DE69433978T2

DE69433978T2 - Methode der spezifischen abschaltung von genen durch dna-methylierung

Info

Publication number: DE69433978T2
Application number: DE69433978T
Authority: DE
Inventors: Robin Holliday
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2014-06-11
Also published as: AU6965394A; EP0707653B1; EP0707653A1; DE69433978D1; US5840497A; WO1994029461A1; AU675333B2; EP0707653A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zum Stummschalten spezifischer Gene mittels DNA Methylierung. Die Methode umfasst das Einführen von Oligonukleotiden in Zellen, wobei die Oligonukleotide 5-Methyl-cytosinreste enthalten und eine Sequenz, die komplementär zu einem Teil der DNA des Gens, das stumm zu schalten ist, haben.
Es ist bekannt, dass die Methylierung von Cytosin in DNA mittels dem Enzym DNA Methyltransferase im biologischen Umfeld zu einer Inaktivierung der Genexpressionen führt. Außerdem erkennt das Enzym sobald ein Cytosinrest zu einem CpG Dinukleotid methyliert ist, dieses Dinukleotid als Substrat und methyliert den neuen Strang nach der DNA Replikation, wogegen nichtmethylierte CpG Dinukleotide unmethyliert bleiben. Ein vorgegebenes Muster an DNA Methylierung wird somit weitergegeben und methylierte Gene bleiben stumm. Ein unspezifisches Stummschalten von Genen in CHO Zellen konnte durch die Aufnahme von 5-Methyl-deoxycytosin-triphosphat, erreicht werden. (Holliday & Ho, 1991, Somatic Cell and Molecular Genetics, 17: 543–550; Nyce, 1991, Somatic Cell and Molecular Genetics, 17: 543–550). Die von den Erfindern entwickelte neue Methode kann spezifische Gene stummschalten, vorausgesetzt die Basensequenz in der Promotorregion ist bekannt. Die von den Erfindern entwickelte Methode, beinhaltet die Verwendung von Einzelstrang-Oligonukleotiden, welche 5-Methyl-deoxycytosin in geeigneten CpG Dinukleotid enthalten.
Die vorliegende Erfindung besteht daher in ihrer ersten Ausführungsform in einer Methode zum Stummschalten des spezifischen Genes in einer Zelle, umfassend das Einführen eines Einzelstrang-Oligonukleotides in die Zelle, wobei das Oligonukleotid ein 5-Methyl-deoxycytosin enthält und der Einzelstrang eine Sequenz, die komplementär zu einem Teil der DNA Sequenz des Genes, welches still zu schalten ist, hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Einzelstrang-Oligonukleotid eine Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb der Promotorregion oder innerhalb der CpG Inseln des stumm zu schaltenden Genes, ist.
Vorausgesetzt, dass einige oder alle der Zellen aktiv DNA synthetisieren (S Phase), kann das methylierte Oligonukleotid an der Einzelstrang-DNA an der Replikationsgabel binden oder hybridisieren. Dem gemäß ist es momentan bevorzugt die Zellen zu synchronisieren und während der DNA Synthese zu behandeln. Synchronisation kann durch Serumentzug mit nachfolgender Serumzugabe, welches die DNA Synthese stimuliert, erreicht werden. Auch andere Methoden der Synchronisation sind anwendbar.
Wie aus dem oben stehenden klar wird, hängt die Methode der vorliegenden Erfindung von der Synthese einzelsträngiger Oligonukleotide, welche 5-Methyl-deoxycytosin enthalten, an geeigneten CpG Dinukleotiden oder anderen Stellen ab. Die Synthese ist ein Standardverfahren, bei dem cytosin-phosphoroamidat mit 5-Methyl-deoxycytosin-phosphoroamidat ersetzt wird (ABI systems oligonucleotide synthesiser). Das Zielgen ist in der Promotorregion unmethyliert und ist oder kann in der zu behandelnden Zelle exprimiert sein. Das Oligonukleotid kann in die Zelle durch Elektroporation, Transfektam oder anderen Mitteln, die permessiv machen, oder anderen Methoden, um DNA Zellen einzuführen, transduziert werden. Vorausgesetzt, dass alle Zellen aktiv DNA synthetisieren (S Phase), kann das methylierte Oligonukleotid am DNA Einzelstrang an der Replikationsgabel binden oder hybridisieren. Dadurch entsteht ein teilweise methyliertes Substrat für die DNA Methyltransferase. Das Enzym methyliert die zelluläre DNA in den Bereichen der Hybridisierung. Die Methylierung in einer kurzen Region des Promotors schaltet das spezifische Gen stumm. Dieser Effekt ist dauerhaft, da die Methylierung nachfolgend weitergegeben wird. Um das Zielgen spezifisch zu erkennen, sollte das Oligonukleotid eine ausreichende Länge (20–40 Basen) haben, um ausschließlich mit diesem Gen und nicht einem anderen im Genom zu hybridisieren. Alternativ kann das Oligonukleotid auch während der aktiven Transkription an das Gen hybridisieren, denn auch während diesem Vorgang findet ein Entwinden der DNA statt. Das Endergebnis ist dasselbe.
Die Zellen können primäre menschliche Zellen oder stabile Zelllinien von menschlichem oder tierischem Ursprung sein. Die Zellen sollten synchronisiert sein und während der DNA Synthese behandelt werden. Synchronisation kann durch Serumentzug mit nachfolgender Zugabe von Serum, welches die DNA Synthese stimuliert, erreicht werden. Jede alternative Methode zur Synchronisation kann verwendet werden.
