JPH08509370A - トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ‐β）の免疫抑制効果の治療用アンチセンス−オリゴヌクレオチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列表中SEQ ID NO.１〜56及び137として規定される以下の核酸配列を含むかまたは配列表中SEQ ID NO.57〜136として規定される以下の核酸配列を含む、但し、おのおのの核酸はDNA-またはRNA-型構造を有する、トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）の免疫抑制効果の治療用アンチセ ンス−オリゴヌクレオチド類 本発明は、トランスフォーミング成長因子（腫瘍増殖因子）−β（TGF-β）を コードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド 類またはその有効な誘導体、ナンセンス−コントロール−ヌクレオチドとしての オリゴヌクレオチド、TGF-βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする少な くとも一つのアンチセンス−オリゴヌクレオチドまたはその有効な誘導体を含有 する医薬組成物、並びに腫瘍の治療用及び／またはTGF-βの免疫抑制効果の治療 用の医薬組成物の製造のためのアンチセンス−オリゴヌクレオチド類の使用に関 する。 トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）は、例えば、ヒト神経膠腫（gl ioma）細胞により分泌される因子である。膠芽腫（glioblastoma）等のヒト神経 膠腫は、現在満足な治療方法が存在しないヒト腫瘍である。TGF-βはそれぞれの 腫瘍細胞の成長をオートクリン様式で支持する。この因子は、免疫抑制効果を示 し、さもなければ神経膠腫細胞を破壊することができるであろうそのような細胞 障害性Ｔ−リンパ球の増殖を減じる。 免疫応答性の抑制は、悪性神経膠腫の患者についてよく報告されてきた。これ らの患者は、皮膚アネルギー（anergy）、抑制された抗体生産、循環Ｔ−細胞の 数の減少を含む種々の免疫学的欠乏を表わす〔ブルクスW．H．、ネトスキーM．G .、ハーワイズD．A.、ノーマンセルD．E.、初期の脳腫瘍患者の細胞伸介免疫、J ．Exp．Med.、136:1931〜1947、1972及びローズマンT.、エリオットL．、ブルク スW．、神経膠腫によるT-細胞機能の調整、Immunol Today 12:370〜374、1991） 。更に最近の研究では、これらの損傷は、正常なT-細胞活性化に必要とされる生 理学的経路の機能不全及びT-細胞の一部の量的及び質的欠陥に起因する可能性が あることを示す。 第82回アメリカ癌研究協会総会、米国テキサス州ヒューストン、1991年５月15 〜18日、の会報Proc AM ASSOC CANCER RES ANNU MEET 32（O）、1991、 427には、因子−β−アンチセンス−オリゴヌクレオチド類が、ヒト黒色腫細胞 を濃厚な血清下では阻害し、かつ無血清培養条件下では促進することが開示され た。得られた結果は、培地中の血清の含有量に依存して、HTZ-19-細胞の成長調 整において、細胞性TGF-β₁に異なる役割があることを示す。加えて、これは外 部から投与したTGF-β-アンチセンスの生物学的潜在力と欠点の可能性を示すか もしれない。 J．Exp．Med.、174（4）、1991、925〜930、ハズフィールドJ．等「アンチセ ンストランスフォーミング成長因子β−１またはＲｂオリゴヌクレオチド類によ る初期のヒト造血機関の無活動からの開放」には、アンチセンストランスフォー ミング成長因子β１またはＲｂオリゴヌクレオチド類による初期のヒト造血機関 の無活動からの開放が開示されている。ＲｂアンチセンスTGF-βは、Ｒｂ遺伝子 生成物との相互作用を介して、初期のヒト造血機関の循環状態を消極的に調整す る。 Proceedings of the National Academy of Science of USA、Vo.88、1991年2 月、ワシントンUSA、1516〜1520頁、ポッツJ．等「未発達心臓のアンチセンス− オリゴデオキシヌクレオチドのトランスフォーミング成長因子−β3'への上皮間 葉のトランスフォーメーション」には、未発達心臓の内皮細胞の上皮間葉のトラ ンスフォーミング成長因子−β３へのトランスフォーメーションは、修飾された アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドにより抑制されることが開示されて いる。このトランスフォーメーションは、心臓により生成するトランスフォーミ ング成長因子−β（TGF-β）分子の活性に依存する。TGF-β1、-2、-3及び-4の 非保存領域に発生させた修飾されたアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド 類は、この変化においてこれらのメンバーの可能な役割を試験するために製造さ れた。その結果、TGF-β群（TGF-β3）のある特定のメンバーが上皮間葉トラン スフォーメーションに不可欠であることが解明された。 WO-A 92/17206には、治癒の間に傷痕組織の形成を抑制するために、医薬的に 許容し得る担体と共に、最適の繊維的（fibrotic）成長因子のみに対して特異的 な成長因子中和剤または剤類の有効活性抑制量を含有する、傷の治療 用組成物が開示されている。前記組成物の製造方法及び組織に損傷を受けた宿主 に前記組成物を投与する方法も開示されている。 WO-A90/09180には、オートロガス（autologous）骨髄移植及び癌治療に有用な 方法が開示されている。癌を有する患者の骨髄細胞は、骨髄提供者に逆に注入す る前に悪性細胞の骨髄を空にするために、選ばれたアンチセンス−オリゴヌクレ オチドで処理する。 本発明の目的は、免疫抑制と相関する癌細胞の治療方法を提供することである 。本発明の他の目的は、免疫抑制に関係する腫瘍細胞の成長を抑制する効果のあ る薬剤を提供することである。 本発明によれば、配列表中にSEQ ID NO.