동등한 서열을 보유한 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포는 반응성 산소종의 레벨에 있어서 이러한 유의적 증가는 나타내지 않았다(패널 E).
클로로퀸 존재 하에서, 결과는 매우 다르다(도 8A). 클로로퀸은 패널 A에서 미처리된 세포가 양성으로 되는 것이 단지 4.3%가 되도록 세포내 반응성 산소종의 배경레벨을 약간 저하시킨다. 클로로퀸은 CpG DNA(패널 B)로 처리된 세포 내에서 반응성 산소종의 유발을 완전히 없애지만, PMA와 이오노마이신(패널 E)으로 처리된 세포 내에서 반응성 산소종의 레벨을 감소시키지는 않는다. 이는 PMA 플러스 이오노마이신과는 달리 CpG DNA로 B세포를 처리함에 뒤따르는 반응성 산소종의 생성은, DNA가 엔도솜에서 산성화 단계를 거치도록 요구한다는 것을 나타낸다. 이는 백혈구활성의 완전하게 새로운 메카니즘이다. 클로로퀴논, 모넨신 및 바필로마이신은 또한 이어지는 증식 및 시토킨 분비 유발 뿐만 아니라 CpG DNA에 의한 NFkB 활성을 차단하는 것으로 나타난다.
(CpG DNA에 의한 만성적 면역 활성화와 자동면역 혼란)
CpG DNA에 의한 B세포 활성화는 B세포의 수용체를 통한 시그날과 함께 공동상승작용을 한다. 이것은 DNA 특이적 B세포가, 그들의 항원 수용체와 박테리아 DNA의 결합에 의하여, 그리고 공동자극성 CpG 매개 시그날에 의하여 활성화될 수 있는 가능성을 높인다. 게다가, CpG DNA는 아폽토시스에 저항성이 되도록 B세포를 유도하는데, 그 메카니즘은 DNA와 같은 자가항원에 대한 면역반응을 방지하는데 중요한 역할을 한다고 생각된다. 또한 bDNA에 대한 노출은 안티-DNA Ab 생산을 개시시킬 수 있다. 자가면역을 촉진시키는 CpG DNA의 잠재적인 능력을 고려할 때, 자가면역질환 전신 홍반성 루푸스를 보유하는 환자는 하이포메틸화된 CpGs에서 풍부한 순환 플라즈마 DNA의 향상된 레벨을 꾸준히 보유한다는 점은 주목할만 하다. 이 발견은 홍반성 루푸스에서 CpG DNA에 의한 만성적인 면역 활성화의 역할의 가능성을 제시하고 있다.
루푸스의 치료에 있어 효과적인 약물 군(class)은 클로로퀸과 같은 항 말라리아 제제이다. 그러나 이 제제의 치료기작은 분명하지 않으며, 그들은 엔도솜 산성화를 저해하는 것으로 알려져 있다. CpG DNA에 의한 백혈구의 활성은 세포의 표면 수용체에 결합하는 것을 통해 매개되지는 않는다. 그러나 세포 흡수를 요구하는데, 세포흡수는 흡수성 식균작용(adsorptive endocytosis)를 통해 산성화된 클로로퀸-민감성 세포내 분획내로 일어난다. 이것은 CpG DNA에 의한 백혈구 활성화는 산성화된 엔도솜과 관련하여 일어나며, pH 의존적일 수 있다는 가설을 제시한다. 이 가설을 시험하기 위해, DNA 산성화의 특이적 저해제를 투여하고, 엔도솜 산성화가 저해된다면 B세포 또는 단핵백혈구가 CpG DNA에 반응할 수 있는지를 결정하였다.
CpG DNA에 대한 반응에서 검지되는 최초의 백혈구 활성화사실은 반응성 산소종(ROS)의 생산이다. 이는 1차 비장세포와 B세포 및 단핵세포주 둘다에서 5분내에 유도된다. 그 작용기작이 상이한 클로로퀸, 바필로마이신A, 그리고 모넨신을 포함하는 엔도솜 산성화 저해제는, CpG 유발된 ROS의 생성을 차단하지만, PMA 또는 CD40 또는 IgM의 결합체에 의해 매개된 ROS의 생성에는 전혀 효과가 없다. 이 연구는 ROS의 생성은 다양한 경로를 통한 백혈구 활성화에 있어서 공통된 현상임을 보여준다. 이러한 ROS 생성은, 일반적으로 CpG DNA에 대한 ROS 반응을 위해서만 요구되는 엔도솜 산성화에 영향을 받지 않는다. CpG에 반응하는 ROS의 생성은 NFkB 저해제 글리오톡신에 의해 저해되지 않고, 이는 NFkB 활성화에 2차적이지 않은 것임을 나타낸다.
CpG DNA의 엔도솜 활성화가 다른 면역자극효과를 위해서도 필요한지 결정하기 위해 실험하였다. LPS와 CpG DNA는 둘다 유사하게 급속히 NFkB 활성화를 유발하며, 프로토-온코유전자(proto-oncogene) mRNA 레벨과 시토킨 분비를 증가시킨다. DNA에 의한 NFkB 활성화는 CpG 모티프에 의존하는데, 이는 CpG 메틸레이즈로 처리된 bDNA 또는 CpGs를 방해하기 위해 염기가 스위치된 ODN에 의해서는 유발되지 않기 때문이다. 특정 항체를 사용한 슈퍼시프트 실험에서 p50과 p65의 구성을 포함하는 활성화된 NFkB 복합체가 나타났다. 이것에 대해 전혀 기대하지 않은 것은 아니나, LPS 또는 CpG-처리된 세포에서 NFkB 활성화는 IkBα와 IkBβ의 분해가 수반되어진다. 그러나, 엔도솜 산성화 저해제는 선택적으로 CpG-유도된 모든 세포활성 발생을 차단하였으나 LPS-유도된 세포활성은 차단하지 않았다. CpG-매개된 백혈구활성을 저해하는 것으로 결정된 매우 작은 클로로퀸의 농도(<10μM)는, 항 말라리아 활성 및 다른 보고된 면역효과(e.g., 100-1000μM)를 위해 요구되는 것보다 낮으므로 주목할만 하다. 이 실험은 CpG DNA의 자극효과를 매개하는 pH-의존성 개시기작의 역할을 뒷받침해주고 있다.
저해제
활성인자 배지 바필로마이신 (250nM) 글로로퀸 (2.5㎍/㎖) 모넨신 (10uM) NAC (50mM) TPCK(50uM) 글리오톡신 n(0.1㎍/㎖) 비스글리오톡신 xin(0.1㎍/㎖)
TNF-α IL-12 TNF-α IL- 12 TNF-α IL-12 TNF-α IL- 12 TNF-α TNF-α TNF-α TNF-α
배 지 37 147 46 102 27 20 22 73 10 24 17 41
CpG ODN 455 17,114 71 116 28 6 49 777 54 23 31 441
LPS 901 22.485 1370 4051 1025 12418 491 4796 417 46 178 1120
(엔도솜 산성화 또는 NFkB 활성화의 저해제에 의한 CpG 유도된 TNF-α 및 IL-12 발현의 특이적 차단)
IL-12와 TNF-α 분석에 따른 표15: 쥐 단핵백혈구 세포주 J774(IL-12을 위한1X105 세포/ml 또는 TNF-α 1x106 세포/ml)는 제시된 농도에서 2시간 동안 저해제의 존재 또는 비존재하에서 배양되고, 4시간(TNF-α) 또는 24시간(IL-12) 동안 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT SEQ ID NO;10) 2μM 또는 LPS(10μg/ml)에서 자극되어지고, 각 시간에 상청액을 회수했다. IL-12 또는 TNF-α(pg/ml)을 위한 ELISA는 공지기술(A.K. Krieg, A.K. YI, S. Matson, T.J.Waldschmit, G.A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky 그리고 D. Klinman, Nature 374, 546(1995);A.K. YI, D.M.Klinman, T.L. Martine, S. Matson and A.M. Krieg, J.Immunol., 157, 5394-5402(1996): Krieg, A.M, J.Lab. Clin.Med., 128, 128-133(1996))에 따라 상청액에서 행하여졌다. CpG 모티프가 결여된 ODN으로 배양된 세포는 시토킨 분비를 유발하지 않았다. 유사한 CpG 반응의 특이적 저해는 IL-6 분석에서 나타났고, 제1차 비장 세포 또는 B세포주 CH12.LX 와 WEHI-231을 이용한 실험에서 클로로퀸 2.5μg/ml이 5μM 이하와 평형을 이룬다(equivalent). PDTC와 칼페인 저해제 I과 II을 포함하는 NFkB 활성화의 다른 저해제는 상기에서 보여준 저해제의 결과와 유사하게 나타난다. 결과는 서로 다른 10개의 실험에서 획득되어진 것의 평균이다.
