DE102004026309A1

DE102004026309A1 - Pharamzeutische Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemswegsveränderungen und von Krebs durch Modulation der Genexpression des Stat6

Info

Publication number: DE102004026309A1
Application number: DE200410026309
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Henke
Original assignee: HAARLEMS ALLERGENEN LAB BV; Haarlems Allergenen Laboratorium BV
Current assignee: HAARLEMS ALLERGENEN LAB BV; Haarlems Allergenen Laboratorium BV
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2005-12-29
Also published as: WO2005116210A3; EP1751285A2; WO2005116210A2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein die Stat6 mRNA Expression inhibierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine pharmaceutische Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemwegsveränderungen und von Krebs, Verwendungen von Nukleinsäuren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren zur Behandlung genannter Erkrankungen.

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik

Stat6 ist die Abkürzung für "signal transducer and activator of transcription 6". Stat6 ist ein obligatorischer Transkriptionsfaktor in der Signaltransduktion der Interleukine IL-4 und IL-13. Im Ergebnis der Bindung von IL-4 oder IL-13 an Zellen wird Stat6 durch JAK-Kinasen phosphoryliert und bildet Homodimere. Die Homodimeren wandern zum Kern und induzieren die Transkription von Genen. Dieser Signalweg ist sowohl in haematopoetischen als auch in nichthämatopoetischen Zellen ausgebildet. In T-Lymphozyten führt die Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen und die IL-4-abhängige Stat6-Aktivierung zur Differenzierung in T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) und zur Bildung von IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13. In B-Lymphozyten kommt es über die Aktivierung des Stat6-Signalweges zur IL-4-abhängigen Proliferation und zur Sekretion der Immunglobuline IgE und IgG4. Nichthämatopoetische Zellen, die am Ort der Antigeninvasion an der Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. Epithelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten der Atemwege, verfügen ebenfalls über Stat6-abhängige Zellfunktionen, wie die Expression von chemotaktischen Mediatoren und Adhäsionsmolekülen, die Freisetzung von Matrixmetalloproteasen und die Produktion von Schleim. In der Lunge wird die Bildung des VCAM1, der Eotaxine und des IL-5 durch IL-4/IL-13 stimuliert. Diese Proteine sind für die Rekrutierung, die Aktivität und das Überleben der eosinophilen Granulozyten und damit für die Entzündungsprozesse von Bedeutung. Matrixmetalloproteasen (MMP) und ihre Inhibitoren (TIMPS) sind an den Auf- und Abbauprozessen des Bindegewebes sowie an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt. Untersuchungen an Mäusen und humanen Zellkulturen legen nahe, dass insbesondere IL-13 die Schleimproduktion in Lungenepithelzellen stimuliert.

Allergische Erkrankungen sind durch eine komplexe entzündliche Genese gekennzeichnet. Die pathologischen Veränderungen werden insbesondere auf die durch Antigenspezifische Th2-Zellen generierten Interleukine und ihre primär auf die Elimination extrazellulärer Pathogene gerichteten Wirkungen zurückgeführt. Die Adaptation dieser Immunreaktionen auf Allergene kann sowohl auf der Haut als auch in der Lunge zu allergischen Reaktionen führen. Allergisches Asthma ist durch Atemwegshyperreagibilität, Eosinophilie, subepitheliale Fibrose und Schleimüberproduktion gekennzeichnet. An knock-out Mäusen wurde gezeigt, dass die Defizienz von Stat6 zur Elimination der Ausprägung des asthmatischen Phänotyps führt.

Es gibt Hinweise auf eine Beteiligung Stat6-abhängiger Mechanismen an der Pathogenese von Tumoren. Steroidhormonsensitive normale humane Epithelzellen der Mamma und der Prostata sowie Tumorzelllinien der Brust, des Kolons und der Cervix exprimieren Stat6. In diesen Zellen stimulieren IL-4 und IL-13 die Induktion von Enzymen, insbesondere die 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase/Δ5-Δ4-Isomerase, die die Bildung aktiver steroidaler Sexualhormonen in peripheren Zielgeweben katalysieren. Die durch IL-4 und IL-13 induzierte systemische Verfügbarkeit von Steroidhormonen kann das Wachstum sensitiver Tumorzellen fördern. So stellt z.B. peripher gebildetes Dihydrotestosteron nach Androgenablation durch pharmakologische oder chirurgische Kastration eine wichtige Quelle für das Wachstum des Prostatakarzinoms dar.

