DE69432375T2

DE69432375T2 - Antisense Oligonukleotide zur Behandlung von immunsuppressiven Wirkungen von TGF-beta2

Info

Publication number: DE69432375T2
Application number: DE69432375T
Authority: DE
Inventors: Georg-Ferdinand Schlingensiepen; Wolfgang Brysch; Karl-Hermann Schlingensiepen; Reimar Schlingensiepen; Ulrich Bogdahn
Original assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Current assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Priority date: 1993-04-30
Filing date: 1994-04-29
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2014-04-30
Also published as: DE69429617T2; JP2004024264A; AU6794594A; JP3600831B2; DE69429617D1; ATE211762T1; WO1994025588A3; DE69432375D1; US6455689B1; ATE235549T1; US7667027B2; JP3555952B2; JPH08509370A; US20080214483A1; WO1994025588A2; US20030040499A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antisense-Oligonucleotide oder effektive Derivate davon, die mit einem Bereich eines Gens hybridisieren, das für den transformierenden Wachstumsfaktor β₂ (TGF-β₂) codiert, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens ein Antisense-Oligonucleotid oder effektive Derivate davon umfasst, die mit einem Bereich eines Gens hybridisieren, das für TGF-β₂ codiert, sowie die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Tumoren und/oder für die Behandlung des immunsuppressiven Effekts von TGF-β₂.
Der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) ist ein Faktor, der zum Beispiel von humanen Gliomzellen sezerniert wird. Humane Gliome, wie Glioblastome, sind humane Tumoren, für die es zur Zeit keine befriedigende Therapie gibt. Das TGF-β unterstützt in einer autokrinen Weise das Wachstum der jeweiligen Tumorzellen. Der Faktor zeigt immunsuppressive Effekte und reduziert die Proliferation solcher cytotoxischer T-Lymphocyten, die ansonsten in der Lage wären, die Gliomzellen zu zerstören.
Die Suppression der Immunreaktion ist bei Patienten mit malignen Gliomen gut. dokumentiert. Diese Patienten zeigen eine Vielzahl immunologischer Defekte einschließlich cutaner Anergie, gesenkter Antikörperproduktion und reduzierter Zahlen von zirkulierenden T-Zellen (W.H. Brooks, M.G. Netsky, D.A. Horwitz, D.E. Normansell, Cell mediated immunity in patients with primary brain tumors, J. Exp. Med., 136: 1931-1947, 1972, und T. Roszman, L. Elliott, W. Brooks, Modulation of T-cell function by gliomas, Immunol. Today 12: 370-374, 1991). Jüngere Studien weisen darauf hin, dass diese Schädigungen aus Fehlfunktionen in physiologischen Wegen, die für die normale T-Zellaktivierung erforderlich sind, und aus quantitativen und qualitativen Defekten in T-Zell-Untergruppen resultieren können.
In Proceedings of the 82nd Annual meeting of the American Association for Cancer Research, Houston, Texas, USA, 15.-18. Mai 1991, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. Annu. Meet. 32 (0), 1991, 427, ist offenbart, dass Faktor-β-Antisense-Oligonucleotide eine humane Melanomzelllinie unter serumangereicherten Kulturbedingungen hemmen und unter serumfreien Kulturbedingungen stimulieren. Die gewonnenen Ergebnisse weisen auf unterschiedliche Rollen des zellulären TGF-β₁ bei der Wachstumsregulierung von HTZ-19-Zellen hin, die von der Menge des im Kulturmedium vorhandenen Serums abhängen. Außerdem kann dies auf das biologische Potential und mögliche Nachteile von exogen verabreichtem TGF-β-Antisense hinweisen.
J. Exp. Med. 174(4), 1991, 925-930, J. Hatzfeld et al., "Release of early human hematopoietic progenitors from quiescence by antisense transforming growth factor β-1 or Rb oligonucleotides", offenbart die Freisetzung von frühen humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen aus der Latenz durch Antisense-transformierenden-Wachstumsfaktor β1 oder Rb-Oligonucleotide. Rb-Antisense-TGF-β reguliert den Cyclusstatus von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen negativ über eine Wechselwirkung mit dem Rb-Genprodukt.
Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 88, Februar 1991, Washington US, Seite 1516-1520, J. Potts et al., "Epithelial-mesenchymal transformation of embryonic cardiac antisense oligodeoxynucleotide to transforming growth factor beta 3", offenbart, dass die Epithel-Mesenchym-Transformation von embryonalen Herzendothelzellen durch ein modifiziertes Antisense-Oligodesoxynucleotid gegen transformierenden Wachstumsfaktor β3 gehemmt wird. Die Transformation hängt von der Aktivität eines vom Herzen produzierten Moleküls des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) ab. Modifizierte Antisense-Oligodesoxynucleotide, die gegen nichtkonservierte Bereiche von TGF-β1, –2, –3 und –4 erzeugt wurden, wurden hergestellt, um die möglichen Rollen dieser Vertreter bei dieser Transformation zu untersuchen. Als Ergebnis hat sich gezeigt, dass ein spezieller Vertreter der TGF-β-Familie (TGFβ3) für die Epithel-Mesenchym-Transformation wesentlich ist.
WO-A-92/17206 offenbart eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden, um die Bildung von Narbengewebe während der Heilung zu hemmen, wobei die Zusammensetzung eine effektive aktivitätsinhibitorische Menge eines oder mehrerer Wachstumsfaktor-Neutralisierungsmittel, die spezifisch nur gegen fibrotische Wachstumsfaktoren sind, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung und ein Verfahren zur Verabreichung der Zusammensetzung an einen Wirt, der unter Gewebsverwundung leidet, sind ebenfalls offenbart.
WO-A-90/09180 offenbart Verfahren, die für die autologe Knochenmarkstransplantation und Krebstherapie geeignet sind. Knochenmarkzellen von einem Patienten, der Krebs hat, werden mit ausgewählten Antisense-Oligonucleotiden behandelt, um das Knochenmark an malignen Zellen abzureichern, bevor es zurück in den Knochenmarkspender infundiert wird.
