CN103429732B

CN103429732B - iPS细胞及其制造方法

Info

Publication number: CN103429732B
Application number: CN201180067989.2A
Authority: CN
Inventors: 高松哲郎; 戴平
Original assignee: LSIP LLC
Current assignee: LSIP LLC
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: JP5886212B2; JPWO2012090997A1; EP2660314A1; CN103429732A; US8956868B2; EP2660314A9; US20120214234A1; EP2660314A4; KR20130131414A; WO2012090997A1; CA2823154A1

Abstract

本发明在于提供一种以使至少1种连接蛋白抑制因子和至少1种TGFβ信号转导抑制因子作用于细胞为特征的制作iPS细胞的方法、含有至少1种连接蛋白抑制因子的iPS细胞、含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导剂、含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导用培养基、含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导用试剂盒。

Description

iPS细胞及其制造方法

技术领域

本发明涉及iPS细胞（induced pluripotent stem cells，诱导性多功能干细胞）及其制造方法。另外，本发明涉及iPS细胞诱导剂、iPS细胞诱导用培养基和iPS细胞诱导用试剂盒。

背景技术

iPS细胞也被称为人工多功能性干细胞或诱导多功能性干细胞，是能够获得与ES细胞同等分化多功能性的细胞。

ES细胞、iPS细胞等具有分化多功能性的细胞，由于保持向构成机体的全部脏器和组织分化的能力，在再生因任何疾病而受损的脏器、血液、骨髓、组织等上作为极其有效的手段备受期待。

但是，从ES细胞得到的血液、骨髓、组织、脏器等机体材料，在移植阶段有引起排斥反应的担心，必须克服这样的免疫性问题，还在伦理上的问题受到指责。另一方面，由于iPS细胞能够使用本人的体细胞来制作，没有免疫排斥的问题，也没有伦理上的问题。

山中伸弥教授等的团队在小鼠的成纤维细胞中导入了作为Yamanaka factors的4种重编程因子（reprogramming factor），制作了iPS细胞（非专利文献1、2），但在应用于医疗时有以下的问题。

1.有细菌DNA等外源基因整合到宿主细胞基因组的担心。

2.由常规方法得到的iPS细胞以一定的概率癌化，在安全性方面存在问题。

3.对外来基因过量表达得到的iPS细胞，不能预计多功能性以外的影响。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Takahashi等，Cell2006，126：663-676

非专利文献2：Okita等，Nature2007，448：313-317

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供无癌化担心、安全的iPS细胞。

用于解决课题的方法

本发明人等鉴于上述课题进行了研究，惊人地发现，使连接蛋白（connexin）抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子作用于细胞，能够不进行基因导入地建立iPS细胞。

本发明是提供以下的iPS细胞及其制造方法、iPS细胞诱导剂、iPS细胞诱导用培养基、iPS细胞诱导用试剂盒的发明。

项1.一种制作iPS细胞的方法，其特征在于：使至少1种连接蛋白抑制因子和至少1种TGFβ信号转导抑制因子作用于细胞。

项2.如项1所述的方法，其中，连接蛋白抑制因子为连接蛋白43抑制因子。

项3.如项1或2所述的方法，其中，上述连接蛋白抑制因子是对连接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体。

项4.如项1～3中任一项所述的方法，其中，上述TGFβ信号转导抑制因子为TGF-β受体I抑制剂。

项5.如项1～4中任一项所述的方法，其中，上述TGF-β受体抑制剂为SB-431542、A-83-01或ALK5抑制剂。

项6.含有至少1种连接蛋白抑制因子的iPS细胞。

项7.如项6所述的iPS细胞，其中，连接蛋白抑制因子为连接蛋白43抑制因子。

项8.如项6或7所述的iPS细胞，其中，上述连接蛋白抑制因子是对连接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体。

项9.一种含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导剂。

项10.一种含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导用培养基。

项11.一种含有选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的iPS细胞诱导用试剂盒。

发明的效果

根据本发明的方法，不必导入外源基因（特别是原癌基因），不使用病毒，因此，不改变iPS细胞以外的形质，癌化和感染的担心极低、是安全的，能够制作对人的实用化具有非常大的优点的iPS细胞。

由本发明得到的iPS细胞，确认以下4点。

1.多功能性细胞标记因子的表达以基因水平、蛋白质水平保持。

2.通过向小鼠皮下移植，形成畸胎瘤，能够分化诱导为腺管、软骨、神经等三胚层的全部细胞。

3.形成类胚体，根据分化诱导条件，能够分别分化为内皮细胞、神经细胞、心肌细胞，分化诱导得到的心肌细胞能够发挥生理功能。

4.能够制作嵌合小鼠。

另外，本发明的iPS细胞能够制作生殖系（Germ line）。

因此，由本发明提供的iPS细胞用于制作在再生医疗等中使用的生物材料是非常优异的细胞。

附图说明

图1表示本发明的实施例中得到的细胞的结果。a.siPSCs的形态类似于小鼠ES。b.siPSCs的ALP活性得到了认可。c.通过各种抗多功能性标记抗体（Nanog、Oct4、Sox2、SSEA1）的免疫染色，能够在蛋白质水平确认了表达。d.通过RT-PCR，各种抗多功能性标记基因的表达在基因水平得到了确认。e.通过在SCID小鼠的皮下进行移植，形成畸胎瘤，确认了腺体、软骨·肌肉、神经·上皮。

图2表示来自EGFP小鼠心肌的siPSCs的形态。

图3表示siPSCs细胞的嵌合小鼠制作。a.表示从siPSCs-#1得到的嵌合小鼠。b.表示从siPSCs-#2得到的嵌合小鼠。

图4是表示TGF信号转导的概略图。

具体实施方式

在本说明书中，“iPS细胞”是指也称为人工多功能性干细胞或诱导多功能性干细胞的获得了分化多功能性的细胞。本发明中得到的iPS细胞，能够分化为内胚层、外胚层、中胚层全部（参照图1），能够制作嵌合小鼠（图3）和生殖系。

“连接蛋白（Cx）”是参与间隙连接的蛋白质的总称，根据分子量，命名为Cx43（43kDa）等。作为连接蛋白的具体例子，可以列举Cx26、Cx30、Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx50等。现在已知超过20种的连接蛋白，今后所发现的连接蛋白类也包括在本发明中抑制对象的连接蛋白中。关于连接蛋白的种类和表达，在总说（Oyamada等，BBA，2005，1719：6-23）中有详细叙述，该记载在本说明书中作为参考援引。在以下的表中总结连接蛋白的种类和表达部位。

［表1］

上表是在各组织中主要表达的连接蛋白，在本发明中，优选抑制在对象细胞中主要表达的连接蛋白。例如，在心室肌中，Cx43大量表达，优选抑制Cx43。另一方面，在心室肌中也表达Cx45，既可以抑制Cx45，也可以同时抑制Cx43和Cx45。优选抑制对象的连接蛋白，为在多种细胞类型中表达的连接蛋白26、32、43、45等，特别优选连接蛋白43。连接蛋白43的氨基酸序列是公知的，例示如下。