１〜56及び137として規定された以下 の核酸配列を含むか、または配列表中SEQ ID NO.57〜136として規定された以下 の核酸配列を含有する、但し、おのおのの核酸はDNA-またはRNA-型構造を有する 、トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β）をコードする遺伝子領域とハイ ブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチド類またはその有効な誘導体に より、上記に述べた問題点を解決することができる。好ましくは、アンチセンス −オリゴヌクレオチド類は、成長因子−β₁、β₂及び／または−β₃をコードす る遺伝子領域とハイブリダイズする。このアンチセンス−オリゴヌクレオチドは 、TGF-βをコードする遺伝子領域及び／またはTGF-βをコードする遺伝子領域お よびコードしない遺伝子領域とハイブリダイズする。例えば、トランスフォーミ ング成長因子−βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス− オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の幾つかは、トランスフォーミング成長 因子をコードしない領域とハイブリダイズする一方、それぞれの配列のその他の 部分がTGF-βをコードする遺伝子領域とハイブリダイズする。もちろん、アンチ センス−オリゴヌクレオチドが成長因子−βのみをコードする遺伝子領域とハイ ブリダイズすることも本発明の範囲内である。当業者には、TGF-βの生成が減少 または抑制されるかぎり、前記アンチセンス−オリゴヌクレオチドの後続部分を 有する断片は、本発明に従って機能することも理解される。 本発明の好ましい具体化において、アンチセンス−オリゴヌクレオチドま たはその有効な誘導体はフォスフォチオエート−オリゴデオキシヌクレオチドで ある。 本発明によれば、アンチセンス−オリゴヌクレオチド類は、3'−5'方向のヌク レオチド鎖の成長により亜リン酸チオエステル化学を用いる固相合成により得る ことができ、その中で各ヌクレオチドは、固相に共有結合した最初のヌクレオチ ドと結合し、以下の工程を含む。 原料ヌクレオチドの5'ＤＭＴ保護基を切断し、 鎖の増殖のための各ヌクレオチドを加え、 亜リン酸基を修飾した後に、未反応の5'-水酸基封鎖し、 固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、 次いで合成生成物を得る。 オリゴデオキシ−リボヌクレオチド類の化学構造を図１に示す。同様に、アン チセンス オリゴ−リボヌクレオチド類のそれぞれの構造を図２に示す。オリゴ ヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド長鎖からの細部として理解されるべきものであ る。 図１において、lit．Bは、デオキシリボーズにN9（A,G）、N1（D,T）を介して 結合するアデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びチミン（T）等の有 機塩基を意味する。これらの塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（mRNA- 配列）である。用いた修飾； １．全てのＲ¹が 1.1 Ｒ¹＝Ｏ 1.2 Ｒ¹＝Ｓ 1.3 Ｒ¹＝Ｆ 1.4 Ｒ¹＝ＣＨ₃ 1.5 Ｒ¹＝ＯＥｔ で置換されるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 ２．Ｒ¹が一つのオリゴヌクレオチド； 上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドdA、dC、dG またはdT、 ｐ＝核酸内リン酸 ｎ＝６〜２０塩基の長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範囲 2.1 R^1a＝Ｓ; R^1b＝Ｏ 2.2 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｏ 2.3 R^1a＝Ｓ; R^1b＝ＣＨ₃ 2.4 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｓ の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド、 ３．Ｒ¹が一つのオリゴヌクレオチド； 上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するデオキシ−リボヌクレオチドdA、dC、dG またはdT、 ｐ＝核酸内リン酸 ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴデオキシ−リボヌクレオチドの範 囲 3.1 R^1a＝Ｓ; R^1b＝Ｏ 3.2 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｏ 3.3 R^1a＝Ｓ; R^1b＝ＣＨ₃ の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴデオキシ−リボヌクレオチド 、 ４．Ｒ²において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物 4.1 コレステロール 4.2 ポリ（L）リジン 4.3 トランスフェリン と結合した化合物1.1〜1.5；2.1〜2.4；3.1〜3.3のいずれか、 ５．Ｒ³において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物 5.1 コレステロール 5.2 ポリ（L）リジン 5.3 トランスフェリン と結合した化合物1.1〜1.5；2.1〜2.4；3.1〜3.3のいずれかである。 RNA-オリゴヌクレオチド類（図２）の場合は、リボーズにN9（A,G）またはN1 （U,C）を介して結合した塩基（アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C） 、ウラシル（U））である。