CpG 모티프에 의한 과도한 면역활성화는 자가면역질환 전신 홍반성 루푸스 의 병인에 기여할 것이다. 그것은 순환 하이포메틸화된 CpG DNA의 증가된 레벨과 관련이 있다. 클로로퀸 및 관련 항 말라리아 화합물은 비록 작용기작이 명백하게 밝혀지지 않았지만, 자가면역질환 전신 홍반성 및 다른 자가면역질환을 위해 효과적인 치료제이다. CpG-매개된 백혈구 활성화를 특이적으로 억제하는 극히 낮은 농도의 클로로퀸의 능력에 대한 증명은, 그 유익한 효과를 위해 가능한 새로운 기작을 제시한다. 루푸스 재발은 빈번히 미생물감염에 의하여 개시된다고 생각되는 것은 주목할만 하다. 감염조직에서 존재하는 bDNA의 레벨은 국지적 염증반응을 유발하기에 충분할 수 있다. 패혈증 및 다른 질병의 매개제로서의 CpG DNA의 역할과 함께, 본 연구는 엔도솜 산성화의 저해제로서 작용하는 항 말라리아제로서 새로운 치료적 적용을 제시한다.
CpG- 유도된 ROS 생성은 세포활성화와 우연히 일치할 수 있고, 이 활성을 매개하는 시그날로도 될 수 있다. ROS 유리기 포착제(scavenger) N-아세틸-L-시스테인(NAC)은 CpG- 유도된 NFkB 활성, 시토킨의 생성, B세포의 증식을 차단하는데, 이는 이 경로에서 ROS의 생성을 위한 원인적인 역할을 제시한다. 이 데이터는 NFkB의 활성화에 있어서 ROS를 위한 역할을 뒷받침하는 이전의 증거와 부합한다. WEHI-231 B세포(5x105 세포/ml)는 클로로퀸(5μg/ml[<10μM] )또는 글리오톡신(0.2μg/ml) 없이 또는 그 존재하에서 30분 동안 전배양되었다. 세포 분취량(aliquot)은 1μM의 CpG ODN(1826) 또는 비-CpG ODN(1911) 또는 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 플러스 이오노마이신(이오노) 없이 또는 존재하에서 RPMI 배지에서 10분 동안 상기와 같이 배양되었다. 세포는 디하이드로로다민123으로 염색되고 공지기술(A.K. Krieg, A.K. YI, S. Matson, T.J.Waldschmit, G.A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky 그리고 D. Klinman, Nature374, 546(1995);A.K. YI, D.M.Klinman, T.L. Martine, S. Matson and A.M. Krieg, J.Immunol., 157, 5394-5402(1996): Krieg, A.M, J.Lab. Clin.Med., 128, 128-133(1996))에 따라 플로우 사이토메트리에 의해 세포내 ROS의 생성을 분석하였다. J774 세포들, 단핵백혈구(단핵세포)주는, 유사한 pH-의존성 CpG 유도된 ROS반응을 나타냈다. 반대로, CpG DNA는 세포외 ROS의 생성을 유도하지 않고, 또한 어떠한 검출가능한 호중구 ROS도 유도되지 않았다. 이러한 클로로퀸의 농도(그리고 엔도솜 산성화의 다른 저해제와 함께 사용된 것)는 톤킨슨 등(Nucl. Acids Res. 22, 4268(1994);A.M. Krieg, In: Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics. Editor, S.Akhtar, CRC Press, Inc., pp. 177(1995))의 기재에 따라, 형광 결합(fluorescein conjugated) ODN을 사용하여 내재화된 CpG DNA의 산성화를 방해했다. 엔도솜 산성화를 저해하는데 요구되는 것보다 높은 농도에서, 비특이적인 저해 효과가 괸찰되었다. 각 실험은 유사한 결과로 최소 3번 행하였다.
NFkB는 유전자 발현의 중요한 조절자로서 알려져 있는 반면, CpG DNA에 대한 전사반응에서의 역할은 불분명하다. 이 NFkB 활성화가 CpG 매개된 유전자 발현 유도를 위해 요구되는지 결정하기 위해, IkB 포스포릴레이션의 저해제, 피롤리딘 디티오카바메이트(PDTC)의 존재 또는 비존재하에서 세포를 CpG DNA와 함께 활성화시켰다. NFkB 활성화의 이들 저해제는 CpG-유도된 프로토온코유전자(protooncogene), 시토킨 mRNA 및 단백질의 발현을 완전하게 억제하며, 이 사실은 이들 현상의 매개제(mediator)로서의 NFkB의 필수적인 역할을 나타낸다. 어떤 저해제도 이 연구에서 사용된 실험상태하에서 세포의 생존성을 감소시키지 않았다. J774, 쥐 단핵백혈구 세포주는 송아지 흉선(CT), E.coli(EC), 또는 메틸화된 E.coli(mEC)DNA(CpG 메틸레이즈로 메틸화된 것)의 5μg/ml하에서 또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN 1826; 표15) 또는 비-CpG ODN(ODN 1745: TCCATGAGCTTCCTGAGTCT)의 0.75μM하에서 1시간 동안 배양한 다음, 세포를 용해시키고 핵 추출액을 얻었다. 일치하는 NFkB 부위를 포함하는 2본쇄 ODN은 5'방사선 표지되고 공지기술(J.D. Dignam, R.M. Levovitz 그리고 R.G. Roeder, Nucleic Acids Res. 11, 1475(1983); M. Briskin, M. Damore, R. Law, G. Lee, P.W. Kincade, C.H. Sibley, M. Kuehl 그리고 R.Wall, Mol. Cell. Biol. 10, 422(1990))에 따라 필수적으로 EMSA를 위한 프로브(probe)로서 이용된다. p50/p65 헤테로다이머(heterodimer)의 위치는 특정 Ab로 p65와 p50로 슈퍼시프팅함으로써 결정되었다(Santa Cruz Biotechnology, 산타 크루즈, CA). LPS로 유도되지 않고 CpG-유도된 NFkB 활성화의 클로로퀸 저해는 J774 세포를 사용하여 구현되었다. 세포는 클로로퀸(20μg/ml)의 존재 또는 비존재하에서 2시간 동안 전배양되고 EC DNA, CpG ODN, 비-CpG ODN 또는 LPS(1μg/ml)와 함께 1시간 동안 상기의 방식으로 자극되었다. 유사한 클로로퀸 민감성 CpG- 유도된 NFkB 활성화가 B세포주, WEHI-231 그리고 제1차 비장세포에서 보여진다. 이들 실험은 2.5μg/ml 내지 20μg/ml의 클로로퀸 농도범위에서 유사한 결과로 3번 행하여졌다.
CpG-자극된 mRNA 발현은 B세포 및 단핵세포에서 엔도솜 산성화 및 NFkB 활성화를 요구한다는 것이 확인되었다. J774 세포(2X 106 세포/ml)는 클로로퀸(2.5μg/ml[<5μM] ) 또는 N-토실-L-페닐알라닌 클로로메트릴 케톤(TPCK;50μM), IkB 프로테오리시스를 방해하고 NFkB 활성화를 차단하는 세린/트레오닌 프로테아제 저해제의 존재 또는 비존재하에서 2시간 동안 배양되었다. 그런 다음, 세포는 E.coli DNA(EC;50μg/ml), 송아지 흉선 DNA(CT;50μg/ml), LPS(10μg/ml), CpG ODN(1826; 1μM), 또는 대조군 비-CpG ODN(1911;1μM)을 첨가하여 3시간 동안 자극되었다. WEHI-231 B세포(5X105 세포/ml)은 글리오톡신(0.1μg/ml) 또는 비스글리오톡신(0.1μg/ml)의 존재 또는 비존재하에서 2시간 동안 배양되고, 그런 다음 0.5 μM의 CpG ODN(1826) 또는 대조군 비-CpG ODN(1911: TCCAGGACTTTCCTCAGGTT)에 의해 8시간 동안 자극되었다. 이 두 경우에, 세포를 획득하고 제조 프로토콜에 따른 RNA졸을 사용하여 RNA를 제조하였다. 다중프로브 RNase 보호분석은 공지기술(A.K.Yi, P. Hornbeck, D.E. Lafrenz,그리고 A.M. Krieg, J. Immmunol., 157, 4918-4925(1996))에 따라 실시되었다. RNA의 상대적인 양은 로딩 콘트롤(L32)로서 리보솜 mRNA을 사용하여 각 레인(lane)에 로드되었다. 이 실험은 유사한 결과로 3번 실시되었다.
그 결과는 백혈구가 세포내 ROS의 pH의존성 생성을 포함하는 새로운 경로를 통하여 CpG DNA에 반응한다는 것을 나타낸다. pH 의존성 단계는 CpG DNA, ROS 생성, 또는 다른 어떤 현상의 수송 또는 프로세싱이 될 수 있다. ROS는 다양한 세포의 시그날 경로에서 제2차 전달자가 되는 것으로 생각된다. 그러나 B세포에서는 자극 시그날을 매개하는 것으로 보여지지 않았다.