［表2］

Cx43的来源	基因/氨基酸序列数据库的登录号
		人	NM-000165
大鼠	NM-000567
		小鼠	NM-010288
猴	AB169817

根据iPS细胞的动物种类，能够使用对应的连接蛋白抑制因子。

作为连接蛋白的抑制因子，可以列举细胞内的连接蛋白基因的表达抑制（转录或翻译的抑制）、与细胞内的连接蛋白（蛋白质）的复合体形成的功能抑制等，具体而言，可以列举对连接蛋白的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体，优选siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA或核酶，更加优选siRNA、shRNA、miRNA。这些根据连接蛋白的种类、细胞来源等，序列不同，因此，选择适当的序列。对于适当序列的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体，本领域技术人员能够容易地设计或选择。例如，对人（对于猴也是同源序列）的连接蛋白43优选的siRNA如下。

正义：5′-CAA UUC UUC UUG CCG CAA TT-3′（序列编号1）

反义：5′-UUG CGG CAA GAA GAA UUG TT-3′（序列编号2）

作为连接蛋白的抑制因子，也能够使用具有硫酸基的粘多糖（日本特开2003-119146，该记载在本说明书中作为参考援引）。

在1个实施方式中，“连接蛋白的抑制因子”是对连接蛋白、连接蛋白半通道（连接子）或连接蛋白的细胞增殖活性施加影响或进行调整的化合物。在连接蛋白的抑制因子中，含有反义化合物（例如反义多核苷酸）、RNAi和siRNA化合物、抗体及其结合片段、以及肽和多肽（包括“肽模拟物”和肽类似物），但不限于这些。优选的连接蛋白的抑制因子是连接蛋白43的抑制因子。本说明书中进一步对例示的连接蛋白的抑制因子进行说明。

在1个实施方式中，本发明的连接蛋白抑制因子能够对向细胞内和向细胞外分子的输送进行调整或施加影响（例如阻断、抑制或减量调节）。

一部分连接蛋白的抑制因子，例如，通过mRNA的转录或翻译的减量调节，能够对连接蛋白表达进行减量调节或者减少或抑制连接蛋白蛋白质、连接蛋白半通道或细胞增殖活性（Asazuma-Nakamura等，Exp Cell Res.，2009，315：1190-1199；Nakano等，Invest Ophthalmol VisSci.，2007，49：93-104；Zhang等，Oncogene，2001，20：4138-4149）。

在连接蛋白的抑制因子的例子中，包括减少或抑制连接蛋白mRNA和/或蛋白质的表达或功能、或者使连接蛋白、连接蛋白半通道或细胞增殖活性减少的药剂。在连接蛋白的抑制因子中，包括抗连接蛋白多核苷酸（反义多核苷酸和其它的多核苷酸（siRNA或具有核酶功能性的多核苷酸等）等）、抗体及其结合片段、以及肽和多肽（包括调整半通道或细胞增殖活性的肽模拟物和肽类似物）。

抗连接蛋白多核苷酸

在抗连接蛋白多核苷酸中包括连接蛋白反义多核苷酸和具有能够使连接蛋白表达减量调节的功能的多核苷酸。在其它适当的抗连接蛋白多核苷酸中包括RNAi多核苷酸和siRNA多核苷酸、shRNA多核苷酸。

反义多核苷酸和其它抗连接蛋白多核苷酸的合成（RNAi、siRNA和核酶多核苷酸及具有修饰骨架与混合骨架的多核苷酸等）对本领域从业人员来说是公知的。例如，参照Stein C.A.和Krieg A.M.（编），Applied Antisense Oligonucleotide Technology，1998（Wiley-Liss）。抗体和结合部位以及肽和多肽（包括肽模拟物和肽类似物）的合成方法对本领域人员来说是公知的。例如，参照Lihu Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1；95（18）：10836-10841（Sept11998）；Harlow和Lane（1998）“Antibodies:A Laboratory Manuel”Cold Spring HarborPublications，New York；Harlow和Lane（1999）“Using Antibodies”ALaboratory Manuel，Cold Spring Harbor Publications，New York。

根据1个实施方式，连接蛋白发现的减量调节一般利用反义多核苷酸（DNA或RNA多核苷酸等），更详细而言，利用反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）。这些多核苷酸（例如ODN）靶向应该减量调节的连接蛋白。典型而言，多核苷酸是单链，但也可以是双链。

反义多核苷酸能够抑制连接蛋白的转录和/或翻译。优选多核苷酸是连接蛋白基因或来自mRNA的转录和/或翻译的特异的抑制剂，不抑制来自其它基因或mRNA的转录和/或翻译。本产物能够（i）对编码序列在5′一侧和/或（ii）编码区域、和/或（iii）对编码序列在3′一侧中的任一个与连接蛋白基因或mRNA结合。

一般来说，反义多核苷酸是对连接蛋白mRNA的反义多核苷酸。这样的多核苷酸能够与连接蛋白mRNA形成杂交，由此，通过对连接蛋白mRNA代谢的1个或多个形态（包括转录、mRNA加工、从核的mRNA输送、翻译或mRNA分解）的干涉，能够抑制连接蛋白表达。典型地，反义多核苷酸与连接蛋白mRNA形成杂交，形成双链，由此，能够产生mRNA翻译的直接抑制和/或不稳定化。这样的双链在核酶引起的分解中能够显示敏感性。

反义多核苷酸能够与全部或一部分连接蛋白mRNA形成杂交。典型地，反义多核苷酸与连接蛋白mRNA的核糖体结合区域或编码区域形成杂交。多核苷酸能够和连接蛋白mRNA的全部或某区域互补。例如，多核苷酸能够是连接蛋白mRNA的全部或一部分的精确的互补链。但是，不必是绝对地互补，对于在生理学条件下形成具有约20℃、30℃或大于40℃熔点的双键是充分互补的多核苷酸在本发明中使用是特别有用。

因此，典型地，多核苷酸是与mRNA序列互补的同源物。多核苷酸能够是在中～高严格条件下（约50℃～约60℃、0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠等）与连接蛋白mRNA形成杂交的多核苷酸。

为了得到一定的形态，典型地，适当的多核苷酸为约6～40个核苷酸长度。优选多核苷酸能够为约12～约35个核苷酸长度，更优选能够为约18～约32个核苷酸长度。根据别的形态，多核苷酸能够为至少约40、例如能够为至少约60或至少约80个核苷酸长度，能够为约100、约200、约300、约400、约500、约1000、约2000或至约3000或者大于3000个核苷酸长度。