Stat6-defiziente Mäuse verfügen über eine erhöhte Immunität gegen primäre und metastatische Tumoren, d.h. sie sind resistent gegen Rezidive primärer Fibrosarkome, rejizieren transplantierte Mastozytome und zeigen eine erniedrigte Mortalität nach der Transplantation spontan metastasierender Mammakarzinome.

In Hodgkin Lymphomen verfügen die Reed-Sternberg-Zellen, welche die maligne Population dieser klonalen B-Zell-Erkrankung darstellen, in einer großen Anzahl von Fällen sowohl über IL-13-Rezeptoren als auch über eine endogene IL-13-Bildung. An Zelllinien des Hodgkin Lymphoms wurde nachgewiesen, dass Stat6 im Ergebnis einer autokrinen Wachstumsregulation durch IL-13 konstitutiv aktiv ist. Die autokrine Wachstumsregulation kann durch einen IL-13-Antagonisten inhibiert werden.

RNA-Interferenz (RNAi)-Moleküle, wie small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA) und lange, doppelsträngige RNA (dsRNA), und katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, sind geeignet die Expression von Genen durch Degradation der Target-RNA zu inhibieren. Die zelluläre, unter der Wirkungen des Enzyms Dicer erfolgende Spaltung von dsRNA und miRNA führt zur Bildung von siRNA, d.h. kurzer, ca. 21 Nukleotide langer, doppelsträngiger RNA mit 3'-terminalen Einzelstrangüberhängen. Exogen applizierte synthetische oder unter Verwendung von Vektoren generierte siRNA oder shRNA (eine kurze, doppelsträngige RNA mit einer Hairpin-Struktur) verfügen über Wirkungen, die der durch zelluläre Mechanismen gebildeten siRNA entspricht. RNAi-Moleküle inhibieren die Expression von Genen in Zelllinien, Pflanzen und Tieren.

Katalytische Nukleinsäuren verfügen sowohl über eine Nukleinsäure-Sequenz, die die katalytische Reaktion realisiert, als auch über eine Nukleinsäure-Sequenz, die spezifisch an die Target-Nukleinsäure bindet. Es wird insbesondere zwischen aus Ribonukleotiden und aus Desoxyribonukleotiden aufgebauten Ribozymen bzw. DNAzymen unterschieden. Vertreter der Ribozyme mit Bindungsspezifischer RNA-Spaltung sind das Hammerhead, Hepatitis deta Virus, Hairpin und VS Ribozym bzw. mit selbstspaltenden Eigenschaften sind die Group 1 Intron, Group II Intron und das Ribonuklease P Ribozym; Vertreter der DNAzyme sind z.B. das 10-23- und das DEC22-18 DNAzym sowie das Zn²⁺-abhängige, imidazolenthaltende DNAzym (J.Am.Chem.Soc. 122 (2000) 2433), das LANzym (J.Am.Chem.Soc. 124 (2002) 13682) oder das Metall-unabhängige, imidazo- und kationisches Amin-enthaltende DNAzym (J.Am.Chem.Soc. 124 (2002) 9960). Diese katalytischen Nukleinsäuren spalten RNA. Die Sequenzabschnitte der Spaltung sind charakteristisch für die katalytische Nukleinsäure. Die Spaltung der Target-RNA führt zur Hemmung der Genexpression.

RNAi-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren können durch kommerzielle RNA- oder DNA-Synthese sowie unter Verwendung von Vektoren, die u.a. Expressionskassetten mit eukaryontischen U6/H 1 -Promotoren (Ambion) oder prokaryontischen T7/T3/SP6-Promotoren enthalten, hergestellt werden. Ihre Stabilität in Stoffwechsel-aktiven Systemen wird durch die Einführung chemischer Modifikationen erhöht. Die Modifikationen erfolgen u.a. als Substitution der Phosphat-Reste durch Phosphorothioate, der 2'-OH-Gruppe der Zucker-Ribonukleotide durch 2'-O-Methyl, 2'-O-Allyl oder -NH₂ sowie durch Einführung von Desoxyribonukleotiden, z.B. von 3'-terminalen Desoxy-Thymidinen in den Einzelstrangüberhängen der siRNA oder in den Bindungsarmen der Ribozyme, oder von 3', 3'-invertierten Desoxyribonukleotiden. RNAi-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren, insbesondere durch chemische Modifikation stabilisierte Derivate, können direkt oder unter Verwendung von Transfektionsreagentien sowie von Vektoren in Zellen, Geweben, Organen oder Organismen zur Wirkung gebracht werden.