예측건대, 엔도솜 내에 또는 근처에 CpG 모티프를 포함하는 DNA를 특이적으로 인식하고, 반응성 산소종의 생성을 일으키는 단백질이 있다. 세포내 세포질에서 특이적으로 CpG DNA와 결합하는 단백질을 검출하기 위해, CpG 모티프의 존재 또는 비존재하에서 5' 방사선반응 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 EMSA를 실시했다. 밴드는 CpG 모티프를 가진 1본쇄 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하나, CpG 모티프가 결여된 올리고뉴클레오티드 또는 메틸화된 CpG 모티프가 있는 올리고뉴클레오티드에는 결합하지 않는 단백질을 표시하는 것으로 나타났다. 이 결합 활성은 만약 NFkB 결합부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 과량 첨가되면 차단되어진다. 이것은 NFkB 또는 관계된 단백질이 자극성 CpG 올리고뉴클레오티드에 결합하는 단백질 또는 단백질 복합체의 구성성분임을 제시한다.
CREB/ATF단백질의 활성은 NFkB가 강하게 활성화된 어떠한 시점에서도 발견되지 않았다. 그러므로 이들 데이터는 NFkB 단백질이 실질적으로 CpG 핵산에 결합되는 것에 대한 증명을 제공하지 못하고 있다. 그러나 단백질이 CpG 활성화를 위한 어떤 경로에 요구되어진다는 것을 증명한다. CREB/ATF 또는 관계된 단백질은 CREB 단백질 그리고 최적 CpG 모티프를 위한 결합 모티프에서 뚜렷한 유사성을 설명하는 NFkB단백질 또는 다른 단백질과 함께 어떤 방식으로 상호 작용이 가능하다. 올리고가 CREB/ATF 또는 관계된 단백질에 결합하고, 그리고 이것이 NFkB 활성화를 이끈다는 것도 가능하다.
선택적으로 CpG 핵산은, CD40의 세포질 영역에 결합되고, CD40이 교차결합된 때 NFkB 활성화를 매개하는 TRAF 단백질의 하나에 결합될 수 있다. 그러한 TRAF 단백질의 예는 TRAF-2와 TRAF-5를 포함한다.
(면역자극 핵산의 제조 방법)
본 발명의 사용을 위해서, 핵산을 공지 기술 중 어느 하나를 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, b-시아노에틸포스포라미디트 법(S.L. Beaucage 및 M.H. Caruthers, (1981)Tet. Let. 22:1859); 뉴클레오티드 H-포스포네이트법(Garegg 등(1986))Tet. Let.27: 4051-4054; Froehler 등(1986)Tet. Let. 29: 2619-2622). 이들 화학작용은 시중에서 사용가능한 다양한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기에 의해 이루어진다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 제한효소 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하는 것 등의 공지 기술을 이용하여 기존의 핵산서열(예를 들면, 게놈 또는 cDNA)로부터 제조될 수 있다.
생체 내에서 사용하기 위해, 핵산은 분해(예를 들면, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제)에 비교적 저항성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 스템루프 등의 2차 구조는 분해에 대항하여 핵산을 안정화할 수 있다. 선택적으로, 핵산 안정화는 인산염 골격 변형을 통해 이루어질 수 있다. 바람직한 안정화된 핵산은 적어도 부분적으로 포스포로티오에이트 변형된 골격을 가진다. 포스포로티오에이트는 포스포라미데이트나 H-포스포네이트 화학반응을 적용한 자동화된 기술을 사용하여 합성하여도 좋다. 아릴 및 알킬포스포네이트는 예를 들면, 미국특허 제4,469,863호에 기재된 바와 같이 만들어 질 수 있고; 알킬포스포트리에스테르(전하를 띤 산소 부분이 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽특허 제092,574호에 기재된 바와 같이 알킬화)는 시판되고 있는 시약을 사용하여 자동화된 고체상합성에 의해 제조될 수 있다. 또 다른 DNA골격 변형 및 치환기를 만들기 위한 방법이 기재되었다(Uhlmann, E. 및 Peyman, A.(1990)Chem.Rev. 90: 544; Goodchild, J.(1990) Bioconjugate Chem. 1:165). CpG모티프를 가지는 2'-O-메틸 핵산 또한 에톡시 변형된 CpG 핵산처럼 면역활성을 일으킨다. 실제, C를 5-메틸C로 치환함으로써 크게 감소되었지만, 골격변형이 없으면 CpG 효과가 완전하게 제거된다는 것을 발견하였다.
생체 내의 투여를 위해, 핵산은 표적세포(예를 들면, B-세포, 단핵세포 및 자연킬러(NK)세포)에 높은 친화성 결합 또는 표적세포에 의한 증가된 세포흡수를 일으키는 분자와 결합하여 "핵산 운반 복합체"를 형성할 수 있다. 핵산은 공지 기술을 이용하여 적당한 분자와 이온결합, 또는 공유결합으로 연결된다. 다양한 커플링제 또는 가교제, 예를 들면, 단백질A, 카르보디이미드 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 사용할 수 있다. 핵산은 공지기술을 사용하여 리포솜 또는 비로솜에 피막화할 수 있다.
(면역자극 핵산분자의 치료제 용도)
그들의 면역자극 특성에 기초하여, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 핵산분자는 생체 내의 객체에 투여되어 "면역시스템 결핍"을 치료한다. 선택적으로, 적어도 하나의 비메틸화된 CpG디뉴클레오티드를 포함하는 핵산분자는 생체 밖에서 면역시스템 결핍을 가지는 객체로부터 얻어진 림프구와 접촉하고, 그런 다음 활성화된 림프구를 객체에 재이식할 수 있다.
상기한 바와 같이, 비메틸화된 CpG 함유 핵산분자에 대한 반응에서, 비장세포의 증가된 수는 IL-6, IL-12, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-1, IL-3, IL-10, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, RANTES 및 또 다른 것을 분비한다. 증가된 IL-6발현이 B세포, CD4+T세포 및 단핵세포에서 일어난다는 것을 발견하였다.
면역자극 핵산분자를 객체의 면역시스템을 돕기 위해 백신과 결합하여 객체에 투여함으로써, 백신으로부터 더 우수한 반응효과를 얻을 수 있다. 바람직하게 면역자극 핵산분자는 백신과 동시에 또는 그 전에 소량 투여된다. 종래의 보조제는종래 보조제가 항원 흡수를 증가시킴으로써 백신화(vaccination)를 더욱 향상시킨 것으로서 항원을 최소한 포함하는 백신과 결합하여 선택적으로 투여되어도 좋다.
백신이 DNA 백신일 때, 적어도 두가지 성분이 그것의 효력을 결정한다. 첫째로, 백신에 의해 암호화된 항원은 면역반응의 특이성을 결정한다. 두번째, 플라스미드의 골격이 CpG모티프를 포함할 경우, 그것은 백신에 대한 보조제로서 작용한다. 따라서, CpG DNA는 효과적인 "위험 신호"로서 작용하고, 면역시스템이 새로운 항원에 격렬하게 반응하도록 한다. 이 작용 형태는 B세포에 대한 공동자극효과 뿐만 아니라 아마도 수지상 세포 또는 다른 "professional" 항원 존재세포에 대한 CpG DNA의 자극 국소적 효과로부터 일차적으로 나타난다.
림프구를 직접적으로 활성화시키고 항원특이적 반응을 보조자극하는 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 비메틸화된 CpG 함유 백신은, 항원을 흡수하여 면역세포에 대해 더욱 효과적으로 제공함으로써 작용한다고 생각되며, 단독 투여시 비활성화 되는 종래 보조제(예를 들면, 알루미늄 침전물)와는 기본적으로 다르다. 더욱이, 종래 보조제는 몇몇 항원에 대해서만 작용하고, 항체(체액) 면역반응(Th2)을 단지 유도하고, 세포 면역반응(Th1)을 유도하기에 매우 부족하다. 많은 병원체에 대해서, 체액반응은 보호에 대해서는 거의 기여하지 못하여, 유해할 수도 있다.
첨가로, 면역자극 올리고뉴클레오티드는 화학요법 또는 면역요법 투여 전에투여되거나, 함께 또는 후에 투여되어, 그 이후의 화학요법 또는 면역요법에 대한 악성세포의 반응성을 증가시키거나, GM-CSF 등의 회복성 시토킨 유도를 통해 골수 회복을 빠르게 한다. CpG 핵산은 또한 자연킬러세포 용균활성 및 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 효과를 증가시킨다. NK활성 및 ADCC의 유도는 면역치료 단독으로 또는 또 다른 치료와 함께 암에 효과적이다.
상술한 면역자극 핵산분자의 또 다른 용도는 무해한 알레르겐에 대항하는 IgE 항체 생성에 의해 일반적으로 일어나는 알레르기에 대해 둔감해지게 하는 것(desensitization)이다. 비메틸화된 CpG핵산에 의해 유도된 시토킨은 세포면역반응임이 특징이며, IL-12 및 IFN-γ와 관련된 "Th1"이라 불리는 군에서 현저하다. 면역 반응의 또 다른 중요한 타입은 항체면역반응 및 IL-4, IL-5 및 IL-10 생성과 연관된 Th2면역반응이다. 일반적으로, 알레르기성 병은 Th2타입 면역반응에 의해 매개되고, 자가면역질환은 Th1면역반응에 의해 매개된다는 것이 나타났다. Th2반응(IgE항체 및 알레르기 생성과 관련)으로부터 Th1반응(알레르기성 반응에 대하여 보호)으로 객체의 면역반응을 변화시키는 면역자극 핵산분자의 성능에 기초하여, 면역자극 핵산분자(또는 핵산을 함유하는 벡터) 단독 또는 알레르겐과 결합한 효과적인 투약량이 객체에 투여되어 알레르기를 치료하거나 예방할 수 있다.