P. Jachimczak et al. offenbaren in J. Neurosurg. 78 (1993), 944-951, das während des Prioritätsjahres veröffentlicht wurde, eine in-vitro-Studie unter Verwendung eines Antisense-Oligonucleotids gegen TGF-β₂, das der SEQ ID Nr. 136 entspricht.
Y. Chai et al. offenbaren in Developmental Biology 162 (1994), 85-103, das während des Prioritätsjahres veröffentlicht wurde, ein Antisense-Oligonucleotid für TGF-β₂, das ein als SEQ ID Nr. 57 identifiziertes Antisense-Oligonucleotid abdeckt und teilweise mit SEQ ID Nr. 136 überlappt.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Krebszellen bereitzustellen, die mit einer Immunsuppression korreliert sind. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein effektives Mittel bereitzustellen, das das Wachstum von Tumorzellen hemmt, die mit einer Immunsuppression in Zusammenhang stehen.
Gemäß der Erfindung sind Antisense-Oligonucleotide oder Modifikationen davon, die aus den folgenden Nucleinsäuresequenzen, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 72, 76, 79, 83, 85 oder 136 identifiziert sind, bestehen, in der Lage, die oben angesprochenen Probleme zu lösen. Das Antisense-Oligonucleotid ist entweder in der Lage, mit Bereichen einer Genregion, die für TGF-β codieren, und/oder mit Bereichen einer Genregion, die für TGF-β codieren oder nicht codieren, zu hybridisieren. Zum Beispiel hybridisieren einige Nucleotide der Antisense-Oligonucleotidsequenz, die mit einem Bereich einer Genregion hybridisiert, der für den transformierenden Wachstumsfaktor β codiert, mit einem Bereich, der nicht für den transformierenden Wachstumsfaktor codiert, wohingegen der andere Teil der jeweiligen Sequenz mit einer Genregion hybridisiert, die für TGF-β codiert. Selbstverständlich liegt es ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung, dass das Antisense-Oligonucleotid mit einem Bereich einer Genregion hybridisiert, der gerade für den Wachstumsfaktor β codiert. Der Fachmann ist sich auch darüber im Klaren, dass Fragmente, die Teilsequenzen des Antisense-Oligonucleotids aufweisen, gemäß der Erfindung funktionieren, solange die Produktion von TGF-β reduziert oder gehemmt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Antisense-Oligonucleotid oder sein effektives Derivat ein Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotid.
Gemäß der Erfindung sind die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung durch Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphonsäuretriesterchemie durch Verlängern der Nucleotidkette in 3'-5'-Richtung erhältlich, wobei das jeweilige Nucleotid an das erste Nucleotid gekoppelt wird, das kovalent an die feste Phase gebunden ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Abspalten der 5'-DMT-Schutzgruppe vom vorigen Nucleotid;
– Hinzufügen des jeweiligen Nucleotids für die Kettenverlängerung;
– Modifizieren von Phosphitgruppen und anschließend Blockieren von nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen; und
– Abspalten des Oligonucleotids von dem festen Träger;
– anschließendes Aufarbeiten des Syntheseprodukts.

Die chemischen Strukturen von Oligodesoxyribonucleotiden sind in 1 angegeben, und die jeweiligen Strukturen von Antisense-Oligoribonucleotiden sind in 2 angegeben. Die Oligonucleotidkette ist als Ausschnitt aus einer längeren Nucleotidkette zu verstehen.
In 1 bedeutet der Buchstabe B eine organische Base, wie Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T), die über N9 (A, G) oder N1 (C, T) an die Desoxyribose gekoppelt ist. Die Sequenz der Basen ist das reverse Komplement der genetischen Zielsequenz (mRNA-Sequenz). Die verwendeten Modifikationen sind

1. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen alle R¹ substituiert sind durch: 1.1 R¹ = O 1.2 R¹ = S 1.3 R¹ = F 1.4 R¹ = CH₃ 1.5 R¹ = OEt
2. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids variiert sind:
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat n = ein Oligodesoxyribonucleotid-Stück einer Länge von 6-20 Basen
3. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids abwechselt:
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat n = ein Oligodesoxyribodinucleotid-Stück einer Länge von 4-12 Dinucleotiden
4. Jede der Verbindungen 1.1-1.5, 2.1-2.4, 3.1-3.3, die an R² mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen: 4.1 Cholesterin 4.2 Poly(L)lysin 4.3 Transferrin
5. Jede der Verbindungen 1.1-1.5, 2.1-2.4, 3.1-3.3, die an R³ mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen: 5.1 Cholesterin 5.2 Poly(L)lysin 5.3 Transferrin Im Falle der RNA-Oligonucleotide (2) sind die Basen (Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Uracil (U)) über N9 (A, G) bzw. N1 (C, U) an die Ribose gekoppelt. Die Sequenz der Basen ist das reverse Komplement der genetischen Zielsequenz (mRNA-Sequenz). Die in der Oligonucleotidsequenz verwendeten Modifikationen sind wie folgt:
6. Oligoribonucleotide, bei denen alle R¹ substituiert sind durch: 6.1 R¹ = O 6.2 R¹ = S 6.3 R¹ = F 6.4 R¹ = CH₃ 6.5 R¹ = OEt
7. Oligoribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids variiert sind:
wobei B = Ribonucleotid A, C, G oder U, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat n = ein Oligoribonucleotid-Stück einer Länge von 4-20 Basen
B. Oligoribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids abwechselt:
wobei B = Ribonucleotid A, C, G oder U, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat n = ein Oligoribodinucleotid-Stück einer Länge von 4-12 Dinucleotiden
9. Jede der Verbindungen 6.1-6.5, 7.1-7.4, 8.1-8.3, die an R² mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen: 9.1 Cholesterin 9.2 Poly(L)lysin 9.3 Transferrin
10. Jede der Verbindungen 6.1-6.5, 7.1-7.4, 8.1-8.3, die an R³ mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen: 10.1 Cholesterin 10.2 Poly(L)lysin 10.3 Transferrin
11. Jede der Verbindungen 6.1-6.5, 7.1-7.4, 8.1-8.3, 9.1-9.3, 10.1-10.3, wobei alle R⁴ substituiert sind durch: 11.1 R⁴ = O 11.2 R⁴ = F 11.3 R⁴ = CH₃

Modifikationen der Antisense-Oligonucleotide sind vorteilhaft, da sie, wenn man sie anwendet, von endogenen Faktoren nicht so schnell zerstört werden wie natürlich vorkommende Nucleotidsequenzen. Der Fachmann ist sich jedoch darüber im Klaren, dass auch natürlich vorkommende Nucleotide mit der offenbarten Sequenz gemäß der Erfindung verwendet werden können. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform ist die Modifikation eine Phosphorothioat-Modifikation.
