DE102006050655A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Allergen sowie eine RNA in physiologisch wirksamer Dosis.

Description

  • Gebiet der Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Allergen und zumindest einem weiteren physiologisch wirksamen Stoff, die Verwendung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder zur Prevention bzw. Prophylaxe einer allergischen Reaktion, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung sowie ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prevention einer allergischen Erkrankung.
  • Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
  • Immunkrankheiten entstehen, wenn Immunreaktionen zu einer Schädigung von Körperzellen führen. Zu den Immunkrankheiten gehören die Überempfindlichkeits-reaktionen, zu welchen wiederum die Allergien gehören, die sogenannten Überempfindlichkeiten des Soforttyps bzw. des Typs I. Allergien werden durch Kontakt mit Antigenen bzw. Allergenen ausgelöst und können zu Krankheitsbildern führen, welche von unangenehmen Reaktionen bis hin zum lebensbedrohlichen anaphylaktischen Schock reichen. Bei einer allergischen Erkrankung binden nach Erstkontakt einer Person mit dem Allergen hierfür spezifische IgE Antikörper über einen hoch affinen Oberflächenrezeptor der CH4-Domäne an Mastzellen bzw. an basophile Zellen. Hierdurch sind die Mastzellen sensibilisiert. Ein weiterer Kontakt mit dem Allergen führt zur Quervernetzung der IgE Antikörper auf den Zellen, Degranulation der Zellen und dadurch zur Freisetzung von allergischen Mediatoren, insbesondere von Histamin und Serotonin. Diese Mediatoren verursachen letztendlich eine Ausdehnung der Blutgefäße und Kontraktion glatter Muskelzellen, beispielsweise des Bronchialtraktes, wodurch die typischen Symptome der allergischen Reaktion, wie Atemschwierigkeiten, gerötete Haut, starke Schleimproduktion, Niesen und juckende sowie tränende Augen, auftreten.
  • Allergische Reaktionen lassen sich auf verschiedene Weisen verhindern bzw. behandeln. Zum ersten kann ein Kontakt mit dem Allergen bzw. Antigen vermieden werden. Zum zweiten kann eine medikamentöse Behandlung bei Auftreten der allergischen Reaktion erfolgen, beispielsweise durch β-adrenerge Wirkstoffe, wie Adrenalin oder Isoprotenerol. Solche Wirkstoffe führen zu einer Anhebung der intrazellulären cAMP Konzentration, die ihrerseits die Histaminfreisetzung verhindert. Andere Wirkstoffe, wie beispielsweise Dinatrium cromoglycat oder Nedocromil (Antiparasitikum), verhindern eine Kontaktierung zwischen dem Antigen und den IgE Antikörpern auf den Mastzellen und so die Freisetzung der allergischen Mediatoren. Schließlich ist die therapeutische Strategie bekannt, die Bildung von Targetmolekülen, die mit einer allergischen Reaktion assoziiert sind, zu inhibieren. Hierzu ist es beispielsweise aus der Literaturstelle DE 10 2004 026 309 A1 bekannt, dass die Bildung des Transkriptionsfaktors Stat6 durch eine inhibitorische RNA unterdrückt wird. Stat6 ist u.a. für die intrazelluläre Signaltransduktion des Interleukins IL-13 essentiell. IL-13 stimuliert u.a. die Schleimproduktion in Lungenepithelzellen.
  • Des Weiteren besteht ein Therapieansatz darin, zunächst das Allergen bzw. das Antigen zu identifizieren und dann damit eine Desensibilisierung durchzuführen. Diese Allergenspezifische Immuntherapie führt u.a. zur Induktion von Toleranz gegen das Allergen durch Stimulation regulatorischer T-Zellen, zum Anstieg Allergen-bindender IgG, zur Induktion von die IgE-Bildung modulierenden CD8+ T-Zellen, zur Verminderung der Mastzellen und eosinophilen Granulozyten sowie zur erniedrigten Produktion der von T-Helferzellen des Type 2 gebildeten Cytokine. Insgesamt wird eine erhöhte Immuntoleranz induziert.
  • Die klassischen medikamentösen Therapieansätze können nur die Symptome lindern. Die Langzeittherapie ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Die Desensibilisierung ist aufwändig und ihr therapeutischer Erfolg dennoch erheblich verbesserungsfähig.
  • Technisches Problem der Erfindung.
  • Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, verbesserte Mittel zur Behandlung von allergischen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
  • Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
  • Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine RNA, insbesondere eine synthetische und/oder nicht-natürliche RNA, und ein hiervon verschiedenes definiertes Allergen, jeweils in physiologisch wirksamer Dosis. Die RNA ist dabei insbesondere verschieden von allen in dem Allergen eventuell natürlicherweise vorkommenden RNAs.
  • Der Begriff des Allergens schließt auch (isolierte) Epitope von Allergenen, rekombinante Allergene, hypoallergene Derivate, Hybridmoleküle und Gemische von Allergenen im vorstehenden Sinne ein. Des Weiteren sind von dem Begriff des Allergens auch Antigene im allgemeinsten Sinne umfasst.
  • Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass die kombinierte Gabe eines Allergens, für welches eine Person sensibilisiert ist, mit einer RNA eine besonders effektive Desensibilisierung des Immunsystems der Person bewirkt. Hierbei kann die RNA unspezifisch sein und wie ein Adjuvans funktionieren. Es ist aber auch möglich, dass die RNA an den Toll-like Rezeptor bindet. Schließlich ist es möglich, dass die RNA spezifisch für ein Targetmolekül ist, dessen Expression in einer Zelle mit einer allergischen Reaktion gegen das Allergen einhergeht. In diesem Falle modifiziert die RNA die Expression des Targetmoleküls durch die Einflussnahme auf die Transkription, die Translation, oder die Bindung an das Targetmolekül oder auf den Abbau der Target-RNA.
  • Als Targetmoleküle für die RNA kommen u.a. in Frage: Interleukine und ihre Rezeptoren (z.B. IL-4, IL-5, IL-13), Transkriptionsfaktoren (z.B. Stat6, GATA3), Chemokine und ihre Rezeptoren (z.B. Eotaxin, TARC), Protein-Kinasen (z.B. Lyn, Syk), Toll-Like Rezeptoren (z.B. TLR3, TLR8).
  • Die RNA kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus „RNA-Interferenz (RNAi)-induzierenden Moleküle siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA, katalytische RNA, der Decoys und der Aptamere". RNAi-Moleküle, wie small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA) und lange, doppelsträngige RNA (dsRNA), sowie katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, sind geeignet, die Expression von Genen durch Degradation der Target-RNA zu inhibieren. Die zelluläre, unter der Wirkungen des Enzyms Dicer erfolgende Spaltung von dsRNA und miRNA führt zur Bildung von siRNA, d.h. kurzer, ca. 21 Nukleotide langer, doppelsträngiger RNA mit 3'-terminalen Einzelstrangüberhängen. Exogen applizierte synthetische oder unter Verwendung von Vektoren generierte siRNA, shRNA oder miRNA verfügt über Wirkungen, die der durch zelluläre Mechanismen gebildeten siRNA entspricht. RNAi-Moleküle inhibieren die Expression von Genen in Zellen und lassen sich anhand der bekannten Sequenzen der für Targetmoleküle codierenden zellulären Nukleinsäuren modellieren. Katalytische Nukleinsäuren verfügen sowohl über eine Nukleinsäure-Sequenz, welche die katalytische Reaktion realisiert, als auch über eine Nukleinsäure-Sequenz, die spezifisch an die Target-Nukleinsäure bindet. Es wird insbesondere zwischen aus Ribonukleotiden und aus Desoxyribonukleotiden aufgebauten Ribozymen bzw. DNAzymen unterschieden. Vertreter der Ribozyme mit Eindungs-spezifischer RNA-Spaltung sind das Hammerhead, Hepatitis deta Virus, Hairpin und VS Ribozym bzw. mit selbstspaltenden Eigenschaften sind die Group 1 Intron, Group II Intron und das Ribonuklease P Ribozym; Vertreter der DNAzyme sind z.B. das 10-23- und das DEC22-18 DNAzym sowie das Zn2 +-abhängige, Imidazol enthaltende DNAzym (J.Am.Chem.Soc. 122 (2000) 2433), das LANzym (J.Am.Chem.Soc. 124 (2002) 13682) oder das Metall-unabhängige, imidazo- und kationisches Amin-enthaltende DNAzym (J.Am.Chem.Soc. 124 (2002) 9960). Diese katalytischen