この塩基配列は、対象配列の遺伝子の逆相補物（mRN A配列）である。オリゴヌクレオチド配列において用いた修飾は以下のとおり： ６．全てのＲ¹が 6.1 Ｒ¹＝Ｏ 6.2 Ｒ¹＝Ｓ 6.3 Ｒ¹＝Ｆ 6.4 Ｒ¹＝ＣＨ³ 6.5 Ｒ¹＝ＯＥt で置換されたオリゴデオキシ−リボヌクレオチド類、 ７．Ｒ¹が一つのオリゴヌクレオチド； 上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドdA、dC、dGまたはdT、 ｐ＝核酸内リン酸 ｎ＝４〜２０塩基の長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲 7.1 R^1a＝Ｓ; R^1b＝Ｏ 7.2 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｏ 7.3 R^1a＝Ｓ; R^1b＝ＣＨ₃ 7.4 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｓ の中の核酸内のリン酸において変わるオリゴ−リボヌクレオチド、 ８．Ｒ¹が一つのオリゴヌクレオチド； 上記式中、Ｂ＝遺伝子配列に依存するリボヌクレオチドdA、dC、dGまたはdT、 ｐ＝核酸内リン酸 ｎ＝４〜１２ジヌクレオチドの長さのオリゴ−リボヌクレオチドの範囲 8.1 R^1a＝Ｓ; R^1b＝Ｏ 8.2 R^1a＝ＣＨ₃; R^1b＝Ｏ 8.3 R^1a＝Ｓ; R^1b＝ＣＨ₃ の中の核酸内のリン酸において代わりになるオリゴ−リボヌクレオチド、 ９．Ｒ²において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物 9.1 コレステロール 9.2 ポリ（L）リジン 9.3 トランスフェリン と結合した化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3のいずれか、 １０．Ｒ³において、共有結合して細胞の取り込みを促進する下記の化合物 10.1 コレステロール 10.2 ポリ（L）リジン 10.3 トランスフェリン と結合した化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3のいずれか、 １１．全てのＲ⁴が 11.1 R⁴＝Ｏ 11.2 R⁴＝Ｆ 11.3 R⁴＝ＣＨ₃ で置換される化合物6.1〜6.5；7.1〜7.4；8.1〜8.3；9.1〜9.3；10.〜10.3のい ずれかである。 アンチセンス−オリゴヌクレオチド類の修飾は、有利である。何故なら、 これが自然に存在するヌクレオチド配列に有効な程、それらが応用された場合に 、内因性の因子によって速く破壊されないからである。しかしながら、開示した 配列を有する自然に存在するヌクレオチドもまた本発明に使用しうることが当業 者には理解される。特に好ましい具体例において、上記修飾はフォスフォロチオ エート修飾である。 本発明のオリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成を、以下の詳細な説明中に例と して述べる。 オリゴデオキシ−ヌクレオチドは、亜リン酸チオエステル化学を用いる保護ヌ クレオチドオの段階的な5'付加により合成した。ヌクレオチドＡは5'-ジメトキ シトリチル−デオキシアデノシン（N⁴-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピル-2-シ アノエチルフォスフォルアミダイト（0.1M）として導入され；Ｃは5'-ジメトキ シトリチル−デオキシシチジン（N⁴-ベンゾイル）-N,N'-ジイソプロピル-2-シア ノエチルフォスフォルアミダイトとして導入され；Ｇは5'-ジメトキシトリチル −デオキシグアノシン（N⁸-イソブチリル）-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチ ルフォスフォルアミダイトとして導入され、かつＴは5'-ジメトキシトリチル− デオキシチミジン-N,N'-ジイソプロピル-2-シアノエチルフォスフォルアミダイ トである。これらのヌクレオチドは、好ましくは0.1Mの濃度のアセトニトリル溶 液として用いられた。 合成は、殆どの3'-ヌクレオチドが長鎖アルキルアミンリンカーを介して共有 結合する（平均担持30μmol/g固体支持体）、直径ほぼ150μmに調節された細孔 ガラス粒子（細孔直径500Å）上で行う。 固体支持体は、円筒状の合成カラムに充填し、試薬類は十分流れることができ るけれども、固体合成支持体は漏れないフィルターで、両末端をキャップした。 試薬類は、不活性ガスの加圧を利用して合成カラムに供給し、回収した。ヌクレ オチド類は、3'→5'方向に伸長するオリゴヌクレオチド鎖に付加した。おのおの ヌクレオチドは以下の合成サイクルを一巡して結合した: 原料ヌクレオチドの5'DMT（ジメトキシトリチル）保護基をジクロロメタン中 で3-クロロ酢酸を用いて開裂し、ついで無水アセトニトリルでカラムを 洗浄した。そして同時に、配列に応じて、それらの保護誘導体の形態の塩基の一 つをアセトニトリル中のテトラゾールに添加した。反応後、反応混合物を回収し 、亜リン酸を、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中、硫黄（S₈）混合物 で酸化した。酸化反応の後、混合物を回収し、カラムをアセトニトリルで洗浄し た。未反応の5'-水酸基は1-メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テト ラヒドロフランを同時に添加して封鎖した。その後、合成カラムはアセトニトリ ルで洗浄し、次サイクルを開始した。 得られた合成生成物の処理及び精製操作は以下の通りである。 最後のヌクレオチドの付加後に、デオキシヌクレオチドをアンモニア溶液中で インキュベーションすることにより固体支持体から分離した。エキソキシクリッ ク（exoxyclic）塩基の保護基は更にアンモニア中でインキュベーションするこ とにより除去した。そしてアンモニアを減圧留去した。依然として5'DMT保護基 を有する全長合成生成物は、シリカC₁₈固定相上で逆相高速液体クロマトグラフ ィーを用いて短い破損不純物から分離した。