DE10005643A1 - Kombination eines Antigens mit einem Sulphatase-Inhibitor - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel, umfassend Inhibitoren der Steroid-Sulphatase in Kombination mit einem Antigen zur Verbesserung und Optimierung der Toleranzinduktion.

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend ein Antigen und einen Sulphatase-Inhibitor. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Arzneimittel für die Induktion von Toleranz, umfassend Inhibitoren der Steroid Sulphatase (SS) in Kombination mit einem Antigen.

Das Immunsystem zeichnet sich durch die Eigenschaft aus, zwischen gefährlichen, krankheitsfördernden körpereigenen und/oder körperfremden und ungefährlichen Antigenen unterscheiden zu können.

Als Toleranz wird dabei der Zustand bezeichnet, der sich durch systemische "Passivität" oder auch "Ignoranz" des Immunsystems gegenüber einem spezifischen Antigen auszeichnet. Dabei spielt es keine Rolle, ob dieses Antigen körpereigen (Selbstantigene) oder körperfremd ist. Ein Zusammenbruch der Toleranz führt, wenn körpereigene Antigene kontinuierlich eine Immunabwehr aufrecht erhalten, zu Autoimmunerkrankungen. Überreaktionen gegen per se nicht krankheitsfördernde Umweltantigene werden unter dem Begriff Allergien zusammengefasst. Im Bereich der Transplantationsmedizin spricht man bei unerwünschten Immunreaktionen von einer Abstoßungsreaktion gegen das Transplantat oder, im Falle einer Abwehrreaktion des transplantierten Materials gegen den Empfänger, von "Graft versus Host Disease" (GVHD).

Die Qualität der immunologischen Toleranz ist abhängig von der Art des Antigens, sowie von der Form und Dosis, mit welcher es dem Immunsystem präsentiert wird.

Man nimmt an, dass Toleranz auf mindestens drei verschiedenen Mechanismen basieren kann. Zum einen werden gefährliche, potentiell autoreaktive T-Zellen, die im Thymus mit dort vorhandenen Antigenen reagieren, negativ selektiert, d. h. sie werden abgetötet (Deletion). Ein weiterer Mechanismus ist die klonale Anergie. Dabei werden T-Zellen, die zwar ein Antigen auf einer antigenpräsentierenden Zelle erkennen, jedoch nicht bei gleichzeitig vorhandenen costimulatorischen Signalen, deaktiviert und können gegen dieses Antigen auch später keine Immunreaktion mehr hervorrufen. Einen dritten Bestandteil der Toleranz bilden vermutlich regulatorische T-Zellen, sogenannte Suppressor-T- Zellen, welche immunmodulatorisch auf bereits ausgelöste immunologische Vorgänge wirken können.

Im Falle einer Immunreaktion z. B. bei der Eliminierung eines Virus oder auch bei unspezifischen Entzündungen tragen regulatorische T-Zellen zur Wiederherstellung eines immunologischen Gleichgewichts und zur Beendigung der Immunreaktion bei. Ein Mangel an Selbstregulation aus ungeklärter Ursache oder die Behinderung derselben, z. B. durch Medikamente, kann zu einem pathologischen Zustand, wie etwa Autoimmunität oder Allergien, oder zu einer unerwünschten Immunreaktion im Bereich der Transplantationsmedizin führen.

Autoimmunerkrankungen stellen eine Situation dar, in der die Toleranz ganz oder teilweise zusammengebrochen ist. Sie verlaufen beim Menschen in der Regel chronisch degenerativ. Eine Remission, spontan oder unter immunsuppressiver Therapie, ist bisher nur selten zu beobachten. Je länger der Krankheitsprozess andauert, desto schwieriger scheint es, den Circulus Vitiosus der chronisch degenerativen Entzündung zu durchbrechen. Mechanismen wie das sog. Epitop- Spreading scheinen dabei eine wichtige Rolle zu spielen (Craft und Fatenejad 1997; Kumar 1998, Moudgil 1998; Vaneden, Vanderzee et al. 1998).

Orale Toleranz beruht auf der Tatsache, dass oral aufgenommene Antigene in der Regel keine Immunreaktionen hervorrufen und zudem verhindern, dass dasselbe Antigen eine Immunreaktion zur Folge hat, wenn es zu einem späteren Zeitpunkt über eine normalerweise Immunreaktionen erzeugende Route in den Organismus gerät. Dies führte zu intensiven Versuchen, durch die Präsentation (insbesondere durch mukosale Verabreichung) eines geeigneten spezifischen Antigens oder eines anderen Antigens, welches eine dem krankheitsrelevanten Antigen ähnliche Immunreaktion bewirkt, den Zustand der Toleranz zu modifizieren bzw. wieder herzustellen (Liblau, Tisch et al. 1997; Weiner 1997; Strobel und Mowat 1998).

In der Medizin spielt die Toleranzinduktion eine zunehmend größere Rolle, insbesondere bei der Bekämpfung von Autoimmunkrankheiten, weiterhin bei der Desensibilisierung gegen Umweltantigene, wie etwa bei der Behandlung von Heuschnupfen und anderen Allergien.

Neueste Erkenntniss schreiben der Induktion von Toleranz auch Bedeutung im Bereich der klassischen Impfung zu (McSorley 1999)

Moderne immunsuppressive Therapien weisen jedoch immer noch erhebliche Nebenwirkungen auf und sind unzureichend, wenn die Krankheit bereits eingesetzt hat, d. h sie bringen keine Heilung.

Der Erfolg der Toleranzinduktion oder Immunmodulation hängt nach derzeitigem Wissensstand sowohl von der Art der Präsentation des Antigens als auch von dem immunologischen Milieu des Gewebes/Organismus in dem die gewünschte Immunreaktion ablaufen soll ab.

Bezüglich der immunologischen Abläufe, die zur Toleranzinduktion in vivo führen, werden verschiedene Theorien zum Teil sehr kontrovers diskutiert.