비메틸화된 CpG모티프를 포함하는 핵산은 또한 천식치료에 유의적인 치료효과를 가진다. Th2 시토킨, 특히 IL-4 및 IL-5는 천식객체의 기도(airway)를 향상시킨다. 이들 시토킨은 IgE 동형 스위칭, 호산성 주화성 및 활성화, 마스트 세포 성장을 포함하는 천식 염증 반응을 중요한 관점에서 증진시킨다. Th1 시토킨, 특히, IFN-γ 및 IL-12는 Th2클론 형성 및 Th2시토킨 생성을 억제할 수 있다.
하기 실시예12에서 상세하게 기재한 바와 같이, 비메틸화된 CpG모티프(즉, TCCATGACGTTCCTGACGTT; 서열번호 10)를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 염증세포 침윤물 및 쥐의 천식 모델에서의 호산성 발전을 막는 올리고뉴클레오티드 (TCCATGAGCTTCCTGAGTCT: 서열번호 11)를 조절하지 않는다. 더욱이, 호산성 염증 억제는 Th2반응의 억제 및 Th1반응의 유도와 관련된다.
치료에 사용하기 위해서, 적당한 면역자극 핵산분자 단독 또는 운반 복합체로서 조제된 것의 효과적인 양이 표적세포(예를 들면, B-세포 및 단핵세포)로 올리고뉴클레오티드가 이행되도록 하는 어떠한 형태에 의해 객체에 투여될 수 있다. 투여의 바람직한 경로는 경구 및 경피(예를 들면, 패치를 통한)이다. 또 다른 투여경로의 예는 주사(피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 척수강내 등)을 포함한다. 주사(injection)는 대형환제(bolus) 또는 연속적인 점적주사(infusion)로 될 수 있다.
핵산 단독 또는 핵산 운반 복합체로서는 의약적으로 허용가능한 운반체와 결합하여 투여될 수 있다. 여기서 사용된 것으로서, 의약적으로 허용가능한 운반체는 핵산 또는 핵산 운반 복합체와 함께 공동 투여될 수 있는 물질을 포함하고, 핵산이 지정된 기능을 수행하도록 한다. 상기 운반체의 예는 용액, 용매, 분산매체, 지연제, 유화제 등을 포함한다. 상기 의약적 활성물질에 대한 상기 매체의 용도는 당업계에 공지된 기술이다. 핵산과 함께 사용하기에 적합한 기타 종래의 운반체도 본 발명의 범위에 해당한다.
핵산분자의 효과적인 양(유효량)이란 바람직한 생물학적 효과를 나타내기에 필수적이거나 충분한 양이다. 예를 들면, 면역시스템 결핍을 치료하기 위한 적어도 하나의 비메틸화된 CpG를 포함하는 핵산분자의 효과적인 양은 종양, 암 또는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 감염을 제거하기에 필수적인 양이다. 백신보조제로서 사용하기 위한 효과적인 양은 백신에 대한 객체 면역반응을 돕기 위해서 유용한 양이다. 천식을 치료하기 위한 효과적인 양은 천식과 관련된 Th2 타입의 면역반응을 Th1타입의 반응으로 방향을 바꾸기 위해 유용한 양이다. 특히 어떠한 적용을 위해서 효과적인 양은 치료된 병 또는 상태, 특히 투여된 핵산분자(예를 들면, 비메틸화된 CpG모티프의 수 또는 핵산에서의 그 위치), 객체크기, 또는 병 또는 상태의 심도 등의 요인에 따라서 변할 수 있다. 종래 기술 중 하나에 의해 많은 실험을 필요로 하지 않고 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 실험적으로 결정할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예로서 더욱 상세하게 기재하지만, 그것에 한정되는 것은 아니다. 이 출원을 통해 참조된 모든 성분이 참조문으로서 결합하여 나타내었다.
(실시예)
실시예 1 : B 세포 총 RNA 합성 및 세포주기에 대한 ODNs의 효과
B세포는, 특정 병원균을 가지지 않은 6-12주된 DBA/2 또는 BXSB 쥐(아이오와 대학 내의 동물 보호 기관에서 채취함; 본질적인 기질 차이는 없음)로부터 얻어진 비장에서 정제된다. 상기한 쥐는 안티-티-1.2 및 보체를 제거한 T 셀 및 림프구 M(캐나다 온타리오 혼비 세더레인 연구소)을 원심분리한 것이다.(B세포) B세포는 1% 미만의 CD4+ 또는 CD8+세포를 포함한다. 8×104 B세포는 10% FBS(65℃에서 30분간 열불활성화시킨다), 50μM 2-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타메이트를 함유하는 100㎕ RPMI 내의 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서 3배로 된다. 20μM ODN은 37℃에서 20시간 배양 초기에 첨가되고, 세포는 3H 우리딘의 1μCi과 표지하며, 4시간 후에 수집한다. Ig 분비 B 세포는 48시간 동안 20μM에서 ODN과 전 비장 세포의 배양 후 ELISA 스팟 분석을 사용하여 확인된다. 표 1에 나타낸 데이터는 ODN 없이 배양된 세포와 비교한 자극 수치를 나타낸다. 3H 티미딘 혼입 분석은 동일한 결과를 보여주나, 디그레이드 ODN(Matson. S 및 A. M. Krieg(1992) 올리고누클레오타이드의 제어에 의한 3H-티미딘 혼입의 불특정 억제, Antisense Research and Development 2:325)으로부터 방출된 티미딘에 의한 불특정 억제는 있다.
실시예 2 : B 세포로부터의 IgM의 생산에 대한 ODN의 효과
방금 죽은 쥐의 비장으로부터의 단일 세포 서스펜션은 Leibson 등의 방법(J. Exp. Med. 154:1681(1981))에 의해 안티-틸, 안티-CD4, 및 안티-CD8 그리고 보체로 처리된다. 남은 B세포(<02% T세포 혼입)는 DeFranco(J. Exp. Med. 155:1523(1982)) 등의 공정에 의한 불연속 퍼콜 구배의 63-70% 밴드로부터 분리된다. 이것들은 상기한 바와 같이 48시간 동안 30μM ODN 또는 20μg/ml LPS에서 배양된다. IgM을 활동적으로 분비하는 B세포의 수는 ELI 스팟 분석(Klinman, D. M. 등 J. Immunol. 144:506(1990))의 결정과 같이 이 때 최대가 된다. 이 분석에서, B 세포는 안티-Ig 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 6시간동안 배양된다. 생산된 Ig는 포스파타제-표지 안티-Ig(AL 버밍엄 남부 생물공학 협회)를 사용하여 확인한다. 각 B 세포에서 생산된 항체는, 포스파타제의 존재하에서 불용성의 파란 침전물을 형성하는 BCIP(St. Louis MO, Sigma Chemical Co.)의 첨가로 가시화된다. 20-40spots/well를 생산하는 세포의 희석은 항체-분비 B세포/샘플의 총수를 결정하는데 사용된다. 모든 분석은 3배로 행해진다(표 1에 기재한 데이터). 몇몇 실험에서는, 배양 상청은 ELISA에 의한 IgM으로 분석하며, CpG-ODN에 대해 동일한 증가를 나타낸다.
실시예 3: 박테리아 DNA에 의한 B 세포의 자극
DBA/2 B세포는 48시간 동안 DNA없이 또는 50μg/ml의 a)미세구균 리소덱티커스; b)NZB/N 쥐 비장; 및 NFS/N 쥐 비장 게놈 DNAs과 배양되며, 세포 수집 전 4시간동안 3H 티미딘으로 표지된다. 2중 DNA 샘플은 세포 배양에 첨가 전 37℃에서 30분간 DNASE I로 온침된다. 또한 E 콜리 DNA는 ELISA-스팟 분석을 4시간동안 사용하므로서 다수의 IgM 분비 B 세포의 8.8 폴드 증가를 유도한다.
DBA/2 B세포는 20μM에서 첨가물 없이, 50μg/ml LPS 또는 ODN l;la;4; 또는 4a로 배양된다. 세포는 4, 8, 24 및 48시간에서 배양 및 수집된다. BXSB 세포는 실시예 1에서와 같이 ODN l;la;4; 또는 4a 또는 LPS의 5, 10, 20, 40 또는 80μM과 배양된다. 이 실험에서 ODN없는 웰은 3833cpm을 가진다. 각 실험은 동일한 결과를 적어도 3회 수행한다. 3배 웰의 표준 편차는 5%미만이다.