Zu den vorstehenden Zusammenhängen wird ergänzend auf die folgenden Literaturstellen verwiesen.

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Kuperman, D. A. et al., (2002) Nat. Med. 8, 885–889
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Wills-Karp, M. et al., (2003) Curr.Opin.Pulm.Med. 9, 21–27
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Foster, P. S. et al., (2002) Pharmacol. Ther. 94, 253–264
Lee, J. H. et al., (2001)Am.JRespirCellMol.Bio1. 25, 474–485
Moore, P. E. et al., (2002) Am.J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 282, L847–L853
Oshima, Y. et al., (2001) Cel/Immunol. 211, 37–42
Skinnider, B. F. et al., (2002) Leuk. Lymphoma 43, 1203–1210
Gingras, S. et al., (2001) J Steroid Biochem.Mol.Bio1. 76, 213–225
Takeda, K. et al., (1996) Nature 380, 627–630
Shimoda, K. et al., (1996) Nature 380, 630–633
Kuperman, D. et al., (1998) J.Exp.Med. 187, 939–948
Terabe, M. et al., (2000) Nat.Immunol. 1, 515–520
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Ostrand-Rosenberg, S. et al., (2002) J Immunol. 169, 5796–5804
Zamore, P. D. et al., (2000) Cell 101, 25–33
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Technisches Problem der Erfindung.

Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, verbesserte Mittel zur Behandlung von allergischer Erkrankungen, pathogener Atemwegsveränderungen und von Krebs zur Verfügung zu stellen.

Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine die Stat6 mRNA Expression inhibierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.

Es sind eine Vielzahl von Oligonukleotiden geeignet. Besonders geeignet sind doppelsträngige siRNA-Moleküle folgender grundsätzlicher Zusammensetzung:

Sensestrang

5'-(N)_19–23(X)_0–5

Antisensestrang

5'(N')_19–23(X')_0–5

wobei X, X' = Ribonukleotide, bevorzugt Thymidin und Desoxy-Thymidin, N = aufeinanderfolgende Ribonukleotide der mRNA-Sequenz des Stat6 (GI: 23397677, NCBI) beziehungeweise Teilsequenz der Länge 19 bis 23 aus der Stat6 Sequenz, und N' = ein zu diesem Sequenzabschnitt der stat6-mRNA komplementäres Ribonukleotid. Es sind auch Homologe zu den genannten Sequenzen mit einer Homologie von zumindest 80%, vorzugsweise zumindest 90% einsetzbar (berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum Anmeldezeitpunkt gültigen Fassung). Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfasst, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Doppelsträngige RNA-Moleküle, wie vorstehend angegeben, können a) integraler Bestandteil langer RNA-Moleküle, wie microRNA oder doppelsträngiger RNA, sein und aus diesen durch katalytische Spaltung, z.B. durch Dicer oder Target-spezifisches Ribozym bzw. DNAzym, generiert werden, und b) kurze, doppelsträngige RNA, wie shRNA, sein, die dem Wirkungsprinzip der vorstehenden siRNA folgen. Es kann sich auch um katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, handeln, die spezifisch an die stat6 mRNA binden, diese an den für Ribozyme und DNAzyme charakteristischen Bindungsstellen spalten und die Genexpression inhibieren.

Bevorzugt ist es, wenn das Oligonukleotid eine siRNA oder eine shRNA ist, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID 1 bis 9.

In aller Regel wird es sich empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich physiologisch verträgliche galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na⁺, K⁺, Li⁺ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann des weiteren auch eine oder mehrere weitere Wirkstoffkomponenten enthalten. Hierfür kommen beispielsweise verschiedene die Expression von Stat6 mRNA inhibierende Oligonukleotide in Frage. Es ist aber auch möglich, beispielsweise zytotoxische Komponenten einzusetzen, beispielsweise bei der Therapie von Krebs. Zytotoxische Komponenten sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten oder zumindest wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbesondere Toxine (z.B. Diphterie-Pseudomonas-Toxin) oder Zytostatika einschließlich sogenannter Prodrugs sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin), Antimetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin), Mitosehemmer (z.B. Vincaalkaloide, Vincristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel), Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid), Antibiotika (z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase), Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin), Hormone und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierensindensteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid). Es ist auch möglich, immunmodulierend (stimulierend oder abschwächend) wirkende Wirksubstanzen einzusetzen. Beispielsweise eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, beta, gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.

Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung eines Oligonukleotides, insbesondere einer siRNA oder einer shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Erkrankungen. Bei den Erkrankungen kann es sich insbesondere um allergische Erkrankungen, wie Asthma, atopische Dermatitis, Rhinitis und Pollinose, Erkrankungen der Lunge, wie Entzündungen, Bronchoobstruktion, pulmonale Vasokonstriktion, Bronchitis und Emphysem sowie Tumorerkrankungen, wie Karzinome, Leukämien, Lymphome, insbesondere Hodgkin Lymphome, und Melanome einschließlich metastasierter Formen handeln.

Die Erfindung betrifft des weiteren ein die Expression von Stat6 mRNA inhibierendes Oligonukleotid, insbesondere siRNA oder shRNA, beispielsweise des Aufbaus

Sensestrang	5'-(N)_19–23(X)_0–5
Antisensestrang	5'-(N')_19–23(X')_0–5,

vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9 und dessen Verwendung.

Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Oligonukleotid in einer physiologisch wirksamen Dosis mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Inhibierung der Expression von Stat6 mRNA, wobei einer Stat6 exprimierenden Zelle in vitro oder in vivo eine physiologisch wirksame Menge einer für Stat6 spezifischen inhibitorischen Nukleinsäure, insbesondere eine siRNA oder eine shRNA, vorzugsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, zugeführt wird.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, einer pathologischen Atemwegsveränderung und/oder von Krebs, wobei einem erkrankten Menschen oder Säugetier eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dargereicht wird. Der Ausdruck der Behandlung umfasst dabei auch die Prophylaxe.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nichtlimitierenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Auswahl und Herstellung von RNAi-Molekülen zur Inhibition der Expression von Stat6
Folgende siRNA und shRNA sind RNAi-Moleküle zur Inhibierung der Expression der humanen stat6-mRNR:
Die vorstehenden Sequenzen sind in dieser Reihenfolge die Seq.-ID 1 bis 9. "t" steht hierbei für Desoxythymidin. Desoxythymidin dient der Stabilisierung der RNA und ist aber auch entbehrlich, weshalb diese Gruppen in Klammern als fakultativ angegeben sind. Die Herstellung der siRNA erfolgt durch Standardmethoden der RNA-Oligonukleotid-Synthese (Dharmacon) und die der shRNA durch in vitro Transkription unter Verwendung von T7-Promotor-Sequenz-enthaltenden Oligonukleotiden (BioTez) und T7-RNA-Polymerase (Promega).
Beispiel 2: Transfektion von siRNA in Zelllinien
Die Zelllinien HeLa, A549, L929, BaF3 sowie humane Hautfibroblasten werden mit siRNA und dem kationischen Transfektionsreagenz (Tfx-20, Tfx-50 bzw. DOTAP) mit einern Ladungsverhältnis von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Die siRNA-Konzentration beträgt 0,1 μM. Die Transfektionsreagenzien werden mit OptiMEM-Medium (Invitrogen) nach den Vorschriften der Hersteller eingesetzt.
Beispiel 3: Wirkung der siRNA auf die mRNA- und Proteinexpression des stat6 in Zellkulturen
Der Nachweis der Wirkung der siRNA auf die stat6-Expression in Zellkulturen erfolgt durch quantitative mRNA-Bestimmung mit der real time PCR und semiquantitativer Stat6-Protein-Bestimmung mit dem Western blot. Acht Stunden nach Beginn der Transfektion wird die RNA mit dem RNeasy Kit (Qiagen) unter Einsatz von RNase-freier DNase 1 isoliert. Die cDNA-Synthese erfolgt mit dem Super-Script Reverse Transkriptase (RT) Kit (Invitrogen) unter Verwendung eines Oligo(dT)-Primers. Die real time PCR wird mit dem LightCycler (Roche) und dem FastStart DNA Master SYBRGreen 1 Kit (Roche) durchgeführt. Die stat6 mRNA-Expression wird unter Bezugnahme auf das konstitutiv exprimierte Referenzgen Pyruvat-Dehydrogenase quantifiziert.