Bisher ging man davon aus, dass Toleranz und insbesondere oral induzierte Toleranz mit bestimmten Cytokinmustern zusammenhängt. Diese Cytokinmuster lassen wiederum auf verschiedene T- Helferzellpopulationen schließen. Man unterscheidet Th1-, Th2- und neuerdings auch Th3-Zellen. So wird im allgemeinen angenommen, dass Autoimmunität hauptsächlich von Th1-Zellen und Toleranz mehr von Th2-Zellen dominiert ist. Allerdings konnte gezeigt werden, dass eine immunologische Toleranz im Tiermodell auch in Abwesenheit von funktionellen Th1- und Th2-Zellen aufrechterhalten werden kann.

Einige Fachleute gehen davon aus, dass bei hohen Dosen eines mukosal verabreichten Antigens autoreaktive T-Zellen, die das jeweilige Antigen erkennen, selektiv eliminiert werden (klonale Eliminierung) (Gutgemann, Fahrer et al. 1998). Bei der Anwendung niedriger Antigendosen geht diese Theorie von der Induktion regulatorischer T-Zellen aus, welche die pathologische Immunreaktion aktiv supprimieren (Bystander- Suppression). Diese ebenfalls antigenspezifischen T-Zellen werden dem Th2- oder auch Th3-Typ bzw. nicht näher charakterisierten T-Zellklassen zugeordnet (Weiner 1997; Mason und Powrie 1998; Seddon und Mason 1999). Die pathologische Situation wird dabei oft so definiert, dass sie im allgemeinen von Th1-T-Zellen verursacht wird. Eine weitere Theorie postuliert eine bisher nicht näher charakterisierte, von einem direkten Kontakt zwischen einzelnen T-Zellen abhängige Regulation als möglichen Mechanismus einer "Bystander-Suppression" (Tsitoura, DeKruyff et al. 1999). Wieder andere Hypothesen postulieren jeweils unterschiedliche Einflüsse verschiedener Cytokine oder von Cytokinen unabhängige Mechanismen der Toleranzinduktion (Segal und Shevach 1998; Lundin, Karlsson et al. 1999; Rizzo, Morawetz et al. 1999; Seddon und Mason 1999).

Im Rahmen der Theorie, welche auf der Gegenregulation zwischen Th1- und Th2/3-Cytokinen basiert, scheint das Cytokinmilieu, in dem die Immunreaktionen ablaufen, von entscheidender Bedeutung bei der Induktion von aktiver Bystander-Suppression zu sein; d. h. die vorwiegende Proliferation von vermutlich protektiven Th2/3 T-Zellen kann nur in einem geeigneten Milieu stattfinden (Liblau, Tisch et al. 1997; Weiner 1997; Strobel und Mowat 1998).

Unter "Milieu" versteht man dabei in der Immunologie die Zusammensetzung verschiedener rein immunologischer Faktoren, welche die Richtung einer antigeninduzierten Immunreaktion bestimmen. Hormone und andere Faktoren, die das Immunsystem beeinflussen, sind in diesen klassisch immunologischen Denkansatz allerdings nicht mit einbezogen.

Ein Ziel bei der Entwicklung von neuartigen Substanzen bzw. Methoden besteht darin, dieses Milieu zu optimieren. Dabei soll erstens die gewünschte Immunreaktion sicher und gezielt ablaufen können und zweitens die notwendige Menge des Antigens minimiert werden.

Nach derzeitigem Stand der Technik ist das Erzielen einer therapeutischen Induktion von Toleranz in fortgeschrittenen Stadien ein bisher unüberwindbares Problem, z. B. bei rheumatioder Arthritis. So scheint dieser neue Therapieansatz derzeit nur bei einer Krankheitsdauer von unter 2 Jahren erfolgreich zu sein. Danach erschweren vermutlich Mechanismen wie Epitop-Spreading und auch unspezifische Entzündungsreaktionen eine orale Toleranzinduktion (Albani, UCSD, persönliche Mitteilung).

WO 98/21951 (Haas et al.) offenbart allgemeine Verfahren zur oralen Toleranzinduktion, wobei ein Antigen mit einer derivatisierten Aminosäure als Adjuvans verwendet wird.

In US Patent Nr. 5,935,577 von Weiner et al. wurde versucht, die Toleranzinduktion durch die Verabreichung eines Bystander-Antigens in Kombination mit Methotrexat zu verbessern. Ein Ziel war es, die Menge des aufgrund seiner Toxizität mit schweren Nebenwirkungen behafteten Methotrexats zu verringern. Es ist jedoch nach heutiger Sicht wünschenswert, ganz auf Stoffe wie Methotrexat verzichten zu können, da Methotrexat eine kumulative Toxizität besitzt, d. h. ab einer gewissen Menge treten Leberschäden ein.

Es wurde auch versucht, eine Modifikation des immunologischen Milieus v. a, in Richtung eines vermutlich protektiven und die Proliferation regulatorischer Th-2/3 begünstigenden Milieus mittels verschiedener Hilfssubstanzen wie zum Beispiel Cytokinen bzw. Antikörper gegen Cytokine zu erzielen (Patent Nr. WO 95/27500, WO 98/16248). WO 95/27500 offenbart ein Verfahren zur oralen Toleranzinduktion unter Verwendung eines Bystander-Antigens zusammen mit Cytokinen, insbesondere IL-4 (Interleukin-4), welche das Immunsystem hin zu einer mehr durch T-Helfer-Zellen des Typs 2 (Th2) dominierten Antwort dirigieren. WO 98/16248 verwendet Inhibitoren von IL-12 bei der oralen Toleranzinduktion.

Es gibt jedoch nur sehr wenig Studien, die versuchen, über körpereigene Mechanismen die immunologischen Vorgänge zu steuern, die für eine gezielte Toleranzinduktion notwendig sind.