Die Synthese der Oligodesoxynucleotide der Erfindung wird wie folgt ausführlicher als Beispiel beschrieben.
Oligodesoxynucleotide wurden durch schrittweise 5'-Addition von geschützten Nucleosiden unter Verwendung von Phosphonsäuretriesterchemie synthetisiert. Das Nucleotid A wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxyadenosin(N⁴-benzoyl)-N,N' diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit (0,1 M) eingeführt; C wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxycytidin(N⁴-benzoyl)-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt; G wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxyguanosin(N⁸-isobutyryl)-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt; und T wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxythymidin-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt. Die Nucleoside wurden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 M, gelöst in Acetonitril, angewendet.
Die Synthese erfolgte auf Glasteilchen mit kontrollierter Porengröße mit einem Durchmesser von ungefähr 150 μm (Porendurchmesser 500 Å), an die das am weitesten 3' liegende Nucleosid über einen langkettigen Alkylamin-Linker kovalent gebunden wird (mittlere Beladung 30 μmol/g fester Träger).
Der feste Träger wurde in eine zylindrische Synthesesäule geladen, an beiden Enden mit Filtern verschlossen, die ein ausreichendes Fließen von Reagentien zulassen, aber den festen Syntheseträger zurückhalten. Reagentien wurden unter Verwendung eines Überdrucks von Inertgas in die Synthesesäule geleitet und aus dieser entfernt. Die Nucleotide wurden in 3'→5'-Richtung an die wachsende Oligonucleotidkette addiert. Jedes Nucleotid wurde unter Verwendung einer Runde des folgenden Synthesecyclus angekuppelt:
Man spalte die 5'-DMT-(Dimethoxytrityl)-Schutzgruppe des vorigen Nucleotids mit 3-Chloressigsäure in Dichlormethan ab und wasche die Säule anschließend mit wasserfreiem Acetonitril. Dann wurde je nach der Sequenz eine der Basen gleichzeitig in Form ihres geschützten Derivats plus Tetrazol in Acetonitril hinzugefügt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch entfernt, und das Phosphit wurde mit einem Gemisch von Schwefel (S₈) in Schwefelkohlenstoff/Pyridin/Triethylamin oxidiert. Nach der Oxidationsreaktion wurde das Gemisch entfernt, und die Säule wurde mit Acetonitril gewaschen. Die nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen wurden durch gleichzeitige Zugabe von 1-Methylimidazol und Essigsäureanhydrid/Lutidin/Tetrahydrofuran verkappt. Danach wurde die Synthesesäule mit Acetonitril gewaschen, und der nächste Cyclus wurde begonnen.
Der Aufarbeitungsvorgang und die Reinigung der Syntheseprodukte erfolgten wie folgt.
Nach der Zugabe des letzten Nucleotids wurden die Desoxynucleotide durch Inkubation in Ammoniaklösung von dem festen Träger abgespalten. Schutzgruppen an exocyclischen Basen wurden durch weitere Inkubation in Ammoniak entfernt. Dann wurde der Ammoniak im Vakuum verdampft. Syntheseprodukte der vollen Länge, die noch die 5'-DMT-Schutzgruppe tragen, wurden mit Hilfe von Umkehrphasen-HPLC (high performance liquid chromatography) auf einer stationären C₁₈-Phase von kürzeren Ausschusskontaminanten getrennt. Eluenten aus dem Produktpeak wurden aufgefangen, im Vakuum getrocknet, und die 5'-DMT-Schutzgruppe wurde durch Inkubation in Essigsäure abgespalten, welche danach im Vakuum verdampft wurde. Die Syntheseprodukte wurden im entionisierten Wasser solubilisiert und dreimal mit Diethylether extrahiert. Dann wurden die Produkte im Vakuum getrocknet. Eine weitere HPLC-AX-Chromatographie wurde durchgeführt, und die Eluenten aus dem Produktpeak wurden gegen einen Überschuss von Tris-Puffer dialysiert, und eine zweite Dialyse erfolgte gegen entionisiertes Wasser. Die Endprodukte wurden lyophilisiert und trocken gelagert.
Die Antisense-Oligonucleotide der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament verwendet werden. Dieses Medikament kann zur Behandlung von Tumoren, bei denen die Expression von TGF-β relevant für die Pathogenität ist, verwendet werden, indem man den transformierenden Wachstumsfaktor β hemmt und dadurch eine Immunsuppression reduziert und/oder die pathologische Angiogenese hemmt. Die Reduktion der Immunsuppression, die durch die Verabreichung einer effektiven Dosis von Antisense-TGF-R-Oligonucleotiden bewirkt wird, kann von einer im Vergleich zum Zustand vor der Verabreichung des Medikaments erhöhten Proliferation cytotoxischer Lymphocyten begleitet sein. Daraufhin beginnen die Lymphocyten ihre cytotoxische Aktivität, indem sie die Anzahl der Tumorzellen senken.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung eignet sich weiterhin für die Behandlung einer endogenen Hyperexpression von TGF-β, für die Behandlung von Brusttumoren, für die Behandlung von Neurofibromen, malignen Gliomen einschließlich Glioblastomen und für die Behandlung und Prophylaxe der Bildung von Hautkrebs sowie für die Behandlung von Speiseröhren- und Magenkarzinomen.