Nukleinsäuren spalten RNA. Die Sequenzabschnitte der Spaltung sind charakteristisch für die katalytische Nukleinsäure. Die Spaltung der Target-RNA führt zur Hemmung der Genexpression. Decoys sind Nukleinsäuren, die an DNA-Bindungsstellen von Proteinen binden. Aptamere sind Nukleinsäuren, die spezifisch an Verbindungen, z.B. an ein Protein oder Peptid, binden. Aptamere gegen eine Verbindung lassen sich beispielsweise mittels des SELEX Verfahren identifizieren und amplifizieren. RNAi-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren können durch kommerzielle RNA- oder DNA-Synthese sowie unter Verwendung von Vektoren, die u.a. Expressionskassetten mit eukaryontischen U6/H 1 -Promotoren (Ambion) oder prokaryontischen T7/T3/SP6-Promotoren enthalten, hergestellt werden. Ihre Stabilität in Stoffwechsel-aktiven Systemen wird durch die Einführung chemischer Modifikationen erhöht. Die Modifikationen erfolgen u.a. als Substitution der Phosphat-Reste durch Phosphorothioate, der 2'-OH-Gruppe der Zucker-Ribonukleotide durch 2'-O-Methyl, 2'-O-Allyl oder 2-Amino sowie durch Einführung von Desoxyribonukleotiden, z.B. von 3'-terminalen Desoxy-Thymidinen in den Einzelstrangüberhängen der siRNA oder in den Bindungsarmen der Ribozyme, oder von 3',3'-invertierten Desoxyribonukleotiden. RNAi-Moleküle und Nukleinsäuren, insbesondere durch chemische Modifikation stabilisierte Derivate, können direkt oder unter Verwendung von Transfektionsreagentien sowie von Vektoren in Zellen, Geweben, Organen oder Organismen zur Wirkung gebracht werden.
  • Das Allergen bzw. Antigen kann ausgewählt sein aus der Allergen-Gruppe der Pflanzen und Pflanzenteile, wie von Gräsern und Bäumen (z.B. Pha a 1, Bet v 1.0101), der Tiere und Tierteile (z.B. Bla g 1, Can f 1), der Mikroorganismen, wie Schimmelpilze (z.B. Asp f 1, Asp fl 139), der Insekten (z.B. Bom p 1) und der Hausstaubmilbe (z.B. Der f 1, Der f 2.0108), der Nahrungsmittel, der chemischen Substanzen sowie der Heilmittel bzw. pharmazeutischen Substanzen. Der Begriff des Allergens ist dabei nicht auf die Substanzen an sich bezogen, sondern auf deren Funktion in Verbindung mit einer Sensibilisierung einer Person. Eine Substanz ist also nur dann ein Allergen, wenn eine bestimmte Person gegen das Antigen eine allergische Reaktion zeigt. Insofern ist der Begriff des Allergens auch personenspezifisch.
  • Im Einzelnen bestehen verschiedene Möglichkeiten der Kombination des Allergens mit der RNA. Einerseits können die RNA und das Allergen in Mischung vorliegen. Andererseits kann eine Koppelung des Allergens und der RNA erfolgen, beide sind konjugiert. In Falle der Koppelung kann eine covalente Bindung eingerichtet sein. Zur Bildung von Konjugaten zwischen Nukleinsäuren und anderen Substanzen wird beispielsweise auf die Literaturstelle US 2005/0153337 A1 verwiesen. Des Weiteren kann das Allergen mit RNA-bindenden Verbindungen (z.B. Histone, Polylysine, kationische Lipide) konjugiert bzw. fusioniert sein.
  • Des Weiteren lehrt die Erfindung die Verwendung einer RNA und eines Allergens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, insbesondere zur Desensibilisierung gegen das Allergen. Dabei können die beiden Wirkstoffkomponenten in separaten Zubereitungen oder in einer einzigen Zubereitung vorliegen.
  • Die allergische Erkrankung ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus „Asthma, atopische Dermatitis, Rhinitis und Pollinose, Erkrankungen der Lunge, wie Entzündungen, Bronchoobstruktion, pulmonale Vasokonstriktion, Bronchitis, Emphysem, Nesselfieber, Konjunktivitis".
  • Des weiteren lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, wobei eine RNA und ein definiertes Allergen miteinander in physiologisch wirksamer Dosis gemischt oder miteinander gekoppelt und optional unter Zugabe zumindest eines physiologisch verträglichen Hilfsstoffes und/oder Trägerstoffes galenisch hergerichtet wird.