실시예 4: 자연 킬러(NK) 활성에 대한 ODN의 효과
10×106 C57BL/6 비장 세포는 48시간 동안 40μM CpG 또는 non-CpG ODN과 또는 없이 2ml RPMI(실시예 1에 기재된 바와 같이 보충됨)에서 배양된다. 셀은 세정되고, YAC-1 및 2C11과, 2 NK 감수성 표적 세포라인(Ballas, Z. K. 등 (1993) J. Immunol. 150:17)을 가진 짧은 51Cr 유리 분석에서 작용인자로서 사용된다. 작용인자 세포는 0.2ml V-하층 마이크로타이터 플레이트에서 다양한 농도의 104 51Cr-표지 표적 세포에 첨가되고, 37℃에서 4시간 동안 5% CO2에서 배양된다. 플레이트는 원심분리되고, 상청의 분할량은 방사능에 산정된다. 퍼센트 특이 용균은 작용인자 세포의 존재에서 유리된 51 Cr에서 표적 세포가 단독 배양될 때 유리된 5qCr을 빼고, 2% 아세트산에서 세포 용균 후 유리된 총계에서 세포가 단독으로 배양될 때 유리된 51 Cr cpm을 뺀 값을 더한 비를 계산하여 결정하였다.
실시예 5: 생체 내 CpG 포스포로티오에이트 ODN의 연구
쥐는 체중을 재고, 0.25ml의 무균 PBS 또는 PBS에 용해된 표지 포포로티오에이트 ODN과 IP를 주사한다. 24시간 후, 비장 세포는 수집, 세정, 및 6B2에서 안티 Ly-6A/E 또는 안티-Iad(Pharmingen, San Diego, CA) 또는 안티-Bla-1(Harby, R. R. 등, J. Exp. Med. 159:1169(1984))과 복합된 바이오틴과 연결된 B 세포의 게이트에 복합된 피코에리트린를 사용하여 플로우 사이토메트리로 착색된다. 2마리의 쥐는 각 조건에서 연구되고, 각각 분석된다.
실시예 6: B 세포 자극을 위한 포스포로티오에이트 ODN 적정
B 세포는 ODN 1a 또는 CpG ODN ld 및 2Db의 제어 배열과 포스포로티오에이트 ODN으로 배양되며, 수집 및 결정 cpm 전에 3H 티미딘으로 44시간 후 또는 3H 우리딘으로 20시간 후 표지된다
실시예 7: 세포자멸사로부터 B세포의 구제
WEHI-231 세포(5×104/웰)은 안티-IgM(1μ/ml)의 첨가 전에 LPS 또는 억제 ODN la 또는 CpG ODN ld 및 3Db의 존재 또는 부재에서 37℃에서 1시간동안 배양된다. 세포는 2μCi/웰 3H 티미딘으로 4시간동안의 펄스 전에 추가로 20시간 배양된다. 이 실험에서, ODN 또는 안티-IgM이 없는 세포는 안티-IgM의 첨가에 의해 90.4×103cpm의 3H 티미딘 혼입을 준다. 표 1에 나타낸 포스포디에스테르 ODN은, ODN 변성에 기인한 몇몇 불특정 서프레션에도 불구하고, 동일한 방어를 준다. 각 실험은 동일한 결과로 적어도 3회 반복된다.
실시예 8: 생체내 마우스 IL-6의 유도
DBA/2 암쥐(2개월)에 500g CpG 도는 억제 포스포로티오에이트 ODN을 가진 IP를 주사한다. 주사 후 여러 시점에서 쥐의 혈액을 채취한다. 2마리의 쥐를 각 시점에서 연구한다. IL-6은 Elisa에 의해 측정되고, IL-6 농도는 제조합체 IL-6을 사용하여 생성된 표준 곡선에 비교하여 계산된다. 분석의 감도는 10pg/ml이다. 8시간 후에는 레벨 검출이 불가능하다.
실시예9: 마우스 IL-6 전사의 전신(systemic) 유도
쥐 및 세포계.
5-10주된 DBA/2, BALB/c, 및 C3H/HeJ 쥐가 림프구의 재료로 사용된다. 모든 쥐는 Jackson 연구소(Bar Harbor, ME)로부터 얻으며, Iowa 동물 보호단체의 대학 내 특정 병원균이 없는 환경에서 혈액 채취 및 유지되었다. 마우스 B 세포계 CH12.LX는 G. Bishop 박사에 의해 제공되었다(Iowa시 Iowa 대학).
세포 준비.
마우스는 경부 탈구로 죽는다. 단일 세포 세스펜션은 쥐의 비장으로부터 무균상태로 준비된다. 쥐의 비장구가 제거된 T 세포는, 안티-티-1.2 및 보체를 사용하고, 림프구 M(캐나다 온타리오 혼비 세더레인 연구소)을 원심분리하여 준비한다(Krieg, A. M. 등 (1989) 림프구 활성의 제어에 있어서 내인성 레트로바이러스 배열의 역할, J. Immunol. 143:2448).
ODN 및 DNA
포스포디에스테르 올리고누클레오타이드(O-ODN) 및 백본드 변형된 포스포로티오에이트 올리고누클레오타이드(S-ODN)은 Iowa 대학의 DNA 중핵 기관 또는 Operon Technologies(Alameda, CA)로부터 얻는다. E. coli DNA(균주 B) 및 송아지 흉선 DNA는 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입한다. 모든 DNA 및 ODN은 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1) 및/또는 에탄올 침전으로 추출하여 정제한다. E. coli 및 흉선 DNA는 10분간 끓임 및 5분간 얼음냉각을 사용하기 전에 단일로 꼬인다. 몇몇 실험에서는, E. coli 및 흉선 DNA는 5mM MgCl2과 1X SSC에서 37℃에서 2시간 동 안 DNase I(DNA 2U/μg)로 소화된다. E. coli DNA 내의 CpG 디누클레오타이드에서 시토신을 메틸화하기 위해서, E. coli DNA는 160μM S-아데노실 메티오닌이 부가된 NE버퍼 2 CpG 메틸라제(M. SssI; DNA의 2U/μg)로 처리되고, 37℃에서 밤새 배양된다. 메틸화된 DNA는 상기와 같이 정제된다. 메틸화 효율은 Hpa II 소화와 젤 전기영동에 의한 분석에 의해 확인된다. 모든 효소는 New England Biolabs(Beverly, MA)로부터 구입한다. ODN 내의 LPS 레벨은 12.5ng/mg이하이며, E. coli 및 송아지 흉선 DNA는 Limulus 분석에 의한 DNA의 2.5ng LPS/mg이하를 포함한다.
세포배양
모든 세포는 10%(v/v) 열 불활성 우태아혈청(FCS), 1.5mM L-글루타민(50μg/ml), CpG 또는 non-CpG 포스포디에스테르 ODN(O-ODN)(20μM), 포스포로티오에이트 ODN(S-ODN)(0.5μM), 또는 E. coli 또는, 37℃에서 24시간(IL-6 생성) 또는 5일(IgM 생성) 동안의 송아지 흉선 DNA(50μg/ml)이 부가된 RPMI-1640 내에서 37℃에서 5% CO2 습도의 인큐베이터에서 배양된다. 자극제의 농도는 적정의 초기 연구에 기초하여 선택된다. 몇몇 경우, 세포는, 뮤린 IL-6(하이브리도마 MP5-20F3)에 대한 여러 농도(1-10μg/ml)의 중화 rat IgG1 항체 또는 E. coli b-갈락토시다제(하이브리도마 GL113; ATCC, Rockville, MD)(20)에 대한 억제 rat IgGl mAb와 CpG O-ODN으로 5일간 처리된다. 배양의 종결에서는, 배양상청 비율은 하기와 같이 ELISA로 분석된다.
생체내 IL-6 및 IgM의 유도
BALB/c 마우스는 PBS, 송아지 흉선 DNA(200μg/100μl PBS/mouse), E. coli DNA(200μg/100 μl PBS/mouse), 또는 CpG 또는 non-CpG S-ODN(200μg/100μl PBS/mouse)으로 정맥주사(iv)한다. 마우스(2/그룹)는 레트로오비탈 천자에 의해 혈액추출되고, 여러 시점에서 경부 탈구에 의해 도살된다. 간장, 비장, 흉선, 및 골수는 제거되고, RNA는 제조자 프로토콜에 의한 RNAzol B(Tel-Test, Friendswood, TX)를 사용한 장기로부터 준비된다.