生成物のピーク溶離液を採取し、減 圧下で乾燥し、5'DMT保護基を酢酸中でインキュベーションして開裂した。酢酸 はその後減圧留去した。合成生成物は、脱イオン水に溶解し、ジエチルエーテル で３回抽出した。そして、生成物は減圧下で乾燥した。再度HPLC-AXクロマトグ ラフィーを実施し、生成物のピークの溶離液は、脱イオン水に対する二度目の透 析と同様に過剰のトリス緩衝液に対して透析した。最終生成物は凍結乾燥し、乾 燥貯蔵した。 本発明のアンチセンス−オリゴヌクレオチド類は医薬組成物、すなわち医薬と して用いることができる。この医薬は、トランスフォーミング成長因子−βの抑 制、及びそれによる免疫抑制の減少および／または病気に起因するアンギオゲネ シス（angiogenesis）の抑制により、TGF-βの発現が発病に関係する腫瘍の治療 に用いることができる。アンチセンス−TGF-β−オリゴヌクレオチド類の有効投 与量の投与により引き起こされた免疫抑制の減少は、医薬の投与前の状態に比較 して細胞障害性のリンパ球の大幅な増殖を伴って起こることがある。その結果、 これらのリンパ球は、腫瘍細胞の数を減じるその細胞障害性活動を開始する。 本発明の医薬は、TGF-βの内生の発現過剰の治療、残余腫瘍（rest tumors） の治療、神経性維腫の治療、膠芽腫を含む悪性神経膠腫の治療、及び、食道癌及 び胃癌の治療と同様に皮膚癌の治療と予防に有用である。 オートロガス（autologous）培養した神経膠腫細胞を用いた剌激の際のヒトT- 細胞の増殖と細胞障害性に対するTGF-β₂−特異的アンチセンス−オリゴヌクレ オチドの効果を研究した。TGF-β₂−誘導フォスフォロチオエート誘導体S-ODN's は、神経膠腫細胞内のTGF-βの蛋白発現を特異的に抑制するであろう。加えて、 TGF-β₂−特異的S-ODN'sは、T-細胞の増殖および細胞障害性に対するTGF-βの免 疫抑制効果を、相当量、逆転（revers）する。 ヒト脳腫瘍患者におけるT-細胞の応答は、明らかに減り、腫瘍侵入リンパ球は 、個々の患者の腫瘍の進行に単に付帯的な影響を有するにすぎないことが明らか にされてきた〔パルマL．、ジ ロレンゾN．、ガイデットB．、初期の膠芽腫お よび慢性神経膠腫へのリンパ球侵入物、J.Neurosurg.、49:854〜861、1978、及 びリドレイA．、カバナフJ．B.、神経膠腫へのリンパ球の浸入、可能な宿主耐性 の証拠、Brain、4：117〜124、1971）。脳腫瘍から単離した腫瘍侵入リンパ球は 機能上役に立たず、これらの免疫抑制効果は、生体外（in vitro）及び生体内（ in vivo）において、TGF-β₂が原因であった〔ボードマーS．、ストロマーK．、 フレイK．、シープルCh．、デ トリボレットN．、ヘイドI．、フォンタナA．、 膠芽腫における免疫抑制およびトランスフォーミング成長因子−β₂、J．Immuno l．、143：3222〜3229、1989；コールウェルW．T.、ドレダフィP．、アプッゾM ．L．J、アンテルJ．P.、免疫機能の悪性神経膠腫調整：異なる溶解因子の相関 的な寄与、J．Neuroimmunol.、33：89〜96、1991；カップナー M．C.、ハモウM. F.、サワムラY．、ボードナーS．、デ トリボレットN．、膠芽腫誘導トランス フォーミング成長因子β₂によるリンパ球機能の抑制 Neurosung.、71：211〜217、1989；マクスウェスM．、ガラノポーラスT.、ネビ ル−ゴールデンJ．、アントニアデスH．N.、免疫抑制及び免疫監視の損失に対す る初期のヒト膠芽腫におけるトランスフォーミング成長因子β₂の発現効果、J． Neurosung．、76：799〜804、1992；パーラディノ M．A．、モーリスR．E.、フレッシャー ターネスH.、レビンソンA．D.、トラン スフォーミング成長因子β、新種の免疫調節分子、Ann．N.Y．Acad．Sci.、59： 181〜187、1990；ローズマンT．、エリオット L．、ブルックスW.、神経膠腫に よるT-細胞機能の調整、Immunol Today、12：370〜374、1991〕。 図３：血清を含まない神経膠腫培養細胞溶解物（lysates）のＩＧＦ−βウェ スタン・ブロット解析。レーン２（HTZ-153）、３（HTZ-209）および４（HTZ-24 3）は、TGF-β₂特異抗体で、それぞれの細胞溶解物のブロット部分を示す。レー ン１は、50ng純粋TGF-β₂を用いたTGF-βポジティブコントロールを表す。TGF- β₂−アンチセンス処理細胞は、レーンＡに示す。未処理のコントロール細胞は 、レーンＢに示す。細胞はアンチセンス−オリゴヌクレオチドで４８時間（最終 濃度１μＭ）処理した。 図４：神経膠腫細胞中のIGF-β₁-mRNA発現。それぞれのレーンは、³²Ｐでラベ ルしたTGF-β₁オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（HTZ -153）、Ｂ（HTZ-209）およびＣ（HTZ-243）由来の、細胞質ＲＮＡ２０μＭを含 有した。ＲＮＡの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブ ロット点はメチレンブルーで着色した（レーンＡ’、Ｂ’、Ｃ’）。 図５：神経膠腫細胞中のTGF-β₂-mRNA発現。それぞれのレーンは、³²Ｐでラベ ルしたTGF-β₂オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、腫瘍Ａ（HTZ -153）、Ｂ（HTZ-209）およびＣ（HTZ-243）由来の、細胞質RNA20μMを含有した 。RNAの等量を確認するために、ハイブリダイザーションに先立ち、ブロット点 はメチレンブルーで着色した（レーンＡ'、Ｂ'、Ｃ'）。 図６：TGF-β₂-S-ODN処理後の神経膠腫細胞中のTGF-β₂-mRNA発現。未処理の 神経膠腫細胞Ａ（HTZ-153）、Ｂ（HTZ-209）およびＣ（HTZ-243）、または、血 清含有培養条件下、１μＭ（最終濃度）のTGF-β₂−特異的S-ODN'sで４８時間処 理した神経膠腫細胞Ａ’、Ｂ’およびＣ’の細胞質ＲＮＡを分離し、ノーザン・ ブロット解析を行った。それぞれのレーンは、³²ＰでラベルしたTGF-β₂オリゴ ヌクレオチドプローブにハイブリダイズした、20μMの細胞 質RNAを含有した。 