由多核苷酸靶向的连接蛋白蛋白质取决于应该被减量调节的部位。连接蛋白在某些方面中，是在人或动物中天然存在，或在连接蛋白的表达或活性应该被减少的组织中天然存在的连接蛋白。连接蛋白基因（包括编码序列），一般具有和1个或多个在本说明书中所记载的特定的连接蛋白的编码序列同源性（与连接蛋白43编码序列的同源性等）。典型而言，连接蛋白为α或β连接蛋白。优选连接蛋白为α连接蛋白，在形成iPS的原料的细胞中表达。

但是，若干连接蛋白蛋白质在组织中的分布比其他更普遍存在。范围最广泛的连接蛋白蛋白质之一是连接蛋白43。编码连接蛋白43的多核苷酸在本发明中的使用特别适当。在其它形态中，靶向其它的连接蛋白。

在抗连接蛋白多核苷酸中，包括连接蛋白反义多核苷酸和具有能够使连接蛋白的表达减量调节功能的多核苷酸。在其它适当的抗连接蛋白多核苷酸中，包括RNAi多核苷酸、shRNA多核苷酸和siRNA多核苷酸。

在1个优选方式中，反义多核苷酸仅靶向1个连接蛋白蛋白质的mRNA。最优选该连接蛋白蛋白质为连接蛋白43。在别的方式中，连接蛋白蛋白质为连接蛋白26、30、31.1、32、36、37、40或45。在其它方式中，连接蛋白蛋白质为连接蛋白30.3、31、40.1、47。这些是人的连接蛋白蛋白质的例示，在其它动物种类时，靶向对应的连接蛋白的mRNA。

也尝试组合使用靶向个别连接蛋白蛋白质的多核苷酸（例如，能够靶向1、2、3、4或大于4个不同的连接蛋白）。例如，能够组合使用靶向连接蛋白43和1个或多个连接蛋白家族的其他成员（连接蛋白26、30、30.3、31.1、32、36、37、40、40.1、45、47）的多核苷酸。

或者，反义多核苷酸能够是可以含有对大于1个连接蛋白蛋白质的多核苷酸的组合物的一部分。优选多核苷酸所指向的连接蛋白蛋白质之一为连接蛋白43。在寡聚脱氧核苷酸所指向的其它连接蛋白蛋白质中，例如，能够包括连接蛋白26、30、30.3、31.1、32、36、37、40、40.1、45和47。在序列编号3～14中表示指向各种连接蛋白的适当例示的多核苷酸（和ODN）。

各反义多核苷酸能够特异地靶向特定的连接蛋白，或能够特异地靶向1、2、3或大于3个不同的连接蛋白。一般而言，相对于特异的多核苷酸一般靶向在连接蛋白之间不保守的连接蛋白基因或mRNA中的序列，非特异的核苷酸靶向各种连接蛋白的保存序列。

在本发明中使用的多核苷酸，能够适当地为非修饰磷酸二酯寡聚物。这样的寡聚脱氧核苷酸，长度能够变化。发现30量体的多核苷酸特别适合。

本发明的多数形态，参照寡聚脱氧核苷酸而记载。但是，可以理解为能够以这些形态使用其它适合的多核苷酸（RNA多核苷酸等）。

能够对反义多核苷酸进行化学修饰。由此，能够增强核酶耐性，能够增强其细胞侵入能力。例如，能够使用硫代磷酸酯寡核苷酸。在其它的脱氧核苷酸类似物中，包括膦酸甲酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3′P5′-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2′-O-烷基类似物和2′-O-甲基核糖核苷酸膦酸甲酯。或者，能够使用混合骨架寡核苷酸（“MBO”）。MBO包括硫代磷酸寡脱氧核苷酸的部分和修饰寡脱氧或寡核糖核苷酸的适当配置的部分。MBO具有硫代磷酸酯结合的部分和其它修饰寡核苷酸的部分（非离子性、对核酶或2′-O-烷基寡核糖核苷酸显示非常高的耐性的膦酸甲酯等）。修饰骨架和混合骨架寡核苷酸的制备方法在该领域是公知的。

本发明中所使用的反义多核苷酸的精确序列取决于靶连接蛋白蛋白质。在1个实施方式中，在适当的连接蛋白反义多核苷酸中，能够含有多核苷酸（序列编号3～14）。

对本说明书中记载的组合多核苷酸的制备适当的多核苷酸中，例如，包括对连接蛋白Cx43的多核苷酸和连接蛋白26、30、31.1、32和37的多核苷酸。

本发明中所使用的反义多核苷酸的精确序列尽管取决于靶连接蛋白蛋白质，而对于连接蛋白43，发现具有以下序列的反义多核苷酸特别适合：

GTA ATT GCG GCA AGA AGA ATT GTT TCT GTC（序列编号3）；

GTA ATT GCG GCA GGA GGA ATT GTT TCT CTC（序列编号4）；

GGC AAG AGA CAC CAA AGA CAC TAC CAG CAT（序列编号5）。

例如，连接蛋白26、31.1和32的适当的反义多核苷酸具有以下序列。

5′TCC TGA GCA ATA CCT AAC GAA CAA ATA（连接蛋白26）（序列编号6）；

5′CGT CCG AGC CCA GAA AGA TGA GGT C（连接蛋白31.1）（序列编号11）；

5′TTT CTT TTC TAT GTG CTG TTG GTG A（连接蛋白32）（序列编号14）。

在本发明的方法中有用的其它连接蛋白反义多核苷酸序列中，包括以下以下。

5′CAT CTC CTT GGT GCT CAA CC3′（连接蛋白37）（序列编号7）；

5′CTG AAG TCG ACT TGG CTT GG3′（连接蛋白37）（序列编号8）；

5′CTC AGA TAG TGG CCA GAA TGC3′（连接蛋白30）（序列编号9）；

5′TTG TCC AGG TGA CTC CAA GG3′（连接蛋白30）（序列编号10）；

5′AGA GGC GCA CGT GAG ACA C3′（连接蛋白31.1）（序列编号12）；

5′TGA AGA CAA TGA AGA TGT T3′（连接蛋白31.1）（序列编号13）。

能够通过任意方便的现有方法，对连接蛋白蛋白质的多核苷酸（含有ODN）选择其核苷酸序列。例如，能够使用计算机程序Mac Vector和OligoTech（Oligos etc.Eugene,Oregon,USA）。如果一旦被选择，就能够使用DNA合成机合成ODN。

多核苷酸同源物

例如，多核苷酸能够是连接蛋白mRNA中序列的互补序列的同源物。这样的多核苷酸，典型地，（同源序列）例如遍及至少大于约15个、至少大于约20个、至少大于约40个、至少大于约100个连续核苷酸的区域，与关联序列至少约70%同源、优选至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约97%、至少约98%或至少约99%同源。