ELISA
플랫-하층 면역 1 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA)는 안티-마우스 IL-6 mAb(MP5-20F3)(2μg/ml) 또는 카보네이트-바이카보네이트 내의 안티-마우스 IgM μ-사슬 종(5μg/ml; Sigma, St. Louis, MO), 4℃에서 밤새 둔 pH9.6 버퍼(15nM Na2CO3, 35mM NaHCO3)의 100μl/웰로 코팅된다. 플레이트는 TPBS(0.5mM MgCl2·6H2O, 2.68mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 0.14M NaCl, 6.6mM K2HPO4, 0.5% 트윈20)로 세정되며, 상온에서 2시간 동안 TPBS 내의 10% FCS로 차단되며 다시 세정된다. 배양 상청, 마우스 혈청, 제조합체 마우스 IL-6(Pharmingen, San Diego, CA) 또는 정제된 마우스 IgM(Calbiochem, San Diego, CA)는 10% FCS에서 적절히 희석되고, 상온에서 6시간 동안 3배 웰에서 배양된다. 플레이트는 세정되고, 100μl/well의 바이오티닐레이티드 rat 안티-마우스 IL-6 모노클로날 항체(MP5-32C11, Pharmingen, San Diego, CA)(10% FCS 중 1μg/ml) 또는 바이오티닐레이티드 안티-마우스 Ig(Sigma, St. Louis, MO)는 상온에서 45분간 첨가 및 배양되고, TPBS로 세정된다. 10% FCS(100μl/well)에서 1:4000으로 희석시킨 아비딘(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)과 복합된 호세라디쉬 퍼옥시다제(HRP)는 상온에서 30 분간 첨가 및 배양된다. 플레이트는 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(OPD; Sigma, St. Louis MO)와 pH5.0인 0.05M 포스페이트-시트레이트 버퍼에서 30분간 세정 및 발생분화한다. 반응은 0.67N H2SO4로 중지되고, 플레이트는 490-600nm에서 마이크로플레이트 판독기(Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA)로 읽는다. 결과는 도 1 및 2에 나타내었다.
RT-PCR
IL-6의 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 인터널 올리고누클레오타이드 검출은 공개된 순서를 사용하여 합성된다(Montgomery, R. A. 및 M. S. Dallman(1991), 폴리메라세 사슬 반응을 이용한 페탈 티믹 개체발생 중 시토킨 유전자 발현의 분석(J. Immunol) 147:554). cDNA 합성 및 IL-6 PCR은 Mongomery 및 Dallman(Montgomery, R. A. 및 M. S. Dallman(1991)) 및 Perkin-Elmer Corp.(Hayward, CA)의 RT-PCR 시약을 사용하여 폴리메라세 사슬 반응을 이용한 페탈 티믹 개체발생 중 시토킨 유전자 발현의 분석(J. Immunol) 147:554)에 의해 기술된 바와 같이 근본적으로 행해진다. 샘플은 젤 전기영동에 의해 증폭된 30사이클 후에 분석 및 언블롯 분석한다(Stoye, J. P. 등, (1991) 프라그멘트 프로브와 건조 젤 내의 DNA 혼성화 : 블롯팅 기술의 진보, Techniques 3:123). 요약하면, 젤은 변성 버퍼(0.05M NaOH, 1.5M NaCl) 내 및 상온에서 30분간 혼성화되며, 변성 버퍼(1.5M NaCl, 1M Tris, pH8) 내에서 30분간 배양되며, 2번 증류된 물로 30분간 세정한다. 젤은 10μg/ml의 변성된 연여 정자 DNA를 함유하는 혼성화 버퍼(5X SSPE, 0.1% SDS) 내 및 47℃에서 2시간 동안 건조 및 예비혼성화된다. 젤은 47℃에 서 밤새 방치한 IL-6(5'CATTTCCACGATTTCCCA3') SEQ ID. No. 56의 2×106cpm/ml g32-[P]ATP 말단-표지 인터널 올리고누클레오타이드 프로브로 혼성화되고, 상온에서 4회(2X SSC, 0.2% SDS) 세정되고, 방사선사진을 찍는다. 결과는 도 3에 나타내었다.
세포 증식 반응 측정법
DBA/2 마우스 비장 B 세포(5×104cells/100μl/well)는 37℃에서 24시간 동안 배지, CpG 또는 non-CpG S-ODN(0.5μM) 또는 O-ODN(20μM)으로 처리된다. 세포는 [3H]티미딘 또는 [3H]우리딘(1μCi/well)으로 최종 4시간 동에 펄스된다. 혼입된 [3H]의 양은 액체 신틸레이션 분석기(Packard Instrument Co., Downers Grove, IL를 사용하여 측정한다.
트랜스펙션 및 CAT 분석
WEHI-231 세포(107세포)는 20μg의 억제 또는 인간 IL-6 프로모터-CAT 구조(S. Manolagas, Univ. Arkansas)(Pottratz, S. T. 등(1994))로 일렉트로포레이트되고, 17B-에스트라디올은 250mV 및 960μF에서 리셉터-디펜던트 메카니즘(J. Clin. Invest. 93:944)에 의해 인간 인터류킨-6 프로모터-리포터 구조의 발현을 억제한다. 세포는 일렉트로포레이션 후 여러 농도 또는 CpG 또는 non-CpG ODN에 의해 촉진된다. 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 활성은 트랜스펙션 후 16시간 동안 용액 분석(Seed, B. 및 J. Y. Sheen (1988) 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 활성의 단일 상-추출 분석 Gene 76:271)으로 측정된다. 결과는 도 5에 나타내었다.
실시예 10: CpG 모티프에 의한 B 세포 자극의 양을 결정하는 올리고데옥시누클레오타이드 변형
ODN은 표준 공정(Beacage 및 Caruthers(1981)데옥시누클레오타이드 포스포마이디티-데옥시폴리누클레오타이드 합성의 주요 중간체의 신종. Tetrahedron Letters 22, 1859-1862)을 이용하여 Applied Biosystems Inc.(Foster City, CA) 모델 380A, 380B, 또는 394 DNA 합성제에 합성된다. 포스포디에스테르 ODN은 표준 베타-시아노에틸 포스포아미디티 화학을 사용하여 합성된다. 포스포로티오에이트 결합은 표준 아이오딘 산화 대신에 황을 가진 포스파이트 결합을 산화시키므로써 도입된다. 4개의 공통 누클레오사이드 포스포아미디티는 응용 바이오시스템에서 구입한다. ODN을 함유하는 모든 포스포디에스테르 및 티오에이트는 55℃에서 12시간 동안 농축된 암모니아로 처리하므로써 디프로텍트된다. ODN은 사용 전에 젤 제외 크로마토그래피로 정제되고, 동결 건조된다. 포스포로디티오에이트 결합은 데옥시누클레오사이드 S-(b-벤조일머캅토에틸) 피롤리디노 티오포스포아미디티(Wiesler, W. T. 등 (1993) 분자 생물학의 방법: 올리고누클레오타이드 및 아날로그의 프로토콜-합성 및 특성, Agrawal, S.(ed.), Humana Press, 191-206)를 사용하므로써 도입된다. ODN을 포함하는 디티오에이트는 55℃에서 12시간 동안 농축된 암모니아로 처리 및 역상 HPLC 정제에 의해 디프로텍트된다.
필요한 인터누클레오타이드 결합에 있어서 포스포디에스테르 뿐 아니라 메틸포스포노티오에이트 또는 메틸포스포네이트를 함유하는 올리고머를 합성하기 위해서는, 두가지 다른 합성 사이클이 이용된다. 상기한 두 사이클에서 주요 합성 차이점은 디알킬아미노메틸누클레오사이드 포스파인이 사용되는 커플링 시약 및 메틸포 스포노티오에이트인 경우의 산화 시약이다. 상기한 두 유도체를 합성하기 위해서, 커플링의 느린 반응속도(Jager 및 Engels, (1984) 포스폰아미디트를 통한 데옥시누클레오사이드 메틸포스포네이트 접근의 합성. Tetrahedron Letters 24, 1437-1440)로 인해 디알킬아미노메틸누클레오사이드 포스파인의 응축시간이 증가되었다. 커플링 단계가 완성된 후, 메틸포스피노디에스테르는 메틸포스포노티오에이트를 생성하기 위해서 황화시약(5% 황 원소, 100millimolar 카본 디설파이드/피리딘/트리에틸아민 중 N,N-디아메틸아미노피리딘), 각 450초의 네 번의 연속 시간으로 처리된다. 메틸포스포네이트 결합을 생성하기 위해서, 메틸포스피노디에스테르가 표준 산화 시약(테트라히드로퓨란/2,6-루티딘/물 중의 0.1M 아이오딘)으로 처리된다.
올리고머에 연결된 실리카젤은 4℃에서 4일 동안 피리딘/농축된 암모니아 1:1(v/v)로 처리 및 증류된다. 상청은 진공에서 건조되고, 물에 용해되며, G50/50 세파덱스 컬럼에 크로마토그래프를 찍는다.
상기한 바와 같이, O-ODN은 포스포디에스테르인 ODN을 나타낸다; S-O-ODN은 중심 결합이 포스포디에스테르인 키메릭 ODN이나, 두 개의 5' 및 다섯 개의 3' 결합은 변성된 포스포로티오에이트이다; S2-O-ODN은 중심 결합이 포스포디에스테르인 키메릭 ODN이나, 두 개의 5' 및 다섯 개의 3' 결합은 변성된 포스포로티오에이트이다; MP-O-ODN은 중심 결합이 포스포디에스테르인 키메릭 ODN이나, 두 개의 5' 및 다섯 개의 3' 결합은 변성된 메틸포스포네이트이다. 연구된 ODN 배열(밑줄로 표시한 CpG 디누클레오타이드)은 다음을 포함한다.