Aufgrund komplexer Funktionen der Cytokine bei der Immunregulation und damit möglichen unkontrollierbaren Nebenwirkungen ist eine Manipulation von Cytokinen als Möglichkeit zur Optimierung von Immunreaktionen und damit zum klinischen Einsatz bei der Induktion von Toleranz allerdings hochproblematisch. Es hat sich gezeigt, dass Eingriffe in das Cytokinnetzwerk häufig von gefährlichen Nebenwirkungen und unkalkulierbaren Risiken begleitet werden. So hat die FDA jüngst darauf hingewiesen, dass es bei der Verabreichung von TNF-Antiköpern im Rahmen einer Rheumatherapie bereits zu 10 Todesfällen gekommen ist, weil eine entzündliche Reaktion im Rahmen einer anderen Erkrankung als der Grunderkrankung Rheuma nicht mehr kontrollierbar und damit letal ablief. Ähnliche Befürchtungen hat man auch bezüglich des Einsatzes von IL-12 neutralisierenden Antikörpern, bzw. bei IL-4 wegen bekannter Nebenwirkungen.

Ein weiterer Gesichtspunkt bei heutigen Therapiemethoden ist die Tatsache, dass orale Toleranzinduktion zum Teil Therapiezyklen umfasst, bei denen das Antigen täglich über mehrere Wochen eingenommen werden muss. Es ist derzeit davon auszugehen, dass diese Zyklen mehrmals wiederholt werden müssen, da der Status der Toleranz unter Umständen die kontinuierliche Präsenz des Antigens erfordert, zumindest bis komplette Heilung eingetreten ist. Ob eine komplette Heilung überhaupt möglich ist, kann aus den bisher veröffentlichten Daten nicht abgeleitet werden.

Die bisherigen Strategien zur Toleranzinduzierung beruhen meist auf einer Verabreichung von supraphysiologischen Mengen sowohl des Antigens als auch der Adjuvantien. Der Nachteil bei der Verwendung hoher Konzentrationen der eingesetzten Mittel sind hohe Kosten und teilweise schwerwiegende Nebenwirkungen, wie etwa bei Methotrexat.

Ein weiterer Nachteil der bisher durchgeführten und veröffentlichten Studien zur Toleranzinduktion ist, dass meist Tiermodelle verwendet werden, bei denen die Induktion von Toleranz dadurch gezeigt wird, dass in den behandelten Tieren die in Kontrolltieren auftretenden Krankheit erst gar nicht ausgelöst wird. Von viel größerer Bedeutung sind jedoch Mittel, die in der Lage sind, auch in die bereits bestehende Krankheit einzugreifen.

Glucocorticoide sind bekannt für ihre anti-inflammatorischen (entzündungshemmenden) und immunsuppressiven Eigenschaften (Cupps und Fauci 1982; Chrousos 1995; Marx 1995; Almawi, Beyhum et al. 1996, Wilckens und Derijk, 1997). Sie werden daher bevorzugt zur Behandlung von Entzündungskrankheiten und auch zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt.

Es ist seit längerem bekannt, dass Glucocorticoide (GCs) in der Lage sind, die Produktion von bestimmten Cytokinen herabzuregulieren. Die antiinflammatorische Wirkung von Glucocorticoiden beruht neben ihrer Fähigkeit zur Inhibition von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-γ (IFN-γ) auf der Herabregulierung von IL-1, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und IL-6.

Während sich im Rahmen der Forschung zur Toleranzinduktion ein umfangreiches Wissen zur Rolle z. B. von Cytokinen angesammelt hat, ist über den Einfluss von Steroidhormonen im allgemeinen und von Glucocorticoiden im speziellen nur wenig oder nichts bekannt. Interessanterweise wurde aber nachgewiesen, dass Östrogene, die in Ihrer Wirkung auf das Immunsystem als immunsuppressiv eingestuft werden (Jansson und Holmdahl 1998), die Induktion von Toleranz verhindern (Mowat, Lamont et al. 1988). Dies ist in sofern besonders bemerkenswert, als Östrogene per se eine Th2-Immunantwort fördern, welche in manchen Systemen orale Toleranz unterstützen soll (Weiner 1997). Die Kombination von jeweils allein verabreichten inaktiven bzw. suboptimalen Konzentrationen von Östrogenen zusammen mit Glucocorticoiden bewirkt eine synergistische Immunsuppression (Carlsten, Verdrengh et al. 1996). Daraus wird im allgemeinen gefolgert, dass auch Glucocortikoide die Toleranzinduktion hemmen.

Über den Einfluss von Glucocorticoiden auf die Toleranzinduktion existieren keine publizierten Daten. Allerdings wurde im Rahmen einer präklinischen Phase I Studie an der Universität San Diego/Californien festgestellt, dass eine Glucocorticoidtherapie einem Therapieversuch zur Induktion von oraler Toleranz entgegensteht. Dies spiegelt sich auch in der Tatsache wieder, dass mit Glucocorticoiden behandelte Patienten von klinischen Studien zur Toleranzinduktion bei Autoimmunerkrankungen generell ausgeschlossen werden. Die Verabreichung sogar niedriger Steroidkonzentrationen blockiert die aktive Induktion von Toleranz. (S. Albani, University of California, San Diego und H. Weiner, Harvard University, Boston, persönliche Mitteilungen, (Weiner 1997; Bonnin und Albani 1998)).

Zwar kann es unter dem Einfluss von Glucocorticoiden unter bestimmten Vorraussetzungen zu einer Shift des Cytokinmusters in Richtung eines Th2-ähnlichen Cytokinprofiles kommen. Letzteres ist aber als Therapie eines Autoimmunprozesses auch im Rahmen von Maßnahmen zur Induktion von Toleranz nicht ausreichend. Sowohl die Applikation von Th2-Cytokinen, als auch der Transfer von Th2-Zellen kann eine Autoimmunreaktion nicht komplett verhindern (Mason und Powrie 1998; Segal und Shevach 1998). Es ist bekannt, dass Glucocorticoide auf periphere T-Zellen und auf undifferenzierte, naive und unreife T-Zellen eine ähnliche Wirkung haben (Cupps und Fauci 1982). Die Induktion von Toleranz propagiert dagegen u. a. die Aktivierung und Proliferation von dieser unreifen T-Zellen, während Gedächtniszellen anscheinend nicht tolerisiert werden können (Chung, Chang et al. 1999). Zusätzlich wird angenommen, dass Glucocorticoide die Antigenpräsentation hemmen (Piemonti, Monti et al. 1999; Piemonti, Monti et al. 1999), was einer Unterstützung von Toleranzinduktion per Definition zusätzlich entgegensteht.