Die Wirkung von TGF-β₂-spezifischen Antisense-Oligonucleotiden auf die Proliferation von humanen T-Zellen und die Cytotoxizität nach Stimulierung mit autologen kultivierten Gliomzellen wurde untersucht. Es wurde gezeigt, dass von TGF-β₂ abgeleitete Phosphorothioat-Derivate (5-ODNs) die Proteinexpression von TGF-β in Gliomzellen spezifisch hemmen können. Außerdem machen TGF-β₂-spezifische S-ODNs immunsuppressive Wirkungen von TGF-β nach T-Zellproliferation und Cytotoxizität in erheblichem Maße wieder rückgängig.
Es wurde gezeigt, dass die T-Zell-Antwort bei humanen Hirntumorpatienten deutlich reduziert ist und dass tumorinfiltrierende Lymphocyten nur eine marginale Wirkung auf die Tumorprogression einzelnen Patienten haben (Palma, L., Di Lorenzo, N., Guidett, B. Lymphocytes infiltrates in primary glioblastomas and recidivous gliomas, J. Neurosurg., 49: 854-861, 1978, and Ridley, A., Cavanagh, J.B. Lymphocytes infiltration in gliomas, Evidence of possible host resistance, Brain, 4: 117-124, 1971). Isolierte tumorinfiltrierende Lymphocyten aus Hirntumoren sind funktionell inkompetent, und diese immunsuppressiven Effekte wurden in vitro and in vivo auf TGF-β₂ zurückgeführt (Bodmer, S., Strainer, K., Frei, K., Siepl, Ch., de Tribolet, N., Held, I., Fontana, A., Immunosuppression and transforming growth factor-β₂ in glioblastoma, J. Immunol., 143: 3222-3229, 1989; Couldwell, W.T., Dore-Duffy, P., Apuzzo, M.L.J., Antel, J.P. Malignant glioma modulation of immune function: relative contribution of different soluble factors, J. Neuroimmunol., 33: 89-96, 1991; Kuppner, M.C., Hamou, M.F., Sawamura, Y., Bodner, S., de Tribolet, N., Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma derived transforming growth factor β₂, J. Neurosurg., 71: 211-217, 1989; Maxwell, M., Galanopoulos, T., Neville-Golden, J., Antoniades, H.N., Effect of the expression of transforming growth factor-β₂ in primary human glioblastomas on immunosuppression and loss of immune surveillance, J. Neurosurg., 76: 799-804, 1992; Palladino, M.A., Morris, R.E., Fletschen Starnes, H., Levinson, A.D., The transforming growth factor betas, A new family of immunoregulatory molecules, Ann. N.Y. Acad. Sci., 59: 181 bis 187, 1990; Roszman, T., Elliott, L., Brooks, W., Modulation of T-cell function by gliomas, Immunol. Today 12: 370-374, 1991).
3: TGF-β-Western-Blot-Analyse von serumfreien Gliomkultur-Zelllysaten. Die Spuren 2 (HTZ-153), 3 (HTZ-209) und 4 (HTZ-243) zeigen Blots der jeweiligen Zelllysate mit TGF-β₂-spezifischem Antikörper an. Spur 1 stellt eine TGF-β-positive Kontrolle dar, bei der 50 ng reines 2 verwendet wurden. TGF-β₂-Antisense-behandelte Zellen sind in den Spuren A gezeigt. Unbehandelte Kontrollzellen sind in den Spuren B abgebildet. Die Zellen wurden 48 h lang mit Antisense-Oligonucleotiden behandelt (1 μM Endkonzentration).
4: TGF-ß₂-mRNA-Expression in Gliomzellen. Jede Spur enthielt 20 μg cytoplasmatische RNA aus den Tumoren A (HTZ-153), B (HTZ-209), C (HTZ-243), die mit einer ³²P-markierten TGF-β₂-Oligonucleotidsonde hybridisierte. Um gleiche Mengen an RNA zu bestätigen, wurde der Blot vor der Hybridisierung mit Methylenblau angefärbt (A', B', C').
5: TGF-β₂-mRNA-Expression in Gliomzellen nach TGF-ß₂-S-ODN-Behandlung. Cytoplasmatische RNA von unbehandelten Gliomzellen A (HTZ-153), B (HTZ-209) und C (HTZ-243) oder von Gliomzellen A', B' und C', die 48 Stunden lang unter serumangereicherten Kulturbedingungen mit 1 μM (f.c.) TGF-β₂spezifilschen 5-ODNs behandelt worden waren, wurden isoliert und einer Northern-Blot-Analyse unterzogen. Jede Spur enthielt 20 μg cytoplasmatische RNA, die mit einer ³²P-markierten TGF-ß₂-Oligonucleotidsonde hybridisierte.
6: Auswirkung von TGF-β₂-spezifischen S-ODNs und TGF-β-neutralisierendem Antikörper auf die Cytotoxizität von PBMCs gegen autologe kultivierte Gliomzellen (Target/Effektor 1:1). Nach 6 Tagen Kultur von PBMCs mit IL-1α und IL-2 wurden die Zellen isoliert, gewaschen, bestrahlt (30 Gy) und in Tar get/Effektor-Verhältnissen von 1:10, 1:5, 1:1 zu autologen Gliomzellen gegeben. Gliom-Targets wurden entweder mit TGF-β-spezifischen S-ODNs oder TGF-β-Antikörper vorbehandelt. Die Cytotoxizität wurde unter Verwendung eines modifizierten Mikrocytotoxizitätsassays bewertet. Die Daten sind Mittelwerte von jeweils drei Parallelproben, Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Datenpunkte geben einzelne Kontrollen wieder, bei denen Tumor-Targets nur mit Medium behandelt wurden (Kontrolle). TGF-β-Antikörper (100 μg/ml) oder S-ODNs (1 μM bzw. 5 μM) als Standards für Cytotoxizitätseffekte. Dadurch konnten Wirkungen auf Targetzellen durch Antikörper oder 5-ODNs allein ausgeschlossen werden.