  • Schließlich lehrt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung und/oder zur Desensibilisierung, wobei ein Allergen, gegen welches eine zu behandelnde Person eine allergische Reaktion zeigt oder droht zu zeigen, mit einer RNA in jeweils physiologisch wirksamer Dosis zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung hergerichtet und der Person dargereicht wird.
  • In aller Regel wird es sich empfehlen, dass die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich physiologisch verträgliche galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, Systeme zur sublingualen Darreichung, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet werden.
  • Als Dosis für die RNA kommt in Frage 0,005 bis 1000 mg, insbesondere 1 bis 500 mg, vorzugsweise 1 bis 100 mg bezogen auf eine erwachsene Person von 75 kg. Als Dosis für das Allergen kommt in Frage 1 bis 1000 μg, insbesondere 5 bis 200 μg. Hierbei handelt es sich nicht um eine kumulative Dosis (Gesamtmengen einer Behandlung) sondern um die Dosis einer einzelnen Darreichung. Die kumulative Dosis kann 1 bis 80, insbesondere 20 bis 50, vorzugsweise 25 bis 40, Darreichungen umfassen. Im Falle einer Rush Immunotherapie können die Darreichungen auf einen Zeitraum von 1 bis 30 Tage verteilt werden, wobei die Obergrenze der Anzahl der Darreichungen im Bereich außer, wie vorstehend angegeben alternativ auch bei 1 bis 20, beispielsweise bei 1 bis 10, liegen kann. Im Falle einer Standard-Immuntherapie, beispielsweise durch übliche s.c. Injektionen, können die Darreichungen auf 1 bis 60 Monate, insbesondere 12 bis 48 Monate verteilt werden. In der Regel wird eine zeitliche Verteilung etwa äquidistant sein.
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, wobei für das Verständnis wichtig ist, dass die beispielhaften RNAs und Allergene keineswegs bevorzugte Beispiele darstellen, sondern lediglich eine von vielen Möglichkeiten darstellen. Die beschriebenen RNAs können durch beliebige andere RNAs ersetzt werden, die der Durchschnittsfachmann unschwer nach Maßgabe des Targetmoleküls bzw. des Targetgens und seiner Sequenz erstellen kann. Ebenso kann das Allergen durch ein beliebiges anderes Allergen ersetzt sein, wobei die Auswahl des Allergens nach Maßgabe einer vorherigen Untersuchung des die Sensibilisierung der zu behandelnden Person verursachenden Allergens erfolgt.
  • Beispiel 1: Auswahl einer inhibitorischen RNA.
  • In diesem Beispiel ist zu Grunde gelegt, dass die RNA Stat6 als Targetmolekül inhibieren soll. Hierfür ist eine Vielzahl von Oligonukleotiden geeignet. Besonders geeignet sind doppelsträngige siRNA-Moleküle folgender grundsätzlicher Zusammensetzung:
    Sensestrang 5'-(N)19-23 (X)0-5
    Antisensestrang 5'-(N')19-23 (X)0-5
    wobei X, X' = Ribonukleotide, bevorzugt Thymidin und Desoxy-Thymidin, N = aufeinanderfolgende Ribonukleotide der mRNA-Sequenz des Stat6 (GI: 23397677, NCBI) beziehungsweise Teilsequenz der Länge 19 bis 23 aus der Stat6 Sequenz, und N' = ein zu diesem Sequenzabschnitt der stat6-mRNA komplementäres Ribonukleotid. Es sind auch Homologe zu den genannten Sequenzen mit einer Homologie von zumindest 80 %, vorzugsweise zumindest 90 % einsetzbar (berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum Anmeldezeitpunkt gültigen Fassung).
  • Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäß eingesetzten RNAs hybridisierende RNAs einsetzbar, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Doppelsträngige RNA-Moleküle, wie vorstehend angegeben, können a) integraler Bestandteil langer RNA-Moleküle, wie microRNA oder doppelsträngiger RNA, sein und aus diesen durch katalytische Spaltung, z.B. durch Dicer oder Target-spezifisches Ribozym bzw. DNAzym, generiert werden, und b) kurze, doppelsträngige RNA, wie shRNA, sein, die dem Wirkungsprinzip der vorstehenden siRNA folgen. Es kann sich auch um katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, handeln, die spezifisch an die stat6 mRNA binden, diese an den für Ribozyme und DNAzyme charakteristischen Bindungsstellen spalten und die Genexpression inhibieren.