Immunologische Therapiemethoden scheitern derzeit somit an der mangelhaften Steuermöglichkeit der Immunreaktion und auch an den Kosten, da sehr hohe Mengen sowohl an Protein-, Peptidantigen als auch DNA zum Einsatz kommen müssen, um relevante klinische Effekte beim Menschen zu induzieren. Während an der Identifikation möglicher Antigene beachtliche Fortschritte erzielt wurden, stehen für den Einsatz beim Menschen derzeit keine geeigneten Methoden zur Verfügung, die sich für einen Langzeiteinsatz eignen. Immunologische Ansätze scheinen derzeit aufgrund unkontrollierbarer Nebenwirkungen wenig erfolgversprechend.

Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, die Toleranzinduktion durch die Verabreichung von bestimmten Antigenen in Kombination mit einem neuen Adjuvans zu verbessern und/oder zu optimieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein neues Arzneimittel umfassend als Wirkstoff Inhibitoren der Steroid-Sulphatase in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen und die Verwendung des Arzneimittels zur Induktion von Toleranz.

Die Steroid-Sulphatase (SS) ist ein Enzym, welches u. a. für die Interkonvertierung von Dehydroepiandrosteronsulphat (DHEAS) in biologisch aktives Dehydroepiandrosteron DHEA verantwortlich ist. Im Stand der Technik wird beschrieben, dass eine Inhibition der SS eine Verstärkung der immunsuppresiven Wirkung endogenen Cortisol bewirken soll (Suitters 1997). Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass Inhibitoren von SS in Kombination mit einem Antigen in der Lage sind, Toleranz zu induzieren.

Dies ist insofern unerwartet, als allgemein bekannt ist, dass eine Steigerung des Cortisolspiegels im Plasma (z. B. bei der Verabreichung von Glucocorticoiden) eine immunsupprimierende Wirkung hat, wie hierin zuvor ausgeführt. Ferner ist gezeigt worden, dass eine Verabreichung von DHEA per se experimentell induziertes Rheuma im Tierversuch abschwächt (Williams 1997), also eine immunsuppressive Wirkung hat. Ein Einfluss von DHEA auf die Induktion von nasaler Toleranz konnte nicht festgestellt werden (Wolvers 1998).

Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält als Wirkstoff eine Kombination von zwei oder mehr Substanzen, welche sowohl als Gemisch oder Formulierung, als auch getrennt, z. B. als Kit vorliegen können.

Zum einen enthält das Arzneimittel ein oder mehrere Antigene, welche zum Auslösen einer spezifischen immunologischen Toleranzreaktion dienen.

Als derartige Antigene eigenen sich alle Stoffe, die unerwünschte Immunreaktionen hervorrufen, wie etwa solche, die mit Autoimmunkrankheiten assoziiert sind, z. B. Rheumatoide Arthritis einschließlich juveniler Formen, Lupus Erythemadotes, Multiple Sklerose, Uveitis, Diabetes Typ I, sowie solche, die mit Allergien assoziiert sind.

Als Antigene können aber auch Stoffe eingesetzt werden, die eine Infektion bewirken, wobei durch das erfindungsgemäße Arzneimittel eine Toleranz induziert werden kann, die nachteilige oder pathologische Reaktionen auf den infektiösen Erreger vermindern oder beseitigen kann. Beispiele für infektiöse Krankheitserreger sind beispielsweise Bakterien, Viren oder andere Mikroorganismen. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann spezifische Epitope oder Antigene solcher infektiöser Krankheitserreger umfassen, es ist aber auch möglich, den gesamten Mikroorganismus oder Teile davon zu verwenden.

Üblicherweise wird bei einer klassischen Impfung ein Pathogen dem Patienten intravenös verabreicht, wodurch eine schützende Immunität hervorgerufen wird. Es wurde nun aber festgestellt, dass ein Impfschutz nicht nur auf herkömmliche Weise, sondern auch durch eine Toleranzinduktion durch mukosale Verabreichung von Antigenen erzielt werden kann (McSorley, 1999). Durch die erfindungsgemäße Arzneimittelkombination wird eine solche Wirkung noch verstärkt, sodass eine Kombination aus Steroidsulphatase-Inhibitor und Antigen vorteilhaft als tolerogenes orales Vaccin eingesetzt werden kann.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Induktion von Toleranz eine vorteilhafte Wirkung auf eine anschließende Infektion nicht nur bei Autoimmunerkrankungen sondern auch bei infektiösen Erkrankungen hat. So konnte festgestellt werden, dass durch Induzieren einer Toleranz Infektionen aufgelöst werden konnten. Es wird vermutet, dass folgender Wirkmechanismus einem Impfschutz durch Toleranzinduktion zugrundeliegt: Viele infektiöse Erreger umfassen mehrere Antigene, wobei offensichtlich einige dieser Antigene eine Überreaktion des Wirts hervorrufen. Diese Überreaktion kann beispielsweise eine Überführung von T-Zellen in Th2-Zellen bewirken, wobei Th2-Zellen das eindringende Pathogen nicht bekämpfen können. Bei einer infektiösen Erkrankung bewirken nun solche Antigene, dass das Immunsystem des Wirts in schädlicher Weise überreagiert, während es gleichzeitig den infektiösen Erreger nicht wirksam bekämpft. Durch Induzieren einer Toleranz, beispielsweise durch mukosale Verabreichung des Antigens und gleichzeitige Verabreichung eines Steroidsulphatase-Inhibitors kann die nachteilige Wirkung der eine Überreaktion hervorrufenden Antigene ausgeschaltet werden, sodass der Rest des Immunsystems seiner Schutzfunktion nachkommen kann. Bei der Toleranzinduktion zum Schutz vor oder zur Heilung von infektiösen Erkrankungen ist es üblicherweise bevorzugt, eine Th1-artige Reaktion zu fördern und eine Th2-artige Reaktion auszuschalten. Entsprechend wird vorteilhafterweise eine Toleranz für Antigene erzeugt, die eine Th2-artige Reaktion hervorrufen.