7: Dosisabhängige Wirkungen von TGF-β₂-spezifischen und Nonsense-S-ODNs auf die Proliferation von Lymphocyten, Gliomzellen und Lymphocyten, die zusammen mit autologen Gliomzellen (MLTC) kultiviert wurden. A: HTZ-153, B: HTZ-209, C: HTZ-243. PBMCs wurden 6 Tage lang mit IL-1α und IL-2 voraktiviert und weitere 6 Tage lang mit autologen bestrahlten (60 Gy) und mit TGF-β₂-(Nr. 6)- bzw. Nonsense-(Nr. 5)-S-ODSN behandelten Gliomzellen (MLTC) inkubiert. Gleichzeitig wurde ein Teil der voraktivierten PBMCs (Lymphocyten) und der Gliomzellen (Tumor) 3 tage lang mit TGF-β₂-spezifischen (Ly: Nr. 2, Tu: Nr. 4) und Nonsense-S-ODNs (Ly: Nr. 1, Tu: Nr. 3) inkubiert, um vermutete direkte Wirkungen von 5-ODNs auf Effektor- oder Targetzellen allein zu bewerten. Die Proliferation von Lymphocyten und Gliomzellen wurde unter Verwendung eines
³H-TdR-Einbauassays bewert. Die Daten sind Mittelwerte von jeweils drei Parallelproben, Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Charakterisierung von Tumorzellen (autologen Targetzellen)
Tumorzellen von 3 Patienten mit hochgradig malignen Gliomen (HTZ-153 und HTZ 209, Glioblastomen, HTZ-243, malignem Astrocytom, Gr. III-WHO) und ihre jeweiligen autologen Lymphocyten wurden untersucht. Standard-Tumorzellkulturen wurden in Dulbeccos Minimalmedium angelegt, das 20% fetales Kälberserum (FCS, Seromed, Berlin, Deutschland), 1 μM L-Glutamin, MEM-Vitaminlösung und nichtessentielle Aminosäuren (Gibco, Paisley, Schottland, UK) enthält (Bogdahn, U., Fleischer, B., Rupniak, H.T.R., Ali-Osman, F., T-cell mediated cytotoxicity in human glioma, Biology of Brain Tumor, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 70: 501-507, 1986). Weitere Targetzellen waren K562 (eine NK-sensitive Erythromyeloid-Leukämiezelllinie, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Tumorzellkulturen wurden durch Immunocytochemie unter Verwendung des PAP-Verfahrens charakterisiert (Bourne, J.A., Handbook of immunoperoxidase staining methods, DAKO Corporation, Carpintena CA, USA, 1983) in Labtek-Gewebekulturobjektträgern (Miles Laboratories Inc., Naperville, IL, USA) charakterisiert, und zwar mit den folgenden mono- oder polyklonalen Antikörpern gegen: GFAP, Cytokeratin, Neurofilament, Desmin, Vimentin, NSE, HLA, DrO, W6/32 (Klasse-I-Antigen), β₂-Mikroglobulin, Fibronectin, Laminin, Ki 67 (Dakopatts, Glostrup, Dänemark) und Anti-TGF-β (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). TGF-β-spezifische Immunocytochemie wurde nach 48 Stunden Inkubation von Gliomkulturobjektträgern mit Kontrollen durchgeführt, die mit 1 μM Endkonzentration (f.c.) an TGF-β₂-spezifischen S-ODNs und 1 μM (f.c.) Nonsense-S-ODNs behandelt wurden.
Beispiel 2
Charakterisierung von Lymphocyten (Effektorzellen)
Periphere mononukleäre Zellen von allen Gliompatienten wurden am Tage der Operation aus heparinisiertem venösem Blut isoliert, wobei man Gradienten zentrifugation mit Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Schweden) verwendete, und unter Standardbedingungen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert (Bogdahn, U., Fleischer, B., Rupniak, H.T.R., Ali-Osman, F., T-cell mediated cytotoxicity in human glioma, Biology of Brain Tumor, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 70: 501-507, 1986). Lymphocyten wurden in RPMI 1640 (Flow Laboratories Inc., Schottland, UK) mit 10% humanem gepooltem AB-Serum (Flow Laboratories Inc., McLean, VA, USA) und 2 mM L-Glutamin kultiviert. Native und aktivierte (siehe unten) periphere mononukleäre Zellen wurden durch Immunocytochemie charakterisiert, wobei man Komplexe von Alkalischer Phosphatase und monoklonalem Anti-Alkalische-Phosphatase-Antikörper (APAAP-Verfahren, Dakopatts GmbH, Hamburg, Deutschland) (Cordell, J.L., Falim, B., Erber, W.N., et al., Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP-Komplexe), J. Histochem. Cytochem., 32: 219-229, 1984) mit monoklonalen Antikörpern gegen die folgenden Antigene verwendete: CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLA DR (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Beispiel 3
Erzeugung von LAK-Zellen
Da die proliferative und cytotoxische Antwort von peripheren mononukleären Zellen von Gliompatienten unterdrückt ist, wurden Zellen (2 × 10⁶ Zellen/ml) 6 Tage lang in vitro mit Interleukin-1α (10 E/ml) (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) und Interleukin-2 (100 E/ml) (BIOTEST AG Frankfurt/M., Deutschland) in 48-Napf-Flachboden-Gewebekulturplatten (2 × 10⁶ Zellen/ml) (Costar, Cambridge, MA, USA) voraktiviert.