Um das Stummschalten des Genes nachzuweisen ist es wünschenswert oder notwendig ein Selektionsverfahren zu haben, welches Zellen, die ein aktives Gen enthalten, eliminiert. Zahlreiche solche Selektionsverfahren sind verfügbar, und umfassen Gene, welche Thymidinkinase, Adenin-phosphoribosyl-Transferase und Hypoxanthin-phosphoribosyl-Transferase synthetisieren. Es sollte nur eine aktive Kopie des Zielgenes vorliegen. Gene des Histokompatibilitäts Komplexes, wie HLA-A, produzieren in menschlichen Zellen ein Zelloberflächenantigen. Das geeignete Antiserum und Komplement tötet alle Zellen, die dieses Antigen exprimieren. Aus diesem Grund ist das Gen oft heterozygot (z. B. HLA-A2/HLA-A3) und es ist möglich Zellen zu selektieren, die entweder den einen oder anderen Haplotypen exprimieren (z. B. durch Verwendung des Antiserums gegen A2 oder A3 Antigene). Obwohl die Promotorregion für beide Gene dieselbe ist, führt die Methylierung eines der beiden Gene zu der Elimination des Genprodukts und solche Zellen können selektiert werden. Diese Zellen können in einer zweiten Behandlung mit methyliertem Oligonukleotid verwendet werden, um Zellen zu erhalten, denen beide Oberflächenantigene fehlen.
Zahlreiche menschliche Erbkrankheiten sind durch dominante Gene verursacht. Solche dominanten Gene produzieren einen Überschuss eines Genproduktes oder ein verändertes Genprodukt. Zellen solcher betroffenen Individuen könnten "normal" gemacht werden, wenn das dominante Gen spezifisch stumm geschaltet werden kann. Für Hautfibroblasten oder Lymphozyten, hämopoetische Knochenmarkstammzellen konnte dies in vitro erreicht werden. In geeigneten Fällen konnten methylierte Oligonukleotide verwendet werden, um spezifische Gene in vivo stumm zu schalten. Derartige Ansätze erinnern an Verfahren der Gentherapie, bei denen ein defektes Empfängergen in ein intaktes Gen durch die Aufnahme und Integration von DNA in das Chromosom umgewandelt wird. Weitere Informationen zur Gentherapie können der Publikation von W. French Anderson, 1992, "Human Gene Therapy", Science 256, 808–813 entnommen werden.
Es sollte weiterhin angemerkt werden, dass die Oligonukleotide wie sie in der Methode der vorliegenden Erfindung verwendet werden sowohl an den Sense wie auch Antisensestrang der DNA hybridisieren können.
Um die Degradierung der Einzelstrang Oligonukleotide durch Nukleasen zu verhindern, werden derzeit bevorzugt methylierte Phosphorothioat Oligonukleotide verwendet. Weitere Informationen betreffend derartiger Oligonukleotide können bei Eckstein & Gish, 1989, TIBS 14, 97–100 gefunden werden.
Wie es für jeden Fachmann ersichtlich ist, bietet die vorliegende Erfindung eine breite Zahl von Anwendungsmöglichkeiten. Durch das Stummschalten von Histokompatibilitätsgenen, können beliebige Spenderzellen für den Einsatz in Transplantationen produziert werden. Tatsächlich ist es absehbar, dass zahlreiche Zellen, die keine Antigene exprimieren, welche typischerweise bei Transplantationsabstoßungsreaktionen involviert sind, hergestellt werden können. Dies eröffnet eine Verwendungsmöglichkeit für eine Vielzahl von Spenderzellen.
Ein anschauliches Modell um das System zu überprüfen, ist das Gen, welches für HPRT (Hypoxanthin-phosphoribosyl-Transferase) kodiert, denn es ist X-chromosomal gebunden, und hat nur eine Kopie in männlichen Zellen und eine aktive Kopie in weiblichen Zellen. Zellen mit einem aktiven HPRT Gen können in HAT Medium (enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) wachsen. Sie werden jedoch durch 6-Thioguanin (6 TG) abgetötet. Zellen ohne HPRT Gen sind resistent gegenüber 6 TH, können aber nicht im HAT Medium wachsen. Es ist daher möglich, auf Verlust der Enzymaktivität im Anschluss an das Stummschalten des Genes und ebenso auf das Wiedererlangen der Enzymaktivität im Anschluss an eine Reaktivierung des Genes zu selektieren. Reaktivierung kann durch das demethylierende Agens 5-Azacytidin, erreicht werden.
Die menschlichen, Maus- und Hamster-HPRT Gene sind bereits sequenziert worden. Sie enthalten 9 Exons und sehr lange Introns. Am 5' Ende des Gens befindet sich eine CpG Insel, die normalerweise unmethyliert ist, während der X-chromosomalen Inaktivierung jedoch methyliert wird. Die Promotorregion enthält zahlreiche CpG Dinukleotide, dennoch gibt es Gründe zu glauben, dass die entscheidenden regulatorischen Stellen in einem relativ kurzen DNA Stück (100–200 Nukleotide) liegen.
Experimente wurden mit männlichen Fibroblasten, Stamm MRC-5, durchgeführt. Hierzu werden methylierte Oligonukleotide mit einer Länge von 40–50 Basen, die verschiedene Regionen des Promotors abdecken können, synthetisiert und zur Behandlung der Zellen eingesetzt.
Im Anschluss an einen Serumentzug werden die Zellen teilweise synchronisiert und behandelt, wenn die Mehrzahl in der S-Phase – 20 Stunden nach dem Serumersatz – sind. Es wird eine 6–8 tägige Expressionszeit gewährt, um zu erlauben, dass zunächst bestehende HPRT verschwindet. Anschließend werden die Zellen in 6 TG Medium ausgesäht. Entstehende Kolonien werden isoliert, vermehrt und auf Reaktivierung mittels Azacytidin getestet. Erfolgreich reaktivierte Zellen können im HAT Medium selektiert werden. Wenn keine Kolonien erhalten werden, werden Oligonukleotide mit anderen Sequenzen der Promotorregion getestet.