  • Folgende siRNA und shRNA sind RNAi-Moleküle sind konkrete Beispiele zur Inhibierung der Expression der humanen stat6-mRNA:
    • ss1: Sensestrang 5'-UGCCUUCUCUGAGAUGGAC(tt) Antisensestrang 5'-GUCCAUCUCAGAGAAGGCA(tt)
    • ss2:Sensestrang 5'-ACGCUGUCUCCGGAGCUAC(tt) Antisensestrang 5'-GUAGCUCCGGAGACAGCGU(tt)
    • ss3: Sensestrang 5'-AGACCUGUCCAUUCGCUCA(tt) Antisensestrang 5'-UGAGCGAAUGGACAGGUCU(tt)
    • hs1: 5'-GACCCCCUGAAGCUGGUGGCUCUGCCACCAGCUUCAGGGGGUC(tt)
    • hs2: 5'-GUAAGCAAUATGUCACUAGCCACGCUAGUGACUTAUUGCUUAC(tt)
    • hs3: 5'-GCCAAAGACCUGUCCAUUCGAGACGAAUGGACAGGUCUUUGGC(tt)
  • Die vorstehenden Sequenzen sind in dieser Reihenfolge die Seq.-ID 1 bis 9. "t" steht hierbei für Desoxythymidin. Desoxythymidin dient der Stabilisierung der RNA und ist aber auch entbehrlich, weshalb diese Gruppen in Klammern als fakultativ angegeben sind. Die Herstellung der siRNA erfolgt durch Standardmethoden der RNA-Oligonukleotid-Synthese (Dharmacon) und die der shRNA durch in vitro Transkription unter Verwendung von T7-Promotor-Sequenz-enthaltenden Oligonukleotiden (BioTez) und T7-RNA-Polymerase (Promega).
  • Der Nachweis der Wirkung der inhibitorischen RNAs auf Stat6 wird wie folgt durchgeführt. Zunächst wird eine Transfektion von Zellen durchgeführt. Die Zelllinien HeLa, A549, L929, BaF3 sowie humane Hautfibroblasten werden mit siRNA und dem kationischen Transfektionsreagenz (Tfx-20, Tfx-50 bzw. DOTAP) mit einem Ladungsverhältnis von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Die siRNA-Konzentration beträgt 0,1 μM. Die Transfektionsreagenzien werden mit OptiMEM-Medium (Invitrogen) nach den Vorschriften der Hersteller eingesetzt. Der Nachweis der Wirkung der siRNA auf die stat6-Expression in Zellkulturen erfolgt durch quantitative mRNA-Bestimmung mit der real time PCR und semiquantitativer Stat6-Protein-Bestimmung mit dem Western blot. Acht Stunden nach Beginn der Transfektion wird die RNA mit dem RNeasy Kit (Qiagen) unter Einsatz von RNase-freier DNase 1 isoliert. Die cDNA-Synthese erfolgt mit dem SuperScript Reverse Transkriptase (RT) Kit (Invitrogen) unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers. Die real time PCR wird mit dem LightCycler (Roche) und dem FastStart DNA Master SYBRGreen 1 Kit (Roche) durchgeführt. Die stat6 mRNA-Expression wird unter Bezugnahme auf das konstitutiv exprimierte Referenzgen Pyruvat-Dehydrogenase quantifiziert. Zur Charakterisierung der Stat6-Proteinexpression werden die zellulären Proteine 48 Stunden nach Transfektion der Zellen durch Lyse gewonnen, mit der Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 7 % SDS aufgetrennt und Stat6 mit dem Western blot unter Verwendung des M20-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) auf der Trans-Blot Nitrocellulose-Membran (Bio-Rad) mit ECL-Detektion (Amersham) nachgewiesen. Die Inhibition der Proteinexpression des Stat6 in der humanen HeLa-Zelllinie durch siRNA ist in 1 dargestellt. 5 × 10^4 Hela-Zellen wurden in einer 12-well Mikrotiterplatte mit 0,1 μM siRNA und Tfx-20 mit einem Ladungsratio von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Nach 48 h wurden die Proteine extrahiert und mit einer 7,5 % SDS-PAGE aufgetrennt. Das Stat6 wurde durch Immunoblot mit dem M20-Stat6-Antikörper nachgewiesen. Spur 1, 2, 3, 4 und 5: Kontrolle ohne siRNA, Kontroll-siRNA, ss1, ss2 und ss3. 1 demonstriert, dass die siRNA ss3 noch wirksamer als ss1 und ss2 ist. Die siRNA ss3 ist auch in der humanen Lungenepithel-Karzinomzelllinie A549 und in der murinen pro-B-Zelllinie BaF3 und Lungenfibroblasten-Zelllinie L929 wirksam.