基于该领域的任意方法，能够计算同源性。例如，UWGCG软件包提供能够用于计算同源性的BESTFIT程序（例如，以其默认设置使用）（Devereux等（1984）Nucleic Acids Research12，p387-395）。例如，如Altschul S.F.（1993）J Mol Evol36:290-300；Altschul,S.F.等（1990）J Mol Biol215:403-10中所记载，使用PILEUP和BLAST算法，能够计算同源性或使序列对齐（典型地，为其默认设置）。

用于实施BLAST分析的软件，能够从美国国家生物技术信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公开使用。该算法包括通过使其与数据库序列中同一长度的字词（words）对齐时匹配或满足若干正数阈值分值T的查询序列中长度为W的短字词鉴定，最初鉴定高分值序列的工序。T称为（Altschul等，参照上述）相邻连接字词分值阈值（neighbourhood word score threshold）。这些最初的相邻连接字词命中（neighborhood word hit）作为用于发现含有这些的HSP的检索开始的种子（seed）发挥作用。只要使累积校准分值增加，将字词命中沿着各序列在两个方向延长。在以下情况停止在各方向的字词命中：累积校准分值由量X从其达到的最大值下降时；由1个或多个负分值的残基校准累积，累积分值成为0以下时；或到达任一个序列的末端时。

BLAST算法参数W、T和X决定校准的灵敏度和速度。作为默认值，BLAST程序使用字词长度（W）、BLOSUM62分值矩阵（Henikoff和Henikoff（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919）、50的校准（B）、10的期待值（E）、M=5、N=4和两条链的比较。

BLAST算法进行2个序列之间类似性的统计分析。例如，参照Karlin和Altschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787。由BLAST算法得到的类似性的1个基准是最小和概率（smallest sumprobability）（P（N））。由此，可以得到在2个核苷酸之间或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率指标。例如，第1序列和第2序列比较的最小和概率为小于约1、优选小于约0.1、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001时，可以看成为一个序列与另一个序列匹配。

同源序列，典型地为由于至少约2个、5个、10个、15个、20个或大于20个的变异（可以是取代、缺失或插入）而与关联序列不同。能够遍及关于同源性计算的上述任一个领域地测定这些变异。

同源序列，典型地，以显著超过背景水平与原来的序列选择性地形成杂交。典型地，使用中～高严格条件（例如，以约50℃～约60℃、0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠）进行选择性地形成杂交。但是，能够以该领域中公知的任意适当的条件进行这样的杂交形成（Sambrook等，（1989），参照Molecular Cloning:A Laboratory Manual）。例如，在需要高严格条件时，在适当的条件中，以60℃含有0.2XSSC。在需要更低的严格时，在适当的条件中，以60℃含有2XSSC。

肽和多肽连接蛋白的抑制因子

另外，结合蛋白质（包括肽、肽模拟物、抗体和抗体片段等）是适合的抑制因子。

在结合蛋白质中，例如，包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段（例如，包括Fab、F(ab′)₂和Fv片段）；单链抗体；单链Fvs；和单链结合分子（例如，包括结合域、铰链区、CH2域和CH3域）、特定的抗体或能够与和其它结合分子接触的抗原决定基（即，一般称为抗原决定簇的分子的一部分）结合的重组抗体和抗体片段。这些结合蛋白质（包括抗体和抗体片段等）能够进行嵌合化或人源化、或能够制作为在给药的被检测体中免疫原性降低、或能够进行合成、或能够重组产生、或能够在表达文库中产生。设定为在该领域公知或之后所发现的任意结合分子（在本说明书中所参照的和/或在该领域所更详细记载的结合分子等）。例如，在结合蛋白质中，不仅包括抗体等，而且包括与标的（例如，连接蛋白或相关分子）结合的配体、受体、肽模拟物或其它的结合片段或分子（例如，由噬菌体展示产生）。

结合分子一般具有所希望的特异性（包括结合特异性，但不限定于此）和所希望的亲和性。亲和性例如能够为约10⁴M^-1以上、约10⁶M^-1以上、约10⁷M^-1以上、约10⁸M^-1以上的Ka。进一步大于约10⁸M^-1的亲和性（约10⁹M^-1以上、约10¹⁰M^-1、约10¹¹M^-1和约10¹²M^-1的亲和性等）是适当的。能够使用现有技术（例如，Scatchard等，1949Ann.NY.Acad.Sci.51:660中记载的技术）容易地确定本发明的结合蛋白质的亲和性。

通过使用从亲水性分析得到的数据，提出了连接蛋白含有4个膜贯通区域和2个短的胞外环。连接蛋白质的第1和第2细胞外区域的配置通过用于割裂缝隙连接上对应的抗原决定簇的免疫定位的抗肽抗体产生的报告进一步特定。Goodenough D.A.J Cell Biol107:1817-1824（1988）；Meyer R.A.，J Cell Biol119:179-189（1992）。

在连接蛋白的抑制因子中，包括对应于连接蛋白（例如，连接蛋白45、43、26、30、31.1和37）的贯通区域（例如，第1～第4）的氨基酸序列的肽。连接蛋白的抑制因子能够包括含有对应于连接蛋白45的膜贯通区域的一部分的氨基酸序列的肽。在连接蛋白的抑制因子中，包括具有含有登录号AAA60458的约5～20个连续氨基酸的氨基酸序列的肽、具有含有登录号AAA60458的约8～15个连续氨基酸的氨基酸序列的肽或具有含有登录号AAA60458的约11～13个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它实施方式涉及具有含有登录号AAA60458的至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽的连接蛋白的抑制因子。在本说明书中所提供的一部分连接蛋白的抑制因子中，使用对应于登录号AAA60458的46～75位和199～228位的氨基酸的连接蛋白45的细胞外区域，能够构建特定的肽序列。在本说明书中记载的一部分肽具有对应于登录号AAA60458的46～75位和199～228位区域的氨基酸序列。肽不必具有与登录号AAA60458的一部分相同的氨基酸序列，肽能够使得保持结合活性或功能活性地使保守的氨基酸变化。或者，肽能够靶向细胞外区域以外的连接蛋白蛋白质区域（例如，不对应于46～75位和199～228位的登录号AAA60458的一部分）。

另外，适当的连接蛋白的抑制因子包括含有对应于连接蛋白43的膜贯通区域的一部分的氨基酸序列的肽。在连接蛋白的抑制因子中，包括具有含有登录号：NP_034418的约5～20个连续氨基酸序列的肽、具有含有登录号：NP_034418的约8～15个连续氨基酸序列的肽、或具有含有登录号：NP_034418的约11～13个连续氨基酸序列的肽。在其它连接蛋白的抑制因子中，包括具有含有登录号：NP_034418的至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个连续氨基酸的氨基酸序列的肽。其它连接蛋白的抑制因子含有对应于登录号：NP_034418的37～76位和178～208位的氨基酸的连接蛋白43的细胞外区域。在连接蛋白的抑制因子中含有具有对应于登录号：NP_034418的37～76位和178～208位区域的氨基酸序列的在本说明书中记载的肽。肽不必具有和登录号：NP_034418的一部分相同的氨基酸序列，肽能够使得保持结合活性或功能活性地使保守的氨基酸变化。或者，肽能够靶向细胞外区域以外的连接蛋白蛋白质区域（例如，不对应于37～76位和178～208位的登录号：NP_034418的一部分）。