Beispiel 4
Proliferationsassay
In gemischten Lymphocyten-Tumorzell-Kulturen (MLTC) dienten 15 × 10³ letal bestrahlte (60 Gy, ⁶⁴Co-Quelle) Tumorzellen als Stimulatoren und wurden 6 Tage lang in 96-Napf-Flachboden-Gewebekulturplatten (NUNC, Kopenhagen, Dänemark) zusammen mit 25 × 10³ voraktivierten mononukleären Zellen (LAK-Zellen, siehe oben) kultiviert. In MLTC-Experimenten wurden dieselben Kulturmediumbedingungen verwendet wie bei der Voraktivierung. Bei Antisense-Experimenten wurden TGF-β₂-spezifische Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide (S-ODNs) und Nonsense-Oligodesoxynucleotide (siehe unten) 12 Stunden vor dem MLTC-Assay zu den Kulturen gegeben. Neutralisierende Anti-TGF-β-Antikörper (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) wurden 2 Stunden vor dem MLTC zu der Kultur gegeben.
Beispiel 5
Cytotoxizitätsassay
Cytotoxizitätsexperimente wurden mit einem modifizierten Mikrocytotoxizitätsassay durchgeführt (Bogdahn, U., Fleischer, B., Rupniak, H.T.R., Ali-Osman, F., Tcell mediated cytotoxicity in human glioma, Biology of Brain Tumor, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 70: 501-507, 1986). Kurz gesagt, 1,5 × 103 Targetzellen wurden in 96-Napf-Flchboden-Gewebekulturplatten angesetzt. Zwölf Stunden nach dem Ausstreichen wurden TGF-β₂-spezifische 5-ODNs und Nonsense-Oligodesoxynucleotide (Antisense-Kontrollen) zu der Kultur gegeben. Neutralisierende Anti-TGF-β-Antikörper und normales Kaninchenserum (Antikörperkontrollen, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) wurden 2 Stunden nach dem Ausstreichen zu der Kultur gegeben. Verschiedene Verhältnisse (Target(Effektor-Verhältnis von 1:1, 1:5, 1:10) von voraktivierten Effektorzellen (LAK-Zellen) wurden bestrahlt (30 Gy) und 24 Stunden nach dem Ausstreichen für 3 Tage unter Standardkulturbedingungen (RPMI-1640-Kulturmedium, das 10% gepool tes AB-Serum und 2 μM L-Glutamin enthält) zu den jeweiligen Targets gegeben. Während der Cytotoxizitätsexperimente wurden keine Cytokine zu der Kultur gegeben. Eine Inkubationszeit von 3 Tagen wurde gewählt, da sich die statistische Bewertung von Daten zu diesem Zeitpunkt als optimal erwies. Das Abtöten der Targetzellen wurde durch Einbau von Trypanblau-Farbstoff (Daten nicht gezeigt) demonstriert. Die Proliferation von Targetzellen in LAK-Zell-behandelten Targets wurde mit einem Standard-³H-Thymidin-Einbauassay (6-³H-Thymidin, 1 μCi/Napf, spez. Aktivität, 27 Ci/mmol) bewertet. Bestimmung des ³H-Thymidin-Einbaus durch Flüssigszintillationszählung wurde 18 Stunden nach der Inkubation der Zellen durchgeführt. Die spezifische Cytotoxizität wurde berechnet als:
(cpm(Kontrolle) – cpm(Sonde)/cpm(Kontrolle) × 100%
Beispiel 6
Northern- und Western-Blot-Analyse
Cytoplasmatische RNA wurde hergestellt, indem man Gliomzellen, die 48 Stunden lang mit 1 μM (f.c.) TGF-β₂-spezifischen S-ODNs behandelt wurden, und unbehandelte Kontrollen in Puffer, der 0,5% NP-40 enthielt, lysierte (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Manatis, T., Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Für die Northern-Hybridisierung wurden Aliquote von 20 μg denaturierter RNA durch Elektrophorese auf 1%igem Agarose-Formaldehyd-Gel aufgetrennt. Die Qualität und Menge der immobilisierten RNA wurde nach der Übertragung durch Methylenblau-Anfärbung der Hybond-N-Membranen überprüft (Amersham/Buchler, Braunschweig, Deutschland). Die Blots wurden über Nacht mit spezifischen synthetischen TGF-β₁- oder TGF-β₂-Oligonucleotidsonden (40-mer, Oncogen Science, Seattle, USA) hybridisiert, unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) mit (gamma-³²P)-ATP markiert und auf Röntgenfilm autoradiographiert.
Für Western-Blots wurden mit TGF-β-S-ODN behandelte (48 Stunden, 1 μM f.c.) bzw. unbehandelte Gliomzellen in Medium, das 10% FCS enthielt, gezüchtet, gewaschen und 24 Stunden lang in definiertem serumfreiem Medium weiterkultiviert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Lysepuffers lysiert, der NP-40 enthielt. Auf jede Spur eines 12%igen Polyacrylamid-SDS-Gels wurden 30 μg Gesamtzellprotein geladen. Dann wurden fraktionierte Proteine 20 Minuten lang durch Electroblotting mit 0,8 mA/cm² auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wie es beschrieben wurde (Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J., Electrophoretic transfer of proteins from PAGE to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 4350-4354, 1979). Filter wurden mit einem polyklonalen Antikörper von TGF-β₂ (R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) sondiert, und 50 μg of TGF-β dienten als Kontrolle.