図７：オートロガス（autologous）培養した神経膠腫細胞へのPBMC'sの細胞障 害性に対するTGF-β₂−特異的S-ODN'sおよびTGF-β中和抗体の効果（ターゲット ／エフェクター １：１０）。IL-1α及び11-2を用いたPBMC'sの培養６日後、細 胞を集め、洗浄し、照射し（30Gy）、そして、ターゲット／エフェクター比1:10 、1:5、1:1で、オートロガス神経膠腫細胞に添加した。神経膠腫ターゲットは、 TGF-β−特異的S-ODN'sまたはTGF-β抗体で前処理した。細胞障害性は、修飾微 小細胞毒性分析を用いて算定した。データは、３重反復検体を意味し、誤差棒は ＳＥを表す。データの点数は、腫瘍ターゲットを培地のみで処理した個々のコン トロールを反映する。細胞障害性の参照としてのS-ODN's（１μM、５μM）また はTGF-β抗体（100μg/ml）。それによって、抗体またはS-ODN's単独のターゲッ ト細胞への影響を除外することができた。 図８：リンパ球、神経膠腫細胞およびオートロガス神経膠腫細胞と共に培養し たリンパ球（MLTC）の増殖に対するTGF-β₂−特異的およびナンセンスS-ODN'sの 投与依存効果。Ａ：HTZ-153、Ｂ：HTZ-209、Ｃ：HTZ-243。ＰＢＭＣ’ｘは、IL- 1αおよびIL-2で６日間前もって活性化し、さらにオートロガス照射（60Gy）と 、TGF-β₂-（No.６）及びナンセンスS-ODSN（No.５）処理神経膠腫細胞（MLTC） を用いて更に６日間インキュベートした。同時に、神経膠腫細胞（腫瘍）および 前もって活性化したＰＢＭＣ’ｓ（リンパ液）の一部は、TGF-β₂−特異的（Ly: No.２、Tu:No.４）およびナンセンスS-ODN's（Ly:No.１、Tu:No.３）で３時間、 インキュベートして、推定上のS-ODN'sのエフェクター細胞またはターゲット細 胞への単独の影響を評価した。リンパ球と神経膠腫細胞の増殖は³H Tdr取り込み 検査を用いて評価した。データは３重反復検体法で示し、誤差棒はＳＥを表す。 本発明は以下の制限されることのない例により更に説明される。 実施例１ 腫瘍細胞（オートロガス・ターゲット細胞）の特定 ３人の高度の悪性神経膠腫〔HTZ-153及びHTZ-209、膠芽腫、HTZ-243、悪性ア ストロシトマ（astrocytoma）、Gr．III-WHO〕患者の腫瘍細胞および それぞれのオートロガスリンパ球について調査した。標準腫瘍細胞種は、牛胎児 血清20%（FCS、Seromed、ベルリン、ドイツ）、L-グルタミン１μM、MEMビタミ ン溶液及び非必須アミノ酸（GIBCO、Paisley、スコットランド、英国）（ボクダ ンU．、フレイシェルB．、ラプニアクH.T.R．、アリーオスマンF．、ヒト神経膠 腫におけるT-細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、 ボストン、70:501〜507、1986）を含有するDulbeccoの最小栄養培地中で決定し た。他のターゲット細胞はK562（NK-感受性エリスロマイロイド（erythromyeloi d）白血病細胞ライン、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション、ロック ビル、MD、USA）を含んだ。腫瘍細胞種は、GFAP、サイトケラチン、ニュウロフ ィラメント、デスミン、ビメンチン、NSE、HLA、DrO、W6/32（クラスＩ抗原）、 β₂−マイクロブロブリン、フィブロネクチン、ラミニンン、Ki 67（ダコパッツ 、グラストラッブ、デンマーク）及びアンチ−TGF-β（R&DシステムスInc．、ミ ネアポリス、MN、USA）に対するモノまたはポリクロノール抗体を用い、ラブテ ック組織培養スライド（マイルス・ラボラトリ−Inc.、ナッパービル、IL、USA ）において、ＰＡＰ−法（ボーネJ.A．、ハンドブック・オブ・イミュノパーオ キシダーゼ・ステイニング・メソッド、DAKO社、カルピンテリアCA、USA、1983 ）を用いる免疫細胞化学により特定した。TGF-β特異的免疫細胞化学は、最終濃 度１μMのTGF-β₂−特異的S-ODN'sおよび最終濃度１μMのナンセンスS-ODN's処 理コントロールを用いて神経膠腫培養スライドを48時間インキュベーシションし た後に行った。 実施例２ リンパ球（エフェクター細胞）の特定 全神経膠腫患者からの抹消血液単核は、手術日にフィコル−ハイパク（Ficoll -Hypaque）（ファルマシア、Uppsala、スウェーデン）傾斜遠心分離を用いてヘ パリン添加した静脈血から採取し、標準状態で液体窒素中に凍結保存した（ボク ダンU．、フレイシェルB．、ラプニアクアクH.T.R．、アリ−オスマンF．、ヒト 神経膠腫におけるT-細胞媒介細胞障害性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ 出版、ボストン、70：501〜507、1986）。リンパ球はRPMI 1640（フロウ・ラボ ラトリーInc.、スコットランド、英国）中で、 10％ヒト鬱血AB-血清（フロウ・ラボラトリーInc.、マクリーン、VA、USA）及び L-グルタミン２mMと共に培養した。天然のおよび活性化した（下記参照）抹消血 液単核は、以下の抗原:CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、HLA DR（ベクトン・ディキ ンソン、Mountain View、Ca USA）に対するモノクローナル抗体と、アルカリフ ォスファターゼおよびモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼ複合体 を用いる、免疫細胞化学により特定した（APAAP-法、Dakoratts GmbH、ハンブル グ、ドイツ）（コーデルJ.L．、ファリニB．、イーバーW.N．等、アルカリフォ スファターゼとモノクローナルアンチ−アルカリフォスファターゼの免疫複合体 （APAAP-錯体）を用いるモノクローナル抗体の免疫酵素標識、J.Histochem．Cyt ochem.、32:219〜229、1984）。 