Grundsätzlich ist es möglich, durch geeignete Auswahl des Antigens gemäß der hierin gegebenen Anleitung einen Impfschutz durch Toleranzinduktion für praktisch alle infektiösen Erkrankungen bereitzustellen. Bevorzugt wird ein Antigen ausgewählt, das mit einer bakteriellen oder viralen Infektion assoziiert ist, beispielsweise Grippe, Leishmania, Pilzinfektionen, Cytomegalie, Pneumonie, Streptokokken B, Chlamydien, Helicobakter, Hepatitis C, Herpes, Human Papilloma Virus, Mycobacterien Tuberculosis und anderen.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Antigen kann bevorzugt ein natürliches oder synthetisches Protein, Proteinbestandteil oder Peptid sein, insbesondere auch ein sogenannter Altered Peptide Ligand (APL), aber Kohlenhydrate einschließlich Polysaccharide und Lipopolysaccharide sind ebenfalls geeignet, sowie Antigene aus biologischen Ressourcen. Letztere umfassen Antigene welche bei der Entstehung und/oder Heilung von Autoimmunerkrankungen, Allergien, oder erwünschten und unerwünschten Immunreaktion im Rahmen der Transplantationsmedizin eine Rolle spielen.

Das Antigen kann dabei eines sein, gegen welches direkt eine Immunantwort erzeugt wird. Es kann aber auch ein sogenanntes Bystander-Antigen sein, welches eine (Auto)immunreaktion gegen auf einem Protein benachbarte oder verwandte Epitope hervorruft.

Altered Peptide Ligands (APLs) sind Peptide, welche im wesentlichen einem Antigen entsprechen, gegen welches eine Immunreaktion ausgelöst wird. Allerdings wurden in APLs einzelne Aminosäuren ausgetauscht. Man hat festgestellt, dass bei der Gabe von APLs im Rahmen einer oralen Toleranzinduktion kein oder wenig zusätzliches Adjuvans notwendig ist.

Im Bereich Allergieprävention können prinzipiell alle nicht toxischen Umweltantigene als erfindungsgemäß geeignete Antigene zum Einsatz kommen. Bevorzugt sind Benzylpenicilloyl, Insulin, Ovalbumin, Lactalbumin, aber auch diverse Pollen, Nahrungsmittelantigene, Hausstaubmilben und deren Bestandteile, deren Exkremente und dgl.

Weitere geeignete Antigene umfassen körpereigene und andere Heat Shock Proteine, Thyroglobulin, Zellbestandteile der Uvea, der Haut, verschiedener Epithelien, der Schilddrüse, der Basalmembran, der Muskeln, der Myelinscheiden, der Nervenzellen, des Thymus, roter Blutkörperchen, weiterer Blutbestandteile und -zellen, Proteolipid, Myelin­ basisches Protein (MBP), Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein (MOG), oder andere Bestandteile normalen oder erkrankten Körpergewebes.

Das Antigen kann im erfindungsgemäßen Arzneimittel auch als Nukleinsäure oder Oligonukleotid vorliegen. Dabei kann die Nukleinsäure oder das Oligonukleotid einerseits selbst das Antigen darstellen. Andererseits kann die Nukleinsäure für ein bestimmtes Peptidantigen kodieren. Sie kann über verschiedene Verabreichungsrouten gegeben werden, z. B. durch Injektion, intravenös, intramuskulär, subkutan oder mit Hilfe der Gen-Pistole.

Als Inhibitoren der Steroid-Sulphatase kommen grundsätzlich alle bisher bekannten, aber auch gegebenfalls noch nicht identifizierte Inhibitoren in Frage.

Bekannte Steroidsulphatase-Inhibitoren sind z. B. Donazol, Bis- Sulphatderivate von 2-(Hydroxyphenyl)indol und Oestron-3-O- methylthiophosphat.

Geeignete Steroidsulphatase-Inhibitoren weisen als aktives Pharmacophor zur Inhibition der Steoridsulphataseaktivität insbesondere eine an einen Arylring angebrachte Sulphamatgruppe auf. Veranschaulichende Beispiele für geeignete Inhibitoren umfassen Verbindungen mit einem Östrongrundgerüst, wie etwa Östron-3-O-sulphamat, sowie Derivate davon, die bevorzugt am A-Ring oder am D-Ring modifiziert sind. Beispiele hierfür umfassen 2-Methoxy-, 2-Nitro-, 4-Nitro-, 2-n-Propyl-, 4- n-Propyl-, 2-Allyl- und 4-Allyl-östron-3-O-sulphamate sowie 17-Deoxy- östron-3-O-sulphamat. Weiterhin umfassen geeignete Inhibitoren Sulphamatverbindungen, die einen Ring, zwei nicht anilierte Ringe oder zwei anilierte Ringe aufweisen. Beispiele hierfür sind Mono-Sulphamat- und Bis-Sulphamatderivate von Diethylstilboestrol, E-Capsaizinsulphamat, 4-n-Heptyloxyphenyl-O-sulphamat, (p-O-Sulphamoyl)-N- tetradecanoyltyramin, N-Tetradecanoyltyramin, p-O-(4-(n- Hexyloxybenzoyl)-N-(4-n-Hexyloxybenzoyl)tyramin und N-(4-n- Hexyloxybenzoyl)tyramin. Sulphamatderivate von THN und Cumarinsulphamatderivate sind Beispiele für Inhibitoren mit 2-Ring- Strukturen. Bevorzugte Cumarinsulphamatderivate sind Cumarin-7-O- Sulphamat, 4-Methyl-cumarin-7-O-sulphamat, 3,4,8-Trimethylcumarin-7- O-sulphamat und 4-(Trifluoromethyl)cumarin-7-O-sulphamat. Aber auch tricyclische Sulphamate auf Cumarinbasis stellen geeignete Inhibitoren dar.