Beispiel 7
Phosphorothioat-modifizierte Antisense-Oligodesoxynucleotide (5-ODNs) TGF-β₂-spezifische Antisense-Oligodesoxynucleotide (Antisense-Richtung der TGF-β₂-mRNA-Primersequenz-Oligonucleotid-Sequenz: CAGCACACAGTACT) und eine randomisierte Nonsense-Sequenz mit demselben GC-Gehalt wie die spezifischen 5-ODNs (Nonsense-Oligonucleotidsequenz: GTCCCTATACGAAC) wurden mit einem DNA-Synthesizer von Applied Biosystems, Modell 380B, synthetisiert (Schlingensiepen, K.-H., Brysch, W., Phosphorothioate oligomers. Inhibitors of oncogene expression in tumor cells and tools for gene function analysis in: Erikson, R., Izant., J. (Hrsg.), Gene regulation by antisense nucleic acids. Raven Press New York 1992). S-ODNs wurden mit 33% Ammoniak aus dem festen Träger entfernt. Oligonucleotide, die noch die 5'-Trityl-Schutzgruppe trugen, wurden durch Umkehrphasen-HPLC mit einer C8-Säule des Typs Aquapore RP-300 (Brownlee) gereinigt. Lösungsmittel: A – 0,1 M TEAA, pH 7, B-Acetonitril. Gradient 3-35% B über 30 min linear. Die trityltragende Fraktion von Oligonucleotiden, die der vollen Länge des Produkts entsprachen, wurde 20 min lang in 80% Essigsäure/EtOH detrityliert, zweimal mit Diethylether extrahiert, auf einer Säule des Typs Sephadex G 25 (Pharmacia) entsalzt, mit Ethanol ausgefällt (2x) und schließlich in 0.1 M Tris/HCl, pH 7.6, verdünnt. Anhand der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wurde bestimmt, dass die 5-ODNs zu mehr als 85% aus Material der vollen Länge bestanden.
Beispiel 8
Charakterisierung von Tumorzellen
Alle Gliomzellkulturen exprimierten GFAP, TGF-β, Vimentin und HLA-Klasse-I-Antigene sowie β-Mikroglobulin, Fibronectin und KI 67, und eine verschiedenartige Expression wurde bei Desmin, HLA-Klasse-II-Antigen (positiv: HTZ-209) und NSE (positiv: HTZ-209, HTZ-243) gefunden. Keine Expression wurde bei Cytokeratin, Laminin und Neurofilamenten gefunden, was auf die gliale Herkunft dieser Tumorzellen hinweist.
Eine Western-Blot-Analyse der Tumorzelllysate zeigte, dass HTZ-153-, HTZ-209-und HTZ-243-Zellen TGF-β₂-Protein erzeugten (3).
Eine Northern-Blot-Analyse von cytoplasmatischen RNAs aus allen 3 Tumoren zeigte eine mRNA für TGF-β₁ (2,3 kb) und TGF-β₂ (4,1 kb) (4 und 5): die mRNA für TGF-β_l war in allen drei Tumoren recht gut repräsentiert (4), doch zeigte der Tumor HTZ-209 im Vergleich zu den übrigen Tumoren nur ein schwaches TGF-β₂-Signal (5).
Beispiel 9
Modulation der TGF-β-Expression durch Behandlung von Gliomzellen mit TGF-β₂spezifischen 5-ODNs
Die Wirkungen der TGF-β₂-spezifischen S-ODN-Behandlung auf die TGF-β₂-mRNA- und -Proteinexpression in Gliomzellen wurden durch Northern-Blotting, Western-Blotting und Immunocytochemie analysiert. Die Northern-Blot-Analyse von Gliomzellen, die mit TGF-β₂-spezifischen S-ODNs behandelt wurden (f.c. 1 μM während 48 Stunden), ergab verschiedenartige Ergebnisse: HTZ-153 zeigte eine Erhöhung der TGF-β₂-mRNA, während die Tumoren HTZ-209 und HTZ-243 nach der Antisense-Oligodesoxynucleotid-Behandlung keine nachweisbare mRNA zeigten (6). Die Western-Blot-Analyse zeigte nach der S-ODN-Behandlung ein reduziertes TGF-β₂-spezifisches Signal für alle 3 Tumoren (3).
Die Immunfärbung von Gliomkulturen, die mit TGF-β₂-spezifischen 5-ODNs behandelt wurden (f.c. 1 μM während 48 Stunden), zeigte eine Abnahme der TGFβ-abhängigen Immunreaktivität im Vergleich zu mit Nonsense-5-ODN behandelten und unbehandelten Kontrollen für alle 3 Tumoren. Kontrollen mit normalem Mausserum und humanem AB-Serum waren negativ (Objektträger nicht gezeigt).
Beispiel 10
Charakterisierung von Lymphocyten
Autologe Effektorlymphocyten, die in den folgenden Experimenten über tumorabhängige Lymphocytenproliferation und Gliomcytotoxizität eingesetzt wurden, wurden mit herkömmlichen Lymphocytendifferenzierungsantigenen charakterisiert. Daten der Charakterisierungsexperimente sind in Tabelle 1 gezeigt, die Zellpopulationen spiegeln den Phänotyp von Lymphocyten-Untergruppen von nativen (Tag 0) und aktivierten (Tag 6) Effektorzellen wider, die in Proliferationsund Cytotoxizitätsexperimenten eingesetzt wurden. Der Prozentsatz an CD3-positiven Zellen nahm während der Kulturzeit auf bis zu 85% zu. Dasselbe galt für CD4-positive (bis zu 80%), CD8-positive (bis zu 18%), CD25-positive (bis zu 60%) Zellen, die Fraktion der CD16-positiven Zellen nahm während der ersten 6 tage der Kultur auf maximal 50% zu (HTZ-243).
Beispiel 11
Cytotoxizitätsexperimente
Native PBMCs von Tumorpatienten, die in unserer Studie untersucht wurden, zeigten eine geringe cytotoxische Aktivität gegenüber autologen Targets (unter 20% bei einem Target/Effektor-Verhältnis von 1:10). Vorversuche offenbarten, dass eine Voraktivierung autologen Effektor-PBMCs am effektivsten war, wenn Zellen 6 Tage lang mit 10 E/ml IL-1α und 100 E/ml IL-2 inkubiert wurden. Diese LAK-Zellen wurden in allen weiteren Cytotoxizitäts/Proliferationsexperimenten eingesetzt.