実施例３ LAK-細胞生成 神経膠腫患者からの抹消血液単核細胞の増殖及び細胞障害性の応答が抑制され るので、細胞（２×10⁶cells/ml）は、底の浅い組織培養プレート（２×10⁶cell s/ml）（Costar、Cambridge、MA、USA）中で、インターロイキン-1α（R&Dシス テムズInc．ミネアポリス、MN、USA）およびインターロイキン-2（100U/ml）（B IOTEST、AG Frankfurt/M．ドイツ）を用いて生体外（in vitro）で６日間、前も って活性化した。 実施例４ 増殖検定 混合リンパ球−腫瘍細胞培養（MLTC）15×10³に、致死照射（60Gy、⁶⁴Co−源 ）した腫瘍細胞を活性化剤として供給し、96ウェルの平底組織培養プレート（NU NC、コペンハーゲン、デンマーク）の中で、６日間25×10³の前もって活性化し た単核細胞（LAK-細胞、上記参照）と共に培養した。MLTC-実験において、前培 養の間、同様の培地条件を用いた。アンチセンス実験において、TGF-β₂-特異性 フォスフォロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類（S-ODN's）及びナンセ ンスオリゴデオキシヌクレオチド類（前記参照）をMLTC検定の12時間前に培地に 添加した。抗-TGF-β中和抗体（R&DシステムスInc、ミネアポリス、MN、USA）を MLTCの２時間前に培地に添加した。 実施例５ 細胞毒性検定 細胞毒性実験は修飾微小細胞毒性検定（ボクダンU．、フレイシェルB．、ラプ ニアクH.T.R．、アリーオスマンF．、ヒト神経膠腫におけるT-細胞媒介細胞障害 性、脳腫瘍の生物学、マルティナスニホフ出版、ボストン、70：501〜507、1986 ） により行った。簡潔には、1.5×10³ターゲット細胞を、96ウェル平底組織培 養プレートに接種した。プレーティングから12時間後、TGF-β₂-特異的S-ODN's およびナンセンスオリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンスコントロール）を 培地に添加した。抗−TGF-β中和抗体及び正常兎血清（抗体コントロール、R&D システムスInc、ミネアポリス、MN、USA）をプレーティングから22時間後に培地 に添加した。種々の比（ターゲット／エフェクターの比1:1、1:5、1:10）の前も って活性化したエフェクター細胞（LAK-細胞）を照射（30Gy）し、プレーティン グから24時間後にそれぞれのターゲットに添加し、３日間、標準培養条件下（10 ％の鬱血AB-R血清及び2PμMMのL-グルタミンを含有る1640培地）にした。細胞毒 性実験の間、細胞毒素は培地に添加しなかった。統計上のデータの評価値はこの 時点で最適であることが判明したため、３日間のインキュベーション期間を選択 した。ターゲット細胞の死滅はトリパン・ブルー染料（データは示さず）の混入 により示された。LAK-細胞処理したターゲット中のターゲット細胞の増殖は、標 準³H-チミジン取り込み検定（6-³H-チミジン、１μCi／ウェル、比活性27cl/mmo l）により評価した。取り込まれた³H-チミジンを計量する液体シンチレーション は18時間の細胞培養の後に行った。比細胞毒性は: 〔cpm（コントロール）−cpm（プローブ）／cpm（コントロール）〕×100% より算出した。 実施例６ ノーザンおよびウェスタンブロット解析。 細胞質ＲＮＡは、１μM（最終濃度）のTGF-β₂−特異的S-ODN'sで、48時間処 理した神経膠腫細胞及び0.5%NP-40含有緩衝液中の未処理コントロールを溶解す ることにより調製した（サンブルックJ．、フリシュE．F.、マニアティスT．、 モレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コール ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、1989）。ノーザンハイブリ ダイゼーシヨン用に、20μgの変性RNAアリコートを、１％ のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動により分離した。固定化した RNAの質および量は、移動の後、ハイボンド（Hybond）-Nメンブラン（Amersham/ Buchler、Baunschweig、ドイツ）のメチレン−ブル−染色により確認した。ブロ ットは一昼夜、特異的TGF-β₁またはTGF-β₂合成オリゴヌクレオチド プローブ （40-マー、オンコゲン・サイエンス、シアトル、USA）ハイブリダイズし、5'を T4ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア、フライブルグ、ドイツ）を用いて （γ-³²P）-ATPでラベルし、X-線フィルムに暴露した。 ウェスタンブロット用に、TGF-β-特異的S-ODN'sでそれぞれ処理した未処理の 神経膠腫細胞を10％Fむ培地で生育させ、洗浄し、更に、24時間前記無血清培地 で培養した。細胞は、NP-40Wを含有する溶解バッファーを用いて溶解した。30μ gの全細胞蛋白質は12％ポリアクリルアミド−SDSゲルの各レーンに充填した。分 別した蛋白質は、次いでニトロセルロース メンブランに20分間、0.8mA//cm²で 上記のように電気ブロットした（トウビンH.、スターヘリンT．、ゴードンJ．、 蛋白質のPAGEからニトロセルロース膜への電気泳動転写、操作及び幾つかの応用 、Pros．Natl．Acad．Sci.、USA、76:4350〜4354、1979。フィルターは、TGF-β₂ のポリクローナル抗体（R&DシステムスInc、ミネアポリス、MN、USA）でブロー ブした。50μgのTGF-βをコントロールとして用いた。 実施例７ フォスフォロチオエートで修飾したアンチセンスオリゴデオキシヌク レオチド類（S-ODN's） TGF-β₂-特異的アンチセンス オリゴデオキシヌクレオチド類（TGF−β₂mRNA プライマー シークエンス オリゴヌクレオチド シークエンス：CAGCACACAGTA CTのアンチセンス方向）および特異的S-ODN'sと同様のGC-含量で無作為化したナ ンセンス シークエンス（ナンセンス オリゴヌクレオチド シークエンス：GT CCCTATACGAAC）は、アプライド バイオシステムズ モデル380 B DNAシンセサ イザー〔シュリンゲンシューペンK．