抗连接蛋白肽能够含有肽为功能活性的连接蛋白的抑制因子这样的具有保守的氨基酸取代的连接蛋白细胞外区域的一部分所对应的序列。在例示的保守的氨基酸取代中，例如，包括非极性氨基酸与其它的非极性氨基酸的取代、芳香族氨基酸与其它的芳香族氨基酸的取代、脂肪族氨基酸与其它的脂肪族氨基酸的取代、极性氨基酸与其它的极性氨基酸的取代、酸性氨基酸与其它的酸性氨基酸的取代、碱性氨基酸与其它的碱性氨基酸的取代、离子性氨基酸与其它的离子性氨基酸的取代。

在以下的序列编号15～23中表示靶向连接蛋白43的肽的例子。

FEVAFLLIQWI（序列编号15）

LLIQWYIGFSL（序列编号16）

SLSAVYTCKRDPCPHQ（序列编号17）

VDCFLSRPTEKT（序列编号18）

SRPTEKTIFII（序列编号19）

LGTAVESAWGDEQ（序列编号20）

QSAFRCNTQQPG（序列编号21）

QQPGCENVCYDK（序列编号22）

VCYDKSFPISHVR（序列编号23）

在以下的序列编号24～37中表示靶向Cx32、Cx40、Cx43的肽的例子。

靶向Cx32的肽（序列编号34是Cx32/Cx43）

ESVWGDEKSSFI（序列编号24）

ICNTLQPGCNSV（序列编号25）

SVCYDHFFPISH（序列编号26）

RLVKCEAFPCPNTVDCFVSRPTEKT（序列编号27）

VKCEAFPCPNTV（序列编号28）

VDCFVSRPTEKT（序列编号29）

VCYDHFFPISHVR（序列编号30）

VWGDEKSSFICNTLQPGY（序列编号31）

DEKSSFICNTLQPGY（序列编号32）

SRPTEKTVFTV（序列编号33）

SRPTEKT（序列编号34）

ICNTLQPGCNSV（序列编号35）

靶向Cx40的肽

FLDTLHVCRRSPCPHP（序列编号36）

靶向Cx43的肽

KRDPCHQVDCFLSRPTEK（序列编号37）

序列编号38～65表示用于本说明书中记载的对人连接蛋白（huCx）26、30、30.3、31.1、32、36、37、40、40.1、43、45、46、46.6的抑制因子。

huCx26KEVWGDEQADFVCNTLQPGCKNVCYDHYFPISHIR（序列编号38）

huCx30QEVWGDEQEDFVCNTLQPGCKNVCYDHFFPVSHIR（序列编号39）

huCx30.3EEVWDDEQKDFVCNTKQPGCPNVCYDEFFPVSHVR（序列编号40）

huCx31ERVWGDEQKDFDCNTKQPGCTNVCYDNYFPISNIR（序列编号41）

huCx31.1ERVWSDDHKDFDCNTRQPGCSNVCFDEFFPVSHVR（序列编号42）

huCx32ESVWGDEKSSFICNTLQPGCNSVCYDQFFPISHVR（序列编号43）

huCx36ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR（序列编号44）

huCx37ESVWGDEQSDFECNTAQPGCTNVCYDQAFPISHIR（序列编号45）

huCx40.1RPVYQDEQERFVCNTLQPGCANVCYDVFS PVSHLR（序列编号46）

huCx43ESAWGDEQSAFRCNTQQPGCENVCYDKSFPISHVR（序列编号47）

huCx46EDVWGDEQSDFTCNTQQPGCBNVCYBRAFPISHIR（序列编号48）

huCx46.6EAIYSDEQAKFTCNTRQPGCDNVCYDAFAPLSHVR（序列编号49）

huCx40ESSWGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIR（序列编号50）

huCx45GESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVR（序列编号51）

huCx26MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKT（序列编号52）

huCx30MYVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKT（序列编号53）

huCx30.3LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKK（序列编号54）

huCx31LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTE（序列编号55）

huCx31.1LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNIVDCFISKPSEKN（序列编号56）

huCx32MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKT（序列编号57）

huCx36LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT（序列编号58）

huCx37LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKT（序列编号59）

huCx40.1GALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTSKS（序列编号60）

huCx43LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKT（序列编号61）

huCx46IAGQYFL YGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKT（序列编号62）

huCx46.6LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKT（序列编号63）

huCx40IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKN（序列编号64）

huCx45LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKT（序列编号65）

序列编号18～19、66～79提供构成连接蛋白抑制因子（肽）的连接蛋白家族成员（人连接蛋白（huCx）26、30、30.3、31.1、32、36、37、40、40.1、43、45、46、46.6）的细胞外区域。这样的连接蛋白抑制因子能够含有该序列编号18～19、66～79中的肽序列的约8～约15个或约11～约13个连续氨基酸。相对肽或其片段，能够使保守氨基酸变化。

huCx43LLIQWYIYGFSLSAVYTCKRDPCPHQVDCFLSRPTEKTIFII（序列编号66）

huCx26MYVFYVMYDGFSMQRLVKCNAWPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV（序列编号67）

huCx30YVFYFLYNGYHLPWVLKCGIDPCPNLVDCFISRPTEKTVFTI（序列编号68）

huCx30.3LYIFHRLYKDYDMPRVVACSVEPCPHTVDCYISRPTEKKVFTY（序列编号69）

huCx31LYLLHTLWHGFNMPRLVQCANVAPCPNIVDCYIARPTEKKTY（序列编号70）

huCx31.1LYVFHSFYPKYILPPVVKCHADPCPNrVDCFISKPSEKNIFTL（序列编号71）

huCx32MYVFYLLYPGYAMVRLVKCDVYPCPNTVDCFVSRPTEKTVFTV（序列编号72）

huCx36LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII（序列编号73）

huCx37LYGWTMEPVFVCQRAPCPYLVDCFVSRPTEKTIFII（序列编号74）

huCx40.1GALHYFLFGFLAPKKFPCTRPPCTGVVDCYVSRPTEKSLLML（序列编号75）

huCx46IAGQYFLYGFELKPLYRCDRWPCPNTVDCFISRPTEKTIFII（序列编号76）

huCx46.6LVGQYLLYGFEVRPFFPCSRQPCPHVVDCFVSRPTEKTVFLL（序列编号77）

huCx40IVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYSRPTEKNVFIV（序列编号78）