Bei einem Target/Effektor-Verhältnis von 1:10 erreichten LAK-Zellen in den autologen Targetsystemen eine cytotoxische Aktivität von bis zu 25% (7). Die Vorinkubation von Tumorzellen mit neutralisierenden TGF-β-Antikörpern (f.c. 100 μg/ml) führte zu einer Cytotoxizität von 30%-50% (5-30% Zunahme über die unbehandelten Kontrollen) (7). Wenn Tumorzellen mit TGF-β₂-spezifischen Antisense-S-ODNs inkubiert wurden, erhöhte sich die Cytotoxizität in dosisabhängiger Weise auf ein Maximum von 79% (5 μM S-ODNs, 25-60% Erhöhung gegenüber unbehandelten Kontrollen) und 67% (1 μM 5-ODNs, 15-45% Erhöhung gegenüber unbehandelten autologen Lymphocyten). Alle drei Effektorzellpopulationen exprimierten eine hohe NK-Aktivität, wie durch einen Cytotoxizitätsassay gegenüber der Zelllinie K 562 gezeigt wurde, wo sie im Bereich von 60% bis 75% lag.
Beispiel 12
Proliferationsexperimente
Die Lymphocytenproliferation nach Stimulation mit autologen Tumorzellen (MLTC), die mit TGF-β₂-spezifischen 5-ODNs behandelt wurden, stieg in den Tumoren HTZ-153 (8a) und HTZ-209 (8b), doch wurde bei HTZ-243-Zellen kein Effekt beobachtet (8c). Nonsense-S-ODNs in einer Endkonzentration (f.c.) von 1 μM änderten die Lymphocytenproliferation nicht (8). Wirkungen von TGF-β₂-spezifischen 5-ODNs wurden in einer dosisabhängigen Weise von 0,1 μM bis zu 1 μM beobachtet, höhere Konzentrationen (5 μM) zeigten eine unspezifische Toxizität gegenüber PBMCs und Tumorzellen ( 8): Die Proliferation von PBMCs in S-ODN-behandelten MLTCs war für Oligonucleotidkonzentrationen von über 1 μM stets geringer. Hohe Konzentrationen an neutralisierendem TGF-β-Antikörper (100 μg/ml) verstärkten die Lymphocytenproliferation nicht. TGF-β₂-spezifische Antisense-S-ODNs hatten eine inhibitorische Wirkung auf die Proliferation entweder von kultivierten Lymphocytenpopulationen (marginaler Effekt) oder autologe Targetzellen (8), die bei einer 5-ODN-Konzentration von 5 μM (f.c.) maximal 75% erreichte. Weniger starke inhibitorische Wirkungen wurden bei randomisierten Kontroll-Nonsense-S-ODNs beobachtet (Mittelwert 20%, bis zu 40% bei 5 μM f.c.).

Claims

Antisense-Oligonucleotide oder Modifikationen davon – die aus den Nucleinsäuresequenzen bestehen, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 72, 76, 79, 83, 85 oder 136 identifiziert sind.
Antisense-Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonucleotid ein Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotid ist.
Antisense-Oligonucleotide gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Modifikationen durch die jeweilige Struktur
gekennzeichnet sind, wobei R¹ = O, S, F, CH₃ oder OEt ist; R², R³ kovalent an Cholesterin, Poly(L)lysin, Transferrin gekoppelt sind; R⁴ = N, O, F oder CH₃ ist; B = A, C, G, T oder U ist; und die Struktur als Ausschnitt aus einer längeren Nucleotidkette zu verstehen ist.
Antisense-Oligonucleotide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Formel
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT oder die Ribonucleotide A, C, G und U, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; n = ein Stück Oligodesoxyribonucleotid oder Oligoribonucleotid mit einer Länge von 6 bis 20 Basen; und R^1a = S; R^1b = O; R^1a = CH₃; R^1b = O; R^1a = S; R^1b = CH₃; R^1a = CH₃; R^1b = S.
Antisense-Oligonucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Formel
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT oder die Ribonucleotide A, C, G und U, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; n = ein Stück Oligodesoxyribodinucleotid oder Oligonucleotid mit einer Länge von 4 bis 12 Dinucleotiden; R^1a = S; R^1b = O; R^1a = CH₃; R^1b = O; R^1a = S; R^1b = CH₃.
Verfahren zur Herstellung eines Antisense-Oligonucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 durch Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphittriesterchemie durch Verlängerung der Nucleotidkette in 3'→5'-Richtung, wobei das jeweilige Nucleotid an das erste Nucleotid gekoppelt wird, das kovalent an die feste Phase gebunden ist, umfassend die folgenden Schritte: – Abspalten der 5'DMT-Schutzgruppe des vorherigen Nucleotids; – Hinzufügen des jeweiligen Nucleotids für die Kettenverlängerung; – Modifizieren von Phosphitgruppen und anschließendes Verkappen von nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen; und – Abspalten des Oligonucleotids vom festen Träger; – anschließend Aufarbeiten des Syntheseprodukts.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Antisense-Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 für die Behandlung von Tumoren, bei denen die Expression von TGF-β von Relevanz für die Pathogenität und/oder für die Hemmung der pathologischen Angiogenese ist.
Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung der immunsuppressiven Wirkung von TGF-β, die Verstärkung der Proliferation von cytotoxischen Lymphocyten, die Behandlung der körpereigenen Überexpression von TGF-β, die Behandlung von Brusttumoren, die Behandlung von Neurofibromen, malignen Gliomen einschließlich Glio blastomen, die Behandlung und Prophylaxe von Hautkarzinogenese sowie die Behandlung von Speiseröhren- und- Magenkarzinomen.