H.、ブリッシュW．、フォスフォロチオエー ト オリゴマーズ．腫瘍細胞中のオンコジーン発現の抑制剤および遺伝子機能解 析手段：エリクソンR．、アイザ ントJ.（Eds.）アンチセンス核酸による遺伝子調節、ラヴァン・プレス・ニュー ・ヨーク1992〕で合成した。S-ODN'sは33%アンモニアを用いて固体支持体より除 去した。依然として5'トリエチル保護基を有するオリゴヌクレオチド類は、アク アポア（Aquapore）RP-300、C8-カラム（Brownlee）で逆相HPLCにより精製した 。溶剤：A-0.1M TEAA pH７、B-アセトニトリル。勾配３〜35% B 30分以上直線的 な。全長生成物に相当する、オリゴヌクレオチド類のトリチルを有するフラクシ ョンは、80%酢酸/ETOH中、20分間脱トリチル化し、ジエチルエーテルで2回抽出 し、セファデックス（Sephadex）G25（ファルマシア）カラムで脱塩し、エタノ ールで沈殿させ（２×）、最後に0.Mトリス/HCL pH7.6で希釈した。S-ODN'sは、 ポリアクリルアミド−ゲル−電気泳動により全長物質の85％以上であると判定さ れた。 実施例８ 腫瘍細胞のキャラクタリゼーション 全神経膠腫細胞培養物は、β-ミクログロブリン、フィブロネクチン及びKI-67 と同様に、GFAP、TGF-β、ビメンチン及びHLA-クラスI抗原を発現し、デスミン 、HLA-クラスII抗原（ポジティブ：HTZ-209）およびNSE（ポジティブ：HTZ-209 、HTZ-243）については矛盾の多い（inconsistent）な発現がみられた。これら 腫瘍細胞のグリアル（glial）起源を示す、サイトケラチン、ラミニン及び神経 繊維については発現は見られなかった。 腫瘍細胞溶解物のウェスタンブロット解析はHTZ-153、HTZ-209及びHTZ-243細 胞がTGF-β₂蛋白質を生成したことを示した（図３）。 全ての３つの腫瘍由来の細胞障害性RNA'sのノーザンブロット解析は 、TGF-β₁（2.3kB）およびTGF-β₂（4.1kB）（図５及び５）についてのメッセー ジを示した:TGF-β₂についてのメッセージは、全ての３つの腫瘍においてかなり よく表され（図４）、しかし、腫瘍HTZ-209は残りの腫瘍と比較してかすかなTGF -β₂シグナルを示した（図５）。 実施例９ TGF-β₂-特異的S-ODN'sでの神経膠腫細胞の処理によるTGF-β発現の 調節 TGF-β₂−特異的S-ODN's処理のTGF-β₂mRNA-および神経膠腫細胞内の蛋白質発 現に対する効果はノーザン・ブロッティング、ウェスタン・ブロッティ ングおよび免疫細胞化学により解析した。TGF-β₂-特異的S-ODN's（48時間で最 終濃度１μM）で処理した神経膠腫細胞のノーザン・ブロット解析は矛盾した結 果を示した。即ち、HTZ-153はTGF-β₂におけるメッセージの増加を示したが、腫 瘍HTZ-209及びHTZ-243は、アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド類処理の 結果起こる検出可能なメッセージを示さなかった（図６）。ウェスタンブロット 解析は、S-ODN処理後の全ての３つの腫瘍についてTGF-β₂-特異的S-ODN'sシグナ ルの減少を示した（図３）。 TGF-β₂-特異的S-ODN's（48時間で最終濃度１μM）で処理した神経膠腫培養物 の免疫着色は、ナンセンスS-ODN処理及び未処理コントロールに比較して、TGF- β依存性の免疫反応性の減少を全て３つの腫瘍について示した。正常マウス血清 及びヒトAB-血清を用いたコントロールはネガティブであった。（スライドは示 していない） 実施例１０ リンパ球のキャラクタリゼーション 以下の腫瘍依存性のリンパ球増殖及び神経膠腫細胞障害性の実験に用いたオウ トロガス エフェクターリンパ球は通常のリンパ球識別抗原によりキャラクタラ イズした。キャラクタリゼーション実験のデータは表１に示し、細胞数は、天然 の（０日）及び活性化した（６日）エフェクター細胞増殖及び細胞毒性実験に使 用したリンパ球サブセットの表現型を反映する。CD3⁺細胞のパーセンテージは培 養時間の間に85％に増加した。CD4⁺も同様である（80％まで）。CD8⁺（18％まで ）細胞、CD25⁺（60％まで）細胞、CD16⁺細胞のフラクションは、培養の最初の６ 日の間に最高50%（HTZ-243）まで増加した。 実施例１１ 細胞毒性実験 腫瘍患者の生来のPBMC'sを、オートロガス ターゲットに低い細胞障害性活性 を示すわれわれの研究において調査した（ターゲット／エフェクター比1:10で20 %以下）。予備実験はオートロガス エフェクターPBMC'sの前活性化が、細胞を1 0U/ML IL-1α及び100U/ML IL-2で、６日間インキュベートした場合、最も効果的 であることを示した。これらのLAK細胞は、全て更に細胞毒性／増殖実験に使用 した。 ターゲット／エフェクター比が1/10のとき、LAK細胞はオートロガス ターゲット システムにおいて25%までの細胞障害性活性を達成した（図７）。 中性化したTGF-β抗体（最終濃度100μg/ml）との腫瘍細胞の前培養は、30〜50% （未処理コントロールより５〜30%増加）の細胞障害性という結果を示した。腫 瘍細胞をTGF-β₂特異的アンチセンスS-ODN'sと前培養した場合、細胞障害性は投 与のしかたに依存して最高79%（S-ODN's５μM、未処理コントロールより25〜60% 増加）及び67%（S-ODN's１μM、未処理オートロガス リンパ球より15〜45%増加 ）増加する。全ての３つのエフェクター細胞数は、K562細胞系に対する細胞毒性 検定によって検出されたように、60%〜70%の範囲の、高いNK-活性を示した。 実施例１２ 増殖実験 TGF-β₂-特異的S-ODN'sで処理したオウトロガス腫瘍細胞（MLTC）で刺激した 際のリンパ球増殖は、腫瘍HTZ-153（図8a）および腫瘍HTZ-209（図8b）では増加 したが、しかし、HTZ-243（図8c）細胞に影響は見られなかった。最終濃度（f.c .）