3D(5" GAGAACGCTGGACCTTCCAT),(SEQ.ID.NO.14);
3M(5' TCCATGTCGGTCCTGATGCT),(SEQ.ID.NO.31);
5(5' GGCGTTATTCCTGACTCGCC),(SEQ.ID.NO.57); 및
6(5' CCTACGTTGTATGCGCCCAGCT),(SEQ.ID.NO.58).
상기한 서열들은 이 연구 중에 시험한 실제의 수 백 CpG 및 non-CpG ODN을 나타낸다.
마우스.
Jackson 연구소(Bar Harbor, ME)에서 얻고, 특정 병원균이 없는 조건하에서 유지된 DBA/2 또는 BXSB 마우스는 본질적으로 동일한 결과를 가지는 5-10주된 림프구의 재료로 사용된다.
세포 증식 반응 측정법
세포 증식 반응 측정법에 있어서, 마우스 비장 세포는(5×104cells/100μl/well) 37℃ 및 10%(v/v) 열 불활성 태아 송아지 흉선(O-ODN의 실험에서 65℃ 또는 변성된 ODN을 사용한 실험에서 56℃로 가열됨), 1.5μM L-글루타민, 50μM 2-머캅토에탄올, 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신이 보완된 RPMI-1640 내의 5% CO2의 배양기에서 24시간 또는 48시간 동안 배양된다. 3H 우리딘 또는 티미딘 1μCi는 각 웰에 첨가되고, 세포는 추가 4시간 배양 후 수집된다. 필터는 신틸레이션 카운터로 계산된다. 3중 웰의 표준 편차는 5%미만이다. 결과는 도 6-8에 나타내었다.
실시예 11: NK 활성의 유도
포스포디에스테르 ODN은 오페론 테크놀로지(Alameda, CA)에서 구입했다. 포 스포로티오에이트 ODN은 Iowa 대학의 DNA 코어 기관 또는 Midland 보증 시약 회사(Midland TX)로부터 구입했다. E. coli(계통 B) DNA 및 송아지 흉선 DNA는 Sigma(St. Louis, MO)로부터 구입했다. 모든 DNA 및 IDN은 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1) 및/또는 에탄올 침전으로 추출하므로써 정제된다. Limulus 분석에 의해 ODN 내의 LPS 레벨은 12.5ng/mg 미만이고, E. coli 및 송아지 흉선 DNA는 DNA 내 LPS/mg를 2.5ng 미만으로 포함한다.
바이러스없는 4-6주된 DBA/2, C57BL/6(B6) 및 선천적 무흉선 BALB/C 마우스는 국제 암 협회(Bethesda, MD)로부터 Veterans Affairs를 통한 접촉으로 얻었다. C57BL/6 SCID 마우스는 Iowa 동물 보호 단체의 대학 내에 SPF 배리어 기관에서 혈액추출했다.
인간 말초 단핵 혈액 백혈구(PBMC)는 상기한 바와 같이 얻어진다(Ballas, Z. K. 등 (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z. K. 및 W. Rasmussen(1990) J. Immunol. 145:1039; Ballas, Z. K. 및 W. Rasmussen(1993) J. Immunol. 150:17). 인간 또는 마우스 세포는, 표지된 농도의 단독 배지 또는 CpG 또는 non-CpG ODN, 또는 E. coli 또는 송아지 흉선(50μg/ml)과 5% CO2 의 24-well 플레이트(Ballas, Z. K. 등 (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z. K. 및 W. Rasmussen(1990) J. Immunol 145:1039; 및 Ballas, Z. K. 및 W. Rasmussen (1993) J. Immunol, 150:17) 내에 37℃, 5×106/well에서 24시간 동안 배양된다. 모든 배양균은 18시에 수집되며, 세포는 표준 4시 내에 작용인자로 사용된다. K562(인간) 또는 YAC-1(마우스) 표적 세포에 대한 51Cr 유리 분석은 상기한 바와 같다. 용균 단위(LU)의 계산에 있어서, 1LU는 30% 특정 용균에 영향을 주는데 필요한 세포의 수로서 정의된다. 나타낸 바와 같이, IFN-β(Lee Biomolecular, San Diego, CA) 또는 IL-12(C15.1, C15.6, C17.15; Dr. Giorgio Trinchieri, Wistar Institute, Philadelphia, PA에 의해 제공됨) 또는 그 이소타입 제어에 대한 중화항체는 10μg/ml 농도의 배양 초기에 첨가된다. 안티-IL-12 첨가에 있어서, 각 4MAB(이소타입 억제)의 10μg는 동시에 첨가된다. 제조합체 인간 IL-2는 농도 100U/ml에서 사용된다.
실시예 12: 천식의 마우스 모델에 있어서 염증 세포 침윤 및 호산구증다증의 발생 예방
6-8주 된 C56BL/6 마우스(Jackson 연구소, Bar Harbor, ME)는 0 및 7일에 인트라페리토니알(i.p.) 주사에 의해 5,000 스키스토소마 만소니 부화란으로 면역된다. 스키스토소마 만소니 부화란은 Th2 면역 반응(예를 들어, IgE 항체의 생성)을 유도하는 항원(스키스토소마 만소니 부화란 항원(SEA))을 함유한다. IgE 항체 생성은 천식의 중요한 원인으로 알려져 있다.
면역된 마우스는 메틸화 되지 않은 CpG 모티프(예를 들어, TCCATGACGTTCCTGACGTT; SEQ ID NO. 10)를 포함하거나 포함하지 않은(예를 들어 억제, TCCATGAGCTTCCTGAGTCT; SEQ ID NO. 11) 올리고누클레오타이드(i. p. 주사에 의한 200μl 생리식염수 중 30μg)로 처리된다. 가용성 SEA(생리식염수 25μl 중 10μg)는 14 및 21일에 비강내 적하에 의해 투여된다. 생리식염수는 제어로 사용된다.
마우스는 공기법 시도 후 여러 차례 도살된다. 전 폐 세척은 공기 및 치조 염증 세포를 수집하도록 수행된다. 시토킨 레벨은 ELISA에 의한 세척액으로부터 측정된다. RNA는 노선 분석 및 CsCl 구배를 이용하는 RT-PCR 연구로서 전 폐로부터 분리된다. 폐는 히스톨로직 검사에 있어서 4% 파라포름알데히드로 팽창 및 관류된다.
도 9는 마우스에 부화란 i. p. 으로 초기 주사하고, 부화란 항원(오픈 사이클)을 흡입했을 때, 많은 염증 세포가 폐에 존재함을 나타낸다. 그러나, 마우스에 초기 부화란이 붙은 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 핵산이 부여됐을 때, 폐 속의 염증 세포는 부화란 항체(오픈 트라이앵글)의 다음 흡입에 의해 증가되지 않는다.
도 10은 폐 세척 내에 존재하는 호산구만을 측정했을 때 동일한 결과가 얻어짐을 나타낸다. 호산구는 천식과 매우 밀접하게 관련된 염증 세포의 유형이다.
도 11은 마우스가 부화란에 초기 조사시에 억제 올리고로 처리될 때, SEA의 흡입 후 폐로의 호산구 유입의 작은 영향을 나타낸다. 따라서, 마우스가 14 또는 21일에 부화란을 흡입했을 때, 그들이 폐 내의 급성 염증 반응을 발생시킨다. 그러나, 마우스가 14일에 부화란 항원을 흡입했을 때, 0 및 7일에 초기 항원 조사시에 부화란과의 CpG 올리고부여는 거의 호산구의 증가를 완전히 폐지한다.
도 12는 올리고누클레오타이드(<10μg)의 매우 낮은 양이 이 프로텍션을 부여하는 것을 나타낸다.
도 13은 합성 염증 반응이 폐 내의 Th2 시토킨 IL-4의 레벨과 관련이 있음을 나타낸다.
도 14는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고누클레오타이드의 투여가, 실제로 면역 반응의 Th1 유형을 나타내고, II-12의 생성으로 가는 폐의 시토킨 반응으로 직접 갈 수 있음을 나타낸다.
도 15는 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 함유하는 올리고누클레오타이드의 투여가, 면역 반응의 Th1 유형을 나타내고, IFN-γ의 생성으로 가는 폐의 시토킨 반응으로 직접 갈 수 있음을 나타낸다.
실시예 13: CpG 올리고누클레오타이드의 인간 PBMC의 시토킨 분비 유도
인간 PBMC는 피콜 히파크 상의 표준 원심분리에 의해 전 혈액으로부터 준비된다. 세포(5×105/ml)는, TNF-α인 경우 4시간 또는 상청 수집 및 분석 전 다른 시토킨에 있어서는 24시간 동안 CpG 또는 억제 올리고데옥시누클레오타이드(24μg/ml 포스포디에스테르 올리고누클레오타이드; 6μg/ml 누클레아제 레지스턴트 포스포로티오에이트 올리고누클레오타이드)와 96웰 마이크로타이터 플레이트 내의 10% 자가 세럼에서 배양되고, 퀀티킨 킷 또는 R&D 시스템(pg/ml)의 시약 또는 Biosource(IL-12 검정)의 시토킨 ELISA를 사용하는 ELISA에 의해 측정된다. 분석은 제조업자의 지시에 따라 수행된다. 데이터는 웰에서 무첨가 올리고데옥시누클레오타이드와 상기한 시토킨의 레벨과 같이 표 6에 나타내었다.