huCx45LIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLLC（序列编号79）

下述序列编号80～92和其部分肽提供关于连接蛋白40的胞外环（E1和E2）显示的连接蛋白40的肽抑制剂。

E1

LGTAAESSWGDEQADFRCDTIQPGCQNVCTDQAFPISHIRFWVLQ（序列编号80）

LGTAAESSWGDEQA（序列编号81）

DEQADFRCDTIQP（序列编号82）

TIQPGCQNVCTDQ（序列编号83）

VCTDQAFPISHIR（序列编号84）

AFPISHIRFWVLQ（序列编号85）

E2

MEVGFIVGQYFIYGIFLTTLHVCRRSPCPHPVNCYVSRPTEKNVFIV（序列编号86）

MEVGFIVGQYF（序列编号87）

IVGQYFIYGIFL（序列编号88）

GIFLTTLHVCRRSP（序列编号89）

RRSPCPHPVNCY（序列编号90）

VNCYVSRPTEKN（序列编号91）

SRPTEKNVFIV（序列编号92）

序列编号93～105提供关于连接蛋白45的胞外环（E1和E2）显示的连接蛋白45的肽抑制剂。

E1

LTAVGGESIYYDEQSKFVCNTEQPGCENVCYDAFAPLSHVRFWVFQ（序列编号93）

LTAVGGESIYYDEQS（序列编号94）

DEQSKFVCNTEQP（序列编号95）

TEQPGCENVCYDA（序列编号96）

VCYDAFAPLSHVR（序列编号97）

APLSHVRFWVFQ（序列编号98）

E2

FEVGFLIGQYFLYGFQVHPFYVCSRLPCHPKIDCFISRPTEKTIFLL（序列编号99）

FEVGFLIGQYF（序列编号100）

LIGQYFLYGFQV（序列编号101）

GFQVHPFYVCSRLP（序列编号102）

SRLPCHPKIDCF（序列编号103）

IDCFISRPTEKT（序列编号104）

SRPTEKTIFLL（序列编号105）

连接蛋白45的抑制因子（肽）的例子如下。

YVCSRLPCHP（序列编号106），

QVHPFYVCSRL（序列编号107），

FEVGFLIGQYFLY（序列编号108），

GQYFLYGFQVHP（序列编号109），

GFQVHPFYVCSR（序列编号110），

AVGGESIYYDEQ（序列编号111），

YDEQSKFVCNTE（序列编号112），

NTEQPGCENVCY（序列编号113），

CYDAFAPLSHVR（序列编号114）

FAPLSHVRFWVF（序列编号115）

LIGQY（序列编号116），

QVHPF（序列编号117），

YVCSR（序列编号118），

SRLPC（序列编号119），

LPCHP（序列编号120）

GESIY（序列编号121），

YDEQSK（序列编号122），

SKFVCN（序列编号123），

TEQPGCEN（序列编号124），

VCYDAFAP（序列编号125），

LSHVRFWVFQ（序列编号126）

作为连接蛋白抑制因子的抗体、肽能够使用市售品。例如，作为Cx43抗体，可以列举Cat.No:Sigma,C-6219;Zymed,13-8300;SantaCruz,sc-6560，作为抑制Cx43的肽，可以列举Cat.No:Santa Cruz,sc-6560P;BD Transduction Laboratories,610063;Abcam,ab56616。

TGFβ信号转导抑制因子包括在该领域已知的TGF-β拮抗剂，可以以抑制TGF-β信号转导的药剂来定义。例如，与TGF-β受体I结合从而防止TGF-β与TGF-β受体结合的药剂作为TGF-β信号转导抑制因子发挥作用。

在其它非限定的例子中，如Dasch等（J.Immunol.（1989）142:1536）和（J.Immunol.（1990）145:1415）记载的例子那样的、对人TGF-β特异的阻断（中和）抗体（NAb）、可溶性TGF-β受体、膜结合性TGF-β受体、将使前体TGF-β向成熟TGF-β活化的蛋白酶失活的蛋白酶抑制剂、对TGF-β受体（I型、II型或III型）特异并预防向TGF-β该受体的结合的抗体和他们的组合。

参照图4，说明TGF-β的信号转导。

配体TGF-β通过与TGF-β受体II（TβRII）结合，TβRII被活化。被活化的TβRII与TGF-β受体I（TβRI）聚合，形成由2个TβRI和2个TβRII构成的四聚体，引起TβRI的C末端的磷酸化。磷酸化的TβRI成为活性型，在其C末端，供给作为TGF-β信号转导介体的Smad2和Smad3，并使其磷酸化。磷酸化的Smad2和Smad3与细胞质中局部存在的Smad4结合，引起核内移动，与靶基因结合，调控靶基因的表达。

本发明的TGFβ信号转导抑制因子是抑制该信号转导的任一步的抑制因子。因此，对于TGFβ信号转导抑制因子，具有TGF-β的表达抑制、TβRI或TβRII的表达抑制、TGF-β向TβRII的结合抑制、由2个TβRI和2个TβRII构成的四聚体的形成抑制、TβRI的C末端磷酸化抑制、TβRI的C末端脱磷酸化、TβRI的泛素化、Smad2和Smad3的磷酸化抑制、Smad2和Smad3的表达抑制、Smad2和Smad3的泛素化、磷酸化的Smad2和Smad3的脱磷酸化、磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4的结合抑制等功能的物质都能够在本发明中作为TGFβ信号转导抑制因子发挥功能。

TGFβ信号转导抑制因子能够使用市售品。市售品可以分为（1）受体的抑制和（2）受体以后的信号转导的抑制。

（1）受体I（ALK5）抑制剂：

SB425342、A-83-01、ALK5抑制剂。

（2）信号转导抑制剂

抑制型Smad：Smad7与TβRI结合，妨碍Smad2和Smad3向TβRI的结合。

信号介体抑制剂：利用siRNA或反义寡聚DNA抑制Smad2、Smad3和Smad4的表达。

TGF-β信号转导抑制因子广泛地包括市售的受体I（ALK5）抑制剂（SB425342、A-83-01、ALK5抑制剂等）、模拟信号转导抑制剂的功能的物质。

TGF-β信号转导抑制因子包括对TGFβ、TβRI、TβRII的抗体。抗体如对连接蛋白抑制因子的说明一样，包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段（例如，包括Fab、F(ab′)₂和Fv片段）；单链抗体；单链Fvs；和单链结合分子（例如，包括结合域、铰链区、CH2域和CH3域），特定的抗体或能够与和其它结合分子接触的抗原决定基（即，一般称为抗原决定簇的分子的一部分）结合的重组抗体和抗体片段。