  • Beispiel 2: Auswahl eines Allergens
  • Eine Person, die in der Vergangenheit allergische Reaktionen zeigte, wird z.B. unter Verwendung des Prick-Testes auf das verursachende Allergen untersucht. Eine Substanz oder ein Extrakt eines die Substanz enthaltenen Gemisches wird auf eine Hautregion aufgetropft und anschließend durch Anstechen mit der Pricklanzette in die oberste Hautschicht eingeimpft. Die Allergen-sensibilisierte Person bildet innerhalb von ca. 15 Minuten an der Teststelle eine Quaddel aus, die zumeist von einer Rötung (Erythem) umgeben ist. Somit ist die Substanz als Allergen identifiziert, z.B. das Birkenpollenprotein Bet v 1.
  • Beispiel 3: Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Eine inhibitorische RNA gemäß Beispiel 1 wird mit dem Allergen gemäß Beispiel 2 sowie galenischen Hilfsstoffen gemischt, wobei die erhaltende Zubereitung in einer Gabeeinheit eine Dosis der inhibitorischen RNA von 5 bis 5000 μg und eine Dosis des Allergens von 5 bis 200 μg enthält. Die Zubereitung ist als s.c. Injektionslösung oder System zur sublingualen Gabe hergerichtet.

Claims (10)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine synthetische und/oder nicht-natürliche RNA und ein hiervon verschiedenes definiertes Allergen jeweils in physiologisch wirksamer Dosis.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die RNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus „RNAi, siRNA, shRNA, miRNA, dsRNA, katalytische RNAs, Ribozyme und DNAzyme".
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die RNA spezifisch für ein Targetmolekül ist, dessen Expression oder Überexpression in einer Zelle mit einer allergischen Reaktion gegen das Allergen einhergeht.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die inhibitorische RNA unspezifisch ist, oder wobei die RNA an den Toll-like Rezeptor bindet, oder wobei die RNA spezifisch für ein Targetmolekül ist, dessen Expression in einer Zelle mit einer allergischen Reaktion gegen das Allergen einhergeht.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Allergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus „Pflanzen und Pflanzenteile, wie von Gräsern und Bäumen (z.B. Pha a 1, Bet v 1.0101), Tiere und Tierteile (z.B. Bla g 1, Can f 1), Mikroorganismen, wie Schimmelpilze (z.B. Asp f 1, Asp fl 139), Insekten (z.B. Bom p 1), Hausstaubmilbe (z.B. Der f 1, Der f 2.0108), Nahrungsmittel, synthetische chemischen Substanzen, und pharmazeutischen Substanzen".
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die RNA und das Allergen in Mischung oder miteinander gekoppelt enthaltend sind.
  7. Verwendung einer RNA und eines Allergens zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, insbesondere zur Desensibilisierung gegen das Allergen.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die allergische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus „Asthma, atopische Dermatitis, Rhinitis und Pollinose, Erkrankungen der Lunge, wie Entzündungen, Bronchoobstruktion, pulmonale Vasokonstriktion, Bronchitis, Emphysem, Nesselfieber, Konjunktivitis".
  9. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, wobei eine RNA und ein definiertes Allergen miteinander in physiologisch wirksamer Dosis gemischt oder miteinander gekoppelt und optional unter Zugabe zumindest eines physiologisch verträglichen Hilfstoffes und/oder Trägerstoffes galenisch hergerichtet wird.
  10. Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung und/oder zur Desensibilisierung, wobei ein Allergen, gegen welches eine zu behandelnde Person eine allergische Reaktion zeigt oder droht zu zeigen, mit einer RNA in jeweils physiologisch wirksamer Dosis zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung hergerichtet und der Person dargereicht wird.
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