Claims

Eine Methode zum Stummschalten eines spezifischen Genes in einer Zelle umfassend in vitro Einführung des Einzelstrang Oligonukleotides in eine Zelle, wobei das Oligonukleotid zwischen 20 und 50 Nukleotide lang ist und 5-Methyl-deoxycytosin umfasst, und wobei das Einzelstrang Oligonukleotid eine Sequenz, die komplementär zu der DNA Sequenz des Genes, welches stumm zu schalten ist, hat.
Eine Methode entsprechend Anspruch 1, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid zwischen 20 und 40 Nukleotide umfasst.
Eine Methode gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid eine Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des Genes, welches stumm zu schalten ist, hat.
Eine Methode gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid eine Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb der CpG Inseln des Genes, welches stumm zu schalten ist, hat.
Eine Methode gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid ein methyliertes Phosphorothioat Oligonukleotid ist.
Eine Methode gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zelle Bestandteil einer Zellkultur ist, welche derart behandelt wurde, dass der Zellzyklus der einzelnen hierin enthaltenen Zellen synchronisiert ist.
Eine Methode gemäß Anspruch 6, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid in die Zellen eingeführt wird, wenn die Zellen der Kultur in der S Phase sind.
Verwendung eines Einzelstrang Oligonukleotides, umfassend zwischen 20 und 50 Nukleotide und 5-Methyl-deoxycytosin, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz, welche komplementär zu einem Teil der DNA Sequenz eines Genes ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung von Organabstoßungen.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid, umfassend zwischen 20 und 50 Nukleotiden und 5-Methyl-deoxycytosin, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz komplementär zu einem Teil der DNA Sequenz eines Genes hat, zur Verwendung beim Stummschalten eines Genes in einer Zelle.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß Anspruch 9 umfassend zwischen 20 und 40 Nukleotiden.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß Anspruch 9 oder 10 mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Sequenz innerhalb der Promotorregion des Genes, welches Stumm zuschalten ist, ist.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 mit einer Sequenz komplementär zu einer Sequenz innerhalb der CpG Inseln des Genes, welches stumm zu schalten ist.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Oligonukleotid ein methyliertes Phosphorothioat Oligonukleotid ist.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Zelle in einer Zellkultur enthalten ist, die derart behandelt wurde, dass der Zellzyklus, der darin enthaltenen Zellen, synchronisiert ist.
Ein Einzelstrang Oligonukleotid gemäß Anspruch 14, wobei das Einzelstrang Oligonukleotid in die Zelle eingeführt wird, während die Zellen der Zellkultur in der S-Phase sind.