TGF-β信号转导抑制因子包括抑制TGF-β前体向成熟型TGF-β变换的物质、可溶型的TGF-β受体。

TGF-β一般作为由与称为潜在相关蛋白质的蛋白质非共价结合的TGF-β构成的潜在前体被分泌（LAP；Harpel等（1992）Prog.GrowthFactor Res.4:321）。该潜在复合体，为了放出活性细胞因子，需要碳水化物基的酶切和暂时酸化。精制LAP其本身以高亲和性结合活性TGF-β，形成潜在复合体。叙述对应于per-pro-TGF-β、在成熟型TGF-β前终止、含有用于Ser33取代的Cys33、编码278个氨基酸肽的DNA（Derynck等（1985）Nature316:701），发现其与TGF-β结合，使其处于潜在的状态。

另外，可溶型TGF-β受体也结合TGF-β，防止向膜结合性TGF-β受体的结合。TGF-β受体由Wang等（Cell（1991）67:797）和Lin等（Cell（1992）68:775）记载。可溶型TGF-β受体能够通过本领域所公知的方法制备。例如，能够制备使TGF-β受体的膜贯通区域缺失的缺失突变体，其表达可溶型TGF-β结合蛋白质（Miyazono等（Adv.Immunol.（1994）55:181）。

另外，作为TGFβ信号转导抑制因子发挥功能的其它形式的TGF-β拮抗剂也是本领域所公知的。例如，Yamaguchi等（Nature（1990）346:281）研究了饰胶蛋白聚糖（Decorin），其与TGF-β结合，调整该增殖因子，是小的硫酸软骨素-皮肤素蛋白多糖。Ohtsuki和Massague（Mol.Cell.Biol.12:621-265,1992）公开了若干阻断TGF-β的生物活性的蛋白激酶抑制剂。作为蛋白酶抑制剂的药物的设计和使用在本领域是充分公知的（Design of Enzyme Inhibitors as Drugs;Sandler和Smith編;1989，Oxford University Press;Proteinase Inhibitors Medical andBiological Aspects;Katunuma，Umezawa和Holzer編，1983，Springer-Verlag）；这样，制造Cruzain van的抑制剂，作为TGF-β拮抗剂是有用的。

另外，更多的其它的TGF-β拮抗剂及其制造方法正在开发中，且在本领域是充分已知的。有效的TGF-β拮抗剂的任一个在本发明中都能够有用，因此，所使用的特异的TGF-β拮抗剂不受限定。在这样的拮抗剂的例子中，包括1个或其以上的对异型TGF-β的单克隆和多克隆抗体（美国专利第5571714号和WO97/13844）、TGF-β受体、其片段、其衍生物、和对TGF-β受体的抗体（美国专利第5693607号、第6008011号、第6001969号和第6010872及WO92/00330、WO93/09228、WO95/10610和WO98/48024），潜在关联肽（WO91/08291）、大的潜在TGF-β（WO94/09812）、胎球蛋白（美国专利第5821227号）、饰胶蛋白聚糖及如双糖链蛋白多糖、纤调蛋白聚糖、光蛋白聚糖和内皮糖蛋白的其它蛋白多糖（美国专利第5583103号、第5654270号、第5705609号、第5726149号、第5824655号、第5830847号、第6015693号及WO91/04748、WO91/10727、WO93/09800和WO94/10187）。

在这样的拮抗剂的更多的例子中，包括生长抑素（WO98/08529）、甘露糖-6-磷酸或甘露糖-1-磷酸（美国专利第5520926号）、催乳激素（WO97/40848）、胰岛素样生长因子II（WO98/17304）、IP-10（WO97/00691）、含有精氨酸（arg）-甘氨酸（gly）-天冬氨酸（asp）的肽（美国专利第5958411号和WO93/10808）、植物、真菌类和细菌类提取物（欧洲专利申请第813875号、日本特开平8-119984号和美国专利第5693610号）、反义寡核苷酸（美国专利第5683988号、美国专利第5772995、美国专利第5821234号和美国专利第5869462号以及WO94/25588）以及SMAD和MAD（欧洲专利申请EP874046、WO97/31020、WO97/38729、WO98/03663、WO98/07735、WO98/07849、WO98/45467、WO98/53068、WO98/55512、WO98/56913、WO98/53830、WO99/50296以及美国专利第5834248号、美国专利5807708号和美国专利第5948639号），以及Ski和Sno（G.沃格尔，科学，286:665（1999）和Stroschein等，科学，286:771-74（1999））以及保持有抑制TGF-β活性的能力的上述分子的任一个片段和衍生物，包括与TGF-β信号转导相关的其它蛋白质。

TGF-β受体和TGF-β受体的TGF-β结合片段，特别是可溶性片段，在本发明的方法中是有用的TGF-β拮抗剂。TGF-β受体和编码这些TGF-β受体的核酸，在本领域是众所周知。编码TGF-β1型受体的核酸序列，在GenBank的登录号L15436和Donahoe等的美国专利第5538892号中被公开。TGF-β2型受体的核酸序列由GenBank的正式登录号AW236001、AI35790、AI279872、AI074706和AA808255能够公开得到的。另外，TGF-β3型受体的核酸序列由GenBank的正式登录号NM003243、AI887852、AI817295、AI681599能够公开得到。在优选的方式中，TGF-β拮抗剂是阻断TGF-β向该受体或F(ab)₂片段、Fv片段、单链抗体和保持与TGF-β结合的能力的其它“抗体”型的该片段的结合的抗体。该抗体可以被嵌合化或人源化。

还可以列举对TGFβ1受体II型作为RNAi作用的RNA序列（日本特开2005-253344）、用于使TGFβII型受体表达沉默的siRNA（日本特表2007-502284）、作为TGF-β酶抑制剂的嘧啶咪唑（pyrimidinylimidazole）（日本特表2008-511631）和嘧啶吡唑（pyrimidinyl pyrazole）（日本特表2008-511630）等。

优选的TGFβ信号转导抑制因子为SB-431542、A-83-01、ALK5抑制剂。

TGFβ信号转导抑制因子能够在细胞的培养液中添加。作为浓度，例示TGFβ信号转导抑制因子的有效量，例如，在SB-431542时为1～100μM，优选为10μM左右。

连接蛋白抑制因子能够通过在培养液中添加有效量以上，向细胞中摄入。例如，在siRNA时能够在培养液中添加10～1000nM，优选添加100nM左右。上述以外的TGFβ信号转导抑制因子、连接蛋白抑制因子的用量，本领域技术人员能够容易地确定。

作为形成iPS细胞的原料细胞，可以列举全部体细胞，例如，可以列举心肌细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等。该体细胞可以是表达连接蛋白的细胞，更优选高表达连接蛋白的细胞。

iPS细胞能够从哺乳动物细胞（人、小鼠、大鼠、牛、马、猪、兔、绵羊、山羊、猴、犬、猫）或鸡、鸭、爪蟾等的动物细胞得到。

连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子既可以同时作用，也可以逐次作用。优选使它们同时作用。

使连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子作用得到的iPS细胞，能够按照通常方法除去非iPS细胞从而分离精制iPS细胞团。