１μMでのナンセンスS-ODN'sはリンパ球増殖を変化させなかった（図８）。T GF-β₂-特異的S-ODN'sの効果が、0.1μMから１μMまで投与のしかたに依存して 観察され、より高い濃度（５μM）は、PBMC'sおよび腫瘍細胞に対して非特異的 障害性を示した（図８）：S-ODNで処理したMLTC's及び腫瘍細胞中のPBMC'sの増 殖（図８）：S-ODNで処理したMLTC's中のPBMC'sの増殖は、オリゴヌクレオチド 濃度１μM以上について永続的に低かった。高濃度の中性化したTGF-β抗体（100 μg/ml）はリンパ球増殖を高めなかった。TGF-β₂-特異的アンチセンスS-ODN's は、培養したリンパ球数（境界効果）またはS-ODN's濃度５μM（最終濃度）での 最高75%を達成するオートロガスターゲット細胞（図８）に対しても抑制効果が なかった。大きくはない抑制効果が無作為化したコントロールナンセンスS-ODN' sに観察された（平均20%、最終濃度５μＭで40%まで）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/02 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/02 21/04 8615−4Ｃ 21/04 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ブリッシュ・ウォルフガング ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37073、アム ゴルドグラーベン ２ (72)発明者 シュリンゲンジーペン・カール−ヘルマン ドイツ連邦共和国、ボーベンデン Ｄ― 37120、ボーベンデル シュトラーセ ５ (72)発明者 シュリンゲンジーペン・レイマール ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37073、アム ゴルドグラーベン 13 (72)発明者 ボグダーン・ウルリッヒ ドイツ連邦共和国、ビュルツブルグ Ｄ― 97078、ミットレーレ ヒールベルグシュ トラーセ 25ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （1）配列表中SEQ ID NO.１〜56及び137に規定された核酸配列を含むかまたは配 列表中SEQ ID NO.57〜136に規定された核酸配列を含む、但しおのおのの核酸はD NA-またはRNA-型構造を有する、トランスフォーミング成長因子−β（TGF-β） をコードする遺伝子領域とハイブリダイズするアンチセンス−オリゴヌクレオチ ド類またはそれの有効な誘導体。 （2）前記核酸がトランスフォーミング成長因子−β₁、−β₂及び／または−β₃ をコードする遺伝子領域とハイブリダイズする請求項１記載のアンチセンス−オ リゴヌクレオチド類。 （3）前記核酸がTGF-βをコードする遺伝子部分の複数の領域及び／またはTGF- βをコードするおよびコードしない遺伝子部分の複数の領域とハイブリダイズす る請求項１及び／または２記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド。 （4）アンチセンス−オリゴヌクレオチドがフォスフォロチオエート オリゴデ オキシヌクレオチドである請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンス− オリゴヌクレオチド。 （5）ヌクレオチド鎖を3'-5'方向に成長させることによる亜リン酸トリエステル 化学を用いる固相合成法、但し、前記合成法中、各ヌクレオチドが固相に共有結 合している第１のヌクレオチドと結合し、前記合成法は −原料ヌクレオチドの5'DMT保護基を切断し、 −鎖増殖用原料ヌクレオチドを添加し、 −亜リン酸基を修飾し、次いで身反応5'−水酸基を封鎖し、かつ −固相支持体から切断し、 −次いで合成生成物を得る の工程を含む、により得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセン ス−オリゴヌクレオチド。 （6）SEQ ID NO.１〜56及び137のオリゴヌクレオチド類がTGF-β₁のアンチセン ス−オリゴデオキシヌクレオチド類であり、SEQ ID NO.57〜136のオリゴヌクレ オチドがTGF-β₂フォスフォロチオエート−アンチセンス−オリゴデオキシヌク レオチドである請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセ ンス−オリゴヌクレオチド。 （7）請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレオチド とＧＣの量が同一であるナンセンス−コントロール−ヌクレオチドであるオリゴ ヌクレオチド。 （8）請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−核酸を含有する医薬 組成物。 （9）TGF-βの発現が病原性及び／または病気に起因するアンギオゲネシス（ang iogenesis）の抑制に関連する腫瘍の治療用の請求項８に記載の医薬組成物の製 造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−オリゴヌクレ オチド類の使用。 （10）TGF-βの免疫抑制効果の治療用、細胞障害性のリンパ球の増殖の増大、TG F-βの内因性発現過多の治療用、胸部腫の治療用、神経線維腫の治療用、膠芽腫 を含む悪性神経膠腫の治療用、及び、食道癌及び胃癌の治療と同様に皮膚癌の治 療及び予防用の請求項８に記載の医薬組成物の製造のための請求項９記載の使用 。 （11）請求項１〜６のいずれか１項に記載のアンチセンス−TGF-β−オリゴヌク レオチド類の有効投与量の投与により、TGF-βを抑制し、かつ、それによる免疫 抑制および／または病気に起因するアンギオゲネスの抑制の減少により、TGF-β の発現が病原性に関係する腫瘍の治療方法。 （12）免疫抑制の減少が、アンチセンス−TGF-β−オリゴヌクレオチド類の投与 前の状態に比較して細胞障害性のリンパ球の増殖の増大を伴い、その結果、始ま った細胞障害性の活動が腫瘍細胞の数を減らす請求項１１に記載の治療方法。