Eine weitere Gruppe von geeigneten Steoridsulphatase-Inhibitoren sind Flavonoidverbindungen, insbesondere mindestens eine Sulphamatgruppe enthaltende Flavonoide. Beispiele für solche Verbindungen sind die natürlichen Flavonoide Quercetin, Kaempferol und Narigenin, sowie Isoflavone, wie etwa Daidzein-4'-O-sulfat und Daidzein-7,4'-O-disulfat sowie 5,7-Dihydroxy-isoflavon-4'-O-sulphamat und 5-Hydroxy-isoflavon- 4',7-bis-sulphamat. Weitere geeignete Flavonoide und Isoflavonoide die, insbesondere wenn sie mit einer Sulphamatgruppe versehen werden, als Inhibitoren eingesetzt werden können, sind beispielsweise bei R. Dickson et al., Trends In Plant Science Reviews, Vol. 4, No. 10 (1999) 394-400 beschrieben und umfassen Sulphamatderivate von Dadzcein, Genistein, Resveratrol, Maackiain, Pisatin, Coumestrol, Antocyanin, Isovitexin, Quercetin und Flavon.

Weitere Verbindungen, die als Steoridsulphatase-Inhibitor eingesetzt werden können umfassen Antioestrogene, wie etwa Tamoxifen, 4- Hydroxy-tamoxifen und Antioestrogen (ICI 164384) sowie Progestogene, wie etwa Progmesteron und Nomegestrolacetat. Die Inhibitoren werden bevorzugt in einer Menge von mindestens 0,01, bevorzugt mindestens 0,1 und besonders bevorzugt mindestens 1 mg/kg Körpergewicht und Tag und bis zu 100, bevorzugt bis zu 50, besonders bevorzugt bis zu 10 mg/kg pro Tag verabreicht. Als Inhibitor der Steroidsulphatase wird eine Verbindung angesehen, die die in vivo Steroidsulphataseaktivität um mindestens 10%, bevorzugt mindestens 30%, mehr bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt mindestens 70% und am meisten bevorzugt mindestens 80% inhibiert. Es kann aber vorteilhaft sein, Stoffe zu verwenden, die die in vivo Steroidsulphataseaktivität um mindestens 90%, bevorzugt um mindestens 95% inhibieren. Die Inhibitoren weisen bevorzugt IC₅₀-Werte, wie in plazentalen Mikrosomen oder MCF-7-Zellen bestimmt von < 100 µM, bevorzugt < 30 µM, besonders bevorzugt < 1 µM auf. Besonders potente Inhibitoren weisen IC₅₀-Werte von < 100 nM, bevorzugt < 10 nM und besonders bevorzugt < 1 nM auf.

Die K_i-Werte der erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren sind bevorzugt < 1200 µM, mehr bevorzugt < 100 µM und besonders bevorzugt < 1 µM.

Bevorzugte Dosierungen der Inhibitoren betragen beim Menschen bis zu 1 g pro Dosiseinheit.

Außer der Verwendung der genannten Inhibitoren ist es auch möglich und im Sinne der Erfindung, als Inhibitor eine Antisense-Nukleinsäure zu verwenden, welche mit Sequenzen hybridisiert, die für Steroid- Sulphatasen kodieren. Das kann insbesondere dann von Vorteil sein, wenn eine SS in einem bestimmten Gewebe spezifisch gehemmt werden soll.

Das Gewichtsverhältnis der Bestandteile Inhibitor und Antigen beträgt bevorzugt 0,1 zu 99,9 bis 99,9 zu 0,1, besonders bevorzugt 90 zu 10 bis 10 zu 90. Das Arzneimittel der Erfindung kann als Gemisch oder Formulierung der beiden Komponenten Antigen(e) und Inhibitor vorliegen. Bevorzugt werden die beiden Bestandteile jedoch nicht als eine Formulierung sondern getrennt verabreicht. Zusätzlich kann das Arzneimittel bzw. die beiden Wirkstoffkomponenten pharmazeutisch annehmbare Hilfs- und/oder Zusatzstoffe (z. B. geeignete Lösungs- oder Verdünnungsmittel) und/oder Adjuvantien enthalten. Geeignete Stoffe können vom Fachmann auf dem Gebiet leicht ermittelt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels bzw. der Kombination aus Hemmstoff der SS mit einem oder mehreren Antigenen zur Toleranzinduktion in einem Säugetier, insbesondere dem Menschen. Anwendungsgebiete liegen im Bereich der Autoimmunkrankheiten, z. B. Rheumatoide Arthritis, einschließlich juveniler Formen, Lupus Erythemadotes, Multiple Sklerose, Uveitis, Diabetes Typ I, sowie bei Allergien und der Transplantationsmedizin, insbesondere Transplantatabstoßung und GVHD.

Die Toleranzinduktion kann aber auch bei der Immunisierung gegen Infektionserreger eingesetzt werden, wie oben ausgeführt.

Die Verabreichung des Arzneimittels kann über verschiedene Wege erfolgen. Es ist möglich, den/die Inhibitoren der SS zusammen mit dem/den Antigenen und gegebenenfalls zusätzlichen Adjuvantien zu verabreichen, wobei die genannten Komponenten als eine Formulierung vorliegen können. Die beiden Wirkstoffkomponenten und die gegebenenfalls zusätzlichen Hilfsstoffe oder Adjuvantien können aber auch separat, und, falls gewünscht, über unterschiedliche Verabreichungsrouten gegeben werden. Möglich sind einerseits mukosale Routen, z. B. intranasal, oral oder durch Inhalation, aber auch weitere, wie etwa intravenös, subkutan, intramuskulär und intraperitoneal. Weiterhin kommt bei der Verabreichung von Nukleinsäuren die Gen- Pistole in Betracht.