Zur Charakterisierung der Stat6-Proteinexpression werden die zellulären Proteine 48 Stunden nach Transfektion der Zellen durch Lyse gewonnen, mit der Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 7% SDS aufgetrennt und Stat6 mit dem Western blot unter Verwendung des M20-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) auf der Trans-Blot Nitrocellulose-Membran (Bio-Rad) mit ECL-Detektion (Amersham) nachgewiesen.
Die Inhibition der Proteinexpression des Stat6 in der humanen HeLa-Zelllinie durch siRNR ist in 1 dargestellt. 5 × 10^4 Hela-Zellen wurden in einer 12-well Mikrotiterplatte mit 0,1 μM siRNA und Tfx-20 mit einem Ladungsratio von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Nach 48 h wurden die Proteine extrahiert und mit einer 7,5% SDS-PAGE aufgetrennt. Das Stat6 wurde durch Immunoblot mit dem M20-Stat6-Antikörper nachgewiesen. Lane 1, 2, 3, 4 und 5: Kontrolle ohne siRNA, Kontroll-siRNA, ss1, ss2 und ss3. 1 demonstriert, dass die siRNA ss3 noch wirksamer als ss1 und ss2 ist. Die siRNA ss3 ist auch in der humanen Lungenepithel-Karzinomzelllinie A549 und in der murinen pro-B-Zelllinie BaF3 und Lungenfibroblasten-Zelllinie L929 wirksam.
Beispiel 4: Charakterisierung der siRNA-Hemmung der Stat6-Expression auf die IL-4 abhängige Proliferation
IL-4 stimuliert die Proliferation der murinen pro-B-Zelllinie BaF3 über den Stat6-Signalweg. BaF3-Zellen werden mit 0,3 μM siRNA und DOTAP über 2 Stunden transfiziert und 24 h in Gegenwart von 1 nM IL-3 inkubiert. Nach Entfernung des IL-3 durch Waschung mit dem Kulturmedium werden die Zellen mit 1 nM IL-4 über 24 h inkubiert und mit dem XTT-Test (Roche) die Proliferationsrate gemessen.
Beispiel 5: Charakterisierung der siRNA-Hemmung der stat6-Expression auf die IL-4 und TNFalpha-stimulierte Expression des chemotaktischen Proteins Eotaxin
IL-4 und TNFalpha stimulieren die Bildung von Eotaxin durch humane Hautfibroblasten. Hautfibroblasten werden mit 0,1 μM siRNA und Tfx-20 über zwei Stunden transfiziert und 24 Stunden inkubiert. Die Eotaxin-Bildung wird durch Zugabe von 1 nM IL-4 und 1 nM TNFa induziert und nach 48 h Inkubation im Zellkulturüberstand durch einen Eotaxin-ELISA (Becton Dickison) gemessen.
SEQUENCE LISTING

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein die Stat6 mRNA Expression modulierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid eine siRNA oder eine shRNA ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID 1 bis 9.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusätzlich enthaltend physiologisch verträgliche galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
Verwendung eines Oligonukleotides, insbesondere einer siRNA oder einer shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemwegsveränderungen und von Krebs.
Die Expression von Stat6 mRNA inhibierendes isoliertes Oligonukleotid, insbesondere siRNA oder shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Oligonukleotid nach Anspruch 6 in einer physiologisch wirksamen Dosis mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird.
Verfahren zur Modulierung, insbesondere Inhibierung, der Expression von Stat6 mRNA, wobei einer Stat6 exprimierenden Zelle, insbesondere einer Vertebratenzelle, vorzugsweise einer humanen Zelle, in vitro oder in vivo eine physiologisch wirksame Menge einer Stat6 modulierenden, insbesondere inhibierenden, Nukleinsäure, insbesondere eine siRNA oder eine shRNA, vorzugsweise eine Nukleinsäure gemäß einer der Sequenzen 1 bis 9, zugeführt wird.
Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, einer pathologischen Atemwegsveränderung und/oder von Krebs, wobei einem erkrankten Menschen oder Säugetier eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dargereicht wird.