可以认为本发明的iPS细胞在使连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子作用、诱导的时刻，连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子的一个或两个在细胞内存在。特别在这些抑制因子是抑制细胞内基因表达的分子时，可以认为在形成iPS的瞬间在细胞内存在。特别是连接蛋白抑制因子是在现有的iPS制作和培养时不使用的细胞因子，在细胞内含有连接蛋白抑制因子的iPS细胞是新型细胞。

连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子都能够用于对iPS细胞的诱导，这些作为iPS细胞诱导剂是有用的。

含有从选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子的培养基，由于能够诱导iPS细胞，因此，作为iPS细胞诱导用培养基是有用的。

从选自连接蛋白抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子中的至少1种抑制因子能够诱导iPS细胞，因此，这些作为iPS细胞诱导用试剂盒是有用的。

实施例

以下，按照实施例更详细地说明本发明。

实施例1：新生小鼠心室由来的心肌细胞的初始化（reprogramming）

对象和方法

1）心肌细胞的分离

利用现有的方法用解剖用剪刀从出生2日后小鼠胎鼠（C57/BL6和C57B/6-Tg（CAG-EGFP））将残留心室部分的心脏细切为约2mm×2mm大小。在0.2%胶原酶（Collagenase II，Worthington，美国，在PBS中溶解），解离心肌细胞。离心分离解离了的心肌细胞，在添加有10%FBS的DMDM培养液中，以37℃、5%CO₂的条件孵化45分钟后，将上清液再次以相同条件孵化，将其进行4次，除去成纤维细胞，分离心肌细胞。

2）心肌细胞的初始化

在6cm培养盘中播种2×10⁵心肌细胞，以上述DMEM培养基培养1周后，以作为10μM TGF-β受体抑制剂的SB-431542（Tocris，美国）或者100nM siRNA Cx43或含有该两者的15%FBS、以小鼠培养基分别进行心肌细胞的初始化选择。

所使用的小鼠Cx43siRNA序列，如下所示。

正义：5′-CAA UUC CUC CUG CCG CAA TT-3′

反义：5′-UUG CGG CAG GAG GAA UUG TT-3′

3）多功能性的评价

（i）ES细胞初期标记（early marker）的细胞免疫染色

从以添加了10μm SB-431542和100nM siRNA Cx43两者的ES培养基条件选择培养得到的心肌细胞以约2周得到2个iPS细胞集落。在免疫染色等和畸胎瘤形成确认中使用在饲养细胞上以与小鼠ES细胞培养条件同样的条件培养、增殖的iPS样细胞。

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的测定利用AlkalinePhosphatase Detection试剂盒（Millipore，美国）进行。

在细胞免疫染色中使用的抗体如下。

抗兔Nanog抗体（稀释200倍，Cosmo Bio，REC-RABOO4PF）、抗兔Dct4抗体（稀释500倍，sc-9081）、抗山羊Sox2抗体（稀释200倍，sc-17320）、抗小鼠SSEA1抗体（稀释200倍，sc-21702）。

（ii）畸胎瘤制作

向SCID小鼠的皮下移植2×10⁵的iPS样细胞，5周后摘出肿瘤，通过HE染色，在组织学上确认是否形成畸形瘤。

（iii）嵌合小鼠的制作

将iPS样细胞移植到来自ICR小鼠的8细胞期的受精卵后，返回ICR小鼠，确认是否能够形成嵌合小鼠。

结果

1.ES初期标记基因的表达

在本发明所制作的小鼠心肌细胞由来的2个iPS细胞、siPSCs（silencing-induced pluripotent stem cells，沉默诱导多功能干细胞）形态上类似于小鼠ES细胞集落（图1a），确认了ALP活性（图1b），在蛋白质水平确认了多功能性标记因子、Nanog、Oct4、Sox2、SSEA1的表达（图1c）。另外，还在基因水平确认了各种多功能性标记基因的表达（图1d）。还确认了EGFP小鼠心肌细胞由来的iPS样细胞的诱导（图2）。

2.siPSCs的分化能力验证

在SCID小鼠的皮下移植iPSCs5周后，形成了包括外胚层的上皮和神经、中胚层的肌肉和软骨、内胚层的腺管等的三胚层的各种组织的畸胎瘤（图1e）。另外，虽然数据未显示，确认了siPSCs形成胚层体，利用分化诱导条件，能够分别分化为神经细胞、心肌细胞、内皮细胞。在心肌细胞中，也可以确认搏动和传导。另外，通过免疫抗体法、RT-PCR，在进行了分化诱导的细胞中，在蛋白质水平和基因水平共同确认了三胚层标记基因的表达。

3.嵌合小鼠的制作

通过将在本发明中制作的小鼠心肌细胞由来的2个iPS细胞向囊胚注入，形成iPS细胞由来的细胞混合存在的成体嵌合小鼠，因此，可以说具有与ES细胞同样的分化万能性（图3）。

在本说明书中所记载的专利文献和论文，其整体在本说明书中作为参考被援引。

工业上的可利用性

本发明是安全且迅速地制备iPS细胞的方法，因此，今后在临床利用iPS细胞上提供了极其有效的手段。

Claims

1.一种制作iPS细胞的方法，其特征在于：

在ES培养基条件下，使连接蛋白43抑制因子和至少1种TGFβ信号转导抑制因子作用于细胞，

所述连接蛋白43抑制因子是对连接蛋白43的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体，

所述TGFβ信号转导抑制因子是TGF-β受体I抑制剂SB-431542、A-83-01或ALK5抑制剂，

且原料细胞为心肌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述连接蛋白43抑制因子是连接蛋白43的siRNA，所述TGFβ信号转导抑制因子是SB-431542。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

使10～1000nM的连接蛋白43的siRNA和1～100μM的TGFβ信号转导抑制因子SB-431542作用于细胞。

4.一种iPS细胞，其特征在于：

含有连接蛋白43抑制因子和至少一种TGFβ信号转导抑制因子，

所述连接蛋白43抑制因子选自对连接蛋白43的siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、肽、抗体或核酶、或在细胞内能够放出这些RNA分子的表达载体，

所述TGFβ信号转导抑制因子选自TGF-β受体I抑制剂SB-431542、A-83-01或ALK5抑制剂，

且原料细胞为心肌细胞。

5.如权利要求4所述的iPS细胞，其特征在于：

6.连接蛋白43抑制因子、或者连接蛋白43抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子在iPS细胞诱导剂的制造中的用途，所述iPS细胞的原料细胞为心肌细胞。

7.连接蛋白43抑制因子、或者连接蛋白43抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子在iPS细胞诱导用培养基的制造中的用途，所述iPS细胞的原料细胞为心肌细胞。

8.连接蛋白43抑制因子、或者连接蛋白43抑制因子和TGFβ信号转导抑制因子在iPS细胞诱导用试剂盒的制造中的用途，所述iPS细胞的原料细胞为心肌细胞。