Zur Präsentation des Antigens kommen insbesondere folgende Applikationsmöglichkeiten in Betracht: die sogenannte mukosale, d. h. orale oder nasale Toleranzinduktion und neuerdings durch Gabe von DNA (Ragno, Colston et al. 1997; Lee, Corr et al. 1998; Lobell, Weissert et al. 1999; McCluskie und Davis 1999; McCluskie, Millan et al. 1999), welche für das betreffende Antigen codiert und in den zu behandelnden Organismus, z. B. einem Menschen, injiziert wird.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Mittel zur mukosalen Toleranzinduktion eingesetzt. Dabei bedeutet mukosal die Aufnahme über Schleimhäute und umfasst die Verabreichung eines Antigens unter anderem durch orale Einnahme oder Instillation in die Nase, bzw. Inhalation und Resorption über die Lunge. Die Verabreichung kann aber auch subkutan, intravenös und/oder intramuskulär erfolgen.

Inhibitor und Antigen können gemeinsam oder getrennt über verschiedene Routen und auch zeitlich versetzt verabreicht werden.

Der Inhibitor kann über alle bekannten Routen verabreicht werden und wird dazu jeweils in die entsprechende Form gebracht, z. B. für die Injektion in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst. Dabei ist es auch möglich, zuerst den Inhibitor, z. B. durch Injektion intravenös, intramuskulär oder subkutan, und dann das oder die Antigene über mukosale Routen zu verabreichen. Es kann von Vorteil sein, den Inhibitor in mehrmaliger Dosis zu geben.

Die Erfindung betrifft schließlich eine Zusammensetzung, die

• a) einen Inhibitor der Steroidsulphatase und
• b) ein Antigen umfasst.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält insbesondere die oben als bevorzugt angegebenen Komponenten.

Beispiele Verstärkung der Toleranzinduktion im Modell der Experimentellen- Autoimmun-Enzephalitis EAE

Dieses Tiermodell, bei dem eine der Multiplen Sklerose (MS) ähnliche Autoimmunkrankheit induziert werden kann, ist im Stand der Technik bekannt (Kumar 1998, Weissert 1998, Stefferl 1999):

Dabei wird Ratten 100 µl Suspension aus Myelin-basischem Protein (MBP) oder Myelin-Oligodendrozyten-Glycoprotein (MOG) (50 µg) in Kochsalzlösung als Emulsion (1 : 1) mit Öl/Mycobacterium (Complete Freund's Adjuvant Suspension mit 200 µg Mycobacterium tuberculosis) in den Schwanz injiziert. Nach etwa 10-14 Tagen entwickeln die Ratten die für die Experimentelle Autoimmune Enzephalitis (EAE) typischen Symptome bzw. Pathologien, welche diejenigen der MS des Menschen widerspiegeln. Die Ausbildung dieser Enzephalitisform wird als Resultat einer sog. Kreuzreaktion der Immunabwehr sowohl gegen Antigene des MBP oder MOG als auch weitere Autoantigen interpretiert (Kumar 1998).

Beispiel 1 Verhinderung der Krankheitsentstehung

Die Entstehung bzw. der Verlauf der Erkrankung können positiv beeinflusst bzw. verhindert werden. Hierzu wird bei den Ratten vor der Induktion der EAE eine Toleranz gegen bestimmte Antigene des MBP oder MOG induziert. Dabei wird das Antigen oder ein sog. Altered Peptide Ligand (APL) entweder oral bzw. nasal als Protein oder Peptid dem Immunsystem präsentiert (Liu, 1998, Anderton, 1998, Bai, 1997, Li 1998, Kumar 1998), oder als DNA verabreicht (Ragno, Colston et al. 1997), bevor die Sensibilisierung mittels der Öl/Mycobakterium Mischung erfolgt. Die Verabreichung z. B. des APL erfolgt hierzu am Tag -15, -10, -5, und am Tag der Sensibilisierung (jeweils 100 µg intranasal).

In diesem Beispiel wurden zudem jeweils spezifische Inhibitoren der Steroidsulphatase verwendet, wie sie von Suitters 1997 und Purohit 1999 beschrieben wurden. Es wurden u. a. Oestron-3-O-sulphamat, 4- Nitro-oestron-3-Q-sulphamat, 17-Deoxyoestron-3-O-sulphamat, p-O- Sulphamoyl-N-tetradecanoyltyramin, 4-Methylcoumarin-7-O-sulphamat, Daidzein-4'-O-sulphat, Daidzein-7,4'-O-disulphat, 5,7-Dihydroxy­ isoflavon-4'-O-sulphamat und 5-Hydroxy-isoflavon-4',7-bis-sulphamat verwendet.

Wird der Inhibitor (z. B. 1-8 mg subcutan in Öl bzw. in 20% Dimethylsulphoxid/80% Öl) zusammen mit dem Antigen bis zur Injektion des Öl/Mycobakterium-Gemischs, d. h. vor der Sensibilisierung, verabreicht, wird letzteres in seiner Wirkung verstärkt und die notwendige Menge Antigen zur Induktion von Toleranz reduziert. Die Erkrankung der Ratten wird dosisabhängig verhindert bzw. in ihrer Inzidenz und Stärke des Verlaufs abgeschwächt. Ferner kann durch Zugabe des Inhibitors die zur Toleranzinduktion notwendige Menge Peptid verringert werden.

Beispiel 2 Manipulation des Krankheitsverlaufs nach erfolgter Induktion von MOG- EAE bzw. nach dem Einsetzen von Symptomen

Die induzierte EAE verläuft nach Einsetzen der entzündlichen Reaktion 10 Tage nach der Injektion von MOG in Freund's Complete Adjuvant fulminant mit mehreren rezdivierenden Schüben.