이 분야에 종사하는 사람은, 오로지 지금까지 기술한 발명의 특정 실시예의 상당, 일상적인 실험에 지나지 않는다는 것을 확인할 수 있거나 깨달을 것이다. 이 러한 상당물은 다음의 청구항에 포함된다.

Claims (76)

  1. 2 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하고, 하기식
    5'N1X1X2CGTTN23'
    을 포함하는 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 인산염 골격 변형을 갖는 1 이상의 인터뉴클레오티드 결합을 포함하고; 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT 또는 ApT이고; N1은 5' TC 또는 TG를 포함하는 뉴클레오티드이고; N1 및 N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2는 0~26 염기이고; 길이로 8~30 염기인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  2. 2 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하고, 객체의 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 사용되고, 하기식
    5'N1X1X2CGTTN23'
    을 포함하는 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드로서,
    1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT 또는 ApT이고; N1은 5' TC 또는 TG를 포함하는 뉴클레오티드이고; N1 및 N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2는 0~26 염기이고; 길이로 8~30 염기인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N1은 5' TC를 포함하는 뉴클레오티드임을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2 이상의 연속적인 CpG가 티민에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  5. 제3항에 있어서, 5'TC 다음에 바로 GTCGT 모티프가 이어지는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  6. 제2항에 있어서, 항원(antigen)을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 합성된 것임을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  8. 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 인산염 골격 변형을 갖는 1 이상의 인터뉴클레오티드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  9. 제1항 또는 제8항에 있어서, 인산염 골격 변형이 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 GTCGCT 또는 GTCGTT 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 팰린드롬(palindrome) 구조가 아닌 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  13. 서열 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 를 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  14. 하기 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드:
    TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT
    TCCTGTCGTTCCTGTCGTT
    TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT
    TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT
    TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT
    TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT
    TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT
    TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT
    TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TCGTCGTCGTCGTT 및
    TGTCGTTGTCGTT.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 인산염 골격 변형을 갖는 1 이상의 인터뉴클레오티드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 인산염 골격 변형이 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  17. 제15항에 있어서, 각각의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 면역자극 올리고뉴클레오티드.
  18. 제1항, 제2항, 제8항, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 핵산 운반 복합체를 형성하기 위한 스테롤, 양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜을 포함하는 조성물.
  19. 제1항, 제2항, 제8항, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항의 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 조성물.
  20. 제1항, 제2항, 제8항, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  21. 제1항, 제2항, 제8항, 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항의 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 객체의 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 사용되는 면역체계 자극용 약물.
  22. 제21항에 있어서, 암 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  23. 제21항에 있어서, 세포독성 림프구 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 약물.
  24. 제21항에 있어서, 바이러스, 곰팡이, 박테리아 또는 기생충 감염의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  25. 제21항에 있어서, 백신에 대한 반응을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약물.
  26. 제21항에 있어서, 면역 활성을 촉진하는 보조제(adjuvant)인 것을 특징으로 하는 약물.
  27. 제21항에 있어서, 알레르기의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  28. 제21항에 있어서, 천식의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  29. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 알레르겐과 함께 투여되지 않으며, 천식의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  30. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 경구투여용이며, 천식의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  31. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 알레르겐과 함께 투여되지 않으며, 알레르기의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  32. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 경구투여용이며, 알레르기의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  33. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 습진, 알레르기성 비염, 코감기, 건초열, 두드러기 또는 음식 알레르기의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가 하기식으로 표시되는 CpG 모티프를 포함하는 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 약물:
    5'N1X1CGX2N23'
    1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1은 아데닌, 구아닌 또는 티민이고; X2는 시토신 또는 티민이고; N은 뉴클레오티드이고, N1 및 N2가 CCGG쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2가 0~26 염기이고; 올리고뉴클레오티드는 길이에서 8~30 염기이다.
  35. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가 하기식으로 표시되는 CpG 모티프를 포함하는 것임을 특징으로 하는 약물:
    5'NX1X2CGX3X4N3'
    1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT, GpG, GpA, ApT 및 ApA로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; X3X4는 TpT 또는 CpT로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; N은 뉴클레오티드이고, N1 및 N2가 CCGG쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 포함하지 않을 경우, N1 및 N2는 0~26 염기이고; 올리고뉴클레오티드는 길이에서 8~30 염기이다.
  36. 제35항에 있어서, X1X2는 GpT, GpG, GpA 및 ApA로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X3X4는 TpT, CpT 및 GpT로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물.
  37. 제34항에 있어서, 약물이 천식의 치료용일 때 면역자극 올리고뉴클레오티드가 하기 서열을 포함하는 것임을 특징으로 하는 약물:
    (a) GTCG(T/C)T 또는 TGACGTT;
    (b) TGTCG(T/C)T.
  38. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 길이에서 8~30 염기인 것을 특징으로 하는 약물.
  39. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 5' 말단에 TC 또는 TG 를 갖는 것을 특징으로 하는 약물.
  40. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 1 이상의 티민에 의해 분리되는 2 이상의 연속적인 CpG를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  41. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 팰린드롬 CpG 모티프를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 약물.
  42. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 약물.
  43. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 인산 골격 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  44. 제43항에 있어서, 인산 골격 변형이 포스포로티오에이트 변형 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  45. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 약물.
  46. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 합성된 것임을 특징으로 하는 약물.
  47. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 안정화된 것임을 특징으로 하는 약물.
  48. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 항체 의존성 세포의 세포독성 효과를 증진시키는 것에 의한, 암종 또는 육종의 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  49. 제48항에 있어서, 암종이 뇌, 폐, 난소, 유방, 전립선 또는 결장의 암인 것을 특징으로 하는 약물.
  50. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 화학요법의 적용과 동시 또는 적용 후에 투여되어 그 이후의 화학요법 또는 면역요법에 대한 악성세포의 반응성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약물.
  51. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 면역요법 적용 전, 적용과 동시 또는 적용 후에 투여되어 그 이후의 화학요법 또는 면역요법에 대한 악성세포의 반응성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약물.
  52. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 화학요법 또는 면역요법의 적용 전, 적용과 동시 또는 적용 후에 투여되어 골수의 회복을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약물.
  53. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, B형 간염 바이러스 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  54. 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 포함하며, C형 간염 바이러스 치료용인 것을 특징으로 하는 약물.
  55. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 2 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하고, 하기식
    5'N1X1X2CGTTN23'
    을 포함하는 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드로서,
    상기 면역자극 올리고뉴클레오티드는 인산염 골격 변형을 갖는 1 이상의 인터뉴클레오티드 결합을 포함하고; 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT 또는 ApT이고; N1은 5' TC 또는 TG를 포함하는 뉴클레오티드이고; N1 및 N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2는 0~26 염기이고; 길이로 8~30 염기인 것을 특징으로 하는 약물.
  56. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤, 양이온성 지질, 비로솜 또는 리포솜을 포함하여 핵산 운반 복합체 또는 약학적으로 허용가능한 운반체를 형성하는 약물.
  57. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  58. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  59. 제22항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  60. 제22항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  61. 제23항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  62. 제23항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  63. 제24항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  64. 제24항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  65. 제25항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  66. 제25항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  67. 제26항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  68. 제26항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  69. 제27항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  70. 제27항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  71. 제28항에 있어서, 인간에게 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  72. 제28항에 있어서, 1 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 경구적으로, 경피적으로 또는 피하, 정맥, 비경구, 복강내, 척수강내 주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 약물.
  73. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 2 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하고, 객체의 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 사용되고, 하기식
    5'N1X1X2CGTTN23'
    을 포함하는 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드로서,
    1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT 또는 ApT이고; N1은 5' TC 또는 TG를 포함하는 뉴클레오티드이고; N1 및 N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2는 0~26 염기이고; 길이로 8~30 염기인 것을 특징으로 하는 약물.
  74. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 2 이상의 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하고, 객체의 질환을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 사용되고, 하기식
    5'N1X1X2CGTTN23'
    을 포함하는 서열을 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드로서,
    1 이상의 뉴클레오티드가 연속적인 CpG를 분리시키고; X1X2는 GpT 또는 ApT이고; N1은 5' TC 또는 TG를 포함하는 뉴클레오티드이고; N1 및 N2가 CCGG 쿼드머 또는 하나 이상의 CCG 또는 CGG 트라이머를 함유하지 않는 경우에, N1+N2는 0~26 염기이고; 길이로 8~30 염기이며, 인산염 골격 변형을 갖는 1 이상의 인터뉴클레오티드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  75. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 서열 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 를 갖는 것을 특징으로 하는 약물.
  76. 제29항 내지 제33항 또는 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 올리고뉴클레오티드가, 하기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약물:
    TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT
    TCCTGTCGTTCCTGTCGTT
    TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT
    TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT
    TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT
    TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT
    TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT
    TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT
    TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TGTCGTTGTCGTTGTCGTT
    TCGTCGTCGTCGTT 및
    TGTCGTTGTCGTT.
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