Der Verlauf der Erkrankung und der Entzündungsreaktionen lässt sich durch eine nasale Verabreichung von Antigenen alleine zur Erzeugung einer Toleranz bisher nicht signifikant positiv beeinflussen. Wenn die Behandlung allerdings in in Kombination mit einem SS-Inhibitor innerhalb von 24-48 Stunden nach dem Eintreten der ersten Symptome erfolgt und täglich fortgesetzt wird, lassen sich die Schübe abmildern, bzw. ganz verhindern.

Dazu wird Ratten gleichzeitig während der nasalen Applikation des Proteinantigens (MOG) der Inhibitor injiziert oder über die Nase instilliert, wobei Inhibitoren und Konzentrationen wie in Beispiel 1 verwendet werden.

Der Anstieg der Symptominzidenz wird hierbei signifikant günstiger beeinflusst als ohne die Hemmung der SS. Bezüglich der Anwendung des Inhibitors in Kombination mit APLs lässt sich eine Abschwächung und Verkürzung des Krankheitsverlaufs bereits mit suboptimalen Peptidkonzentrationen erzielen.

Die Tatsache, dass die Hemmung der SS zusammen mit der Verwendung des bisher nicht zum therapeutischen Einsatz geeigneten Peptids (MOG) eine Abschwächung des Krankheitsverlaufs erlaubt, bzw. die notwendige Menge an APL verringert, zeigt an, dass es gelingen kann, auch in Spätstadien Heilversuche mittels oraler Toleranzinduktion erfolgreich zu initieren. Somit ermöglichen die Daten aus dem Tierversuch einen ad hoc Heilversuch zur Unterstützung der Toleranzinduktion beim Menschen.

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Claims (27)

1. Arzneimittel, umfassend als Wirkstoff einen Inhibitor der Steroid Sulphatase (SS) in Kombination mit einem Antigen.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor und das Antigen getrennt vorliegen.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus endogenen und exogenen Hemmstoffen der SS und Antisense-Nukleinsäuren, die mit Sequenzen, die für Steroidsulphatase codieren, hybridisieren.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus Verbindungen, die als aktives Pharmacophor zur Inhibition der Steroidsulphatase-Aktivität eine an einen Arylring gebundene Sulphamatgruppe aufweisen.

5. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus Oestronsulfamaten, p-O- sulphamoyl)-N-alkanoyltyraminen und Coumarinsulphamaten.

6. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus Flavonoiden und Derivaten davon.

7. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt ist aus synthetischen und natürlichen Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Altered Peptide Ligands (APL), Kohlenhydraten, einschließlich Polysacchariden und Lipopolysacchariden.

8. Arzneimittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es das Antigen in Form einer dafür kodierenden Nukleinsäure enthält.

9. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Bystander-Antigen ist.

10. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen aus Antigenen ausgewählt ist, welche mit den Krankheiten Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Uveitis, Diabetes Typ I, Lupus Erythematodes oder infektiösen Krankheitserregern assoziiert sind.

11. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt ist aus körpereigenen und anderen Heat Shock Proteinen, Proteolipid, MBP, MOG und Zellbestandteilen der Uvea, der Haut, Epithelien, der Schilddrüse, der Basalmembran, der Muskeln, der Nervenzellen, des Thymus oder der roten Blutkörperchen.

12. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt ist aus Benzylpenicilloyl, Insulin, Ovalbumin, Lactalbumin, Pollenbestandteilen, Nahrungsmittel­ bestandteilen und Hausstaubmilbenbestandteilen.

13. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe, Zusatz­ stoffe oder/und Adjuvantien umfasst.

14. Arzneimittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Toleranzinduktion.

15. Arzneimittel nach Anspruch 14, für die mukosale Toleranzinduktion.

16. Verwendung von Inhibitoren der SS in Kombination mit einem Antigen zur Toleranzinduktion.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man als Inhibitor eine Substanz einsetzt, welche für ein oder mehrere Isoenzyme der SS spezifisch ist.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass man als Inhibitor endogene oder exogene Hemmstoffe der SS oder Antisense-Nukleinsäuren einsetzt.

19. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor auswählt wird aus Verbindungen, die als aktives Pharmacophor zur Inhibition der Steroidsulphatase-Aktivität eine an einem Arylring gebundene Sulphamatgruppe aufweisen.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, zur mukosalen Toleranzinduktion.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt wird aus synthetischen und natürlichen Proteinen, Peptiden, Kohlenhydraten einschließlich Polysacchariden, Lipopolysacchariden und Antigenen aus biologischen Ressourcen.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Bystander-Antigen ist.

23. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen aus Antigenen ausgewählt wird, welche mit den Krankheiten Rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Uveitis, Diabetes Typ I, Lupus Erythematodes oder infektiösen Krankheitserregern assoziiert sind.

24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt wird aus körpereigenen und anderen Heat Shock Proteinen, Proteolipid, MBP, MOG und Zellbestandteilen der Uvea, der Haut, verschiedener Epithelien, der Schilddrüse, der Basalmembran, der Muskeln, der Nervenzellen, des Thymus oder der roten Blutkörperchen.

25. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ausgewählt wird aus Benzylpenicilloyl, Insulin, Ovalbumin, Lactalbumin, Pollenbestandteilen, Nahrungsmittel­ bestandteilen und Hausstaubmilbenbestandteilen.

26. Verfahren zur Induktion von Toleranz zur Bekämpfung von Auto­ immunkrankheiten, Allergien und der Transplantatabstoßung und GVHD, umfassend Behandeln eines Säugetieres oder eines Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, mit einer wirksamen Menge eines Inhibitore der Steroid Sulphatase in Kombination mit einer Verabreichung eines Antigens oder einer Verabreichung einer für das Antigen kodierenden Nukleinsäure.

27. Zusammensetzung umfassend

• a) einen Inhibitor der Steroid Sulphatase und
• b) ein Antigen.